JP2004515533A

JP2004515533A - 代謝障害を治療するためのペプチドｙｙおよびペプチドｙｙアゴニスト

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Publication number: JP2004515533A
Application number: JP2002549282A
Authority: JP
Inventors: リチャード・エイ・ピットナー; アンドリュー・エイ・ヤング; ジェイムズ・アール・パターニティ・ジュニア
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Priority date: 2000-12-14
Filing date: 2001-12-14
Publication date: 2004-05-27
Also published as: WO2002047712A3; AU2002230843B8; WO2002047712A2; CN1568195A; CA2431800C; EP2123293A2; DE60140693D1; EP1349563B1; US8273713B2; EP2123293A3; AU3084302A; AU2002230843B2; ATE450269T1; US20130023466A1; EP1349563A2; CA2431800A1; RU2275207C2; BR0116206A; US20020141985A1; CN1568195B

Abstract

治療上有効量のＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを投与することを含む、肥満症、糖尿病、および心血管疾患の危険性のごとき代謝疾患を治療するための方法および組成物を開示する。

Description

【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、出典明示して本明細書の一部とみなす、２０００年１２月１５日に”ＰｅｐｔｉｄｅＹＹａｎｄＰｅｐｔｉｄｅＹＹＡｇｏｎｉｓｔｓｆｏｒＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＯｂｅｓｉｔｙ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，ａｎｄｏｔｈｅｒＭｅｔａｂｏｌｉｃＤｉｓｏｒｄｅｒｓ”なる発明の名称で出願した米国仮特許出願番号６０／２５６，２１６号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、代謝の症状または障害、詳細にはカロリー利用能を低下させることによって軽減し得るもの、例えば、糖尿病、肥満症、摂食障害、インスリン抵抗性症候群（シンドロームＸ）、グルコース非耐性、高脂血症および心血管障害を治療するための方法および組成物に関する。
【０００３】
背景
多数の関連するホルモンが膵臓ポリペプチド（ＰＰ）ファミリーを構成している。膵臓ポリペプチドはインスリン抽出物の夾雑物として発見され、その機能的重要性よりもその起源の器官に由来して命名された（Ｋｉｍｍｅｌ，Ｐｏｌｌｏｃｋら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ８３：１３２３−３０，１９６８）。それは、異なる構造モチーフを含む３６アミノ酸のペプチドである［配列番号：１］。その後、関連するペプチドが腸の抽出物中に発見され、Ｎ−およびＣ−末端がチロシンのためにペプチドＹＹ（ＰＹＹ）と命名された（Ｔａｔｅｍｏｔｏ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ７９：２５１４−８，１９８２）［配列番号：２］。３番目の関連するペプチドは、脳の抽出物中にその後見出され、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）と命名された（Ｔａｔｅｍｏｔｏ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ７９：５４８５−９，１９８２；Ｔａｔｅｍｏｔｏ，Ｃａｒｌｑｕｉｓｔら，Ｎａｔｕｒｅ２９６：６５９−６０，１９８２）［配列番号：４］。
【０００４】
これら３の関連するペプチドは、種々の生物学的作用を発揮することが報告されている。ＰＰの作用には、膵臓分泌の阻害および胆嚢の弛緩が含まれる。中枢投与した（ｃｅｎｔｒａｌｌｙａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）ＰＰは気分における適度な向上を作り出し、これは視床下部および脳幹に局在する受容体によって仲介されている可能性がある（（Ｇｅｈｌｅｒｔ．ＰｒｏｃＳｏｃＥｘｐＢｉｏｌＭｅｄ２１８：７−２２，１９９８）によって概説されている）。
【０００５】
ＰＹＹ［配列番号：２］の放出は食事の後に起こる。もう１のＰＰＹの分子形態はＰＹＹ［３−３６］［配列番号：３］である（Ｅｂｅｒｌｅｉｎ，Ｅｙｓｓｅｌｅｉｎら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ１０：７９７−８０３，１９８９）（Ｇｒａｎｄｔ，Ｓｃｈｉｍｉｃｚｅｋら，ＲｅｇｕｌＰｅｐｔ５１：１５１−９，１９９４）。このフラグメントは、ヒトおよびイヌの腸抽出物における全ＰＹＹ−様免疫反応のほぼ４０％を構成し、絶食状態の全血漿ＰＹＹ免疫反応の約３６％から食事後の５０％をわずかに超えるまでを構成する。これは、明らかにＰＹＹのジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰＰ４）切断産物である。ＰＹＹ［３−３６］は、報告されているところによると、Ｙ２およびＹ５受容体の選択的リガンドであり、これらの受容体はＮ−末端が切断されているＮＰＹアナログ（すなわち、そのＣ−末端アナログ）を優先する点において薬理学的にユニークである。ＰＹＹの末梢投与は、報告されているところによると、胃酸分泌、胃運動、外分泌腺膵臓分泌（Ｙｏｓｈｉｎａｇａ，Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉら，ＡｍＪＰｈｉｙｓｉｏｌ２６３：Ｇ６９５−７０１，１９９２）（Ｇｕａｎ，Ｍａｏｕｙｏら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１２８：９１１−６，１９９１）（Ｐａｐｐａｓ，Ｄｅｂａｓら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ９１：１３８６−９，１９８６）、胆嚢収縮および腸運動（Ｓａｖａｇｅ，Ａｄｒｉａｎら，Ｇｕｔ２８：１６６−７０，１９８７）を低下させる。ＰＹＹの中枢注射の胃内容排出、胃運動および胃酸分泌に対する効果は、菱脳／脳幹の中またはまわりに直接注射した後に見られるように（ＣｈｅｎおよびＲｏｇｅｒｓ．ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌ２６９：Ｒ７８７−Ｒ７９２，１９９５）（Ｃｈｅｎ，Ｒｏｇｅｒｓら，ＲｅｇｕｌＰｅｐｔ６１：９５−９８，１９９６）（ＹａｎｇおよびＴａｃｈｅ．ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌ２６８：Ｇ９４３−８，１９９５）（Ｃｈｅｎ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓら，ＮｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌＭｏｔｉｌ９：１０９−１１６，１９９７）、末梢注射後に観察される効果とは異なり得る。例えば、中枢投与したＰＹＹは、胃酸分泌が刺激され、阻害されないという点において末梢注射したＰＹＹ［３−３６］について本明細書中に記載する効果とは反対の幾つかの効果を有していた。胃運動はＴＲＨ刺激と関連する場合にのみ抑制され、単独で投与した場合には抑制されず、ＰＰ受容体との予想される相互作用を介してより高用量では実際に刺激された。ＰＰＹは中枢投与後に食物および水の摂取を刺激することが示されている（Ｍｏｒｌｅｙ，Ｌｅｖｉｎｅら，ＢｒａｉｎＲｅｓ３４１：２００−２０３，１９８５）（Ｃｏｒｐ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅら，ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌ２５９：Ｒ３１７−２３，１９９０）。
【０００６】
同様にして、ＮＰＹ［配列番号：４］の最も早期に報告された中枢効果のうちの１は、特に視床下部において、摂食を増大させることであった（Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｄａｎｉｅｌら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ６：１２０５−１１，１９８５）。ＰＹＹおよびＰＰはこれらの効果を模倣することが報告されており、ＰＹＹはＮＰＹよりも効力が高いかまたは同等の効力を有すると報告されている（Ｍｏｒｌｅｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｓ．，Ｇｒａｃｅ，Ｍ．およびＫｎｅｉｐ，ＪＢｒａｉｎＲｅｓ３４１：２００−２０３，１９８５）（Ｋａｎａｔａｎｉ，Ｍａｓｈｉｋｏら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１４１：１０１１−６，２０００）（Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｉｎｕｉら，ＪＰｈａｒｍａｃｏｌＥｘｐＴｈｅｒ２６８：１０１０−４，１９９４）。幾つかのグループが、ＮＰＹによって誘導される摂食の程度が以前に試験されたいずれの薬理剤によって誘導されるものよりも高く、極めて長期間不変的であることも見出している。摂食のＮＰＹ−誘導刺激は多くの種において再現されている。３の基本的な多量栄養素（脂質、タンパク質および炭水化物）の中では、炭水化物の取込みが優先的に刺激された。ＮＰＹの摂食亢進作用に対する耐性は全く示されず、ペプチドを１０日以上繰返して投与した場合には体重増加の比率における顕著な上昇が観察された。飢餓状態の後、視床下部ＰＶＮ中のＮＰＹの濃度は時間とともに上昇し、食物を摂取した後は迅速に対照レベルまで戻った。
【０００７】
薬理学的研究およびクローニングの努力により、ペプチドのＰＰファミリーについて多くの７回膜貫通受容体が明らかになり、これらの受容体にはＹ１ないしＹ６（および、推定ＰＹＹ−優先受容体またはＹ７）の名称が割当てられている。これらの受容体の典型的なシグナル応答は他のＧｉ／Ｇｏ共役型受容体の応答、すなわちアデニルシクラーゼの阻害に類似する。受容体の中では配列ホモロジーがかなり低いにもかかわらず、Ｙ１、Ｙ４およびＹ６受容体の間でアミノ酸配列類似性が一群をなし、一方でＹ２およびＹ５が他のファミリーを決めていることは明らかである。他の結合部位が種々のペプチドの効力のランク順序によって同定されている。クローン化されていないＮＰＹ−優先受容体はＹ３と名付けられ、ＰＹＹ−優先受容体も存在することが示されている（推定Ｙ７）（（Ｍｉｃｈｅｌ，Ｂｅｃｋ−Ｓｉｃｋｉｎｇｅｒら，ＰｈａｒｎａａｃｏｌＲｅｖ５０：１４３−５０，１９９８）（Ｇｅｈｌｅｒｔ，Ｄ．Ｒ．ＰｒｏｃＳｏｃＥｘｐＢｉｏｌＭｅｄ２１８：７−２２，１９９８）によって概説されている）。
【０００８】
Ｙ５およびＹ１受容体は摂食応答の最初のメディエーターと示唆されている（Ｍａｒｓｈ，Ｈｏｌｌｏｐｅｔｅｒら，ＮａｔＭｅｄ４：７１８−２１，１９９８）（Ｋａｎａｔａｎｉ，Ａ．，Ｍａｓｈｉｋｏ，Ｓ．，Ｍｕｒａｉ，Ｎ．，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｉｔｏ，Ｊ．，Ｆｕｋｕｒｏｄａ，Ｔ．，Ｆｕｋａｍｉ，Ｔ．，Ｍｏｒｉｎ，Ｎ．，ＭａｃＮｅｉｌ，Ｄ．Ｊ．，ＶａｎｄｅｒＰｌｏｅｇ，Ｌ．Ｈ．，Ｓａｇａ，Ｙ．，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．，およびＩｈａｒａ，Ｍ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１４１：１０１１−６，２０００）。有力な考え方は、内因性ＮＰＹがこれらの受容体を介して、摂食行動を亢進するというものである。肥満症に対して提唱されている療法は、ＮＰＹ受容体の拮抗に不変的に指向されている一方で、食欲不振を治療するための療法はこのリガンドファミリーのアゴニストに向けて指向されている（例えば、米国特許第５，９３９，４６２号；第６，０１３，６２２号；および第４，８９１，３５７号を参照されたい）。一般的に、ＰＹＹおよびＮＰＹは、実験した全てのＹ１、Ｙ５（およびＹ２）受容体アッセイにおいて等しい効力があり、等しく有効であることが報告されている（Ｇｅｈｌｅｒｔ，Ｄ．Ｒ．ＰｒｏｃＳｏｃＥｘｐＢｉｏｌＭｅｄ２１８：７−２２，１９９８）。
【０００９】
推定Ｙ３受容体の主な特徴は、それらがＮＰＹを認識する一方、ＰＹＹが少なくとも一桁効力が低いことである。Ｙ３受容体はＮＰＹに対して優先性を示す結合部位／受容体のみを表す。
【００１０】
ＰＹＹ−優先受容体と呼ばれるＰＹＹに対する優先性を示すさらなる結合部位／受容体が存在し、これを本明細書中においてはＹ７受容体という。この受容体または受容体のクラスに対する結合性の異なるランク順序が報告されており、これはこのファミリーに１を超える受容体が存在し得ることを示唆している。大部分の場合においては、ＰＰＹがＮＰＹよりも３ないし５倍効力がある受容体を描写するために適用されている。ＮＰＹ、ＰＹＹおよびＰＰ受容体の命名に関するＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＵｎｉｏｎｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙの推奨は、ＰＹＹとＮＰＹの間に少なくとも２０倍の効力の差が観察されない限り、ＰＹＹ−優先受容体という語は用いないというものであった（ＳＭｉｃｈｅｌ，Ｍ．Ｃ．，Ｂｅｃｋ−Ｓｉｃｋｉｎｇｅｒ，Ａ．，Ｃｏｘ，Ｈ．，Ｄｏｏｄｓ，Ｈ．Ｎ．，Ｈｅｒｚｏｇ，Ｈ．，Ｌａｒｈａｍｍａｒ，Ｄ．，Ｑｕｉｒｉｏｎ，Ｒ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｔ．およびＷｅｓｔｆａｌｌ，Ｔ．ＰｈａｒｍａｃｏｌＲｅｖ５０：１４３−５０，１９９８）。しかしながら、この開示の目的のために、Ｙ７受容体またはＰＹＹ−優先受容体の薬理学という場合には、ＮＰＹを超えるＰＹＹに対する優先性のいずれかの程度を有する受容体を意味する。
【００１１】
合衆国においておよび全世界を通して、肥満症およびその関連する障害は一般的であって、非常に深刻な公衆健康の問題である。身体上部肥満症（ｕｐｐｅｒｂｏｄｙｏｂｅｓｉｔｙ）は、２型真性糖尿病について知られている最も強い危険因子であり、心血管疾患に対する強い危険因子である。肥満症は、高血圧症、アテローム性動脈硬化症、鬱血性心不全、発作、胆嚢疾患、骨関節症、骨関節症、睡眠無呼吸、多嚢胞性卵巣症候群、乳房、前立腺および結腸の癌のごとき再発性の障害、ならびに全身麻酔の合併症の発生率の上昇の認識されている危険因子である（例えば、（Ｋｏｐｅｌｍａｎ．Ｎａｔｕｒｅ４０４：６３５−４３，２０００）を参照されたい）。それは寿命を縮め、前記の同時発生病的状態、ならびに感染症、拡張蛇行静脈、黒色表皮腫、湿疹、運動能低下、インスリン抵抗性、高血圧症、高コレステロール血症、胆石症、整形外科的傷害、および血栓塞栓疾患のごとき障害の重篤な危険性を運んでいる（Ｒｉｓｓａｎｅｎ，Ｈｅｌｉｏｖａａｒａら，ＢＭＪ３０１：８３５−７，１９９０）。肥満症はインスリン抵抗性症候群または“シンドロームＸ”と呼ばれている一群の症状に対する危険因子でもある。肥満症および関連する障害の医療的費用の最近の概算は、全世界において１５００億ドルである。肥満症の病理は、多因子であると考えられているが、基本的な問題は、肥満症患者においては、過剰な脂肪組織が存在するまでは栄養利用能とエネルギー消費が釣り合わないことである。最近では肥満症はほとんど治療不可能な、慢性の、本質的には難治性の代謝障害である。肥満症患者の体重減少に有用な治療剤は、患者の健康に対して顕著に有利な効果を有し得るであろう。
【００１２】
本明細書中で言及したすべての刊行物は、出典明示して本明細書の一部とみなす。
【００１３】
発明の概要
膵臓ポリペプチドファミリーのメンバーの中枢投与の報告されている活性とは反対に、ＰＹＹおよびＰＹＹアゴニストの末梢投与が、栄養利用能を低下させ、肥満症および関連する障害の治療に有用であることを発見した。ＰＹＹおよびＰＹＹアゴニスト組成物およびそれらの使用を本明細書に開示して、栄養利用能における低下によって利益を受け得る代謝障害を治療するための患者における栄養利用能を調節する。これらの方法は、例えば肥満症、限定するものではないが２型またはインスリン非依存性型の糖尿病を含む糖尿病、摂食障害、インスリン抵抗性症候群、および心血管疾患の治療に有用であろう。
【００１４】
”ＰＹＹ”とは、いずれかの種から得られたか、または由来するペプチドＹＹポリペプチドを意味する。したがって、”ＰＹＹ”なる語には、配列番号：２に記載するヒトの完全な長さの３６アミノ酸のペプチド、ならびに例えば、げっ歯類、ハムスター、ニワトリ、ウシ、ラット、およびイヌのＰＹＹを含むＰＹＹの種変異型の両方が含まれる。”ＰＹＹアゴニスト”とは、ＰＹＹの作用を誘起して栄養利用能を低下させるいずれの化合物、例えば、本明細書中の実施例１、２、５または６に記載する摂食、胃内容排出、膵臓分泌、または体重損失アッセイにおいて活性を有する化合物（１）、およびＹ受容体アッセイ（実施例１０）または例えば、最後野（実施例９）（ここでは、ＰＹＹアゴニストは膵臓ポリペプチドではない）を含む豊富なＹ受容体を有するある種の組織からの標識したＰＹＹまたはＰＹＹ［３−３６］との競合結合アッセイにおいて特異的に結合する化合物（２）を意味する。好ましくは、ＰＹＹアゴニストはかかるアッセイにおいて１μＭよりも高い、より好ましくは１−５ｎＭよりも高い親和性で結合するであろう。
【００１５】
かかるアゴニストは、機能的ＰＹＹドメイン、ＰＹＹの活性フラグメント、または化学的分子もしくは小分子を有するポリペプチドを含み得る。ＰＹＹアゴニストはペプチドであっても非ペプチド化合物であってもよく、”ＰＹＹアゴニストアナログ”を含み、これは、ＰＹＹ受容体あるいはＰＹＹ自体が相互作用して生物学的応答を誘起し得る他の受容体もしくは受容体群に結合するか、さもなければそれまたはそれらと直接的または間接的に相互作用することによって典型的にはＰＹＹ活性を有する、ＰＹＹに構造的に類似するいずれの化合物をもいう。かかる化合物には、ＰＹＹの誘導体、３６を超えるアミノ酸を有する伸長ＰＹＹ分子、３６未満のアミノ酸を有する切頭ＰＹＹ分子、ならびに１またはそれを超える異なるアミノ酸を有する置換型ＰＹＹ分子、あるいは前記したもののいずれかの組合せが含まれる。かかる化合物は、アミド化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化および環化のごときプロセスによって修飾することもできる。
【００１６】
１のかかるＰＹＹアゴニストアナログは、本明細書中において配列番号：３として同定するＰＹＹ［３−３６］である。括弧内の数字を有するポリペプチドは、括弧内のアミノ酸位置にわたって完全長のペプチドの配列を有する切頭ポリペプチドをいう。したがって、ＰＹＹ［３−３６］はアミノ酸３ないし３６にわたってＰＹＹと同じ配列を有する。ＰＹＹアゴニストはより高いかまたはより低い親和性でＰＹＹ受容体に結合し得、これは天然のＰＹＹよりもイン・ビボ（ｉｎｖｉｖｏ）またはイン・ビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）におけるより長いかまたはより短い半減期、あるいはより高いかまたはより低い有効性を示す。
【００１７】
“カロリー（または栄養）利用能を低下させることによって軽減し得る症状または障害”とは、比較的高い栄養利用能によって引起こされる、悪化する、あるいは重くなるかのいずれかの、または栄養利用能を低下させることによって軽減し得る、例えば摂食を減少することによって軽減し得る、対象におけるいずれの症状または障害をも意味する。かかる症状または障害には、限定されるものではないが、肥満症、２型糖尿病を含む糖尿病、摂食障害、およびインスリン抵抗性症候群が含まれる。
【００１８】
１の態様において、本発明は、治療上有効量のＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを投与することによって肥満または体重過多の対象における肥満症を治療する方法を提供する。“肥満症”は一般的には３０を超えるボディーマスインデックスと定義されているが、本明細書の開示の目的のために、体重の減少を必要とするかまたは望む、３０未満のボディーマスインデックスを有する者を含むいずれの対象も“肥満”の範囲に含まれる。インスリン抵抗性、グルコース非耐性であるか、またはいずれかの形態の真性糖尿病（例えば、１型、２型または妊娠糖尿病）を有するいずれの対象も、本発明の方法から利益を受け得る。
【００１９】
もう１の態様において、本発明は、摂食を低下させ、真性糖尿病を治療し、および脂質プロファイルを改善する（ＬＤＬコレステロールおよびトリグリセリドのレベルを低下させ、および／またはＨＤＬコレステロールのレベルを変化させることを含む）方法を特徴とし、それには、治療上有効量のＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを対象に投与することが含まれる。好ましい具体例において、本発明の方法は、それを必要とする対象における栄養利用能を低下させることによって軽減し得る症状または障害を治療するために使用し、それには、治療上有効量のＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを該対象に投与することが含まれる。かかる症状および障害には、限定されるものではないが、高血圧症、高脂血症、心血管疾患、摂食障害、インスリン抵抗性、肥満症およびいずれかの種類の真性糖尿病が含まれる。
【００２０】
本発明の方法において、好ましいＰＹＹアゴニストは、本明細書中に記載するアッセイのうちの１（好ましくは、摂食、胃内容排出、膵臓分泌、または体重減少アッセイ）において、同じアッセイにおけるＮＰＹの効力よりも大きな効力を有するものである。
【００２１】
すべての表示について、好ましい具体例において、好ましいＰＹＹアゴニストはＰＹＹ［３−３６］であって、好ましくは単一または分割した用量で１日当り約１μｇないし約５ｍｇ、または用量当り約０．０１μｇ／ｋｇないし約５００μｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０５μｇ／ｋｇないし約２５０μｇ／ｋｇ、最も好ましくは約５０μｇ／ｋｇ以下の用量で末梢投与する。これらの範囲の投与量は、もちろん、各アゴニストの効力で変化し、それは当業者によって容易に決定される。
【００２２】
本発明の方法においては、ＰＹＹおよびＰＹＹアゴニストは、長期または短期の作用を示して栄養利用能を低下させる１または他の化合物および組成物と別々または一緒に投与し得、これらには限定されるものではないが、アミリンまたはアミリンアゴニスト、コレシストキニン（ＣＣＫ）またはＣＣＫアゴニスト、レプチン（ＯＢタンパク質）またはレプチンアゴニスト、エキセンジンまたはエキセンジンアゴニスト、またはＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１アゴニストを含むほかの化合物および組成物が含まれる。好適なアミリンアゴニストには、例えば、［２５，２８，２９Ｐｒｏ−］−ヒトアミリン（プラムリンチド（ｐｒａｍｌｉｎｔｉｄｅ）としても知られ、米国特許第５，６８６，５１１号および第５，９９８，３６７号に記載されている）およびサケ・カルシトニンが含まれる。使用するＣＣＫは、好ましくはＣＣＫオクトペプチド（ＣＣＫ−８）である。レプチンは、例えば、（Ｐｅｌｌｅｙｍｏｕｎｔｅｒ，Ｃｕｌｌｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６９：５４０−５４３，１９９５）（Ｈａｌａａｓ，Ｇａｊｉｗａｌａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６９：５４３−６，１９９５）および（Ｃａｍｐｆｉｅｌｄ，Ｓｍｉｔｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６９：５４６−５４９，１９９５）で論じられている。好適なエキセンジンには、エキセンジン−３およびエキセンジン−４が含まれ、エキセンジンアゴニスト化合物には、例えば、国際公開番号ＷＯ９９／０７４０４、ＷＯ９９／２５７２７およびＷＯ９９／２５７２８に記載されているものが含まれる。
【００２３】
発明の詳細な説明
内因性ＮＰＹ（（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｗｏｏｄｓら，Ｎａｔｕｒｅ４０４：６６１−７１，２０００）で概説されている）およびＰＹＹ（Ｍｏｒｌｅｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｓ．，Ｇｒａｃｅ，Ｍ．およびＫｎｅｉｐ，Ｊ．ＢｒａｉｎＲｅｓ３４１：２００−２０３，１９８５））がそれらの受容体を介して、摂食行動を亢進することは一般的に認められている。肥満症に対する療法に指向された方法はＹ受容体に拮抗することを常に試行しているが、食欲不振を治療するための請求の範囲はこのリガンドファミリーのアゴニストに試行される。しかしながら、本明細書において記載および特許請求するごとく、予期せぬことに、ＰＹＹおよびそのアゴニストの末梢投与が、特許および科学刊行物における報告（例えば、体重増加を亢進するためのＰＹＹ受容体アゴニストの使用を開示する米国特許第５，９１２，２２７号および第６，３１５，２０３号を参照されたい）によって示唆されているごとく、栄養利用能を上昇させるよりも、それを低下させる効力作用を有することを発見した。摂食、胃内容排出の鈍化、胃酸分泌の阻害、および膵臓酵素分泌の阻害の作用のスペクトルは、１型、２型または妊娠真性糖尿病、肥満症およびインスリン抵抗性症候群（シンドロームＸ）の他の病徴のごとき代謝疾患において、ならびに栄養利用能を低下させるためのいずれか他の使用において臨床的利益を発揮するのに有用である。
【００２４】
摂食および栄養利用能を低下させるための、ならびに糖尿病および肥満症のごとき障害を治療することにおけるＰＹＹおよびＰＹＹアゴニストの使用は、以前に全く主張されていない。事実、糖尿病におけるかかる有用性は、血中グルコースに対する急性の効果の欠如およびインスリン分泌の阻害の報告からは予想されないであろう。しかしながら、本明細書においては、この群のリガンドおよびアゴニストリガンドがこれらの症状および関連する症状において有用であろうことを実証する。
【００２５】
本出願人のデータは、摂食を低下させ、胃内容排出を遅延させる末梢投与したＰＹＹまたはＰＹＹ［３−３６］の効果を、Ｙ−フォールドファミリー（Ｙ−ｆｏｌｄｆａｍｉｌｙ）のもののまたはそれに類似する１またはそれを超えるユニークな受容体クラスとの相互作用によって決定する。データは、ＰＹＹ−優先（またはＹ７）受容体に類似する受容体または受容体群との相互作用によって最もよく説明され、Ｙ１−Ｙ６のごとき他の既知のＹ受容体との相互作用によってはあまりよく説明されない。（下記の）表Ｉは、既知の受容体で報告された公開ＰＰファミリーリガンドの効力、ならびに本出願人のある種の未公開データ、および種々のリガンドの効力のランク順序を示している。本明細書中の実施例における効力のランク順序はいずれの単一の公開された受容体薬理学にも対応せず、それは、カロリー利用能を低下させることにおけるＰＹＹ作用の新規な機構を示している。
【００２６】
【表１】

【００２７】
【表２】

【００２８】
いずれのＰＹＹおよびＰＹＹアゴニストも本発明において有用となり得る。好ましいＰＹＹアゴニストにはペプチドアゴニスト、詳細にはＰＹＹ［３−３６］のごときＰＹＹアゴニストアナログが含まれる。アナログは、例えば、ＰＹＹの配列またはその一部分の同類アミノ酸置換によって作製し得、ＮＰＹまたはＰＰの作用からＰＹＹの作用を区別する実施例に記載するアッセイまたは他の好適なアッセイにおいて試験し得る。非−ペプチドアゴニストも予想される。
【００２９】
ＰＹＹによって奏される作用のスペクトル、例えば摂食の阻害、胃内容排出の鈍化、胃酸分泌の阻害、膵臓酵素分泌の阻害ほかは、調和するように作用して栄養同化を制限し、それによって、真性糖尿病、肥満症、心血管疾患（アテローム性動脈硬化症、高血圧症、高脂血症ほか）、およびインスリン抵抗性症候群（例えば、シンドロームＸ）の発現のごとき代謝疾患において臨床的利益を発揮する。
【００３０】
本明細書中で言及するＰＰリガンドファミリー中のペプチドのヒト配列は、以下のとおりである（慣用的な１文字アミノ酸コード）：
【００３１】
【化１】

【００３２】
これらのペプチドは生理学的に発現された場合にはＣ−末端がアミド化されているが、本発明の目的については必要とされない。これらのペプチドは、他の翻訳後修飾をも有し得る。
【００３３】
本明細書に記載するＰＹＹおよびペプチドベースのＰＹＹアゴニストは、当該技術分野で知られている標準的な組換え発現または化学ペプチド合成技術を用いて、例えば自動または半自動ペプチド合成機を用いて調製し得る。
【００３４】
固相ペプチド合成は、ＮＭＰ／ＨＯＢｔ（オプション１）システムを用いる自動ペプチド合成機（例えば、Ｍｏｄｅｌ４３０Ａ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）ならびにキャッピングとともにｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ法（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＵｓｅｒ’ｓＭａｎｕａｌｆｏｒｔｈｅＡＢＩ４３０ＡＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ，Ｖｅｒｓｉｏｎ１．３Ｂ，１９８８年７月１日、第６章、ｐｐ．４９−７０，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を用いて行い得る。ペプチドはＡｄｖａｎｃｅｄＣｈｅｍＴｅｃｈＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＭｏｄｅｌＭＰＳ３５０，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）を用いてアセンブリーすることもできる。ペプチドは、例えば、ＷａｔｅｒｓＤｅｌｔａＰｒｅｐ３０００ｓｙｓｔｅｍおよびＣ４、Ｃ８またはＣ１８分取用カラム（１０μ，２．２ｘ２５ｃｍ；Ｖｙｄａｃ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣ（分取用および分析用）によって精製し得る。
【００３５】
本発明において有用なペプチド化合物は、現在当該技術分野で知られている方法を用いる組換えＤＮＡ技術を用いて調製し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｄＥｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ（１９８９）を参照されたい。本発明において有用な非−ペプチド化合物は、当該技術分野で知られている方法によって調製し得る。例えば、かかるアミノ酸を含むペプチド、リン酸を含有するアミノ酸およびペプチドは、当該技術分野で知られている方法を用いて調製し得る。例えば、ＢａｒｔｌｅｔｔおよびＬａｎｄｅｎ，ＢｉｏｒｇＣｈｅｍ．１４：３５６−３７７（１９８６）を参照されたい。
【００３６】
前記した化合物は、それらの薬理学的特性に鑑みて有用である。詳細には、本発明の化合物は、摂食の低下を含む栄養利用能を低下させるための剤としての活性を所有している。
【００３７】
この組成物または医薬組成物は、静脈内、腹膜内、皮下、および筋肉内、経口、局所、粘膜内、あるいは肺吸入を含むいずれの経路によっても投与し得る。本発明において有用な組成物は、（静脈内、筋肉内および皮下を含む）非経口、鼻腔または経口投与に好適な処方の形態で簡便に提供し得る。一緒に投与するために、単一の組成物または液剤中に、ＰＹＹまたはＰＹＹアゴニスト、およびアミリン、アミリンアゴニスト、ＣＣＫまたはＣＣＫアゴニスト、またはレプチンもしくはレプチンアゴニスト、またはエキセンジンもしくはエキセンジンアゴニストのごとき、もう１の摂食低下、血漿グルコース低下または血漿脂質改変剤を提供することが簡便な場合もある。また、該ＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストと分離して、さらなる剤を投与するのがより有利な場合もある。
【００３８】
好適な投与形式は、個別に各患者の医師によって最良に決定し得る。種々の医薬上許容し得る担体およびそれらの処方は、標準的な処方文献、例えば、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。また、Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｊ．およびＨａｎｓｏｎ，Ｍ．Ａ．”ＰａｒｅｎｔｅｒａｌＦｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓａｎｄＰｅｐｔｉｄｅｓ：ＳｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄＳｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ，”ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｒｅｎｔｅｒａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＴｅｃｈｎｉｃａｌＲｅｐｏｒｔＮｏ．１０，Ｓｕｐｐ．４２：２Ｓ（１９８８）も参照されたい。
【００３９】
本発明において有用な化合物は、例えば注射または点滴用の、非経口組成物として提供し得る。好ましくは、それらは水性担体、例えば約３．０ないし約８．０、のｐＨ、好ましくは約３．５ないし約７．４、３．５ないし約５．０のｐＨの等張緩衝液中に懸濁する。有用な緩衝液には、クエン酸ナトリウム−クエン酸およびリン酸ナトリウム−リン酸、および酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液が含まれる。経皮注射またはデリバリーの後に数時間または数日にわたって治療上有効量の調製物が血流にデリバリーされるように、持続性または“デポー”徐放性調製物の形態を用い得る。
【００４０】
本発明の生成物は両イオン性であるため、それらは遊離塩基として、酸付加塩として、または金属塩として利用し得る。もちろん、該塩は医薬上許容し得るものでなければならず、それには金属塩、詳細にはアルカリおよびアルカリ土類金属塩、例えばカリウム塩またはナトリウム塩が含まれるであろう。広範な種々の医薬上許容し得る酸付加塩が利用可能である。かかる生成物は、当業者によく知られている手法によって容易に調製される。
【００４１】
医師による使用については、組成物は、もう１の有効成分、例えば摂食低下、血漿グルコース低下または血漿脂質改質剤を含むかまたは含まない、一定の量のＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを含有する単位投与形態で提供されよう。栄養利用能を低下させるのに使用するＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストの治療上有効量は、所望のレベルで食欲を抑制する量である。当業者によって認識されるように、治療剤の有効量は、患者の年齢および体重、患者の身体状態、血中糖レベル、得るべき体重のレベル、および他の因子を含む多くの因子によって変化する。
【００４２】
該化合物の有効日食欲抑制用量は、典型的には、５０ｋｇの患者に対して、単一または分割した用量で投与する、約１ないし３０μｇから約５ｍｇ／日、好ましくは約１０ないし３０μｇないし約２ｍｇ／日、およびより好ましくは約５ないし１００μｇないし約１ｍｇ／日、最も好ましくは約５μｇないし約５００μｇ／日の範囲内であろう。好ましくは、用量は約０．０１ないし約１００μｇ／ｋｇ／用量である。投与すべき正確な用量は、当業者によって簡単に決定され、特定の化合物の効力ならびに個人の年齢、体重および状態に依存する。投与は、栄養利用能、摂食、体重の抑制、血中グルコースまたは血漿脂質を低下が望まれる如何なる場合、例えば病徴の最初の徴候または肥満症、真性糖尿病、またはインスリン抵抗性症候群と診断された直後に開始すべきである。投与はいずれの経路、例えば注射、好ましくは皮下または筋肉無い、経口、鼻腔、経皮ほかでもよい。ある種の経路、例えば経口投与用の用量は、バイオアベイラビリティーの低下を考慮して、例えば５−１００倍増加すべきである。
【００４３】
患者に対する本願の化合物の最適な処方および投与様式は、特定の疾患または障害、望む効果、および患者のタイプのごとき当該技術分野で知られている因子に依存する。典型的に該化合物を使用してヒト対象を治療するが、それを用いて他の霊長類、ブタ、ウシおよび家禽のごとき農業動物、およびウマ、イヌおよびネコのごとき競技動物およびペットのごとき他の脊椎動物における同様および同じ疾患を治療することもできる。
【００４４】
さらなるＰＹＹアゴニストのスクリーニング
他のＰＹＹアゴニストは、後記の辞し例において記載する生理学的スクリーニングと組合せた、後記（例えば、実施例９および１０）するかまたは当該技術分野において知られている受容体結合アッセイを用いて同定し得る。効力のあるＰＹＹアゴニストは、ＰＹＹまたはＰＹＹ［３−３６］の活性と比較し得る。
【００４５】
また、１またはそれを超えるＰＹＹ−優先（Ｙ７）受容体が特徴付けられ、クローン化されている場合には、以下に論じあるいは当該技術分野において知られているごとく、別のアッセイおよび大量処理スクリーニングを実行し得る。Ｙ７受容体は、ＮＰＹに対する親和性よりも大きなＰＹＹまたはＰＹＹ［３−３６］に対する親和性を有するものである。ＰＹＹ受容体活性を調節する化合物をスクリーニングする方法には、試験化合物とＰＹＹ受容体とを接触させ、ついで該化合物と該ＰＹＹ受容体との間の複合体の存在についてアッセイすることが含まれる。かかるアッセイにおいては、試験リガンドは典型的には標識する。適当にインキュベートした後に、遊離リガンドを結合した形態のものから分離し、遊離または複合体形成しなかった標識の量がＰＹＹ受容体に結合する特定の化合物の能力の測定値である。また、結合した標識リガンドを測定することもできる（例えば、発現した膜−結合Ｙ７受容体を用いて）。
【００４６】
本発明のもう１の具体例において、ＰＹＹ受容体に対して好適な結合親和性を有する化合物の大処理スクリーニングを用いる。例えば、多数の異なる小ペプチド試験化合物を固体基板上で合成する。そのペプチド試験化合物をＰＹＹ受容体と接触させ、洗浄する。結合したＰＹＹ受容体を当該技術分野でよく知られている方法によって検出する。精製した試験化合物は、前記した薬剤スクリーニング技術において使用するためのプレート上に直接的にコートすることもできる。さらに、試験化合物がタンパク質である場合には、抗体を使用してタンパク質を捕捉し、それを当該技術分野で知られているいずれの方法によって固体支持体に固定化する。
【００４７】
本発明の他の具体例には、本発明のポリペプチドを結合することができる中和抗体を該ポリペプチドに対する結合について、試験化合物と特異的に競合させる競合スクリーニングアッセイが含まれる。この様にして、抗体を用いて、ＰＹＹアゴニストと１またはそれを超える抗原決定基を共有するいずれのペプチドの存在をも検出し得る。放射性同位元素標識競合結合実験は、出典明示して本明細書の一部とみなす、Ａ．Ｈ．Ｌｉｎら，ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＡｇｅｎｔｓａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９７，ｖｏｌ．４１，ｎｏ．１０．ｐｐ．２１２７−２１３１に記載されている。
【００４８】
本発明の理解を助けるために、以下の実施例を含める。本発明に関連する実験は、もちろん、本発明を特異的に限定することを意図するものではなく、当業者の視野の範囲内に存在するであろう、現在知られているまたは後に開発される本発明のかかる変形は本明細書および後記の請求の範囲に記載する発明の範囲内に入ると考えられる。
【００４９】
実施例
以下に記載する実験において、ＰＰリガンドファミリーのメンバーを種々のアッセイで用いた。別段指摘しない限り、すべてのペプチド試験化合物はｐＨを測定することなく、１−５ｍｇ／ｍｌの濃度まで生理食塩水に溶解した。すべての場合において、調製物は投与する前は視覚で清澄であった。
【００５０】
実施例：一晩絶食したＮＩＨ／ＳＷマウスにおける摂食に対するＹ受容体リガンドの活性
雌性ＮＩＨ／Ｓｗｉｓｓマウス（８−１２週齢）を群にわけて、０６００に点灯する１２：１２時間の明所：暗所サイクルで飼育した。水および標準的なペレット状マウス食餌を特に注記しない限り自由に与えた。動物を実験の１日前に、ほぼ１５００時間目に個別に絶食させ飼育を開始した。実験日の午前（ほぼ０６３０時）に、すべての動物の体重を計測し、群の間で最も類似する体重分布になるように実験群に分割した。典型的な実験においては、対照群にｎ＝１０および各処理群に少なくともｎ＝５とした。
【００５１】
時間＝０分において、すべての動物に５ｍｇ／ｋｇの体積で担体または化合物の腹膜内注射を投与し、ただちに予め計量した量（１０−１５ｇ）の標準的な食餌を与えた。増加する投与量のＰＹＹ［３−３６］またはＰＹＹ（０．１μｇ／ｋｇないし５００μｇ／ｋｇ）およびＮＰＹ（１００および５００μｇ／ｋｇ）、ならびに単一の高用量のＮＰＹ［３−３６］（１００μｇ／ｋｇ）、Ｎ−末端アセチル化Ａｃ−ＰＹＹ［２２−３６］（２００μｇ／ｋｇ）およびＰＰ（５００μｇ／ｋｇ）を、図１に示すように与えた。１時間目に食餌を取出し、重量を計測して消費された食餌の量を算出した（Ｍｏｒｌｅｙ，Ｆｌｏｏｄら，ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌ２６７：Ｒ１７８−Ｒ１８４，１９９４）。
【００５２】
分析：
摂食は時間＝０で最初に与えた食餌の重量から１時間後に残っていた食餌の重量を差し引くことによって算出した。摂食に対する処理の効果は対照に対する％変化として表す。
有意な処理の効果はＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０５）によって同定した。有意差が存在する場合には、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定（Ｐｒｉｓｍｖ２．０１，ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて試験平均を対照平均と比較した。
【００５３】
結果：
図１に見られるように、１０、１００および５００μｇ／ｋｇで末梢投与（腹膜内注射）したＰＹＹは、一晩絶食した雌性ＮＩＨ／ＳＷマウスにおいて６０分間にわたって測定した摂食を顕著に低下させた。ＰＹＹ［３−３６］のこれらの用量はほぼ等しい効力を有していた。ＰＰおよびＮＰＹは５００μｇ／ｋｇで活性に向かうトレンドを示した。しかし、ＮＰＹおよびＮＰＹ［３−３６］［配列番号：５］は１００μｇ／ｋｇで不活性であった。２００μｇ／ｋｇのＡｃ−ＰＹＹ［２２−３６］［配列番号：６］も不活性であった。効力のランク順序は：ＰＹＹ［３−３６］＞ＰＹＹ＞＞ＮＰＹ＝ＮＰＹ［３−３６］＝ＰＰ＝Ａｃ−ＰＹＹ［２２−３６］であった。効力のランク順序、詳細にはＮＰＹの効果の欠如は、いずれの知られているクローン化受容体の薬理学にも反映しなかった。
【００５４】
末梢投与したＰＰは摂食を低下させることが報告されている（Ａｓａｋａｗａ，Ｉｎｕｉら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ２０：１４４５−８，１９９９）。さらに、肥満マウスに末梢投与したＰＰは、報告されているところによると、摂食および体重を減少させた（Ｍａｌａｉｓｓｅ−Ｌａｇａｅ，Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒら，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ３３：９１５−７，１９７７）。ｏｂ／ｏｂマウスは、幾つかの食欲不振源に対して過敏感であることが報告されている（ＹｏｕｎｇおよびＢｈａｖｓａｒ．ＰｒｏｇｒａｍａｎｄＡｂｓｔｒａｃｔｓ，１ＯｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｇｒｅｓｓｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ４１９（ポスターＰ２−５８），１９９６）。ＰＰを過剰発現しているマウスは体重および摂食が減少すると報告された（Ｕｅｎｏ，Ｉｎｕｉら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１１７：１４２７−３２，１９９９）。本出願人らは、図１に示した試験系においてはＰＰで摂食を低下させることはできなかった。Ａｓａｋａｗａらの実験は、短時間単一注射実験であり、体重変化に対するデータは何ら提供していない。ＰＰトランスジェニックマウス実験（Ｕｅｎｏら，，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１１７：１４２７−３２，１９９９）は過剰発現動物における体重および摂食の低下を示すことを主張しているが、動物の半数は周産期器官に死亡し、これは飢餓に通じるミルク摂取の低下の直接的な説明とは離れた病態生理学の信号を出している可能性がある。さらに、遺伝子発現系は膵臓特異的でなく、ペプチドは脳中で発現しており、これは過剰発現データのいずれの解釈をも混乱させる。Ｕｅｎｏらは、彼らのデータから、ＰＰはＧＥの調節を部分的に介して摂食および体重調節に関与している可能性があると結論付けているが、実施例１および２（下記）中のデータはＰＰが食物消費に対してほとんどまたは全く効果を有しておらず、胃内容排出を鈍化させることに本質的に不活性であることを示している。重要なのは、ＰＰがＰＹＹ（またはＮＰＹ）と５０％しか相同性がなく、異なる一次組織局在性（膵臓−対−腸Ｌ−細胞−対−ニューロン）を有し、Ｙ１およびＹ２を超えるＹ４受容体に対して明らかな優先を有する。ＰＹＹに対して７０％相同なＮＰＹは、中枢投与した場合は強力な摂食亢進剤である。それは摂食において適度な低下しか生じず、末梢投与した場合の実施例２（下記）の胃内容排出アッセイにおいて完全に不活性である。
【００５５】
実施例２：ＨＳＤラットにおける胃内容排出に対するＹペプチドリガンドの活性
１８０−２１５ｇの雄性ＨＳＤラットを１２：１２時間の明所：暗所サイクルで飼育し、２０時間（一晩）絶食した。時間＝０分に、試験ペプチド（ＰＹＹ［３−３６］、ＰＹＹ、Ａｃ−ＰＹＹ［２２−３６］、ＮＰＹ、ＮＰＹ［３−３６］またはＰＰ）または生理食塩水担体を意識のあるラット（ｎ＝６／群）に注射（腹膜内）した。ｔ＝１分において、５μＣｉの^３Ｈ−３−Ｏ−メチルグルコースを含有する１ｍＬの滅菌水の溶液を口腔咽頭チューブによって意識のあるラットに胃管栄養した。胃管栄養から４０分後に血液試料（１０μｌ）を採取し、血漿中のｃｐｍについてアッセイした。尾部静脈の試料採取の間の苦痛を取り除くため、２％のリドカイン（０．１ｍＬ）を尾部の端から３−４ｃｍに注射した（Ｇｅｄｕｌｉｎ，Ｊｏｄｋａら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１０８：Ａ６０４，１９９５）。
【００５６】
データ分析：
試験化合物の効果は、対照に対する％変化として表し、これは−１００＊（１−（平均試験ラット／平均対照））として算出した。
相対活性は、ＡＮＯＶＡにより検定してｐ＜０．０５である場合に有意とした。有意差が存在する場合には、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定（Ｐｒｉｓｍｖ２．０１，ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて試験平均を対照平均と比較した。
【００５７】
結果：
図２に見られるように、１０μｇ／ｋｇ以上の用量で末梢投与（腹膜内注射）したＰＹＹ［３−３６］は、顕著かつ用量依存的に、ＨＳＤラットで４０分に測定した胃内容排出を低下させた。１００および５００μｇ／ｋｇのＰＹＹも効力があった。それに対して、５００μｇ／ｋｇで注射したＮＰＹ、ＮＰＹ［３−３６］またはＰＰおよび２００μｇ／ｋｇのＡｃ−ＰＹＹ［２２−３６］は不活性であった。試験化合物の効力の順番は以下のとおりである：ＰＹＹ［３−３６］＞ＰＹＹ＞＞ＮＰＹ＝ＮＰＹ［３−３６］＝ＰＰ＝Ａｃ−ＰＹＹ［２２−３６］。この効力プロファイルは摂食について見られたものと類似している（図１）。ＮＰＹの効果の欠如は、いずれか知られているクローン科受容体の薬理学を反映していない。Ａｃ−ＰＹＹ［２２−３６］が両方のアッセイにおいて不活性であったことは重要である。Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら，米国特許第５，６０４，２０３号では、このサブペプチドがラットの腸ＰＹＹ受容体およびＹ２受容体の両方に対するリガンドであることが報告されているからである。
【００５８】
実施例３：ＰＹＹ［３−３６］の緊急末梢投与はラットにおける胃酸分泌を阻害する
雄性ハーランスプラーグドーリーラットを１２：１２時間の明所：暗所サイクルで飼育した。すべての実験は明所サイクルの間に行なった。動物は実験前のほぼ２０時間は絶食させたが、実験が開始するまでは自由に水を飲ませた。
ラット（１１−１６週齢、体重２９１−３６５ｇ）に胃フィステルを外科的に装着した（Ｋａｔｏ，Ｍａｒｔｉｎｅｚら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ１６：１２５７−１２６２，１９９５）。一晩絶食させたラットの体重を測定し、それらの胃フィステルを外し、胃まで伸長するであろうＰＥ２０５チュービングの一片を嵌めたフレキシブルなＴｙｇｏｎチュービング（３／８×１／１６）に連結した。生理食塩水を狭い方のＰＥ２０５チュービングを通して注射し、Ｔｙｇｏｎチュービングから流出物を収集した。フィステルおよび空の胃からの適当な流動を確保するために、流動が容易になりかつ流出物が清涼になるまで、胃に室温の〜５ｍＬの生理食塩水溶液を数回流した。胃酸分泌は５ｍＬの生理食塩水を注射することによって１０分間隔で測定し、つづいて３ｍＬの空気を注入し、流出物を収集した。３ｍＬの各胃の吸引物を、ｐＨメーターを使用しつつ０．０１Ｎの水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．０にタイトレートした。各タイトレーションに要し、収集した合計体積に補正した塩基の量を用いて各試料中の酸のモルを算出した。
【００５９】
ベースライン試料を収集した、回収した体積を記録した後に、動物に１２５μｇ／ｋｇのペンタガストリンを皮下注射して胃分泌を刺激した。胃酸分泌物を毎１０分にサンプリングした。ペンタガストリンを注射して４０分後に、動物に１００μｇ／ｋｇのＰＹＹ［３−３６］または生理食塩水を皮下注射し、胃分泌物のサンプリングを毎１０分で合計２時間続けた。データは、１０分間のサンプリング間隔当りに分泌された酸のμｍｏｌ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４／群）として表す。
【００６０】
結果：
図３は末梢（腹膜内）注射（１００μｇ／ｋｇ）によって緊急投与したＰＹＹ［３−３６］がラットにおけるペンタガストリン刺激した胃酸分泌を阻害することを実証している。この効果のＥＤ_５０は、ほぼ２０μｇ／ｋｇであった。
【００６１】
実施例４：ＰＹＹ［３−３６］の緊急末梢投与はマウスにおける胆嚢排出を妨げる−−ＣＣＫ−８によって可逆的
マウスは、実験を開始するまでは、水およびマウス食餌を自由に摂取し得るようにしつつ１２：１２時間の明所：暗所サイクルで飼育した。ｔ＝０で、１、１０、１００または１０００μｇ／ｋｇのＰＹＹ［３−３６］、１または１０μｇ／ｋｇのＣＣＫ−８、両方または生理食塩水をマウスに皮下注射した（図４に示す処理およびｎ／群）。３０分後に、動物を麻酔し、その無傷の胆嚢を取出し、計量した。
【００６２】
分析：
データはｍｇで器官重量として表す。活性は対照群の平均からの変化として定義した。統計学的な有意性はＡＮＯＶＡおよび／またはＤｕｎｎｅｔｔ検定によるｐ＜０．０５と定義した。
【００６３】
結果：
図４から見れるように、１０μｇ／ｋｇ以上の用量で緊急末梢注射によって投与したＰＹＹ［３−３６］はマウスにおける胆嚢内容排出を妨げた。内容排出のこの阻害はＥＤ５０３１μｇ／ｋｇを有し、試験したＰＹＹ［３−３６］の最大用量でさえもＣＣＫ−８によって圧倒された。
【００６４】
実施例５：ＰＹＹ［３−３６］の緊急末梢投与はラットにおけるＣＣＫ−８刺激した内分泌性膵臓分泌（アミラーゼ）を阻害する
雄性ハーランスプラーグドーリーラットを１２：１２時間の明所：暗所サイクルで飼育した。全ての実験は明所サイクルの間に行なった。動物は実験前にほぼ２０時間絶食させたが、実験が開始するまでは水を自由に与えた。
【００６５】
ラットは５％のハロセインで麻酔し、手術の間は２％のハロセインで維持し、その後は１％のハロセインで維持した。大腿動脈の気管切開および挿管を行ない、体温は加熱操作テーブルを切り替えるサーモレギュレーターで体温を制御した。血液サンプリングに使用した大腿動脈線をヘパリン処理した生理食塩水（２Ｕ／ｍｌ）で灌流し、血圧を記録するための血圧変換機に連結した。中線切開（ｍｉｄｌｉｎｅｉｎｃｉｓｉｏｎ）を介して、２のポリエチレン製カニューレを総胆−膵管（ｃｏｍｍｏｎｂｉｌｅ−ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｄｕｃｔ）に、該管が膵臓に入るところの約０．５ｃｍ上方で挿入した。第１のカニューレは肝臓へ向けて上方に挿入して胆汁を採取した。このカニューレの他端は、十二指腸における小切開を介して十二指腸に入れた。したがって、肝臓から小腸に直接流れる胆汁を完全に膵臓から離れてそらせた。第１のカニューレの近くの総胆−膵管に挿入した第２のポリエチレン製カニューレは、膵臓に向けて指向させて膵液を収集した。膵管をそれが十二指腸に入るところで結紮し、分泌した膵液を収集カニューレに強制的に送った。
【００６６】
膵液はｔ＝−１５ないし＋６０分に１５分の間隔で収集した。膵液の体積（重量によって測定した）およびアミラーゼの活性を各１５分間アリコットについて測定した（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｙａｚａｋｉら，ＥｕｒＪＰｈａｒｍａｃｏｌ３１２：２２７−３３，１９９６）。膵液はアッセイの前に１：２０００に希釈した。酵素分泌は、活性を収集した体積に乗じることによって得られた１５分間当りの単位で表した（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｙａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｙｏｍｏｔａ，Ｅ．，Ｓｈｉｋａｎｏ，Ｔ．，Ｅｎｄｏ，Ｔ．，ａｎｄＮａｇａｓａｋｉ，Ｍ．ＥｕｒＪＰｈａｒｍａｃｏｌ３１２：２２７−３３，１９９６）。
【００６７】
統計解析
ペアワイズ統計解析をスチュデントｔ検定を用いて行った；Ｄｕｎｎｅｔ検定を用いた対照に対する多重比較；一般的な効果を一方向ＡＮＯＶＡによって検定した。結果は、平均±平均の標準誤差として報告する。Ｐ＜０．０５を有意性のレベルとして用いた。
【００６８】
結果：
図５は、３０μｇ／ｋｇで緊急末梢（皮下）注射することによって投与したＰＹＹ［３−３６］が、膵液中のアミラーゼ活性によって測定してラットにおけるＣＣＫ−８刺激した膵臓分泌をブロックしたことを示している。ＣＣＫ−８不存在下では、３００μｇ／ｋｇのＰＹＹ［３−３６］は、生理食塩水を注射した対照と比較した場合に基底アミラーゼ活性に対して何ら影響を及ぼさなかった。
【００６９】
実施例６：連続した末梢ＰＹＹ［３−３６］注入は、肥満Ｃ５７ＢＩ／６（ＤＩＯ）マウスにおける体重を減少させる。
雄性Ｃ５７Ｂ１／６マウス（実験開始時に４週齢）に高脂肪（ＨＦ；脂肪として５８％の食餌ｋｃａｌ）または低脂肪（ＬＦ；脂肪として１１％の食餌ｋｃａｌ）の餌を摂食させた。食餌を与えて７週後に、各マウスに、４週間連続してＰＹＹ［３−３６］（３０、１００、３００または１０００μｇ／ｋｇ／日）の図６に示す用量をデリバリーする浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ＃２００４）を移植した。体重および摂食を毎週測定した（Ｓｕｒｗｉｔ，Ｆｅｉｎｇｌｏｓら，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ−ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ４４：６４５−６５１，１９９５）。
【００７０】
データ分析：
試験化合物の効果は、処理群当り少なくとも１４匹のマウスの出発体重からのグラム単位の変化の平均±ｓｄとして表した（（ｐ＜０．０５ＡＮＯＶＡ，Ｄｕｎｎｅｔｔ検定（Ｐｒｉｓｍｖ２．０１，ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）。
【００７１】
結果：
図６は、連続末梢注入によって投与したＰＰＹ［３−３６］が食餌誘導した肥満症（ＤＩＯ）マウスにおける体重に用量依存的な減少を生じたことを実証している。効果は、最初の３週間については３００μｇ／ｋｇ／日および１０００μｇ／ｋｇ／日の用量については全ての時点で有意であった。
【００７２】
実施例７：ＰＹＹ［３−３６］の連続末梢注入は肥満Ｃ５７Ｂ１／６（ＤＩＯ）マウスにおけるカロリー能率を低下する
雄性Ｃ５７Ｂ１／６マウス（実験開始時に４週齢）に高脂肪（ＨＦ；脂肪として５８％の食餌ｋｃａｌ）または低脂肪（ＬＦ；脂肪として１１％の食餌ｋｃａｌ）の餌を摂食させた。食餌を与えて７週後に、各マウスに、４週間連続してＰＹＹ［３−３６］（３０、１００、３００または１０００μｇ／ｋｇ／日）の図６に示す用量をデリバリーする浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ＃２００４）を移植した。体重および摂食を毎週測定した（Ｓｕｒｗｉｔ，Ｆｅｉｎｇｌｏｓら，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ−ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ４４：６４５−６５１，１９９５）。
【００７３】
分析：
試験化合物の効果は、消費したｋｃａｌ当りの出発時の体重から体重における変化（ｇ）として表す。消費したｋｃａｌは、消費した食物の重量（ｇ）に製造業者によって特定されたカロリー密度（ｋｃａｌ／ｇ）を乗じることによって計算した。これらのデータは実施例３において使用した動物に由来することを注意されたい。
活性はｎ＝少なくとも１４のマウス／群の平均±ｓｄの変化として定義した。有意性はＡＮＯＶＡまたはＤｕｎｎｅｔｔ検定によるｐ＜０．０５と定義した。
【００７４】
結果：
図７は連続末梢注入によって準慢性的に投与したＰＹＹ［３−３６］が食餌誘導肥満（ＤＩＯ）マウスにおいてカロリー能率（増えた体重／消費したｋｃａｌとして算出）の用量に関連する低下を生じたことを示している。効果は１０００μｇ／ｋｇ／日については全ての時点で、３００μｇ／ｋｇについては幾つかの時点で有意であった。
【００７５】
実施例８：２８日間のＰＹＹ［３−３６］の連続末梢注入は肥満糖尿病（ＺＤＦ）ラットにおける血糖制御を改善する。
糖尿病の肥満Ｚｕｃｋｅｒラット（ＺＤＦ）（７週齢）を、１２：１２時間の明所：暗所サイクル室で飼育し、高脂肪げっ歯類食餌および水を自由に摂取できるように与えた。１週間順化させた後に、血液試料を引抜き、動物を出発ＨｂＡｌｃによってソートして各処理群に同様な範囲を得た。
【００７６】
動物に、末梢に２８日間連続してＰＹＹ［３−３６］の図８に示す用量または生理食塩水をデリバリーする浸透圧ポンプを移植した。ＨｂＡ１ｃは一週間間隔で測定した。ＨｂＡｃ１レベル（％）を時間に対してプロットした（Ｂｒｏｗｎ，Ｈｅｎｋｅら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ４８：１４１５−２４，１９９９）。
【００７７】
結果：
図８に示すごとく、ＤｉａｂｅｔｉｃＺｕｃｋｅｒＦａｔｔｙ（ＺＤＦ）ラットに末梢注入することによって連続投与したＰＹＹ［３−３６］は、ＨｂＡ１ｃのレベルによって測定して長期血中グルコース制御における用量依存的な改善を生じた。血糖症制御における改善は処理期間全体を通じて上昇し、２８日におけるＰＹＹ［３−３６］の全ての用量において顕著であった。
【００７８】
前記の実施例は、ＰＹＹアゴニストがカロリー利用能を低下させることに有用性を有し、肥満症および２型糖尿病のごときカロリー利用能の低下から利益を得る症状を治療するための治療剤として使用し得る。さらに、実施例はカロリー利用能を低下させるＰＹＹアゴニストの効果が幾つかの機構を介して生じ、ＰＹＹアゴニストを同定するための枠組みを提供することを示している。ＰＹＹおよびＮＰＹは実験したすべてのＹ１およびＹ２受容体アッセイにおいて等しく効力があるかまたは等しく有効であると報告されているため、前記実施例１および２のデータは摂食を低下させる（図１）および胃排出を遅延させる（図２）ことに対するＰＹＹおよびアゴニストの効果がＹ１またはＹ２受容体を介して仲介されないことを示している。これらのデータは、ＮＰＹがこれらのアッセイにおいてほとんどまたは全く活性を示さなかったため、摂食および胃排出に対するＰＹＹの効果がＹ１およびＹ２受容体に対する報告された効果に匹敵しないことを示している。
【００７９】
図１は本発明の１の態様を示している。ＰＹＹまたはＮＰＹアゴニストの中枢投与が摂食を増大させることは知られている（Ｃｌａｒｋ，Ｋａｌｒａら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１１５：４２７９，１９８４；Ｃｌａｒｋ，Ｓａｈｕら，ＲｅｇｕｌＰｅｐｔ１７：３１−９，１９８７）。予期せぬことには、本発明者らは、ＰＹＹまたはＰＹＹ［３−３６］の末梢投与が摂食を効果的に低下させることを見出した。ここには示さないが、本発明者らは、ｏｂ／ｏｂマウスおよびｆａ／ｆａラットを含むほかのげっ歯類モデルにおける長期実験においてＰＹＹ［３−３６］が摂食を効果的に低下させることを実証した。末梢投与した場合、他のメンバーのＰＰファミリーは摂食に対してほとんどまたは何ら効果を有していなかった。効力の順序、詳細にはＮＰＹの効果の欠如；はいずれの既知のクローン化されたＹ受容体の薬理学も反映していない。ＰＹＹアゴニストのユニークな薬理学は、このアッセイにおいて不活性である他のＰＰファミリーのメンバーと比較した場合の胃内容排出を遅延させるその効力効果によってさらに確立される（例えば、図２のデータを参照されたい）。
【００８０】
ＰＹＹアゴニストであるＰＹＹ［３−３６］の特徴付けにより、カロリー利用能を低下させ得るというさらなる機構が示された。これらには、胃酸分泌の低下（図３）、内分泌性膵臓分泌の低下（図５）、胆嚢排出の遅延（図４）が含まれる。いずれの理論に拘束させるものではないが、本発明者らは、摂食および胃腸機能に対する効果のこの全体のスペクトルは、カロリー利用能を低下させるＰＹＹアゴニストの有用性に帰すると仮定する。例えば、報告されているところによると、ＰＹＹおよびＰＹＹ［３−３６］は、ウサギにおいて迷走神経刺激した胃酸の生成を阻害した（Ｌｌｏｙｄ，Ｇｒａｎｄｔら，ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌ２７０：Ｇ１２３−Ｇ１２７，１９９６）。ＰＹＹはヒト（Ａｄｒｉａｎ，Ｆｅｒｒｉら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ８９：１０７０−７，１９８５）およびラット（Ｇｒｅｅｌｅｙ，Ｇｕｏら，ＰｒｏｃＳｏｃＥｘｐＢｉｏｌＭｅｄ１８９：３２５−８，１９８８）においてペンタガストリン刺激した胃酸分泌も阻害し、ラットにおいてＧＲＦ−誘導した胃酸分泌を阻害した（Ｇｕｅ，Ｊｕｎｉｅｎら，ＢｒＪＰｈａｒｍａｃｏｌ１１８：２３７−４２，１９９６）。ＰＹＹ（Ｙｏｓｈｉｎａｇａ，Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉら，ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌ２６３：Ｇ６９５−７０１，１９９２）（Ｇｕａｎ，Ｍａｏｕｙｏ，ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１２８：９１１−６，１９９１）（Ｐａｐｐａｓ，Ｄｅｂａｓら，ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌ２４８：Ｇｌｕｓ−２３，１９８５）およびＰＹＹ［３−３６］（Ｄｅｎｇ，Ｇｕａｒｉｔａら，ＤｉｇＤｉｓＳｃｉ４６：１５６−６５，２００１）は膵臓酵素分泌を阻害することが報告されており、最近、ＰＰＹがＣＣＫ−依存相ではなく頭部依存相の胆嚢排出を低下させることが報告された（Ｈｏｅｎｔｊｅｎ，Ｈｏｐｍａｎら，ＳｃａｎｄＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ３５：１６６−７１，２０００）。
【００８１】
本発明者らは、本明細書中で同定した機構を介してＰＹＹアゴニストでの処理が、体重を低下させることを提唱する。本発明者らは、幾つかの肥満げっ歯類モデルにおいて、ＰＹＹ［３−３６］の末梢投与が体重および／または獲得体重の比率における用量依存的な低下を生じることを確立した。本発明者らは、本明細書中において、食餌誘導肥満（ＤＩＯ）マウスモデルにおいてこの効果を実証する（図６）。
【００８２】
さらに、図１に要約するごとく、ＰＹＹアゴニストの末梢投与は摂食を低下させる。ＤＩＯマウス実験において消費されたｋｃａｌ当りの獲得した体重の計算から、ＰＹＹアゴニストの末梢投与が、カロリーを体重に変換する効率を低下させることが明らかとなった（図７）。したがって、この実施例はカロリー利用能と関連して獲得した体重を低下させるＰＹＹアゴニストの効果を支持している。
【００８３】
ＰＹＹおよびＰＹＹアゴニストは、より詳細には、肥満症、２型糖尿病および心血管疾患のごときカロリー利用能の低下から利益を得るであろう疾患の治療における有用性を有する。本発明者らは、肥満糖尿病マウスであるＺＤＦラットにおけるＰＹＹ［３−３６］の抗糖尿病活性を調べた。ＰＹＹアゴニストの末梢投与は、ヘモグロビンＡｌｃレベルによって測定する血糖制御における顕著な、強い、用量に関連する改善を生じる（図８）。実施例には示していないが、ＰＹＹ［３−３６］投与によって摂食も低下した。
【００８４】
実施例９：最後野アッセイ
末梢投与したＰＹＹは最後野のニューロンを活性化することが報告されている（Ｂｏｎａｚ，Ｔａｙｌｏｒら，ＮｅｕｒｏｓｃｉＬｅｔｔ１６３：７７−８０，１９９３）。本発明の効力のある化合物のＰＹＹアゴニスト活性の評価は、下記のようにして、例えば実施例１および２の方法のようなＰＹＹ効果のアッセイと組合せて、最後野アッセイを用いて行ない得る。
【００８５】
膜の調製
このアッセイにおいては、ブタまたはウシの脳幹から切除した組織から最後野膜を調製した。最後野膜の調製は、リン酸生理食塩水（１３８ｍＭＮａＣｌ、８．１ｍＭＮａ_２Ｐ０_４、２．５ｍＭＫＣｌ、１．２ｍＭＫＨ_２Ｐ０_４、０．９ｍＭＣａＣｌ_２、０．５ｍＭＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．４）のごとき緩衝液中、氷冷温度で、例えばＰｏｌｙｔｒｏｎ組織ホモジナイザー（ＢｒｉｎｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＮＹ）を用いて組織を簡単に（４−１０秒）ホモジナイズすることによって開始する。組織を破砕した後に、大きな粒子および残渣を遠心（２００×ｇ、５分、４℃）によって清浄化し、その上清画分を氷に戻す。高速遠心（少なくとも、４００００×ｇ、少なくとも１０分、４℃）によって上清画分から膜を単離する。膜は、通常、新たな緩衝液中に再懸濁し、再遠心することによって少なくとも２回洗浄し、内因性の妨害性の物質を除去する。洗浄した膜を、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）またはバシトラシンのごときタンパク質分解酵素インヒビターを含有する緩衝液中に再懸濁する。最終的な組織濃度を用いる特定のスクリーニング方法に好適なレベルまで調整するのに十分な体積の緩衝液を添加することもできる。
【００８６】
結合反応
１の具体例において、スクリーニング方法のインキュベーション混合物は下記のようにセットアップする。バシトラシンまたはＰＭＳＦのごときプロテアーゼインヒビター、プロテアーゼ非含有血清アルブミン（好ましくは、フラクションＶＢＳＡ、プロテアーゼ非含有）を含有し、ならびに所望によりＭｇ^２＋またはＣａ^２＋塩およびＥＤＴＡを含有していてもよいＨＥＰＥＳのごとき緩衝液からなる少量の緩衝液混合物（ＨＢＢＭ）をガラス製またはポリマー製のチューブに添加する。その緩衝液混合物に、約１０^−１１ないし１０^−５Ｍの濃度のアゴニスト活性について試験すべき非標識分子を含有する小体積の緩衝液を添加する。対照チューブには緩衝液のみが含まれている。この混合物に、最終濃度約１０ないし約１００ｐＭとなるように、緩衝液中の標識した一定量の最後野調製物リガンド（ここでは、ＰＹＹ）を添加する。高い比活性が得られ、化学的に標識するのが簡便なため、^１２５Ｉが最後野リガンドを標識するのに好ましい。リガンドはヒト組織、動物組織から単離するか、または化学合成または組換え手段によって生成し得る。標識した最後野調製物リガンドはプロテアーゼ非含有フラクションＶＢＳＡを含有する滅菌水に溶解し、小分けし、使用するまで冷凍保存する。
【００８７】
反応は、例えば、膜を各インキュベーションチューブに添加することによって開始する。チューブ当りに必要な膜タンパク質の量は、アッセイにおいて膜に結合する標識リガンドの量が、アッセイにおけるリガンドの合計濃度の１０％未満となるように変化させる（典型的には約１００μｇ）。
【００８８】
反応混合物を一定時間、時間内に安定した状態の条件に達するのに十分な温度にてインキュベートする。本明細書中で用いる“安定状態”なる語は、結合したホルモンの正味の量に影響するすべての反応およびプロセス全体の合計を包含することを意図する。それは“平衡”と同義であっても同義でなくてもよい。典型的には、チューブは室温にて約６０分間インキュベートする。
【００８９】
定義
膜を用いる場合、標識リガンドと非標識リガンドとを競合させた後に結合した標識リガンドの量を測定するために、結合させた後に膜を単離する。非特異的結合（ＮＳＢ）を減少するために予め試薬に浸漬しておいたグラスファイバーフィルター（例えば、ＧＦ／Ｂ，Ｗｈａｔｍａｎ）を通す吸引型ＢｒａｎｄｅｌＣｅｌｌＨａｒｖｅｓｔｅｒ（ＢｒａｎｄｅｌＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＭｏｄｅｌＭ−２４）を用いて濾過することによって膜を収集することが便利である。フィルターは約０．３％のポリエチレンイミン中に約５時間予め浸漬させておくのが好ましい。当業者であれば、受容体結合アッセイに使用することができるＭｉｌｌｉｐｏｒｅＦｉｌｔｒａｔｉｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙ（（Ｍｏｄｅｌ１２２５）またはＳａｎｄｂｅｃｋｆｉｌｔｅｒｂｏｘ（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｐ．，ＮｅｕｒｏｔｎａｎｓｍｉｔｔｅｒＲｅｃｅｐｔｏｒＢｉｎｄｉｎｇ，Ｈ．Ｉ．Ｙａｍｕｒａ，ら，；Ｒａｖｅｎ，ＮｅｗＹｏｒｋ１９７８，ｐａｇｅ５７−９０）、収集用フィルター、およびＮＳＢ低下試薬のごとき他の膜収集装置も知っているであろう。濾過の直前および直後の両方に、コンタミネートしている物質、例えば非結合標識リガンドを除去するために、大量（数ｍｌ）の氷冷緩衝液でフィルターを洗浄する。フィルターを取出し、膜に結合した標識リガンドの量を定量化する。^１２５Ｉが標識である場合には、放射能をガンマ線カウンターで評価し得る。化学ルミネセンスレポーター分子（例えば、ＡＭＰＰＤ，Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いる場合には、生成する光をルミノメーターで定量化し得る。酵素的および蛍光的な標識も使用し得る。
【００９０】
濾過の代わりに、膜はインキュベーション後に、遠心（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ−２−２１−Ｍ２１，０００ｒｐｍで冷却遠心またはＢｅｃｋｍａｎ１２もしくはＥｐｐｅｎｄｏｒｆｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）によって単離し、氷冷緩衝液で洗浄し、ついでそれ自体をカウントするか、または界面活性剤もしくはアルカリで膜を可溶化した後にカウントし得る。
【００９１】
データ分析
結合／遊離（Ｂ／Ｆ）の標識リガンドを結合した量の関数としてプロットする結合データのスキャッチャードプロット飽和分析は、標準的な方法によって行なう。例えば、（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ．ＡｎｎＮＹＡｃａｄＳｃｉ５１：６６０，１９４９）を参照されたい。
【００９２】
結合した量（Ｂ）をリガンドの濃度のｌｏｇの関数としてプロットする競合曲線はコンピュータによって分析し得る。例えば、４−パラメータ・ロジスティック式に対する非線形回帰（ＰｒｉｓｍＰｒｏｇｒａｍ；ＧｒａｐｈＰＡＤＳｏｆｔｗａｒｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはＡＬＬＦＩＴプログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ２．７（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ２０８９２））、（ＭｕｎｓｏｎおよびＲｏｄｂａｒｄ．ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ１０７：２２０−３９，１９８０；ｄｅＬｅａｎ，Ａ．，Ｍｕｎｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら，１９８８）によって分析し得る。
【００９３】
結合定数を決定するためにスキャッチャード飽和曲線を作製し、Ｂｙｌｕｎｄ，Ｄ．Ｂ．，ら，”ＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＲｅｃｅｐｔｏｒＢｉｎｄｉｎｇ，”、Ｈ．Ｉ．Ｙａｍａｍｕｒａら編，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＮｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒＡｎａｌｙｓｉｓｓＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９０ｐｐ．１−３５によって記載されているスキャッチャードの方法の変形に従って分析し得る。
【００９４】
実験的に特異的な結合値を得るために、広い範囲のトレーサー濃度の標識リガンド（典型的には、１−１５０ｐＭ）を用いて合計結合を得、非常に高濃度、例えば１００ｐＭの非標識の存在下でチューブを２回評価して、非特異的結合（ＮＳＭ）を得る。毎濃度の標識リガンドの特異的結合を得るために、各合計の結合値から後者の値を差し引いた。
【００９５】
実施例１０：Ｙ受容体結合アッセイ
本発明の潜在的な化合物のＰＹＹアゴニスト活性の評価は、例えば実施例１および２におけるもののようなＰＹＹ効果のアッセイと組合せた、細胞において発現するＹ１−Ｙ６のごときいずれか公知のＹ受容体、あるいはＰＹＹ−優先受容体（Ｙ７のごとき）とのその相互作用を調べることによって行い得る。これらの細胞は、目的のＹ受容体を内因的に発現し得る（Ｙ１受容体を発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞またはＹ２受容体を発現するＳＫ−Ｎ−ＢＥ２細胞のごとき）か、または目的のＹ−受容体のクローンでトランスフェクトした他の細胞（ＣＯＳ−７またはＨＥＫ２９３細胞のごとき）とし得る。
【００９６】
細胞培養
ＳＫ−Ｎ−ＢＥ２細胞を、例えば補充物を含む組織培養培地（１０％ウシ胎児血清、４ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むダルベッコ修飾イーグル培地）を入れた１５０ｍｍプレート上、５％のＣＯ_２の湿度調節した雰囲気中、３７℃にて増殖する。ストックプレートはトリプシン処理し、３−４日おきに１：６に分割する。
【００９７】
膜の調製
細胞を、プレートから小体積のリン酸生理食塩水（１３８ｍＭＮａＣｌ、８．１ｍＭＮａ_２ＰＯ_４、２．５ｍＭＫＣｌ、１．２ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、０．９ｍＭＣａＣｌ_２、０．５ｍＭＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．４）のごとき小体積の緩衝液にかきとるか、あるいはトリプシン処理し、洗浄し、緩衝液に再懸濁する。膜の調製は、氷冷温度で、例えばＰｏｌｙｔｒｏｎ組織ホモジナイザー（ＢｒｉｎｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＮＹ）を用いる、細胞の簡単な（１０秒間）ホモジネーションによって開始する。膜は実施例９に記載したように遠心によってさらに調製する。結合反応、検出およびデータ分析は実施例９に記載したのと同様である。
【００９８】
本明細書中に示し、記載したものに加えて本発明の変形や、それらが後記の請求の範囲の範囲内に入ることは、前記の説明から当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は一晩絶食させたＮＩＨ／ＳＷマウスにおける摂食アッセイのＹ受容体リガンドの活性のプロットである。
【図２】図２は、ＨＳＤラットにおける胃内容排出に対する種々のＹ受容体リガンドの活性のプロットである。
【図３】図３は、ＰＹＹ［３−３６］の緊急末梢投与した際のラットにおける胃酸分泌の阻害を示す。データは、分泌した酸のμｍｏｌ／１０分として表す。
【図４】図４は、ＰＹＹ［３−３６］の緊急末梢投与がマウスにおける胆嚢内容排出を妨げることを示す棒グラフである。この効果はＣＣＫ−８の投与によって逆転し得る。
【図５】図５は、ラットにおけるＣＣＫ−８刺激した外分泌膵臓分泌を阻害するための皮下投与ＰＹＹ［３−３６］の急激な用量依存的な効果を示す。
【図６】図６は、４週間の期間にわたる連続末梢ＰＹＹ［３−３６］注入を用いた肥満Ｃ５７ＢＩ／６（食餌誘導した肥満またはＤＩＯ）マウスにおける体重の減少を示す。
【図７】図７は、肥満Ｃ５７ＢＩ／６（食餌誘導した肥満またはＤＩＯ）マウスにおける４週間の期間にわたるカロリー効率を低下させる連続末梢ＰＹＹ［３−３６］注入の効果を示す。
【図８】図８は、ＰＹＹ［３−３６］を連続末梢注入した際の肥満糖尿病（ＺＤＦ）ラットにおける２８日間にわたるＨｂＡｌｃにおける％変化によって測定した血糖症対照における改善を示す。

Claims

治療上有効量のＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを肥満対象に投与することを含む肥満症を治療する方法。
対象がインスリン抵抗性またはグルコース非耐性のうちの少なくとも１である請求項１記載の方法。
対象が真性糖尿病に罹っている請求項１記載の方法。
ＰＹＹアゴニストがＰＹＹ［３−３６］である請求項１記載の方法。
ＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを末梢投与する請求項１記載の方法。
１日当りに約１μｇないし約５ｍｇのＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを単一用量または分割用量で投与する請求項１記載の方法。
約０．０１μｇ／ｋｇないし約５００μｇ／ｋｇのＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを用量当りに投与する請求項１記載の方法。
治療上有効量のＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを対象に投与することを含む摂食を低下させる方法。
ＰＹＹアゴニストがＰＹＹ［３−３６］である請求項８記載の方法。
ＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを末梢投与する請求項８記載の方法。
１日当りに約１μｇないし約５ｍｇのＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを単一用量または分割用量で投与する請求項８記載の方法。
約０．０１μｇ／ｋｇないし約５００μｇ／ｋｇのＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを用量当りに投与する請求項８記載の方法。
有効量のＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを投与することを含む対象における真性糖尿病を治療する方法。
ＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを末梢投与する請求項１３記載の方法。
対象が２型糖尿病に罹っている請求項１３記載の方法。
対象が体重過多である請求項１３記載の方法。
ＰＹＹアゴニストがＰＹＹ［３−３６］である請求項１３記載の方法。
１日当りに約１μｇないし約５ｍｇのＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを単一用量または分割用量で投与する請求項１３記載の方法。
約０．０１μｇ／ｋｇないし約５００μｇ／ｋｇのＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを用量当りに投与する請求項１３記載の方法。
有効量のＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを対象に投与することを含む該対象における脂質プロファイルを改善する方法。
脂質プロファイルにおける改善が、ＬＤＬコレステロールレベルを低下させること、トリグリセリドレベルを低下させること、およびＨＤＬコレステロールレベルを上昇させることのうちの少なくとも１を含む請求項２０記載の方法。
ＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを末梢投与する請求項２０記載の方法。
治療上有効量のＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを対象に投与することを含む、該対象における栄養利用能を低下させることによって軽減し得る症状または障害を治療するための方法。
症状または障害が高血圧症である請求項２３記載の方法。
症状または障害が高脂血症である請求項２３記載の方法。
症状が心血管の危険性である請求項２３記載の方法。
障害が摂食障害である請求項２３記載の方法。
症状または障害がインスリン抵抗性である請求項２３記載の方法。
症状が肥満症である請求項２３記載の方法。
症状が真性糖尿病である請求項２３記載の方法。
１日当りに約１μｇないし約５ｍｇのＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを単一用量または分割用量で投与する請求項２３記載の方法。
約０．０１μｇ／ｋｇないし約５００μｇ／ｋｇのＰＹＹまたはＰＹＹアゴニストを用量当りに投与する請求項２３記載の方法。
ＰＰＹアゴニストが、摂食または胃内容排出アッセイのうちの少なくとも１においてＮＰＹよりも高い効力を有する請求項１、８、１３、２０または２３のいずれか１項記載の方法。