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Erklärung bezüglich der
vom Bund geförderten
Forschung
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Die
Finanzierung der hierin beschriebenen Arbeit wurde von der Bundesregierung
bereitgestellt, welche gewisse Rechte an der Erfindung haben kann.
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Hintergrund
der Erfindung
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Hepatitis
C-assoziierte Osteosklerose (HCAO) ist ein seltenes Syndrom, welches
durch einen markanten Anstieg in der Skelettmasse bei Erwachsenen,
welche mit dem Hepatitis C Virus infiziert sind, gekennzeichnet
ist. Beyer et al., J. Bone Min. Res., 5:1257-1263 (1990); und Diamond
et al., Bone, 19:679-683 (1996). Wirbelsäulen- und Hüftknochenmineraldichten sind
bei diesen betroffenen Individuen, welche das dramatischste Beispiel
erworbener Osteosklerose in Menschen darstellen, ungefähr zweifach
erhöht.
Radiogramme zeigen dichte Knochen im Extremitätenskelett und axialen Skelett,
mit Ausnahme der Schädeldecken-
und Gesichtsknochen. Biochemische Marker der Knochenbildung sind
für gewöhnlich erhöht und transiliakale
Knochenbiopsien zeigen allgemein gesteigerte Knochenbildungsraten.
Dennoch erscheint das Knochengewebe dieser Patienten histologisch
von guter Qualität,
mit intakten Lamellenmustern zu sein, im Gegensatz zum anormalen,
schnell umbauenden, verwobenen Knochen, wie er bei Patienten mit
der Pagetschen Knochenkrankheit gefunden wurde.
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Bis
Dato sind zehn Fälle
von HCAO berichtet worden. Es ist jedoch offensichtlich, dass nur
ein kleiner Prozentsatz aller mit Hepatitis C infizierter Patienten
Osteosklerose entwikkelt, da Radiogramme der Skelette von 107 zufällig ausgewählten Hepatitis
C infizierten Patienten keine dichten Knochen zeigten. Beyer et
al., Am. J. Med., 95:660-662 (1990). Obwohl es unsicher ist, ob
Hepatitis C der verursachende Wirkstoff der Skelettkrankheit ist,
ist es folglich eine plausible Hypothese, dass entweder Hepatitis
C oder ein anderer parenteral übertragener
Wirkstoff die hepatische Produktion vom/von Wachstumsfaktor(en),
welcher/welche die Osteoblastenfunktion stimuliert/stimulieren,
steigert.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass das Insulinähnlicher
Wachstumsfaktor bindende Protein 2 (IGFBP2), das Abzielen Insulinähnlicher
Wachstumsfaktoren (IGFs) und insbesondere von IGFIIE auf Skelettgewebe
ermöglicht.
Komplexe des IGFIIE-Polypeptids und IGFBP2-Polypeptids bewirken
eine Stimulation der Proliferation menschlicher Osteoblasten und
können
zum Steigern der Knochenmasse bei Patienten mit Osteoporose verwendet
werden.
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Die
Erfindung zeichnet sich durch einen im Wesentlichen reinen, ein
IGFIIE-Polypeptid und ein IGFBP2-Polypeptid enthaltenden Komplex
aus. Das IGFIIE-Polypeptid und das IGFBP2-Polypeptid können in etwa äquimolaren
Mengen vorliegen. Das IGFBP2-Polypeptid kann IGFBP2 voller Länge sein.
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Die
Erfindung betrifft auch eine Methode oder ein Verfahren zum Herstellen
eines Komplexes, der auf die extrazelluläre Matrix eines Skeletts eines
Patienten abzielt, gemäß der Merkmale
des Anspruchs 4. Der Komplex enthält ein IGFIIE-Polypeptid und ein
IGFBP2-Polypeptid. Das IGFBP2-Polypeptid kann IGPBP2 voller Länge sein.
Die Zusammensetzung enthält
einen chemotherapeutischen Wirkstoff oder einen Wachstumsfaktor,
wie ein IGFII-Polypeptid oder IGFI. IGFIIE ist ein besonders nützliches
IGFII-Polypeptid.
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Wenn
nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen
und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, die allgemein
von einem Durchschnittsfachmann in dem Fach, welchem diese Erfindung
angehört,
verstanden wird. Obwohl ähnliche
oder gleichwertige Methoden und Materialien zu den hierin beschriebenen
verwendet werden können,
um die Erfindung auszuführen,
werden geeignete Methoden und Materialien nachfolgend beschrieben.
Alle Veröffentlichungen,
Patentanmeldungen, Patente und andere hierin erwähnten Referenzen sind in ihrer
Gesamtheit durch Referenz eingebunden. Im Konfliktfall wird die
vorliegende Beschreibung einschließlich der Definitionen maßgeblich
sein. Außerdem
sind die Materialien, Methoden und Beispiele rein veranschaulichend
und nicht als Einschränkung
beabsichtigt. Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden
aus der folgenden detaillierten Beschreibung und aus den Ansprüchen ersichtlich.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
ein Graph, welcher die Wirkungen von IGFBP2 auf die IGFII-(beide
bei 10 nM) Stimulation der Osteoblastenproliferation in Zellen veranschaulicht,
welche entweder für
1 Tag oder für
10 Tage vor der Stimulation mit IGFII oder IGFII + IGFBP2 kultiviert
wurden. Die Daten sind als Prozent der maximalen IGFII Stimulation
(Mittel + SEM von drei Experimenten) ausgedrückt. *, P < 0,001 gegenüber IGFII alleine.
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2 ist
ein Chromatogramm von IGFIIE-Pegeln von Seren zweier HCAO-Patienten
(☐-☐, O-O) und eines normalen Kontrollsubjekts
(Δ-Δ). Die Pfeile
zeigen das Elutionsvolumen von als molekulare Größenmarker verwendeten Proteinen
an, wobei die Zahlen die Größe in kD
anzeigen.
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3A-3C sind
Chromatogramme der Fraktionierung von (A) IGFBP3, (B) IGFI und (C)
IGFII von Seren zweier HCAO-Patienten
(☐-☐, O-O) und von einem Kontrollsubjekt (Δ-Δ). Die Pfeile
zeigen das Elutionsvolumen von als molekulare Größenmarker verwendeten Proteinen
an, wobei die Zahlen die Größe in kD anzeigen.
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4A-4B sind
Chromatogramme der Fraktionierung von (A) IGFBP2 und (B) IGFIIE
von Seren zweier HCRO-Patienten (☐-☐, O-O) und
von einem Kontrollsubjekt (Δ-Δ). Die Pfeile
zeigen das Elutionsvolumen von als molekulare Größenmarker verwendeten Proteinen
an, wobei die Zahlen die Größe in kD
anzeigen.
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Detaillierte
Beschreibung
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Im Wesentlichen
reine Komplexe
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In
einem Aspekt, zeichnet sich die Erfindung durch einen im Wesentlichen
reinen, ein IGFIIE-Polypeptid und ein IGFBP2-Polypeptid enthaltenden Komplex aus.
Im Wesentlichen reine, IGFIIE-Polypeptid und IGFBP2-Polypeptid enthaltende
Komplexe werden leicht durch die Inkubation der gereinigten Polypeptide
miteinander gebildet. Ein Komplex, welcher etwa äquimolare Mengen von IGFIIE-Polypeptid
und IGFBP2-Polypeptid beinhaltet, ist besonders nützlich.
IGFII ist ein Skelett-Wachstumsfaktor,
welcher durch die Leber und durch Osteobla sten produziert wird.
Conover, in Principles of Bone Biology, 1. Edition, J.P. Bilezikian,
L.G. Raisz und G.A. Rodan, Editoren, Academic Press/San Diego, Seiten
607-618 (1996); und LeRoith, New Engl. J. Med., 336:633-640 (1997).
IGFII wird als Vorläufer
mit einer carboxyterminalen E-Domänen Erweiterung synthetisiert.
Dieses Prohormon (IGFIIE) wird dann durch Entfernung der E-Domäne in ein
normalerweise im Kreislauf vorliegendes reifes ~7 kD Peptid prozessiert.
IGFIIE scheint eine ähnliche
biologische Aktivität
wie IGFII aufzuweisen und gesteigerte Kreislaufpegel von ~10-20
kD IGFIIE, welches durch bestimmte mesenchymale und epitheliale
Tumore produziert wird, sind mit der Pathogenese der Nicht-Inselzelltumor-Hypoglykämie (NICTH)
in Verbindung gebracht worden. Valenzano et al., J. Biol. Chem.,
272:48004-4813 (1997); und Liu et al., J. Clin. Endocrinol. Metab.,
76:1095-1100 (1993).
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Wie
hierin verwendet, betrifft der Begriff "Polypeptid" das spezifische Polypeptic. von Interesse
und Polypeptide, welche dem spezifischen Polypeptid funktional gleichwertig
sind. Zum Beispiel schließt
das IGFIIE-Polypeptid IGFIIE und dem IGFIIE funktional gleichwertige
Polypeptide ein. Das IGFBP2-Polypeptid schließt IGFBP2
und dem IGFBP2 funktional gleichwertige Polypeptide ein. Funktional
gleichwertige Polypeptide behalten die biologische Aktivität des spezifischen
Polypeptids bei und können
Aminosäure-Insertionen, -Deletionen
oder -Substitutionen, sowie chemische Modifikationen beinhalten.
Funktional gleichwertige Polypeptide sind unter Verwendung der hierin
beschriebenen Methoden leicht identifiziert.
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Aminosäure-Insertionen
können
zum Beispiel Glykosaminoglykan-Bindungsmotive,
wie ein Heparin-Bindungsmotiv, einschließen. Aminosäure-Deletionen können zum
Beispiel Bereiche des Poly peptids einschließen, welche für eine Bindung
oder Bindungsspezifität
nicht erforderlich sind. Aminosäure-Substitutionen können konservative
und nicht-konservative Aminosäure-Substitutionen einschließen. Konservative
Aminosäure-Substitutionen ersetzen
eine Aminosäure
durch eine Aminosäure
derselben Klasse, wohingegen nicht-konservative Aminosäure-Substitutionen eine
Aminosäure
durch eine Aminosäure
einer anderen Klasse ersetzen. Nicht-konservative Substitutionen
können
in einer Änderung
der Hydrophobizität
des Polypeptids oder des Hauptteils einer Rest-Seitenkette resultieren.
Außerdem
können
nicht-konservative Substitutionen eine wesentliche Änderung
in der Ladung des Polypeptids hervorrufen, wie ein Reduzieren elektropositiver
Ladungen oder ein Einführen
elektronegativer Ladungen. Dennoch sind solche Änderungen möglich, wenn das resultierende
Peptid die biologische Aktivität
des unmodifizierten Polypeptids beibehält. Beispiele nicht-konservativer
Substitutionen schließen
eine basische Aminosäure
durch eine nicht-polare Aminosäure
oder eine polare Aminosäure
durch eine sauere Aminosäure
ein. Aminosäure-Insertionen, -Deletionen
und -Substitutionen können
unter Verwendung zufälliger
Mutagenese, ortsgerichteter Mutagenese oder anderer im Stand der Technik
bekannter Rekombinationstechniken vorgenommen werden.
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Ein
IGFIIE-Polypeptid kann durch standardmäßige Rekombinationstechniken
produziert werden. Die cDNA von IGFIIE hat eine GenBank Zugangsnummer
X00910 M17862 g32995. Bell, G.I. et al., Nature, 310(5980):775-777
(1984). In bakteriellen Systemen wird IGFIIE aus Einschlusskörpern isoliert,
welche in etwa 8 M Harnstoff gelöst
sind. Nach dem Rückfalten
des Proteins werden chromatographische Standardtechniken zum Reinigen
des IGFIIEs verwendet.
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Die
IGFBPs sind Bindungsproteine hoher Affinität, welche die Aktivität der IGFs
sowohl systemisch als auch lokal modulieren. Sechs IGFBPs sind charakterisiert
worden. Die IGFBPs sind strukturell homolog, jedoch funktional verschieden
und dienen mehreren Zwecken, einschließlich dem Transport von IGFs
im Kreislauf, dem Überbringen
von IGFs an Zielgewebe, und der Modulation von Zellantworten auf
die IGFs. Fünfundneunzig
Prozent der IGFs im Kreislauf sind in einem ternären Komplex von ~150 kD fest
an IGFBP3 mit einer säurelabilen
Untereinheit (ALS) gebunden. Dieser 150 kD Komplex ist auf den vaskulären Raum
beschränkt und
dient der Beschränkung
der Bioverfügbarkeit
von IGFs für
Zielgewebe. Etwa 5 % der IGFs zirkulieren an IGFBP-1, -2, und -4
gebunden in ~50 kD binären
Komplexen, welche die kapillare Barriere überqueren können und für das Abzielen von IGFs auf
spezifische Gewebe verantwortlich sein können.
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Menschliches
IGFBP2 kann von Sandoz Pharmaceuticals (Basel, Schweiz) oder Austral
(San Ramon, CA) gekauft werden. Alternativ kann IGFBP2 durch standardmäßige Rekombinationstechniken
produziert werden. Die codierende Sequenz für menschliches IGFBP2 hat eine
GenBank Zugangsnummer M35410 g179476. Agarwal, N. et al., Exp. Eye
Res., 52(5):549-561 (1991). Die codierende Sequenz für Rinder-IGFBP2 ist
ebenso verfügbar.
Upton, F.Z. et al., J. Mol. Endocrinol., 5:77-84 (1990). Im Allgemeinen
kann IGFBP2 aus konditionierten Zellmedien durch Affinitätschromatographie
mit menschlichem IGFI Protein, welches an Affi-prep 10 Medien oder ähnliche
feste Trägermaterialien
gebunden ist, isoliert werden und anschließend durch chromatographische
Techniken gereinigt werden.
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Methoden zur
Behandlung von Osteoporose
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Die
Erfindung ermöglicht
auch eine Methode, einen Osteoporose-Patienten zu behandeln. Die
Methode schließt
das Verabreichen einer Menge ein IGFII-Polypeptid und ein zum Steigern
der Knochenmasse beim Patienten wirksamen IGFBP2-Polypeptid einschließenden Komplexes
ein. Osteoporose ist ein Skelettzustand, welcher durch verminderte
Dichte eines normal mineralisierten Knochens gekennzeichnet ist,
was zu einer gesteigerten Anzahl von Frakturen führt. Post-menopausale, altersbezogene
und idiopathische Osteoporose sind nichteinschränkende Beispiele primärer Osteoporose,
welche unter Verwendung dieser Methode vorteilhaft behandelt werden
können.
Sekundäre
Formen von zum Beispiel durch übermäßige Alkoholeinnahme,
Hypogonadismus, Hyperkortisolismus und Hyperthyroidismus verursachte
Osteoporose können
auch unter Verwendung dieser Methode behandelt werden. IGFII und
IGFIIE sind besonders nützliche
IGFII-Polypeptide.
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Mehrere
anti-resorptive Arzneimittel, einschließlich Oestrogen, Kalzitonin,
Bisphosphonate und selektive Oestrogen-Rezeptor-Modulatoren sind jetzt zur
Behandlung von Osteoporose verfügbar,
obwohl die Möglichkeit,
große,
anhaltende Steigerungen in der Knochenmasse zu erreichen, ein alleiniges
Ziel bleibt. HCAO wird mit markanten Steigerungen in der Knochenmasse
im Erwachsenenleben assoziiert, was mit spezifischen Abnormitäten im IGF/IGFBP
System zusammenhängen
kann. HCAO-Patienten haben normale Serumpegel von IGFI und -II,
aber markant erhöhte
IGFIIE-Pegel. Bei den IGFBPs war ein Anstieg des IGFBP2 bei diesen Patienten
einzigartig und wurde nicht in Hepatitis C oder Hepatitis B Kontrollpatienten
gefunden. IGFI und -II in Seren von Patienten mit HCAO wurden, wie
im Fall von Seren von Kontrollsubjekten, an IGFBP3 gebun den im ~150
kD Komplex getragen, welcher im Kreislauf zurückgehalten wird. IGFIIE lag
jedoch überwiegend
in einem ~50 kD Komplex in Verbindung mit IGFBP2 vor; dieser Komplex
kann die kapillare Barriere überqueren und
hat Zugang zu Zielgeweben. In vitro verstärkte IGFII die Bindung von
rekombinantem menschlichem IGFBP2 an durch menschliche Osteoblasten
produzierte extrazelluläre
Matrix mehr als 3-fach und in einer Umgebung, welche reich an extrazellulärer Matrix
ist, war der IGFII/IGFBP2-Komplex beim Stimulieren menschlicher
Osteoblastenproliferation so wirksam wie IGFII alleine. Folglich
kann IGFBP2 das Abzielen von IGFs, und insbesondere IGFIIE, auf
Skelettgewebe bei HCAO-Patienten, mit einer nachfolgenden Stimulation
der Osteoblastenfunktion durch IGFs ermöglichen. Der vorliegende Befund
bezüglich
HCAO legt einen Ansatz zum Steigern der Knochenmasse bei Patienten
mit Osteoporose nahe. Sich über
drei Jahre erstreckende Langzeitdaten bei einem der Patienten, stützen eine
Ursache-und-Wirkung-Beziehung zwischen den erhöhten IGFBP2- und IGFIIE-Pegeln
und dem Anstieg in der Knochenbildung.
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Anstiege
sowohl an IGFBP2 als auch an IGFIIE können für die Stimulation der bei HCAO-Patienten beobachteten
Knochenbildung erforderlich sein. Folglich hatten Patienten mit
Hepatitis C aber ohne Osteosklerose und Patienten mit Pagetscher
Knochenkrankheit, erhöhte
IGFIIE Immunreaktivität
aber normale IGFBP2-Pegel. IGFBP2-Pegel sind auch nach langem Fasten,
in Verbindung mit bestimmten Tumoren und bei fortgeschrittener zirrhotischer
Leberkrankheit erhöht.
Keiner dieser Zustände
wird mit Osteosklerose, wie bei den HCAO-Patienten gefunden, in
Verbindung gebracht. Ein gemeinsamer Genotyp oder neuer Stamm der Hepatitis
C wurde in vier der sieben HCAO-Patienten
nicht beobachtet.
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Es
ist anzumerken, dass Messungen von IGFIIE in Serum (~10-20 kD) auf Standardkurven
unter Verwendung des E-II69-84 Fragments
(1,8 kD) beruhten. Während
der gegen E-II69-84 gebildete Antikörper spezifisch das
IGFIIE Prohormon erkannte, scheint er außerdem keinen vollen Zugang
zu diesem Epitop in der längeren IGFIIE
Vorläuferform
zu haben. Aus IGFII plus den ersten 21 Aminosäuren der E-Peptiddomäne bestehendes rekombinantes
IGFIIE ist in dem IGFII E-Domänen-RIA
ein nur 3-17 so wirksames Antigen, wie das E-II69-84 Peptid.
Folglich würden
auf einer molaren Basis vorsichtige Schätzungen zirkulierender Pegel
von intaktem IGFIIE bei HCAO-Patienten Pegel von IGFBP2 (~24 nM)
gleichen oder diese überschreiten.
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Die
einzige andere bekannte Erkrankung, welche sowohl mit IGFBP2 als
auch mit IGFIIE Erhöhungen verbunden
ist, ist NICTH. NICTH-Patienten entwickeln eine schwere Hypoglykämie, und
obwohl Knochenmasse oder Knochenumbau bei diesen Individuen nicht
bewertet worden sind, wurde von ihnen nicht berichtet, dass sie
Osteosklerose haben. Umgekehrt hat keiner der Patienten mit HCRO
klinisch offensichtliche Hypoglykämie gehabt. Tatsächlich hatten
zwei der HCAO-Patienten Diabetes mellitus und erhielten eine Therapie, entweder
mit einem oralen Wirkstoff oder mit Insulin, und die Nüchternwerte
der Serum-Glukosekonzentrationen in zumindest sechs der Patienten
sind nicht niedrig gewesen.
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Die
primäre
Ursache von Hypoglykämie
bei NICTH scheint die Möglichkeit
von vom Tumor stammendem IGFIIE zu sein, direkt und indirekt die
Bildung des ternären
150 kD IGF/IGFBP3/ALS-Komplexes
zu beeinträchtigen
(d. h., durch Vermindern von Wachstumshormon und Wachstumshormon-abhängigem ALS).
Bei HCAO hingegen ist die Bildung des 150 kD Komplexes nicht beeinträchtigt,
wobei alles IGFI und die Mehrheit des IGFIIs fest an IGFBP3 im ternären Komplex
gebunden bleiben, wie dies in normalem Serum der Fall ist. Die Produktion
von IGFIIE und IGFBP2 durch dasselbe Gewebe (d. h. die Leber) und
die schnelle Bildung eines Komplexes, stört das normale IGF/IGFBP Muster
möglicherweise
nicht, was ein Nichtvorliegen von Hypoglykämie bei HCAO-Patienten erklärt.
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Unter
Bedingungen, unter denen extrazelluläre Matrix vorliegt, war ein äquimolarer
IGFII/IGFBP2 Komplex ebenso wirksam in der Stimulation der Osteoblastenproliferation
wie IGFII. Dagegen deuteten mehrere frühere Studien darauf hin, dass
IGFBP2 die IGF Aktivität
hemmen kann. Es gibt jedoch wichtige Unterschiede zwischen diesen
Studien und den hierin beschriebenen in vivo und in vitro Befunden.
Die hemmende Wirkung von IGFBP2 auf die IGFI Stimulation der Osteoblastenfunktion
wurde durch einen 10-fachen oder größeren molaren Überschuß des IGFBP2s
bezüglich
IGFI demonstriert. Zirkulierende Pegel von intaktem IGFIIE bei HCAO-Patienten
würden
IGFBP2-Pegel gleichen oder sie überschreiten;
folglich würde
IGFBP2 bei HCAO-Patienten nicht in signifikantem molarem Überschuß vorliegen.
Wenn äquimolar
Mengen von IGFBP2 und IGFII verwendet wurden, war IGFBP2 in den
zehn-Tage-Kulturen nicht hemmend. Folglich scheinen sowohl die verwendete
Konzentration von IGFBP2 als auch das Vorliegen oder Nichtvorliegen
extrazellulärer
Matrix wichtige Faktoren bei der Bestimmung von IGFBP2 Wirkungen
auf die IGF Bioverfügbarkeit
zu sein. Eine ähnliche
Situation scheint im Fall von IGFBP3 vorzuliegen, welches die IGF
Aktivität
hemmen kann, wohingegen IGFBP3 bei niedrigen Konzentrationen oder
zell-assoziiertes IGFBP3 für
IGFI Wirkungen nicht hemmend ist. Außerdem resultiert die IGFBP-5-Bindung
an extrazelluläre
Matrix in einer verminderten Affinität von IGFBP-5 für IGFs,
weshalb die Bioverfügbarkeit
von IGFs ansteigt.
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IGFI
ist als eine Behandlung für
Osteoporose verwendet worden und gesteigerte Pegel von Markern der
Knochenbildung wurden im Serum beobachtet. Dieser Ansatz wurde jedoch
durch vielfache systemische Wirkungen von IGFI einschließlich der
Hypoglykämie
beschränkt.
Ebeling, P.R. et al., J. Clin. Endocrinol., 77:1384-1387 (1993);
Ghyon, L.S. et al., J. Bone Miner. Res., 10:1844-1852 (1995). Eine
Kombination von IGFI und IGFBP3 ist gesunden, älteren Frauen verabreicht worden,
was die Verabreichung höherer
Dosen von IGFI erlaubt. Ein Anstieg von Knochenbildungsindizes wurde
in dieser Studie bemerkt. Adam, S. et al., Endocrine Society, Treffen
von 1997, Abst. P3-240, Seite 496. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen
an, dass ein effizienterer Transfer von IGFs zum Skelett unter Verwendung
von IGFBP2-Polypeptid und insbesondere eines IGFIIE-Polypeptid und
IGFBP2-Polypeptid einschließenden
Komplexes erreicht werden kann.
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Die
Erfindung zeichnet sich auch durch eine Methode zum Abzielen einer
Zusammensetzung auf die extrazelluläre Matrix eines Skeletts eines
Patienten aus. Die Methode schließt das Verabreichen eines Komplexes
aus einem IGFIIE-Polypeptid, einem IGFBP2-Polypeptid und der Zusammensetzung
an den Patienten ein. Nicht einschränkende Beispiele von Zusammensetzungen
schließen
chemotherapeutische Wirkstoffe und Wachstumsfaktoren wie ein IGFI
ein.
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Wie
hierin gezeigt, zirkulieren IGFBP2 und IGFIIE in HCAO Seren zusammen
in einem 50 kD Komplex. Mehrere Beweisreihen legen nahe, dass IGFBP2
in dieser Form den Transport von IGFIIE oder IGFII zum Skelettgewebe
ermöglicht.
Die gleichzeitige Infusion von IGFBP2 mit IGFI oder II in Ziegen
steigerte die Clearance von IGFI und -II, und reduzierte zur gleichen
Zeit den Transfer von IGFs in Brustmilch, was nahe legt, dass IGFBP2
den Durchgang des IGFs aus dem Kreislauf und fort vom Brustepithel
ermöglichte.
Die Befunde bei den HCAO-Patienten und die in vitro Daten legen
nahe, dass dieses andere Gewebe das Skelett ist. Ein potenzieller
Mechanismus für
den selektiven Transport von IGFIIE (und möglicherweise IGFII) zur Knochenmatrix
von HCAO-Patienten ist nahegelegt, da IGFs, und speziell IGFII,
die IGFBP2-Bindung an die durch menschliche Osteoblasten produzierte
extrazelluläre
Matrix erhöhen.
Es ist gezeigt worden, dass der IGF/IGFBP2 Komplex an die extrazelluläre durch
Fibroblasten produzierte Matrix bindet. Die Bindung von IGFBP2 erfolgte
hauptsächlich
an Glykosaminoglykane, welche in der Knochenmatrix reichlich vorhanden sind.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen
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Die
Erfindung ermöglicht
auch eine pharmazeutische Zusammensetzung einschließlich einer
Menge von IGFII-Polypeptid und IGFBP2-Polypeptid, welche zur Steigerung
der Knochenmasse bei einem Säuger wirksam
ist, und eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers. Nützliche IGFII-Polypeptide schließen IGFII,
IGFIIE und IGFI ein, welche ein Heparin-Bindungsmotiv beinhalten.
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Die
Menge des zur Steigerung der Knochenmasse in einem Säuger wirksamen
IGFII-Polypeptids und IGFBP2-Polypeptids kann in Abhängigkeit
mehrerer Faktoren variieren, einschließlich der bevorzugten zu verabreichenden
Dosis des Komplexes, der chemischen Eigenschaften der eingesetzten
Polypeptide, der Formulierung der Komplexhilfsstoffe und des Wegs
der Verabreichung. Die Dosis einer zu verabreichenden pharmazeutischen
Zusammensetzung kann vom Arzt eingestellt werden, um solche Variablen
wie den gesamten Gesundheitsstatus des einzelnen Patienten und die
relative biologische Wirksamkeit der ausge wählten Zusammensetzung zu berücksichtigen.
Zum Beispiel können
einem Patienten von der pharmazeutischen Zusammensetzung etwa 0,01
mg/kg/Tag bis etwa 10 mg/kg/Tag verabreicht werden.
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Das
IGFII-Polypeptid und IGFBP2-Polypeptid kann in pharmazeutische Zusammensetzungen
durch die Mischung mit pharmazeutisch akzeptablen, nicht-toxischen
Hilfsstoffen oder Trägern
formuliert werden. Solche Verbindungen und Zusammensetzungen können zur
parenteralen Verabreichung, insbesondere in Form flüssiger Lösungen oder
Suspensionen in wässrigen
physiologischen Pufferlösungen,
zur oralen Verabreichung, insbesondere in Form von Tabletten oder
Kapseln, oder zur intranasalen Verabreichung, insbesondere in Form
von Pulvern, Nasentropfen oder Aerosolen zubereitet werden. Zusammensetzungen
für andere Verabreichungswege
können
wie gewünscht
unter Verwendung von Standardmethoden zubereitet werden.
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Formulierungen
für die
parenterale Verabreichung können
als allgemeine Hilfsstoffe steriles Wasser oder Salzlösung, Polyalkylenglykole,
wie Polyäthylenglykol, Öle pflanzlichen
Ursprungs, hydrierte Naphthaline und dergleichen enthalten. Insbesondere
sind biokompatible(s), biologisch abbaubare(s) Lactid-Polymer, Lactid/Glykolid-Kopolymer,
oder Polyoxethylen-Polyoxypropylen-Kopolymere Beispiele von Hilfsstoffen
zur Steuerung der Freisetzung einer Zusammensetzung der Erfindung
in vivo. Andere geeignete parenterale Freisetzungssysteme schließen Äthylen-Vinylazetat-Kopolymerpartikel,
osmotische Pumpen, implantierbare Infusionssysteme und Liposomen
ein. Formulierungen für
inhalative Verabreichung können,
falls gewünscht,
Hilfstoffe wie Lactose enthalten. Formulierungen zum Inhalieren
können
wässrige
Lösungen
sein, welche zum Beispiel Polyoxyäthylen-9-Lauryl-Äther, Glykocholat
und Deoxycholat enthalten oder sie können ölige Lösungen für die Verabrei chung in Form
von Nasentropfen sein. Wenn gewünscht,
können
die Zusammensetzungen als Gele zur intranasalen Anwendung formuliert
werden. Formulierungen für
die parenterale Verabreichung können
auch Glykocholat für
die bukkale Verabreichung einschließen.
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Die
Erfindung ermöglicht
auch ein Erzeugnis, welches Verpackungsmaterial und einen im Verpackungsmaterial
enthaltenen pharmazeutischen Wirkstoff einschließt. Der pharmazeutische Wirkstoff
schließt einen
Komplex eines IGFII-Polypeptids und eines IGFBP2-Polypeptids ein
und ist therapeutisch wirksam, um die Knochenmasse zu steigern.
Das Verpackungsmaterial schließt
ein Etikett oder einen Packungseinsatz ein, welcher anzeigt, dass
der pharmazeutische Wirkstoff verwendet werden kann, um die Knochenmasse
zu steigern oder Osteoporose zu behandeln, zum Beispiel unter Verwendung
der hierin beschriebenen Methoden.
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Die
Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen, welche den in
den Ansprüchen
beschriebenen Umfang der Erfindung nicht einschränken, beschrieben.
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BEISPIELE
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Beispiel 1 – Allgemeine
Methoden:
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Nach
einer Einverständniserklärung wurden über Nacht
Nüchtern-Serumproben
von sieben zuvor berichteten HCAO Fällen gewonnen. Villareal et
al., Am. J. Med., 93:371-381 (1992); Beyer et al, J. Bone Miner. Res.,
5:1257-1263 (1990); Whyte et al., J. Bone Miner. Res., 11:554-558
(1996); Whyte et al., Am. J. Med., 102:219-220 (1997); und Hassoun
et al., Am. J. Med., 103:70-73 (1997). Alle Patienten hatten dokumentierte erworbene
Osteosklerose (radiologisch und histologisch bewertet) und serologische
Beweise einer chronischen Hepatitis C Infektion, obwohl keiner davon
eine symptomatische Leberkrankheit hatte und die Hepatitis C Infektion
tendenziell ein zufälliger
klinischer Befund war. Es wurden Proben von fünf Männern und zwei Frauen im Alter
von 32 bis 73 Jahren gewonnen. Die Seren wurden entweder auf Trockeneis
oder bei –70°C aufbewahrt,
bis sie analysiert wurden. Kontrollgruppen schlossen normale, gesunde
Individuen (n = 9, Altersbereich von 36 bis 71 Jahre), Hepatitis
C Patienten ohne klinischen oder radiologischen Beweis von Osteosklerose
(n = 9, Altersbereich von 22 bis 70 Jahre), Hepatitis B Patienten
(als Kontrolle für
eine Leberkrankheit ohne Bezug) (n = 6, Altersbereich von 23 bis
51 Jahre) und Patienten mit Pagetscher Knochenkrankheit (als Kontrolle
für erhöhte Knochenbildung
ohne Bezug zu einer Hepatitis C Infektion) (n = 5, Altersbereich
von 54 bis 71 Jahre) ein.
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Herstellung und Isolierung
von Rinder-IGFBP2:
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Um
das Rinder-IGFBP2 Protein zu exprimieren, wurde eine zuvor beschriebene
cDNA, welche für
das Protein codiert (Upton, F.Z. et al., J. Mol. Endocrinol., 5:77-84
(1990)) in das Säugerexpressionsplasmid
pRSVN (McKinnon P. et al., J. Mol. Endocrinol., 6:231-239 (1991))
eingefügt.
Dieses Plasmid wurde durch Elektroporation in die CHO K1 Zelllinie
eingeführt.
Neomyzinresistente Klone wurden isoliert und mittels ELISA Untersuchung
mit einem monoklonalen Antikörper,
welcher gegen Rinder-IGFBP2 erzeugt wurde, daraufhin ausgesucht,
ob sie Rinder-IGFBP2 Protein in die Medien abgeben. Ein einzelner
als 1C1 bezeichneter Klon wurde für die Herstellung von Rinder-IGFBP2
Protein ausgewählt.
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Ein
konditioniertes Medium, welches das IGFBP2 Protein enthält, wurde
erzeugt durch Kultur der 1C1 CHO Zellen in einer Cell Factory (Nunc)
in DMEM/F12 Medium plus 2 % FBS bis zur Konfluenz und Umstellen auf
Serum-freies DMEM/F12 zur Herstellung. Konditioniertes Medium wurde
bei –20°C in Gegenwart
von 0,5 % Tween 20 gelagert. Eine Reinigung des IGFBP2 Proteins
wurde durch eine anfängliche
Reinigung durch Affinitätschromatographie
mit menschlichem IGFI Protein (GroPep), welches gemäß der Vorschriften
des Herstellers an Affi-prep 10 Medium (Bio-Rad) gekoppelt worden
war, erreicht. Die IGFBP2 enthaltenden Überstände wurden zweimal über die
Affinitätssäule laufen
gelassen, mit 50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 6,5 gewaschen
und mit 0,5 M Essigsäure
eluiert. Durch analytische HPLC identifizierte Fraktionen, welche
einen Protein-Peak enthielten, wurden vereint und an einer C4 Delta-Pak
HPLC Säule
(Waters) in Gegenwart von 0,1 % TFA adsorbiert und mit einem Acetonitrilgradienten
von 28 % bis 44 % mit 0,1 % TFA als das Gegenion eluiert. Fraktionen,
welche einen Protein-Peak enthielten, wurden nochmals vereint und
in Gegenwart von 20 mM Tris-HCl, pH 7,2 (Puffer A) auf eine Hi Load
Q Säule
(Pharmacia) geladen. Das IGFBP2 Protein wurde mit einem Gradienten
von 0-100 % von 150 mM NaCl in Puffer A über 100 min. eluiert. Dieser
Schritt löste
mehrere Prozessierungsvarianten des IGFBP2-Proteins auf. Das reife
IGFBP2 Protein wurde dann durch eine pH 3,0 bis pH 9,0 isoelektrische
Fokussierung-Gelelektrophoreseanalyse der Protein-Peak enthaltenden Fraktionen
(Pharmacia Phast System) identifiziert.
-
Die
Identität
und Reinheit des IGFBP2-Proteins wurde durch Analyse auf 10-20 %
Tris-Glycin-Polyacrylamid Gelen (Novex) und N-terminaler Sequenzanalyse
bestätigt.
Eine Massenspektrometrie zeigte das erwartete Molekulargewicht von
etwa 31 kD. Eine Western-Liganden-Blot-Analyse zeigte, dass das
IGFBP2 Protein im Stande war, IGFII zu binden.
-
Herstellung
und Isolierung von IGFIIE: Um das IGFIIE Protein voller Länge in Bakterien
zu exprimieren, wurde das Expressionsplasmid pMpGH(1-46)VNG/IGFII,
welches für
die reife Version von IGFII-cDNA mit einer 46 Aminosäuren-Wachstumshormon-Leitsequenz (wie
ausführlich
im U.S. Patent Nr. 5,330,971 beschrieben) und einem Glycin an der
ersten Position des IGFII Moleküls
(Whitfield H.J. et al., Nature, 312:277-280 (1984)) codiert, wie
folgt modifiziert. Dieses Plasmid wurde als eine Schablone für eine Polymerase-Kettenreaktion-(PCR)
Verlängerungstechnik
verwendet, um Nukleotide hinzuzufügen, welche der für die Expression
in Bakterien optimierten E-Domäne
von IGFII entsprechen. Die folgenden DNA-Oligonukleotid-Primer wurden
synthetisiert:
-
Das
Expand high Fidelity-PCR System (Boehringer Mannheim) und Primer
#1714 und IIE/1 wurden dann verwendet, um ein Produkt aus dem Plasmid
pMpGH(1-46)VNG/IGFII zu vervielfältigen.
Das Produkt wurde mit Standardtechniken gereinigt und als die Schablone
zur PCR Vervielfältigung
mit dem Primer #1714 und IIE/2 verwendet. Es folgten aufeinanderfolgende
Runden der Vervielfältigung
mit Primer #1714 und den IIE/3, IIE/4 und IIE/5 Primern, um ein
Endprodukt zu erzeugen, welches für das vollständige Präpro-IFG-IIE-Protein
codiert. Dieses PCR-Fragment
wurde mit HpaI und HindIII verdaut und in einen HpaI-HindIII beschränkten pMpGH(1-46)VNG/IGFII-Vektor
subkloniert, um die IGFII-cDNA durch die IGFIIE-cDNA zu ersetzen.
-
Die
Sequenz des IGFIIE-Inserts im resultierenden Plasmid wurde durch
eine DNA-Sequenzanalyse unter Verwendung des Thermo Sequenase Terminator
Zyklus Sequenzierungskits (Amersham) gemäß den Vorschriften des Herstellers
bestätigt.
Dieses bakterielle Expressionsplasmid enthält eine cDNA, welche für die IGFIIE
Sequenz voller Länge
mit einem Glycin an Position-1 des IGF-Proteins unmittelbar stromabwärts einer Hydroxylamin-Spaltungsstelle und
einer 46 Aminosäure
Wachstumshormon-Führungspeptidsequenz
codiert und wird nachfolgend mit pGH(46)/IGFIIE bezeichnet.
-
Zur
Proteinexpression wurde das pGH(46)/IGFIIE Plasmid in den E. coli
Stamm BL21 (Stratagene) gemäß den Vorschriften
des Lieferanten eingeführt.
Eine pGH(46)/IGFIIE-transformierte Kolonie wurde in ein Luria Bertani
(LB) Medium überimpft
und über
Nacht kultiviert. Ein Aliquot wurde in eine frische Probe des LB-Mediums überführt und
bei 37°C
inkubiert bis eine Absorption (A600) von
0,6 erreicht wurde. Zu diesem Zeitpunkt wurde Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid
(IPTG) zu einer Endkonzentration von 0,2 mM hinzugefügt, um die Zellen
zum Herstellen des IGFIIE-Fusionsproteins als Einschlusskörper (IBs)
zu veranlassen. Nach weiterer Inkubation wurde die Kultur zentrifugiert,
um die Zellen zu pelletieren, und nach Entfernung des Überstands wurden
die Zellen mit SDS-PAGE-Lysepuffer (Novex) lysiert. Diese Kulturen
wurden durch SDS-PAGE-Chromatographie
unter Einsatz von 10-20 % Tris-Glycin-Gelen (Novex) direkt mit Kulturen
verglichen, welche von parentalen BL21-Zellen ohne das IGFIIE-Expressionsplasmid
stammten um die Expression des IGFIIE-Fusionsproteins zu bestätigen. Ein
als das Fusionsprotein exprimierend identifizierter Klon wurde in
einem Scale-Up-Verfahren zur Herstellung geeigneter Mengen des Fusionsproteins
für in
vitro und in vivo Experimente verwendet.
-
Zwei
5 Liter Applikon Fermenter wurden verwendet, wobei jeder 3 l des
mit Glukose (12 % w/v) und MgSO4 (0,12 %
w/v) ergänzten
LB-Mediums enthielt. Das Medium wurde mit einem Aliquot einer log-Phase-Kultur
von das IGFIIE-Fusionsprotein exprimierenden BL21-Zellen angeimpft.
Angeimpfte Fermentierungskulturen wurden bei 37°C über Nacht inkubiert. Bei einer
Absorption zwischen 4-6 bei 600 nm (A600)
wurde den Kulturen IPTG zu einer Endkonzentration von 0,2 mM hinzugefügt und die Zellen
inkubierten weiter, bis eine A600 von etwa
15-20 erreicht wurde, wonach die Fermentierungssuspension vier Durchgängen durch
einen Homogenisierer unterworfen wurde. Dieses Verfahren zerstörte die
Zellen, was die weitere Isolierung und Reinigung von IBs durch vier
Zentrifugations- und Waschschritte unter Verwendung von 30 mM NaCl/10
mM KH2PO4-Waschpuffer erleichterte.
Eine Endausbeute von 14,5 Gramm nasser IBs wurde gewonnen und bei –20°C aufbewahrt.
-
Das
das IGFIIE-Fusionsprotein enthaltende IB-Pellet wurde mit herkömmlichen
Methoden gelöst,
entsalzt und rückgefaltet.
Das IGFIIE-Fusionsprotein wurde dann isoliert und gespalten, gefolgt
von Chromatographieschritten unter Einsatz von Variationen bekannter
Methoden. Diese Verfahren schlossen der Reihe nach ein:
- 1) Auflösen
von IBs in Puffer (8 M Harnstoff, 0,1 M Tris, 40 mM Glycin, 0,5
mM NzCl2 und 16 mM Dithiothreitol (DTT)
pH 9,0), Zentrifugation und Filtration (1 μm Gradienten Whatman Filter),
um partikuläre
Kontaminationen zu entfernen und Entsalzung in 8 M Harnstoff, 0,1
M Tris, 40 mM Glycin, 0,5 mM ZnCl2 und 1,6 mM
DTT pH 9,0 durch Größenausschlusschromatographie
auf Cellufine GCL-1000M.
- 2) Ein 195 ml Vorrat eines Puffers, welcher etwa 180 mg des
Fusionsproteins enthält,
wurde zu 5 l in 4 M Harnstoff, 20 mM Glycin, 0,1 M Tris, 0,4 mM
DTT und 0,5 mM ZnCl2, pH 9,0 rekonstituiert; über 180
Minuten unter Zugabe von 2-Hydroxyethyl-Disulfid
zu 1 mM rückgefaltet.
Die Mischung wurde mit konzentrierter HCl wieder auf pH 2,5 angesäuert, um
die Reaktion zu stoppen.
- 3) Die 5 l Rückfaltungsmischung
wurde mit einem Spaltungs puffer, welcher 4 M Harnstoff, 20 mM Glycin, 0,1
M Tris und 2 M NH2OH enthält, auf
10 l verdünnt.
Der pH wurde auf pH 8,65 eingestellt und für 16 Stunden bei 37°C inkubiert.
- 4) Nach Filtration durch einen 0,8 μm Filter (Millipore) wurde die
geklärte
Mischung unter Verwendung einer Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(RP-HPLC) unter Einsatz einer 100 mm langen C4 Säule mit 40 mm Durchmesser (Waters),
Waschen mit 0,1 % Heptafluorbuttersäure (HFBA) und Eluieren mit
80 % Acetonitril/0,1 % HFBA chromatographiert.
- 5) Eine letzte Entsalzung und Reinigung wurde unter Verwendung
von RP-HPLC und der C4 Säule,
aber unter Einsatz einer 0,1 % Heptafluorbuttersäure-(HFBA) Wäsche und
Elution mit 80 % Acetonitril/0,1 % HFBA Gradienten bei 0,16 pro
Minute durchgeführt.
-
Auflösung, Rückfaltung
und Spaltung des von dem pGH(46)-IGFIIE-Expressionsvektorkonstrukts stammenden
IGFIIE-Fusionsproteins
auf die vorhergehende Weise ergab Material, welches eine IGF-Rezeptor-Bindungsaktivität aufwies.
Eine SDS-PAGE Analyse zeigte, dass das Protein als eine Hauptbande
von 17,6 kD mit zusätzlichen
Unterformen niedrigeren Molekulargewichts lief.
-
IGF/IGFBP
Messungen: IGFI und IGFII wurden durch spezifische Radioimmununtersuchungen
(RIA) nach Abtrennung von IGFBPs durch G-50 Säurechromatographie, wie zuvor
beschrieben, gemessen. Powell et al., Clin. Endocrinol. Metab.,
63:1186-1192 (1986). IGFIIE wurde durch eine zuvor validierte RIA
unter Verwendung eines gegen ein synthetisches 16-Aminosäurensegment
der vorhergesagten IFG-II E-Domäne (E-II69-84) erzeugten Antikörpers gemessen. E-II69-84 wurde als Radio ligand und für die Standardkurve
verwendet. Liu et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 76:1095-1100
(1993). Diese Untersuchung ist für
Proteine mit der E-II Domäne
spezifisch und detektiert nicht die reife Form von IGFII. IGFBP3-Pegel
wurden durch RIA wie zuvor beschrieben unter Verwendung von kovalentem
[125I]IGFII:IGFBP3 als Tracer gemessen.
Liu et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 75:1261-1267 (1992). IGFBP2-Pegel
wurden durch RIA mit einem von Dr. Werner Blum (Tübingen,
Deutschland) bereitgestellten polyklonalen anti-IGFBP2 Antikörper (1:2000
Endverdünnung)
untersucht. Für
den Tracer und die Standardkurve wurde rekombinantes menschliches
IGFBP2 verwendet (Austral, San Ramon, CA). IGFBP-1 wurde durch eine
Zweistellen-Immunradiometrie-Untersuchung und ALS durch eine Immunosorbent-Untersuchung
(Diagnostic Systems Laboratories, Webster, TX) gemessen.
-
Säulenchromatographie:
Eine Sephadex G-50 Säulenchromatographie
wurde, wie zuvor beschrieben, in Säure durchgeführt. Liu
et al., 1993, oben. Kurz, Patienten- oder Normalserum (1 ml) wurde
auf einer 1 × 120
cm G-50 Sephadex Säule
(Pharmacia, Piscataway, NJ) in 1 % Ameisensäure fraktioniert. Fünf ml Fraktionen
wurden gesammelt, lyophilisiert und dann in einem RIA-Puffer wieder
aufgelöst.
Für Superdex 200-(5-200)
Chromatographie wurde eine 1 × 120
cm 5-200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) Säule in 0,1 M Tris/HCl mit 0,15
m NaCl, pH 7,4 Puffer äquilibriert
und 0,5 ml jeder Serumprobe wurde bei einer Flussrate von 0,5 ml/min
fraktioniert. Zwei ml Fraktionen wurden gesammelt und die IGFs und
IGFBPs wie oben beschrieben untersucht. Säulen wurden mit Aldolase (158
kD), Ovalbumin (43 kD), Myoglobin (19 kD), Cytochrom c (12,4 kD)
und IGFI und -II (~7 kD) kalibriert.
-
Western-Ligand-Blotting:
Eine Western-Ligand-Blot Analyse für IGFBPs wurde, wie zuvor beschrieben,
durchgeführt.
Hassager et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 75:228-233 (1992).
Kurz, 1 μl
Serum oder 50 μl
der extrazellulären
Matrixprobe (siehe unten) wurde durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE) mit einem linearen Gradienten von 7,5 % bis 15 % unter
nicht-reduzierenden Bedingungen aufgetrennt. Die aufgetrennten Proteine
wurden auf Nitrozellulosefilter durch Elektro-Blotting aufgebracht, und
die Filter wurden dann blockiert, mit 125I-markiertem
IGFII über
Nacht bei 4°C
sondiert und durch Autoradiographie nach der Methode von Hossenlopp
et al., Anal. Biochem., 154:138-143 (1986) visualisiert. Abtast-Densitometrie
und Molekulargrößenbestimmungen
wurden unter Verwendung eines UltraScan XL Laser Densitometers und
einer Gel-Scan XL Software (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala,
Schweden) durchgeführt.
-
IGFBP-2-Bindung
an extrazelluläre
Matrix: Bindungsuntersuchungen wurden unter Verwendung extrazellulärer Matrix
durchgeführt,
welche von normalen adulten menschlichen osteoblastischen Zellen
oder fötalen
menschlichen osteoblastischen Zellen, welche mit einem temperatur-sensitiven
T-Antigen immortalisiert wurden, stammte. Robey et al., Calcif.
Tissue Int., 37:453-460 (1985) und Harris et al., J. Bone Miner.
Res., 10:178-186 (1995). Zellen wurden zur Konfluenz in 24-Well-Platten (Primera,
Falcon Laboratories, Logan VT) wachsen gelassen. Monoschichten wurden
gewaschen und die Zellen wurden entfernt. Atria et al., Endocrinology,
137:4571-4575 (1996). Die extrazelluläre Matrix, welche auf den Platten
zurückblieb,
wurde für
die Bindungsstudien verwendet.
-
In
einer Reihe von Experimenten wurde extrazelluläre Matrix über Nacht bei 4°C mit rhIGFBP2
(500 ng/ml, Sandoz Pharmaceuticals, Basel, Schweiz) in Abwesenheit
oder Gegenwart von 400 ng/ml IGFI, IGFII oder Insulin inkubiert.
Extrazelluläre
Matrixproteine wurden extrahiert und der IGFBP-Gehalt durch Western-Ligand-Blotting
bestimmt. In einer zweiten Reihe von Experimenten wurden mit extrazellulärer Matrix
beschichtete Wells über
Nacht bei 4°C
mit 125I-rhIGFBP2 (50 000 cpm; 5 μCi/μg) in Abwesenheit
oder Gegenwart von unmarkierten IGFI, IGFII oder Insulin inkubiert.
Extrazelluläre
Matrix wurde extrahiert und in einem Gammazähler (ICN Micromedic Systems,
Huntsville, AL) gezählt.
Unspezifische Bindung wurde als die Menge 125I-rhIGFBP2
definiert, welche in Gegenwart von 400 ng/ml von unmarkierten IGFBP2
gebunden hat. Unspezifische Bindung wurde von der Gesamtbindung
abgezogen, um spezifische Bindung zu bestimmen.
-
Menschliche Osteoblastenproliferationsstudien:
-
Proliferationsstudien
unter Verwendung normaler adulter menschlicher Osteoblasten wurden
wie zuvor beschrieben durchgeführt.
Conover, C.A., J. Clin. Invest., 88:1354-1361 (1991); Durham, S.K.
et al., J. Bone Miner. Res., 9:111-117 (1994). Kurz, adulte menschliche
osteoblastische Zellen wurden in 24-Well-Platten ausplattiert und
entweder 1 Tag oder 10 Tage wachsen gelassen. Die Zellen wurden
gewaschen und auf ein serumfreies Medium ohne oder mit 10 nM IGFII,
IGFBP2 oder der Kombination umgestellt. Ein [3H]Thymidin-Einbau
wurde bei 22-26 Stunden gemessen.
-
Statistische
Analyse: Gesamtgruppenunterschiede wurden unter Verwendung von Varianzanalyse (ANOVA)
untersucht. Wenn die ANOVA statistisch signifikant war (P < 0,05), wurden Einzelvergleiche
unter Verwendung ungepaarter, zweiseitiger t-Tests durchgeführt. Daten
sind als Mittelwert ± SEM
dargestellt.
-
Beispiel 2 – Serumpegel
von IGFs/IGFBPs/ALS:
-
Tabelle
1 stellt Serumpegel von IGFs, IGFBPs und ALS bei HCAO-Patienten
und vier Kontrollgruppen dar. Serumpegel von IGFI und -II waren
bei HCAO nicht verändert
und waren unter den Gruppen nicht signifikant verschieden. Die Immunreaktivität für die E-Peptiddomäne von IGFII
war bei HCAO in etwa 2,6-fach erhöht, in den Bereich von Werten,
welche zuvor für
Patienten mit NICTH unter Verwendung dieser Untersuchung berichtet
wurden. IGFIIE-Pegel waren auch bei Hepatitis C-Patienten ohne Osteosklerose aber nicht
bei Hepatitis B-Patienten
erhöht.
Unter den viralen Hepatitis-Patienten waren IGFIIE Erhöhungen deshalb
für die zwei
Gruppen der Hepatitis C-Patienten spezifisch. Jedoch war diese Abnormität nicht
einzigartig für
die Hepatitis C-Patienten, weil IGFIIE-Pegel auch bei Patienten
mit Pagetscher Knochenkrankheit erhöht waren. Tabelle
1
-
Die
IGFIIE-Domänen-Immunreaktivität in den
Seren der HCAO-Patienten
wurde weiter unter Verwendung von Sephadex G-50 Säurechromatographie
charakterisiert. Daten von zwei dieser Patienten sind in 1 gezeigt.
Die IGFIIE-Immunreaktivität in den
HCAO Seren hatte ein Molekulargewicht von etwa 10-20 kD, mit etwas
Größenheterogenität, wie zuvor
für IGFII
Prohormon berichtet. Es gab keinen Beweis für E-Domänen-Fragmente
niedrigen Molekulargewichts in den Seren dieser Patienten. Ähnliche
Molekulargewichtsabschätzungen
von ~15 kD für
die IGFIIE Immunreaktivität
wurden durch Immuno-Blotting
von HCAO-Seren mit einem IGFII-Antikörper gewonnen. Folglich entsprach
die IGFIIE-Domänen-Immunreaktivität in Seren
von HCAO-Patienten dem intakten IGFII-Prohormon oder IGFIIE.
-
Tabelle
1 stellt auch immununtersuchbare Pegel von IGFBP-1, IGFBP2, IGFBP3
und ALSs in den HCAO- und Kontrollgruppen dar. IGFBP-1-Pegel waren
unter den Gruppen nicht signifikant verschieden. IGFBP3- und ALS-Pegel
waren bei den Hepatitis C- und
8-Patienten verglichen mit entweder den normalen Subjekten oder
den Patienten mit Pagetscher Knochenkrankheit nied riger. Die einzigartige
Abnormität
in den HCAO-Patienten war jedoch ein markanter Anstieg in IGFBP2-Pegeln
(Tabelle 1). Die Immununtersuchungsdaten wurden durch Western-Ligand-Blot-Analyse von HCAO-
gegenüber
normalen Seren bestätigt,
welche auch den signifikanten Anstieg in IGFBP2 bei diesen Patienten
bei der erwarteten Molekulargröße für das intakte
Protein auf SDS-PAGE (~34 kD) demonstrierte. Die Western-Ligand-Blot-Daten wurden unabhängig durch
Immunpräzipitation
mit einem IGFBP2-Antikörper
verifiziert. Durch Biogel P-60-Säurechromatographie sowie
nicht-denaturierende S-200 Chromatographie wurde bestätigt, dass
immunreaktives IGFBP2 in HCAO-Seren ein intaktes Protein ist (siehe 3). Während
IGFBP-4-Pegel nicht durch Immununtersuchung gemessen wurden. Zeigte
der Western-Ligand-Blot an, dass es keinen offensichtlichen Unterschied
in den IGFBP-4-Pegeln zwischen HCAO- und normalen Subjekten gab.
-
Der
Western-Ligand-Blot zeigte auch die Abnahme in IGFBP2-Serumpegeln zwischen
1993 und 1996 bei einem der HCAO-Patienten,
welcher über
diesen Zeitraum eine klinische Remission von Knochenschmerzen hatte.
Diese Remission war mit einer Abnahme in Serumpegeln von Leberenzymen
(Aspartat-Aminotransferase) sowie in Markern der Knochenbildung
(alkalische Phosphatase, Osteocalcin) verbunden. Die biochemischen Änderungen
waren auch mit einem markanten Abfall sowohl in Serum-IGFBP2 als
auch -IGFIIE auf Pegel verbunden, welche nicht vom Mittelwert für die normalen
Subjekte zu unterscheiden sind (Tabelle 2). Die Behandlung während dieser
Zeit bestand aus subkutanem Kalzitonin und Bisphosphonaten (intravenöses Pamidronat
gefolgt von oralem Etidronat) in einem Versuch, Knochenumbau zu
vermindern. Da verstärkter
Knochenumbau per se, wie er bei den Pagetschen Patienten vorliegt,
nicht zu signifikanten Erhöhungen
in IGFBP2-Pegeln führte
(Tabelle 1), hing der Abfall in IGFBP2-Pegeln über diesen Zeitraum wahrscheinlich
eher mit dem Verlauf der Krankheit, vielleicht bedingt durch Remission
der Leberkrankheit, als mit einer unspezifischen Wirkung einer Abnahme
im Knochenumbau zusammen.
-
-
Beispiel 3 – Verteilung
von Serum IGFs und IGFBPs zwischen 150 kD- und 50 kD-Komplexen:
-
Zusätzlich zum
Messen der Serumpegel der IGFs und IGFBPs wurde die Verteilung der
IGFs, welche in den ~150 kD- und ~50 kD-Komplexen im HCAO-Serum
an IGFBPs gebunden waren, durch S200-Säulenchromatographie untersucht
(2). IGFBP3 ist das einzige Bindungsprotein, welches
einen ternären
150 kD-Komplex mit
IGF und ALS bildet. Wie in 2A gezeigt,
wurde das meiste IGFBP3 im HCAO-Serum im 150 kD-Komplex gefunden,
wie es für
normales Serum der Fall ist. Im Wesentlichen war alles IGFI im HCAO-Serum
mit IGFBP3 im 150 kD-Komplex assoziiert, und diese Verteilung von
IGFI unterschied sich nicht zwischen HCAO- und normalem Serum (2B). Fast alles IGFII im normalen Serum
war auch in der 150 kD-Fraktion, und obwohl das meiste IGFII im
HCAO-Serum in der 150 kD-Fraktion
war, gab es etwas Anstieg an IGFII in der 50 kD-Fraktion im HCAO- im Vergleich zum normalen
Serum (2C).
-
Alles
IGFBP2 sowohl in den HCAO-Patienten- als auch in normalen Seren
war in der 50 kD-Fraktion. Jedoch war die absolute Menge an IGFBP2
in den Patientenseren signifikant erhöht (3A). Es
gab keinen Beweis durch 5-200 Chromatographie für niedermolekulare Fragmente
von IGFBP2 in HCAO-Seren. Außerdem
wurde, wie in 3B gezeigt, die Mehrheit des
IGFIIEs beim Patienten- und Kontrollserum auch im 50 kD-Komplex
gefunden, vermutlich in Verbindung mit IGFBP2, welches der Hauptbestandteil
dieses Komplexes ist. Im HCAO-Serum gab es auch einige Beweise für IGFIIE
im 150 kD-Komplex.
-
Beispiel 4 – In vitro
Studien über
IGFBP2-Wechselwirkungen mit der extrazellulären Matrix menschlicher Osteoblasten:
-
Die
obigen in vivo Daten zeigten nicht nur, dass HCAO-Patienten sowohl
einen Anstieg an intaktem IGFIIE als auch IGFBP2 hatten, sondern
auch, dass die zwei Proteine zusammen im 50 kD-IGF/IGFBP-Komplex
zirkulierten. Um zu bestimmen, ob IGFBP2 den Transport von IGFII
und/oder IGFIIE zur Knochenmatrix in diesen Patienten ermöglichen
könnte,
wurde untersucht, ob der IGF/IGFBP2-Komplex in vitro an menschliche
Knochenmatrix binden könnte.
rhIGFBP2 (500 ng/ml) wurde über
Nacht bei 4°C
mit von menschlichen Osteoblasten stammender extrazellulärer Matrix
in Gegenwart oder Abwesenheit von 400 ng/ml von IGFI, IGFII oder
Insulin inkubiert. Die extrazelluläre Matrix wurde gewaschen mit,
rhIGFBP2-Bindung bestimmt durch Western-Ligand-Blot gelöster Matrix.
Ohne IGFs inkubierte extrazelluläre
Matrix zeigte eine minimale Bindung von rhIGFBP2. In Gegenwart von
IGFI oder IGFII war jedoch die Bindung von rhIGFBP2 an extrazelluläre Matrix
signifikant erhöht.
Densitometrisch war die Bindung von rhIGFBP2 an die extrazelluläre Osteoblasten-Matrix
in Gegenwart von IGFI 2-fach gesteigert, wohingegen die rhIGFBP2-Bindung
in Gegenwart von IGFII über 3-fach
gesteigert war. Das strukturell mit den IGFs verwandte aber die
IGFBPs nicht bindende Insulin, erhöhte die rhIGFBP2-Bindung an
die extrazelluläre
Osteoblasten-Matrix
nicht. In Abwesenheit von exogenem rhIGFBP2 war wenig oder kein
endogenes IGFBP in der extrazellulären Osteoblasten-Matrix vorhanden.
Diese Befunde wurden in einer anderen Reihe von Experimenten bestätigt, welche
spezifische
125IrhIGFBP2-Bindung an die
durch menschliche Osteoblasten hergestellte extrazelluläre Matrix
maßen.
Wie in Tabelle 3 gezeigt, steigerte unmarkiertes IGFI die spezifische
125IrhIGFBP2-Bindung an die extrazelluläre Osteoblasten-Matrix
um etwa das 2-fache, wohingegen dieselbe Konzentration von IGFII
die
125I-rhIGFBP2-Bindung um über das
4-fache steigerte. Das umgekehrte Experiment ergab ähnliche
Befunde, d. h.
125I-IGFII allein band extrazelluläre Matrixkomponenten
nicht (0,05 ± 0,05
%), wohingegen in Gegenwart von unmarkiertem rhIGFBP2 die spezifische
125I-IGFII-Bindung 2,86 ± 0,10 % betrug (P < 0,001). Tabelle
3
-
Beispiel 5 – Studien
zur Bewertung von IGFBP2-Wirkungen auf IGFII-Stimulation der Osteoblastenproliferation:
-
Die
obigen Studien zeigten, dass IGFBP2 den Transport von IGFII und/oder
IGFIIE zur Knochenmatrix in HCAO-Patienten ermöglichen konnte. Um zu testen,
ob der IGFII/IGFBP2-Komplex eine Proliferation menschlicher Osteoblasten
stimulieren könnte,
und um die potenzielle Rolle extrazellulärer Matrix in der Modulation
dieser Wirkung zu bewerten, wurde die IGFII- mit der IGFII + IGFBP2-Stimulation
der Proliferation menschlicher Osteoblasten entweder 1 Tag nach
dem Ausplattieren oder 10 Tage nach dem Ausplattieren verglichen.
Es wurde gezeigt, dass diese Zellen in vitro fortlaufend extrazelluläre Matrix
herstellen und bei kontinuierlicher Kultur unter geeigneten Bedingungen
tatsächlich
mineralisierte Knötchen
bilden. Folglich stellen die 1 Tages-Kulturen eine an extrazellulärer Matrix
relativ arme Umgebung dar, wohingegen die 10 Tage-Kulturen eine
an extrazellulärer
Matrix relativ reiche Umgebung darstellen. Unter beiden Bedingungen
stimulierte IGFII markant die Osteoblastenproliferation: der prozentuale
[3H]Thymidin-Einbau steigerte sich nach
Stimulation mit IGFII von 0,12 ± 0,003 % auf 0,74 ± 0,086
% in den 1 Tages-Kulturen (P < 0,005)
und von 0,98 ± 0,08
% auf 2,06 ± 0,12
%(P < 0,005) in
den 10 Tage-Kulturen. Wie in 4 gezeigt
war jedoch, während
IGFBP2 markant die IGFII-Stimulation
der Osteoblastenproliferation in den 1 Tages-Kulturen hemmte (um ~80 %) der IGFII/IGFBP2-Komplex
ebenso wirksam wie IGFII in der Stimulation der Osteoblastenproliferation
in den 10 Tage-Kulturen. IGFBP2 allein hatte unter beiden Bedingung
keine Wirkung auf die Osteoblastenproliferation.
-
Beispiel 6 – spezifische
Bindung von IGFBP2 an von Knochenzellen stammende extrazelluläre Matrix
und Heparin-Sepharose:
-
125I-IGFBP2 wurde ohne (B0)
und mit IGF (IGFI, IGFII, IGFIIE oder IGFIs2) über Nacht bei 4°C mit von menschlichen
Osteoblasten (hOB) und Rattenosteosarkomzellen (UMR, ROS) hergestellter
ECM und mit Heparin-Sepharose-(Hep-Seph) und Sepharose-(Seph) Kügelchen
inkubiert. IGFIs2 ist ein ein Heparin-Bindungsmotiv enthaltendes IGFI. Die
unspezifische Bindung wurde (in Gegenwart eines Überschusses an unmarkiertem
IGFBP2) von der Gesamtbindung abgezogen, um die in Tabelle 4 gezeigte
prozentuale spezifische 125I-IGFBP2-Bindung
zu erhalten. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt.
-
Wie
in Tabelle 4 gezeigt, erhöhten
die IGFs die IGFBP2-Bindung
an ECM. IGFIIE verschaffte den größten Anstieg in der IGFBP2-Bindung
an die ECM und Heparin-Sapherose, gefolgt von IGFII, IGFIs2 und IGFI.
Die IGFs steigerten die Bindung an von menschlichen sowie Ratten-Osteoblastenzellen
stammender ECM. Die Bindung schien für Heparin-Sepharose spezifisch
zu sein, was nahe legt, dass in vivo die Bindung an Heparinsulfatreste
innerhalb von Glykosaminoglykanen der extrazellulären Matrix
erfolgt. Tabelle
4
-
Die
spezifische Bindung von IGFBP2 (menschliches gegenüber dem
von Rind) an die von menschlichen Osteoblasten stammende extrazelluläre Matrix
(ECM) wurde wie folgt untersucht. Menschliche- oder Rinder-Formen
von IGFBP2 (500 ng/ml) ohne (Kontrolle) und mit 400 ng/ml IGFI,
IGFII oder Insulin (Ins) wurden über
Nacht bei 4°C
mit von menschlichen Osteoblasten in Kultur stammender ECM inkubiert.
Die ECM wurde gewaschen, und Proteine wurden extrahiert und auf
den IGFBP Gehalt hin durch Western-Ligand-Blotting mit 125I-IGFII
analysiert. Die Bindung von menschlichem und Rinder-IGFBP2 an die
ECM wurde durch IGFII erhöht. Ähnliche
Experimente wurden mit der Ausnahme durchgeführt, dass IGFBP-1, -2 und -6
(500 ng/ml) mit Heparin-Sepharose ohne (Kontrolle) und mit 400 ng/ml
IGFII, IGFIs2, IGFI inkubiert wurden. Von den sechs getesteten IGFBPs
erhöhte
IGFII spezifisch die IGFBP2-Bindung an die Matrix. Ähnliche
Ergebnisse wurden mit dem IGFI-analogen IGFIs2 gewonnen.
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Beispiel 7 – Wirkung
von IGFBP2 auf die IGFII Stimulation der Proliferation unterschiedlicher
Zellarten in Kultur:
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IGF-responsive
menschliche Zellarten [normale Osteoblasten (hOB), normale Hautfibroblasten
(HF), Brustkrebszellen (MCF-7),
Eierstockkrebszellen (OV266)] wurden mit 10 nM IGFII, 10 nM IGFBP2
oder der Kombination stimuliert. Der 3H-Thymidin-Einbau wurde als
ein Index der proliferativen Antwort gemessen.
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Die
in Tabelle 5 gezeigten Ergebnisse werden als der Mittelwert ± S.E.M.
dreier Bestimmungen berichtet. Äquimolar
IGFBP2 hatte keine Wirkung auf den IGFII-stimulierten
3H-Thymidin-Einbau in normalen
Osteoblasten und Fibroblasten, hemmte aber die IGFII Stimulation
in menschlichen Brust- und Eierstockkrebszellen um –90 %. Der
IGFII/IGFBP2 Komplex ist möglicherweise
nur in bestimmten extrazellulären
Umgebungen, wie dem Knochen, biologisch aktiv. Tabelle
5
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Beispiel 8 – Wirkung
von IGFBP2 auf die IGFII-Stimulation von Proteinsynthese in normalen
menschlichen Osteoblasten:
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Normale
menschliche Osteoblasten wurden wie in Beispiel 7 behandelt, außer dass 3H-Prolin- und 3H-Leucin-Einbau
als Maß der
Kollagen- bzw. Gesamtprotein-Synthese verwendet wurden. Wie in Tabelle
6 gezeigt, hatte äquimolar
IGFBP2 keine Wirkung auf die IGFII-Stimulation der differenzierten
Osteoblastenfunktion, d. h, die Matrixproteinsynthese.
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Beispiel 9 – Abzielen
von systemisch verabreichtem IGFBP2/IGFIIE auf Knochen in vivo:
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Weiblichen
Sprague-Dawley Ratten (200 g) wurden etwa 2,5 × 106 cpm 125I-IGFBP2 ± unmarkiertes IGFIIE (4 in
jeder Gruppe) über
die Vena iliaca verabreicht. Zwei Stunden später wurden die Tiere getötet und ihre
Oberschenkelknochen und ihr Schienbein entfernt, gereinigt, gewogen
und gezählt.
Gesamtcpm pro Gramm Knochen in den Tieren, welche 125I-IGFBP2
+ IGFIIE empfingen, war 5770 ± 1609
gegenüber
3766 ± 1259
für 125I-IGFBP2 allein (P < 0,05, gepaarter t-Test). Folglich
zeigen diese Ergebnisse das bevorzugte Abzielen von IGFBP2/IGFIIE
auf Knochen in vivo, übereinstimmend
mit den in vitro-Ergebnissen.
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Weitere Ausgestaltungen
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Während die
Erfindung in Verbindung mit deren detaillierter Beschreibung beschrieben
worden ist, ist die vorhergehende Beschreibung selbstverständlich zum
Darstellen und nicht Ein schränken
des Umfangs der Erfindung vorgesehen, welcher durch den Umfang der
angehängten
Ansprüche
definiert wird. SEQUENZPROTOKOLL