DE69821025T2

DE69821025T2 - Wachstumsfördernde peptide für nierenepithelzellen

Info

Publication number: DE69821025T2
Application number: DE69821025T
Authority: DE
Inventors: F. Gary Toback; M. Margaret WALSH-REITZ
Original assignee: Arch Development Corp
Current assignee: Arch Development Corp
Priority date: 1997-11-20
Filing date: 1998-05-22
Publication date: 2004-09-02
Anticipated expiration: 2018-05-23
Also published as: JP3820102B2; JP2001524303A; US20030176340A1; AU7693598A; JP4686379B2; EP1034187B1; JP2006176536A; ATE257486T1; AU745894B2; AU745894C; CA2310677C; US6534290B1; DE69821025D1; EP1034187A1; CA2310677A1; JP2010150277A; US6096706A; JP2007077158A

Description

Neuartige Wachstumspeptide abgeleitet von Proteinfaktoren, die Molekulargewichte von um 22 und 45 kDa haben, regen mitogenische Aktivität von epithelialen, aber nicht fibroblastischen Zellen, insbesondere Nierenepithelzellen in der Kultur an. Diese wachstumsfördernde Effekte wurden, auch in vivo demonstriert.
Akutes Nierenversagen ist eine ernste Krankheit, die mit hoher Sterblichkeit verbunden ist, für die keine „reale" Behandlung z. Z. besteht. Akutes Nierenversagen wird als die plötzliche Unterbrechung der vorher normalen Nierenfunktion definiert. Es wird durch eine Vielzahl von Mechanismen verursacht, einschließlich Kreislaufausfalls (Schock), Gefäßblockade, Glomerulonephritis, und Blockade des Urinflußes. Zusätzlich kann es nach Operation, Trauma, Sepsis, oder durch bestimmte Medikationen, besonders Antibiotika und krebsbekämpfende Medium auftreten.
In 1985 ca. 140.000 Amerikaner wurden mit akutem Nierenversagen hospitalisiert (siehe 1990 National Institutes of Health Long Range Plan). Die durchschnittlichen Behandlungskosten verbunden mit diesen Fällen waren über $9000. Basierend auf dem Anstieg der Krankheit über die letzten Jahre und der normalen Inflation, wurde geschätzt, dass z. Z. ca. 240.000 Patienten akutes Nierenversagen mit jährlichen Kosten von über $10.000 pro Patienten entwickeln. Dies führt zu Gesamtkosten für das U.S. Gesundheits-System von fast $2.5 Milliarden pro Jahr.
TABELLE 1. DURCHSCHNITTSKOSTEN PRO KRANKENHAUS-AUFENTHALT FÜR NIEREN UND UROLOGISCHE KRANKHEITEN, VEREINIGTE STAATEN, 1985¹
QUELLEN: Nationales Zentrum für Gesundheit Statistiken: Nationale Krankenhaus-Aufenthalts Übersicht, 1985 (alle aufgeführten Diagnosen). Abteilung der Veteran-Angelegenheiten, für das Jahr endend September 30, 1986 (erstregistrierte Diagnosen) (unveröffentlicht). Gesundheitspflege-Finanzierung Leitung, Medicare Versorgeranalysen und Berichtdaten, 1985 (unveröffentlicht).
Wie in Tabelle 1 von dem „National Institutes of Health Long Range Plan" gesehen werden kann trägt, Nierenkrankheit zu den medizinischen Hauptkosten in den Vereinigten Staaten bei, weshalb Faktoren, die die Zeit der Heilung verringern, für die Gesellschaft vorteilhaft sind.
Ebenso bedeutsam, ist die Tatsache, dass die Zahl der Fälle von akutem Nierenversagen mit einer Rate von 9% pro Jahr wächst (National Institutes of Health, 1995) und es wird erwartet dass, diese hohe Zuwachsrate anhält. Ein Grund, der für diesen Aufstieg in der Ausdehnung des Nierenausfalls angegeben wird, ist, dass „kränkere" Patienten mit einer hohen Gefahr des Nierenausfalls länger überleben.

1. Ältere Patienten, die ein erheblich häufigeres Auftreten von akutem Nierenversagen haben (z. B., bei Patienten über 65 ist, akutes Nierenversagen 5-mal wahrscheinlicher im Alter von 45 bis 64) überleben, jetzt ernste medizinische Ereignisse (z. B., Herz-Attacken, Schlaganfall) sowie schwierige Operationen. Verbesserte Intensivstationen in Krankenhäusern mit den hoch entwickelten Überwachungs- und Lebenserhaltungssystemen helfen auch, wenn sie "kränkere" Patienten lebendig halten. Darüber hinaus sind verbesserte therapeutische Medium für das Behandeln von Krebs und lebensbedrohenden Infektionen häufig nephrotoxisch.
2. Neugeborene, die eine extrem hohe Gefahr des Nierenausfalls haben, überleben auch an nach Frühgeburten den kürzeren Trägerzeite und bei erheblich niedrigeren Geburts-Gewichten. Solche Kinder hatten früher Schwierigkeiten, schwere Lungen- und Herzprobleme zu überwinden aber diese Probleme können mit verbesserten Arzneimitteln und Techniken jetzt erfolgreich behandelt werden, insbesondere in spezialisierten Intensivpflegeeinrichtungen für Neugeborene.

Weil erwartet wird, dass sich diese Fortschritte in den Behandlungsmodalitäten, fortsetzen und sogar beschleunigen, ist es wahrscheinlich, dass sich die Zahl die Fälle von akutem Nierenversagens erhöhen, möglicherweise sogar mit einer schnelleren Rate.
Gegenwärtig besteht keine reale „Heilung" für akutes Nierenversagen. Die gegenwärtige Behandlungsmethode soll die Niere „stillstllen", in dem sie Dialyse durchführt, um metabolische Ungleichheiten zu beheben und zu warten, dass die Nierenfunktion spontan zurückkehrt.
Dialyse ist eine Technik, in der Verunreinigungen und Giftstoffe vom Blut, die normalerweise durch die Nieren gereinigt, werden, künstlich durch einen Extra-Korporalen Kreislauf und einen Filter (Hämodialyse) oder durch die peritoneale Membran entfernt werden. Durch das Entfernen solcher Verunreinigungen, können die metabolischen lebensbedrohenden Ungleichheiten resultierend aus dem Nierenausfall behoben werden und der Patient kann stabilisiert werden.
Die Sterblichkeitsrate, die aus sich entwickelnden akuten Nierenversagen eines Patienten resultiert, ist extrem hoch. Eine neue Studie (Levy et al., 1996), die den Effekt des akuten Nierenversagens auf Patienten Sterblichkeit analysierte, berichtet über solche Raten, die von 42% bis 88% reichen, basierend auf 18 vorher erschienenen Berichten. Diese Raten sind im Wesentlichen unverändert seit den frühen 50 Jahren geblieben. In der Studie von 1996 selbst war die Sterblichkeit für hospitalisierte Patienten, die akutes Nierenversagen entwickelten, 5-mal höher verglichen mit ähnlichen Patienten ohne Nierenausfall (34% gegen 7%).
Ein wesentliches Ergebnis dieser Studie ist, dass „akutes Nierenversagen scheint, die Gefahr des Entwickelns der schweren Nichtnierenkomplikationen zu erhöhen, die zum Tod führen, und sollte nicht als behandelbare Komplikation der ernsten Krankheit betrachtet werden." Folglich scheint es, dass die schnelle Umkehr des akuten Nierenversagens die Gefahr von Sterblichkeit bei Patienten erheblich verringern kann, die häufig schwierige Behandlungen haben, indem die Entwicklung der schweren und häufig tödlichen Nichtnierenkomplikationen verhindert wird.
Es ist lange bekannt, dass die Niere eins der wenigen menschlichen Organe ist, die die Fähigkeit haben, sich nach Verletzung zu reparieren. Sogar in den Fällen wo die Niere irreversibel beschädigt worden ist, und es umfangreiche Nekrose der Nierezellen gibt, gibt es Hinweise, dass neues Zell-Wachstum auftritt.
Es ist vorgeschlagen worden, dass Wachstumsfaktoren ein therapeutischer Ansatz sind, um den regenerativen Prozess in der verletzten Niere anzuregen oder zu vergrößern und dadurch die Schwere zu verringern und die Dauer des akuten Nierenversagens zu verkürzen. Die Verwendung von Wachstumsfaktoren als Behandlung für akutes Nierenversagen wurde zuerst von Toback (1984) vorgeschlagen. Jedoch stellte sich ein geeigneter Wachstumsfaktoren als schwierig heraus. Das Grundprinzip für diese Strategie wurde ausgedehnt nachdem mehrere spezifische Wachstumsfaktor-Proteine identifiziert worden waren (Mordan and Toback, 1984; Toback 1992; Mendley und Toback, 1989; Toback 1992 a und b). Jedoch sind noch keine Faktoren als nützlich zur Behandlung von Menschen bestätigt worden.
Die Wachstumsfaktoren, die in vivo fungieren, um die Proliferation und Migration von, nicht beschädigten röhrenförmigen Zellen in der Niere anzuregen, und die möglicherweise die Regeneration der sublethal-verletzten Zellen, zu beschleunigen, wäre förderlich. Ein spezifischer Wachstumsfaktor könnte in Verbindung mit genügenden Nährstoffen, Kalorien, und dialytischer Therapie verwendet werden, um die Überlebensrate der Patienten mit Nierenproblemen zu erhöhen. Zum Beispiel könnte die Verabreichung der Wachstumsfaktoren (1) die positiven Resultate bei Patienten mit Nierentransplanten, in einer Situation, in der akutes Nierenversagen mit erhöhter Abstoßung verbunden, ist erhöhen, (2) die Dauer des akuten Nierenversagens, die das Überleben erhöhen würde verkürzen, und (3) die Zahl der Tage, die für Hämodialyse-Behandlung während des Nierenausfallsyndroms erforderlich sind, verringern.
Autokrine Wachstumsfaktoren werden lokal durch die gleichen Zellen produziert, auf denen sie fungieren. Sie scheinen, in Antwort auf ein Stimulierungsereignis wie Zell-Verletzung produziert zu werden. Außerdem werden sie in extrem kleinen Mengen produziert und können auf nachweisbarem Level nur während einer kurzen Zeit bestehen. Folglich waren sie ziemlich schwierig zu isolieren und zu identifizieren.
Zwei andere Arten von Wachstumsfaktoren – Parakrine und Endokrine – scheinen beide, irgendeine Rolle bei der Stimulierung des Nierenzell-Wachstums zu haben. Parakrine Faktoren wirken auf angrenzende Zellen während Endokrine Faktoren in einer Zelle produziert werden und transportiert werden (z. B., durch den Blutstrom) zu einer anderen entfernten Zelle. Mehrere dieser Arten von Faktoren, welche gewöhnlich in größeren Mengen produziert werden, und eine längere „Halbwertszeit" als einige autokrine Faktoren haben, sind entdeckt worden, und ihre cDNAs sind identifiziert worden.
Tier- und klinische Studien
Mehrere Wachstumsfaktoren sind in einem Rattenmodell des akuten Nierenversagens untersucht worden, um ihre Wirksamkeit für eine beschleunigte Wiederherstellung festzustellen. Die Resultate dieser Studien unterstützen die Theorie, dass Wachstumsfaktoren eine Hauptrolle bei der beschleunigten Nierenreparatur spielen können. Drei der wichtigsten von diesen sind:

1. Epidermaler Wachstums-Faktor (EGF). Es ist berichtet worden, dass der EGF Faktor Wiederherstellung in Ratten mit akutem Nierenversagen beschleunigt (Coimbra et al., 1990). Jedoch wurde festgestellt, dass EGF auch Kalzium vom Knochen mobilisiert, welches eine ernste Nebenwirkung ist, die wahrscheinlich seinen Gebrauch in den Menschen verhindert.
2. Insulin-ähnlicher Wachstums Factor-1 (IGF-1). Mehrere Studien im Rattenmodell bestätigen, dass dieser Faktor in der Tat wirkungsvoll ist. Jedoch in zwei klinischen Studien in Menschen schien IGF-1 keinen erheblichen beschleunigenden Effekt, bei der Wiederherstellung eines Patienten nach akuten Nierenversagen zu haben.
3. Osteogenische Protein-1 (OP-1) ist ein Knochen-Wachstumsfaktor, der bereits für menschlichen Gebrauch zur Reparatur von Knochen, Knorpel, und Augengewebe, genehmigt wurde. Obgleich OP-1 eine Schlüsselrolle in der embryonalen Entwicklung der menschlichen Nieren spielen kann, ist es nicht klar, wie die Reparatur erwachsener-Nierenzellen funktioniert. Es ist möglich, dass OP-1 und andere autokrine Nierenwachstumsfaktoren sich komplementieren.

Autokrine Nieren-Wachstumsfaktoren
Obgleich die Untersuchungs-Ergebnisse an Tieren bei den vorher genannten Wachstumsfaktoren ermutigend sind, wird keiner dieser Faktoren klinisch zur zeit verwendet. Bemerkenswert ist, dass ist die Nieren mRNA der drei Wachstumsfaktoren – EGF, IGF-1 und OP-1 – tatsächlich in den Nieren während des akuten Nierenversagens abnimmt. Wenn ein Wachstumsfaktor bei der Reparatur von Verletzungen und der Umkehr akuten Nierenversagens wirkungsvoll sein soll, würde man erwarten, dass sein Spiegel sich während dieses klinischen Falls erhöht.
Einige der zitierten Faktoren, werden durch Nierenepithelzellen freigegeben und sind zum Anregen des Wachstums der Zellen in einer autokrinen Weise fähig. Zum Beispiel, Zellen der Affenniere (BSC-1) reagieren auf Kulturmedium mit einer verringerten Konzentration des Kaliums, in dem sie den „niedrigen Kalium-Wachstumsfaktor" freigeben, und reagieren auf eine verringerte Konzentration des Natriums, in dem sie den „niedrigen Natrium-Wachstumsfaktor" freigeben (Mordan und Toback, 1984; Walsh-Reitz et al., 1986; Toback et al., 1992b und 1995).
Es besteht daher ein Bedarf für neue therapeutische Ansätze, um akutes Nierenversagen zu „heilen" oder zumindest die Wiederherstellung zu beschleunigen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung schließt die Familie der Proteine und der Peptide mit ein, einschließlich Aminosäure-Sequenzen der neuartigen mitogenischen Proteine des Wundwachstumsfaktor (WGF), und seine NH₂-terminalen Peptide, die auch Wachstum der Nierenepithelzellen anregen. „Bioaktiver WGF" wird hierin als Faktor definiert, der mitogenische Aktivität in kultivierten Nierenzellen anregt und dies ist im Allgemeinen, die Bedeutung „WGF". „WGF" schließt Peptide verschiedener Längen mit ein, abgeleitet vom Ursprungs-Molekül, solange wie sie mitogenische Aktivität haben. Geeignete „WGF-abgeleitete Peptide" sind die, in denen Aminosäueresubstitutionen, Hinzufügungen oder Auslassungen auftreten, wobei aber die Peptide die mitogenische Aktivität anregen, und ihre Aktivität durch das Pentapeptid YPQGN blockiert wird, oder irgendein anderes Peptid, das die Aktivität blockiert. Es wird angenommen, dass mindestens das Pentapeptid YPQGN den Zugang zu einem zellulären WGF Rezeptor blockiert. Ein bevorzugtes Hexamer (6-mer) Sequenz, NH₂-Tyrosin/Cystein-Prolin-Glutamin-Glycin-Asparagin-Histidin-COOH (Y/CPQGNH) ist im Allgemeinen in den Peptiden eingeschlossen. (Ein Schrägstrich zwischen Aminosäuren in einer Position zeigt an, dass eins präsent ist.)
Die Erfindung bezieht sich auf biologische wachtumsfördernde Proteine und Peptide, die von einer Aminosäureresequenz abgeleitet werden, die zuerst als „Wundwachstums-Faktor" (WGF) bezeichnet wurde wegen der An und Weise der Herstellung des grundlegenden „Faktors" in der Kultur. Weitere anfängliche Analysen deckten zuerst Faktoren von zwei Molekulargewichten auf,
Eine Ausführungsform eines neuartigen erfindungsgemäßen Peptids abgeleitet von WGF ist ein starkes Mitogen für Affennieren-Epithelzellen in Kultur. Das Peptid schließt die Sequenz der 14-Aminosäuren, AQPYPQGNHEASYG ein. Dieses Peptid mit 14-Aminosäuren (14-mer) wird „14-Ser genannt", um anzuzeigen, dass es einen Serin-Rest in Position 12 hat. Verglichen mit anderen bekannten Nierenwachstumsfaktor Mitogenen, hat dieses Peptid, welches die Sequenz YPQGNH oder CPQGNH enthält, oder natives Voll-Längen WGF, einen mitogenischen Effekt, der entweder Additiv ist, Äquivalent, oder stärker als andere bekannte Faktoren: z. B., epidermialer Wachstumsfaktor, säurehaltiger Fibroblastischer-Wachstumsfaktor, grundlegender Fibroblastischer-Wachstumsfaktor, Insulin-like Wachstumsfaktor-I, Vasopressin, oder Kalbserum.
Der natürlich vorkommende Faktor (WGF) wird in das Kulturmedium freigegeben, wenn ein Nierenzellen Monolayer mit einer Pipettenspitze mechanisch verwundet wird. Dieses war ein neuartiger Befund. Das heißt, der Wachstumsfaktor wird von den verletzten Nierenepithelzellen freigegeben und kann eine Vermehrung der Zellen der gleichen Art anregen. Daher ist es ein Autokriner Wachstumsfaktor. Eine Quelle der Zellen, die den Faktor freigibt, ist die BSC-1 Zell-Linie (nicht transformierte Nierenepithelzellen der afrikanischen Grünen Affen) (ATCC CCL 26/BSC-I). Diese Peptide können auch durch bekannte Techniken synthetisiert werden, einschließlich Peptidsynthese und rekombinanter Gentechnologie.
Das Auftreten der wachtumsfördernden Aktivität, nach Verwundung wird wahrscheinlich durch die proteolytische Aktivierung eines inaktivierten Vorläufers von WGF vermittelt. Beweis hier für ist, dass Vorinkubation der Zellen für 10 Minuten mit jedem der folgenden verschiedenen Protease-Inhibitoren das Auftreten der wachtumsfördernden Fähigkeit nach Verwundung verhinderte: Aprotinin, Phenylmethylsulfonylfluorid (Sigma) (PMSF), Antipain, L-1-Chloro-3-(4-tosylamido)-7-Amino-2-Heptanon-Hydrochlorid (TLCK) oder α₂-Macroglobulin. Keines dieser Medien inhibitierte Zellwachstum, wenn es Zellen von nicht-verletzten Kulturen hinzugefügt wurde. Wenn es dem Medium nach dem Auftreten der mitogenischen Aktivität von WGF hinzugefügt wurden, schienen weder PMSF noch Aprotinin, den Sprung in der Zelle zur starken Vermehrung zu inhibieren. HPLC-gereinigtes WGF scheint nicht, eine Protease zu sein, weil es keine proteolytische Aktivität zeigt, wenn es mit Protase Substrat-Geltabletten (BioRad) getestet wird.
Wie hier beschrieben hat WGF eine wachtumsfördernde Aktivität, nachdem es in das Kulturmedium der verletzen Nieren-Epithelzellen wie BSC-1 Zellen freigegeben wird. Isolierung und Reinigung der Bestandteile, die für diese wachtumsfördernde Aktivität verantwortlich sind, zeigten, dass die Bestandteile auf Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid Elektrophorese eine relative molekulare Masse (M_r) von 22 und/oder 45 Kilodaltons (kDa) hatten. Weitere Analysen zeigten, dass WGF ein Protein ist, das ein Mitogen für Affennierenzellen BSC-1 ist, aber nicht für Fibroblasten 3T3. Die Freigabe von WGF scheint auch, verhältnismäßig Nieren-Epithelzellen Typ spezifisch zu sein, weil es bei verwundenden BSC-1 Zellen in der Kultur erscheint, aber nicht nachdem Fibroblasten in der Kultur verwundet worden sind.
Folglich betrifft ein Aspekt der Erfindung ein Protein, das als „WGF" bezeichnet wird mit den folgenden Eigenschaften:

a) ein geschätztes Molekulargewicht von ungefähr 45 und/oder 22 kDa, besagte Schätzung erhalten durch die Elektrophorese des HPLC-gereinigten Proteins auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel;
b) die Fähigkeit der Stimulierung der mitogenischen Aktivität beim Kontakt mit kultivierten Zellen; und
c) die Freigabe durch BSC-1 Zellen in der Kultur durch das Kratzenverwunden.

Insbesondere das 45 kDa Protein, das aus seinem Naturzustand isoliert wird, hat die folgende teilweise Aminosäureresequenz an seinem Aminoterminalende: NH₂-Alanin-Glutamin-Prolin-Tyrosin/Cystein-Prolin-Glutamin-Glycin-Asparagin-Histidin-Glutamin-Säure-X-Alanin/Serin-Tyrosin-Glycin-COOH (X = undefinierte Aminosäure).
Ein anderes WGF Protein hat ein geschätztes Molekulargewicht von ungefähr 22 kDa, wobei besagtes geschätztes Molekulargewicht durch Elektrophorese des HPLC-gereinigten Proteins auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel erhalten wurde und hat die folgende Aminosäureresequenz an seinem Aminoterminalende, wie folgt: NH₂-Alanin-Glutamin-Prolin-Tyrosin/Cystein-Prolin-Glutamin-Glycin-Asparagin-Histidin-Glutamin-Säure-Alanin-Threonin-Serin-Serin-Serin-Phenylalanin-COOH.
Ein Protokoll, das verwendbar ist, WGF von konditioniertem Zellkulturmedium zu reinigen, verwendet Ultrafiltration, Heparin-Affinität Chromatographie und gegenphasische (RP) Hochleistungs Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC). Obgleich die Menge des WGF Proteins extrem niedrig ist, werden etwa 50 ng Protein pro Liter des konditionierten Mittels bei 6400-facher Aufreinigung erhalten.
Die Größe von bioaktivem WGF wurde definiert in dem HPLC-gereinigtes WGF auf SDS Gelen parallel zu Standardproteinen (d. h., Proteine von bekannten Größen) der Elektrophorese unterzogen wurde, Schneiden des Gels in 2-mm breite Fragmente des Gels, Eluieren jedes Fragments im Puffer, und untersuchen des Eluats auf mitogenische Aktivität mit Kulturen der BSC-1 Zellen. Diese experimentelle Strategie zeigte, dass WGF Proteine einen geschätzten M_r von 22 und 45 kDa haben und mitogenisch sind.
Ein einzelner scharfer Peak des absorbierten Materials bei 214 nm erhalten durch RP-HPLC wachtumsfördernde Aktivität auf Nieren-Epithel, aber nicht auf fibroblastische Zellen, und erbrachte mehrer Bänden auf SDS-Polyacrylamid-Gel Elektrophorese nach Silberfärbung.
Strukturelle Aminosäure Analyse des Materials, das den scharfen Peak bildete, bestätigte den Proteincharakter von WGF. Microsequenzierung deckte die ersten 16 Aminosäuren des NH₂-Amino-terminus der 22 kDa Isoform auf: NH₂-Alanin-Glutamin-Prolin-Tyrosin/Cystein-Prolin-Glutamin-Glycin-Asparagin-Histidin-Glutamin-Säure-Alanin-Threonin-Serin-Serin-Serin-Phenylalanin-COOH. Für die 45 kDa Isoform sind die 14 Aminosäuren am Aminoterminalende identifiziert worden: NH₂-Alanin-Glutamin-Prolin-Tyrosin/Cystein-Prolin-Glutamin-Glycin-Asparagin-Histidin-Glutamin-Säure-X-Alanin/Serin-Tyrosin-Glycin-COOH. Die Identität der Aminosäure in Position 11 ist unsicher (X), und es ist nicht möglich, festzustellen, ob ein Tyrosin (Y) oder ein Cystein (C) in Position 4 ist, oder ein Alanin (A) oder Serin (S) in Position 12 ist. Eine Suche in den sieben Peptidsequenz-Datenbanken im experimentellen GENINFO(R) BLAST Vermittlungsdienst (Blaster) des Nationalen Zentrums für Biotechnologie-Information (NCBI) zeigte, dass die Aminoterminalen-Sequenzen von neuen Proteinen sind.
Vom erheblichen Wert war die zusätzliche Entdeckung, dass Peptide kleiner als die Sequenz der 16 Aminosäuren auch starke mitogenische spezifische Aktivität hatten. Diese Entdeckung war ziemlich bedeutend, weil diese kleinen Peptide: (1) viel weniger wahrscheinlich antigenisch sind (d. h., sie können in ein anderes Tier oder Menschen direkt injektziert werden, ohne durch das Immun-System zurückgewiesen zu werden) und (2), sie können in großen Mengen leicht hergestellt werden und mit einem Peptidsynthesizer modifiziert werden, ohne erst einen cDNA Klon finden zu müssen, der das gesamte 22 oder 45 Kilodalton Protein kodiert, und dann das rekombinante Protein zu exprimieren.
Zusätzlich zum Produzieren des Faktors durch verwundende kultivierte Zellen wurden, synthetische Peptide produziert, die mitogenische Aktivität haben. Vom besonderen Interesse ist ein synthetisches Peptid, dessen Sequenz auf den ersten elf Aminosäureresten des 22 kDa Proteins basiert und das mitogenische Aktivität zeigt. Andere Polypeptide, die kurze Peptiddomänen des Faktors sind, sind auch innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung. Ein Hexamer war das kleinste Peptid, das noch mitogenische Aktivität beibehielt (YPQGNH oder CPQGNH).
Ein Peptid, das eine Aminosäureresequenz von NH₂-Tyrosin/Cystein-Prolin-Glutamin-Glycin-Asparagin-Histidin-COOH enthält, ist für die Durchführung der Erfindung verwendbar. Im Allgemeinen hat das Peptid eine Länge von 7 bis 16 Aminosäuren, aber andere Längen sind auch verwendbar, wenn die mitogenische und/oder antigenische Funktion konserviert wird.
Der „Transforming"-Wachstums-Faktor-beta 2, und ein synthetisches 5-Aminosäuren Peptid, welches die Sequenz YPQGN hat, blockieren den mitogenischen Effekt von AQPYPQGNHEASYG. Die Glycosaminoglycane, Heparin- und Keratinsulfat, potenzieren beide den mitogenische Effekt des Peptids.
Ein Peptid, welches die Sequenz AQPYPQGNHEASYG (14-Ser) hat und andere in Verbindung stehende Peptide abgeleitet vom NH₂-terminus von Wundwachstums-Faktor Isoformen, wurden ausgewertet, bezüglich ihrer Kapazität den Verlauf des akuten Nierenversagens (ARF) in nephrotoxischen und ischämischen Rattenmodellen zu ändern; dieses Syndrom betrifft im allgemeinen Menschen.
Quecksilber-Chlorid subkutan gegeben (s. c.) wurde verwendet, um ARF in den Ratten zu induzieren, und eine Lösung jedes Peptids wurde getestet bezüglich seiner Kapazität das Überleben und die Wiederherstellung der Nierenfunktion zu erhöhen. Gemessen wurde die Serumkreatininkonzentration während der folgenden 7 Tage.
Verabreichung eines Peptids (100 μg) mit der Sequenz AQPYPQGNHEASYG, s. c., 1 Stunde nach Verabreichung des Quecksilber-Chlorids, verbesserte erheblich die Wiederherstellung der Nierenfunktion nach zwei Tagen und verbesserte das Überleben nach drei Tagen. Ein Vorteilhafter Effekt des Peptids auf das Überleben und die Wiederherstellung der Nierenfunktion wurde auch beobachtet, wenn es 16.5 Stunden nach oder 24 Stunden vor Induktion des nephrotoxischen ARF Syndroms verabreicht wurde.
Das Ischämisches ARF, induziert in Ratten durch 45 Minuten bilaterale Nierenstiel-Klemmen, verbesserte das Verabreichen des AQPYPQGNHEASYG Peptids (100 μg) 1 Stunde nachdem die Klemmen entfernt waren, das Überleben und erhöhte die Wiederherstellung der Nierenfunktion.
Beweis, dass das Peptid das Überleben und die Wiederherstellung der Nierenfunktion verbesserte, indem die DNA Synthese in den Zellen nahe der Stelle der Quecksilber-Chloridverursachten Nierenverletzung anregt, wurde erhalten, indem man Bromdeoxyuridin verwendete, um die DNA in den regenerierten Nieren zu markieren. Das Peptid war stärker als der epidermiale-Wachstumsfaktor, ein Mittel bekannter Wirksamkeit in diesem Modell-System, für das Fördern des Überleben, wenn es 24 Stunden vor der Nierenverletzung gegeben wird, und äquivalent, wenn es kurz danach gegeben wird. Verbessertes Überleben und eine schnellere Wiederherstellung der Nierenfunktion als Antwort auf die Behandlung mit dem Peptid wird bei Menschen mit nephrotoxischem sowie ischämischem ARF erwartet.
Verwendbare Peptide für die Durchführung der Erfindung schließen ein:
Die Peptide YPQGNH oder CPQGNH (Y/CPQGNH) sind jeweils ein mitogenisches Fragment des Proteins.
Varianten (Isoformen) der verschiedenen WGF-abgeleiteten NH₂-terminalen Peptide oder des Volllängen des WGF Proteins können sich in ihrer Aminosäureresequenz oder in anderer Weise sich unterscheiden, die nicht Sequenz-Änderungen wie Post-translationalle Änderungen (z. B., Glycosylierung), oder beides betrifft. Varianten in der Aminosäureresequenz werden erzeugt, wenn eine oder mehrere Aminosäuren der NH₂-terminalen Peptide oder des WGF Proteins mit einer anderen natürlich vorkommenden Aminosäure, einem Aminosäurederivat, oder einer nicht nativen Aminosäure ersetzt werden. Besonders bevorzugte Varianten schließen native WGF Protein Isoformen, biologisch-aktive Peptide des natürlich vorkommenden WGF Proteins, und synthetische Peptide deren Sequenzen sich von der Wildtyp-Sequenz durch eine oder mehrere konservative Aminosäueresubstitutionen unterscheidet, welche gewöhnlich minimalen Einfluß auf die Sekundärstruktur und die hydrophobe Natur des Proteins oder des Peptids haben ein. Varianten können auch Sequenzen haben, die sich durch eine oder mehrere nicht-konservative Aminosäueresubstitutionen, Deletionen oder Einfügungen unterscheiden, die nicht die biologische Aktivität besitzen, das heißt, die mitogenische Aktivität des WGF Peptids oder des Vollängen-Proteins.
Funktionell äquivalente Peptide können konstruiert werden, indem man gleichwertige Aminosäuren ersetzt, und unter Verwendung des mitogenischen Assays, um zeigen, dass das produzierte Molekül das Wachstum der BSC-1 Zellen um 15 bis 35% anregt, verglichen mit einem funktionell inaktivem Kontroll-Peptid. Die Peptide, die mit diesen „äquivalenten" oder „konservativen" Substitutionen konstruiert werden, können stimulieren, inhibieren, oder haben keinen Effekt auf das Nierenepithelzellen Wachstum. Ein Führer „für konservative Substitutionen" wird in Tabelle 2 dargestellt. Die Synthesen der Peptide mit Substitutionen können vom Fachmann durchgeführt werden, und die mitogenischen Assays sind einfach durchzuführen. Folglich sind Peptide innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung klar bestimmt.
Konservative Änderungen schließen gewöhnlich den Ersatz von einer Aminosäure für andere mit ähnlichen Eigenschaften wie die Substitutierten innerhalb der folgenden Paare oder der Gruppen ein: Valin, Glycin; Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin; Asparagin-Säure, Glutamin-Säure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin. Die nicht-polaren (hydrophoben) Aminosäuren schließen Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin mit ein. Die polaren neutralen Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystin, Tyrosin, Asparagin und Glutamin mit ein. Die positiv-geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin mit ein. Die negativ-geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparagin-Säure und Glutamin-Säure mit ein.
Tabelle 2 faßt zusätzliche konservative Substitutionen zusammen; andere sind von Dayhoff im „Atlas der Protein-Sequenz und der Struktur" beschrieben worden.
Wie hierin beschrieben zeigte die, Analyse der Chromatogramme, die dem Microsequencing folgt, dass die Identität bestimmter Aminosäure-Reste im NH₂-terminus der WGF Isoformen vieldeutig war. Das Verwenden jeder der plausiblen Aminosäuren, um ein spezifisches synthetisches Peptid herzustellen, erlaubte die Identifizierung von WGF-abgeleiteten Molekülen mit unterschiedlichen mitogenischen Potential (Tabelle 3).
Ein Zusammensetzung, die hierin beschriebenen Proteine oder Peptide enthält, ist innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung.
Eine Methode für das Herstellen eines Proteins oder Peptids der vorliegenden Erfindung schließt die Schritte ein:

a) Züchten der Nierenepithelzellen im Medium,
b) Verwunden der Zellen in der Kultur durch Schaden, und
c) Erhalten des Proteins aus dem konditioniertem Medium.

Das erhaltene Protein wird aus dem konditionierten Medium isoliert und gereinigt. Eine Quelle der Nierenepithelzellen in der Kultur ist die afrikanische Grüne Affen Nieren-Epithelzelle BSC-1 Linie.
Ein rekombinante DNA Methode zur Herstellung eines Proteins oder eines Peptids der vorliegenden Erfindung schließt die Folgen den Schritte ein:

a) Erhalten einer Nukleotid-Sequenz, die das Protein oder das Peptid kodiert; und
b) Verwenden der Nukleotid-Sequenz in einem genetischen Expressions-System, um das Protein oder das Peptid zu bilden.

Die Peptide der vorliegenden Erfindung können auch direkt auf einen Peptidsynthesizer hergestellt werden, ohne Verwendung von zellulären oder molekular biologischen Techniken.
Antikörper zu WGF und zu abgeleiteten Peptiden sind ein Aspekt der vorliegenden Erfindung. Die Verfügbarkeit jedes Antikörpers liefert ein Diagnosewerkzeug, um die Menge des Faktors und seiner abgeleiteten mitogenischen Peptide im Urin, Blut und Gewebe zu messen. Neue Diagnoseeinblicke werden bei den Patienten erleichtert, die Arzneimittel mit nephrotoxischen Potential während der Behandlung von Infektion oder von Malignitäten empfangen, und bei Einzelpersonen mit Nierenverletzung oder Neoplasia. Solch ein Antikörper kann auch benutzt werden, um Nierenkrebs in den Restnieren der Patienten zu ermitteln, die chronische peritoneale Dialyse und/oder Hämodialyse durchmachen. Die Antikörper sind, z. B. gerichtet auf ein Protein oder ein Peptid einschließlich der aktiven Stelle, die im Allgemeinen Y/CPQGNH einschließt.
Ein Diagnose-Kit wird benutzt, um die Quantität eines WGF Proteins, oder des mitogenischen Peptids davon abgeleitet, in einem biologischen Assay zu messen, um akute Nierenverletzung oder den frühen Anfang einer Nierekrankheit zu ermitteln, die Behandlung von Nierenzell-Krebs zu überwachen, oder die Umwandlung des gutartigen Nierensystem bei chronischen Dialysepatienten zu Karzinomen oder zu Zysten-Adenocarcinoma zu erkennen. Der Kit schließt in getrennten Behältern ein:

a) Einen Antikörper zu WGF oder zu einem mitogenischen Peptid abgeleitet von; und
b) Mittel für das Ermitteln eines spezifischen Komplexes zwischen dem WGF Protein oder einem mitogenisches Peptid und dem Antikörper.

Kontrollen und Puffer können auch enthalten sein.
Die Erfindung schließt die Verwendung der Peptide zur Herstellung einer Zusammensetzung für ärztliche Behandlung der Nierenkrankheit ein. Die Herstellung umfasst das Erhalten der Peptide und das Hinzufügen eines geeigneten Trägers. Solche Träger sind dem Fachmann bekannt.
Die neuen Nierenwachstumsfaktor-Proteine und Peptide der vorliegenden Erfindung, und die dagegen gerichteten Antikörper haben unterschiedliche Verwendung in der klinischen Medizin. Die WGF Peptide sind für das Anregen des Nierenzellen Wachstums nützlich, eine Eigenschaft nützlich für die Behandlung des akuten Nierenversagens. Es ist besonders wünschenswert, die Wiederherstellung bei Patienten mit akutem Nierenversagen zu beschleunigen, besonders bei denen, die Nieren-Transplante von Toten empfangen, die verringertes Wachstumspotential haben. Die Infusion des Proteins oder der Peptide in Patienten ist auf die Verkürzung der Dauer der Episode des akuten Nierenversagens gerichtet, welche das Überleben erhöhen würde, wenn die Zahl der Tage, die für Hämodialysebehandlung während des Nierenausfallsyndroms erforderlich sind, verringern würde. Die Peptide stellen auch einen in vitro Standard für den Vergleich mit anderen Wachstumsfaktoren-Kandidaten zur Verfügung. Eins oder eine Mehrzahl der Peptide können verwendet werden.
Es wird erwartet, dass WGF eine Rolle als therapeutisches Mittel hat, um die Weiterentwicklung der bestehenden Nierenkrankheiten wie chronische Glomerulonephritis oder zwischenräumliche Nephritis zu verlangsamen. WGF und sein Rezeptor scheinen auf der Oberfläche der Nierenepithelzellen zu sein. Wenn gefunden wird, dass WGF ein Ligand für Rezeptoren auf der Oberfläche des spezifischen Nierenepithelzellen-Typs entlang dem Nephron ist, soll seine Anwendung in der Krebschemotherapie in Betracht gezogen werden. Wenn gefunden wird, dass er Krebszellen-Typ spezifisch ist, könnte der Wachstumsfaktor mit einem zellulären Giftstoff konjugiert werden, ein radioaktives Isotop oder cytotoxischen Antikörper, um ein leistungsfähiges neues chemotherapeutisches Mittel zu produzieren.
Eine Verfahren zur Behandlung einer Person mit akutem Nierenversagen, schließt ein: a) Vorbereiten einer pharmakologisch wirkungsvollen Menge des nativen WGF Proteins oder des WGF-abgeleiteten Peptids in einem verwendbaren Verdünnungsmittel; und b) Verabreichen der Zubereitung zu der Person. Das WGF kann mit einem cytolytischen Ligand verbunden werden, z. B. einen Giftstoff.
Die Erfindung bezieht sich auch auf den Gebrauch eines Proteins oder eines Peptids, die hierin beschrieben werden, um eine Zusammensetzung zu erhalten, nützlich zur Behandlung einer Person mit akutem Nierenversagen.
Multimere können sogar wirkungsvoller für die Erhöhung der zellulären mitogenischen Aktivität, z. B. wie das hier beschriebene 40-mer sein. Multimere können von den homogenen Peptiden gebildet werden, z. B., Multimere des Hexapeptide Y/CPQGNH, oder können Kombinationen der Peptide von WGF sein. Eine Zusammensetzung kann mindestens ein Multimer eines WGF-abgeleiteten Peptids einschließen, gebildet von einer Gruppe, die aus dem Hexapeptide NH₂-Y/CPQGNH-COOH besteht, oder der ersten 10 Aminosäuren des 22- und 45-kDa WGF Proteins (AQPYPQGNHE), oder des 14-Ser Peptids (AQPYPQGNHEASYG), oder Multimere anderer WGF Sequenzen, oder Kombinationen von irgendwelchen der hier beschriebenen Peptide.
Die Zusammensetzung kann mindestens ein WGF-abgeleitetes Peptid miteinschließen, in dem eine oder mehrere Aminosäuren mit einer natürlich vorkommenden Aminosäure, einem Aminosäurederivat, oder einer nicht-nativen Aminosäure ersetzt werden, solange die resultierende Variante ihre mitogenische Aktivität behält. Ein verwendbares WGF-abgeleitetes Peptid kann eine Aminosäureresequenz haben, die sich durch mindestens eine Aminosäueresubstitution, Deletion, oder Einfügung von einen anderen WGF-abgeleiteten Peptide mit mitogenischer Aktivität unterscheidet.
Auch innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung sind Zusammensetzungen einschließlich eines strukturellen Homologs des WGF-Proteins dessen Nukleotid- und Aminosäure-Sequenzen mindestens 80% Homologie haben und das mitogenische Aktivität zeigt.
Auch innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung sind Zusammensetzungen einschließlich mindestens einer strukturell geänderten Isoform des WGF-Proteins, die mitogenische Aktivität behält und die Post-translationall durch Glycosylierung, Sulfation oder Myristilation modifiziert ist.
Eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann einen Zell-Oberfläche Rezeptoren) einschließen, zu dem natives WGF Protein und WGF-abgeleitete Peptide binden, um die mitogenische Signal-transduction einzuleiten.
Eine Zusammensetzung kann das WGF Protein oder die WGF-abgeleiteten Peptide in Verbindung mit anderen bekannten Wachstumsfaktoren und/oder Nährstoffen einschließen.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung sind für die Behandlungsmethoden des Nierenausfalls oder -disfunktion nützlich, durch a) das Herstellen einer pharmakologisch wirkungsvollen Menge des nativen WGF Proteins oder des WGF-abgeleiteten Peptids in einem geeigneten Verdünnungsmittel, optional mit anderen Wachstumsfaktoren und/oder Nährstoffen; und b), Verabreichen einer wirkungsvollen Menge der Zubereitung zur Person mit den Nierenproblemen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt wachtumsfördernde Aktivität der Wundwachstum Faktor-abgeleiteten Peptide auf dem Wachstum der BSC-1 Zellen.
2A zeigt erhöhtes Überleben und 2B zeigt Nierenfunktionswiederaufnahme der Ratten nach einer Gabe WGF-abgeleiteten Peptids (14-Ser) nach einer Quecksilberchlorid induzierten akuten tubular Nekrose (A: Werte sind Mittelwerte +/– Standardfehler. *, Student's t-test, p < 0.034.) (B: Prozentüberleben wird errechnet in dem die Zahl der lebendigen Ratten, geteilt wird durch die Gesamtzahl von Toten und lebendigen; *, chisquared, p < 0.050.).
3A zeigt erhöhtes Überleben und 3B Nierenfunktionswiederaufnahme von Ratten nach Gabe von WGF-abgeleiteten Peptid (14-Ser) nachdem das ischämische akute Nierenversagen durch das bilaterale abklemmen der Nierenstiele verursacht wurde. (Prozentüberleben ist die Zahl lebendiger Ratten, geteilt durch die Gesamtzahl von Toten und Lebendigen.) Werte sind Medium +/– Standardfehler. *, Student's t-test, p < 0.032.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Produktion des Wundwachstum-Faktors aus Nierenzellen Kulturen
Konfluente Monolayer-Kulturen wurden mechanisch mit einer 200 μL Pipettenspitze gerieben (Continentale Laborprodukte, San Diego, CA). Unter einem Mikroskop wurde beobachtet, dass dieses reiben, die Zellen nicht beschädigt, und sie nur von einander getrennt wurden und sich zurückziehen, was zu einem schmalen Weg auf der Kulturschale führte, der mit dem blanken Auge gesehen werden konnte. Dieser Prozess von Reiben der Zellen ist „Verwunden" genannt worden und ist für viele Jahre wie ein vorbildliches System verwendet worden, um Reparatur der Korneaabnutzungen des Auges (Joyce et al., 1990) zu studieren. In Wirklichkeit wird Druck auf die Zellen ausgeübt, der genügt, die interzelluläre Adhäsion zu stören. Um feststellen, ob Nierenepithelzellen einen Autokrinen Faktor in das Medium freigaben, nachdem sie verwundet wurden, wurde konditioniertes Kulturmedium vom Kulturteller entfernt, nachdem man einen monomolekularen Film der BSC-1 Zellen durch reiben verwundet hatte. Ein Aliquote wurde für jede Wachtumsfördernde Aktivität auf einer nicht-verletzten „Detektor" Kultur geprüft (Zellen 1.2 × 10⁶ pro 55-mm Schale).
Wachstumsfördernende Aktivität des Faktors
Wachtumsfördernde Aktivität in einem Aliquot des konditionierten Mediums wurde geprüft, indem man die Zellzahl in einer Detektorkultur vier Tage zählte und Vergleich mit der Zahl in einer Kontrollkultur, zu der ein Aliquote des Mediums von einer nicht-verletzten Kultur, hinzugefügt wurde. Diese Strategie zeigte, dass Mediums der verletzte Nieren-Epithelzellen der BSC-1 Linie eine wachtumsfördernde Aktivität freigab, die zuerst „Wundwachstums-Faktor" benannt wurde. Fibroblasten 3T3 produzierten einen ähnlichen Effekt nicht.
Für den Assay, wurden Zellen von der Schale mit einer Lösung Trypsins abgetrennt, und ein Aliquot wurde in einem Hämocytometer gezählt. Konfluente Kulturen wurden für diesen Assay benutzt, damit die Zellen, die WGF ausgesetzt wurden, eine Zellzahl von 2.6 × 10⁶ Zellen/Kultur hatten, während die Zellen, die mit einem Aliquot des Mediums von einer nicht-verletzten Kultur behandelt wurden, ein Zellzahl von 2.0 × 10⁶ Zellen vier Tage nach dem Hinzufügen hatten. Also regte WGF die Zellproliferation um 30% in diesem Assay an.
Wenn High-Density, bewegungslose Kulturen (3 × 10⁶ Zellen/55-mm Schale) benutzt wurden, um mitogenische Aktivität zu prüfen, indem man Einbau des Thymidins [³H] in DNA maß, erhöhte die WGF DNA Synthese ungefähr um 60%. Um WGF herzustellen, können Zellen durch reiben jeden zweiten Tag verletzt werden, so dass maximale Aktivität in das konditionierte Medium freigegeben wird. WGF ist für spärliche und konfluente Kulturen der BSC-1 Zellen mitogenisch, und ist nach Ablage bei 4°C bis –40°C für viele Wochen beständig.
Charakterisierung der mitogenischen Aktivität des Wundwachstums-Faktors
Nach Nachweis der wachtumsfördernden Aktivität im konditionierten Medium der durch reiben-verletzten Kulturen der BSC-1 Zellen wurden Bemühungen aufgenommen, Größe und Aufbau des mitogenische Faktors festzustellen. Zuerst wurden Filter, die unterschiedliche Molekulargewicht-Abgrenzungen haben, verwendet, um zu zeigen, dass die wachtumsfördernden Aktivität eine Amicon YM Membrane durchschritt, die eine Abgrenzung von 100 kDa hat, wurde aber durch eine Membrane mit einer Abgrenzung von 30 kDa zurückgehalten. Die Größe des mitogenische Faktors wurde vorgeschlagen grösser als 30 kDa, aber weniger als 100 kDa. Diese Membranen liefern nur eine sehr grobe Größenfeststellung des mitogenischen Faktors.
Weitere Analyse legten nahe, dass die Aktivität ein Protein war, weil sie durch Trypsin zerstört werden konnte (100 μg/ml für 3 Stunden), Dithiothreitol (65 mM für 1 Stunde), Essigsäure (1 M für 5 Stunden), oder durch Hitze (70°C für 20 Minuten).
Die Kennzeichnung der elektrischen Nettoaufladung auf WGF wurde mit DEAE- und CM-Zellulose Matrizen (Pharmacia) bestimmt die unterschiedliche Aufladungen haben. Die Resultate zeigten an, dass WGF kationisch war. Nach folgende Experimente zeigten an, dass es fest zu einer Heparinsäule bindet (Pharmacia Hi Trap Heparin) von der es mit 0.4 bis 1.0 M Natriumchlorid eluiert werden konnte.
Pentosanpolysulfat (Sigma-Chemical, St. Louis), welches bekannt, ist die Aktivität der Heparin-bindenen Wachstumsfaktoren wie säurehaltige und basische Fibroblasten-Wachstumsfaktoren zu blockieren, blockierte auch die Aktivität von WGF, was nahelegt, dass es ein kationisches Molekül ist. Untersuchungen an einer C₄-Gegenphasischen-HPLC-Säule (Vydac) deckten auf, dass das Protein ausgesprochen hydrophob war eine Konzentration von 55% Acetonitrils (J. T. Baker, HPLC-Grade) notwendig war, um die WGF-Wachstumsförderung Aktivität von der Säule zu eluieren. WGF Aktivität war auch Stabil in 0.1% Trifluoroessig-Säure (TFA) (J. T. Baker, HPLC-Grade) und Isopropanol.
Bestimmte mitogenische aktive Fragmente von WGF, eluiert von einer C₄-Gegenphasischen-HPLC-Spalte, binden auch an Concanavalin-A-Sepharose 4B (Pharmacia LKB), und werden durch alpha-Methyl-Mannosid eluiert, das Nahelegt, dass der Faktor Kohlenhydrat enthält. Vier Fraktionen von der HPLC-Säule, die maximale wachtumsfördernde Aktivität zeigten, einschließlich der, die bei 55% Acetonitril eluiert, und als WGF gekennzeichnet wird, wurden jeweils Concanavalin-A-Sepharose und nachher alpha-Methyl-Mannosid ausgesetzt. Das Eluat wurde dann auf wachtumsfördernde Aktivität geprüft. Fraktionen, die von der HPLC-Säule bei 55% eluierten und bei 49% Acetonitril zu Concanavalin-A-Sepharose binden, wurden durch alpha-Methyl-Mannosid eluiert und waren völlig aktiv. Demgegenüber binden Fraktionen, die bei 46% oder 57% Acetonitril eluierten, oder reiner epidermialer Wachstumsfaktor, verwendet als Kontrollemitogen, das nicht ein Glucoprotein ist, nicht an Concanavalin-A. Diese Resultate legen nahe, dass natives WGF ein Glucoprotein ist.
WGF, Heparin, und andere Wachstum-Faktoren
Obgleich das Verwunden durch Kratzen einer anderen Zell-Typ, endothelialer Zellen, einen säurehaltigen Fibroblast-Wachstumsfaktor (aFGF) frei gibt, zeigte die Charakterisierung von Nierenzellen, WGF an, dass sich WGF vom aFGF unterschied. Beweis für dieses ist, wie folgt: (1) Heparin (Sigma), vergrößert die mitogenische Aktivität von WGF, aber inhibiert aFGF, wenn jeder Bestandteil BSC-1 Zellen hinzugefügt wird, (2) Keratinsulfat (ein Glycosaminoglycan Bestandteil der extrazellularen Matrix) regt, mitogenische Aktivität von WGF an, aber hat keinen Effekt auf die Aktivität von aFGF, (3) die mitogenischen Effekte der maximalen Konzentrationen von WGF und von aFGF sind additiv, und (4) die Größe von WGF ist ungefähr 45 kDa, während aFGF ungefähr 16 kDa ist.
WGF unterscheidet sich auch vom basischem FGF (bFGF) dadurch dass (1) bFGF (Gibco/BRL) von einer Heparinaffinität, Säule bei 1.5 bis 1.6 M NaCl eluiert, während WGF bei 0.4 bis 1.0 M NaCl eluiert, und (2) die mitogenische Aktivität von bFGF wird 90%, durch 55% Acetonitril/0.1% (TFA) gehemmt, welches keinen Effekt auf Aktivität von WGF hat. Ausserdem werden aFGF und bFGF mRNA nicht, durch einen Northern Blot der BSC-1 Zellen ermittelt, was zeigt, dass die Gene, die diese Wachstumsfaktoren kodieren, nicht in den Zellen exprimiert werden.
Die mitogenischen Effekte der maximalen Konzentrationen teilweise-gereinigten WGF und des epidermialen Wachstumsfaktors (EGF, Promega) sind ebenfalls additiv, was andeutet, dass sie vermutlich mitogenische Effekte durch unterschiedliche Rezeptoren und Signalwege vermitteln.
Die Behandlung eines konfluenten Monolayers der BSC-1 Zellen mit dem Enzym Heparinase I (Sigma), aber nicht Heparinase III (Sigma), gibt WGF mitogenische Aktivität von den Zellen in das Kulturmedium frei. Jedoch scheint dieses, WGF mindestens vorübergehend zu verbrauchen,. Wenn Zellen zuerst mit Heparinase I behandelt werden, ausgespült, die Medien aspiniert, und der monomolekulare Film dann reiben-verletzt wird, wird keine wachtumsfördernde Aktivität in den konditionierten Medien ermittelt. Diese Beobachtungen schlagen eine Rolle für ein Heparin-ähnliches Molekül, wie ein Glycosaminoglycan vor, das die Verbindung von WGF zur Plasmamembran vermittelt, von welcher es nach dem Verwunden oder der Behandlung mit Heparinase I freigegeben wird.
Wenn WGF auf der Zell-Oberfläche liegt, scheint es, vor Abbau durch Trypsin geschützt zu sein, vielleicht durch Kohlenhydrat-Reste verbunden mit seinem Proteinrückgrat, und/oder durch Assoziation mit Glycosaminoglycanen anhaftend an der Plasmamembran (Glycoaclyx). Ein Beweis zugunsten dieser Hypothese leitete sich vom folgenden Experiment ab. Ein Zell-Monolayer wurde dem proteolytischen Enzym Trypsin ausgesetzt (1 bis 10 μg/ml) für 10 Minuten. Das Enzym, so wurde vorher gezeigt, hat die Kapazität WGF Aktivität zu zerstören. Dann wurde Soyabohnentrypsin-Inhibitor (10 μg/ml) hinzugefügt, um das Enzym zu neutralisieren. Als der Zell-Monolayer nachher verwundet wurde, wurde voll biologisch aktives WGF in das Kulturmedium freigegeben, was anzeigt, dass exogenes Trypsin nicht den Wachstumsfaktor zerstört hatte, der mit den Zellen verbunden ist.
WGF scheint nicht, durch die Zellen in der extrazellularen Matrix (ECM) gespeichert zu werden. Diese Schlussfolgerung basiert auf dem folgenden Experiment. Ein konfluenter Monolayer der BSC-1 Zellen wird von ECM durch Hinzufügung von EGTA (J. T. Baker) zum Medium abgetrennt, und hinterläßt eine Schicht ECM auf der Oberfläche der Kulturschale. Frisches Medium wurde der Schale hinzugefügt und seine ECM Schicht wurde dann dem Verwunden durch Reiben unterworfen. Keine mitogenische Aktivität wurde im konditionierten Medium ermittelt, was vermuten läßt, dass die Aktivität auf oder innerhalb der Zellen und nicht im ECM lag.
Die mitogenische Stärke von teilweise-gereinigtem WGF ist mit der mitogenischen Stärke von ungefähr 5% Kalbserums gleichwertig, oder 2 pg/ml aFGF, oder 20 pg/ml basischem FGF, oder 15 ng/ml EGF, unter Verwendung hier beschriebener Assays.
Vergleich der bekannten Wachstums-Faktoren zu WGF-Abgeleitetem Peptid; Additive Effekte
Die mitogenische Stärke des 14-Aminosäuren Peptids AQPYPQGNHEASYG, das einen Serin-Reste in Position 12 (14-Ser) hat, wurde mit Wachstumsfaktoren und anderen mitogenischen Signalen der Affennieren-Epithelzellen der BSC-1 Linie verglichen. Die vorher identifizierte maximale mitogenische Konzentration jedes wachtumsfördernden Signals wurde eingesetzt, und verglichen mit dem WGF-abgeleiteten Peptid bei Konzentrationen von 0 bis 0.5 μg/ml.
Das folgende Peptid und die ionische mitogenischen Signale wurden studiert: EGF, 50 ng/ml; IGF-I, 50 ng/ml; säurehaltiger Fibroblasten-wachstumfaktor (FGF-1), 100 pg/ml; basischer Fibroblasten-wachstumfaktor (FGF-2), 1.000 pg/ml; Vasopressin, 75 pg/ml; Kalbserum (0– 1%); hohes Kaliummedium (5 mM KCl hinzugefügt, abschließende Konzentration 10.4 mM), hohes Natriummedium (25 mM NaCl hinzugefügt, abschließende Konzentration 180 mM).
Nicht-transformierte Affenieren-Epithelzellen der BSC-1 Linie wurden bis zur Konfluenz in Dulbecco's modifiziertem Eagle Medium, das 1% Kalbserum und das 1.6 μM Biotin enthält in den 55-mm Kulturschalen bei 38°C in einem CO₂-Inkubator angezogen. Als Zellen eine Dichte von ungefähr 10⁶ pro Schale erzielten wurde, das Ausgabe Medium entfernt und mit dem frischen Medium ersetzt, das 0.5% Kalbserum und das 14-Aminosäure Peptid enthält (0.5 μg/ml). Das Hinzufügen von jedem der mitogenischen Signale zum Kulturmedium wurde bei maximaler Konzentration gemacht. Vier Tage später wurde die Zahl der Zellen in jeder Kultur in einem Hämocytometer gezählt. Die erhaltenen Werte waren das Medium von 3 verschiedenen Kulturen. Die Verdoppelung der Kalbserumkonzentration von 0.5% auf 1.0% änderte das Wachstum der BSC-1 Zellen nicht erheblich. Hinzufügung des 14-Ser Peptids (0.5 μg/ml) regte das Wachstum 25–30% bei jeder der Serumkonzentrationen an.
1. Vergleiche mit EGF, IGF-I, Säurehaltiges FGF, basisches FGF, Vasopressin
Das „14-Ser Peptid" AQPYPQGNHEASYG erhöhte die Zellzahl um 25–30% verglichen mit der Kontrolle nach vier Tagen. EGF (50 ng/ml) allein regte das Wachstum um 31% in Abwesenheit „des 14-Ser Peptids", und um 61% in seiner Anwesenheit an, was zeigt, dass die zwei Mitogene additiv waren.
IGF-I (50 ng/ml) regte das Wachstum um 20% an; es war weniger stark als das 14-Ser Peptid. Als beide hinzugefügt wurden, wurde eine 38% Simulierung beobachtet. Obgleich kleiner als die erwarteten 45%, wenn völlig additiv, der mitogenische Effekt von IGF-I sah zu dem des 14-Ser Peptids additiv aus.
Säurehaltiges FGF (100 pg/ml), basisches FGF (1.000 pg/ml), und Vasopressin (75 pg/ml) regten das Wachstum um 17%, 18%, und 14% an, verglichen mit dem 14-Ser Peptid, das die Zellzahl um 25% erhöhte. Jeder dieser bekannten Peptid-Wachstumsfaktoren war mit dem 14-Ser Peptid additiv; säurehaltiges FGF um 44%; basisches FGF, 41%; und Vasopressin, 36%.
Zusammenfassend ist das 14-Ser WGF-abgeleitete Peptid ein starkes Mitogen, weil es Äquivalent ist, oder stärker ist als, jeder von fünf bekannten Peptid-Wachstumsfaktoren für Nierenepithelzellen. Zusätzlich war der wachtumsfördernde Effekt des 14-Ser Peptids additiv mit jedem der fünf Wachstumsfaktoren, was nahelegt, dass er mit einem anderen Rezeptor und/oder Signal-transduktion-Weg als sie interagiert. Schließlich legen die additiven mitogenische Effekte nahe, dass das 14-Ser Peptid, im Verbindung mit einem oder mehreren der bekannten Wachstumsfaktoren, in vivo fungieren könnte, um Reparatur und Regeneration der verletzten Niere während des akuten Nierenversagens zu beschleunigen.
2. Hohes Kaliummedium, Hohes Natriummedium
Die Erhöhung der Kaliumkonzentration vom Kontrollwert von 5.4 mM auf 10.4 mM, oder der Natriumkonzentration von 155 mM (Kontrolle) zu 180 mM durch Hinzufügen der passenden Salzlösung dient als mitogenisches Signal für Nierenepithelzellen.
Als die Kaliumkonzentration des Kulturmedium von 5.4 auf 10.4 mM angehoben wurde, indem man eine Lösung der Kaliumchloridverbindung hinzufügte erhöhte sich, die Zellzahl um 18%. Eine 43% Erhöhung des Wachstum nach dem Hinzufügen des 14-Ser Peptids wurde erwartet; eine Zunahme von 35% wurde beobachtet.
Das Erhöhen der Natriumkonzentration des Mediums von 155 mM auf 180 mM durch Hinzufügung der Natriumchloridlösung erhöhte das Wachstum um 25%. Als das 14-Ser Peptid addiert wurde, wurde ein Anstieg des Wachstums von 41% beobachtet, kleiner als die vorausgesagten 50%.
Zusammenfassend, jedes der zwei ionischen mitogenischen Signale war additiv mit dem 14-Ser Peptid-Mitogen.
3. Erforderliche Zeit für den Wachstumsfördernden Effekt des 14-Ser Peptid
Um zusätzlichen Einblick in die Affinität des 14-Ser WGF-abgeleiteten Peptids für die Zell-Oberfläche zu gewinnen, wurden Experimente durchgeführt, um die Mindestzeit festzustellen, die für den Ligand erfordert ist, um in Verbindung mit den Nierenzellen zu treten, um deren beschleunigtes Wachstum irreversibel festzulegen.
Ein konfluenter Monolayer der BSC-1 Zellen wird hergestellt wie hier beschrieben und dem 14-Ser Peptid (0.5 μg/ml) für unterschiedliche Zeitintervolle (0 bis 30 Minuten) ausgesetzt. Am Ende der definierten Periode wurde, das Kulturmedium, welches das Mitogen enthält, aspiriert, der Monolayer wurde abgespült, um nicht-adhärente Peptide zu entfernen, und frisches Medium wurde addiert. Vier Tage später wurde die Zahl der Zellen in der Kultur gezählt.
Eine Aussetzung der Zellen zum 14-Ser Peptid für 2 Minuten war ausreichend um bei ihnen die maximale Wachstumsanregung (29%) festzulegen; die halb-maximale Anregung war bei 1 Minute. Das 40-Aminosäure Peptid (siehe Tabelle 2), verhielt sich ähnlich. Demgegenüber ist die Verpflichtungszeit für EGF 4 Minuten, und für Vasopressin 2 Minuten. So erfordert das 14-Ser Peptid anscheinend eine bemerkenswert kurze Zeit (2 Minuten), um an den Oberflächen-Rezeptor irreversibel zu binden und die Zellen zum beschleunigtem Wachstum festzulegen. Die Zeit, die erfordert wird, ist gleichwertig mit oder geringer als bei anderen bekannten Peptidmitogenen (EGF, 4 Minuten; Vasopressin, 2 Minuten; niedriger Natriumwachstumsfaktor, 5 Minuten; hohes Kaliummedium, 6 Minuten; Adenosinmonophosphat, 14 Stunden).
Reinigung von WGF
Ein Protokoll, um einen Liter des WGF konditionierten Mediums herzustellen wird hierin beschrieben. Die normale Ausbeute des WGF Proteins ist ungefähr 50 ng pro Liter, wie durch SDS-Polyacrylamid Elektrophorese und Analyse der Aminosäurezusammensetzung bestimmt wurde.
Herstellung des Konditionierten Mediums: 100 Kulturen der BSC-1 Zellen werden bis zur Konfluenz (6–8 × 10⁶) auf den Plastikgewebekulturschalen (Nunc) mit einem Durchmesser von 10 cm in Dulbecco's Modified Eagles Medium angezogen, das 2% Kalbserum enthält. Das Medium wird aspiriert, und die Kultur wird mit Phosphatgepuffertem-Saline Lösung (PBS) (Sigma) ausgespült, um das Medium und das Serum zu entfernen. Dann werden 10 ml PBS jeder Schale in der Vorbereitung für das Verwunden hinzugefügt. Eine Gesamtzahl von 5 Wunden pro Zell-Monolayer werden schnell gemacht, indem man eine 200 μL Plastikpipettenspitze über die Oberfläche der Schale von Rand zu Rand reibt. Ungefähr 10 Minuten später (9.5 Minuten wird bevorzugt), wird der konditionierte Puffer in einen Plastik Nalgene Becher abgefüllt.
Isolierung und Reinigung von WGF: Nach der Konditionierung wird der vereinigte konditionierte Puffer in silanisierte (Aquasil, Pierce) Glasflaschen (Wheaton) steril-filtriert (Costar, 0.2 μm Poregröße) um alle Rückständ oder Zellen abzutrennen. Der sterile konditionierte Puffer wird diafiltriert, entsalzt, und mit einer YM-30 Membran (Amicon) bei 4°C konzentriert. Das konzentrierte Material wird dann sterilfiltriert (Millex HA, 0.45 Fm) bei Raumtemperatur, lyophilisiert, um das Volumen weiter zu reduzieren, auf eine 1 ml Heparin-Affinitäts-Cartridge geladen und mit einer Lösung von 1 M NaCl eluiert. Die Cartridge wird zuerst 0.4 M NaCl in 10 mM Natrium-phosphats (pH 7.4) ausgesetzt, um nicht-mitogenisches Material zu eluieren; der gleiche Puffer, der 1 M NaCl enthält, wird dann benutzt, um mitogenische Aktivität von der Cartridge zu eluieren. Das Eluat wird entsalzt, und das Volumen wird mit einem Centricon 3 Filter (Amicon) durch Zentrifugierung verringert (7500 g für 2 Stunden bei 4°C). Das Konzentrat (300–400 μl) wird auf eine C₄-gegenphasische-HPLC-Säule geladen (250 mm × 4.6 mm, Teilchengröße 5 μm) (Vydac), und wird mit einem Gradienten des Acetonitrils (1–80%) in Trifluoroessigäure (0.1%) (TFA) für 50 Minuten mit einem Beckman Goldchromatographischen System eluiert. Mindestens 5 unterschiedliche Proteinpeaks (überwacht durch Absorption bei 214 nm) die mitogenische Aktivität zeigen, können leicht identifiziert werden. Jedoch der Peak, der bei ~55% Acetonitril eluiert, zeigt routinemäßig die stärkste mitogenische Aktivität und Reproduzierbarkeit in den unterschiedlichen Isolaten. Dieses Eluat wird per Hand gesammelt in ein silanisiertes Eppendorf-Tube, auf eine C₈-Säule (Vydac) geladen, und rechromatographiert mit dem gleichen Acetonitril-TFA Gradienten wie oben beschrieben. Wieder eluiert die mitogenische Aktivität bei ~55% Acetonitril. Wachtumsfördernde Aktivität und Gesamtproteingehalt wird an jedem Schritt während des Reinigungprozesses überwacht. Abhängig von der Anzahl der Liter des konditionierten Puffers, kann es notwendig sein, eine zweite C₈-Säule laufen zu lassen, um Trennung der Peaks von Interesse zu optimieren. Dieses bioaktive Material wird dann im Volumen mit einem Vakuumverdichter (Savant) verringert, und wird nachher auf ein 12.5% SDS Gel für elektrophoretische Trennung geladen.
Der M_r von WGF wird durch Vergleich seiner elektrophoretischen Migration zu dem der Standardproteine der bekannten molekularen Größe geschätzt. Unterschiedliche Proteine im Gel werden sichtbar gemacht, indem man mit Silber (BioRad) färbt, oder nach Blotten auf eine PVDF Membrane (Millipore) mit Coomassie-Blauer färbt (Gibco/BRL). Mehr als eine Bande erscheint normalerweise. Um festzustellen, welche Bande die mitogenische Form von WGF darstellt, wurde, ein ungefärbtes nicht reduzierendes Gel in breite 2-mm Fragmente nach der Elektrophorese geschnitten, und jedes wurde für 18 Stunden mit Bewegung bei Raumtemperatur in PBS eluiert, das Acetonitril (3%) und Rinderserumalbumin (0.1%) enthält. Das Eluat jedes Fragments wurde einer Kultur der BSC-1 Zellen hinzugefügt, um seine Kapazität festzustellen, Zell-Wachstum anzuregen. Diese experimentelle Strategie deckte auf, dass die aktiven WGF Proteine einen M_r von 22 und 45 kDa hatten.
WGF scheint, von den Zellen nach Verletzung freigegeben zu werden; es erscheint nicht im Kulturmedium von nicht-verletzten Kulturen. Ein Beweis zur Unterstützung dieser Schlussfolgerung wurde durch das folgende Experiment erzielt. Konditionierter Puffer (1550 ml) von durch reiben-verletzten Kulturen wurde, wie oben beschrieben erhalten und auf eine C₈-HPLC Säule gegeben, die bei 55% Acetonitril wachtumsfördernde Aktivität eluierte, während das gleiche Volumen (1550 ml) des Puffers von nicht-verletzten Kulturen, diesen Proteinpeak oder mitogenische Aktivität nicht zeigte.
NH₂-Terminale Sequenz des Wundwachstums-Faktors
Um die Aminosäuresequenz des NH₂-Terminus von WGF zu erhalten, wurden 2.5 μg von C₈-gereinigtes Protein der Elektrophorese auf einem 12.5% SDS-Polyacrylamid Gel unterworfen. Die relative elektrophoretische Mobilität des gereinigten Proteins wurde mit Standardproteinen bekannter molekularer Größe verglichen. Nachdem Blotten auf eine PVDF Membran (Millipore) und dem Färben mit Coomassie-Blau wurden zwei Bänden mit entsprechenden Größen von 45 kDa und 22 kDa gesehen. Sie wurden nachher aus dem Fleck heraus geschnitten und dann auf ein ABI Microsequenzer geladen. Die Resultate des Mikrosequenzierens werden mit typischen Abkürzungen und Symbolen für die Aminosäuren ausgedrückt, die nachstehend aufgeführt werden:
Eine Gesamtmenge von vier Ermittlungen der Aminoterminalen Sequenz von WGF sind auf unterschiedlichen Batches des konditionierten Medium gebildet worden. Die ersten vierzehn Aminosäuren des 45 kDa Proteins in der Amino- zur Carboxyl-Orientierung (NH2 → COOH) werden unten gezeigt, worin sich die Zahlen auf Positionen mit der ersten Aminosäure als Nummer Eins beziehen:
Ermittlungen der Sequenz von drei unterschiedlichen Isolaten des 22 kDa Proteins sind:
Das längste ist 16 Aminosäuren.
Wichtig ist, dass die ersten 10 Aminosäuren in jeder der vier Sequenz Ermittlungen identisch sind, was nahelegt, dass das 22 kDa Protein ein Fragment oder Spaltprodukt des 45 kDa Proteins sein könnte. Jedoch lassen die unterschiedlichen Sequenzen von Aminosäuren 12 bis 14 in den 22 und 45 kDa Proteinen vermuten, dass sie zwei WGF-Isoformen darstellen könnten.
Die NH₂-Terminale Domäne von WGF ist für Nieren-Epithelzellen Mitogenisch
Eine Sequenz der elf NH₂-terminalen Aminosäuren AQPYPQGNHEA (11-mer) des 22 kDa Proteins wurde verwendet, um ein synthetisches Peptid herzustellen, das mit einem verzweigten Lysin-Kern verbunden wurde. Dieses mehrfach antigenische-Peptidsystem (MAPS) wurde benutzt, um Tiere zu immunisieren, um einen polyclonalen Antikörper herzustellen, der WGF erkennen würde. Das MAPS-Protein hat ein Polylysin-Rückgrat, dass an ein Harz an einem Ende gebunden wird und vier Verzweigungen am anderen hat; jede Verzweigung wird mit einem Molekül des 11-mer Peptids verbunden. Überraschenderweise, als auf wachtumsfördernde Aktivität geprüft wurde, regte das MAP-Peptid DNA Synthese und Vermehrung der Affennieren-Epithelzellen der BSC-1 Linie an. Sein maximaler wachtumsfördernde Effekt war dem nativen WGF ähnlich. Wenn es mit einem MAPS-Protein verglichen wurde, das aus einer anderen 11-Aminosäure Sequenz hergestellt wurde, und mit einem Peptid einer 16-Aminosäure Sequenz ohne Bezug, zeigte nur die Sequenz, die auf dem WGF Protein basierte, mitogenische Aktivität. In den folgenden Experimenten wurde gezeigt, dass das 11-Aminosäure Peptid, in Abwesenheit des verzweigten Lysin-Kerns, starke Vermehrung dieser Nierenzellen im gleichen Umfang anregte, wie gereinigtes WGF-Protein. Gegründet auf zwei getestete Zelltypen, stimulierte das 11-mer WGF Peptid die mitogenische Aktivität der Nierenepithelzellen, aber regte nicht das Wachstum der Mäuse-Fibroblasten 3T3 an.
Zusätzlich war der wachtumsfördernde Effekte des 11-mer Peptids und des Wundekonditionierten Puffers nicht additiv, was vorschlägt dass das 11-mer Peptid starke Zell-Vermehrung durch den gleichen Rezeptor anregt und den gleichen Signal-Pathway benutzt, wie intaktes WGF. Diese unerwarteten Resultate lassen vermuten, dass die 11-Aminosäuren des NH₂-Terminus eine mitogenische Domäne von WGF darstellen, obgleich andere wachtumsfördernde Domäne im nativen 45 kDa Protein enthalten sein können, dessen geschätzte Länge ungefähr 400 Aminosäuren ist.
1 zeigt ein gleichwertiges mitogenisches Ansprechen auf die Dosis eines synthetischen 11-mer Peptids, AQPYPQGNHEA, welches natives (22 kDa) Amino-Terminales WGF darstellt, und des aktivsten Hexapeptid synthetisiert gemäss der verliegenden Erfindung YPEGNH, welches sich von nativem WGF durch den Austausch eines Restes des Glutamins (Q (Charge = 0) mit Glutamin-Säure (E) (Charge = –1) unterscheidet. Jedoch wird die native Sequenz bevorzugt (siehe Tabelle 3). Die „native" Sequenz ist, die sich im 22 oder 45 kDa WGF fand, das von kultivierten Zellen erhalten wurde. Die Peptide werden durch gegenphasische-HPLC auf einer C₁₈-Säule mit einem Gradienten des Acetonitrils (1–80%) in 0.1% Trifluoressig-Säure gereinigt, lyophilisiert, und dann aufgelöst im Gewebekulturmittel.
Nicht-transformierte Affennieren-Epithelzellen der BSC-1 Linie wurden bis zur Konfluenz in geändertem Dulbecco's Medium bei 38°C in einem CO₂-Inkubator angezogen, das 1% Kalbserum und 1.6 μM Biotin enthält. Als Zellen eine Dichte von ungefähr 10⁶ pro Schale erzielten, wurde das verbrauchte Medium entfernt und mit dem frischen Medium ersetzt, das 0.5% Kalbserum und unterschiedliche Mengen der zwei Peptide enthält. Vier Tage später wurde die Zellzahl in jeder Kultur gezählt. Jeder Wert ist das Medium von 3 verschiedenen Kulturen.
Mitogenität der WGF-Abgeleiteten Peptide
Um die Sequenz des kleinsten Peptids zu bestimmen, das Nierenzell-Wachstum anregen könnte, wurden synthetische Peptide der unterschiedlichen Längen (siehe unten), hergestellt, und gereinigt durch gegenphasischen-HPLC auf einer C₁₈-Säule. Mitogenische Aktivität wurde in einer Kultur der BSC-1 Zellen untersucht, indem man die Zellzahl nach Aussetzung zu einer spezifizierten Konzentration (0.5 bis 20 μg/ml) des Peptids für vier Tage zählte, und das Resultat mit dem Wachstum in Abwesenheit des zugesetzten Peptids verglich.
PEPTIDE
Wie das 11-mer, jedes von fünf kürzeren Peptiden, (6 bis 9 Aminosäuren lang) regte Nierenzell-Wachstum maximal im gleichen Umfang (25–30%) wie natives WGF an.
Die folgenden Peptide (4 bis 6 Aminosäuren lang) stellen Domänen des NH₂-terminalen WGF dar, die das Zell-Wachstum nicht anregten, verglichen mit dem aktiven 11-mer von Linie 1.
Die folgenden 6-mer und 7-mer Peptide, deren Sequenzen sich von WGF unterscheiden, regten auch das Zell-Wachstum nicht an:
Die vorstehenden Resultate zeigen, dass maximale mitogenische Aktivität der Peptide, die auf der nativen Sequenz basieren, in einem 6-mer liegt, dessen Sequenz YPQGNH ist, weil:

(1) Peptide, die diese Sequenz enthalten, die 7, 8, 9 oder 11 Aminosäuren lang sind, regen Wachstum im gleichen Umfang an,
(2) jedes von zwei 5-mers, deren eine Aminosäure entweder am NH₂- oder -COOH Terminus des 6-mer fehlt sind nicht im gleichen Umfang mitogenisch,
(3) ein 6-mer (YPRGNH), das sich von YPQGNH in nur einer einzelnen Aminosäure unterscheidet, ist nicht im gleichen Umfang mitogenisch,
(4) ein anderes 6-mer (QPYPQG), das sich von YPQGNH in zwei Aminosäuren unterscheidet, ist nicht mitogenisch, und
(5) weder ein 4-mer (GNHE), dessen Sequenz in WGF gefunden wird, noch ein 7-mer (LKYSGQD) mit einer Sequenz ohne Bezug, ist mitogenisch.

So enthält der NH₂-Terminus des nativen WGF eine Hexapeptid-Sequenz, NH₂-Tyrosin-Prolin-Glutamin-Glycin-Asparagin-Histidin-COOH, die für Nierenepithelzellen mitogenisch ist, wie durch die BSC-1 Linie illustriert wird.
Peptide der verschiedenen Längen sind auch innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung, solange die mitogenische Hexamer Sequenz enthalten ist. Peptide der verschiedenen Längen können einzeln benutzt werden oder in verschiedener Weise für spezifische Zwecke kombiniert werden. Diese Möglichkeiten schließen ein (NH₂-Terminus → COOH-Terminus):
Diese Peptide können mit anderen Aminosäuresequenzen entweder an einem Ende oder an beiden Enden kombiniert werden (NH₂ und COOH). Der Aminosäure Terminus Y kann durch Cystein ersetzt werden.
Charakterisierung der nativen und modifizierten WGF-Abgeleiteten Amino-Terminalen Peptide
Aminosäureaustausche am Amino-Terminus des nativen WGF wurden identifiziert, die mitogenische Aktivität des Peptids ändern können. Die Zielsetzung dieser Bemühung war, die wachtumsfördernde Aktivität des Peptids für die Verwendung in Wirksamkeitsstudien der Behandlung des akuten Nierenversagens in Tiermodellen des Syndroms zu maximieren. Die Strategie war verschiedene Peptide zu entwerfen und dann chemisch zu synthetisieren, indem strukturell in Verbindung stehende Aminosäuren für die ersetzt wurden, die in der nativen WGF Sequenz gefunden werden. Das Peptid von Interesse wurde dann auf einer gegenphasischen-HPLC C₁₈-Säule gereinigt, wie hier beschrieben mit einem Gradienten von Acetonitril 1–80% in 0.1% Trifluoroessig-Säure (TFA). Das gereinigte Peptid wurde dann lyophilisiert, um das Acetonitril und TFA zu entfernen und das lyophilisierte Puder wurde gewogen, aufgelöst im Puffer und dem Kulturmedium hinzugefügt, um seinen Effekt auf das Wachstum der Affennieren-Epithelzellen zu messen, wie hierin beschrieben. Um die relative Stärke der unterschiedlichen Peptide zu vergleichen, wurden nur jene Moleküle, die Wachstum maximal nach 4 Tagen in der Kultur um 25–30% anregten, weiter durch das Definieren ihrer Konzentration-Abhängigkeit analysiert. Ein Wert, der „K½" benannt wurde, wurde verwendet. Diese Bezeichnung wird hierin verwendet als die Peptidkonzentration in Micromole (μM) bei der der Wachstums-Fördernde Effekt die Hälfte beträgt verglichen mit der Konzentration an der maximale Vermehrung beobachtet wird. Je niedriger der Wert, desto grösser die mitogenische Kraft des Peptids.
TABELLE 3. RELATIVE KRAFT DER WGF-ABGELEITETEN PEPTIDE AUF DAS WACHSTUM DER NIEREN-EPITHELZELLEN
Die Aminosäuren, die durch Großbuchstaben gekennzeichnet werden, sind die die im nativem WGF vorhanden sind, während die fetten Buchstaben sich auf konservativen Aminosäueresubstitutionen beziehen.
Die Resultate, die in Tabelle 3 zusammengefasst sind, zeigen an, dass es die längeren Peptide (40-mer > 28-mer > 14-mer > 11-mer > 6-mer) sind, die die Sequenz YPQGNH enthalten, die am stärksten sind. Das längste nicht wiederholende stärkste geprüfte Peptid ist das 14-mer AQPYPQGNHEASYG, d. h., es hat den niedrigsten K_1/2, 0.126 μM. Beachte die Aussetzung der Zellen für 5 Minuten dem Glycosaminoglycan, Keratinsulfat (2 μg/ml) vor Hinzufügung des Peptids, erhöht die Stärke (K_1/2 = 0.067 μM). Heparin (1 μg/ml) ist sogar wirkungsvoller (0.040 μM). In den Ratten-studien war das 14-mer auch wirkungsvoll bei der Erhöhung des Überlebens der Ratten, in denen ARF durch Quecksilber-Chlorid verursacht wurde. Das 14-mer mit Serin in Position 12 war wirkungsvoller als das 11-mer mit Glutamin-Säure in Position 6.
Die Länge des 14-mer AQPYPQGNHEASYG erregte Interesse über die dreidimensionale Struktur des Peptids. Kreisförmiger Dichroismus wurde durchgeführt und ein Spektrum aufgedeckt, das mit einer Beta-Faltblattstrubetur überinstimmend ist.
Es ist von Interesse, dass die Kraft des 11-mer Peptids AQPYPQGNHEA (native WGF Sequenz) ähnlich dem des synthetischen Hexapeptid YPEGNH (K_1/2 = ~0.3 μM) ist, das einen einzelnen Austausch hat: Glutamin-Säure (E), die das native Glutamin (Q) ersetzt. Einige in hohem Grade konservative Änderungen der 6-mer Sequenz ergeben drastische Verringerungen der Stärke: Ersatz des Rests Tyrosins (Y) mit Phenylalanin (F), Ersatz von Asparagin (N) mit Asparaginsäure (D) oder Lysin (K), oder Amidierung des Carboxy-Terminus.
Der Beweis, der Hypothese dass das WGF und seine Peptide ihre mitogenische Effekten über einen Zell-Oberflächen Rezeptormechanismus zeigen, wurde erreicht, indem man zeigte, dass das pentamerische Peptid, dem eine Aminosäure an jedem Terminus des Hexapeptids YPQGNH fehlte, den proliferative Effekt des intakten Hexamer blockierte. In diesen Studien wurden die Pentamere, PQGNH oder YPQGN synthetisiert, gereinigt durch HPLC und auf wachtumsfördernde Aktivität geprüft. Keins war mitogenisch. Als jedes Pentamer dem Zellkulturmedium hinzugefügt wurde, blockierte es die Kapazität des Hexamer YPQGNH, das gleichzeitig oder danach hinzugefügt wurde, um Zell-Wachstum anzuregen. Diese Beobachtungen schlagen vor, dass die Pentamere und das Hexapeptid um die gleiche Bindungsstelle/Rezeptor auf der Plasmamembran konkurrieren. Weil die Pentamere nicht mitogenisch sind, wenn sie an der Stelle binden, wird Wachstum nicht beobachtet. Nachdem Pentamere an die Stelle gebunden sind, scheinen die Pentamere, dem Hexapeptid den Zutritt zur Membran nicht zu ermöglichen.
Ein zusätzlicher Beweis, dass die Hexapeptide YPQGNH oder YPEGNH eine hohe Stärke für Nierenepithelzellen haben, wurde erhalten, indem man die Zeit definierte, die für Interaktion zwischen Peptid und Zellen erfordert wird für die irreversibel Verpflichtung zur beschleunigten starken Vermehrung. In diesen Experimenten wurde eine Lösung, die das Peptid des Interesses enthält, dem Zell-Monolayer hinzugefügt; Kulturmedium wurde dann zu einer spezifizierten Zeit danach angesogen. Dann wurde frisches Medium ohne das Peptid hinzugefügt und die Zellzahl wurde vier Tage später gezählt. Kontakt der Zellen mit dem Peptid YPQGNH für 2 Minuten ergab maximale wachtumsfördernde Aktivität, während das Peptid vollständig von den Zellen zu den früheren Zeiten weg gewaschen werden konnte (0.5, 1, oder 1.5 Minuten) ohne Wachstum zu stimulieren. Als die Zellen Keratinsulfat ausgesetzt wurden (2 μg/ml) für 5 Minuten, bevor das Peptid addiert wurde, war nur 1 Minute Aussetzung notwendig, um den maximalen mitogenischen Effekt zu beobachten. Ähnliche Resultate wurden erreicht, wenn das Peptid YPEGNH gestestet wurde; 3 Minuten Belichtung waren genügend, um eine maximale Wachstumsantwort zu erhalten, aber nur 1.5 Minuten, als die Zellen mit Keratinsulfat vorbehandelt wurden. So erhöht Keratinsulfat die mitogenische Stärke nicht nur des nativen WGF Proteins sondern auch der WGF-abgeleiteten Peptide.
Eine Suche in den sieben Proteinsequenz-Datenbanken (Blaster) bearbeitet von NCBI deckte auf, dass die NH₂-terminale Sequenz von WGF neuartig ist und begrenzte Homologie zu zwei bekannten mitogenischen Proteinen hat, Gastrin-freisetzendes Peptid (GRP) und Bombesin, wie unten gezeigt unter Verwendung der erste Aminosäure des NH₂-Terminus als Position eins:
Symbole für Aminosäuren in der Fettschrift stellen Identitäten zwischen unterschiedlichen Proteinen dar.
Das Alignment zwischen den 14 Aminosäuren des NH₂-Terminus von WGF und dem Bombesin Molekül ist auf die aufeinander folgenden GN Reste begrenzt (Aminosäuren #7, 8 im aktiven 14 Aminosäure Peptid von WGF; #5, 6 im Bombesin), und ein A Rest (Aminosäure #11 in WGF; #9 im Bombesin). Vorhergehende Berichte (Broccardo, et al. 1975; und Heimbrook et al., 1988) zeigen, dass die sieben COOH-terminalen Aminosäuren von Bombesin und des GRP (WAVGHLM-Amid) identisch sind, und ebenfalls der Lokus der mitogenischen Aktivität in diesen zwei Proteinen. Ein synthetisches Peptid, das diese Sequenz von Aminosäuren enthält, ist für BSC-1 Zellen mitogenisch, aber sein K_1/2 ist ~10 μM. Wichtig ist, dass die mitogenische Sequenz dieser sieben COOH-terminalen Aminosäuren nicht in den mitogenischen 16 Aminosäuren des NH₂-Terminus von WGF gefunden wird.
Die Funktionsunterschiede zwischen WGF und anderen bekannten Sequenzen schließen ein, dass das Hexapeptid YPQGNH für Nierenepithelzellen mitogenisch ist, während das GRP-abgeleitete Hexapeptid YPRGNH höchstens mitogenische Restaktivität (die 10% Anregung) für Nierenepithelzellen hat und nicht berichtet wird, dass es für mitogenische Anregung der Fibroblasten notwendig sei.
Es ist von Interesse, dass das mitogenische Hexapeptid, abgeleitet vom NH₂-Terminus von WGF, YPQGNH (Aminosäuren #4 bis 9 in der WGF Sequenz), sich in nur einer einzelnen Aminosäure (Q → R) von einer Hexapeptid Sequenz in menschlichem und schweineartigem GRP, YPRGNH (Aminosäuren #15 bis 20), eine Domäne, die nicht bekannt ist mitogenisch zu sein (Heimbrook et al., 1988), unterscheidet. Es gibt keinen vorherigen Vorschlag, einem Aminosäureaustausch an dieser Position zu machen, um mitogenische Aktivität in WGF zu erhalten.
Diese Resultate zeigen dass das WGF-abgeleitete Hexapeptid, YPQGNH, ein neuartiges Mitogen für Nierenepithelzellen ist.
Ersatz des Tyrosins durch Cystein in WGF-Abgeleitetem Hexapeptid konserviert die Mitogenische Aktivität
Das kürzeste synthetische Peptid mit mitogenischer Aktivität wurde zuerst gefunden, die Sequenz NH₂-Tyrosin-Prolin-Glutamin-Glycin-Asparagin-Histidin-COOH (YPQGNH) zu haben. Dieses Hexapeptid stellt Aminosäuren in Positionen #4 bis #9 des Amino-Terminus von WGF dar. Die Aminosäure, die in Position #4 von jedem der zwei WGF-Isoformen identifiziert wurden, indem sie mikrosequenziert wurden, könnte entweder ein Cystin (C) oder ein Tyrosin (Y) Rest sein.
Die Halb-maximale Konzentration (K_1/2) an dem das YPQGNH Peptid seinen Wachstumstimulierenden Effekt zeigt, ist 0.35 μM (Tabelle 3). Ein anderes synthetisches Hexamer (YPEGNH), in welchem Glutamin-Säure (E) für das Glutamin (Q in nativem WGF ersetzt wurde, war etwas stärker; sein K_1/2 ist 0.30 μM. Um festzustellen, ob Cystin Tyrosin im mitogenischen Peptid ersetzen könnte, wurde das Hexapeptid CPEGNH synthetisiert. Dieses Cystein -enthaltene Peptid war in der Tat mitogenisch, und seine Kraft (K_1/2) war gleich der des Tyrosin -enthaltenen Peptids. Unterstützung für die Behauptung, dass die Aminosäure in dieser Position entweder ein Tyrosin oder Cystin für maximale wachtumsfördernde Aktivität sein kann, wurde erreicht, indem man die Resultate zweier zusätzlicher Experimente analysierte. Im ersten Experiment wurde ein hexamerisches Peptid, das einen Phosphotyrosin (P_i-Y) Rest enthält mit dem Sequenz P_i-YPQGNH synthetisiert. Im zweiten Experiment wurde ein Peptid, in dem Phenylalanin (F) den Tyrosin-Rest ersetzte, synthetisiert, um FPEGNH herzustellen. Wichtig ist, dass der K_1/2 für P_i-YPQGNH dem für YPQGNH (0.35 μM) ähnlich war, während der Austausch des Tyrosins mit Phenylalanin die mitogenische Stärke des Peptids über 9-fach verringerte (K_1/2 für FPEGNH = 2.75 μM; K_1/2 für YPEGNH = 0.30 μM). So ist die mitogenische Aktivität des Peptids nicht erheblich beeinträchtigt, wenn die Hydroxylgruppe des Tyrosins phosphoryliert ist, aber wird drastisch verringert, wenn die Hydroxylgruppe abwesend ist (Phenylalanin für Tyrosin).
Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass eine Sulfhydryl- oder Hydroxyl-gruppe eher als ein Benzolring des Tyrosins im Aminosäurerest dem Hexapeptid Mitogenität vermittelt. Diese Analyse sagt voraus, dass der Ersatz des Tyrosins oder Cysteins mit dem Hydroxyl-Enthaltenen, natürlich vorkommenden Aminosäuren Serin oder Threonin auch wachtumsfördernde Hexapeptide ergeben könnte.
Zusammenfassend ein Tyrosin- oder Cystin- Rest in der hexamerischen Kassette (Y/CPQGNH) der WGF-abgeleiteten synthetischen Peptide der unterschiedlichen Längen (z. B., 6 bis 40 Reste) wie hierin beschrieben, kann die mitogenische Funktion in den Nierenepithelzellen unterstützen. Synthetische Peptide, die mitotische Aktivität in einer gleichwertigen Position erhöhen, enthaltend irgendeine dieser zwei Aminosäuren, oder andere (Tabelle 2), werden hergestellt und verwendet, um das Überleben zu verbessern und Funktionswiederaufnahme nach akutem Nierenversagen zu beschleunigen.
Weitere Kennzeichnung der Mitogenischen Peptide abgeleitet vom NH₂-Terminus des Wundwachstum-Faktors
Wie in den vorhergehenden Abschnitten besprochen, deckte die Reinigung des Wundwachstum-Faktors (WGF) aus konditioniertem Medium der durch reiben-verletzten Epithelzellen der Affenniere (BSC-1 Linie) zwei mitogenische Proteine, 22 kDa und 45 kDa, in der Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) auf. Microsequezieren des NH₂-Terminus dieser Proteine zeigte, dass sie Isoformen sein können, weil die ersten 10 Aminosäuren von jedem identisch waren. Eine Gesamtmenge von 16 Aminosäuren wurden am NH₂-Terminus der 22 kDa Isoformen gekennzeichnet, und 14 für die 45 kDa Isoform. Jedoch wurde für die 45 kDa Isoform die Aminosäure an Position 11 nicht gekennzeichnet, und an Position 12, waren Alanin oder Serin gleichwertige Kennzeichnungen.
Peptide der verschiedenen Längen sind innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung, so lang wie die mitogenische Hexamer Sequenz, NH₂-Tyrosin-Prolin-Glutamin-Glycin-Asparagin-Histidin-COOH (YPQGNH) enthalten ist.
Aminosäureaustausche wurden im Amino-Terminus des nativen WGF gekennzeichnet, die die wachtumsfördernde Aktivität des Peptids für die Verwendung in den Wirksamkeits-Studien für die Behandlung des akuten Nierenversagens in einem Rattenmodell dieses Syndroms maximieren konnten. Die Strategie war chemisch verschiedene Peptide zu entwerfen und dann zu synthetisieren, indem strukturell in Verbindung stehende Aminosäuren für die ersetzte wurden, die in der nativen WGF Sequenz gefunden wurden.
Das Peptid von Interesse wurde dann auf einer C₁₈-gegenphasischen-HPLC-Säule mit einem Gradicnten von Acetonitril 1–80% in 0.1% Trifluoroacetic Säure (TFA) gereinigt. Das gereinigte Peptid wurde dann lyophilisiert, um das Acetonitril und TFA zu entfernen und das lyophilisierte Puder wurden gewogen, aufgelöst im Puffer und dem Gewebekulturmittel hinzugefügt, um seinen Effekt auf Wachstum der Affennieren-Epithelzellen zu messen.
Um die relative Potenz der unterschiedlichen Peptide zu vergleichen wurden, nur jene Moleküle, die das Wachstum maximal nach 4 Tagen in der Kultur um 25–30% anregten, weiter durch das Definieren ihrer Konzentration Abhängigkeit analysiert. Ein Wert, der als K_1/2 benannt wurde, wurde verwendet. Diese Bezeichnung wird hierin definiert als die Peptidkonzentration in Mikromole (μM) an dem der wachstumsfördernde Effekt die Hälfte beträgt verglichen mit der Konzentration, an der maximale Vermehrung beobachtet wird. Je niedriger der Wert, desto grösser die mitogenische Stärke des Peptids.
Tabelle 3 zeigt an, dass das 14-Aminosäure Peptid AQPYPQGNHEASYG mit einem Serinrest in Position 12 (14-Ser) (K_1/2 = 0.126 μM) ein stärkeres Mitogen ist als AQPYPQGNHEAAYG, das einen Alanin-Rest an dieser Position hat (K_1/2 = 0.199 μM). Als das Glycosaminoglycan Keratinsulfat bei einer Konzentration von 10 μg/ml hinzugefügt wurde, wurde die mitogenische Stärke erhöht, weil der K_1/2 zu 0.067 μM fiel. Zusätzlich war das Glycosaminoglycan Heparin, bei einer Konzentration von 1 μg/ml hinzugefügt sogar wirkungsvoller und verringerte den K_1/2 auf 0.040 μM. Bei den optimalen Konzentrationen eingesetzt in diesen Experimenten, wurde den Zellen ein molekulares Verhältnis von 1 Peptidmolekül : 1 Glycosaminoglycan (GAG) Molekül entweder mit Keratinsulfat oder Heparin hinzugefügt. Der stimulierende Effekt von Glycosaminoglycanen wurde durch Bildung eines Peptid-GAG Komplexes über IOnenbindungen (kationisches Histidin des Peptids zum anionischen Sulfat des GAG) oder durch Wasserstoffbindungen vermittelt (Hydroxylgruppen des Serin/Tyrosin des Peptids zum Sauerstoffrest des GAG-Kohlenhydrats). Der Peptid-GAG Komplex könnte stabilisieren/erleichtern die Bindung des Peptids zu seinem Rezeptor auf der Zell-Oberfläche, wie vorgeschlagen worden ist, um den erhöhten mitogenischen Effekt des säurehaltigen Fibroblasten-Wachstumfaktors (FGF-1) mit Heparin zu erklären, der mit verschiedenen Arten der Zellen beobachtet worden ist. Das Ersetzen eines Restes des Glutamins (Q) in Position 6 mit einem Rest der Glutamin-Säure (E) änderte nicht die mitogenische Kraft des Peptids 14-Ser (K_1/2 = 0.128 μM), obgleich diese Austauschstrategie den K_1/2 für das 6-Aminosäure Peptid YPQGNH (K_1/2 = 0.352 bis 0.301 μM), und für das 11-Aminosäure Peptid AQPYPQGNHEA (K_1/2 = 0.260 bis 0.206 μM) verringerte.
Kürzere Peptide von 11 Aminosäuren in der Länge wie AQPYPQGNHEA (K_1/2 = 0.260 μM), und 6 Aminosäuren, YPQGNH (K_1/2 = 0.332 μM) jedes ohne die SYG terminalen Aminosäuren des 14-Aminosäuren Peptids AQPYPQGNHEASYG (K_1/2 = 0.126 μM) sind als Mitogene weniger stark. Um festzustellen, ob ein 11 Aminosäure Peptid, enthaltend diese SYG Sequenz, für maximale Mitogenese erforderlich ist, wurde ein Peptid mit der Sequenz YPQGNHEASYG synthetisiert, gereinigt, und dann auf Aktivität geprüft. Interessanterweise war sein K_1/2 0.166 μM in Abwesenheit oder beim Vorhandensein des Heparins, was zeigt, dass die volle 14 Aminosäurelänge für den maximalen mitogenische Effekt erforderlich war.
Um zu bestimmen, ob das Verlängern des 14-Ser Peptids die mitogenische Stärke erhöhen würde, wurde ein Dimer des Peptids, mit der Sequenz AQPYPQGNHEASYGAQPYPQGNHEASYG (28-mer) synthetisiert, gereinigt, und auf wachtumsfördernde Aktivität geprüft. Der K_1/2 des 28-mer war 0.067 μM, was zeigt es hat zweimal die Stärke von 14-Ser dessen K_1/2 0.126 μM war (Tabelle 3). Zunehmende Peptidlänge ist nicht der einzige Möglichkeit um mitogenische Stärke zu erhöhen, weil der K_1/2 von 14-Ser in Anwesenheit des Glycosaminoglycan Keratinsulfats (0.067 μM) (Tabelle 3) identisch zum K_1/2 des 28-mer ist.
Ein Peptid synthetisiert mit der längsten bekannten WGF Sequenz, die 16-Aminosäuren der 22 kDa Isoform, AQPYPQGNHEATSSSF, wurde auch auf seine mitogenische Aktivität geprüft (K_1/2 = 0.218 μM). Es war nicht so stark wie das 14-Aminosäure Peptid AQPYPQGNHEASYG, das vom NH₂-Terminus des 45 kDa Isoform abgeleitet wurde (Tabelle 3).
Schließlich wurde ein 40-Aminosäure Peptid synthetisiert. Es ist ein Tetramer der ersten 10 Aminosäuren, welche in den 22 kDa und 45 kDa Isoformen von WGF identisch sind. Dieses ist das stärkste bisher identifizierte WGF Peptid mit, einem K_1/2 = 0.012 μM. Die erhöhte mitogenische Stärke hängt wahrscheinlich mit seiner verhältnismäßig großen Länge zusammen, die die Ligand-Bindung, am Zell-Oberflächen Rezeptor durch die Ionen- oder hydrophoben Interaktionen, und/oder Wasserstoffbindungen stabilisieren könnte. Es könnte das wirkungsvollste WGF-abgeleitete Peptid unter klinischen Bedingungen wegen seiner großen Potenz sein. Das Hinzufügung des Heparins verringert den K_1/2 des 40-mer auf 0.0051 μM, wodurch dieses das stärkste WGF-abgeleitete Peptid ist, das bisher identifiziert wurde.
Das 14- Aminosäure Peptid (14-Ser) wurde, wegen seiner hohen mitogenischen Kraft und verhältnismäßig kurzen Länge für die Verwendung bei der Behandlung der Ratten mit Quecksilber-Chlorid-verursachtem akutem Nierenversagen gewählt.
Ein Antikörper zu den Peptiden abgeleitet von WGF
Die 11 Aminosäuren des NH₂-Terminus von WGF wurden benutzt, um zwei unterschiedliche konjugierte Peptidantigene vorzubereiten. Eins war das MAPS-Protein, das oben beschrieben wurde, in welchem das 11-mer Peptid zu einem verzweigten Polylysin-Rückgrat verbunden wurde, und das andere war ein Konjugat, in dem das 11-mer Peptid zum Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) verbunden wurde. Das MAPS-Protein und das KLH-Konjugat wurden verwendet, um Kaninchen, Hühner, und ein Schaf zu immunisieren. Der Antikörper, der aus diesen Strategien resultiert, dient dazu natives WGF Protein im Urin, Serum, und Gewebe bei Patienten mit akuten oder chronischen Nierenkrankheiten und Nierenzellen-Krebs zu ermitteln. Es könnte auch verwendet werden, um einen DNA Klon zu erhalten, der WGF kodiert, indem man Immunoscreening in einer Nierenepithelzell-DNA-Bibliothek in Lambda gt11 durchführt.
Ein Mangel an Immunisierungsfähigkeit des Peptids würde dessen klinische Nützlichkeit bei der Behandlung von Nierenkrankheiten wie dem akutem Nierenversagen erhöhen.
Produktion von WGF durch rekombinante genetische Methoden
Ein passender Vektor, um WGF von einer Nukleinsäuresequenz zu exprimieren, die einen Voll-Längen Klon kodiert, hängt zum Teil davon ab, ob Glykosilierung des Proteins für jede seiner biologischen Effekte notwendig ist. Wenn WGF nicht glykosyliert ist, kann ein bakterielles Expressions-System verwendet werden. Wenn die Zuckerreste für die volle Aktivität erforderlich sind, wäre ein Säugetier-Expressions-System wie das Chinesische Hamster Ovar-Zellen (CHO) angebrachter.
Weil in der Tat ein Hexamer des Amino-Terminus des synthetischen 14-mer Peptids mitogenische ist, scheint es, dass Glykosilierung des Proteins nicht für mitogenische Aktivität erforderlich ist. Jedoch könnte Glykosilierung ein wichtiger bestimmender Faktor für die Modulierung des in vivo Umsatz (Halbwertzeit) des Proteins sein. Dieses ist der Fall für z. B., Erythropoietin.
Eine Nukleotid-Sequenz Kodierend für mindestens das mitogenische Hexamer wird vorbereitet, verbunden mit verwendbaren regulatorischen Elementen, und mit einem Expressions-Vektor verbunden. Eine Wirtszelle wird mit dem Vektor transformiert, und der Wirt wird in unter Bedingungen plaziert, die für die Expression erforderlich sind. Nach Expression des WGF Gens oder Teilen der Nukleotid-Sequenz in einem rekombinanten Wirt, wird das rekombinante Protein aus dem Kulturmedium isoliert, indem man eine Antikörper-Affinitäts Säule verwendet, vorbereitet indem man einen Antikörper zu WGF an eine passende Matrix konjugiert. Diese vorbereitende Strategie sollte große Quantitäten des rekombinante Proteins erbringen.
Alternativ und einfacher, können Mengen des NH₂-Terminalen 14-Ser, des 11 Aminosäure Peptids, des Hexapeptids Y/CPQGNH, oder anderer Peptide, die ähnliche mitogenische Kraft haben durch normale Peptidsynthese hergestellt werden. Die mitogenische Kraft der Peptide, die durch die rekombinante oder chemisch synthetische Verfahren hergestellt werden, kann bestimmt werden, indem man die Kapazität eines Aliquots des Produktes mißt, das Wachstum der BSC-1 Zellen anzuregen. Die erwartete Antwort ist eine 20 bis 35% Zunahme der Zellzahl nach 4 Tagen in den konfluenten Kulturen vergleichen mit Kontrollkulturen.
Die ausführlichen Techniken, um WGF durch rekombinante Systeme zu produzieren, sind bekannt.
In-vitro und In-vivo Modelle
In-vitro und in-vivo Modelle des akuten Nierenversagens sind nützlich, um zwei biologische Haupteigenschaften der Wundreparatur zu studieren: Zell-Migration und -Vermehrung. Diese Modelle sind für das Analysieren der Effekte von WGF oder dessen Peptide der vorliegenden Erfindung verwendbar.
i. In-vitro Modell: durch Reiben-Verletzte Monolayer-Kulturen der Nierenepithelzellen, um verletztes röhrenförmiges Nierenepithel zu simulieren.
In diesem Modell, werden high-density, bewegungslose Affennieren-Epithel-Monolayer-Kulturen (BSC-1 Linie) verwundet, indem man mechanisch definierte Regionen des Monolayers weg reibt, um den Effekt des Zell-Verlustes nach röhrenförmiger Nekrose zu simulieren. Die Zahl der Zellen, die in den entblößten Bereich abwandern, wird gezählt (Kartha und Toback, 1992). Es wurde gefunden, dass Zell-Migration unabhängig von der Zell-Vermehrung ist, obgleich beide Prozesse in dieser experimentellen Preparation studiert werden können.
Das Modell ist nützlich, um die Kinetik der Nierenepithelzell-Migration zu studieren, und um Gene zu identifizieren deren Expression induziert oder unterdrückt wird. Die biologischen Eigenschaften und die Stärke des WGF sind für Untersuchungen mit diesem System geeignet.
ii. In vivo Modell: Quecksilber-Chlorid (nephrotoxische) und Arterie-festklemmende (ischämische) Nierenmodelle des akuten Nierenversagens (ARF) in der Ratte.
Die vorhergehenden Studien, die dieses Modell-System verwenden, haben die klinischen, histologischen, und biochemischen Funktionen des ARF Syndroms gekennzeichnet. Es wurde demonstriert, dass Infusion einer Mischung der wesentlichen und unwesentlichen Aminosäuren die Synthese des Phosphatidylcholins und des Proteins im erneuernden Ratten-Nierengewebe anregt und das Level der Nierenfunktionsstörung nach intravenöser Verabreichung von Quecksilber-Chlorid verringert (Toback, 1980). Diese Studien zeigten, dass biochemische und Funktionsreparatur der verletzten Niere in unbehandelten Tieren nicht optimal sind und dass die Bereitstellung von exogenen Aminosäuren mit Glukose die Wiederherstellung beschleunigen könnte. Die Kapazität des WGF, die Regeneration nach ARF zu erhöhen, wird in den nephrotoxischen und ischämischen Modellen von menschlichem ARF studiert.
Es ist wichtig, den Beginn der abnormalen Nierenfunktion und -struktur, seinen Verlauf, und die folgende Wiederherstellung zu definieren. In den Menschen wie in den Ratten wird die Nierenfunktion während ARF durch Messungen der Konzentration des Serumkreatinin- und Blutharnstoffstickstoffes (BUN) auf einer täglichen Basis überwacht. Diese Maße liefern Schätzungen der knäuelförmigen Filtration in der Niere, die eine seiner Hauptfunktionen ist. Kreatinin kommt vom Muskel in das Serum, in dem es ständig als Folge des metabolischen Umsatzes des Kreatinphosphats freigegeben wird, während der BUN dann Endprodukt des Gesamtkörperproteinumsatzes ist. Beide Moleküle machen ihren Weg in das Blut und wegen ihrer kleinen Größe werden sie im Urin ausgeschieden. So liefert der Umfang, in dem sie sich im Blut ansammeln und nicht bei ARF ausgeschieden werden, einen Hinweis auf den Umfang einer Nierenverletzung. Eine bedeutende Wiederherstellung der Nierenfunktion wird durch eine Verringerung der Serumkreatinin Konzentration angezeigt.
Behandlung der chronischen Nierenkrankheiten
Die Mechanismen, die die Weiterentwicklung der Nierenkrankheit bei zuckerkranken Nierenleiden, interstitaler Nephritis, und chronischer Glomerulonephritis vermitteln sind unbekannt. Unnachgiebiger Verlust der Nierenfunktion ergibt die Notwendigkeit der chronischen Dialysebehandlung, welche Kosten von Milliarden Dollar jedes Jahr in den Vereinigten Staaten verursachen, weil es zur Zeit keine therapeutische Strategie gibt, den Prozeß zu verlangsamen oder umzukehren. Patienten im frühen Verlauf der Nierenkrankheit sind geeignete Anwärter für Wachstumfaktortherapie, weil keine andere Alternative zur Behandlung bis jetzt vorhanden ist. Die Zielsetzung der Verabreichung von WGF ist, die Wiederherstellung der verletzten Nierenepithelzellen entlang dem Nephron zu beschleunigen, welches dadurch die Beschädigung repariert, die durch den Krankheitprozeß vermittelt wird, die Nierenfunktion konserviert, und die Notwendigkeit der Dialyse entfallen läßt.
Behandlung des Nierenzell-Krebses
Nierenzell-Krebs ist häufig ein Zustand langsamen Wachsens, der in weitverbreitete Metastasen an den entfernten Orten im Körper resultiert, wodurch die erfolgreiche Behandlung schwierig ist. Die Studien, die radioaktives WGF verwenden, ermöglichen einen Rezeptoren auf Nierenzellen zu identifizieren und zu lokalisieren; Antikörper gegen den Rezeptor werden dann hergestellt. Diese Antikörper dienen, Rezeptoren auf spezifischen Arten der Nierenzellen entlang dem Nephron zu lokalisieren. Bewaffnet mit diesen Informationen über die Zell-Typ Spezifität der WGF Rezeptoren, können Strategien zur Behandlung des Krebes des jeweiligen Nierenzell-Typs verwendet werden, die WGF oder ein spezifisches WGF Peptid einschließend, das eine Bindung zum Rezeptor zeigt und dadurch verwendet werden kann, ein krebsbekämpfendes Mittel an die stark vermehrenden Zellen zu liefern. Solche krebsbekämpfenden Mittel anfassen WGF oder ein spezifisches WGF Peptid oder Peptide, die zu einem Giftstoff, zytolytischen Antikörper, oder einem Radioisotop konjugiert werden. Obgleich die Behandlung des Primärnierentumors wahrscheinlich durch chirurgisches Abtrennen des Organs durchgeführt wird, ist die Behandlung von Krebs-Metastasen, besonders die der kleinen Größe, ein wichtiges Ziel dieser neuartigen chemotherapeutischen Mittel, die mit Wissen der WGF Struktur und der Funktion formuliert werden können.
Verabreichung von WGF an die Patienten
Verabreichung an die Patienten ist im Allgemeinen durch die intravenöse Infusion, ähnlich der Krebschemotherapie oder der experimentellen Behandlung der kleinen Säugetiere. Ein anderer Weg ist der, der für Behandlung der Anämie mit Erythropoietin (EPO) bei Nierenausfall verwendet wird, wobei EPO alle paar Tage durch subkutane Einspritzung verabreicht wird.
Z. B., eine typische Dosis des 14-Ser Peptids für einen 70-kg Patienten mit ARF würde ungefähr 35 mg (100 μg pro 200 g Körpergewicht) sein, verabreicht durch langsame intravenöse Infusion.
Diagnose der Nierenzell-Verletzung mittels eines Antikörper gegen WGF
Der Antikörper zu nativem WGF wird hergestellt, wie hierin beschrieben und verwendet, um die Konzentration des Wachstumsfaktors im Urin und im Blut festzustellen. Die Verteilung von WGF in den unterschiedlichen Typen der Nierenzellen entlang dem Nephron wird festgestellt. Die Konzentration des Wachstumsfaktors entweder im Blut oder Urin oder beiden könnte sich resultierend aus der Nierenverletzung erhöhen. Wenn der Wachstumsfaktor im Urin ausgeschieden wird, wie der epidermiale Wachstumsfaktor, kann es möglich sein, festzustellen, ob Nierenverletzung zu erhöhten Urin-Ausscheidung der neuen Faktoren führt. Wenn dies so ist, so können ELISA-Kits zum Nachweis von WGF benutzt werden, um Nierenverletzung frühzeitig vor einem Ausfall der glomerularen Filtrationsrate schnell zu bestimmen, die mit herkömmlichen Laborversuchen nicht nachweisbar sind, bis mehr als 50% der Nierenfunktion verloren sind. Dieses ist bei den Patienten besonders wertvoll, die Arzneimittel mit nephrotoxischem Potential während der Behandlung von schweren Infektionen oder Krebs erhalten. Ein Antikörper zu WGF wird in einen Diagnose-ELISA Kit eingegliedert, der entworfen wurde, um das Auftreten des Wachstumsfaktors im Blut und Urin der Patienten mit Nierenverletzung oder Neoplasia zu ermitteln.
Abfragung des Nierenkrebses bei chronischen Hämodialysepatienten
Wenn Nierenadenome, Zystadenome, oder Karzinome, die in den Restnieren der Patienten auftreten, die chronische Hämodialyse durchmachen, gefunden werden die den Wachstumsfaktor überexprimiern und ihn im Urin ausscheiden, könnte ein ELISA Kit ein neues frühe Abfrage-System für diese Verletzungen zur Verfügung stellen. Solch ein Diagnose-Kit könnte auch in den asymptomatischen aber zur Hochrisiko-Gruppe zählenden Einzelpersonen benutzt werden. Nierenkrebs ist jetzt schwierig, früh zu ermitteln, weil er dazu neigt, asymptomatisch zu sein, bis der Tumor zu einer bedeutenden Größe gewachsen oder weit metastasiziernd ist.
Manipulationen des Wachstums-Faktors, Struktur und Funktionen
Analoge des Wachstumsfaktors werden entwickelt, um den wachtumsfördernden Effekt von WGF zu maximieren, indem man die spezifische Bindung zu den Nierenepithelzell-Rezeptoren optimiert. Inhibitoren, die die biologische Aktivität jedes Faktors blockieren, indem sie zu den Rezeptoren auf der Zell-Oberfläche binden, sind ebenfalls nützlich. Solche Inhibitoren schliessen die Pentapeptide wie YPQGN und PQGNH ein. Die Entwicklung eines synthetischen oder rekombinanten Produktes, das gegen den Abbau beständig ist, würde die pharmakologische Aktivität in vivo ausdehnen.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele werden zur näheren Beschreibung zur Verfügung gestellt, und sind nicht als Beschränkung zu verstehen.
Beispiel 1: 14-Ser Peptid ist bei der Behandlung des nephrotoxischen akuten Nierenversagens wirkungsvoll
Das nephrotoxische und ischämische akute Nierenversagen (ARF) experimentell verursacht in den Ratten ist schon lange verwendet worden, um dieses Syndrom im Menschen zu modellieren. Um festzustellen, ob der mitogenische Effekt von 14-Ser, einem WGF-abgeleitetem NH₂-Terminalen Peptid, wirkungsvoll als therapeutisches Mittel in den Tieren mit ARF sein würde, wurde akute röhrenförmige Nekrose durch subkutanes Verabreichen einer Lösung von Quecksilber-Chlorid (in normaler Salzlösung) in Ratten mit einer Dosis von 2.25 mg pro kg Körpergewicht verursacht. Männliche Ratten wogen 200–225 mg am Anfang des Experimentes. Diese Dosis wurde benutzt, weil einleitende Experimente anzeigten, dass sie ein Überleben von 25–50% der Tiere 7 Tage später ergab. Blut wurde jeden Tag aus dem Schwanz erhalten und die Konzentration des Kreatinins im Serum wurde gemessen und als Index der Nierenfunktion verwendet. Eine Zunahme der Serumkreatinin-Konzentration signalisiert eine Abnahme der Nierenfunktion, weil die verletzte Niere nicht imstande ist, endogenes Kreatinin im Urin auszuscheiden, so dass es sich im Blut ansammelt.
Das synthetische Peptid AQPYPQGNHEASYS (14-Ser) (aufgelöst in sterilem 0.01% Rinderserumalbumin in phosphatgepufferter Salzlösung) wurde subkutan in Ratten eingespritzt, um dessen Effekt auf das Überleben, die Wiederherstellung der Nierenfunktion, und die Anregung der DNA Synthese festzustellen. Mehrere unterschiedliche Peptide wurden studiert, einschließlich 14-Ser, AQPYPEGNHEASYG (14-mer), AQPYPQGNHEATSSSF (16-mer), AQPYPQGNHEA (11-mer), und AQPYPEGNHEA (11-mer). Unterschiedliche Konzentrationen und Zeiten der Verabreichung wurden geprüft und verglichen. Die Resultate zeigten an, dass 14-Ser das wirkungsvollste WGF-abgeleitete Peptid war; es verbesserte das Überleben und die Wiederherstellung der Nierenfunktion nach Quecksilber-Chlorid verursachtem ARF.
Akute röhrenförmige Nekrose wurde in 44 Ratten durch das subkutane (s. c.) Einspritzen des Quecksilber-Chlorids verursacht, und eine einzelne Dosis von 14-Ser wurde 1 Stunde danach s. c. verabreicht. Unterschiedliche Mengen des Peptids wurden gegeben, um seine Kapazität zu bestimmen, das Resultat zu beeinflussen. Das Überleben war 7 Tage später ungefähr zweimal so hoch in den Tieren, denen 100–150 μg des Peptids gegeben wurde (63%) als in den Ratten, denen 0–75 μg Peptid gegeben wurde (29%) (chi-squared, p = 0.015).
Um den Effekt des Peptids auf das Überleben und die Wiederherstellung der Nierenfunktion festzustellen, wurde akute röhrenförmige Nekrose in 59 Ratten verursacht; 29 empfingen 14-Ser (100 μg/Ratte) und 30 empfingen ein gleiches Volumen des Trägers s. c. 1 Stunde nach Verabreichung des Quecksilber-Chlorids. Erhöhtes Überleben (2A) und Nierenfunktions-Wiederherstellung (2B) der Ratten denen ein WGF-abgeleitetes Peptid, nach Quecksilber-Chlorid-verursachter akuter röhrenförmiger Nekrose gegeben wurden, ist gezeigt. Quecksilber-Chlorid wurde subkutan in jede der 59 Ratten eingespritzt, und 1 Stunde später ein 100 μg des WGF Peptids (14-Ser) (n = 29 Ratten) oder der Träger (n = 30) wurde gegeben. Das Überleben war in den Ratten grösser, die das Peptid erhielten als in den Tieren, die den Träger schon am Tag 3 nach Verabreichung den Quecksilber-Chlorids bekamen. Blut wurde aus dem Schwanz an den angezeigten Tagen erhalten, und die Serumkreatinin-Konzentration wurde gemessen. Eine ähnliche Zunahme der Kreatinin-Konzentration wurde bei beiden Gruppen Tiere an Tag 1 beobachtet, was bedeuten, dass sie den gleichen Umfang einer Nierenfunktionsverletzung erhielten. An den Tagen 2, 3 und 4, zeigt die niedrigere Kreatinin-Konzentration in Peptid-behandelten Ratten eine beschleunigte Wiederherstellung der Nierenfunktion an.
2A zeigt an, dass das Überleben der Ratten, denen das Peptid gegeben wurden, erheblich grösser war (chi-squared, p = 0.035) als bei denen die dem Träger 3 Tage nach dem Beginn des ARF Syndroms erhielten. Ein Unterschied, der während der folgenden 4 Tage fortbestand. Am Tag 7 waren nur 20% der Ratten, die den Träger empfingen, lebendig, während 48% von den Ratten, deren das Peptid gegeben wurde, überlebten (chi-squared, p = 0.012).
Die Einschätzung der Nierenfunktion während des Beginns des ARF Syndroms deckte eine beeinträchtigte Funktion am Tag 1 auf, als die Kreatinin-Konzentration vom basalen Wert von 0.5 mg/dL sich zu 2.3 mg/dL erhöhte. Es war ähnlich in den Tieren, die mit dem Peptid (n = 29 Ratten) behandelt wurden oder den Träger allein (n = 30) (2B) erhielten, was zeigt, dass der Umfang einer Nierenverletzung in Peptid-behandelten und unbehandelten Tieren gleichwertig war. An Tag 2 war die Serumkreatinin-Konzentration in Peptidbehandelten Ratten (n = 29) erheblich niedriger als in den Tieren, denen der Träger gegeben wurde (n = 30) (p = 0.034, Student's t-test). Dieses Resultat zeigt an, dass die Abnahme der Nierenfunktion in den Ratten weniger schwer war, denen Quecksilber-Chlorid gefolgt vom Peptid gegeben wurde. Der Beweis von einer deutlich schnelleren Wiederherstellung der Nierenfunktion war auch an den Tagen 3 und 4 nach dem Angriff von ARF offensichtlich. Ein ähnlicher vorteilhafter Effekt der Peptidverabreichung wurde beobachtet, als die Blutharnstoffstickstoff-Konzentration als Index der Nierenfunktion gemessen wurde. Diese Resultate zeigen an, dass ein WGF Peptid, das für Nierenepithelzellen mitogenisch ist, Nierenfunktionswiederaufnahme beschleunigt und das Überleben der Ratten mit nephrotoxischen ARF erhöhen kann.
Beispiel 2: In vivo Verabreichung des 14-Ser Peptids 16.5 Stunden nach Induktion von nephrotoxischem ARF.
Weil Ärzte nicht imstande sind, mit Sicherheit vorauszusagen, wenn akutes Nierenversagen bei Patienten auftritt, wird die Serumkreatinin-Konzentration gemessen, um festzustellen, wenn die Nierenfunktion beeinträchtigt worden ist. Nachdem die Nieren-Funktionsstörung festgestellt worden ist, ist eine Behandlung, wünschenswert um die Bedingungen umzukehren. So erfordert die Nützlichkeit des verabreichten 14-Ser Peptids in menschlichem ARF dass es vorteilhaft wirkt, wenn eine verhinderte Nierenfunktion ermittelt worden ist. Das Peptid erhöhte die Geschwindigkeit der Wiederherstellung der Nierenfunktion, wenn es Ratten nach dem Beginn von nephrotoxischem ARF unter Bedingungen verabreicht wird, die das Syndrom im Menschen nachahmen. Jede von 16 Ratten erhielt Quecksilber-Chlorid, um eine Nierenverletzung zu verursachen. Diese Dosis erhöhte die Serumkreatinin-Konzentration 4-fach von 0.5 mg/dL zum Zeitpunkt 0 bis 2.0 mg/dL 16.5 Stunden später. Dann wurde der Hälfte der Tiere das Peptid gegeben (n = 8) und der anderen Hälfte wurde der Träger subkutan gegeben (n = 8). Der Träger ist steriles 0.01% Rinderserumalbumin in phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7.40. Am Tag 2 des Syndroms, steig die Kreatinin-Konzentration weniger in den Peptid-behandelten Ratten (3,0 mg/dL) als in denen, die den Träger empfangen (3.9 mg/dL) (p = 0.0499). Wichtig ist, dass am Tag 3 die Kreatinin-Konzentration zu 2.6 mg/dL in den Tieren denen das Peptid gegeben wurde sank, aber weiter anstieg zu 4.2 mg/dL in den Ratten, denen nur der Träger gegeben wurde (p = 0.020). Am Tag 7, war das Überleben der Tieren höher, die mit dem Peptid (88%) behandelt wurden als bei denen die den Träger erhielten (63%).
So beschleunigt das 14-Ser Peptid klinisch nachweisbar die Wiederherstellung der Nierenfunktion, wenn es nach nephrotoxischer Nierenverletzung verabreicht wird.
In einem unterschiedlichen Satz von Experimenten wurden, das 14-Ser (n = 7) oder der Träger (n = 9) den Ratten 24 Stunden vor Quecksilber-Chlorid-verursachter Verletzung gegeben. Am Tag 3, war die Nierenfunktion, die mit der Serumkreatinin-Konzentration untersucht wurde, in den Ratten erheblich besser, denen das Peptid gegeben wurde (p = 0.039). Das Überleben am Tag 4 war 71% bei den Ratten, die mit dem Peptid behandelt wurden, aber nur 22% in denen, die den Träger bekamen (chi-squared, p = 0.049). Die Behandlung mit dem 14-Ser Peptid 24 Stunden vor der Quecksilber-Chlorid-verursachten Verletzung schien, einen vorteilhafteren Effekt auf das Überleben zu haben als 1 Stunde danach, obgleich der Unterschied statistisch nicht abgesichurt ist.
Um festzustellen, ob die vorteilhaften Effekte des 14-Ser Peptids auf Überleben und Nierenfunktion das Resultat der mitogenischen Aktivität des Peptids waren, wurde die DNA Synthese in den Nieren der Ratten gemessen, denen Quecksilber-Chlorid gegeben wurde. 5-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU), ein nichtradioaktives Analog des Thymidins, das in DNA eingebaut wird, wurde verwendet, um den Zellkern zu markieren. Ein monoklonischer Antikörper zu BrdU und die Diamidobenzid-Färbung wurden benutzt, um Zellkerne zu ermitteln, die DNA Synthese in den histologischen Abschnitten des Nierengewebes durchlaufen. BrdU wurde in 20% Äthanol aufgelöst und wurde intraperitoneal 23 Stunden nach Verabreichung der Quecksilber-Chlorid eingespritzt. Eine Stunde später sind die Nieren schnell mit einer warmen Lösung von phosphatgepuffertem Salzlösung über einen Aortenkatheter durchspült worden, um rote Blutzellen vom Organ zu beseitigen und die Durchgängigkeit des Nierentubules beizubehalten. Die Kapsel wurde von den Nieren entfernt, die dann longitudinal halbiert wurden, und in 4 Stunden Formalin, und dann in 70% Äthanol fixiert wurden. Gewebeschnitte wurden vorbereitet und BrdU-makierte Zellkerne wurden, wie oben beschrieben, nachgewiesen.
Das BrdU-Färben der Nieren der Ratten, denen kein Quecksilber-Chlorid gegeben wurde, deckte ungefähr drei markierte Zellkerne pro High Power Feld (X400) in der subkapsular und aglomerularen (inneren) Rinde auf. In den Nieren der Ratten denen Quecksilber-Chlorid gegeben wurde, wurden umfangreiche Nekrosen der röhrenförmigen Zellen des Terminalteils (S₃) des proximalen Nephron beobachtet, wie erwartet in diesem gut-gekennzeichneten Modell-System. Der Umfang der Nekrose war, ein wenig variabel von Ratte-zu-Ratte aber war immer auf die aglomerulare Rinde begrenzt. Mehr markierte Zellen wurden in der aglomerularen Rinde der Ratten gesehen, denen Quecksilber-Chlorid 24 Stunden früher gegeben wurden als in den Zellen der unbehandelten Kontrollratten. Nierengewebe von einer Ratte, der 14-Ser (100 μg) 24 Stunden vor Verabreichung der Quecksilber-Chlorid gegeben wurde, wurde auch überprüft. In diesem Tier wurde das 1-Stündige BrDu Markiern 24 nach Quecksilber-Chlorid durchgeführt, wie hierin beschrieben. Mikroskopische Prüfung deckte auf, dass viel mehr markierte Zellkerne benachbart der Zone der röhrenförmigen Zell-Nekrose waren. Dieses ist wichtig, weil es in diesem Grenzbereich der Rinde ist, in der regenerierte Zellen erwartet werden, die Mitosis durchmachen und dann in die nekrotische Zone des Nephrons wandern, um Zellen zu ersetzen, die irreversibel durch die nephrotoxische Verletzung verletzt wurden. So scheint das 14-Ser Peptid die DNA Synthese in den Zellen von regenerierenden Nephrons nach Quecksilber-Chlorid verursachter röhrenförmiger Nekrose anzuregen, und durch diesen Mechanismus konnte die Wiederherstellung der Nierenfunktion beschleunigt werden und das Überleben nach ARF verbessert werden.
Beispiel 3: 14-Ser Peptid ist in der Behandlung des ischämischen akuten Nierenversagens wirkungsvoll
Ischämisches akutes Nierenversagen wird häufig verursacht durch niedrigen Blutdruck nach schwerer Blutung, Flüssigkeits-verlust (Diarrhöe, Erbrechen, Diuretics), Infektion (Sepsis), und Herzausfall (myokardiale Krankheit, Arrhythmie). Es kann auch eine eingeschränkte Funktion in der Spenderniere nach Transplantation in einen neuen Wirt verursachen. Um festzustellen, ob das 14-Ser Peptid als therapeutisches Mittel in den Tieren mit ischämischem ARF dienen würde, wurden männlichen Ratten, die 200–225 g beim Anfang des Experimentes wiegen, benutzt. Den Tieren wurde zuerst Pentobarbital (12.5 mg/100 g der Ratte) subkutan zur Anästhesie gegeben. Die Haut wurde dann rasiert, und kleine Schnitte wurden über den rechten und linken Flanken gemacht, um die Nieren auszustellen. Eine Schwartz chirurgische Klemmplatte wurde auf jedes Nierenpedikl gesetzt (Ureter, Arterie, die Ader) um den Nieren Blutfluß zu unterbrechen, um akute ischämischen Nierenausfall zu verursachen. Ungefähr 45 Minuten später wurden die Klemmplatten entfernt, um den Blutfluß in die verletzten Nieren zu ermöglichen, und Metallhautclips wurden benutzt, um die Hautschnitte zu schließen. Dieses ist ein etabliertes Modell des experimentellen ARF, wie hierin beschrieben. Eine Stunde, nachdem die zwei Klemmplatten entfernt worden sind, empfing jede Ratte entweder das 14-Ser Peptid (AQPYPQGNHEASYG) (100 μg) mit Träger (0.01% Rinderserumalbumin in phosphatgepuffertem Salzlösung) oder Träger alleine, subkutan eingespritzt am Nackenansatz.
Um den Effekt des Peptids auf Überleben und Wiederherstellung der Niere zu ermitteln wurden bilaterale Nierenarterie-klemmen verwendet, um ischämisches ARF in 29 Ratten zu verursachen. WGF-abgeleitetes Peptid (14-Ser, 100 μg) wurde s. c. jedem von 14 Tieren 1 Stunde nach der 45-Minütigen ischämischen Verletzung verabreicht; 15 Ratten empfingen ein gleiches Volumen des Trägers. 93% der Ratten überlebten am Tag 6 nach der Induktion von ischämischen ARF (3A), denen das Peptid gegeben wurden verglichen mit 67% der Tiere, die den Träger empfangen haben (chi-squared, p = 0.082). Blut wurde aus dem Schwanz an den Tagen erhalten, die in der 3A angezeigt sind und die Serumkreatinin-Konzentration wurde gemessen. Beschleunigte Wiederherstellung der Nierefunktion in Peptid-behandelten Ratten zeigte sich in der niedrigeren Serumkreatinin-Konzentration an den Tagen 1, 2, 3 und 4 des ARF Syndroms. Bis zum Tag 1 hatte sich die Kreatinin-Konzentration von seinem basalen Wert von 0.5 mg/dL erhöht zu 3.8 mg/dL in den Ratten denen der Träger (n = 15 Ratten) gegeben wurde, aber erreichte einen erheblich niedrigerer Wert von 3.4 mg/dL in den Tieren, die mit Peptid behandelt wurden (n = 14 Ratten) (p = 0.032, Student's t-test) (3B). Die Kreatinin-Konzentration war in Peptid-behandelten Tieren niedriger als an Tag 2 (p = 0.015) und an Tag 3 (p = 0.014) in denen, die den Träger empfangen hatten. Bis zum Tag 4 war die Kreatinin-Konzentration nach und nach auf einen Wert von 2.2 mg/dL gefallen in Peptid-behandelten Ratten, während sie sich 2-fach erhöhte, auf 4.4 mg/dL in den Tieren denen der Träger gegeben wurde (p = 0.011). So blieb während der ersten vier Tage des ARF Syndroms, die Nierenfunktion in den Tieren eingeschränkt denen der Träger gegeben wurde, während Peptid-behandelte Ratten eine schnelle Wiederherstellung zeigten.
Zusammenfassend, das 14-Ser WGF-abgeleitete Peptid, das den Ratten mit entweder ischämischer, oder nephrotoxischer Niereverletzung gegeben wurde, erhöhte das Überleben und beschleunigte die Wiederherstellung von dem Syndrom des akuten Nierenversagens.
Beispiel 4: Verbessertes Überleben wurde mit dem 11-mer des von WGF-Abgeleiteten Peptids bei der Behandlung des nephrotoxischen akuten Nierenversagens erzielt
Experimentelles ARF wurde in den Ratten durch subkutane Einspritzung von Quecksilber-Chlorid verursacht. Das synthetische Peptid AQPYPEGNHEA (aufgelöst im sterilen 0.01% Rinderserumalbumin und in PBS), wurde subkutan in Ratten eingespritzt, zwei Stunden nachdem Quecksilber-Chlorid gegeben wurde, um seinen vorteilhaften Effekt auf Überleben beim ARF Syndrom zu zeigen. In einem Experiment wurden 17 Ratten die Dosis Quecksilber-Chlorid injeziert, die ARF verursacht, wie oben beschrieben. Dann wurden unterschiedliche Mengen des Peptids (bekannt, das Wachstum der Nierenzellen in der Kultur anzuregen) in die Tiere 1 Stunde später eingespritzt, um seine Kapazität festzusetzen, das Resultat zu verbessern. Drei Tage später waren, fünf von fünf Tieren, denen allein Salzlösung gegeben wurde und drei von drei Ratten, die 50 Mikrogramme des Peptids erhielten, tot. Demgegenüber zwei von drei Ratten, die 100 Mikrogramme des Peptids erhielten, waren lebendig, wie fünf von sechs denen 200 Mikrogramme gegeben wurde. Zusammenfassend keine von acht Ratten (0%), die bis zu 50 Mikrogramme des Peptids erhielten, überleben, während sieben von neun (78%), denen 100–200 Mikrogramme gegeben wurde (chi-squared, p = 0.032) überlebten. So verbessert das 11-mer WGF Peptid das Überleben bei nephrotoxischem ARF.
Beispiel 5: Effekt der spezifischen WGF-abgeleiteten Peptide auf die Nieren-Reparatur
Zusätzlich beschleunigt die Verabreichung der spezifischen WGF-abgeleiteten Peptide die Reparatur der Nierenstruktur. Standardassays in der Nierenwachstums-Physiologie und – Pathologie werden verwendet, um zu zeigen, dass der wachtumsfördernde (mitogenische) Effekt eines WGF Peptids eine erhöhte Anzahl von Nierenzellen zur DNA Synthese zur Vorbereitung der Zellteilung anregt, wie in der Gewebekultur gezeigt worden ist.
Zuerst sind Abschnitte des Nieregewebes von den Ratten mit Quecksilber-Chloridverursachtem ARF vorbereitet und unter Lichtmikroskopie kontrolliert worden, um den Umfang der Nierenverletzung und einer Reparatur in den Tieren, die WGF Peptide empfingen mit denen zu vergleichen, die einen Träger in Salzlösung alleine empfingen. Ein anderes Maß des Effektes von WGF auf die Wiederherstellung ist eine histopathologische Einschätzung, die auf ausführlicher mikroskopischer Kontrolle des Nieregewebes basiert. Ein Auswertungsverfahren, das die charakteristischen Eigenschaften von ARF und von Wiederherstellung ordnet, wird benutzt, um Nierengewebe von den Ratten zu untersuchen und zu vergleichen, die Behandlung mit WGF empfingen oder nicht (Miller et al., 1994).
Abhängig von methodologischen Betrachtungen kann radioaktives Thymidin benutzt werden, um die Kapazität des WGF Peptids zu messen die Nieren-DNA Synthese nach ARF anzuregen. In diesen Experimenten wird radioaktives Thymidin intraperitoneal 1 Stunde vor Tod eingespritzt, und seine Einlagerung in Nieren-DNA wird festgestellt, indem man nachher DNA vom Gewebe extrahiert, und die Menge von DNA durch einen chemischen Assay und seine Radioaktivität durch das Szintillationzählen misst. Autoradiograme können auch vorbereitet und verwendet werden, um festzustellen, welche Zellen im Nierengewebe radioaktives Thymidin in DNA eingebaut haben. Alle diese Techniken sind bekannt (Coimbra et al., 1990).
Beispiel 6: Inhibition der WGF-Abgeleiteten Peptid Mitogenesis durch TGF-β2 und YPQGN Peptid
Um die Rolle des 14-Ser Peptids in der Nierenzellen Wachstumsregelung besser zu verstehen, wurden Mittel, die dessen mitogenischen Effekt hemmen konnten, studiert.
Umwandelnder Wachstumsfaktor (TGF)-β2 ist ein autokriner Wachstums-Inhibitor, der durch BSC-1 Zellen (diese begrenzen starke Vermehrung in der Kultur) abgesondert wird. Exogenes TGF-β2 wurde dem Kulturmedium hinzugefügt, um seine Kapazität festzustellen, den wachtumsfördernden Effekt von 14-Ser zu inhibieren. TGF-β2 war bei einer Konzentration von 1 ng/ml ausreichend, die 25% Anregung des Wachstums zu beseitigen verursacht durch 14-Ser. Bei einer TGF-β2 Konzentration von 2 ng/ml wurde Wachstum um 30% in Gegenwert von oder ohne 14-Ser gehemmt; bei 10 ng/ml war die Hemmung 60%. Bei einer TGF-β2 Konzentration von 6 ng/ml bis zu 5 μg/ml, hob exogenes 14-Ser nicht die Wachstumshemmung auf.
Weil TGF-β2 die starke Vermehrung hemmt, die durch verschiedene Mitogene verursacht wird, wurde ein spezifischerer Inhibitor gesucht. Frühere Studien der 5-Aminosäure WGF-abgeleiteten Peptide YPQGN und PQGNH zeigten, dass sie den mitogenischen Effekt des 6-Aminosäuren Peptids, YPQGNH, hemmen. Diese Pentapeptide ändern nicht das Wachstum, wenn sie zu Zellen hinzugefügt werden. Die Zellen wurden für 30 Minuten mit dem Pentapeptid YPQGN inkubiert. Das Kulturmedium wurde dann aspiriert, der Monolayer wurde abgespült, frisches Medium wurde hinzugefügt, und die Zellzahl wurde 4 Tage später gezählt. Vorinkubation der Zellen mit YPQGN hemmte den mitogenische Effekt des 6-Aminosäure Peptids. Zusätzlich blockierte die, Vorinkubation mit YPQGN für 10 oder 30 Minuten vollständig den wachtumsfördernden Effekt von jedem der folgenden Peptide: CPQGNH, 14-Ser, 28-mer (14-Ser Dimer), und das 40-mer (Tabelle 3). Wichtig ist, dass der mitogenische Effekt des teilweise-gereinigten Wundwachstums-Faktors (über eine Heparin-Affinität Patrone, nicht eine HPLC-Säule gereinigt) wurde auch vollständig beseitigt.
Diese Beobachtungen lehren, dass natives WGF (teilweise-gereinigt) und WGF-abgeleitete 6 bis 40 Aminosäuren Lange Peptide, die die hierin beschrieben Sequenz Y/CPQGNH enthalten, an den gleichen Zell-Oberflächen Rezeptor binden, welcher auch hohe Affinität für das Pentapeptid YPQGN hat.
Zusätzliche Experimente wurden durchgeführt, um festzustellen, ob die Kapazität von YPQGN, den wachtumsfördernden Effekt des nativen WGF oder 14-Ser Peptids zu blockieren, spezifisch war. Kulturen der BSC-1 Zellen wurden für 30 Minuten mit YPQGN vorinkubiert, das Medium wurde dann aspiriert, und der Monolayer wurde zweimal mit frischem Medium abgespült. Jedes der folgenden Nierenzellen-Mitogene wurde bei den maximalen Konzentrationen, die unter diesem Bedingungen bekannt sind einzeln untersucht: EGF (50 ng/ml), Insulin-ähnlicher Wachstum Faktor-I (50 ng/ml), Vasopressin (75 pg/ml), säurehaltiger Fibroblasten-Wachstumsfaktor (100 pg/ml), und basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (1.000 pg/ml). Die Resultate zeigten an, dass jedes der fünf Proteine trotz der Vorinkubation der Zellen mit YPQGN völlig mitogenisch war. Die Vorbehandlung mit YPQGN kann auch den Wachstums-hemmenden Effekt von TGF-β2 (6 mg/ml) nicht blockieren. Diese Beobachtungen zeigen, dass die mitogenische Hemmung des nativen WGF durch YPQGN spezifisch ist, und dass die WGF Rezeptor-Stelle und der Signal-Transduction-Pathway sich von denen der fünf Wachstumsfaktoren unterscheidet.
Klonierung des Zell-Oberflächen Rezeptors für das WGF Protein und WGF-abgeleitete Peptide
Die Informationen, die oben zusammengefaßt wurden, schlagen eine experimentelle Strategie vor, um den Zell-Oberflächen Rezeptor zu lokalisieren und zu klonen, an den natives WGF und WGF-abgeleitete Peptide binden. Um den WGF Rezeptor auf der Oberfläche der Affennieren-Epithelzellen der BSC-1 Linie zu ermitteln, wird die hohe Affinität des 40-mer WGF Peptids ausgenutzt, welches in Anwesenheit des Heparins an die Zellen mit einem K_1/2 = 0.00511 μM (5.1 nM) bindet. Zusätzlich wird die Spezifität der Bindung an Zellen oder Plasmamembranfraktionen überwacht, indem man das Pentapeptid YPQGN verwendet, welches die Haftfähigkeit des Peptids zur Zell-Oberfläche blockiert. Radioiodiniertes 40-mer wird vorbereitet und dann mit Heparin den Kulturen der BSC-1 Zellen hinzugefügt. Der Rezeptor ist durch Quervernetzung an das [¹²⁵I] 40-mer durch die Aktivität von Disuccinimidyl-Suberat affinitätsmarkiert (Segarini et al., 1987). Die Zell-Proteine sind solubilisiert und durch SDS-PAGE getrennt. Autoradiographie ermöglicht die Sichtbarmachung des Rezeptors und die Definition seiner Größe. Nachdem eine genügende Menge Rezeptor-Protein durch diese Gelreinigungmethode isoliert wird, werden Amino-Terminus und interne Aminosäure-Sequenz Informationen eingeholt, Oligonukleotid-Primer werden hergestellt, und die Polymeraseketten-Reaktion wird verwendet, um einen cDNA Klon zu erhalten, der das Rezeptor-Protein kodiert.
Beispiel 7: In vivo Vergleich zwischen dem 14-Ser WGF-Abgeleiteten Peptid und dem EGF auf Überleben nach akutem Nierenversagen
Die Wirksamkeit des 14-Ser Peptids als therapeutisches neuartiges Mittel bei Quecksilber-Chlorid verursachtem ARF wurde mit EGF verglichen, welches der erste Peptid-Wachstumsfaktor war, von dem gezeigt wurde, in diesem Tiermodellsystem wirkungsvoll zu sein (Coimbra et al., 1990).
Acht Ratten in jeder von drei Gruppen (n = 24) wurden entweder 14-Ser gegeben (100 μg, s. c.) 1 Stunde nach Quecksilber-Chlorid (2.25 mg/kg, s. c. ), EGF (20 μg, s. c. ), 2 Stunden nach dem Giftstoff oder der Träger (s. c. ) und das Überleben wurde überwacht. Vier Tage später waren 63% von den Ratten, denen das 14-Ser Peptid gegeben wurde, am Leben verglichen mit 25% von den Tieren, die den Träger empfangen hatten (chi-squared, p = 0.0499); 50% von den Ratten, die EGF empfangen, waren lebendig (chi-squared, p = N.S.). An Tag 5 waren 50% von den Ratten, denen EGF gegeben wurde, lebendig verglichen mit 12.5% von den Tieren denen der Träger gegeben (chi-squared, p = 0.436) wurde. An Tag 6 war das Überleben in den Ratten, die das 14-Ser Peptid oder das EGF (37.5%) erhalten hatten gleich, verglichen mit 12% bei den Tieren, die mit dem Träger behandelt wurden. Diese Beobachtungen zeigen, dass das 14-Ser Peptid und das EGF, gegeben, nach einer Nierenverletzung, in ihrer Fähigkeit ähnlich sind, das Überleben vom ARF Syndrom zu verbessern.
In einem unterschiedlichen Experiment wurden Ratten EGF gegeben (20 μg, s. c. ) 24 Stunden vor Verabreichung des Quecksilber-Chlorids, um den Effekt dieses Wachstumsfaktors mit dem 14-Ser Peptid zu vergleichen. Überraschenderweise war die EGF Behandlung nicht unterschiedlich als der Träger, während das 14-Ser Peptid unter diesen Bedingungen in hohem Grade schützend war. So war am Tag 4, das Überleben der Ratten, denen EGF gegeben wurde 25%, für Träger 31% und für das 14-Ser WGF-abgeleitete Peptid, 73%.
Diese Studien zeigen an, dass das 14-Ser Peptid wirkungsvoller als EGF ist, das Überleben zu fördern, wenn es prophylaktisch eingesetzt wird, d. h., vor dem Auslösen der Nierenverletzung. Die Verabreichung des WGF-abgeleiteten Peptids war besonders wirkungsvoll: (1) vor chirurgischen Verfahren bei Patienten mit einer hohen Gefahr des Entwickelns von ARF (z. B., älteren Personen, Neugeborene), (2) bei den Patienten denen möglicherweise nephrotoxische Mittel wie Antibiotika für Behandlung von Sepsis oder antineoplastische Mittel gegeben wurden, und (3) bei dem Durchspülen der Spendernieren vor ihrer Versetzung in neue Wirte.
Ein WGF-abgeleitetes Peptid wie 14-Ser oder natives WGF, gelöst in einer wässerigen Lösung, können zum Spülen und Schützen ("ex vivo") ischämischer „Spender" Nieren vor Verletzung verwendet werden, welche nach Reperfusion des Bluts nach Reimplantation in einen menschlichen Empfänger auftreten kann. So kann WGF als wirkungsvolles Schutzhilfsmittel dienen, wenn es den Lösungen hinzugefügt wird, die eingesetzt werden, um die Leichennieren oder Nieren zu konservieren, die von lebenden Spendern entfernt werden und für die Transplantation beabsichtigt sind.
ZITIERTE DOKUMENTE
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Claims

Ein mitogenes Peptid oder Protein, umfassend eine Aminosäuresequenz NH₂-Tyrosin/Cystein-Prolin-Glutamin-Glycin-Asparagin-Histidin-COOH.
Peptid oder Protein gemäß Anspruch 1, wobei das Peptid oder Protein ein isoliertes mitogenes Protein ist, das ein geschätztes Molekulargewicht von etwa 45 und 1 oder 22 kDa besitzt, wobei diese Einschätzung durch Elektrophorese des HPLC-gereinigten Proteins auf einem SDS-Polyacrylamid Gel erhalten wurde, und das eine Aminosäuresequenz beginnend an Position 1 des aminoterminalen Endes des Proteins besitzt, wobei die Sequenz YPQGNH oder CPQGNH umfasst.
Isoliertes mitogenes Protein gemäß Anspruch 2, wobei die Aminosäuresequenz Alanin-Glutamin-Prolin-Tyrosin/Cystein-Prolin-Glutamin-Glycin-Asparagin-Histidin-Glutaminsäure-X-Alanin/Serin-Tyrosin-Glycin (AQPY/CPQGNHEXA/SYG) umfasst.
Isoliertes mitogenes Protein gemäß Anspruch 2, wobei die Aminosäuresequenz Alanin-Glutamin-Prolin-Tyrosin/Cystein-Prolin-Glutamin-Glycin-Asparagin-Histidin-Glutaminsäure-Alanin-Threonin-Serin-Serin-Serin-Phenylalanin (AQPY/CPQGNHEATSSSF) umfasst.
Isoliertes mitogenes Protein gemäß Anspruch 2, weiterhin definiert als abgegeben von BSC-1 Zellen in Kultur durch Kratzverwundung.
Peptid oder Protein gemäß Ansprüch 1, mit einer Länge von 7 bis 16 Aminosäuren.
Peptid oder Protein gemäß Anspruch 1, bestehend aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
Zusammensetzung, umfassend das Protein gemäß Anspruch 1 oder 7.
Protein gemäß Anspruch 1, umfassend das Peptid AQPYPQGNHEASYG oder AQPCPQGNHEASYG.
Antikörper au den Peptiden gemäß Anspruch 7.
Antikörper gemäß Anspruch 10, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren zur Herstellung des Peptids oder Proteins gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren umfasst: (a) Erhalten einer Nukleotidsequenz, die das Protein oder Peptid kodiert; und (b) Verwenden der Nukleotidsequenz in einem genetischen Expressionssystem um das Protein oder Peptid herzustellen.
Diagnostischer Kit, um die Quantität eines Proteins gemäß Anspruch 1 in einer biologischen Probe zu messen, wobei der Kit in getrennten Behältern umfasst: (a) einen Antikörper zu dem Protein oder zu einem mitogenen Peptid davon; und (b) Mittel zum Nachweis spezifischer Komplexe zwischen dem Protein oder einem mitogenen Peptid und dem Antikörper.
Verwendung des Peptids oder Proteins aus Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Nierenerkrankung.
Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei das Protein an einen zytosolischen Liganden ligiert ist, zur Behandlung von Nierenkrebs.
Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei der zytosolische Ligand ein Toxin zur Behandlung von Nierenkrebs umfasst.
Verfahren zur Perfusion einer humanen Spenderniere „ex vivo", die zur Transplantation in einen neuen Wirt gedacht ist, mit einer pharmakologisch wirksamen Menge des Peptids aus Anspruch 4 in einem geeigneten Verdünnungsmittel.
Peptid gemäß Anspruch 1, wobei das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Hexapeptid NH₂-Y/CPQGNH-COOH, den ersten 10 Aminosäuren des 22 kDa und 45-kDa WGF Proteins (AQPY/CPQGNHE) und dem 14-Ser Peptid (AQPYPQGNHEASYG).
Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, in Kombination mit anderen Wachstumsfaktoren und/oder Nährstoffen, wobei die Wachstumsfaktoren und/oder Nährstoffe ausgewählt sind, aus der Gruppe umfassend EGF, IGF-I, saures FGF, basisches FGF, Vasopressin, Kaliumchlorid und Natriumchlorid.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 19, zur Verwendung in der Behandlung von akutem Nierenversagen oder chronischer Nierenerkrankung.
Pentapeptid, dass die mitogene Wirkung von einem Peptid oder Protein blockiert;, wobei das Pentapeptid eine Aminosäuresequenz von YPQGN oder PQGNH hat.