DE60032331T2

DE60032331T2 - Exendine zur glucagon suppression

Info

Publication number: DE60032331T2
Application number: DE60032331T
Authority: DE
Inventors: Andrew Point Loma YOUNG; Bronislava San Diego GEDULIN
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1999-01-14
Filing date: 2000-01-14
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2020-01-15
Also published as: EP1143989A3; DK1143989T3; CY1106347T1; JP2002538084A; PT1143989E; NO20013469D0; WO2000041548A2; NO20013469L; EP1143989A2; ATE347901T1; CN1347327A; US6872700B1; CN100425284C; US20050171019A1; US20070037750A1; BR0007823A; AU770712B2; BRPI0007823A8; WO2000041548A3; NO328077B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Unterdrückung und/oder Senkung von Glucagon in einem Lebewesen durch Verabreichung eines Exendins, eines Exendin-Agonisten, oder eines modifizierten Exendins oder Exendin-Agonisten, wobei ein Exendin- oder Exendin-Agonist-Peptid an ein oder mehrere Polyethylenglykol-Polymere oder eine andere Verbindung geknüpft ist, die zur Herabsetzung der Nierenausscheidung (Clearance) des Stammpeptids nützlich ist. Dies ist zum Beispiel in der Behandlung von Hyperglucagonämie und anderen Zuständen nützlich, bei denen niedrigere Glucagonspiegel oder die Unterdrückung der Glucagonsekretion von Nutzen sind.
HINTERGRUND
Die folgende Beschreibung enthält Informationen, die zum Verständnis der vorliegenden Erfindung nützlich sein können. Es stellt kein Zugeständnis dar, dass jegliche der hierin bereitgestellten Informationen dem Stand der Technik für die derzeit beanspruchten Erfindungen entsprechen, oder dafür relevant sind, noch dass jegliche der spezifisch oder ausdrücklich genannten Veröffentlichungen der Stand der Technik sind.
Bei Exendinen handelt es sich um Peptide, die in den Speichelsekretionen des Gila-Monsters (Heloderma suspectum) und des „Mexican Beaded Lizard" (Heloderma horridum) zu finden sind, Reptilien, die in Arizona und Nordmexiko einheimisch sind. Exendin-3 [SEQ ID NR. 1: His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-NH₂] ist in den Speichelsekretionen von Heloderma horridum (Mexican Beaded Lizard) vorhanden, und Exendin-4 [SEQ ID NR. 2: His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-NH₂] ist in den Speichelsekretionen von Heloderma suspectum (Gila-Monster) vorhanden (Eng, J., et al., J. Biol. Chem., 265: 20259–62, 1990; Eng, J., et al., J. Biol. Chem., 267: 7402–05, 1992). Die Aminosäuresequenz von Exendin-3 ist in 1 gezeigt. Die Aminosäuresequenz von Exendin-4 ist in 2 gezeigt. Exendin-4 wurde zunächst für eine (potenziell giftige) Komponente von Schlangengift gehalten. Es scheint heute, dass Exendin-4 frei von Toxizität ist und dass es vielmehr in den Speicheldrüsen des Gila-Monsters erzeugt wird.
Die Exendine weisen eine gewisse Sequenzähnlichkeit zu verschiedenen Mitgliedern der „glucagon-like peptide"-Familie auf, wobei die höchste Homologie von 53% die zu GLP-1[7–36]NH₂ ist [SEQ ID NR. 3] (Goke, et al., J. Biol. Chem., 268: 19650–55, 1993). GLP-1[7–36]NH₂, das manchmal auch als Proglucagon[78–107] bezeichnet wird, oder einfach als "GLP-1", wie hierin meistens verwendet, weist eine insulinotrope Wirkung auf, indem es die Insulinsekretion aus pankreatischen Beta-Zellen stimuliert; von GLP-1 wurde auch berichtet, dass es die Glucagon-Sekretion aus pankreatischen Alpha-Zellen hemmt (Ørsov, et al., Diabetes, 42: 658–61, 1993; D'Alessio, et al., J. Clin. Invest., 97: 133–38, 1996). Die Aminosäuresequenz von GLP-1 ist in 3 gezeigt. Von GLP-1 ist berichtet worden, dass es die Magenentleerung hemmt (Willms, B., et al., J Clin Endocrinol Metab 81 (1): 327–32, 1996; Wettergren A, et al., Dig Dis Sci 38 (4): 665–73, 1993) und die Magensäuresekretion (Schjoldager BT, et al., Dig Dis Sci 34 (5): 703–8, 1989; O'Halloran DJ, et al., J Endocrinol 126 (1): 169–73, 1990; Wettergren A, et al., Dig Dis Sci 38 (4): 665–73, 1993)). Von GLP-1[7–37], welches einen zusätzlichen Glycin-Rest an seinem Carboxy-Terminus aufweist, wird auch berichtet, dass es die Insulinsekretion beim Menschen (Ørsov, et al., Diabetes, 42: 658–61, 1993) stimuliert. Ein Transmembran-G-Protein-Adenylat-Cyclasegekoppelter Rezeptor, dem zumindest zum Teil die Verantwortung für die insulinotrope Wirkung von GLP-1 zugesprochen wird, wurde berichtetermaßen aus einer Beta-Zelllinie kloniert (Thorens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8641–45, 1992). GLP-1 stellte in den letzten Jahren den Schwerpunkt beträchtlicher Untersuchungen aufgrund seiner berichteten Einwirkung auf die Verstärkung einer stimulierten Insulinproduktion (Byrne, MM, Goke, B. Lessons from human studies with glucagon-like peptide-1: Potential of the gut hormone for clinical use. In: Fehmann HC, Goke B. Insulinotropic Gut Hormone Glucagon-Like Peptide 1. Basel, Switzerland: Karger, 1997: 219–33).
Andere Berichte betreffen die Hemmung der Magenentleerung (Wettergren A, et al., Truncated GLP-1 (proglucagon 78–107-amide) inhibits gastric and pancreatic functions in man, Dig. Dis. Sci. 1993 Apr.; 38(4): 665–73), der Hemmung der Glucagonsekretion (Creutzfeldt WOC, et al., Glucagonostatic actions and reduction of fasting hyperglycemia by exogenous glucagon-like peptide I(7–36) amide in type I diabetic patients, Diabetes Care 1996; 19(6): 580–6) und einer angeblichen Rolle in der Appetitkontrolle (Turton MD, et al., A role for glucagon-like peptide-1 in the central regulation of feeding, Nature 1996 Jan; 379 (6560): 69–72) dar.
Von GLP-1 wurde auch berichtet, dass es die Insel-Glukoseempfindlichkeit bei alternden Ratten wiederherstellt, indem ihre Glukosetoleranz auf das Niveau jüngerer Ratten eingestellt wird (Egan JM, et al., Glucagon-like peptide-1 restores acutephase insulin release to aged rats, Diabetologia 1997 Juni 40 (Ergänz. 1): A130). Die kurze Dauer der biologischen Wirkung von GLP-1 in vivo stellt jedoch ein Merkmal des Peptids dar, das seine Entwicklung als ein Therapeutikum behindert hat. Verschiedene Methoden sind ausprobiert worden, um die Halbwertszeit von GLP-1 oder GLP-1(7–37) zu verlängern, einschließlich der Versuche, ihre Aminosäuresequenz zu verändern und sie unter Anwendung bestimmter Formulierungen zu verabreichen (siehe z.B. European Patent Application, mit dem Titel "Prolonged Delivery of Peptides", von Darley, et al., Veröffentlichungsnummer 0 619 322 A2, bezüglich der Aufnahme von Polyethylenglykol in Formulierungen, die GLP-1(7–37) enthalten).
Pharmakologische Studien haben zu Berichten geführt, dass Exendin-4 an GLP-1-Rezeptoren auf bestimmten Insulin-sekretierenden Zellen, an verstreuten Azinuszellen der Meerschweinchen-Bauchspeicheldrüse und an Parietalzellen des Magens wirken kann; von dem Peptid wird auch berichtet, dass es die Somatostatin-Freisetzung stimuliert und die Gastrin-Freisetzung in vereinzelten Mägen hemmt (Goke, et al., J. Biol. Chem. 268: 19650–55, 1993; Schepp, et al., Eur. J. Pharmacol., 69: 183–91, 1994; Eissele, et al., Life Sci., 55: 629–34, 1994). Exendin-3 und Exendin- 4 wurden berichtetermaßen als die cAMP-Produktion in und Amylase-Freisetzung aus pankreatischen Azinuszellen stimulierend befunden (Malhotra, R., et al., Regulatory Peptides, 41: 149–56, 1992; Raufman, et al., J. Biol. Chem. 267: 21432–37, 1992; Singh, et al., Regul. Pept. 53: 47–59, 1994). Außerdem weist Exendin-4 eine beträchtlich längere Wirkdauer als GLP-1 auf. Bei einem Experiment beispielsweise wurde berichtet, dass die Senkung des Glukosespiegels durch Exendin-4 in diabetischen Mäusen für mehrere Stunden, und in Abhängigkeit von der Dosis für bis zu 24 Stunden anhielt (Eng J. Prolonged effect of exendin-4 on hyperglycemia of db/db mice; Diabetes 1996 Mai; 45 (Ergänz. 2): 152A (Zusammenf. 554)). Basierend auf ihren insulinotropen Wirkungen wurde die Verwendung von Exendin-3 und Exendin-4 zur Behandlung des Diabetes mellitus und zur Verhütung einer Hyperglykämie vorgeschlagen (Eng, US-Patent Nr. 5.424.286).
Die Ergebnisse einer Untersuchung dazu, ob Exendine eine zu Säuger-GLP-1 homologe Spezies sind, wurde berichtet von Chen und Drucker, die Exendin-Gene aus dem Gila-Monster klonierten (J. Biol. Chem. 272(7): 4108–15 (1997)). Die Beobachtung, dass das Gila-Monster auch separate Gene für Proglucagone aufweist (aus denen GLP-1 prozessiert wird), die dem Säuger-Proglucagon ähnlicher sind als Exendin, zeigt auf, dass Exendine keine Spezies-Homologa von GLP-1 sind.
Derzeit haben Agenzien, die zur Verzögerung der Magenentleerung dienen, allgemein einen Platz in der Medizin als diagnostische Hilfsmittel bei gastrointestinalen radiologischen Untersuchungen gefunden. So ist beispielweise Glucagon ein Polypeptidhormon, das durch die Alpha-Zellen der pankreatischen Langerhans-Inseln produziert wird. Ein hyperglykämisches Mittel kann Glukose durch Aktivieren der hepatischen Glycogenolyse mobilisieren. Es kann in geringerem Umfang die Sekretion von pankreatischem Insulin stimulieren. Glucagon kann in der Behandlung von Insulin-induzierter Hypoglykämie eingesetzt werden, zum Beispiel dann, wenn eine intravenöse Verabreichung von Glukose nicht möglich ist. Da jedoch Glucagon die Motilität des Magen-Darm-Trakts vermindert, kann es auch als ein diagnostisches Hilfsmittel bei radiologischen Untersuchungen des Magen-Darm-Trakts verwendet werden. Glucagon wurde außerdem bei mehreren Studien zur Behandlung verschiedener, mit Krämpfen verbundener schmerzhafter Magen-Darm-Störungen verwendet. Da niel, et al. (Br. Med. J., 3: 720, 1974) berichtete von einer schnelleren Beseitigung der Symptome einer akuten Divertikulitis bei Patienten, die mit Glucagon behandelt wurden, relativ zu jenen, die mit Analgetika oder Antispasmodika behandelt worden waren. Ein Überblick von Glauser, et al. (J. Am. Coll. Emergency Physns., 8: 228, 1979) beschrieb die Besserung einer akuten Speiseröhrenverstopfung mit Nahrungsmitteln auf eine Glucagontherapie hin. Bei einer anderen Studie milderte Glucagon Schmerz und Empfindlichkeit bei 21 Patienten mit einer Gallengangserkrankung im Vergleich zu 22 mit Placebo behandelten Patienten signifikant (M. J. Stower, et al., Br. J. Surg., 69: 591–2, 1982).
Methoden zur Regulierung der Magen-Darm-Motilität unter Verwendung von Amylin-Agonisten sind in der vom gleichen Inhaber angemeldeten internationalen Anmeldung Nr. PCT/US94/10225, veröffentlicht am 16. März 1995, WO 95/07098, beschrieben.
Neuartige Exendin-Agonisten-Verbindungen sind beschrieben in der demselben Inhaber gehörenden PCT-Anmeldung der Seriennummer PCT/US98/16387, eingereicht am 6. August 1998, mit dem Titel "Novel Exendin Agonist Compounds", welche den Nutzen der US-Patentanmeldung der Seriennummer 60/055.404, eingereicht am 8. August 1997, beansprucht.
Weitere neuartige Exendin-Agonisten sind beschrieben in der demselben Inhaber gehörenden PCT-Anmeldung der Seriennummer PCT/US98/24210, eingereicht am 13. November 1998, mit dem Titel "Novel Exendin Agonist Compounds", welche den Nutzen der Vorläufigen US-Anmeldung Nr. 60/065.442, eingereicht am 14. November 1997, beansprucht.
Noch weitere neuartige Exendin-Agonisten sind beschrieben in der demselben Inhaber gehörenden PCT-Anmeldung der Seriennummer PCT/US98/24273, eingereicht am 13. November 1998, mit dem Titel "Novel Exendin Agonist Compounds", welche den Nutzen der Vorläufigen US-Anmeldung Nr. 60/066.029, eingereicht am 14. November 1997, beansprucht.
Die Modifizierung des Polyethylenglykols (PEG) der therapeutischen Peptide und Proteine kann sowohl Vorteile als auch Nachteile bieten. Zwar kann die PEG-Modifizierung zu verbesserten Zirkulationszeiten, reduzierter Antigenität und Immunogenität, verbesserter Löslichkeit, Resistenz gegen Proteolyse, verbesserter Bioverfügbarkeit, reduzierter Toxizität, verbesserter Stabilität und einfacherer Formulierung der Peptide führen (siehe Francis et al., International Journal of Hetamology, 68: 1–18, 1998), doch ist ein Problem mit der PEGylierung in den meisten Fällen eine beträchtliche Verminderung der Bioaktivität. Id. Außerdem beziehen die meisten Methoden die Verwendung von Linkern ein, die mehrere Arten von Nebenwirkungen bezüglich der Immunogenität, Instabilität, Toxizität und Reaktivität zeigen. Id.
Ein Glucagonom (Tumor der Glucagon-sekretierenden Zellen) erzeugt, über eine Glucose-Intoleranz hinaus, eine Hauterkrankung, das nekrolytische migratorische Erythem. Dabei handelt es sich um einen erhabenen schuppigen geröteten Hautausschlag, der manchmal blasig und schließlich verkrustet ist, die im Gesicht, auf dem Bauch, den Extremitäten und dem Damm lokalisiert ist. Es kann auch mit einer Entzündung der Zunge und des Mundes und erkrankten Nägeln und ausdünnendem Haar verbunden sein. Der Zustand soll berichtetermaßen auf Octreotid reagieren, einem glucagonostatischem Hormon-Analogon. Die hierin beschriebenen Verbindungen sind auch als glucagonostatische Mittel nützlich und somit für die Behandlung dieser Erkrankung, die erstmals im Jahre 1966 beschrieben wurde (Kaplan, L. M. Endocrine Tumors of the Gastrointestinal Tract and Pancreas, Kap. 262, S. 1392. In Harrison's Principles of Internal Medicine, 12. Auflage, McGraw-Hill Inc., New. York, 1991). Die hierin beschriebenen Verbindungen, die zur Senkung der Glucagonspiegel und/oder Unterdrückung der Glucagonsekretion nützlich sind, umfassen Exendin, Exendin-Agonisten, und modifizierte Exendine und Exendin- Agonisten und darauf bezogene Formulierungen und Dosisformulierungen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Senkung der Glucagonspiegel und/oder Unterdrückung der Glucagonsekretion in einem Lebewesen. Sie betrifft auch die Hyperglucagonämie und Zustände, die durch die Verabreichung glucagonostatischer Mittel günstig beeinflusst werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf das nekrolytische migratorische Erythem.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines Exendins, Exendin-Agonisten, modifizierten Exendins oder modifizierten Exendin-Agonisten in der Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung zur Verwendung in der Behandlung von Hyperglucagonämie, Glucagonom oder nekrolytischem migrierendem Erythem bereit, wobei das Exendin, Exendin-Agonist, modifizierte Exendin oder modifizierte Exendin-Agonist eine Aminosäuresequenz der folgenden Formel umfasst:
worin Xaa₁ His, Arg, Tyr oder 4-Imidazopropionyl ist; Xaa₂ Ser, Gly, Ala oder Thr ist; Xaa₃ Asp oder Glu ist; Xaa₄ Phe, Tyr oder Naphthylalanin ist; Xaa₅ Thr oder Ser ist; Xaa₆ Ser oder Thr ist; Xaa₇ Asp oder Glu ist; Xaa₈ Leu, Ile, Val, Pentylglycin oder Met ist; Xaa₉ Leu, Ile, Pentylglycin, Val oder ist; Xaa₁₀ Phe, Tyr oder Naphthylalanin ist; Xaa₁₁ Ile, Val, Leu, Pentylglycin, tert-Butylglycin oder Met ist; Xaa₁₂ Glu oder Asp ist; Xaa₁₃ Trp, Phe, Tyr oder Naphthylalanin ist; X₁ Lys Asn, Asn Lys, Lys-NH^ε-R Asn, Asn Lys-NH^ε-R ist, worin R Lys, Arg, C₁-C₁₀-geradkettiges oder verzweigtes Alkanoyl oder Cycloalkylalkanoyl ist; Xaa₁₄, Xaa₁₅, Xaa₁₆ und Xaa₁₇ unabhängig Pro, Homoprolin, 3Hyp, 4Hyp, Thioprolin, N-Alkylglycin, N-Alkylpentylglycin oder N-Alkylalanin sind; Xaa₁₈ Ser, Thr oder Tyr ist; und Z -OH oder -NH₂ ist; oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist das Exendin ein Exendin-4. Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen weist das modifizierte Exendin oder Exendin- Agonist ein Molekulargewicht auf, das größer als das Molekulargewicht des Exendins oder Exendin-Agonisten ist (vorzugsweise um etwa 10%, 50% oder 90% größer), weist das modifizierte Exendin oder Exendin-Agonist eine negative Ladung auf, die größer als die negative Ladung des Exendins oder Exendin-Agonisten ist (vorzugsweise um etwa 10%, 50% oder 90% größer), zeigt das modifizierte Exendin oder Exendin-Agonist eine Nierenausscheidung, die geringer ist als die Nierenausscheidung des Exendins oder Exendin-Agonisten (vorzugsweise um etwa 10%, 50% oder 90% geringer), zeigt das modifizierte Exendin oder Exendin-Agonist eine Halbwertszeit, die größer ist als die Halbwertszeit des Exendins oder Exendin-Agonisten (vorzugsweise um etwa 10%, 50% oder 90% größer), weist das modifizierte Exendin oder Exendin-Agonist eine Immunogenität/Antigenität auf, die geringer ist als die Immunogenität (Antigenität) des Exendins oder Exendin-Agonisten, weist das modifizierte Exendin oder Exendin-Agonist eine Löslichkeit auf, die größer ist als die Löslichkeit des Exendins oder Exendin-Agonisten (vorzugsweise um etwa 10%, 50% oder 90% größer), weist das modifizierte Exendin oder Exendin-Agonist eine Proteolyserate auf, die kleiner ist als die Proteolyserate des Exendins oder Exendin-Agonisten (vorzugsweise um etwa 10%, 50% oder 90% kleiner), weist das modifizierte Exendin oder Exendin-Agonist eine Toxizität auf, die geringer ist als die Toxizität des Exendins oder Exendin-Agonisten, zeigt das modifizierte Exendin oder Exendin-Agonist eine Stabilität, die größer ist als die Stabilität des Exendins oder Exendin-Agonisten und weist das modifizierte Exendin oder Exendin-Agonist eine Permeabilität/biologische Funktion auf, die größer oder kleiner ist als die Permeabilität/biologische Funktion des Exendins oder Exendin-Agonisten (vorzugsweise um etwa 10%, 50% oder 90% größer oder kleiner).
Das Exendin oder der Exendin-Agonist kann an einen, zwei oder drei Polyethylenglykol-Polymere geknüpft sein. Die Polyethylenglykol-Polymere können vorzugsweise Molekulargewichte von zwischen 500 und 20.000 aufweisen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das modifizierte Exendin oder Exendin-Agonist eine der Verbindungen 201–217, bevorzugter eine der Verbindungen 209, 210 und 213, oder eine der Verbindungen 201 und 202, oder eine der Verbindungen 216 und 217 (siehe unten stehendes Beispiel 4).
Die Polyethylenglykol-Polymere sind vorzugsweise an eine Amino-, Carboxyl- oder Thiogruppe geknüpft, und können durch N- oder C-Endigungen der Seitenketten von Lysin, Aspartinsäure, Glutaminsäure oder Cystein verknüpft sein, oder alternativ können die Polethylenglykol-Polymere mit Diamin- und Dicarboxylgruppen verknüpft sein. Das Exendin oder der Exendin-Agonist ist vorzugsweise an die Polyethylenglykol-Polymere durch eine Epsilon-Aminogruppe an einer Lysin-Aminosäure des Exendins oder Exendin-Agonisten geknüpft.
Mit "Exendin-Agonist" ist eine Verbindung gemeint, welche die Wirkungen von Exendinen, z.B. auf die Magenmotilität und Magenentleerung, nachahmt (das heißt, eine Verbindung, die wirksam an den Rezeptor bindet, an dem Exendine ihre Wirkung auf die Magenmotilität und Magenentleerung ausüben, vorzugsweise ein Analogon oder Derivat eines Exendins) oder eine Verbindung, die z.B. die Wirkungen von Exendin auf die Reduzierung der Nahrungsaufnahme durch Bindung an den Rezeptor oder die Rezeptoren nachahmt, an denen Exendin diese Wirkung ausübt. Die Wirkungen der Exendine oder Exendin-Agonisten können identifiziert, ausgewertet oder daraufhin gescreent werden unter Anwendung der hierin beschriebenen Methoden oder anderer im Fachgebiet bekannter Methoden zur Bestimmung der Exendin-Wirkungen.
In einem anderen Aspekt kann auch eine therapeutisch wirksame Menge eines Amylin-Agonisten dem Patienten verabreicht werden. In einem bevorzugten Aspekt ist der Amylin-Agonist ein Amylin oder ein Amylin-Agonist-Analogon, wie etwa ^25,28,29Pro-Human-Amylin (auch bekannt als "Pramlintid", und zuvor bezeichnet als "AC-137" und beschrieben in "Amylin Agonist Peptides and Uses Therefor", US-Patent Nr. 5.686.511, ausgegeben am 11. November 1997) oder Lachscalcitonin.
Vorzugsweise ist das Lebewesen ein Vertebrat, bevorzugter ein Säuger, und am bevorzugtesten ein Mensch. Das Exendin, Exendin-Agonist, oder modifizierte Exendin oder Exendin-Agonist der Erfindung kann parenteral verabreicht werden, bevorzugter durch Injektion. In einem am meisten bevorzugten Aspekt ist die Injektion eine periphere Injektion. Vorzugsweise werden etwa 1 μg–30 μg bis etwa 5 mg des modifizierten Exendins oder Exendin-Agonisten der Erfindung pro Tag verabreicht. Bevor zugter werden etwa 1–30 μg bis etwa 2 mg, oder etwa 1–30 μg bis etwa 1 mg des modifizierten Exendins oder Exendin-Agonisten der Erfindung pro Tag verabreicht. Am bevorzugtesten werden etwa 3 μg bis etwa 500 μg des modifizierten Exendins oder Exendin-Agonisten der Erfindung pro Tag verabreicht.
Definitionen
Gemäß der vorliegenden Erfindung und wie hierin verwendet, sind die folgenden Begriffe durch die folgenden Bedeutungen definiert, sofern nicht ausdrücklich anders angegeben.
Der Begriff "Aminosäure" bezieht sich auf natürliche Aminosäuren, nicht-natürliche Aminosäuren und Aminosäure-Analoga, alle in ihren D- und L-stereoisomeren Formen, sofern deren Strukturen solche stereoisomeren Formen erlauben. Zu natürlichen Aminosäuren zählen Alanin (Ala), Arginin (Arg), Asparagin (Asn), Aspartinsäure (Asp), Cystein (Cys), Glutamin (Gln), Glutaminsäure (Glu), Glycin (Gly), Histidin (His), Isoleucin (Ile), Leucin (Leu), Lysin (Lys), Methionin (Met), Phenylalanin (Phe), Prolin (Pro), Serin (Ser), Threonin (Thr), Tryptophan (Trp), Tyrosin (Tyr) und Valin (Val). Zu nicht-natürlichen Aminosäuren zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Azetidincarbonsäure, 2-Aminoadipinsäure, 3-Aminoadipinsäure, Beta-Alanin, Aminopropionsäure, 2-Aminobutyrsäure, 4-Aminobutyrsäure, 6-Aminocapronsäure, 2-Aminoheptansäure, 2-Aminoisobutyrsäure, 3-Aminoisobutyrsäure, 2-Aminopimelinsäure, tertiäres Butylglycin, 2,4-Diaminoisobutyrsäure, Desmosin, 2,2'-Diaminopimelinsäure, 2,3-Diaminopropionsäure, N-Ethylglycin, N-Ethylasparagin, Homoprolin, Hydroxylysin, Allo-Hydroxylysin, 3-Hydroxyprolin, 4-Hydroxyprolin, Isodesmosin, Allo-Isoleucin, N-Methylalanin, N-Methylglycin, N-Methylisoleucin, N-Methylpentylglycin, N-Methylvalin, Napthalanin, Norvalin, Norleucin, Ornithin, Pentylglycin, Pipecolinsäure und Thioprolin. Zu Aminosäure-Analoga zählen die natürlichen und nicht-natürlichen Aminosäuren, die chemisch entweder reversibel oder irrreversibel blokkiert oder an ihrer N-terminalen Aminogruppe oder deren Seitenkettengruppen modifiziert sind, wie zum Beispiel Methioninsulfoxid, Methioninsulfon, S-(Carboxyme-thyl)-Cystein, S-(Carboxymethyl)-Cysteinsulfoxid und S-(Carboxymethyl)-Cystein-sulfon.
Der Begriff "Aminosäure-Analogon" bezieht sich auf eine Aminosäure, bei der entweder die C-terminale Carboxygruppe, die N-terminale Aminogruppe oder die funktionelle Seitenkettengruppe zu einer anderen funktionellen Gruppe chemisch modifiziert worden ist. So ist zum Beispiel Aspartinsäure-(beta-Methylester) ein Aminosäure-Analogon der Aspartinsäure; N-Ethylglycin ist ein Aminosäure-Analogon von Glycin; oder Alanincarboxamid ist ein Aminosäure-Analogon von Alanin.
Der Begriff "Aninosäure-Rest" bezieht sich auf Radikale mit der Struktur: (1) -C(O)-R-NH-, worin R typischerweise -CH(R')- ist, worin R' eine Aminosäure-Seitenkette ist, typischerweise H oder ein kohlenstoffhaltiger Substituent;
oder (2), worin p 1, 2 oder 3 ist, die jeweils für den Azetidincarbonsäure-, Prolin- oder Pipecolinsäure-Rest stehen.
Der Begriff "nieder", der hierin in Verbindung mit organischen Radikalen wie Alkylgruppen genannt wird, definiert Gruppen mit bis zu und einschließlich etwa 6, vorzugsweise bis zu und einschließlich 4, und vorteilhafterweise ein oder zwei Kohlenstoffatomen. Solche Gruppen können geradkettig oder verzweigtkettig sein.
"Pharmazeutisch akzeptables Salz" umfasst Salze der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die von der Kombination dieser Verbindungen und einer organischen oder anorganischen Säure abgeleitet sind. In der Praxis entspricht die Verwendung der Salzform der Verwendung der basischen Form. Die Verbindungen sind sowohl in Form der freien Base als auch des Salzes nützlich, wobei beide Formen als innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung befindlich zu betrachten sind.
Darüber hinaus stehen die folgenden Abkürzungen für das folgende:

"ACN" oder "CH₃CN": bezieht sich auf Azetonitril.
"Boc", "tBoc" oder "Tboc": bezieht sich auf t-Butoxycarbonyl.
"DCC": bezieht sich auf N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid.
"Fmoc": bezieht sich Fluorenylmethoxycarbonyl".
"HBTU": bezieht sich auf 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat.
"HOBt": bezieht sich auf 1-Hydroxybenzotriazolmonohydrat.
"homoP" oder "hPro": bezieht sich auf Homoprolin.
"MeAla" oder "Nme": bezieht sich auf N-Methylalanin.
"naph": bezieht sich auf Naphthylalanin.
"pG" oder "pGly": bezieht sich Pentylglycin.
"tBuG": bezieht sich auf tertiäres Butylglycin.
"ThioP" oder "tPro": bezieht sich auf Thioprolin.
"3Hyp": bezieht sich auf 3-Hydroxyprolin.
"4Hyp": bezieht sich auf 4-Hydroxyprolin.
"NAG": bezieht sich auf N-Alkylglycin.
"NAPG": bezieht sich auf N-Alkylpentylglycin.
"Norval": bezieht sich auf Norvalin.
"Norleu": bezieht sich auf Norleucin.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen, und aus den Ansprüchen, ersichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Aminosäuresequenz für Exendin-3 (SEQ ID NR. 1).
2 zeigt die Aminosäuresequenz für Exendin-4 (SEQ ID NR: 2).
3 zeigt die Aminosäuresequenzen für bestimmte, bei der vorliegenden Erfindung nützliche Exendin-Agonist-Verbindungen (SEQ ID NRn. 10 bis 40).
4 zeigt die Aminosäuresequenzen für bestimmte Verbindungen der vorliegenden Erfindung, Verbindungen 1–174.
5 zeigt ein Schaubild, das die Wirkung einer funktionellen Nephrektomie auf die Exendin-4-Ausscheidung darstellt.
6 zeigt ein Schaubild, das den terminalen Zerfall der Exendin-4-Plasmaspiegel in nephrektomisierten und simulierten Patienten darstellt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Unterdrückung und/oder Senkung des Glucagons in einem Lebewesen durch die Verabreichung eines Exendins, eines Exendin-Agonisten, oder eines modifizierten Exendins oder Exendin-Agonisten, wobei ein Exendin oder Exendin-Agonist-Peptid an ein oder mehrere Polyethylenglykol-Polymere oder eine andere Verbindung geknüpft ist, die zur Erhöhung des Molekulargewichts nützlich ist. Die Erfindung kann zum Beispiel in der Behandlung der Hyperglucagonämie oder anderer Zustände nützlich sein, bei denen niedrigere Spiegel an Glucagon oder die Unterdrückung der Glucagonsekretion von Nutzen sind. Zu solchen Zuständen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein Glucagonom und ein nekrolytisches migratorisches Erythem.
Modifizierte Exendine und Exendin-Agonisten
Die modifizierten Exendine und Exendin-Agonisten der vorliegenden Erfindung umfassen zum Beispiel ein oder mehrere PEG-Polymere, die an ein Exendin oder Exendin-Agonisten geknüpft sind, wie etwa ein natürlich vorkommendes Exendin, ein synthetisches Exendin oder ein Exendin-Agonist, geknüpft sind.
Exendin-4
Exendin-4 ist ein natürlich vorkommendes Peptid, das aus den Speichelsekretionen des Gila-Monsters isoliert wird. Die Testung an Tieren von Exendin-4 hat gezeigt, dass Sein Vermögen, die Blutglucose zu senken, für mehrere Stunden fortdauert. Exendin-4, ein Polypeptid aus 39 Aminosäuren, wird unter Anwendung der hierin beschriebenen Festphasen-Synthese synthetisiert, wobei gezeigt wurde, dass dieses synthetische Material zu dem des nativen Exendin-4 identisch ist.
Wie hierin beschrieben, ist die nicht-klinische Pharmakologie von Exendin-4 untersucht worden. Im Gehirn bindet Exendin-4 prinzipiell an die Area postrema- und Nucleus tractus solitarius-Region im Hinterhirn und an das subfornikale Organ im Vorderhirn. Die Exendin-4-Bindung ist im Ratten- und Mäusegehirn und -Niere beobachtet worden. Die Strukturen, an die Exendin-4 in der Niere bindet, sind unbekannt.
Verschiedene Experimente haben die biologischen Wirkungen von Exendin-4 und GLP-1 verglichen und ein günstigeres Eigenschaftenspektrum für Exendin-4 nachgewiesen. Eine einzige subkutane Dosis an Exendin-4 senkte die Plasmaglucose in db/db (diabetischen) und ob/ob (diabetischen fettleibigen) Mäusen um bis zu 40%. In Zucker Diabetic Fatty-(ZDF)-Ratten senkte eine 5-wöchige Behandlung mit Exendin-4 den HbA_1c (ein Maß des glykosylierten Hämoglubins, das zur Bewertung der Plasmaglucosespiegel verwendet wird) um bis zu 41%. Die Insulin-Empfindlichkeit war nach einer 5-wöchigen Behandlung bei fettleibigen ZDF-Ratten ebenfalls um 76% verbessert. Bei Glucose-intoleranten Primaten wurden ebenfalls dosisabhängige Abnahmen bei der Plasmaglucose beobachtet.
Eine insulinotrope Wirkung von Exendin-4 wurde auch bei Nagern beobachtet, indem die Insulinreaktion auf Glukose um über 100% bei nicht-gefasteten Harlan Spraque Dawley-(HSD)-Ratten und um bis zu dem 10-fachen bei Nicht-Fasten gelassenen db/db-Mäusen verbessert war. Höhere Vorbehandlungs-Plasmaglukosekonzentrationen waren mit höheren Glukose-senkenden Wirkungen verbunden. So scheint die beobachtete Glukose-senkende Wirkung von Exendin-4 Glukose-abhängig zu sein, und minimal zu sein, wenn die Tiere bereits euglykämisch sind.
Exendin-4 verlangsamte dosisabhängig die Magenentleerung bei HSD-Ratten und war ~90-mal potenter als GLP-1 bei dieser Wirkung. Es wurde auch von Exendin-4 gezeigt, dass die Nahrungsaufnahme bei NIH/Sw-(Swiss)-Mäusen nach der peripheren Verabreichung vermindert und es mindestens 1000-mal potenter alS GLP-1 bei dieser Wirkung war. Exendin-4 reduziert die Plasmaglucagon-Konzentrationen um etwa 40% bei anästhesierten ZDF-Ratten während hyperinsulinämischen, hyperglykämischen Clamp-Bedingungen, doch beeinflusste die Plasmaglucagon-Konzentrationen während euglykämischer Bedingungen in normalen Ratten nicht. Von Exendin-4 wurde gezeigt, dass es das Körpergewicht von fettleibigen ZDF-Ratten in dosisabhängiger Weise senkte, wohingegen bei schlanken ZDF-Ratten die beobachtete Abnahme im Körpergewicht vorübergehend zu sein scheint.
Durch seine Wirkungen auf die Senkung des Glucagons und Unterdrückung der Glucagonsekretion, werden Exendine, Exendin-Agonisten, und modifizierte Exendine oder Exendin-Agonisten, die zum Beispiel Exendin-4 enthalten, bei Menschen nützlich sein, für die ein gesenkter Glucagonspiegel von Vorteil wäre, zum Beispiel Menschen mit Glucagonom und nekrolytischem migratorischem Erythem, und Menschen mit Diabetes, unabhängig davon, ob sie die Fähigkeit zum Sekretieren von Insulin beibehalten. Siehe Beispiel 5.
Die Toxikologie von Exendin-4 wurde in Einzeldosis-Studien bei Mäusen, Ratten und Affen, in Wiederholungsdosis-(bis zu 28 aufeinanderfolgende tägliche Dosen)-Studien bei Ratten und Affen und in in vitro-Tests der Mutagenität und Chromosomenveränderungen untersucht. Bis heute sind keine Todesfälle aufgetreten, und es wurden keine behandlungsbezogenen Änderungen bei Hämatologie oder klinischer Chemie oder grobe oder mikroskopische Gewebeveränderungen beobachtet. Exendin-4 wurde als nicht-mutagen nachgewiesen und bewirkte keine chromosomalen Abweichungen bei den getesteten Konzentrationen (bis zu 5000 μg/ml).
Zur Bekräftigung der Untersuchung der nicht-klinischen Pharmakokinetik und des Metabolismus von Exendin-4 wurde eine Reihe von Immunosassays entwickelt. Ein Radioimmunoassay von beschränkter Empfindlichkeit (~100 pM) wurde für anfängliche pharmakokinetische Studien verwendet. Ein „two-site IRMA-Assay" für Exendin-4 wurde anschließend bei einer Untergrenze der Quantifizierung von 15 pM validiert. Die Bioverfügbarkeit von Exendin-4 wurde bei subkutaner Gabe mit etwa 50–80% unter Verwendung des Radioimmunoassays befunden. Dies war dem ähnlich, was nach intraperitonealer Verabreichung festgestellt wurde (48–60%). Spitzen-Plasmakonzentrationen (C_max) traten nach 30 bis 43 Minuten auf (T_max). Sowohl C_max als auch AUC-Werte wurden monoton auf die Dosis bezogen. Die scheinbare terminale Halbwertszeit für Exendin-4 betrug bei subkutaner Gabe etwa 90–110 Minuten. Dies war beträchtlich länger als die 14–41 Minuten, die nach intravenöser Dosierung festgestellt wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Anwendung des IRMA-Assays erhalten. Abbaustudien mit Exendin-4 im Vergleich zu GLP-1 zeigen, dass Exendin-4 relativ resistent gegenüber einem Abbau ist.
Exendin-Agonisten
Die Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR) von Exendin wurde für Strukturen untersucht, die möglicherweise mit der antidiabetischen Aktivität von Exendin in Beziehung stehen, für seine Stabilität im Stoffwechsel und für die Verbesserung seiner physikalischen Eigenschaften, insbesondere, was die Peptidstabilität und die Zugänglichkeit für alternative Verabreichungssysteme anbetrifft, und verschiedene Exendin-Agonist-Peptidverbindungen sind erfunden worden. Exendin-Agonisten umfassen die Exendin-Peptid-Analoga, bei denen ein oder mehrere natürlich vorkommende Aminosäuren eliminiert oder durch ein oder mehrere andere Aminosäuren ersetzt sind. Bevorzugte Exendin-Agonisten sind Agonist-Analoga von Exendin-4.
Die Aktivität als Exendin-Agonisten kann zum Beispiel durch die Aktivität in den nachstehend beschriebenen Assays angegeben werden. Wirkungen von Exendinen oder Exendin-Agonisten auf die Magenmotilität und Magenentleerung können identifiziert, ausgewertet oder daraufhin gescreent werden unter Anwendung der hierin beschriebenen Methoden oder anderer im Fachgebiet bekannter oder äquivalenter Methoden zur Bestimmung der Magenmotilität. Negative Rezeptor-Assays oder Screenings für Exendin-Agonist-Verbindungen oder Kandidat-Exendin-Agonist-Verbindungen, wie z.B. ein Amylinrezeptor-Assay/Screening unter Verwendung eines Amylinrezeptor-Präparats, wie beschrieben in US-Patent Nr. 5.264.327, ausgegeben am 23. November 1993, ein oder mehrere Calcitoninrezeptor-Assays/Screenings unter Verwendung beispielsweise der T47D- und MCF7-Brustkarzinomzellen, die Calciumrezeptoren enthalten, gekoppelt an die Stimulierung der Adenylcyclase-Aktivität, und/oder ein CGRP-Rezeptor-Assay/Screening unter Verwendung beispielsweise von SK-N-MC-Zellen.
Eine solche Methode zur Anwendung in der Identifizierung oder Auswertung der Fähigkeit einer Verbindung, die Magenmotilität zu verlangsamen, umfasst: (a) Zusammenbringen einer Testprobe und eines Testsystems, wobei die Testprobe ein oder mehrere Testverbindungen enthält, wobei das Testsystem ein System für die Auswertung der Magenmotilität ist, wobei das System dadurch gekennzeichnet ist, dass es, zum Beispiel, eine erhöhte Plasmaglucose als Reaktion auf die Einführung in das System von Glucose oder einer Mahlzeit zeigt; und (b) Bestimmen des Vorhanden seins oder des Umfangs eines Anstiegs der Plasmaglucose im System. Positive und/oder negative Kontrollen können ebenfalls angewendet werden.
Ebenfalls vom Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst sind pharmazeutisch akzeptable Salze der Verbindungen der Formeln (VII–VIII) und pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Verbindungen und Salze davon enthalten.
FORMEL VII
Verbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind die Exendin-Agonist-Verbindungen der Formel (VII) [SEQ ID NR. 47]:
worin Xaa₁ His, Arg, Tyr ist; Xaa₂ Ser, Gly, Ala oder Thr ist; Xaa₃ Asp oder Glu ist; Xaa₄ Phe, Tyr oder Naphthylalanin ist; Xaa₅ Thr oder Ser ist; Xaa₆ Ser oder Thr ist; Xaa₇ Asp oder Glu ist; Xaa₈ Leu, Ile, Val, Pentylglycin oder Met ist; Xaa₉ Leu, Ile, Pentylglycin, Val oder Met ist; Xaa₁₀ Phe, Tyr oder Naphthylalanin ist; Xaa₁₁ Ile, Val, Leu, Pentylglycin, tert-Butylglycin oder Met ist; Xaa₁₂ Glu oder Asp ist; Xaa₁₃ Trp, Phe, Tyr oder Naphthylalanin ist; Xaa₁₄, Xaa₁₅, Xaa₁₆ und Xaa₁₇ unabhängig Pro, Homoprolin, 3Hyp, 4Hyp, Thioprolin, N-Alkylglycin, N-Alkylpentylglycin oder N-Alkylalanin sind; Xaa₁₈ Ser, Thr oder Tyr ist; und Z -OH oder -NH₂ ist; unter der Voraussetzung, dass die Verbindung weder die Formel der SEQ ID NR. 1 noch 2 aufweist. Bevorzugte N-Alkylgruppen für N-Alkylglycin, N-Alkylpentylglycin und N-Alkylalanin umfassen niedere Alkylgruppen von vorzugsweise 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen, bevorzugter von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Geeignete Verbindungen umfassen solche mit den Aminosäuresequenzen der SEQ ID NRn. 10 bis 40. Eben falls nützlich in der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutisch akzeptable Salze der Verbindungen der Formel (VII).
Bevorzugte Exendin-Agonist-Verbindungen umfassen solche, worin Xaa₁ His oder Tyr ist. Bevorzugter ist Xaa₁ His.
Bevorzugt sind solche Verbindungen, worin Xaa₂ Gly ist.
Bevorzugt sind solche Verbindungen, worin Xaa₉ Leu, Pentylglycin oder Met ist.
Bevorzugte Verbindungen umfassen solche, worin Xaa₁₃ Trp oder Phe ist.
Ebenfalls bevorzugt sind Verbindungen, worin Xaa₄ Phe oder Naphthylalanin ist; Xaa₁₁ Ile oder Val ist, und Xaa₁₄, Xaa₁₅, Xaa₁₆ und Xaa₁₇ unabhängig ausgewählt sind aus Pro, Homoprolin, Thioprolin oder N-Alkylalanin. Vorzugsweise weist N-Alkylalanin eine N-Alkylgruppe von 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen auf.
Gemäß eines besonders bevorzugten Aspekts sind Xaa₁₅, Xaa₁₆ und Xaa₁₇ dieselben Aminosäure-Reste.
Bevorzugt sind Verbindungen, worin Xaa₁₈ Ser oder Tyr ist, bevorzugter Ser.
Vrzugsweise ist Z -NH₂.
Gemäß eines Aspekts sind Verbindungen der Formel (VII) bevorzugt, worin Xaa₁ His oder Tyr ist, bevorzugter His; Xaa₂ Gly ist; Xaa₄ Phe oder Naphthylalanin ist; Xaa₉ Leu, Pentylglycin oder Met ist; Xaa₁₀ Phe oder Naphthylalanin ist; Xaa₁₁ Ile oder Val ist; Xaa₁₄, Xaa₁₅, Xaa₁₆ und Xaa₁₇ unabhängig ausgewählt sind aus Pro, Homoprolin, Thioprolin oder N-Alkylalanin; und Xaa₁₈ Ser oder Tyr ist, bevorzugter Ser. Bevorzugter ist Z -NH₂.
Gemäß eines besonders bevorzugten Aspekts umfassen besonders bevorzugte Verbindungen solche der Formel (VII), worin: Xaa₁ His oder Arg ist; Xaa₂ Gly ist; Xaa₃ Asp oder Glu ist; Xaa₄ Phe oder Naphthylalanin ist; Xaa₅ Thr oder Ser ist; Xaa₆ Ser oder Thr ist; Xaa₇ Asp oder Glu ist; Xaa₈ Leu oder Pentylglycin ist; Xaa₉ Leu oder Pentylglycin ist; Xaa₁₀ Phe oder Naphthylalanin ist; Xaa₁₁ Ile, Val oder t-Butylglycin ist; Xaa₁₂ Glu oder Asp ist; Xaa₁₃ Trp oder Phe ist; Xaa₁₄, Xaa₁₅, Xaa₁₆ und Xaa₁₇ unabhängig Pro, Homoprolin, Thioprolin oder N-Methylalanin ist; Xaa₁₈ Ser oder Tyr ist; und Z -OH oder -NH₂ ist; unter der Voraussetzung, dass die Verbindung weder die Formel der SEQ ID NR. 1 noch 2 aufweist. Bevorzugter ist Z -NH₂. Besonders bevorzugte Verbindungen umfassen solche mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NRn. 10, 11, 22, 23, 24, 27, 29, 36, 37 und 40.
Gemäß eines besonders bevorzugten Aspekts werden Verbindungen bereitgestellt, worin Xaa₉ Leu, Ile, Val oder Pentylglycin ist, bevorzugter Leu oder Pentylglycin, und Xaa₁₃ Phe, Tyr oder Naphthylalanin ist, bevorzugter Phe oder Naphthylalanin. Bei diesen Verbindungen wird davon ausgegangen, dass sie eine vorteilhafte Wirkdauer zeigen und weniger einem oxidativen Abbau sowohl in vitro als auch in vivo, als auch während der Synthese der Verbindung, unterliegen.
FORMEL VIII
Ebenfalls bereitgestellt werden Verbindungen, die beschrieben sind in der PCT-Anmeldung der Seriennummer PCT/US98/16387, eingereicht am 6. August 1998, mit dem Titel "Novel Exendin Agonist Compounds", einschließlich der Verbindungen der Formel (VIII) [SEQ ID NR. 48]:
worin Xaa₁ His, Arg, Tyr oder 4-Imidazopropionyl ist; Xaa₂ Ser, Gly, Ala oder Thr ist; Xaa₃ Asp oder Glu ist; Xaa₄ Phe, Tyr oder Naphthylalanin ist; Xaa₅ Thr oder Ser ist; Xaa₆ Ser oder Thr ist; Xaa₇ Asp oder Glu ist; Xaa₈ Leu, Ile, Val, Pentylglycin oder Met ist; Xaa₉ Leu, Ile, Pentylglycin, Val oder Met ist; Xaa₁₀ Phe, Tyr oder Naphthyllanin ist; Xaa₁₁ Ile, Val, Leu, Pentylglycin, tert-Butylglycin oder Met ist; Xaa₁₂ Glu oder Asp ist; Xaa₁₃ Trp, Phe, Tyr oder Naphthylalanin ist; X₁ Lys Asn, Asn Lys, Lys-NH^ε-R Asn, Asn Lys-NH^ε-R ist, worin R Lys, Arg, C₁-C₁₀-geradkettiges oder verzweigtes Alkanoyl oder Cycloalkylalkanoyl ist; Xaa₁₄, Xaa₁₅, Xaa₁₆ und Xaa₁₇ unabhängig Pro, Homoprolin, 3Hyp, 4Hyp, Thioprolin, N-Alkylglycin, N-Alkylpentylglycin oder N-Alkylalanin sind; Xaa₁₈ Ser, Thr oder Tyr ist; und Z -OH oder -NH₂ ist; unter der Voraussetzung, dass die Verbindung weder die Formel der SEQ ID NR. 1 noch 2 aufweist. Geeignete Verbindungen der Formel (VIII) umfassen Verbindungen, wie beschrieben in der PCT-Anmeldung der Seriennummer PCT/US98/16387, eingereicht am 6. August 1998, mit dem Titel "Novel Exendin Agonist Compounds", welche die Aminosäuresequenzen der SEQ ID Nrn. 37–40 enthalten.
Bevorzugte Exendin-Agonist-Verbindungen der Formel (VIII) umfassen solche, worin Xaa₁ His, Tyr oder 4-Imidazopropionyl ist. Bevorzugter ist Xaa₁ His oder 4-Imidazopropionyl.
Bevorzugt sind solche Verbindungen der Formel (VIII), worin Xaa₂ Gly ist.
Bevorzugt sind solche Verbindungen der Formel (VIII), worin Xaa₉ Leu, Pentylglycin oder Met ist.
Bevorzugt sind solche Verbindungen der Formel (VIII), worin Xaa₁₃ Trp oder Phe ist.
Bevorzugt sind solche Verbindungen der Formel (VIII), worin X₁ Lys Asn oder Lys-NH^ε-R Asn ist, worin R Lys, Arg, C₁-C₁₀-geradkettiges oder verzweigtes Alkanoyl ist.
Ebenfalls bevorzugt sind Verbindungen der Formel (VIII), worin Xaa₄ Phe oder Naphthylalanin ist; Xaa₁₀ Phe oder Naphthylalanin ist; Xaa₁₁ Ile oder Val ist und Xaa₁₄, Xaa₁₅, Xaa₁₆ und Xaa₁₇ unabhängig ausgewählt sind aus Pro, Homoprolin, Thioprolin oder N-Alkylalanin. Gemäß eines besonders bevorzugten Aspekts ist Xaa₁₈ Ser oder Tyr. Bevorzugt sind solche Verbindungen, worin Xaa₁₈ Ser ist. Vorzugsweise ist Z -NH₂.
Gemäß eines bevorzugten Aspekts sind Verbindungen der Formel (VIII) bevorzugt, worin Xaa₄ Phe oder Naphthylalanin ist; Xaa₁₀ Phe oder Naphthylalanin ist; Xaa₁₁ Ile oder Val ist; X₁ Lys Asn oder Lys-NH^ε-R Asn ist, worin R Lys, Arg, C₁-C₁₀-geradkettiges oder verzweigtes Alkanoyl ist und Xaa₁₄, Xaa₁₅, Xaa₁₆ und Xaa₁₇ unabhängig ausgewählt sind aus Pro, Homoprolin, Thioprolin oder N-Alkylalanin.
Herstellung der modifizierten Exendine und Exendin-Agonisten
Die modifizierten Exendine und Exendin-Agonisten der vorliegenden Erfindung können durch Knüpfen eines oder mehrerer Polyethylenglykol-Polymere an ein Exendin oder Exendin-Agonisten hergestellt werden. Die Synthese der Exendine und Exendin-Agonisten wird daher zunächst beschrieben, gefolgt von der Methodologie zur Knüpfung des/der Polyethylenglykol-Polymers/e an das Exendin oder den Exendin-Agonisten.
Herstellung von Exendinen und Exendin-Agonisten
Exendine und Exendin-Agonist-Verbindungen, wie etwa die hierin beschriebenen Exendin-Analoga und Exendin-Derivate, können durch Peptidreinigung präpariert werden, wie beschrieben beispielsweise bei Eng, et al., J. Biol. Chem. 265: 20259–62, 1990; und Eng, et al., J. Biol. Chem. 267: 7402–05, 1992. Alternativ können Exendine und Exendin-Agonist-Peptide mittels den Fachleuten des Gebiets bekannter Methoden präpariert werden, wie zum Beispiel beschrieben bei Raufman, et al. (J. Biol. Chem. 267: 21432–37, 1992), unter Anwendung standardmäßiger Festphasen-Peptidsynthesetechniken und vorzugsweise eines automatischen oder halbautomatischen Peptidsynthesegeräts. Die Verbindungen, die die aktiven Inhaltsstoffe der Formulierungen und Dosierungen der vorliegenden Erfindung darstellen, können unter Anwendung standardmäßiger Festphasen-Peptidsynthesetechniken und vorzugsweise eines automatischen oder halbautomatischen Peptidsynthesegeräts präpariert werden. Typischerweise werden unter Anwendung dieser Techniken eine α-N-Carbamoyl-geschützte Aminosäure und eine Aminosäure, die an die wachsende Peptidkette an einem Harz gebunden ist, bei Raumtemperatur in einem inerten Lö sungsmittel gekoppelt, wie etwa Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidinon oder Methylenchlorid in Gegenwart von Kopplungsmitteln, wie etwa Dicyclohexylcarbodiimid und 1-Hydroxybenzotriazol in Gegenwart einer Base, wie etwa Diisopropylethylamin, gekoppelt. Die α-N-Carbamoyl-Schutzgruppe wird vom resultierenden Peptidharz unter Verwendung eines Reagenz, wie etwa einer Trifluoressigsäure oder Piperidin, entfernt, und die Kopplungsreaktion wird mit der nächsten gewünschten N-geschützten Aminosäure, die an die Peptidkette angefügt werden soll, fortgesetzt. Geeignete N-Schutzgruppen sind im Fachgebiet wohlbekannt, wobei t-Butyloxycarbonyl (tBoc) und Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) hierin bevorzugt sind.
Die Lösungsmittel, Aminosäure-Derivate und 4-Methylbenzhydryl-Aminharz, die im Peptidsynthesegerät verwendet werden, können von Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) bezogen werden. Die folgenden Seitenketten-geschützten Aminosäuren können bezogen werden von Applied Biosystems, Inc.: BSD-112344.1-Arg(Pmc), Boc-THr(Bz1), Fmoc-Thr(t-Bu), Boc-Ser(Bzl), Fmoc-Ser(t-Bu), Boc-Tyr(BrZ), Fmoc-Tyr(t-Bu), Boc-Lys(Cl-Z), Fmoc-Lys(Boc), Boc-Glu(Bzl), Fmoc-Glu(t-Bu), Fmoc-His(Trt), Fmoc-Asn(Trt) und Fmoc-Gln(Trt). Boc-His(BOM) kann bezogen werden von Applied Biosystems, Inc. oder Bachem Inc. (Torrance, CA). Anisol, Dimethylsulfid, Phenol, Ethandithiol und Thioanisol können erhalten werden von Aldrich Chemical Compony (Milwaukee, WI). Air Products und Chemikalien liefert HF (Allentown, PA). Ethylether, Essigsäure und Methanol können bezogen werden von Fisher Scientific (Pittsburgh, PA).
Die Festphasen-Peptidsynthese kann mit einem automatischen Peptidsynthesegerät (Modell 430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) unter Verwendung des NMP/HOBt-(Option 1)-Systems und der tBoc- oder Fmoc-Chemie (siehe Applied Biosystems-Gebrauchsanleitung für den ABI 430A Peptid Synthesizer, Version 1.3B, 1. Juli 1988, Abschnitt 6, S. 49–70, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) unter Verkappung vorgenommen werden. Die Boc-Peptidharze können mit HF gespalten werden (–50°C bis 0°C, 1 Stunde). Das Peptid kann vom Harz abwechselnd mit Wasser und Essigsäure extrahiert und die Filtrate lyophilisiert werden. Die Fmoc-Peptidharze können gemäß standardmäßiger Methoden gespalten werden (Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc. 1990, S. 6–12). Die Peptide können auch unter Verwendung eines Advanced Chem Tech Synthesizers (Modell MPS 350, Louisville, Kentucky) zusammengebaut werden.
Die Peptide können mittels RP-HPLC (präparativ und analytisch) unter Verwendung eines Waters Delta Prep 3000 Systems gereinigt werden. Eine präparative C4-, C8- oder C18-Säule (10 μm, 2,2 × 25 cm; Vydac, Hesperia, CA) kann zur Isolierung der Peptide verwendet und die Reinheit unter Verwendung einer analytischen C4-, C8- oder C18-Säule (5 μm, 0,46 × 25 cm; Vydac) bestimmt werden. Die Lösungsmittel (A = 0,1%, TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/CH₃CN) können der analytischen Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min und der präparativen Säule bei 15 ml/min zugeführt werden. Die Aminosäure-Analysen können auf dem Waters Pico Tag-System vorgenommen und unter Verwendung des Maxima-Programms prozessiert werden. Die Peptide können mittels Dampfphasen-Säurehydrolyse (115°C, 20–24 Std.) hydrolysiert werden. Die Hydrolysate können mittels standardmäßiger Methoden derivatisiert und analysiert werden (Cohen, et al., The Pico Tag Method: A Manual of Advanced Techniques for Amino Acid Analysis, S. 11–52, Millipore Corporation, Milford, MA (1989)). Eine Fast Atom Bombardment-Analyse kann mittels M-Scan, Incorporated (West Chester, PA) durchgeführt werden. Die Massenkalibration kann unter Verwendung von Cäsiumiodid oder Cäsiumiodid/Glycerol vorgenommen werden. Die Plasmadesorptions/Ionisationsanalyse unter Anwendung des Flugzeitnachweises kann auf einem Applied Biosystems Bio-Ion 20-Massenspektrometers durchgeführt werden. Die Elektrospray-Massenspektroskopie kann auf einer VG-Trio-Maschine vorgenommen werden.
Die bei den Formulierungen und Dosierungsformen der Erfindung nützlichen Peptid-Wirkstoffverbindungen können auch unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken mittels im Fachgebiet bekannter Methoden präpariert werden. Siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor, (1989). Alternativ können solche Verbindungen mittels Homogenphasen-Peptidsynthese-Methoden hergestellt werden. Bei der vorliegenden Erfindung nützliche Nicht-Peptidverbindungen können durch im Fachgebiet bekannte Methoden hergestellt werden. Zum Beispiel können Phosphat-enthaltende Aminosäuren und Peptide, die solche Aminosäuren enthalten, unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten Methoden hergestellt werden. Siehe z.B. Bartlett and Landen, Biorg. Chem. 14: 356–377 (1986).
Konjugation von Polyethylenglykol-Polymeren
Es gibt mehrere Strategien zur Kopplung von PEG an Peptide/Proteine. Siehe Int. J. Hematology 68: 1 (1998); Bioconjugate Chem. 6: 150 (1995) und Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Sys. 9: 249 (1992). Fachleute des Gebiets werden daher in der Lage sein, diese wohlbekannten Techniken zur Knüpfung von ein oder mehreren Polyethylenglykol-Polymeren an die hierin beschriebenen Exendine und Exendin-Agonisten zu nützen. Geeignete Polyethlenglykol-Polymere sind typischerweise im Handel erhältlich oder können mittels den Fachleuten des Gebiets wohlbekannten Techniken hergestellt werden. Die Polyethylenglykol-Polymere weisen vorzugsweise Molekulargewichte von zwischen 500 und 20.000 auf und können verzweigt- oder geradkettige Polymere sein.
Die Bindung eines PEG an ein intaktes Peptid oder Protein kann durch Koppeln an Amino-, Carboxyl- oder Thiolgruppen erreicht werden. Diese Gruppen werden typischerweise die N- und C-Endigungen sein und sich an den Seitenketten solcher natürlich vorkommender Aminosäuren wie Lysin, Aspartinsäure, Glutaminsäure und Cystein befinden. Da Exendin-4 und andere Exendine und Exendin-Agonisten mittels Festphasen-Peptidchemietechniken hergestellt werden können, kann eine Vielzahl von Komponenten, die Diamino- und Dicarboxylgruppen mit orthogonalen Schutzgruppen enthalt, zur Konjugation an PEG eingeführt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Konjugation eines Exendins oder Exendin-Agonisten an ein oder mehrere andere Polymere als Polyethylenglykol bereit, welche die Nierenausscheidung in einer ähnlichen Weise wie Polyethylenglykol regulieren können. Zu Beispielen solcher Polymere zählen Albumin und Gelatine. Siehe Gombotz und Pettit, Bioconjugate Chem, 6: 332–351; 1995.
Nutzen
Die hierin beschriebenen Formulierungen und Dosierungen sind im Hinblick auf ihre pharmakologischen Eigenschaften nützlich. Insbesondere besitzen die hierin be schriebenen Verbindungen eine Aktivität als Mittel zur Senkung der Glucagonspiegel und Unterdrückung der Glucagonsekrektion, wie durch die Fähigkeit zur Senkung der Glucagonspiegel bei Tieren und Menschen nachgewiesen. Sie können zur Behandlung von Zuständen und Erkrankungen verwendet werden, die durch Senkung der Glucagonspiegel und Unterdrückung der Glucagonsekretion gemildert werden können.
Die oben genannten Verbindungen können Salze mit verschiedenen anorganischen und organischen Säuren und Basen bilden. Zu solchen Salzen zählen Salze, die mit organischen und anorganischen Säuren, zum Beispiel HCl, HBr, H₂SO₄, H₃PO₄, Trifluoressigsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Methansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Apfelsäure, Fumarsäure und Kampfersulfonsäure hergestellt sind. Zu Salzen, die mit Basen hergestellt werden, zählen Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze, z.B. Natrium- und Kaliumsalze, und Erdalkalisalze, z.B. Calcium- und Magnesiumsalze. Acetat-, Hydrochlorid- und Trifluoracetatsalze sind bevorzugt. Die Salze können mittels herkömmlicher Methoden, zum Beispiel durch Umsetzen der freien Säure- oder Basenformen des Produkts mit ein oder mehreren Äquivalenten der entsprechenden Base oder Säure in einem Lösungsmittel oder Medium, in welchem das Salz unlöslich ist, oder in einem Lösungsmittel, wie etwa Wasser, welches dann in vacuo entfernt wird, oder durch Gefriertrocknen oder durch Austauschen der Ionen eines bestehenden Salzes durch ein anderes Ion auf einem geeigneten Ionenaustauscherharz, entfernt werden.
Formulierung und Verabreichung
Die Formulierungen und Dosierungsformen des modifizierten Exendins und Exendin-Agonisten der Erfindung sind im Hinblick auf ihre Exendin-artigen Wirkungen nützlich und können in bequemer Weise in Form von zur parenteralen (einschließlich intravenösen, intramuskulären und subkutanen) Verabreichung geeigneten Formulierungen bereitgestellt werden. Ebenfalls beschrieben hierin sind Formulierungen und Dosierungsformen, die bei alternativen Verabreichungswegen, einschließlich dem oralen, nasalen, bukkalen, sublingualen und pulmonalen, nützlich sind.
Die Durchführbarkeit der alternativen Verabreichungswege für Exendin-4 ist durch Messen von Exendin-4 im Kreislauf in Verbindung mit der Beobachtung einer biologischen Reaktion, wie etwa einer Senkung der Plasmaglucose bei diabetischen Tieren nach der Verabreichung, untersucht worden. Die Durchgang von Exendin-4 ist durch mehrere Flächen, nämlich den Atemweg (nasale, tracheale und pulmonale Wege) und den Darm (sublinguale, Magensonden- und intraduodenale Wege) untersucht worden. Die biologische Wirkung und das Auftreten von Exendin-4 im Blut sind bei jedem Verabreichungsweg über den Atemweg, und bei dem sublingual und durch Sonde gegebenen Peptid über den Magendarmtrakt, beobachtet worden. Die intratracheale Verabreichung, nasale Verabreichung, Verabreichung über den Darm und sublinguale Verabreichung sind alle beschrieben worden.
In einigen Fällen wird es sich als günstig erweisen, ein modifiziertes Exendin oder Exendin-Agonist und ein anderes Anti-Glucagonmittel, wie etwa ein Amylin oder einen Amylin-Agonisten, in einer einzigen Zusammensetzung oder Lösung für die gemeinsame Verabreichung bereitzustellen. In anderen Fällen mag es vorteilhafter sein, ein anderes Anti-Glucagonmittel separat von dem Exendin, Exendin-Agonisten oder modifizierten Exendin oder Exendin-Agonisten, zu verabreichen. In noch anderen Fällen mag es von Nutzen sein, ein Exendin, Exendin-Agonist, oder modifiziertes Exendin oder Exendin-Agonist entweder gemeinsam formuliert oder separat mit anderen Glucagon-senkenden Mitteln, wie etwa Amylin, bereitzustellen. Ein geeignetes Verabreichungsformat lässt sich am besten durch einen praktischen Arzt für jeden Patienten individuell bestimmen. Geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger und deren Formulierung sind beschrieben in den Formulierungs-Standardwerken, z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences von E. W. Martin. Siehe auch Wang, Y. J. und Hanson, M. A. " Parenteral Formulations of Proteins and Peptids: Stability and Stabilizers." Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report Nr. 10, Ergänz. 42: 2S (1988).
Bei der Erfindung nützliche Verbindungen können als parenterale Zusammensetzungen zur Injektion oder Infusion bereitgestellt werden. Sie können beispielsweise in einem inerten Öl, geeigneterweise einem Speiseöl wie Sesam-, Erdnuss-, Olivenöl oder einem anderen geeigneten Träger, suspendiert werden. Vorzugsweise werden sie in einem wässrigen Träger, zum Beispiel einer isotonischen Pufferlösung, bei einem pH-Wert von etwa 5,6 bis 7,4 suspendiert. Diese Zusammensetzungen können mittels herkömmlicher Sterilisationstechniken sterilisiert werden, oder können steril filtriert werden. Die Zusammensetzungen können nach Bedarf pharmazeutisch geeignete Hilfssubstanzen, um sie physiologischen Bedingungen anzunähern, zum Beispiel pH-Puffermittel, enthalten. Zu nützlichen Puffern zählen zum Beispiel Natriumacetat/Essigsäure-Puffer. Eine Form von verzögernd freisetzendem Speicher- oder "Depot"-Präparat kann verwendet werden, so dass therapeutisch wirksame Mengen des Präparats über viele Stunden oder Tage nach einer transdermalen Injektion oder anderen Verabreichungsform in den Blutstrom abgegeben werden.
Die gewünschte Isotonizität kann unter Verwendung von Natriumchlorid oder anderen pharmazeutisch akzeptablen Agenzien, wie etwa Dextrose, Borsäure, Natriumtartrat, Propylenglykol, Polyolen (wie etwa Mannitol und Sorbitol) oder anderen anorganischen oder organischen Soluten erzielt werden. Natriumchlorid ist bevorzugt, insbesondere für Puffer, die Natriumionen enthalten.
Die beanspruchten Verbindungen können auch als pharmazeutisch akzeptable Salze (z.B. Säureadditionssalze) und/oder Komplexe davon formuliert werden. Pharmazeutisch akzeptable Salze sind nicht-toxische Salze bei der Konzentration, bei der sie verabreicht werden. Die Zubereitung solcher Salze kann die pharmakologische Anwendung durch Verändern der physikochemikalischen Eigenschaften der Zusammensetzung erleichtern, ohne dabei die Zusammensetzung am Ausüben ihrer physiologischen Wirkung zu hindern. Beispiele nützlicher Veränderungen der physikalischen Eigenschaften umfassen die Senkung des Schmelzpunkts, um die transmukosale Verabreichung zu erleichtern, und die Steigerung der Löslichkeit, um die Verabreichung bei höheren Konzentrationen des Wirkstoffs zu erleichtern.
Zu pharmazeutisch geeigneten Salzen zählen Säureadditionssalze wie solche, die Sulfat, Hydrochlorid, Phosphat, Sulfamat, Acetat, Citrat, Lactat, Tartrat, Methansulfonat, Ethansulfonat, Benzolsulfonat, p-Toluolsulfonat, Cyclohexylsulfamat und Chinat enthalten. Pharmazeutisch geeignete Salze können aus Säuren gewonnen werden, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Sulfaminsäure, Essigsäure, Zi tronensäure, Milchsäure, Weinsäure, Apfelsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Cyclohexylsulfaminsäure und Chininsäure. Diese Salze können zum Beispiel durch Umsetzen der freien Säure oder der basischen Formen des Produkts mit ein oder mehreren Äquivalenten der entsprechenden Base oder Säure in einem Lösungsmittel oder Medium hergestellt werden, in welchem das Salz unlöslich ist, oder in einem Lösungsmittel wie Wasser, welches dann in vacuo oder durch Gefriertrocknen oder durch Austauschen der Ionen eines vorliegenden Salzes gegen ein anderes Ion auf einem geeigneten Ionenaustauscherharz entfernt wird.
Träger oder Exzipienten können zur Erleichterung der Verabreichung der Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden. Zu Beispielen für Träger und Exipienten zählen Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker wie Lactose, Glucose oder Sucrose, oder bestimmte Typen von Stärke, Cellulose-Derivate, Gelatine, Speiseöle, Polyethylenglykole und physiologisch kompatible Lösungsmittel. Die Zusammensetzungen oder pharmazeutische Zusammensetzung kann auf verschiedenen Wegen verabreicht werden, einschließlich intravenös, intraperitoneal, subkutan und intramuskulär, oral, topisch oder transmukosal.
Sofern erwünscht, können die Lösungen der obigen Dosierungszusammensetzungen mittels eines Verdickungsmittels die Methylcellulose angedickt werden. Sie können in emulgierter Form, entweder Wasser-in-Öl oder Öl-in-Wasser, präpariert werden. Ein beliebiger aus einer breiten Vielzahl von pharmazeutisch geeigneten Emulgatoren kann verwendet werden, einschließlich zum Beispiel von Akazienpulver, einem nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittel (wie etwa ein Tween), oder einem ionischen grenzflächenaktiven Mittel (wie etwa Alkalipolyetheralkoholsulfate oder Sulfonate, z.B. ein Triton).
Im allgemeinen werden die bei der Erfindung nützlichen Zusammensetzungen durch Mischen der Inhaltsstoffe gemäß allgemein akzeptierter Verfahrensweisen hergestellt. Zum Beispiel können die ausgewählten Komponenten einfach in einem Mischer oder anderen standardmäßigen Gerät zur Erzeugung eines konzentrierten Gemischs vermengt werden, welches dann auf die Endkonzentration und Viskosität durch Zugabe von Wasser oder eines Verdickungsmittels und möglicherweise eines Puffers zur Kontrolle des pH-Werts oder eines zusätzlichen gelösten Stoffs zur Kontrolle der Tonizität eingestellt wird.
Zur Anwendung durch den Arzt werden die Verbindungen in Dosierungseinheitenform bereitgestellt, die eine Menge eines Exendins, Exendin-Agonisten, oder modifizierten Exendins oder Exendin-Agonisten, mit oder ohne ein weiteres Anit-Glucagonmittel, enthalten. Therapeutisch wirksame Mengen eines Exendins, Exendin-Agonisten, oder modifizierten Exendins oder Exendin-Agonisten zur Verwendung in der Kontrolle von Glucagon und bei Bedingungen, bei denen die Glucagonspiegel nutzbringenderweise gesenkt oder reguliert werden, sind solche, die die postprandialen Blutgucagonspiegel je nach Wunsch herabsetzen. Bei diabetischen oder Glukose-intoleranten Individuen können die Plasmaglukosespiegel höher als bei normalen Individuen sein. Bei solchen Individuen kann eine vorteilhafte Senkung oder "Glättung" der postprandialen Blutglucagonspiegel erzielt werden. Wie für Fachleute des Gebiets erkennbar sein wird, wird eine wirksame Menge des Therapeutikums in Abhängigkeit von vielen Faktoren, einschließlich des Alters und Gewichts des Patienten, des körperlichen Zustands des Patienten, des Glucagonspiegels oder des Grads der zu erzielenden Hemmung der Glucagonunterdrückung, und weiterer Faktoren, variieren.
Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen sind dazu nützlich, eine Senkung des Glucagons bei einem Patienten zu bewirken, und können auch bei anderen Störungen verwendet werden, bei denen ein gesenktes oder unterdrücktes Glucagon nutzbringend ist.
Die wirksame tägliche Anti-Glucagondosis der Verbindungen wird typischerweise im Bereich von 0,01 oder 0,03 bis etwa 5 mg/Tag, vorzugweise etwa 0,01 oder 0,5 bis 2 mg/Tag, und bevorzugter etwa 0,01 oder 0,1 bis 1 mg/Tag, für einen Patienten von 70 kg bei Verabreichung in einer einzelnen oder in aufgeteilten Dosen liegen. Die exakt zu verabreichende Dosis wird durch den betreuenden Arzt bestimmt oder hängt davon ab, wo die jeweilige Verbindung innerhalb des oben genannten Bereichs liegt, als auch vom Alter, Gewicht und Zustand des Individuums. Die Verabrei chung sollte mit dem ersten Anzeichen der Symptome oder kurz nach der Diagnose von zum Beispiel Diabetes mellitus, wie durch erhöhtes Glucagon manifest, beginnen. Die Verabreichung kann durch Injektion, vorzugsweise subkutan oder intramuskulär, erfolgen. Oral aktive Verbindungen können oral aufgenommen werden, wobei allerdings die Dosierungen um ein 5- bis 10-faches erhöht sein sollten.
Im Allgemeinen können in der Behandlung oder Verhütung von erhöhten, unangemessenen oder unerwünschten postprandialen Blutglucagonspiegeln die Verbindungen dieser Erfindung an Patienten verabreicht werden, die einer solchen Behandlung bedürfen, in Dosierungsbereichen ähnlich den oben angegebenen, wobei allerdings die Verbindungen häufiger verabreicht werden, zum Beispiel ein-, zwei- oder dreimal pro Tag.
Die optimale Formulierung und Verabreichungsform der Verbindungen der vorliegenden Anmeldung an einen Patienten hängt von im Fachgebiet bekannten Faktoren ab, wie etwa der jeweiligen Erkrankung oder Störung, der gewünschten Wirkung und dem Typ von Patienten. Zwar werden die Verbindungen typischerweise zur Behandlung von menschlichen Patienten verwendet werden, doch können sie auch zur Behandlung ähnlicher oder identischer Erkrankungen bei anderen Vertebraten, wie etwa anderen Primaten, landwirtschaftlichen Nutztieren wie Schweinen, Rindern und Geflügel, und Sporttieren und Haustieren wie Pferden, Hunden und Katzen, verwendet werden.
Um das Verständnis der vorliegenden Erfindung zu erleichtern, sind die folgenden Beispiele aufgenommen, die die Ergebnisse einer Reihe von Experimenten beschreiben. Die Experimente bezüglich dieser Erfindung sollten natürlich nicht als spezifische Begrenzung der Erfindung aufgefasst werden, wobei solche Abwandlungen der Erfindung, die derzeit bekannt oder später entwickelt werden, die innerhalb des Bereichs eines Fachmanns des Gebiets liegen, als innerhalb des Rahmens der Erfindung, wie hierin beschrieben und im Folgenden beansprucht, befindlich erachtet werden.
BEISPIEL 1 – HERSTELLUNG VON EXENDIN-3

His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-NH₂ [SEQ ID NR. 1]

Das oben amidierte Peptid wurde auf 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamid-Norleucin-MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von Fmoc-geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengebaut. Generell wurden Einzelkopplungszyklen während der gesamten Synthese und eine Fast-Moc-(HBTU-Aktivierungs)-Chemie angewendet. Die Schutzentfernung (Fmoc-Gruppenentfernung) der wachsenden Peptidkette wurde unter Verwendung von Piperidin erreicht. Die abschließende Schutzentfernung des komplettierten Peptidharzes wurde unter Verwendung eines Gemischs von Triethylsilan (0,2 ml), Ethandithiol (0,2 ml), Anisol (0,2 ml), Wasser (0,2 ml) und Trifluoressigsäure (15 ml) gemäß standardmäßigen Methoden erzielt (Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc.). Das Peptid wurde in Ether/Wasser (50 ml) ausgefällt und zentrifugiert. Das Präzipitat wurde in Eisessigsäure rekonstituiert und lyophilisiert. Das lyophilisierte Peptid wurde in Wasser gelöst. Die Rohreinheit betrug etwa 75%.
In den Reinigungsschritten und der Analyse verwendet wurden Lösungsmittel A (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN).
Die das Peptid enthaltende Lösung wurde auf eine präparative C-18-Säule aufgebracht und gereinigt (10% bis 40% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 40 Minuten). Die Reinheit der Fraktionen wurde isokratisch unter Verwendung einer analytischen C-18-Säule bestimmt. Die reinen Fraktionen wurden gepoolt, was das oben identifizierte Peptid erbrachte. Die analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids ergab das Peptidprodukt mit einer beobachteten Rückhaltezeit von 19,2 Minuten.
BEISPIEL 2 – HERSTELLUNG VON EXENDIN-4

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-NH₂ [SEQ ID NR. 2]

Das oben amidierte Peptid wurde auf 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamid-Norleucin-MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von Fmoc-geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengebaut, vom Harz abgespalten, entschützt und in ähnlicher Weise wie Exendin-3 gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Bei der Analyse verwendet wurden Lösungsmittel A (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN). Die analytische RP-HPLC (Gradient 36% bis 46% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids ergab das Peptidprodukt mit einer beobachteten Rückhaltezeit von 14,9 Minuten. Elektrospray-Massenspektrometrie (M): berechnet 4186,6; festgestellt 4186,0 bis 4186,8 (vier Chargen).
BEISPIEL 3: AUSSCHEIDUNG AUS DER NIERE
Die Niere kann eine Hauptrolle in der Eliminierung einiger Moleküle (Wirkstoffe, Peptide, Proteine) spielen. Für einige Moleküle beginnt dieser Prozess dann, wenn die Niere das Blut am Glomerulus filtriert, um das nachstehend beschriebene Ultrafiltrat zu produzieren. Der glomeruläre Filter unterscheidet nicht nur auf der Grundlage des Molekulargewichts, sondern auch, indem er als eine negativ geladene selektive Barriere wirkt, die die Rückhaltung anionischer Verbindungen fördert. Die freie Fraktion der Moleküle im Plasma (nicht an Protein gebunden) mit einem Molekulargewicht von weniger als 5 kD und einem effektiven Radius von weniger als 15 Å lässt sich leicht abfiltrieren. Bei Molekülen mit größerem Molekulargewicht werden Sie auf einer restriktiveren und begrenzteren Basis filtriert, hauptsächlich nach Molekülgröße, Struktur und Nettoladung. Der Ausschlusspunkt für die glomeruläre Filtration liegt zwischen Albumin (67 kD), welches rückgehalten wird, und Hämoglobin (68 kD), welches filtriert wird. Albumin, mit einem effektiven Radius von etwa 36 Å, wird zu weniger als 1% am Glomerulus filtriert.
Einmal in Glomerulus, wandert ein Molekül zum proximalen Tubulus, wo es entweder reabsorbiert wird oder durch die Henle-Schleife weiter zum distalen Tubulus wandert, wo Auffanggänge das Filtrat in die Blase lenken. Filtrierte Proteine und Peptide werden typischerweise durch Bürstensaumenzyme im proximalen Tubulus gespalten, von wo sie durch Natrium/Amino-Cotransporter (Fängerpumpen) wirksam rückgewonnen werden. Ansonsten werden Moleküle, die polar, ionisiert und von großem Molekulargewicht sind, nicht reabsorbiert. Während dieses Prozesses können metabolisierende Enzyme in der Nierenrinde (proximaler Tubulus) ebenfalls das Molekül zu polareren Molekülen abbauen, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Ausscheidung in den Urin erhöht wird. Viele Peptid-Hormone (zum Beispiel Amylin, Calcitonine) werden bei Durchgang durch die Nierenzirkulation abgebaut, vermutlich durch vaskuläre Ectoenzyme, die erreichbar für das Plasma sind, unabhängig vom Prozess der glomerulären Filtration. Bei diesen Beispielen sind die Raten der Peptidausscheidung aus dem Plasma ähnlich den Raten des renalen Plasmastroms, welcher um ein 3-faches größer ist als die Rate der glomerulären Filtration.
Studien, die zur Identifizierung von im Plasma zirkulierenden Metaboliten von Exendin-4 durchgeführt wurden, erbrachten einen sehr geringen Nachweis eines proteolytischen Abbaus; im Anschluss an große intravenöse Dosen bei Tieren ergab die HPLC-Analyse des Plasmas lediglich das Vorhandensein von intaktem Exendin und ein vernachlässigbares Auftreten von "Tochter"-Peaks, die für den Aufbau von Abbauprodukten indikativ sind. Dies steht im Gegensatz zu anderen untersuchten Peptiden (zum Beispiel Amylin und GLP-1), wo das Auftreten des "Stamm"-HPLC-Peaks mit dem Auftreten von "Tochter"-HPLC-Peaks verbunden war, die anschließend als Subpeptid-Abbauprodukte identifiziert wurden. Die Abwesenheit von Plasma-Abbauprodukten von Exendin weist auf wenig oder keine Proteolyse an irgendeinem Ort, einschließlich der Nierenzirkulation, hin. Jegliche Ausscheidung durch die Niere erfolgt dann über nicht-proteolytische Wege, nämlich die Filtration oder aktive Exkretion (wie sie mit Paraaminohippurat erfolgt).
Die Ausgangs-Messungen der Exendinausscheidung beim Menschen (120–130 ml/min), Affen (~9 ml/min) und Ratten (3,2–4,4 ml/min) stimmten mit den berichteten glomerulären Filtrationsraten bei jenen Spezies überein. Um zu testen, ob die Nierenfiltration der Hauptmodus der Exendineliminierung sein könnte, wurden Studien an über Nacht gefasteten nephrektomisierten männlichen Ratten, die mit Exendin bei einer konstanten Rate infundiert wurden, vorgenommen. Die steady-state-Plasmaspiegel an Exendin-4 waren bei nephrektomisierten Ratten im Vergleich zu Ratten mit intakten Nieren stark erhöht. Diese Daten zeigten, dass die Niere für mindestens 80% der Ausscheidung an Exendin-4 verantwortlich war (siehe 5 und 6). Die Exendin-Ausscheidungsraten bei intakten Ratten waren auch hier ähnlich den glomerulären Filtrationsraten, die bei diesen Ratten erwartet wurden (4,2 ml/min). Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass ein sehr geringer Stoffwechsel systemisch erfolgt und dass der Großteil der Ausscheidung des Exendin-4 durch die Niere über die Filtration (doch nicht durch renale intravaskuläre Proteolyse) erfolgt. Die geringen Mengen an immunreaktivem Volllängen-Exendin im Urin stimmen mit der Spaltung durch Büstensaumenzyme im proximalen Tubulus nach der Filtration überein.
BEISPIEL 4 – EXENDIN-4 SENKT DIE GLUCAGONSEKRETION WÄHREND HYPERGLYKÄMISCHEN CLAMPS IN ZUCKER DIABETIC FATTY-RATTEN
Eine absolute oder relative Hyperglucagonämie ist oftmals ein Merkmal beispielsweise des Typ 1- und Typ 2-Diabetes mellitus, und die Unterdrückung einer übermäßigen Glucagonsekretion bei diesen und anderen Zuständen, wie hierin beschrieben oder darauf Bezug genommen, stellt einen potenziellen Nutzen der Therapie unter Verwendung von glucagonostatischen Mitteln dar. In diesem Beispiel wurde die Wirkung von Exendin-4 auf die Glucagonsekretion in männlichen unanästhesierten Zukker Diabetic Fatty-(ZDF)-Ratten untersucht. Unter Verwendung eines hyperinsulinämischen hyperglykämischen Clamp-Protokolls wurden Faktoren, die zur Beeinflussung der Glucagonsekretion neigen, konstant gehalten. Die Plasmaglucose wurde bei ~34 nM 60 min vor Beginn von intravenösen Infusionen von Saline (n = 7) oder Exendin-4 (0,21 μg + 2,1 μg/ml/h; n = 7) geclampt. Die vor diesen Infusionen gemessene Plasmaglucagon-Konzentration war in beiden Gruppen ähnlich (306 ± 30 pM gg. 252 ± 32 pM, respektive; n.s.).
Die mittlere Plasmaglucagon-Konzentration bei mit Exendin-4 infundierten Ratten war nahezu halb so hoch wie die bei mit Saline infundierten Ratten in den letzten 60 Minuten des Clamps gemessene (165 ± 18 pM gg. 298 ± 26 pM, respektive; P < 0,002). Das hyperglykämische Clamp-Protokoll ermöglichte auch die Messung der Insulinempfindlichkeit. Die Glucose-Infusionsrate während des Clamp wurde um 111 ± 7% bei Exendin-4-behandelten gg. Kontrollratten erhöht (P < 0,001). In anderen Worten zeigte Exendin-4 eine glucagonostatische Wirkung in ZDF-Ratten während hyperglykämischer Clamp-Studien, eine Wirkung, die von therapeutischem Nutzen für diabetische Menschen sein wird.
BEISPIEL 5 – METABOLISCHE EFFEKTE VON EXENDIN-4 AUF DIE GLUCAGONSEKRETION BEI MENSCHEN MIT TYP 2-DIABETES
In diesem Beispiel wurde die Sicherheit, Verträglichkeit und Wirksamkeit von synthetischem Exendin-4 bei 8 männlichen, nicht Insulin anwendenden Patienten mit Typ 2-Diabetes ausgewertet, die eine andere antidiabetische Therapie mindestens 7 Tage zuvor abgesetzt hatten. Jeder Patient erhielt subkutane (SC) Injektionen von Plazebo (PBO) und 0,1, 0,2 und 0,3 μg/kg Exendin-4 im Abstand von 48 Stunden in einem einfachblinden, dosierungsansteigenden, plazebokontrollierten Crossover-Design. Fünf Patienten erhielten außerdem eine Dosis von 0,4 μg/kg. Die Plasmaglucose-, -insulin- und -glucagon-Konzentrationen wurden im Fastenzustand und als Reaktion auf eine 7 Kcal/kg Sustacal^®-Provokation, die zum Zeitpunkt der Exendin-4/PBO-Injektion gegeben wurde, bewertet. Die Magenentleerung wurde durch Messung der Serumacetaminophen-Konzentrationen im Anschluss an eine 20 mg/kg orale Dosis an Flüssigacetaminophen, die mit dem Sustacal^® verabreicht wurde, ausgewertet. Keine Sicherheitsprobleme wurden identifiziert, ausgehend von berichteten Nebenwirkungen, EKG und Sicherheitslabor-Überwachung. Dosen von 0,3 und 0,4 μg/kg lösten eine dosisabhängige Zunahme an Übelkeit aus; Erbrechen trat bei der höchsten Dosis auf.
Die Plasmaglucose-Konzentrationen waren bei allen Dosen an Exendin-4 im Vergleich zu PBO reduziert, obschon die Insulinkonzentrationen nicht signifikant verschieden waren. Der 8 Stunden-Mittelwert ± SE-Abweichungen in der Plasmaglucose-AUC von der Grundlinie waren +391 ± 187, –263 ± 108, –247 ± 64, –336 ± 139 und –328 ± 70 mg·hr/dL für das PBO, 0,1, 0,2, 0,3 bzw. 0,4 μg/kg-Dosen. Die 3 Stunden-Veränderungen im Plasmaglucagon waren +128,0 ± 19,2, –5,6 ± 10,5, –29,4 ± 18,6, –40,5 ± 24,5 bzw. +6,9 ± 38,6 pg·hr/ml. Die Rate der Magenentleerung war bei allen Dosen verlangsamt, und das mittlere absorbierte Gesamtacetaminophen über 6 Stunden war um 51%, 50%, 57% und 79% im Vergleich zu PBO für 0,1, 0,2, 0,3 bzw. 0,4 μg/kg-Dosen reduziert. Zusammengefasst ergab die SC-Injektion von Exendin-4 bei Patienten keine Sicherheitsprobleme, wurde bei Dosen ≤ 0,3 μg/kg vertragen, reduzierte Plasmaglucose und -glucagon und verlangsamte die Rate der Magenentleerung. Diese Beobachtungen unterstützen die Verwendung von Exendin für die Behandlung von Zuständen, die einen Nutzen aus reduzierten Glucagonspiegeln und/oder der Unterdrückung von Glucagon ziehen würden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Typ 1- und Typ 2-Diabetes.
BEISPIEL 6: PEG-MODIFIZIERTES EXENDIN-4
Im Falle von Exendin-4, einem Peptid aus 39 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 4187, werden Modifikationen, die seine Größe steigern und/oder seine anionische Natur erhöhen, seine Filtrierbarkeit durch die Niere herabsetzen. Da die Ausscheidung von Exendin-4 großteils durch die Niere erfolgt, wird dies seine Halbwertszeit effektiv erhöhen. Andere Eigenschaften der PEGylierung (erhöhte Plasma-Halbwertszeit aufgrund der Umgehung solcher renaler und/oder zellulärer Ausscheidungsmechanismen, die vorliegen können; reduzierte Immunogenität und Antigenität; erhöhte Löslichkeit; Resistenz gegen Proteolyse; reduzierte Toxizität (Vermeidung von Dosis-Spike); verbesserte Wärme- und mechanische Stabilität; verbesserte Durchlässigkeit der Schleimhaut- oder Epithelschicht; und selektive Kontrolle über eine spezifische biologische Funktion) sind ebenfalls von potenziellem Vorteil für Exendin-4 und Exendin-Agonisten.
Da wir insbesondere multiple Pharmakologien beobachtet haben (die wahrscheinlich multiple. Rezeptor-Subtypen repräsentieren), können unterschiedliche Spektren der biologischen Aktivitäten von Exendin-4 selektiert werden, indem eine PEG-Gruppe an die geeigneten Positionen angebracht wird. Ein Verlust oder eine Veränderung der Bioaktivität ist für PEGylierte Proteine berichtet worden, der auf das Vorhandensein der PEG-Ketten selbst, der jeweiligen, durch die PEG-Kette besetzten Stelle oder die Kopplungsbedingungen mit einer abträglichen Wirkung auf das Protein zurückführbar sein kann.
Die primären Erwägungen für die PEG-Modifikation bezüglich der Filtration an der Niere von Exendin und Exendin-Agonisten betreffen die Größe und Ladung. Unmodifiziert weist Exendin-4 ein Molekulargewicht von etwa 4,2 kD auf und ist von anioni scher Natur mit einer Gesamtnettoladung von etwa –2 bei physiologischem pH. Ein, zwei oder drei PEG-Komponenten können kovalent an Exendin-4 oder ein Analogon von Exendin-4 geknüpft werden, wobei zum Beispiel eine PEG-Komponente bevorzugt ist. Die Größe des PEG kann von einem Molekulargewicht von 500 bis 20.000, vorzugsweise zwischen 5.000 und 12.000, variieren.
Viele der Methoden für die kovalente Anlagerung von PEG ziehen Nutzen aus der Epsilon-Aminogruppe am Lysin. Exendin-4 weist zwei Lysine auf, die durch Anlagerung an PEG modifiziert werden können. Ein Alanin-Scan von AC3177 (Leu¹⁴, Phe ²⁵1–28 Exendin-4), ein verkürztes Analogon von Exendin-4, erbrachte Positionen, die für eine Substitution durch Alanin empfänglich sind. Die beiden Lysine an Positionen 12 und 27 waren durch diese Substitution mäßig betroffen, was nahe legt, dass der Verlust der Seitenkette mit der Lysin-spezifischen R-Gruppe (Methylenkette + Epsilon-Aminogruppe) toleriert wird. Bezüglich des Volllängen-Peptids, Exendin-4, sind die beiden Lysin-Positionen für die PEG-Anlagerung geeignet (siehe Verbindungen 1 und 2). Außerdem können, in Abhängigkeit von der zur Konjugation des PEG angewandten Chemie, die Epsilon-Aminogruppen an diesen Positionen maskiert werden, was die anionische Natur des Peptids erhöht.
Basierend auf den Ergebnissen des Alanin-Scans sind andere wahrscheinliche Positionen, die durch Insertion eines Lys-PEG oder Äquivalents modifiziert werden können, zum Beispiel die folgenden:
Die drei obigen Positionen *, die normalerweise eine Glutaminsäure enthalten, die für die Modifikation mit K(PEG) angegeben wurden, können auch durch Konjugation an die Carboxylgruppe der Glutamin-Seitenkette, E(PEG), modifiziert werden.
Ein anderes Analogon, in welchem das Lys-PEG addiert werden kann, befindet sich am angenommenen GlyGly-Turn:
Positionen 29–39 von Exendin-4 sind möglicherweise für die Glucose-senkende Aktivität nicht entscheidend, wie durch AC3177 mit nahezu gleichwertiger Aktivität zu Exendin-4 nachgewiesen, und jegliches von diesen kann, alleine oder in Kombination, für K(PEG) oder ein Äquivalent substituiert werden.
Ein Fachmann des Gebiets wird ohne weiteres erkennen, dass die vorliegende Erfindung zur Durchführung der Aufgaben und Erreichung der genannten, ebenso wie den ihr inhärenten, Ziele und Vorteile gut angepasst ist. Die Molekülkomplexe und die Methoden, Verfahrensweisen, Behandlungen, Moleküle, spezifischen Verbindungen, wie hierin beschrieben, sind derzeit repräsentativ für die bevorzugten Ausführungsformen, sind aber beispielhafter Natur und nicht als Begrenzungen des Rahmens der Erfindung vorgesehen. Veränderungen daran und andere Anwendungen werden den Fachleuten des Gebiets erkennbar sein, die von der Erfindung umfasst und durch den Rahmen der Ansprüche definiert sind.
Die hierin veranschaulichend beschriebene Erfindung kann geeigneterweise in Abwesenheit jeglichen Elements oder Elemente, Beschränkung oder Beschränkungen, die hierin nicht spezifisch beschrieben sind, ausgeführt werden. So kann zum Beispiel in jedem hierin genannten Fall jeder der Begriffe "umfassend", "bestehend im Wesentlichen aus" und "bestehend in" durch jeden der beiden anderen Begriffe ersetzt werden. Die Begriffe und Ausdrücke, die verwendet worden sind, werden als beschreibende und nicht als beschränkende Begriffe verwendet, und es ist bei der Verwendung dieser Begriffe und Ausdrücke nicht beabsichtigt, jegliche Äquivalente der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon auszuschließen, sondern es wird zuerkannt, dass verschiedene Modifikationen innerhalb des Rahmens der beanspruchten Erfindung möglich sind. Daher sollte verstanden sein, dass, obschon die vorliegende Erfindung durch bevorzugte Ausführungsformen und optionale Merkmale spezifisch beschrieben worden ist, auf eine Modifikation und Variation der hierin beschriebenen Konzepte durch Fachleute des Gebiets zurückgegriffen werden kann und dass solche Modifikationen und Variationen als innerhalb des Rahmens dieser Erfindung, wie durch die Ansprüche im Anhang definiert, befindlich betrachtet werden.
Wo außerdem Merkmale und Aspekte der Erfindung bezüglich der Markush-Gruppen beschrieben sind, werden Fachleute des Gebiets erkennen, dass die Erfindung dadurch auch bezüglich jedes einzelnen Mitglieds oder Untergruppe der Mitglieder der Markush-Gruppe beschrieben ist. Ist zum Beispiel X als ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Brom, Chlor und Iod beschrieben, so sind Äußerungen, dass X Brom ist, und Äußerungen, dass X Brom und Chlor ist, damit vollständig beschrieben.
Die Erfindung ist hierin breit und generisch beschrieben worden. Jede der engeren Spezies und subgenerischen Gruppierungen, die innerhalb der generischen Beschreibung liegen, bilden ebenfalls Teil der Erfindung. Dies umfasst die generische Beschreibung der Erfindung, mit einem Vorbehalt oder einer Negativeinschränkung bezüglich der Entfernung jeglicher Sache von der Gattung, unabhängig davon, ob das entnommene Material hierin spezifisch genannt ist oder nicht.
Weitere Ausführungsformen befinden sich innerhalb der folgenden Ansprüche.
Sequenzliste

Claims

Verwendung eines Exendins, Exendin-Agonisten, modifizierten Exendins oder modifizierten Exendin-Agonisten in der Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung zur Verwendung in der Behandlung von Hyperglucagonämie, Glucagonom oder nekrolytischem migrierendem Erythem, wobei das Exendin, Exendin-Agonist, modifizierte Exendin oder modifizierte Exendin-Agonist eine Aminosäuresequenz der folgenden Formel umfasst:
worin Xaa₁ His, Arg, Tyr oder 4-Imidazopropionyl ist; Xaa₂ Ser, Gly, Ala oder Thr ist; Xaa₃ Asp oder Glu ist; Xaa₄ Phe, Tyr oder Naphthalanin ist; Xaa₅ Thr oder Ser ist; Xaa₆ Ser oder Thr ist; Xaa₇ Asp oder Glu ist; Xaa₈ Leu, Ile, Val, Pentylglycin oder Met ist; Xaa₉ Leu, Ile, Pentylglycin, Val oder Met ist; Xaa₁₀ Phe, Tyr oder Naphthalanin ist; Xaa₁₁ Ile, Val, Leu, Pentylglycin, tert-Butylglycin oder Met ist; Xaa₁₂ Glu oder Asp ist; Xaa₁₃ Trp, Phe, Tyr oder Naphthalanin ist; X₁ Lys Asn, ASn Lys, Lys-NH^ε-R Asn, Asn Lys-NH^ε-R ist, worin R Lys, Arg, C₁-C₁₀-geradkettiges oder verzweigtes Alkanoyl oder Cycloalkylalkanoyl ist; Xaa₁₄, Xaa₁₅, Xaa₁₆ und Xaa₁₇ unabhängig Pro, Homoprolin, 3Hyp, 4Hyp, Thioprolin, N- Alkylglycin, N-Alkylpentylglycin oder N-Alkylalanin sind; Xaa₁₈ Ser, Thr oder Tyr ist; und Z -OH oder -NH₂ ist; oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Exendin oder Exendin-Analogon die Aminosäuresequenz von Exendin-3 oder Exendin-4 umfasst.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Exendin oder Exendin-Analogon die Aminosäuresequenz von Exendin-4 umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Exendin oder Exendin-Analogon eine Aminosäuresequenz der folgenden Formel umfasst:
worin Xaa₁ His, Arg, Tyr ist; Xaa₂ Ser, Gly, Ala oder Thr ist; Xaa₃ Asp oder Glu ist; Xaa₄ Phe, Tyr oder Naphthalanin ist; Xaa₅ Thr oder Ser ist; Xaa₆ Ser oder Thr ist; Xaa₇ Asp oder Glu ist; Xaa₈ Leu, Ile, Val, Pentylglycin oder Met ist; Xaa₉ Leu, Ile, Pentylglycin, Val oder Met ist; Xaa₁₀ Phe, Tyr oder Naphthalanin ist; Xaa₁₁ Ile, Val, Leu, Pentylglycin, tert-Butylglycin ist; Xaa₁₂ Glu oder Asp ist; Xaa₁₃ Trp, Phe, Tyr oder Naphthalanin ist; Xaa₁₄, Xaa₁₅, Xaa₁₆ und Xaa₁₇ unabhängig Pro, Homoprolin, 3Hyp, 4Hyp, Thioprolin, N-Alkylglycin, N-Alkylpentylglycin oder N-Alkylalanin sind; Xaa₁₈ Ser, Thr oder Tyr ist; und Z -OH oder -NH₂ ist; oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei Xaa₁ His ist; Xaa₂ Gly ist; Xaa₄ Phe oder Naphthalin ist; Xaa₉ Leu, Pentylglycin oder Met ist; Xaa₁₀ Phe oder Naphthalanin ist; Xaa₁₁ Ile oder Val ist; Xaa₁₃ Phe, Tyr oder Naphthalanin ist; und Xaa₁₄, Xaa₁₅, Xaa₁₆ und Xaa₁₇ unabhängig ausgewählt sind aus Pro, Homoprolin, Thioprolin oder N-Alkylalanin; und Xaa₁₈ Ser oder Tyr ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei Xaa₄ und Xaa₁₀ unabhängig ausgewählt sind aus Phe oder Nahpthalanin; Xaa₁₁ Ile oder Val ist; und Xaa₁₄, Xaa₁₅, Xaa₁₆ und Xaa₁₇ unabhängig ausgewählt sind aus Pro, Homoprolin, Thioprolin oder N-Alkylalanin.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das modifizierte Exendin oder modifizierte Exendin-Agonist an ein oder mehrere Polyethylenglykol-Polymere geknüpft ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Polyethylenglykol-Polymer ein Molekulargewicht von zwischen 500 und 20.000 aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die pharmazeutische Formulierung zur Anwendung in der Senkung des Plasmaglucagon beim Menschen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die pharmazeutische Formulierung zur Anwendung in der Behandlung von Glucagonom ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die pharmazeutische Formulierung zur Anwendung in der Behandlung von nekrolytischem migrierendem Erythem ist.