DE69209277T2

DE69209277T2 - Kombination von igf-i und igfbp für den aufbaustoffwechsel (anabolismus)

Info

Publication number: DE69209277T2
Application number: DE69209277T
Authority: DE
Inventors: Ross G. Pacifica Ca 94403 Clark; Venkat R. Fremont Ca 94536 Mukku
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1991-02-12
Filing date: 1992-01-13
Publication date: 1996-10-31
Anticipated expiration: 2012-01-14
Also published as: CA2101340C; JPH06505235A; WO1992013556A1; EP0571417B1; EP0571417A1; DK0571417T3; CA2101340A1; ES2085001T3; US5187151A; ATE135587T1; GR3019851T3; DE69209277D1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Medikament zur Erzeugung eines anabolen oder wachstumsfördernden Zustands in einem Säuger. Konkreter betrifft diese Erfindung die Verwendung eines Komplexes von IFG-I und einem seiner bindenden Proteine zur Erzeugung eines anabolen Zustands, einschließlich einer Steigerung des Wachstums des gesamten Körpers und des Knochenwachstums.
Im Blutkreislauf, in anderen Körperflüssigkeiten und in Medien, die durch kultivierte Zellen konditioniert werden, sind die Somatomedine (IGF-I und IGF-II) an spezifische hochaffine Trägerproteine gebunden, die als Modulatoren von IGF-Wirkungen angesehen werden. Die Geschichte der IGF-bindenden Proteine (BPs) geht bis 1984 zurück, als zum ersten Mal die Existenz spezifischer Somatomedin-Trägerproteine in Serum gezeigt wurde. Hintz, din. Edocrinol. Metab., 13: 31-42 (1984). Vier unterschiedliche IGF-BPs sind nun kloniert und sequenziert worden und darüber hinaus sind verschiedene andere, noch nicht gründlich charakterisierte BP-Spezies in verschiedenen Geweben identifiziert worden. Siehe beispielsweise Baxter und Martin, Prog. in Growth Factor Res 1: 49-68 (1989); Roghani et al., FEBS Lett, 255: 253-258 (1989); Bautista et al., Clinical Res., 38: PA117 (1990). Auf Grundlage der Sequenzen wurde ersichtlich, daß viele der vorher identifizierten BPs, die unter verschiedenen Namen bekannt waren, in der Tat identisch waren und in eine definierte Anzahl von Klassen klonierter BPs fielen. Zur Klärung des gegenwärtigen Status dieser BPs wurden auf dem "Workshop on IGF Binding Proteins", gehalten im Juni 1989 in Vancouver, Kanada, die Bezeichnungen IGFBP-1, IGFBP- 2 und IGFBP-3 für die bindenden Proteine mit definierten Sequenzen vorgeschlagen. Ballard et al., Acta Endocrinol. (Copenh), 121: 751- 752 (1989). Es wurde eine Übereinkunft auf dem Workshop getroffen, daß andere unvollständig charakterisierte IGFBPs bis zur Sequenzierung durch Größe und Ursprung bezeichnet werden sollten. Seitdem wurde ein weiteres IGFBP, nämlich IGFBP-4, wie unten beschrieben sequenziert.
Fruchtwasser stellte die erste Quelle dar, aus der IGFBP-1 nachgewiesenwurde. Chochinov et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 44: 902-908 (1977). Das Protein wurde auch aus Gewebeextrakt von fötaler und mütterlicher Plazenta gereinigt und Plazenta-Protein genannt. Kiostinen et al., Endocrinology, 118: 1375-1378 (1986). Das reife Protein enthält 234 Aminosäuren, womit ein Molekulargewicht von 25,3 kD vorausgesagt wird. Lee et al., Mol. Endocrinol 2 404-411 (1988); WO 89/09792, veröffentlicht am 19. Oktober 1989. IGFBP-1 wandert bei SDS-PAGE bei 28-35 kD in Abhängigkeit vom Reduktionszustand. IGFBP- 1 ist ein kleineres bindendes Protein in Serum und enthält die ungesättigten Serum-IGF-Bindungsstellen. Die Serumniveaus sind umgekehrt abhängig von Insulin und variieren im Verlauf des Tages deutlich, wobei die Niveaus am frühen Morgen am höchsten sind. Diese Niveaus erhöhen sich in der Schwangerschaft bis zu mehreren 100 µg/l und die Fruchwasserniveaus sind bis zu 1000-fach höher als diejenigen in Serum.
Trägerproteine der IGFBP-2-Klasse sind aus fötaler Human-Leber und Ratten- und Rinder-Zellinien isoliert worden. Binkert et al., EMBO J., 8: 2497-2502 (1989); Rosenfeld et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 70: 551-553 (1990). Bei Menschen enthält die reife Form 289 Aminosäuren und weist ein scheinbares Molekulargewicht von 31-40 kD in Abhängigkeit vom Reduktionszustand bei SDS-PAGE auf. Bei Menschen sind hohe IGFBP-2-Niveaus in der Cerebrospinal-Flüssigkeit gefunden worden. Die Häufigkeit dieses Proteins in fötalem Gewebe legt nahe, daß es eine Rolle bei der Steuerung der Entwicklung spielt. IGFBP- 2 bindet vorzugsweise an IGF-II.
Die Mehrheit der Serum-IGFS sind an ein BP gebunden, welches aus zwei Teilen besteht, die einen Komplex mit einem Molekulargewicht von 125 - 150 kD bilden. IGFBP-3 ist die IGF-bindende Untereinheit (β-Untereinheit) in diesem Komplex. Baxter und Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6898-6902 (1989). Es ist ein säurestabiles Glykoprotein, das bei SDS-PAGE als eine größere und eine kleinere Bande auftritt, entsprechend 53 bzw. 47 kD. Die anderen Komponenten in dem Komplex sind die säurelabile, nicht-IGF-bindende Untereinheit (α-Untereinheit) mit einem Molekulargewicht von 84-86 kD [Baxter, WO 90/0569] und IGF-I oder IGF-II ( -Untereinheit). Die Sequenzierung der klonierten CDNA für IGFBP-3 (früher als IGFBP-53 bekannt) sagt ein Molekulargewicht von 28,7 kD für das unglykosylierte Protein voraus und offenbart, daß IGFBP-3 eine Sequenzidentität von 33% mit IGFBP-1 teilt. Wood et al., Mol. Endocrinol., 2: 1176-1185 (1988); WO 89/09268, veröffentlicht am 5. Oktober 1989.
Jüngst wurde ein 25-kD-IFBP-4 aus durch kultivierte Human-Osteoblasten-ähnliche TE89-Osteosarkomzellen konditionierten Medien isoliert und sequenziert. Mohan etat.4 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 8338-8342 (1989). Ein ähnliches, wenn nicht identisches,IGFBP wurde aus Human-Prostatakarzinom-Zellen isoliert und sequenziert. Perkel et al., J. Clin. Endocrin. and Metab., 71: 533-535 (1990)]. Ein weiteres ähnliches TGFBP wurde im Serum adulter Ratten identifiziert. Shimonaka et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 165: 189-195 (1989).
Es wurde festgestellt, daß die Niveaus an IGFBP im Serum von Erwachsenen den Wachstumshormon (GH)-Status von Individuen reflektieren, die entweder GH-defizient oder akromegalisch sind. So korrelieren hohe Niveaus an IGFBP-3 mit hohen Niveaus an GH. Martin und Baxterl J. Olin. Endo. and Metabol., 61: 799-801 (1985). Unter normalen Bedingungen sind etwa 95 - 98% des IGF-I in Humanplasma an die IGFBPs gebunden. Untersuchungen von größenfraktioniertem Humanserum, das nach der Extraktion jeder Fraktion zur Entfernung von bindender Aktivität einem IGF-I-RIA unterworfen wurde, zeigten, daß 72% des endogenen Peptids mit der 150-kD-Fraktion und 25% mit der 50-kD-Fraktion assoziiert sind. Daughaday et at., J. Clin. Endocrinol. Metab., 55: 916-921 (1982).
Die Literatur hat IGFBP-3 sowohl eine passive Rolle als Träger von IGF-I, der dessen Halbwertszeit im Kreislauf verlängert, als auch eine aktive Rolle als Promotor von IGF-I-Aktivität zugeschrieben. Beispielsweise wurde von Biogrowth, Inc. offenbart, daß IGFBP-3 die Heilung bei einem Wundheilungs-Tiermodell signifikant beschleunigt und daß der Komplex von IGF-I und IGFBP-3 kortikales und trabekuläres Knochenwachstum bei Ratten in vorläufigen Versuchen stimuliert, was nahelegt, daß die BP zur Behandlung von Osteoporose geeignet sein könnten. Siehe Bibventure View, Band IV, Nr. 1 (31. Januar 1989), Seiten 19-20. Siehe auch EP 294021 und 375438 von BioGrowth, Inc., welche offenbaren die Verwendung von IGFBP-3 in Verbindung mit IGF-I oder -II zur Behandlung von Krankheiten wie Osteoporose und Human-GH-Defizienz, und zur Wundheilung und Steigerung von Tierwachstum, einschließlich der Abgabe an Knochengewebe, um das Knochenwachstum zu stimulieren (siehe z.B. S. 8 von EP 294021 und S. 11 von EP 375438). Siehe auch WO 90/00569, veröffentlicht am 2. Januar 1990. Für diese spekulativen Verwendungen stehen keine Daten zur Verfügung. Es gibt einen Vorschlag von Biogrowth-Wissenschaftlern, daß IGFBP-3 (als IGF-CP bezeichnet) anscheinend IGF- gesteuertes Knochenwachstum bei Ratten steigert. Talkington-Verser et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 16: 223- 224 (1989). Es werden jedoch keine Versuchsprotokolle oder Daten angegeben.
Es wurde auch offenbart, daß ein 28-kD-IGFBP aus Human-Plazenta- und Hepatom-CDNA-Banken in gemeinsamer Verabreichung mit IGF-I, IGF- II oder anderen Wachstumsfaktoren oder formuliert als übliche Präparate für die topische Anwendung in therapeutischen Vorrichtungen, die zur Heilung von Wunden oder Knochen oder zur Behandlung von Osteoporose geeignet sind, für eine stetige kontrollierte Freisetzung der Somatomedine in solchen Vorrichtungen wertvoll sein könnte. WO 89/08667, veröffentlicht am 21. September 1989, Seiten 8-9.
Ein weiteres Human-BP, das dem BRL-3A der Ratte äquivalent ist, wird in EP 369943, veröffentlich am 23. Mai 1990, in Kombination mit einem IGF als geeignet zur Behandlung von z.B. Osteoporose, Zwergwuchs vom Laron-Typ, Anämien, Hypophysenunterfunktion und Wunden angegeben (siehe Spalte 15). IG-I- und -II-BPs, die IGF-potentierende und inhibierende Aktivitäten aufweisen, sind in WO 89/09792, veröffentlicht am 19. Oktober 1989, beschrieben.
Ferner wurde auf der Basis von Untersuchungen unter Verwendung von Babyhamster-Nieren- und Human-Haut-Fibroblasten die Auffassung vertreten, daß IGFBP als Reservoir dient, das kontinuierlich geringe Mengen von IGF-I freisetzt und so einen Gleichgewichtszustand von Rezeptor-Besetzung erzeugt, der ein besserer mitogener Stimulus zu sein scheint als vorübergehende große Konzentrationen von IGF-I. Blum et al., Endocrinology, 125: 766-772 (1989).
Jedoch stellen mehrere jüngere Übersichtsartikel die präzisen biologischen Aktivitäten der IGFBPs weiter in Frage. Beispielsweise stellen Zapf et at., Growth Factors: From Genes to Clinical Application, Karolinska Nobel Conference Series, Hrsg. Vicki Sara et al., (Raven Press 1990), S. 227] fest, daß sowohl inhibierende als auch verstärkende Wirkungen von IGF-Trägerproteinen auf IGF-Wirkungen in vitro beobachtet wurden, unter Berufung auf DeMellow et at., Biochem. Biophys. Res. Comm., 156: 199-204 (1988); Elgin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 3254-3258 (1987); Knauer und Smith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 22: 7252-7256 (1980); Meuh et al., Diabetologia, 14: 255-259 (1978); Schwiwiller et al., Nature, 323: 169-171 (1986). Zapf et al., stellen ferner fest, daß es immer noch unbekannt ist, ob sich die verschiedenen bisher bekannten IGFBP-Spezies hinsichtlich der Inhibierung oder Verstärkung der wachstumsfördernden Wirkungen von IGF unterscheiden.
Auf Seite 241 desselben Buchs stellen Hall et at. fest, daß im allgemeinen IGFBP-1 ähnlich wie IGFBP-3 als Inhibitor für die IGF- I-Stimulierung der Aminosäureaufnahme und DNA-Synthese befunden wird, unter Zitierung von u.a. Walton et al., P.S.E.B.M., 190: 315- 319 (1989).
In einem Ubersichtsartikel von 1988 wird berichtet, daß trotz erhöhtem Interesse an IGFBPs in den letzten Jahren deren Funktionen immernochwenigverstandenwerden. Baxter, Comp. Biochem. Physiol., 91B, 229-235 (1988), S. 232-233. Baxterweist auf einige Befunde hin, daß eine Assozuerung mit BPs die Aktivität der IGFs nicht immer inhibieren könnte und daß Zelltypen, welche die BPs produzieren, imstande sein könnten, ihr Ansprechverhalten auf IGF in einer autokrinen Weise zu erhöhen. Es werden Beispiele zitiert, daß einige Komplexe aus Humanplasma mit hohem Molekulargewicht die biologische Aktivität in Ratten-Adipozyten-Assays auf Insulin-ähnliche Aktivität beibehalten, kultivierte Human-Fibroplasten ein BP von 35 kD sekretieren, welches die Zell-IGF-Bindung erhöht, und eine reine Präparation von Fruchtwasser-BP die Wirkung von IGF-I bei der Stimulierung der DNA-Synthese in glatten Schweinemuskelzellen und Fibroplasten verschiedener Spezies signifikant verstärkt. Ferner wurde gezeigt, daß IGFBP-3 bei subkutaner Verabreichung zusammen mit dem IGF-I in einem 1:1-Verhältnis die hypoglykämische Wirkung von IGF-I blockiert. Spencer et al., 2nd International Symposium on Insulin-Like Growth Factors/Somatomedins, 12.-16. Januar 1991, Program and Abstracts, S. 269.
Ein weiterer Standpunkt ist, daß IGFBPs lokal in allen Geweben produziert werden, um lokal produziertes IGF-I in der Nähe von Zellen zu konzentrieren, die das IGF-I benötigen, was die aktive Rolle von an BPs gebundenem IGF-I und im Blut zirkulierendem IGF-I reduziert. Isaksson et al., Endocrine Reviews, 8: 426-438 (1987). Es ist beispielsweise berichtet worden, daß IGF-I lokal in Knochen durch GH et al., Science, 233: 571-574 (1986)] produziert wird und GH-Rezeptoren sind auf Chondrozyten gefunden worden. Nilsson et al., J. Endocr., 122: 69-77 (1989).
Ferner zeigt die kürzliche Arbeit von Gonover, 72nd Annual Meeting of Endocrine Society, Prog. Abstract 1986 (Juni 1990) invitro, daß die Aktivität der IGFBPs bei der Erhöhung der Aktivität von IGF-I von Zellen abhängig ist, die den BPs allein ausgesetzt sind. Es gab keine Antwort auf IGF-I in Zellen, die mit vorgemischtem BP und IGF-I inkubiert worden waren. Wurde das BP mit den Zellen allein inkubiert, gefolgt von der Zugabe von IGF-I, wurde die Aktivität des zugegebenen IGF-I erhöht. Diese Daten legen nahe, daß ein Zusammenmischen von IGF und einem IGFBP und eine gemeinsame Injektion des Komplexes nicht in einer Erhöhung der Aktivität des IGF-I resultieren würde.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Medikaments zur Förderung des Wachstums von Säugern durch Verabreichung eines Komplexes von IGF-I und eines IGFBP durch subkutane Injektion.
Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung eines Weges zur Verabreichung großer Dosen von IGF-I an einen Patienten ohne Besorgnis einer Hypoglykämie.
Dementsprechend betrifft diese Erfindung die Verwendung einer Kombination von IGFBP-3 und IGF-I in einem Molverhältnis von 0,5:1 bis 3:1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Erzeugung eines anabolen Zustandes in einem Säuger, wobei das Medikament für die subkutane Bolus-Injektion gedacht ist.
Die gemeinsame Verabreichung von IGF-I und IGFBP-3 ergab ein stärkeres Wachstums-Ansprechen als die dreifache Menge an IGF-I allein. Ohne Beschränkung auf irgendeine Theorie wird angenommen, daß dieser Effekt ein pharmakokinetisches oder Halbwertszeit- Phänomen sein könnte oder daß IGFBP-3 dem IGF-I ermöglicht, eine anabole Wirkung auszuüben, obwohl es gebunden ist. IGFBP-3 blockiert Hypoglykämie, aber nicht die anabole Wirkung von IGF-I, so daß große Dosen an IGF-I ohne das Risiko akuter Hypoglykämie gegeben werden können. Es wurde festgestellt, daß subkutane Injektionen von IGF- 1, gekoppelt an ein IGFBP, für das Knochenwachstum wirksam sind und die Knorpelplattenbreite erhöhen und eine allgemeine anabole Wirkung besitzen. Im Gegensatz dazu ist IGF-I allein bei einer Gabe mittels subkutaner Injektionen relativ inaktiv. Die Tatsache, daß die Daten eine allgemeine anabole Wirkung bei dem gesamten Säuger zeigen, einschließlich eine Gewichtszunahme des gesamten Körpers und eine Zunahme an Organgewicht, impliziert, daß eine anabole Wirkung in anderen Situationen, z.B. Zuständen von Ernährungsstreß, beobachtet werden würde.
Figur 1 zeigt 20-Minuten-Blutglukosewerte, normalisiert auf anfängliche Blutglukosewerte, für IGF-I allein und IGF-I plus IGFBP- 3, die Ratten intravenös injiziert wurden, für ein Experiment.
Figur 2 zeigt dieselben Daten wie Figur 1 für ein zweites Experiment.
Figur 3 zeigt einen Graphen, der die Wirkung von Exzipient, IGF- I und IGF-I plus IGFBP-3 auf die Gewichtszunahme bei hypophysektomierten Ratten darstellt, denen die Reagenzien mittels Minipumpen 7 Tage lang verabreicht werden, wobei die Dosen in mg/kg/Tag angegeben sind.
Figur 4 zeigt einen Graphen; der die Wirkung von Exzipient, IGF- I und IGF-I plus IGFBP-3 auf verschiedene Organgewichte der hypophysektomierten Ratten darstellt, die wie für Figur 3 beschrieben behandelt wurden, wobei das Organgewicht als Prozentsatz der mit Exzipienten behandelten Kontrollen ausgedrückt ist.
Figur 5 zeigt einen Graphen, der die Wirkung auf die Gewichtszunahme von IGF-I darstellt, das hypophysektomierten Ratten in drei verschiedenen Dosen durch subkutane Injektion zweimal täglich in den angegebenen Mengen drei Tage lang verabreicht wurde.
Figur 6 zeigt die Wirkung auf die Gewichtszunahme von Exzipient, IGF-I (in zwei verschiedenen Dosen) und IGF-I plus IGFBP-3, die hypophysektomierten Ratten wie für Figur 5 beschrieben verabreicht wurden, nach 3-tägiger Behandlung.
Figur 7 zeigt die Wirkung auf die Schienbeinknochenendplattenbreite von Exzipient, IGF-I (in zwei verschiedenen Dosen) und IGF-I plus IGFBP-3, die hypophysektomierten Ratten wie für Figur 6 beschrieben verabreicht wurden.
Figur 8 zeigt Balken-Graphen der Wachstumsrate in cm/Jahr von Patienten mit verschiedenen Etiologien der Wachstumshemmung, die entweder keine vorherige Behandlung (Prev Rx Nein) oder vorherige Behandlung (Prex Rx Ja) mit HGH erhalten hatten. N gibt an die Anzahl der Patienten bei dem angezeigten Dosis-Niveau von hGH, das in Einheiten von mg/kg angegeben ist. Fig. 8A stellt die Daten für das erste Jahr der HGH-Behandlung und Fig. 8B für das zweite Jahr der hGH-Behandlung dar.
Figur 9 zeigt Balken-Graphen der auf das Jahr bezogenen (12-Monats)- Wachstumsrate in cm/Jahr von Patienten, die mit der angegebenen hGH-Dosis in den Bereichen 1-2, 3-5, 6-8, 9-11, 12-14, 15-17 und mehr als 17 Jahre behandelt wurden. N gibt die Anzahl der Patienten in jeder Altersgruppe an.

Definitionen:

"IGF-I", wie hier verwendet, bezieht sich auf Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-I jeder beliebigen Spezies, einschließlich Rind, Schaf, Schwein, Pferd und vorzugsweise Mensch, mit der nativen Sequenz oder in Form einer Variante und aus jeder natürlichen, synthetischen oder rekombinanten Quelle, vorausgesetzt, daß er an IGFBP-3 an der entsprechenden Stelle binden wird. Für die Verwendung bei Tieren ist hier die IGF-I-Form der speziellen, zu behandelnden Spezies bevorzugt, z.B. Schweine-IGF-I zur Behandlung von Schweinen, Schaf-IGF-I zur Behandlung von Schafen, Rinder-IGF-I zur Behandlung von Rindern etc. Zur Verwendung bei Menschen ist hier die native Human-Sequenz, reifes IGF-I, bevorzugt, noch bevorzugter ohne N- terminales Methionin, z.B. nach dem in EP 230869, veröffentlicht am 5. August 1987; EP 128733, veröffentlicht am 19. Dezember 1984; oder EP 288451, veröffentlicht am 26. Oktober 1988, beschriebenen Verfahren hergestellt. Noch bevorzugter wird dieses IGF-I mit nativer Sequenz auf rekombinante Weise hergestellt und ist von Genentech, Inc., South San Francisco, CA, für klinische Untersuchungen erhältlich. Ebenfalls zur Verwendung bevorzugt ist IGF-I mit einer spezifischen Aktivität von mehr als etwa 14.000 Einheiten/mg, wie bestimmt durch Radiorezeptor-Assay unter Verwendung von Plazenta- Membranen, z.B. wie erhältlich von Kabigen AB, Stockholm, Schweden.
Die am meisten bevorzugten IGF-I-Varianten sind diejenigen, welche beschrieben sind in PCT WO 87/01038, veröffentlicht am 26. Februar 1987, und in PCT WO 89/05822, veröffentlicht am 29. Juni 1989, d.h. diejenigen, worin mindestens der Glutaminsäurerest an Position 3 des N-Terminus des reifen Moleküls fehlt oder diejenigen mit einer Deletion von bis zu fünf Aminosäuren am N-Terminus. Bei der am meisten bevorzugten Variante sind die ersten drei Aminosäuren des N-Terminus deletiert (unterschiedlich als Hirn-IGF, tIGF-I, des(1- 3)-IGF-I oder des-IGF-I bezeichnet).
"IGFBP", wie hier verwendet, bezieht sich auf IGFBP-3, welches ein Protein darstellt, das IGF-I im Blutkreislauf, in anderen Körperflüssigkeiten und in durch kultivierte Zellen konditionierten Medien bindet, wie definiert beim "Workshop on IGF Binding Proteins", gehalten in Vancouver, Kanada, im Juni 1989, wie oben erörtert und berichtet in Ballard et al., Acta Endocrinol. (Copenh), 121: 751-752 (1989). IGFBP-3 wird beschrieben in WO 89/09268, veröffentlicht am 6. Oktober 1989, und Wood et al., Molecular Endocrinology, supra.
Der Ausdruck umfaßt tierische Äquivalente zu Human-IGFBP-3 sowie Human-IGFBP-3, beispielsweise die Rinder-, Schaf-, Schweine- und Pferde-Spezies. Es kann aus einer beliebigen natürlichen, synthetischen oder rekombinanten Quelle stammen, verausgesetzt, daß es an die entsprechende Bindungsdomäne von IGF-I binden wird.
"ALS", wie hier verwendet, bezieht sich auf die säurelabile, nicht- IGF-bindende 84-86 kD-Untereinheit des 125-150 kD-Komplexes mit IGFBP-3 und IGF-I, wie beschrieben in Baxter, WO 90/0569, oder auf irgendein tierisches Aquivalent davon, vorzugsweise auf Human-ALS. Es kann aus jeder Quelle, einschließlich natürlichen synthetischen oder rekombinanten Quellen, stammen.
"Säuger", wie hier verwendet, bezeichnet sowohl Menschen als auch Tiere. Säuger, die Kandidaten für die Behandlung sind, umfassen Tiere von wirtschaftlicher Bedeutung wie Rinder, Schafe und Schweine. Der hier bevorzugte Säuger ist ein Mensch.
Der Ausdruck "Erzeugung eines anabolen Zustands", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Förderung einer Gesamtkörpergewichtszunahme ebenso wie der Dynamik des Größenwachstums, das ein Individuum während des Säuglingsalters, der Kindheit und Adoleszenz erfährt, wie dargestellt durch eine normale Wachstumskurve, d.h. Wachstum von linear produzierenden Knochenpiatten, das von Chondrozyten veranlasst wird, sowie das Wachstum von Osteoplasten-Zellen, die von einem anderen Teil des Knochens stammen. Eine Wiederherstellung der normalen Wachstumsmuster würde dem Patienten die Erreichung einer zufriedenstellenderen Wachstumskurve erlauben. Beispiele von Patienten, die relativ resistent gegen GH sind, aber eine Behandlung zur Induktion eines anabolen Effekts benötigen, umfassen diejenigen mit Turner's Syndrom, GH-defiziente Kindern, die als Antwort auf GH-Behandlung schlecht wachsen, Kinder, die eine Verlangsamung oder Retardation ihrer normalen Wachstumskurve etwa 2-3 Jahre vor dem Schließen ihrer Wachstumsplatten erfahren, so daß die alleinige Verabreichung von GH das Wachstum der Kinder nicht länger steigern würde, sogenannte normal-kleine Kinder, und Patienten, deren IGF- 1-Antwort auf GH chemisch- blockiert wurde (d.h. durch Glucocorticoid-Behandlung) oder durch einen natürlichen Zustand wie bei erwachsenen Patienten, wo die IGF-I-Antwort auf GH natürlicherweise vermindert ist. Ferner ist das vorliegende Verfahren geeignet zur Behandlung schwangerer Frauen, die sich in einem katabolen Zustand befinden und/oder einen Verlust von Knochenmasse erfahren, zur Behandlung von Frauen mit Osteoporose und zur Wiederherstellung von Knochen.
Das vorliegende Verfahren beinhaltet die gemeinsame Verabreichung der IGF-I und IGFBP-3 in einem Molverhältnis von IGFBP-3 zu IGF- I von 0,5:1 bis 3:1 durch subkutane (sc) Bolus-Injektion. Die IGF- 1- und IGFBP-3-Mischung, die in der Therapie eingesetzt werden soll, wird auf eine Weise formuliert und dosiert werden, die guter medizinischer Praxis entspricht, unter Berücksichtigung des klinischen Zustands des individuellen Patienten (einschließlich etwaiger wahrgenommener oder erwarteter Nebenwirkungen oder verringerter anaboler Wirkungen bei Verwendung von IGF-I allein), des speziellen Wachstumsdefekts oder katabolen Zustands, der korrigiert werden soll, des speziell zu verwendenden IGFBP-3, des Abgabeorts der Mischung und anderer Faktoren, die Praktikern bekannt sind. Die "effektiven Mengen" an IGF-I und IGFBP-3 für die hier angesprochenen Zwecke werden somit durch solche Überlegungen bestimmt, unter der Voraussetzung, daß die beiden Arzneimittel in einem Molverhältnis von IGFBP-3 zu IGF-I im Bereich von 0,5:1 bis 3:1 vor der Verabreichung vorgemischt werden, und der Voraussetzung, daß die verabreichten Mengen bei dem behandelten Patienten einen stärker anabolen Zustand fördern als die anabole Wirkung, welche bei Verwendung derselben Menge an IGF-I erhalten wird, das nach demselben Versuchsprotokoll, Zeitplan und auf demselben Weg verabreicht wird, ohne daß jedoch IGFBP-3 ebenfalls verabreicht wird.
Gegebenenfalls wird IGFBP-3 auch von ALS als dritter Komponente der Mischung in einem Molverhältnis von mindestens 1:1 von ALS zu IGFBP- 3 begleitet. Die Anwesenheit des ALS wird die Bildung des 125-150 kD-Dreikomponentenkomplexes erlauben, in dem IGF-I natürlicherweise im Blut transportiert wird.
Die Verabreichung geschieht in Abwesenheit einer Verabreichung von GH, d.h., jede Spezies von Wachstumshormon oder Wachstumshormon- Variante wie rekombinantes hGH, z.B. Methionyl-Human-Wachstumshormon wie in U.S.-Patent Nr. 4,755,465, erteilt am 5. Juli 1988, und Goeddel et at., Nature, 282: 544 (1979) beschrieben, und rhGH, erhältlich für klinische Untersuchungen und Forscher von Genentech, Inc. unter dem Warenzeichen Nutropin und im Handel von Eli Lilly erhältlich, dem das N-terminale Methionin fehlt.
Als allgemeiner Hinweis wird die pharmazeutisch effektive Gesamtmenge des subkutan pro Dosis verabreichten IGF-I im Bereich von 1 µg/kg/Tag bis 100 mg/kg/Tag des Patienten-Körpergewichts liegen, obwohl dies, wie oben ausgeführt, weitgehend Gegenstand des therapeutischen Ermessens sein wird und aufgrund möglicher hypoglykämischer Wirkungen bei der Verwendung von IGF-I allein wird die Maximaldosis an IGF- I niedriger sein als bei alleiniger Verwendung. Vorzugsweise beträgt diese Dosis mindestens 0,1 mg/kg/Tag und noch bevorzugter 1-20 mg/kg/Tag. Am meisten bevorzugt ist die eingesetzte IGF-I-Dosis eine Dosis, die allein beim Patienten keine Hypoglykämie verursachen wird, so daß, falls ein Abbau des IGF-I/ IGFBP-3-Komplexes oder des IGFBP- 3 stattfindet, das überschüssige IGF-I, welches frei bleibt, dem Patienten nicht schaden wird.
Die pharmazeutisch effektive Gesamtmenge des subkutan verabreichten IGFBP-3 pro Dosis wird im allgemeinen derart sein, daß das Molverhältnis von IGFBP-3 zu IGF-I 0,5:1 bis 3:1, vorzugsweise 0,8:1 bis 1,5:1, beträgt. Ist das Molverhältnis geringer als 0,5:1, kann das überschüssige IGF-I, welches nicht von dem IGFBP-3 gebunden ist, einen unerwünschten hypoglykämischen Effekt haben, ist das Verhältnis jedoch größer als 3:1, kann die Aktivität des IGF-I beträchtlich verringert sein. Der Schlüsselfaktor bei der Wahl einer geeigneten Dosis ist das erhaltene Ergebnis, welches in optimaler Weise die Nebenwirkungen, insbesondere Hypoglykämie, minimiert während die Wirksamkeit maximiert wird. Wirksame Ergebnisse werden gemessen durch Zunahmen des Körpergewichts, der mageren Körpermasse, des Knochenwachstums oder Größenwachstums, welche sich dem normalen Bereich annähern, oder durch andere Kriterien zur Messung des anabolen Zustands eines Säugers wie hier definiert, wie sie dem Praktiker geeignet scheinen.
Während die Mischung von IGF-I und IGFBP-3 selbst eine IGF-I- Formulierung mit verzögerter Freisetzung darstellt, da das IGF-I mit dem BP-3 komplexiert ist, wird die IGF-I- und IGFBP-3-Mischung auch geeigneterweise mit einem weiteren Agens verabreicht, das bekanntermaßen eine Formulierung mit verzögerter Freisetzung ergibt, die mit einer subkutanen Bolus-Injektion kompatibel ist. Solche Zusammensetzungen umfassen in Liposomen eingeschlossene IGF-I und IGFBP- 3. Liposome, die IGF-I und IGFBP-3 enthaltenl werden nach an sich bekannten Verfahren hergestellt: DE 32 18 121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52322; EP 36676; EP 88046; EP 143949; EP 142641; japanische Patentanmeldung 83- 118008; U.S.-Patente Nr. 4485045 und 4544545; und EP 102324. Gewöhnlich sind die Liposomen vom kleinen (etwa 20-80 nm) unilamellaren Typ, bei dem der Lipidgehalt größer als etwa 30 Mol-% Cholesterin ist, wobei der gewählte Anteil für die optimale IGF- I/IGFBP-3-Therapie eingestellt wird.
Für subkutane Verabreichung werden die IGF-I und IGFBP-3 gewöhnlich formuliert durch deren Zusammenmischen mit dem gewünschten Reinheitsgrad in eine injizierbare Einheits-Dosierungsform (Lösung, Suspension oder Emulsion) und durch Zugeben oder gleichzeitiges Einmischen eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers, d.h., ein Träger, der für die Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch ist und mit anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel ist. Beispielsweise enthält die Formulierung vorzugsweise keine Oxidationsmittel und andere Verbindungen, die bekanntermaßen für Polypeptide schädlich sind. Die Mischung enthält auch vorzugsweise einen Stabilisator wie einen Proteaseinhibitor, z.B. Aprotinin, welcher den Abbau der kombinierten Formulierung von IGF-I und IGFBP- 3 im Lagerungsbehälter oder nach der Injektion verhindern wird.
Im allgemeinen werden die Formulierungen hergestellt indem die IGF- I und IGFBP-3 gleichmäßig und innig mit flüssigen Trägern kontaktiert werden. Vorzugsweise ist der Träger eine Lösung, die mit dem Blut des Empfängers isotonisch ist. Beispiele solcher Trägervehikel umfassen Wasser, Salzlösung, Ringer's Lösung und Dextroselösung. Nicht-wäßrige Vehikel wie fixierte Öle und Ethyloleat sind hier ebenfalls geeignet, ebenso wie Liposome.
Der Träger enthält geeigneterweise kleinere Mengen an Zusätzen wie Substanzen, welche die Isotonie und chemische Stabilität erhöhen. Solche Materialien sind für Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer wie Phosphat, Citrat, Succinat, Essigsäure und andere organische Säuren oder deren Salze, vorzugsweise Citrat für IGF-I vollständiger Länge; Antioxidantien wie Ascorbinsäure; Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste), z.B. Polyarginin oder Tripeptide; Proteine wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Cellulose oder deren Derivate, Glucosel Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zuckeralkohole wie Mannit oder Sorbit; Gegenionen wie Natrium, und/oder nicht-ionische Tenside wie Polysorbate, Poloxamere oder PEG.
Die IGF-I und IGFBP-3 werden typischerweise zur Injektion in solchen Vehikeln in einer Konzentration von 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml, vorzugsweise 1-10 mg/ml, bei einem pH von 4,5 bis 8 formuliert. IGF- I vollständiger Länge ist gewöhnlich bei einem pH von nicht mehr als etwa 6 stabil. Es versteht sich, daß die Verwendung bestimmter der voranstehenden Exzipienten, Träger oder Stabilisatoren die Stabilität des IGF-I/IGFBP-3-Komplexes erhöhen wird.
Die für die therapeutische Verabreichung einzusetzenden IGF-I und IGFBP-3 müssen steril sein. Sterilität wird ohne weiteres erreicht mittels Futration durch sterile Filtrationsmembranen (z.B. 0,2 Mikron-Membranen). Therapeutische IGF-I- und IGFBP-3-Zusammensetzungen werden zur Lagerung gewöhnlich in einen Einzel- oder Mehrfachdosis-Behälter eingebracht, der eine sterile Zugangsöffnung enthält, z.B. eine verschlossene Ampulle, ein Beutel oder ein Gefäß mit einem Stopfen, der mit einer hypodermischen Injektionsnadel durchstochen werden kann. Die Zusammensetzung wird als wäßrige Lösung oder als lyophilisierte Formulierung zur Rekonstitution gelagert werden. Als Beispiel einer lyophilisierten Formulierung werden 10 ml-Gefäße mit 5 ml einer steril filtrierten 1% igen (w/v) wäßrigen Lösung von IGF-I und IGFBP-3 gefüllt und die resultierende Mischung lyophilisiert. Die Injektionslösung wird hergestellt, indem das lyophilisierte IGF-I unter Verwendung von bakteriostatischem Wasser für Injektionszwecke rekonstituiert wird.
Die folgenden Beispiele sollen eine Ausführungsform erläutern, die derzeit zur Durchführung der Erfindung bekannt ist, die Erfindung sollte jedoch nicht als auf diese Beispiele beschränkt betrachtet werden. Alle Zitate wissenschaftlicher Literatur und Patentliteratur sind durch die Bezugnahme ausdrücklich eingeschlossen.

BEISPIEL 1

Wirkung von IGFBP-3 auf Blutglukose-Niveaus

In zwei separaten Studien wurde IGF-I allein injiziert oder mit verschiedenen Dosen an IGFBP-3 kombiniert und zusammen injiziert. Es wurden Basis-Blutproben und dann Blutproben nach den Proteininjektionen genommen. Im abgetrennten Plasma wurde die Blutglukose gemessen. IGF-I allein verursachte den erwarteten Abfall der Blutglukose. In dosisabhängiger Weise inhibierte das IGFBP-3 die Fähigkeit von IGF-I zur Reduktion von Blutglukose. In einem Wiederholungsversuch wurde diese Beobachtung bestätigt unter Verwendung einer Dosis von IGFBP-3, die im ersten Experiment als wirksam beobachtet wurde. Das IGFBP-3 war allein inaktiv.
In zwei separaten Versuchen wurden weibliche Zwergratten (60 bis 70 Tage alt, 100 bis 140 g) mit Ketamin/Xylazin narkotisiert und eine Kehl-Kanüle wurde zur Blutprobenentnahme implantiert. Die Blutprobenentnahme wurde unter Verwendung einer automatisierten Blutprobenentnahmevorrichtung durchgeführt, so daß 12 Ratten gleichzeitig Proben entnommen werden konnten. Drei (Vers. 1) oder zwei (Vers. 2) Basis-Blutproben, jeweils 100 µl, wurden in 5- minütigen Intervallen genommen. Die Testsubstanzen wurden dann durch eine Bolus-Injektion über den Kehl-Katheter verabreicht. Die Blutproben wurden in 10-minütigen Intervallen 40 Minuten lang und dann in 20-minütigen Intervallen bis 120 Minuten nach den Injektionen entnommen. Die Proben wurden zentrifugiert und das Plasma zurückbehalten und mit Hilfe des Monarch 2000 Blutchemie-Analysators auf Glukose analysiert.
Rekombinantes Human-IGF-I, produziert in E. coli nach dem allgemein in EP 230 869, veröffentlicht am 5. August 1987, beschriebenen Verfahren, oder im Handel erhältlich von Kabigen AB, Stockholm, Schweden (spezifische Aktivität > 14.000 E/mg gemäß Radiorezeptor- Assay unter Verwendung von Plazenta-Membranen), oder für klinische Untersuchungen von Genentech, Inc., South San Francisco, erhältlich, wurde in Citratpuffer bei 5 mg/ml eingesetzt. Das rekombinante IGFBP- 3 wurde in Säugerzellen exprimiert und gereinigt wie beschrieben in WO 89/09268, veröffentlicht am 5. Oktober 1989; Wood et al., Molecular Endocrinology, oben; Mukku et al., Insulin-like Growth Factor Binding Proteins, Drop und Hintz, Hrsg. (Elsevier Science Publishers, 1989)).

Vers. 1

IGF-1 wurde auf 50 µg/ml verdünnt und 0,5 ml dieser Lösung wurde den Ratten gegeben (25 µg/Ratte). Verschiedene Konzentrationen an IGFBP- 3 wurden über Nacht mit IGF-I inkubiert (bei 50 µg/ml). Die IGFBP- 3-Konzentrationen betrugen 50, 100 und 200 µg/ml, so daß 25,50 und 100 µg IGFBP-3 mit 25 µg IGF-I coinjiziert wurden.
1) Drei Tieren wurden 25 µg IGF-I gegeben
2) Drei Tieren wurden 25 µg IGF-I + 25 µg IGFBP-3 gegeben.
3) Drei Tieren wurden 25 µg IGF-I + 50 µg IGFBP-3 gegeben.
4) Drei Tieren wurden 25 µg IGF-I + 100 µg IGFBP-3 gegeben.

Vers. 2

IGF-I und IGFBP-3 wurden wie oben beschrieben präpariert und verabreicht. Bei diesem Versuch wurde nur eine Dosis IGFBP-3 mit dem IGF-I kombiniert und das IGFBP-3 wurde allein verabreicht.
6) Vier Tieren wurden 25 µg IGF-I gegeben.
7) Vier Tieren wurden 50 µg IGFBP-3 gegeben.
8) Vier Tieren wurden 25 µg IGF-I und 50 µg IGFBP-3 gegeben.

Ergebnisse:

Figur 1 zeigt die vollständigen Ergebnisse von Vers. 1. Die Daten wurden normalisiert, so daß die Blutprobe 5 Minuten vor der Injektion der Testsubstanzen den 100%-Wert darstellt. Es ist ersichtlich, daß die Blutglukose vor der Injektion stabil ist. IGF-I verursachte einen Abfall der Blutglukose auf 53 ± 13% (Mittel ± SD) . Mit steigenden Dosen des IGFBP-3 wurde dieses Ansprechen in abgestufter Weise blockiert.
Figur 2 zeigt die 20-Minuten-Blutglukosewerte, wiederum auf die anfänglichen Blutglukoseniveaus normalisiert, für beide Versuche 1 und 2 (Gruppen 1 bis 4 und 6 bis 8 wie oben beschrieben). In Vers. 2 verursachte IGF-I einen Abfall der Blutglukose, so daß diese bei 20 Minuten 58 ± 5% des Anfangsniveaus betrug. Dieses Niveau unterschied sich nicht von dem in Vers. 1 induzierten. In Vers. 2 beeinflußte das IGFBP-3 allein die Blutglukose nicht (99 ± 4% des Anfangswerts) und bei 20 Minuten brachten IGFBP-3 + IGF-I die Blutglukose auf 93 ± 5% des Anfangsniveaus.

BEISPIEL II

Abgabe durch kontinuierliche Infusion

Versuchsprotokoll:

Zweiundzwanzig hypophysektomierte Ratten (Taconic, Germantownl New York) von 85-105 g wurden viermal im Verlauf von 10 Tagen gewogen, um einen Wachstumsstillstand zu etablieren (Gewichtszunahme oder Gewichtsverlust von weniger als 7 g). Sie fraßen pelletierte Labornahrung und tranken Wasser nach Belieben. Sie wurden in Gruppen (5/Käfig) in einem Raum mit kontrollierter Beleuchtung und Temperatur gehalten. Sie wurden dann statistisch in drei Gruppen von Ratten eingeteilt, basierend auf ihrem anfänglichen Körpergewicht. Die Ratten wurden mit Ketamin/xylazin narkotisiert und zwei osmotische Minipumpen (2001, Abgaberate 1 µl/h/Pumpe) wurden subkutan eingepflanzt. Die Ratten wurden täglich gewogen und nach 7 Tagen wurden sie getötet und verschiedene Körperorgane entfernt.
Das für diesen Versuch eingesetzte IGF-I war das in Beispiel I in Citratpuffer bei 5 mg/ml eingesetzte IGF-I. Das eingesetzte IGFBP- 3 war das in Beispiel I beschriebene. Die Pumpen enthielten entweder den Exzipienten (Citratpuffer) oder IGF-I oder IGF-I plus IGFBP- 3, so daß die Versuchsgruppen waren:
1) Exzipientenpumpen (n = 8)
2) IGF-I-Abgabe mit 0,3 mg/kg/Tag (n = 8)
3) IGF-I-Abgabe mit 0,3 mg/kg/Tag + IGFBP-3-Abgabe mit 0,9 mg/kg/Tag (n = 6)

Ergebnisse:

Figur 3 zeigt die Gewichtszunahmen im Verlauf von 7 Tagen. Mit Exzipienten behandelte hypophysektomierte Ratten zeigten die erwartete fehlende Gewichtszunahme während des Versuchszeitraums. Die eingesetzte Dosis an IGF-I (0,3 mg/kg/Tag) ergab die erwartete Gewichtszunahme für diese Dosis bei subkutaner Infusion. Wurde IGF- I gekoppelt mit IGFBP-3 in einem 1:1-Molverhältnis abgegeben, war die IGF-I-induzierte Gewichtszunahme nicht erheblich verringert.
Figur 4 zeigt die Wirkung von IGFBP-3 bezüglich des Organgewicht- Ansprechens auf die IGF-I-behandelten Ratten. Thymus, Milz und Niere zeigten alle die erwarteten signifikant erhöhten Naßgewichte nach der IGF-I-Behandlung. Diese IGF-I-empfindlichen Organe reagierten jedoch unterschiedlich auf die Anwesenheit des IGFBP-3. Es gab ein signifikantes Wachstums-Ansprechen der Milz, wenn IGF-I und IGFBP- 3 zusammen abgegeben wurden; der Thymus und die Niere zeigten jedoch kein signifikantes Wachstums-Ansprechen.
Sowohl in Figur 3 als auch in Figur 4 wurden statistische Vergleiche durch eine Analyse der Abweichung (ANOVA) mit nachfolgenden Vergleichen durch "Duncan's Multiple Range Test" durchgeführt. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als signifikant betrachtet. Alle Daten sind als Mittelwert + SD von 6-8 Tieren pro Gruppe dargestellt. Die Sternchen zeigen eine statistische Signifikanz im Vergleich zu Exzipienten-behandelten Kontrollen (* p< 0,05, ** p< 0,01) an.

BEISPIEL III

Abgabe durch subkutane Injektion

In einem einleitenden Experiment wurde festgestellt, daß IGF-I (wie in den Beispielen I und II beschrieben), das subkutan als zweimal tägliche Injektionen drei Tage lang (6 Injektionen) gegeben wurde, eine sehr geringe Wirkung auf die Gewichtszunahme bei der hypophysektomierten Ratte hatte im Vergleich zu der wesentlich größeren Wirkung von subkutanen Infusionen von IGF-I mittels Minipumpe. Figur 5 zeigt die Gewichtszunahme für subkutane Injektionen von drei verschiedenen Dosen von IGF-I.
In einem neuen Versuch zur Testung der Wirkung von IGFBP-3 auf subkutane Injektionen von IGF-I wurden 26 weibliche hypophysektomierte Ratten (Taconic, Germantown, New York) von 85-105 g viermal im Verlauf von 10 Tagen gewogen, um einen Wachstumsstillstand wie oben definiert zu etablieren. Sie fraßen pelletierte Labornahrung und tranken Wasser nach Belieben. Sie wurden als Gruppe (5/Käfig) in einem Raum mit kontrollierter Beleuchtung und Temperatur gehalten. Sie wurden dann statistisch in drei Gruppen von Ratten eingeteilt, basierend auf ihrem anfänglichen Körpergewicht. Den Ratten wurden zweimal täglich subkutane Injektionen von jeweils 0,1 ml um 8 Uhr und 17 Uhr an den Tagen 0, 1 und 2 (6 Injektionen insgesamt) gegeben. Körpergewichtsmessungen wurden bei den Morgeninjektionen durchgeführt. Die Ratten wurden am Tag 3 (etwa 16 Stunden nach der 6. Injektion) getötet und verschiedene Körperorgane entfernt. Die IGF- I und IFGBP-3 waren die in den Beispielen I und II verwendeten. Die Versuchsgruppen waren:
1) Exzipienten-Injektionen
2) IGF-I-Abgabe mit 0,3 mg/kg/Tag (zwei Injektionen von 15 µg pro Tag)
3) IGF-I-Abgabe mit 0,9 mg/kg/Tag (zwei Injektionen von 45 µg pro Tag)
4) IGF-I-Abgabe mit 0,3 mg/kg/Tag plus IGFBP-3-Abgabe mit 0,8 mg/kg/Tag (zwei Injektionen von 15 µg IGF-I plus 40 µg IGFBP- 3 pro Tag)

Ergebnisse:

Mit Exzipienten behandelte hypophysektomierte Ratten zeigten eine geringe Gewichtszunahme während des Versuchs. Die niedrige Dosis IGF- I (0,3 mg/kg/Tag) erhöhte die Gewichtszunahme nicht, aber die hohe Dosis (0,9 mg/kg/Tag) ergab eine geringe Gewichtszunahme. Überraschenderweise wurde dann, wenn die niedrige Dosis IGF-I, die allein keine Gewichtszunahme ergab, mit IGFBP-3 gekoppelt abgegeben wurde, ein großes Maß an Gewichtszunahme induziert. Figur 6 zeigt diese Daten, wobei die statistischen Vergleiche durch ANOVA, gefolgt von und hohen und niedrigen Dosen von IGF-I darstellt, und * p < 0,05 gegenüber Exzipient darstellt.
Nach der Tötung wurde ein Schienbein entfernt und der proximale Bereich in Formalin fixiert, von Kalk befreit, ein Längsschnitt durchgeführt, angefärbt und unter einem Lichtmikroskop unter Verwendung eines Mikrometers untersucht, um die Knochenendplattenbreite zu messen. Figur 7 zeigt die Ergebnisse. Statistische Vergleiche erfolgten durch ANOVA, gefolgt von Duncan's Test, wobei die Symbole in Figur 7 eine statistische Signifikanz im Vergleich zu Exzipienten-behandelten Kontrollen anzeigt (*** p < 0,001 oder # p < 0,01, gegenüber hohen Dosen von IGF-I). Die mittlere Plattenbreite bei den mit Exzipienten behandelten hypophysektomierten Kontrollen betrug 228 Mikron, in Übereinstimmung mit den erhaltenen historischen Daten. Die niedrige Dosis IGF-I erhöhte die Plattenbreite nicht signifikantl während die hohe Dosis IGF-I ein signifikantes Knochenwachstum ergab (Mittelwert 291 Mikron). Wiederum resultierte die Kombination von IGF-I und IGFBP-3 in einem sehr großen Knochenwachstum.
Die Organgewichte waren sowohl absolut als auch relativ für Leber, Milz, Thymus und Herz unverändert. Das absolute Nierengewicht war unverändert, aber das relative Nierengewicht war erhöht (im Vergleich der IGF-I- plus IGFBP-3-behandelten Ratten mit Exzipienten-Gruppen und Gruppen mit niedriger IGF-I-Dosis (p < 0,05)).

Schlußfolgerungen aus den Beisdielen I bis III:

Signifikante anabole Eigenschaften von IGF-I werden nur beobachtet, wenn freies IGF-I durch langsame Infusion abgegeben wird. Mehrfache Injektionen von IGF-I, beispielsweise zweimal täglich, sind relativ unwirksam zur Induktion von anabolen Antworten. Eine gemeinsame Verabreichung von IGF-I und IGFBP-3 als subkutane Infusion erhöhte die Wirksamkeit des IGF-I nicht. Nur wenn IGF-I und IGFBP-3 als eine subkutane Bolus-Injektion gegeben wurden, wurde eine Erhöhung der wachstumsfördernden Aktivität von IGF-I beobachtet. Es ist ersichtlich, daß IGFBP-3 die durch eine große Dosis von IGF- I induzierte Hypoglykämie inhibiert. So würde es durch subkutane Bolus-Injektionen abgegebenes IGF-I mit IGFBP-3 gekoppelt ermöglichen, weniger häufige Injektionen mit einem breiteren therapeutischen Index zu geben, da die kurzfristigen metabolischen Antworten (Hypoglykämie) minimiert würden.
Nachdem an IGFBP-3 gebundenes IGF-I eine verlängerte Halbwertszeit in vivo aufweist, wird dieser Abgabemodus von IGF-I das zirkulierende Blut-IGF-I aufrechterhalten. So besitzt IGFBP-3 das Potential für ein System mit verzögerter Freisetzung zur Abgabe großer Mengen von IGF-I durch subkutane Injektion. Ferner sollte dieses Mittel zur Abgabe von IGF-I die anabolen Eigenschaften von IGF-I erhöhen, da im Blut zirkulierendes IGF-I anabole Aktivität aufweist, wodurch das Verhältnis der kurzfristigen metabolischen Wirkungen zu den langfristigen anabolen Eigenschaften von IGF-I verbessert. Eine bevorzugte Form von IGF-I zur Verabreichung ist des-IGF-I, das nicht an die anderen IGFBPs binden wird, wenn es von dem IGFBP-3 dissoziiert wird, und es somit zu erwarten steht, daß es aktiver als IGF-I vollständiger Länge ist.

BEISPIEL IV

Zwei klinische Szenarien für die Kombinationsbehandlung

Zwei Beispiele einschlagiger klinischer Szenarien sind unten beschrieben, die zweifellos von der gleichzeitigen Verabreichung von IGFBP-3 und IGF-I profitieren werden:

1) Patienten, die eine Verlangsamung der Wachstumsrate nach mindestens 12-monatiger GH-Verabreichung aufweisen

Es ist von pädiatrischen Endokrinologen anerkannt, daß entweder native (keine vorherige Behandlung) oder vorher behandelte Patienten (nach einer Unterbrechung in der GH-Verabreichung) einen Abfall der Wachstumsrate im zweiten Jahr aufweisen. Dieses Phänomen ist unabhängig von der Etiologie des Typs von Kleinwuchs oder GH- Defizienz (z.B. ob idiopathisch, organisch, septo-optische Dysplasie (S-O D), Turner, oder andere). Siehe Figur 8.
So würde während des Zeitraums, in dem sich die Wachstumsrate verlangsamt, eine Behandlung mit IGF-I zusammen mit IGFBP-3 die auf das Jahr bezogene Rate erhöhen, um diesen Verlust an Ansprechen im zweiten Jahr zu kompensieren.

2) Patienten, denen für eine maximal effektive GH-Verabreichung wenig Zeit bleibt

Sind Patienten älter, wenn bei ihnen eine GH-Defizienz diagnostiziert wird, steht weniger Zeit zur Verfügung, um den resultierenden Kleinwuchs zu korrigieren. Dies wird in Figur 9 veranschaulicht, wo die auf das Jahr bezogene Wachstumsrate für Patienten in sieben Altersgruppen dargestellt ist. Ältere Patienten haben nur beispielsweise 2-3 Jahre, bevor sich ihre Wachstumsplatten schließen, was ein weiteres lineares Wachstum unwahrscheinlich macht. Diese Patienten könnten mit der Kombination von IGF-I und einem IGFBP behandelt werden, um eine Optimierung ihrer Wachstumsraten zu ermöglichen.
Die hier gezeigten Resultate haben Bedeutung für die Medizin und Landwirtschaft in jeder Situation, wo eine IGF-I-Behandlung eingesetzt wird. Dieser Plan einer kombinierten IGF-I- und IGFBP-3- Behandlung würde die Gabe von kleineren Dosen von IGF-I (mindestens neunfach weniger) ermöglichen, um zur Behandlung mit IGF-I allein aquivalente Antworten zu ergeben. Dies wäre von besonderer Bedeutung in Situationen, wo die Nebenwirkungen der IGF-Behandlung (d.h. Hypoglykämie) minimiert werden sollen.

Claims

1. Verwendung einer Kombination von IGFBP-3 und IGF-I in einem Molverhältnis von 0,5:1 bis 3:1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Erzeugung eines anabolen Zustandes in einem Säuger, wobei das Medikament für die subkutane Bolus-Injektion gedacht ist.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Säuger ein Tier ist.

3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei das IGF-I und das IGFBP-3 Rinder-, Schafs- oder Schweine-IGF-I und -IGFBF-3 sind und das Tier ein Rind, ein Schaf bzw. ein Schwein ist.

4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Säuger ein Mensch ist.

5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das IGF-I reifes Human- IGF-I mit nativer Sequenz ist und das IGFBP-3 Human- IGFBP-3 ist.

6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei das IGF-I in einer sterilen, isotonen Lösung, die einen Citratpuffer, pH 6, enthält, vorliegt.

7. Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Molverhältnis von IGFBP-3 zu IGF-I 0,8:1 bis 1,5:1 beträgt.

8. Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Mischung weiter Human-ALS umfaßt.

9. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das IGF-I ein Analogon zu Human-IGF-I mit nativer Sequenz ist, bei dem die Glutaminsäure in Stellung 3 durch eine andere Aminosäure ersetzt oder weggelassen ist.

10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das IGF-I Des(1-3)-IGF-I ist.

11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Des(1-3)-IGF-I in einer sterilen, isotonen Lösung, die Essigsäure enthält, pH 3,2 bis 4,5, vorliegt.

12. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das IGFBP-3 Human- IGFBP-3 ist.

13. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die effektive Menge an IGF-I mindestens 0,1 mg/kg/Tag beträgt.

14. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die effektive Menge an IGF-I 1 - 20 mg/kg/Tag beträgt.

15. Verwendung nach Anspruch 4, wobei der zu behandelnde Mensch ein maximales Wachstumsniveau und darauf eine Abnahme der aufs Jahr bezogenen Wachstumsrate erreicht hat, nachdem er zuvor mit Wachstumshormon allein behandelt worden ist.

16. Verwendung nach Anspruch 4, wobei der zu behandelnde Mensch ein Alter aufweist, das 2 - 3 Jahre vor dem Schließen der Wachstumsplatte liegt.

17. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die effektive Menge an IGF-I weniger als die Dosis beträgt, die unter Verwendung von IGF-I allein eine maximales Wachstums-Ansprechen liefert.

18. Verwendung nach Anspruch 4, wobei der zu behandelnde Mensch eine schwangere Frau ist.