DE69231062T3

DE69231062T3 - Morphogen-induzierte Modulation von entzündlichen Antworten

Info

Publication number: DE69231062T3
Application number: DE69231062T
Authority: DE
Inventors: Thangavel Kuberasampath; H. Roy PANG; Hermann Oppermann; C. David RUEGER; M. Charles COHEN; Engin Ozkaynak; E. John SMART
Original assignee: Creative Biomolecules Inc
Current assignee: Stryker Corp
Priority date: 1991-08-30
Filing date: 1992-08-28
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2012-08-29
Also published as: DE69231062D1; JP3693338B2; CA2116562A1; CA2116562C; EP0601106B2; AU2564592A; AU669127B2; DE69231062T2; EP0601106B1; WO1993004692A1; ES2149776T3; ATE192931T1; JPH06510989A; ES2149776T5; EP0601106A1

Description

Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung findet allgemein Anwendung bei einem Verfahren zur Modulation der Entzündungsreaktionen, die nach einer Gewebeverletzung in einem Säugetier induziert wurden. Diese Erfindung findet insbesondere Anwendung auf ein Verfahren zur Linderung einer Immunzellen-vermittelten Gewebezerstörung, die mit der Entzündungsreaktion assoziiert ist.
Hintergrund der Erfindung
Die Entzündungsreaktion des Körpers auf Gewebeverletzungen kann zu einer signifikanten Gewebezerstörung führen, die wiederum den Verlust der Gewebefunktion nach sich ziehen kann. Schaden an den Zellen aufgrund der Auswirkungen der Entzündungsreaktion, wie zum Beispiel durch Immunzellenvermittelte Gewebezerstörung, wurde als Ursache einer reduzierten Gewebefunktion oder eines Verlusts der Gewebefunktion bei Gelenkkrankheiten (wie zum Beispiel rheumatischen Krankheiten oder Osteoarthritis) und vielen Organkrankheiten genannt, darunter Krankheiten der Nieren, der Bauchspeicheldrüse, der Haut, der Lunge und des Herzens. Es wird zum Beispiel angenommen, das glomuläre Nephritis, Diabetes, entzündliche Enteritis, Gefäßkrankheiten, wie Atherosklerose und Vaskulitis sowie Hautkrankheiten, wie Psoriasis und Dermatitis größtenteils durch akute entzündliche Reaktionen und Fibrose hervorgerufen werden. Viele dieser Krankheiten, darunter auch Arthritis, Psoriasis und entzündliche Enteritis sind chronische, entzündliche Krankheiten. Das beschädigte Gewebe wird oftmals durch fibrotisches Gewebe, wie Narbengewebe, ersetzt, was die Gewebefunktion noch weiter reduziert. Die Abstoßung von Transplantaten und transplantierten Organen wird auch auf die Aktion des Immun-/Entzündungsreaktionssystems des Körpers zurückgeführt.
Die Immunzellen-vermittelte Gewebezerstörung folgt oftmals einer Gewebeverletzung oder einem Gewebeinsult. Der Sekundärschaden, der sich aus der Entzündungsreaktion ergibt, führt meist zu wesentlichen Gewebeschaden. Einige der Faktoren, die diese schädlichen Effekte vermitteln, sind diejenigen die mit der Modulation der Entzündungsreaktion des Körpers nach einer Gewebeverletzung, zum Beispiel Zytokine, wie Interleukin-1 (IL-1) und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) und sauerstoffabgeleiterter Radikale, wie Superoxydanione assoziiert sind. Diese Humoralerreger werden von adhärenten Neutrophilleukozyten oder Endothelialzellen produziert und wurden bei der Reperfusion an ischämischen Stellen gefunden. TNF-Konzentrationen nehmen in Menschen nach einem Myokardialinfarkt zu.
Eine Vielzahl an Lungenkrankheiten wird durch Luftwegsentzündungen, darunter auch chronische Bronchitis, Emphysem, idopathische Pulmonarfibrose und Asthma charakterisiert. Eine andere Art entzündlicher Lungenkrankheiten sind entzündliche Krankheiten, die durch eine allgemeine, weitverbreitete akute Entzündungsreaktion, wie Atemdepression charakterisiert sind. Eine weitere Funktionsstörung, die mit der Entzündungsreaktion assoziiert ist, ist mit einer Reaktion auf Verletzungen, die durch Hyperoxie, wie zum Beispiel längerer Kontakt mit letal hohen Konzentrationen von O₂ (95–100% O₂) hervorgerufen werden. Eine reduzierte Blutzufuhr zu Gewebe (und daher Sauerstoffmangel im Gewebe) wird nachstehend beschrieben und kann auch eine Primärgewebeverletzung hervorrufen, die eine Entzündungsreaktion auslöst.
Es ist weitgehend bekannt, dass bei Säugetieren, die nicht genügend Sauerstoff erhalten, Schaden am Gewebe auftritt. Die Unterbrechung von Blutzufuhr, sei es nur teilweise (Hypoxie) oder vollständig (Ischämie) und die daraus resultierenden Entzündungsreaktionen, sind wahrscheinlich die wichtigste Ursache für koagulative Nekrose oder Zelltod in menschlichen Krankheiten. Die Komplikationen der Atherosklerose sind z. B. im allgemeinen das Ergebnis von ischämischen Zellverletzungen im Gehirn, im Herzen, dem Dünndarm, den Nieren und den unteren Extremitäten. Hoch differenzierte Zellen, wie die Zellen der Nierentubuli, der Herzmyozyten und der Neuronen des zentralen Nervensystems hängen von der aeroben Respiration ab, die ATP produziert, die Energie, die für die Funktion dieser Zellen notwendig ist. Wenn Ischämie die Sauerstoffzufuhr einschränkt und ATP abgebaut wird, können die betroffenen Zellen dauerhaft verletzt werden. Die daraus resultierenden Entzündungsreaktionen auf diese ursprüngliche Verletzung stellen einen weiteren Insult für das betroffene Gewebe dar. Beispiele für Hypoxie oder Ischämie sind der teileweis oder vollständige Verlust der Blutzufuhr im gesamten Körper, zu einem Organ oder einem Bereich in einem Organ, wie bei Herzstillstand, Pulmonarembolus, Nierenarterienverschluss, Koronarokklusion oder okklusivem Schlaganfall.
Der mit der Ischämie-Reperfusionsverletzung assoziierte Gewebeschaden umfasst sowohl den ursprünglichen Zellschaden, der sich aus der verminderten Sauerstoffzufuhr zu den Zellen ergibt, und die nachfolgende Rezirkulation sowie den Schaden, der sich aus der Reaktion des Körpers auf den ursprünglichen Schaden ergibt. Es wird angenommen, dass die Reperfusionsverletzung zu einer Funktionsstörung des Endotheliums der Vaskulatur sowie einer Verletzung des umgebenden Gewebes führt. Bei der idiopathischen Pulmonarfibrose häuft sich zum Beispiel Narbengewebe auf der Lungenoberfläche an, was die Elastizität des Gewebes negativ beeinflusst. Der mit der Hyperoxie einhergehende Gewebeschaden folgt einem ähnlichen Mechanismus, wobei der ursprüngliche Schaden hauptsächlich durch das Vorhandensein toxischer Sauerstoffmetaboliten hervorgerufen wird, gefolgt von einer Entzündungsreaktion auf diese ursprüngliche Verletzung.
Auf ähnliche Weise werden auch Gewebe und Organe für eine Transplantation den zerstörerischen Effekten des Gewebes ausgesetzt, die nach einer Transplantation mit der Entzündungsreaktion des Körpers des Empfängers assoziiert werden. Es wird derzeit angenommen, dass die ursprüngliche zerstörerische Reaktion hauptsächlich auf die Reperfusionsverletzung des transplantierten Organs zurückzuführen ist, nachdem das Organ in den Empfänger transplantiert wurde.
Der Erfolg einer Gewebe- oder Organtransplantation hängt folglich wesentlich von der Bewahrung der Gewebeaktivität (z. B. Gewebe- oder Organ-Lebensfähigkeit) bei der Entnahme des Organs, der Aufbewahrung des entnommenen Organs und bei der Transplantation ab. Derzeit ist die Konservierung von Organen, wie Lunge, Bauchspeicheldrüse, Herz und Leber ein wesentliches Problem bei der erfolgreichen Transplantation dieser Organe. U.S. Patent, Nr. 4.952.409 beschreibt ein Superoxyd Dismutase enthaltendes Liposom, das Reperfusionsverletzungen hemmt. U.S. Patent, Nr. 5 002 965 beschreibt den Einsatz von Ginkoliden, bekannte Thrombozytenaggregationshemmer, zur Hemmung von Reperfusionsverletzungen. Beide dieser Faktoren funktionieren hauptsächlich durch Hemmung der Abgabe und/oder Hemmung der schädlichen Effekte freier Sauerstoffradikale. Einige Patente beschreiben auch die Anwendung von immunsupprimierenden Substanzen zur Verhinderung einer Transplantatabstoßung. Eine Liste umfasst die U.S. Patente, Nr. 5 104 858, 5 008 246 und 5 068 323. Ein signifikantes Problem bei vielen immunsupprimierenden Substanzen ist ihr niedriger therapeutischer Index, der die Verabreichung hoher Dosierungen erforderlich macht, die wiederum toxische Nebeneffekte haben können.
Rheumatische Krankheiten und Osteoarthritis werden durch eine chronische Entzündung der Synovialmembranschicht des betroffenen Gelenks charakterisiert. Eine wichtige Konsequenz einer chronischen entzündeten Gelenkkrankheit (wie rheumatische Arthritis) und degenerativen Arthritis (wie Osteoarthritis) ist der Funktionsverlust dieser betroffenen Gelenke. Der Funktionsverlust ist weitgehend auf die Zerstörung der wichtigen Strukturkomponenten des Gelenks, der Knorpel und der Knochen und den daraus resultierenden Verlust der Gelenkanatomie zurückzuführen. Als Folge einer chronischen Krankheit, kann eine Gelenkzerstörung dauerhaften Schaden am Gelenk und Funktionsverlust hervorrufen. Derzeit verfügbare Behandlungsmethoden für rheumatische Arthritis umfassen die Entfernung der Synovialmembrane, die sogenannte Synovektomie. Chirurgische Synovektomie hat viele Einschränkungen, darunter das Risiko eines chirurgischen Eingriffs und die Tatsache, dass der Chirurg nicht immer in der Lage ist, die gesamte beschädigte Membrane zu entfernen. Das zurückbleibende, beschädigte Gewebe regeneriert sich und ruft dieselben Symptome hervor, die durch die Operation gelindert werden sollten.
Psoriasis ist eine chronische, immer wieder auftretende, schälende Hautkrankheit unbekannter Etiologie, die durch die chronische Entzündung der Haut charakterisiert ist. Erythematöse Ausbrüche, oftmals in Papeln oder Platten und normalerweise mit einer weiß-silberfarbenen Schälung, können an allen Hautstellen auftreten, treten aber am häufigsten auf dem Kopf, den Ellbogen, am Knie und am Rücken auf. Die Krankheit tritt normalerweise in Erwachsenen auf, kann aber auch Kinder betreffen. Patienten mit Psoriasis haben ein erhöhtes Risiko für Arthritis (psoriatische Arthritis) und in bestimmten Patienten kann sich die gesamte Haut abschälen und sogar der Tod eintreten.
Die derzeitige Behandlung umfasst die topische oder intraläsionale Anwendung von Kortikosteroiden, die topische Anwendung von Keratolytika und die Verwendung von Teer und UV-Licht auf den betroffenen Stellen. Es gibt keine ideale Therapie, und die meisten Patienten müssen sich verschiedenen Behandlungen unterziehen. Die systematische Behandlung kann zu einer unmittelbaren Auslösung der psoriatischen Läsionen führen, aber die Suppression erfordert immer höhere Dosierungen, die manchmal toxische Nebeneffekte haben; eine Behandlung mit geringeren Dosierungen kann zu einem wiederholten Auftreten und einer Erweiterung der Läsionen bis hin zum vollständigen Schälen der Haut (Exfoliation) führen.
Entzündliche Enteritis (IBD) wird als eine Klasse klinischer Störungen der Magen-Darm-Mukosa beschrieben, die durch eine chronische Entzündung und schwere Ulzerationen der Mukosa charakterisiert ist. Die zwei wichtigsten Krankheiten in dieser Klassifikation sind ulzerative Kolitis und regionale Enteritis (Crohns Krankheit). Wie bei der oralen Mukositis sind die als IBD klassifizierten Krankheiten mit schweren mukosalen Ulzerationen (die häufig die Darmwände durchstoßen und Strikturen und Fisteln bilden), schweren mukosalen und submukosalen Entzündungen und Ödemen sowie Fibrose (z. B. Narbengewebebildung, die den Säureschutz der Magen-Darm-Schleimhaut schädigt) assoziiert. Andere Arten von IBD umfassen regionale Ileitis und Proktitis. Patienten mit fulminanter IBD können schwer krank sein und massiven Durchfall, Blutverlust, Dehydration, Gewichtsverlust und Fieber aufweisen. Die Prognose der Krankheit ist nicht gut und erfordert häufig die Resektion des erkrankten Gewebes.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Methode zum Schutz des Gewebes in Säugetieren, besonders beim Menschen, vor dem Schaden, der mit einer Entzündungsreaktion nach einer Gewebeverletzung assoziiert ist. Die Entzündungsreaktion kann eine Reaktion auf eine ursprüngliche Gewebeverletzung oder einen Insult sein. Die ursprüngliche Verletzung kann chemisch, mechanisch, biologisch oder auf das Immunsystem bezogen sein. Eine andere Anwendung liegt in einer Methode zum Schutz von Gewebe vor dem gewebeschädigenden Effekt chronisch entzündlicher Krankheiten, darunter auch Arthritis (z. B. rheumatische oder Osteoarthritis), psoriatische Arthritis, Psoriasis und Dermatitis, IBD und andere Autoimmunerkrankungen. Eine andere Anwendung liegt in Methoden und Zusammensetzungen für die Verbesserung von zu transplantierenden Geweben und Organen in Säugetieren, darunter auch der Schutz der transplantierten Organe vor einer Immunzellen-vermittelten Gewebezerstörung, wie der Gewebeschaden, der mit Ischämie-Reperfusionsverletzungen assoziiert ist. Der Gewebeschaden kann bei einer Entnahme des Spendergewebes oder des Spenderorgans oder nach der Initiierung der Blutzufuhr nach einer Transplantation eines Organs oder von Gewebe im Empfänger auftreten.
Die Erfindung findet weiterhin Anwendung bei einem Verfahren zur Abwendung von Gewebeschaden, der mit einer Ischämie-Reperfusionsverletzung in einem Säugetier nach einer Unterbrechung der Sauerstoffzufuhr zum Gewebe verbunden ist. Andere Anwendungen umfassen eine Methode zur Abwendung von Gewebeschaden, der mit Ischämie-Reperfusionsverletzung im Menschen assoziiert ist, der nach einem Herzstillstand, einer Pulmonarembolie, einer Okklusion der Nierenarterie, einer Koronarokklusion oder einem okklusiven Schlaganfall unter Hypoxie oder Ischämie gelitten hat. Eine weitere Anwendung ist eine Methode zur Abwehdung von Gewebeschaden, der mit Hyperoxie-induzierter Gewebeverletzung, wie zum Beispiel letal hohen Sauerstoffkonzentrationen verbunden ist.
Eine weitere Anwendung der Erfindung ist ein Verfahren zur Modulation von Entzündungsreaktionen im Allgemeinen, aber insbesondere auf Reaktionen, die beim Menschen nach einer Gewebeverletzung induziert werden.
Diese und andere Ziele und Eigenschaften der Erfindung werden durch die Beschreibung, Zeichnungen und den folgenden Aussagen deutlich gemacht.
Kuvilla, et al. (1991), 88 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2918–2921, Lefer et al. (1990), 249 Science 61–64, Shepard et al., EP 0.269.408 , Nathan et al., WO909/00900 und Bentz et al., US-Patent 4.971.852, beschreiben Studien, in denen getestet wurde, ob TGFβ bestimmte Typen von entzündlichem oder ischämischem Reperfusionsschaden an Zellen oder am Gewebe von Säugetieren mitigieren kann. TGF-β ist nicht ein Mitglied der Proteinklasse, die hier als Morphogene definiert werden.
Oppermann et al. WO91/05802, Kuberasampath et al. WO89/09787, Oppermann et al., WO89/09788 und Oppermann et al. WO92/07073 lehren, dass OP-1 und verwandte Proteine bei der Stimulation gewebespezifischer Regeneration von Knorpeln und Knochengewebe in Säugetieren. Diese Verweise beschreiben, das OP-1 bei der Absorption auf einer geeigneten unterstützenden Matrix die Entwicklungskaskade der Zell- und Molekülereignisse induziert, die in der endochronen Knochenmorphogenese kulmuliert. Die biologisch aktiven OP-1 Präparationen sind nur gering löslich in physiologisch kompatiblen Lösungen. OP-1 geladene Matrix-Geräte sind daher für die Induzierung der lokalen Morphogenese der Knochen und/oder Knorpel nützlich.
Cohen et al. WO92/15323 lehrt, dass OP-1 gewebespezifische Morphogene im Gewebe in verschiedenen Säugetieren induziert und dass Morphogen für den Ersatz oder die Reparatur beschädigten Gewebes verwendet werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird in den Ansprüchen definiert. Sie findet ihre Anwendung in einem Verfahren zur Linderung der gewebezerstörenden Effekte, die mit der Aktivierung der Entzündungsreaktion nach einer Gewebeverletzung assoziiert sind. Das Verfahren umfasst den Schritt der Versorgung des betroffenen Gewebes mit einer therapeutisch effektiven Konzentration eines morphogenen Proteins (hier als „Morphogen" definiert) nach einer Gewebeverletzung oder in Antizipierung einer Gewebeverletzung, um die gewebezerstörenden Effekte der Entzündungsreaktion zu hemmen oder zu reduzieren.
Hier werden auch Zusammensetzungen und therapeutische Behandlungsmethoden beschrieben, die den Schritt umfassen, ein Säugetier mit einer therapeutisch effektiven Menge eines morphogenen Proteins („Morphogen") nach einer Gewebeverletzung oder bei der Antizipierung einer derartigen Verletzung über einen bestimmten Zeitraum zu versorgen und genügend hohe Dosierungen zu verabreichen, um die gewebezerstörenden Effekte, die mit der Entzündungsreaktion des Körpers einhergehen, zu hemmen, darunter auch die Reparatur des beschädigten Gewebes und/oder die Abwehrung zusätzlicher Schäden am Gewebe.
In diesem Dokument bezieht sich die Bezeichnung "Ischämische Reperfusionsverletzung" auf den ursprünglichen Schaden, der mit einer verminderten Sauerstoffversorgung einer Zelle assoziiert wird, sowie alle nachfolgenden Schäden, die mit der Entzündungsreaktion einhergehen, wenn die Zelle wieder mit Sauerstoff versorgt wird. Der Begriff "Hyperoxie-induzierte" Verletzung bezieht sich in diesem Dokument auf den Gewebeschaden, der mit dem langen Kontakt letal hoher Sauerstoffkonzentrationen, z. B. höher als 95% O₂, verbunden ist, einschließlich des Gewebeschadens, der mit der Entzündungsreaktion auf die toxisch hohen Sauerstoffdosierungen verbunden ist. Der Begriff toxische Sauerstoffkonzentrationen bezieht sich in diesem Dokument auf den Gewebeschaden, der mit der Verletzung einhergeht, die durch letal niedrige Sauerstoffkonzentrationen (einschließlich vollständigen Sauerstoffmangels) und letal hohe Sauerstoffkonzentrationen hervorgerufen wird. Der Begriff "Abwehren" bedeutet in diesem Dokument den Schutz von, die Reduzierung und/oder Eliminierung ungewünschter Gewebezerstörung, besonders der Immunzellen-vermittelten Gewebezerstörung. Die Gewebezerstörung kann sich als Reaktion auf die ursprüngliche Verletzung ergeben, die mechanisch, chemisch oder immulogisch bedingt sein kann. Der Ausdruck "die Lebensfähigkeit der Gewebe und Organe verbessern" bezieht sich auf den Schutz vor, die Reduzierung und/oder Eliminierung reduzierter oder verlorengegangener Gewebe- oder Organfunktion als Ergebnis eines Gewebesterbens, besonders zellvermittelten Gewebesterbens. "Transplantiertes" lebendes Gewebe umfasst Gewebetransplantationen (z. B. in dem Fall einer Knochenmarktransplantation) oder Gewebetransplantate. Ein "freies Sauerstoffradikale hemmender Agens" ist ein Molekül, das in der Lage ist, die Abgabe und/oder den gewebschädigenden Effekt freier Sauerstoffradikale zu hemmen.
Dieses Dokument beschreibt Methoden und Zusammensetzungen zur Hemmung einer ischämischen Reperfusionsverletzung in Säugetiergeweben nach einem Sauerstoffmangel und nachfolgender Reperfusion des Gewebes. Dieses Dokument beschreibt auch eine Methode zur Abwehrung der zerstörerischen Effekte einer Hyperoxie. Methoden und Zusammensetzungen zur Beibehaltung der Lebesfähigkeit des Gewebes und der Organe, besonders lebender Organe und lebenden Gewebes, das transplantiert werden soll, einschließlich des Schutzes dieses Gewebes und dieser Organe vor einer ischämischen Reperfusionsverletzung, gemeinsam mit Methoden zum Schutz der Gewebe und Organe vor den zerstörerischen Effekten chronisch entzündlicher Krankheiten, wie Arthritis, Psoriasis, Dermatitis, darunter auch Kontaktdermatitis, IBD und andere chronisch entzündliche Krankheiten des Magen-Darm-Trakts sowie der gewebezerstörerischen Effekte, die mit anderen bekannten Autoimmunkrankheiten, wie Diabetes, MS, ALS und anderen hier beschriebene autoimmun-neurodegenerativen Krankheiten assoziiert sind.
Das Morphogen kann dem beschädigten Gewebe nach einer anfänglichen Gewebeverletzung hin zugeführt werden. Das Morphogen kann dem Gewebe direkt, durch Injektion in den Bereich des beschädigten Gewebes oder durch topische Verabreichung oder indirekt, z. B. systemisch auf oralem oder parenteralem Wege, zugeführt werden.
Das Morphogen kann dem Gewebe auch dann zugeführt werden, wenn das Risiko einer Gewebeschädigung auf Grund von immuner Zell-vermittelter Gewebezerstörung besteht. Beispiele für solches Gewebe sind Gewebe- und Organtransplantationen oder Gewebe bzw. Organe, die chirurgischen Eingriffen oder anderen Verfahren ausgesetzt werden, die sehr wahrscheinlich die Blutzufuhr zum Gewebe verhindern oder eine Entzündungsreaktion hervorrufen können. In diesem Fall wird das Morphogen dem Patienten vorzugsweise vor der Herbeiführung einer Verletzung, z. B. als prophylaktische Maßnahme, hinzugefügt, um auf das Gewebe eine zellschützende Wirkung ausüben zu können.
Wenn das gefährdete Gewebe zu verpflanzende Organe oder Gewebe einschließt, wird das zu verpflanzende Gewebe/Organ vorzugsweise vor der Transplantation einem Morphogen ausgesetzt. Die Idealsituation besteht dann, wenn das zu verpflanzende Gewebe/Organ vor der Entnahme vom Spender einer Zusammensetzung aus einem Morphogen ausgesetzt wird. Alternativ oder zusätzlich wird das Gewebe/Organ nach der Entnahme vom Spender in einer Konservierungslösung aufbewahrt, die ein Morphogen enthält. Zusätzlich wird dem Transplantatempfänger vorzugsweise kurz vor oder während der Transplantation ein Morphogen zugeführt. In all diesen Fällen kann das Morphogen dem gefährdeten Gewebe entweder direkt durch Injektion oder topische Verabreichung oder aber systemisch – entweder oral oder parenteral – zugeführt werden.
Die hier beschriebenen Morphogene werden als hilfreich eingeschätzt, um die Lebensfähigkeit von zu verpflanzenden Organen oder lebendem Gewebe zu verbessern. Diese Morphogene erweisen sich möglicherweise besonders hilfreich für Lungen-, Herz-, Leber-, Nieren- oder Bauchspeicheldrüsen-Transplantate sowie in Transplantationen und/oder Verpflanzungen von Knochenmark, Haut, gastrointestinaler Schleimhaut und anderem lebenden Gewebe.
Wenn der Patient unter chronischen Entzündungskrankheiten leidet, z. B. Diabetes, Arthritis, Psoriasis, IBD usw., wird das Morphogen vorzugsweise in regelmäßigen Abständen zur Prophylaxe verabreicht, um Gewebeschädigungen zu hemmen oder zu verhindern, die normalerweise in den akuten Phasen dieser Krankheiten auftreten. Wie oben bereits erwähnt, kann das Morphogen dem gefährdeten Gewebe entweder direkt durch Injektion oder topische Verabreichung oder aber systemisch – entweder oral oder parenteral – zugeführt werden.
Zu den in diesem Zusammenhang wirksamen Morphogenen gehören ursprünglich als osteogen identifizierte Proteine, wie z. B. die Proteine OP-1, OP-2 und CBMP2, des Weiteren mit der Aminosäuren-Sequenz zusammenhängende Proteine, wie z. B. DDP (von Drosophila), Vgl (von Xenopus), Vgr-1 (von Maus, siehe US 5.011.691 , Oppermann et al.), GDF-1 (von Maus, siehe Lee (1991) PNAS 88: 4250–4254) – alle werden in Tabelle II und Seq.-ID-Nr. 5–14 aufgeführt) sowie das erst kürzlich identifizierte 60A Protein (von Drosophila, Seq.-ID-Nr. 24, siehe Wharton et al. (1991) PNAS 88: 9214–9218). Die Mitglieder dieser Familie, zu denen Mitglieder der TGF-β Protein-Superfamilie gehören, weisen in ihren C-Terminal-Regionen eine gemeinsame beachtliche Übereinstimmung der Aminosäurensequenz auf. Die Proteine werden als Vorläufer übersetzt und zeichnen sich durch eine N-Terminal-Signal-Peptidsequenz mit typischerweise weniger als 30 Rückständen aus, auf die eine „Pro"-Domäne folgt, die gespalten ist, um eine voll entwickelte Sequenz hervorzubringen. Das Signal-Peptid wird bei der Übersetzung schnell gespalten, und zwar an einer Spaltstelle, die in einer vorgegebenen Sequenz anhand der Methode von Von Heiijne ((1986) Nucleic Acids Research 14: 4683–4691.) vorbestimmt werden kann. In der Tabelle 1 unten werden die verschieden, bis heute identifizierten Morphogene beschrieben, einschließlich ihrer Nomenklatur, ihrer Seq.-ID-Verweise und Verweise auf Publikationsquellen für Aminosäuresequenzen für Proteine voller Länge, die in der Seq.-Liste nicht aufgeführt sind.
Tabelle I
OP-2 Proteine verfügen über zusätzliche Cystein-Rückstände in dieser Region (z. B. Rückstand 41 der Seq.ID-Nr. 7 und 8), zusätzlich zum konservierten Cystein-Skelett, das den anderen Proteinen dieser Familie gemein ist. Das GDF-1-Protein verfügt über einen Vier-Aminosäuren-Einsatz im konservierten Skelett (Rückstände 44–47 der Seq.-ID-Nr. 14), dieser Einsatz hat jedoch wahrscheinlich keine Auswirkungen auf die Beziehung der Cysteine in der gefalteten Struktur. Zudem fehlt bei den CBMP2-Proteinen ein Aminosäurerückstand im Cysteinskelett.
Morphogene sind nicht aktiv, wenn sie reduziert werden, sie sind jedoch aktiv als oxidierte homodimere Morphogene oder oxidiert in Kombination mit anderen Morphogenen (wie z. B. heterodimeren Morphogenen). Gemäß der hier gegebenen Definition ist ein Morphogen also ein dimerisches Protein, das zwei Polypeptidketten beinhaltet, wobei jede Kette mindestens das C-Terminal-Sechs-Cystein-Skelett, das über die Rückstände 43–139 der Seq.-ID-Nr. 5 definiert wird, enthält, einschließlich in ihrer Funktionsweise gleichwertigen Anordnungen dieser Cysteine (z. B. Aminosäuren-Einsätze oder Löschungen, die zwar die lineare Anordnung der Cysteine in der Sequenz, nicht aber ihre Beziehung in der gefalteten Struktur ändern). Dies bedeutet, dass die dimerischen Proteinarten, die zwei Polypeptidketten enthalten, bei einer Faltung dieser Polypeptidketten die gewünschte dreidimensionale Struktur aufweisen, einschließlich der zugehörigen Disulfidbindung zwischen den oder innerhalb der Ketten, damit das Protein in der Lage ist, wie ein hier definiertes Morphogen zu agieren. Die Morphogene sind insbesondere in der Lage, die folgenden biologischen Funktionen durchzuführen, die normalerweise von Morphogenen in einer Morphogen-freundlichen Umgebung durchgeführt werden können: Stimulierung der Proliferation von Vorläuferzellen; Stimulierung der Differenzierung von Vorläuferzellen; Stimulierung der Proliferation differenzierter Zellen sowie Unterstützung des Wachstums und der Anordnung von differenzierten Zellen, einschließlich der „Neudifferenzierung" von transformierten Zellen. Es wird außerdem erwartet, dass diese Morphogene unter bestimmten Umgebungsbedingungen die Neudifferenzierung determinierter Zellen einleiten.
Die hier beschriebenen Morphogene können eine der zwei generischen Aminosäuresequenzen enthalten: Generische Sequenz (Seq.-ID-Nr. 1) oder Generische Sequenz 2 (Seq.-ID-Nr. 2), wobei jedes „Xaa" für eine der 20 natürlich vorkommenden L-Isomere, α-Aminosäuren oder zugehörigen Derivate steht. Generische Sequenz 1 umfasst das konservierte Sechs-Cystein-Skelett und Generische Sequenz 2 umfasst das konservierte Sechs-Cystein-Skelett und weitere Cysteine, die in OP-2 identifiziert werden (siehe Rückstand 36, Seq.-ID-Nr. 2). Diese Sequenzen können außerdem die folgende zusätzliche Sequenz an ihrem N-Terminus:
enthalten.
Zu den Aminosäuresequenzen innerhalb der zuvor beschriebenen Sequenzen gehören: Generische Sequenz 3 (Seq.-ID-Nr. 3), Generische Sequenz 4 (Seq.-ID-Nr. 4), Generische Sequenz 5 (Seq.-ID-Nr. 30) und Generische Sequenz 6 (Seq.-ID.-Nr. 31), die unten aufgeführt sind. Diese generischen Sequenzen beinhalten die Homologien, die von verschiedenen bevorzugten Mitgliedern dieser Morphogen-Familie (Tabelle II) geteilt werden sowie Aminosäurensequenz-Variationen zwischen diesen Mitgliedern. Bei den generischen Sequenzen 3 und 4 handelt es sich um zusammengesetzte Aminosäuresequenzen der folgenden Proteine, die in Tabelle II aufgeführt und in Seq.-ID-Nr. 5–14 identifiziert sind: menschliches OP-1 (hOP-1, Seq.-ID-Nr. 5 sowie 16–17), Maus-OP-1, (mOP-1, Seq.-ID-Nr. 6 und 18–19), menschliches und Maus-OP-2 (Seq.-ID-Nr. 7, 8 und 20–22), CMBP2A (Seq.-ID-Nr. 9), CBMP2B (Seq.-ID-Nr. 10), DPP (von Drosophila, Seq.-ID-Nr. 11), Vgl (von Xenopus, Seq.-ID-Nr. 12), Vgr-1 (von Maus, Seq.-ID-Nr. 13) und GDF-1 (von Maus, Seq.-ID-Nr. 14). Die generischen Sequenzen enthalten sowohl die Aminosäureidentität, die von den Sequenzen gemeinsam verwendet wird (Tabelle II), als auch alternative Rückstände für die Variablenpositionen innerhalb der Sequenz. Beachten Sie, dass diese generischen Sequenzen zusätzliche Cysteine an Position 41 oder 46 in den generischen Sequenzen 3 oder 4 gleichermaßen zulassen und somit ein geeignetes Cystein-Skelett bereitstellen, in dem sich inter- und intramolekulare Disulfidbindungen bilden können und dass sie außerdem bestimmte wichtige Aminosäuren enthalten, die sich auf die tertiäre Struktur der Proteine auswirken. Generische Sequenz 3
wobei die einzelnen Aminosäurereste Xaa unabhängig voneinander aus einer Gruppe von einer oder mehreren, im folgenden spezifizierten Aminosäuren ausgewählt wird ("Res." steht dabei für "Position", "at" für "an", "or" für "oder" und "and" für "und"):
Xaa at res. 4 = (Ser, Asp or Glu); Xaa at res. 6 = (Arg, Gln, Ser or Lys): Xaa at res. 7 = (Asp or Glu); Xaa at res. 8 = (Leu or Val); Xaa at res. 11 = (Gln, Leu, Asp, His or Asn); Xaa at res. 12 = (Asp, Arg or Asn); Xaa at res. 14 = (Ile or Val); Xaa at res. 15 = (Ile or Val); Xaa at res. 18 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro or Arg); Xaa at res. 20 = (Tyr or Phe); Xaa at res. 21 = (Ala, Ser, Asn, Met, His, Leu or Gln); Xaa at res. 23 = (Tyr, Asn or Phe); Xaa al res. 26 = (Glu, His, Tyr, Asp or Gln); Xaa at res. 28 = (Glu, Lys, Asp or Gln); Xaa at res. 30 = (Ala, Ser, Pro or Gln); Xaa at res. 31 = (Phe, Leu or Tyr); Xaa at res. 33 = (Leu or Val): Xaa at res. 34 = (Asn, Asp, Ala or Tyr); Xaa at res. 35 = (Ser, Asp, Glu, Leu or Ala); Xaa at res. 36 = (Tyr, Cys, His, Ser or Ile); Xaa at res. 37 = (Met, Phe, Gly or Leu): Xaa at res. 38 = (Asn or Ser); Xaa at res. 39 = (Ala, Ser or Gly); Xaa at res. 40 = (Thr, Leu or Ser); Xaa at res. 44 = (Ile or Val); Xaa at res. 45 = (Val or Leu); Xaa at res. 46 = (Gln or Arg); Xaa at res. 47 = (Thr, Ala or Ser); Xaa at res. 49 = (Val or Met); Xaa at res. 50 = (His or Asn); Xaa at res. 51 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala or Val); Xaa at res. 52 = (Ile, Met, Asn, Ala or Val); Xaa at res. 53 = (Asn, Lys, Ala or Glu); Xaa at res. 54 = (Pro or Ser); Xaa at res. 55 = (Glu, Asp, Asn, or Gly); Xaa at res. 66 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser or Ala); Xaa at res. 57 = (Val, Ala or Ile); Xaa at res. 58 = (Pro or Asp); Xaa at res. 59 = (Lys or Leu); Xaa at res. 60 = (Pro or Ala); Xaa at res. 63 = (Ala or Val); Xaa at res. 65 = (Thr or Ala); Xaa at res. 66 = (Gln, Lys, Arg or Glu); Xaa at res. 67 = (Leu, Met or Val); Xaa at res. 68 = (Asn, Ser or Asp); Xaa at res. 69 = (Ala, Pro or Ser); Xaa at res. 70 = (Ile, Thr or Val); Xaa at res. 71 = (Ser or Ala); Xaa at res. 72 = (Val or Met); Xaa at res. 74 = (Tyr or Phe); Xaa at res. 75 = (Phe, Tyr or Leu); Xaa at res. 76 = (Asp or Asn); Xaa at res. 77 = (Asp, Glu, Asn or Ser); Xaa at res. 78 = (Ser, Gln, Asn or Tyr); Xaa at res. 79 = (Ser, Asn, Asp or Glu); Xaa at res. 80 = (Asn, Thr or Lys); Xaa at res. 82 = (Ile or Val; Xaa at res. 84 = (Lys or Arg); Xaa at res. 85 = (Lys, Asn, Gln or His); Xaa at res. 86 = (Tyr or His); Xaa at res. 87 = (Arg, Gln or Glu); Xaa at res. 88 = (Asn, Glu or Asp); Xaa at res. 90 = (Val, Thr or Ala); Xaa at res. 92 = (Arg, Lys, Val, Asp or Glu); Xaa at res. 93 = (Ala, Gly or Glu); and Xaa at res. 97 = (His or Arg); Generische Sequenz 4

wobei die einzelnen Aminosäurereste Xaa unabhängig voneinander aus einer Gruppe von einer oder mehreren, im folgenden spezifizierten Aminosäuren ausgewählt wird ("Res." steht dabei für "Position", "at für "an", "or" für "oder" und "and" für "und"):
Xaa at res. 2 = (Lys or Arg); Xaa at res. 3 = (Lys or Arg); Xaa at res. 4 = (His or Arg); Xaa at res. 5 = (Glu, Ser, His, Gly Arg or Pro); Xaa at res. 9 = (Ser, Asp or Glu); Xaa at res. 11 = (Arg, Gln, Ser or Lys); Xaa at res. 12 = (Asp or Glu); Xaa at res. 13 = (Leu or Val); Xaa at res. 16 = (Gln, Leu, Asp, His or Asn); Xaa at res. 17 = (Asp, Arg, or Asn); Xaa at res. 19 = (Ile or Val); Xaa at res. 20 = (Ile or Val); Xaa at res. 23 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro or Arg); Xaa at res. 25 = (Tyr or Phe); Xaa at res. 26 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Leu, or Gln); Xaa at res. 28 = (Tyr, Asn or Phe); Xaa at res. 31 = (Glu, His, Tyr, Asp or Gln); Xaa at res. 33 = Glu, Lys, Asp or Gln); Xaa at res. 35 = (Ala, Ser or Pro); Xaa at res. 36 = (Phe, Leu or Tyr); Xaa at res. 38 = (Leu or Val); Xaa at res. 39 = (Asn, Asp, Ala or Thr); Xaa at res. 40 = (Ser, Asp, Glu, Leu or Ala); Xaa at res. 41 = (Tyr, Cys, His, Ser or Ile); Xaa at res. 42 = (Met, Phe, Gly or Ile); Xaa at res. 44 = (Ala, Ser or Gly); Xaa at res. 45 = (Thr, Leu or Ser); Xaa at res. 49 = (lle or Val); Xaa at res. 50 = (Val or Leu); Xaa at res. 51 = (Gln or Arg); Xaa at res. 52 = (Thr, Ala or Ser); Xaa at res. 54 = (Val or Met); Xaa at res. 55 = (His or Asn); Xaa at res. 56 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala or Val); Xaa at res. 57 = (Ile, Met, Asn, Ala or Val); Xaa at res. 58 = (Asn, Lys, Ala or Glu); Xaa at res. 59 = (Pro or Ser); Xaa at res. 60 = (Glu, Asp, or Gly); Xaa at res. 61 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser or Ala); Xaa at res. 62 = (Val, Ala or Ile); Xaa at res. 63 = (Pro or Asp); Xaa at res. 64 = (Lys or Leu); Xaa at res. 65 = (Pro or Ala); Xaa at res. 68 = (Ala or Val); Xaa at res. 70 = (Thr or Ala); Xaa at res. 71 = (Gln, Lys, Arg or Glu); Xaa at res. 72 = (Leu, Met or Val); Xaa at res. 73 = (Asn, Ser or Asp); Xaa at res. 74 = (Ala, Pro or Ser); Xaa at res. 75 = (Ile, Thr or Val); Xaa at res. 76 = (Ser or Ala); Xaa at res. 77 = (Val or Met); Xaa at res. 79 = (Tyr or Phe); Xaa at res. 80 = (Phe, Tyr or Leu); Xaa at res. 81 = (Asp or Asn); Xaa at res. 82 = (Asp, Glu, Asn or Ser); Xaa at res. 83 = (Ser, Gln, Asn or Tyr); Xaa at res. 84 = (Ser, Asn, Asp or Glu); Xaa at res. 85 = (Asn, Thr or Lys); Xaa at res. 87 = (Ile or Val); Xaa at res. 89 = (Lys or Arg); Xaa at res. 90 = (Lys, Asn, Gln or His); Xaa at res. 91 = (Tyr or His); Xaa at res. 92 = (Arg, Gln or Glu); Xaa at res. 93 = (Asn, Glu or Asp); Xaa at res. 95 = (Val, Thr or Ala); Xaa at res. 97 = (Arg, Lys, Val, Asp or Glu); Xaa at res. 98 = (Ala, Gly or Glu); and Xaa at res. 102 = (His or Arg).
In ähnlicher Weise repräsentieren generische Sequenz 5 (Seq. ID Nr. 30) und generische Sequenz 6 (Seq. ID Nr. 31) die von allen in Tabelle II aufgeführten Mitgliedern der Morphogen-Proteinfamilie geteilten Homologien. Genauer gesagt handelt es sich bei den generischen Sequenzen 5 und 6 um Kombinationssequenzen, die aus den Aminosäuresequenzen von Human-OOP-1, Seq. ID Nr. 5 und 16– 17), Maus-OP-1, (mOP-1 Seq. ID Nr. 6 und 18–19), Human- und Maus-OP-2 (Seq. ID Nr. 7, 8 und 20–22), CBMP2A (Seq. ID Nr. 9), CBMP2B (Seq. ID Nr. 10), DPP (von Drosophila, Seq. ID Nr. 11), Vgl (von Xenopus, Seq. ID Nr. 12), Vgr-1 (von der Maus, Seq. ID Nr. 13), GDF-1 (von der Maus, Seq. ID Nr. 14), Human-BMP3 (Seq. ID Nr. 26), Human-BMP5 (Seq. ID Nr. 27), Human-BMP6 (Seq. ID Nr. 28) und 60(A) (von Drosophila; Seq. ID Nr. 24–25) zusammengestellt wurden Die generischen Sequenzen enthalten sowohl die Aminosäurenidentität, die alle diese Sequenzen in der durch die sechs bzw. sieben Cystinbrücken definierten C-terminalen Domäne gemeinsam haben (siehe generische Sequenzen 5 und 6), als auch die alternativen Aminosäurereste für die variablen Positionen innerhalb der Sequenz. Im Vergleich zu den generischen Sequenzen 3 und 4 lassen die generischen Sequenzen 5 und 6 einen zusätzlichen Cysteinrest an Position 41 (Generische Sequenz 5) bzw. Position 46 (Generische Sequenz 6) zu und ermöglichen damit ein zweckentsprechendes Cysteinskelett, in dem sich inter- und intramolekulare Disulfidbindungen ausbilden können, und das bestimmte kritische, die Tertiärstruktur des Proteins beeinflussende Aminosäuren enthält. Generische Sequenz 5

wobei die einzelnen Aminosäurereste Xaa unabhängig voneinander aus einer Gruppe von einer oder mehreren, im folgenden spezifizierten Aminosäuren ausgewählt wird ("Res." steht dabei für "Position", "at" für "an", "or" für "oder" und "and" für "und"):
Xaa at res. 2 = (Tyr or Lys); Xaa at res. 3 = Val or Ile); Xaa at res. 4 = (Ser, Asp or Glu); Xaa at res. 6 = (Arg, Gln, Ser, Lys or Ala); Xaa at res. 7 = (Asp, Glu or Lys); Xaa at res. 8 = (Leu, Val or Ile); Xaa at res. 11 = (Gln, Leu, Asp, His, Asn or Ser); Xaa at res. 12 = (Asp, Arg, Asn or Glu); Xaa at res. 14 = (Ile or Val): Xaa at res. 15 = (Ile or Val); Xaa at res. 16 (Ala or Ser); Xaa at res. 18 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro or Arg); Xaa at res. 19 = (Gly or Ser); Xaa at res. 20 = (Tyr or Phe); Xaa at res. 21 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Gln, Leu or Gly); Xaa at res. 23 = (Tyr, Asn or Phe); Xaa at res. 26 = (Glu, His, Tyr, Asp, Gln or Ser); Xaa at res. 28 = (Glu, Lys, Asp, Gln or Ala); Xaa at res. 30 = (Ala, Ser, Pro, Gln or Asn); Xaa at res. 31 = (Phe, Leu or Tyr); Xaa at res. 33 = (Leu, Val or Met); Xaa at res. 34 = (Asn, Asp, Ala, Thr or Pro); Xaa at res. 35 = (Ser, Asp, Glu, Leu, Ala or Lys); Xaa at res. 36 = (Tyr, Cys, His, Ser or Ile); Xaa at res. 37 = (Met, Phe, Gly or Leu); Xaa at res. 38 = (Asn, Ser or Lys); Xaa at res. 39 = (Ala, Ser, Gly or Pro); Xaa at res. 40 = (Thr, Leu or Ser); Xaa at res. 44 = (Ile, Val or Thr); Xaa at res. 45 = (Val, Leu or Ile); Xaa at res. 46 = (Gln or Arg); Xaa at res. 47 = (Thr, Ala or Ser); Xaa at res. 48 = (Leu or Ile); Xaa at res. 49 = (Val or Met); Xaa at res. 50 = (His, Asn or Arg); Xaa at res. 51 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala or Val); Xaa at res. 52 = (Ile, Met, Asn, Ala, Val or Leu); Xaa at res. 53 = (Asn, Lys, Ala, Glu, Gly or Phe); Xaa at res. 54 = (Pro, Ser or Val); Xaa at res. 55 = (Glu, Asp, Asn, Gly, Val or Lys): Xaa at res. 56 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser, Ala, Pro or His); Xaa at res. 57 = (Val, Ala or Ile); Xaa at res. 59 = (Pro or Asp); Xaa at res. 59 = (Lys, Leu or Glu); Xaa at res. 60 = (Pro or Ala); Xaa at res. 63 = (Ala or Val); Xaa at res. 65 = (Thr, Ala or Glu); Xaa at res. 66 = (Gln, Lys, Arg or Glu); Xaa at res. 67 = (Leu, Met or Val); Xaa at res. 68 = (Asn, Ser, Asp or Gly); Xaa at res. 69 = (Ala, Pro or Ser); Xaa at res. 70 = (Ile, Thr, Val or Leu); Xaa at res. 71 = (Ser, Ala or Pro); Xaa at res. 72 = (Val, Met or Ile); Xaa at res. 74 = (Tyr or Phe); Xaa at res. 75 = (Phe, Tyr, Leu or His); Xaa at res. 76 = (Asp, Asn or Leu); Xaa at res. 77 = (Asp, Glu, Asn or Ser); Xaa at res. 78 = (Ser, Gln, Asn, Tyr or Asp); Xaa at res. 70 = (Ser, Asn, Asp, Glu or Lys); Xaa at res. 80 = (Asn, Thr or Lys); Xaa at res. 82 = (Ile, Val or Asn); Xaa at res. 84 = (Lys or Arg); Xaa at res. 85 = (Lys, Asn, Gln, His or Val); Xaa at res. 86 = (Tyr or His); Xaa at res. 87 = (Arg, Gln, Glu or Pro); Xaa at res. 88 = (Asn, Glu or Asp); Xaa at res. 90 = (Val, Thr, Ala or Ile); Xaa at res. 92 = (Arg, Lys, Val, Asp or Glu); Xaa at res. 93 = (Ala, Gly, Glu or Ser); Xaa at res. 95 = (Gly or Ala) and Xaa at res. 97 = (His or Arg). Generische Sequenz 6

wobei die einzelnen Aminosäurereste Xaa unabhängig voneinander aus einer Gruppe von einer oder mehreren, im folgenden spezifizierten Aminosäuren ausgewählt wird ("Res." steht dabei für "Position", "at" für "an", "or" für "oder" und "and" für "und"):
Xaa at res. 2 = (Lys, Arg, Ala or Gln); Xaa at res. 3 = (Lys, Arg or Met); Xaa at res. 4 = (His, Arg or Gln); Xaa at res. 5 = (Glu, Ser, His, Gly, Arg, Pro, Thr, or Tyr); Xaa at res. 7 = (Tyr or Lys); Xaa at res. 8 = (Val or Ile); Xaa at res. 9 = (Ser, Asp or Glu); Xaa at res. 11 = (Arg, Gln, Ser, Lys or Ala); Xaa at res. 12 = (Asp, Glu, or Lys); Xaa at res. 13 = (Leu, Val or Ile): Xaa at res. 16 = (Gln, Leu, Asp, His, Asp or Ser); Xaa at res. 17 = (Asp, Arg, Asn or Glu); Xaa at res. 19 = (Ile or Val); Xaa at res. 20 = (Ala or Val); Xaa at res. 21 = (Ala or Ser); Xaa at res. 23 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro or Arg); Xaa at res. 24 = (Gly or Ser); Xaa at res. 25 = (Tyr or Phe); Xaa at res. 26 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Gln, Leu, or Gly); Xaa at res. 28 = (Tyr, Asn or Phe); Xaa at res. 31 = (Glu, His, Tyr, Asp, Gln or Ser); Xaa at res. 33 = Glu, Lys, Asp, Gln or Ala); Xaa at res. 35 = (Ala, Ser, Pro, Gln or Asn); Xaa at res. 36 = (Phe, Leu or Tyr); Xaa at res. 38 = (Leu, Val or Met); Xaa at res. 39 = (Asn, Asp, Ala, Thr or Pro); Xaa at res. 40 = (Ser, Asp, Glu, Leu, Ala or Lys); Xaa at res. 41 = (Tyr, Cys, His, Ser or Ile); Xaa at res. 42 = (Met, Phe, Gly or Leu); Xaa at res. 43 = (Asn, Ser or Lys); Xaa at res. 44 = (Ala, Ser, Gly or Pro); Xaa at res. 45 = (Thr, Leu or Ser); Xaa at res. 49 = (Ile, Val or Thr); Xaa at res. 50 = (Val, Leu or Ile): Xaa at res. 51 = (Gln or Arg); Xaa at res. 52 = (Thr, Ala or Ser); Xaa at res. 53 = (Leu or Ile); Xaa at res. 54 = (Val or Met); Xaa at res. 55 = (His, Asn or Arg); Xaa at res. 56 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala or Val); Xaa at res. 57 = (Ile, Met, Asn, Ala, Val or Leu); Xaa at res. 58 = (Asn, Lys, Ala, Glu, Gly or Phe); Xaa at res. 59 = (Pro, Ser or Val); Xaa at res. 60 = (Glu, Asp, Gly, Val or Lys); Xaa at res. 61 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser, Ala, Pro or His); Xaa at res. 62 = (Val, Ala or Ile); Xaa at res. 63 = (Pro or Asp); Xaa at res. 64 = (Lys, Leu or Glu); Xaa at res. 65 = (Pro or Ala); Xaa at res. 68 = (Ala or Val); Xaa at res. 70 = (Thr, Ala or Glu); Xaa at res. 71 = (Gln, Lys. Arg or Glu); Xaa at res. 72 = (Leu, Met or Val); Xaa at res. 73 = (Asn, Ser, Asp or Gly): Xaa at res. 74 = (Ala, Pro or Ser); Xaa at res. 75 = (Ile, Thr, Val or Leu); Xaa at res. 76 = (Ser, Ala or Pro); Xaa at res. 77 = (Val, Met or Ile); Xaa at res. 79 = (Tyr or Phe); Xaa at res. 80 = (Phe, Tyr, Leu or His); Xaa at res. 81 = (Asp, Asn or Leu); Xaa at res. 82 = (Asp, Glu, Asn or Ser); Xaa at res. 83 = (Ser, Gln, Asn, Tyr or Asp); Xaa at res. 84 = (Ser, Asn, Asp, Glu or Lys); Xaa at res. 85 = (Asn, Thr or Lys); Xaa at res. 87 = (Ile, Val or Asn); Xaa at res. 89 = (Lys or Arg); Xaa at res. 90 = (Lys. Asn, Gln, His or Val); Xaa at res. 90 = (Tyr or His); Xaa at res. 92 = (Arg, Gln, Glu or Pro); Xaa at res. 93 = (Asn, Glu or Asp); Xaa at res. 95 = (Val, Thr, Ala or Ile); Xaa at res. 97 = (Arg, Lys, Va, Asp or Glu); Xaa at res. 98 = (Ala, Gly, Glu or Ser); Xaa at res. 100 = (Gly or Ala); and Xaa at res. 102 = (His or Arg).
Zur Verwendung als erfindungsgemäße Morphogene besonders nützliche Sequenzen sind u. a. die C-terminalen Domänen, z. B. die C-terminalen 96 bis 102 Aminosäurereste von Vgl, Vgr-1, DPP, OP-1, OP-2, CBMP-2A, CBMP-2B, GDF-1 (siehe Tabelle II unten und Seq. ID Nr. 5–14) sowie Proteine, die aus den C-terminalen Domänen von 60A, BMP3, BMP5 und BMP6 bestehen (siehe Seq. ID Nr. 24–28), die alle wenigstens das Skelett mit den konservativen sechs oder sieben Cysteinen beinhalten. Außerdem sind von den generischen Sequenzen abgeleitete biosynthetische Konstruktionen nützlich, wie z. B. die in US-Patent 5.011.691 offengelegten COP-1, 3–5, 7 und 16.
Unter einem anderen bevorzugten Gesichtspunkt der Erfindung schließen brauchbare Morphogene aktive Proteine ein, die Spezies aus Polypeptidketten mit der generischen und hier mit „OPX" bezeichneten Aminosäuresequenz umfassen, womit alle Homologien zwischen den verschiedenen identifizierten Formen von OP1 und OP2 (Seq.-ID-Nr. 29) abgedeckt sind.
Die hier beschriebenen Morphogene schließen Proteine mit irgendeiner der oben beschriebenen Polypeptidketten ein, unabhängig davon, ob sie aus natürlich vorkommenden Quellen isoliert oder mittels Rekombinanten-DNA oder sonstigen synthetischen Methoden hergestellt wurden. Darin eingeschlossen sind alle allelischen und artenspezifischen Varianten dieser Proteine, alle natürlichvorkommenden oder biosynthetischen Mutanten davon sowie diverse trunkierte und fusionierte Konstruktionen. Außerdem wird erwartet, dass bestimmte Deletions- und Additionsmutanten aktiv sind, insbesondere auch solche Mutanten, bei denen Änderungen am konservativen C-terminalen Cysteinskelett erfolgt sind, so lange wie durch die Änderung die funktionelle Beziehung zwischen diesen Cysteinen in der gefalteten Struktur nicht gestört wird. Dementsprechend sind solche aktiven Formen als Äquivalent der hier offengelegten und genau beschriebenen Konstruktionen anzusehen.
Die Proteine können verschiedene Glycosylierungsmuster und N-Termini aufweisen sowie aus einer Familie von verwandten Proteinen mit Regionen homologer Aminosäuresequenz bzw. aus aktiv trunkierten oder mutierten Formen von nativen oder biosynthetischen Proteinen bestehen, wobei Letztere durch Expression von rekombinanter DNA in Wirtszellen produziert werden.
Die morphogenetischen Proteine können mit Hilfe intakter oder trunkierter cDNA bzw. synthetischer DNA in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen exprimiert, gereinigt, gespalten, neu gefaltet und zu morphogenetisch aktiven Kompositionen dimerisiert werden. Derzeit bevorzugte Wirtszellen sind z. B. E. coli oder Säugetierzellen wie CHO-, COS- oder BSC-Zellen.
Daher können angesichts dieser Offenlegung erfahrene Gentechniker aus cDNA- oder Genbibliotheken verschiedener Tierarten Gene isolieren, die entsprechende Aminosäuresequenzen kodieren, bzw. DNA aus Oligonukleotiden konstruieren und diese anschließend in verschiedenen Arten von Wirtszellen, sowohl Prokaryoten als auch Eukaryoten, exprimieren, um große Mengen aktiver Proteine herzustellen, die die Fähigkeit besitzen, Gewebe und Organe vor durch Immunzellen verursachter Gewebezerstörung zu schützen, einschließlich der Fähigkeit, solche Schäden in einer Reihe von Säugetieren, einschließlich dem Menschen, großenteils zu verhindern und/oder geschädigtes Gewebe zu regenerieren.
Das oben Gesagte sowie andere Objekte, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende, detaillierte Beschreibung der Erfindung noch weiter erläutert.
Kurzbeschreibungen der Zeichnungen
1 zeigt die herzschützende Wirkung von Morphogen hOP1 in einem myokardialen Ischämie-Reperfusionsmodell der Ratte, zu erkennen an dem geringen Verlust an myokardialer Creatinkinase in hOP1-behandelten Ratten.
2 zeigt die Wirkung von 20 μg Morphogen (hOP1-Verabreichung 24 Stunden vor der Isolierung des Rattenherzen) auf die endothelabhängige Vasorelaxation durch Acetylcholin im Anschluß an eine Ischämie-Reperfusionsverletzung.
3 zeigt die Wirkung von Morphogen (hOP1) auf die Neutrophilenadhäsion an LTB4-stimuliertes Mesenterialarterienendothel in der Neutrophilen-aktivierten Ratte.
4 (A und B) sind schematische-Darstellungen der Morphogeninhibition auf die frühe Multinuklearisierung mononuklearer Phagozyten in vivo.
5 zeigt in grafischer Form die Wirkung eines Morphogens (z. B. OP-1) und eines Plazebos (Kontrolle) auf die Entstehung von Schleimhautentzündungsschäden.
6 (A–D) stellen die Auswirkungen eines Morphogens (z. B. OP-1, 6A und 6C) und von TGF-☐ (6B und 6D) auf die Produktion von Kollagen (6A und 6B) und Hyaluronsäure (6C und 6D) in primären Fibroblastenkulturen dar.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Es ist jetzt überraschend entdeckt worden, daß die hier definierten Morphogene wirkungsvolle Mittel zur Verringerung der mit der Entzündungsreaktion des Körpers auf Gewebeverletzung verbundenen, gewebezerstörenden Wirkungen sind. Insbesondere haben, wie hier offengelegt wird, die Morphogene die Eigenschaft, die mit den auf eine anfängliche Gewebeverletzung folgenden Entzündungsreaktionen verbundene Gewebenekrose zu mildern.
Wann immer es zu Gewebeverletzungen kommt, unabhängig davon, ob dies durch Bakterien, Trauma, Chemikalien, Hitze oder irgendein anderes Phänomen verursacht ist, wird die Entzündungsreaktion des Körpers ausgelöst. Als Antwort auf die von den geschädigten Zellen freigesetzten Signale (z. B. Cytokine) wird die Extravasation von Immuneffektorzellen ausgelöst. Unter normalen Umständen töten diese [in das geschädigte Gewebe] eindringenden Immuneffektorzellen die Infektionskeime und/oder die infizierten oder geschädigten Zellen (durch Freisetzung abtötender Substanzen wie Superoxid, Perforine und andere, in Granula gespeicherten antimikrobiellen Mitteln) ab, entfernen totes Gewebe und Organismen (durch Phagozytose), setzen verschiedene biologische Response-Modifizierer frei, die ein schnelles Abheilen und Abdecken der Wunde fördern (und recht häufig zu fibrotischer Narbenbildung führen) und ziehen sich anschließend, nachdem der Bereich erfolgreich abgeheilt ist, aus dem Bereich des anfänglichen Traumas zurück. Sobald ein Bereich als normal angesehen wird, hört die örtliche Freisetzung von entzündungsauslösenden Cytokinen auf, und das Spektrum von Adhäsionsmolekülen auf dem Gefäßendothel kehrt zur Ausgangsstufe zurück. In einigen Fällen allerdings schießen diese wechselwirkenden Signale und zellulären Systeme, die ja zum Einfangen und Unschädlichmachen sich sehr schnell vermehrender Infektionskeime gedacht sind, über das Ziel hinaus und schädigen den Körper, indem sie zur Abtötung von weiterem, ansonsten gesundem Umgebungsgewebe führen. Dieses zusätzliche und unnötige Gewebesterben beeinträchtigt die Funktion von Organen weiter und führt in manchen Fällen zum Tod des Individuums. Außerdem können die oft entstehenden Narben die normale Gewebefunktion stören; dies ist z. B. bei idiopathischer Lungenfibrose, IBD (inflammatory bowel disease, Enteritis regionalis Crohn) und Organzirrhose der Fall.
Das Gefäßendothel stellt die erste Barriere zwischen den zirkulierenden Immuneffektorzellen und dem extravaskulären Gewebe dar. Zur Extravasation müssen sich diese zirkulierenden Zellen an Gefäßendothelzellen binden, die Basalmembran durch- und in angegriffenes Gewebe z. B. durch Phagozytose oder Protease-vermittelte extrazelluläre Matrixdegradation eindringen. Wenngleich es uns fernliegt, dieses Patent durch irgendeine Theorie einschränken zu wollen, so sei hier dennoch die Ansicht geäußert, dass die erfindungsgemäßen Morphogene die Entzündungsreaktion teilweise dadurch verändern können, dass sie die Anheftung der Immuneffektorzellen an die luminale Seite des Blutgefäßendothels an oder in der Nähe der geschädigten Stellen und/oder der Entzündungsherde modulieren. Da die (hier beschriebene) Methode die Anheftung der Immuneffektorzellen an diese Stellen verhindert oder zumindest reduziert, wird auch die nachfolgende Freisetzung von gewebeschädigenden Substanzen an Stellen zerstörten Gewebes und/oder Entzündungsherden durch diese Immuneffektorzellen unterbunden. Weil der Extravasation der Immuneffektorzellen deren Anheftung (an das Gefäßendothel) vorausgehen muss, verhindert die (erfindungsgemäße) Methode auch das anfängliche und fortgesetzte Eindringen dieser Zellen in extravaskuläre Stellen mit zerstörtem Gewebe bzw. in aktive Entzündungsherde. Daher findet diese Erfindung nicht nur Anwendung in einem Verfahren zur Reduzierung oder Verhinderung von durch Immunzellen vermittelter Gewebezerstörung an extravaskulären Stellen mit vorausgegangener Gewebezerstörung, sondern bietet sich außerdem als Anwendung in einem Verfahren zur Reduzierung oder Verhinderung des fortlaufenden Eindringens von Immuneffektorzellen in extravaskuläre Bereiche von aktiven Entzündungskaskaden an. Fachleute werden außerdem unschwer erkennen, dass die erfindungsgemäßen Morphogene darüber hinaus für einen Mechanismus zur Unterbrechung der funktionellen Wechselwirkung von Immuneffektorzellen und Endothel in Betracht gezogen werden können, bei der die Adhäsionsmoleküle durch andere Stimula als eine Gewebeschädigung induziert werden.
Eine Entstehungsursache für Gewebeschädigungen ist der Kontakt der Zellen mit toxischen Sauerstoffkonzentrationen; dies ist z. B. bei Ischämie-Reperfusionsgewebeschäden (Sauerstoffmangel) und bei Hyperoxiaschäden (letal hohe Sauerstoffkonzentrationen) der Fall. Dementsprechend findet die Erfindung Anwendung in einem Verfahren zur Verringerung der durch Ischämie-Reperfusion und Hyperoxia induzierten Gewebeschäden, wobei ein Verfahrensschritt darin besteht, dass dem betroffenen Individuum vor, während oder nach der Schädigung des betroffenen Gewebes eine therapeutische Menge eines Morphogens verabreicht wird. In Fällen, bei denen die toxischen Sauerstoffkonzentrationen bewusst in Kauf genommen werden, wie z. B. bei einem chirurgischen oder klinischen Eingriff, wird das Morphogen vorzugsweise schon vor der Induzierung (der toxischen Sauerstoffkonzentrationen) verabreicht.
Im Gegensatz zu fibrogenen Wachstumsfaktoren wie TGF-β stimulieren die hier beschriebenen Morphogene außerdem die Gewebemorphogenese, aber weder die Fibrose noch die Entstehung von Narbengewebe (siehe Beispiel 9 unten). Dementsprechend haben die Morphogene neben ihrer Eigenschaft, die mit Entzündungsreaktionen verbundenen, gewebeschädigenden Wirkungen zu verhindern, außerdem die Eigenschaft, die Lebensfähigkeit von geschädigtem Gewebe bzw. geschädigten Organen zu verbessern, indem sie die Regenerierung geschädigten Gewebes fördern und eine Fibrogenese verhindern.
Weiterhin können die hier beschriebenen Morphogene die Epithelzellenproliferation verhindern (siehe Beispiel 10 unten). Diese Aktivität der Morphogene kann sich als besonders nützlich für die Behandlung der Psoriasis und anderer, mit Epithelzellpopulationen zusammenhängenden Entzündungskrankheiten erweisen.
Es folgen ausführliche Beschreibungen der für die Erfindung geejgneten Morphogene sowie von Verfahren für deren Verabreichung und Anwendung und von zahlreichen, nicht beschränkenden Beispielen, die

1.) die Eignung der hier beschriebenen Morphogene als Therapeutika für den Schutz von Gewebe vor den mit der Entzündungsreaktion des Körpers verbundenen Gewe beschädigungen belegen sollen und
2.) Tests bereitstellen sollen, mit denen potentielle Morphogene auf ihre Wirksamkeit geprüft werden können.

1. Nützliche Morphogene
Nach der in diesem Patent gegebenen Definition ist ein Protein dann ein Morphogen, wenn es die Entwicklungskaskade zellulärer und molekularer Ereignisse, die in der Entstehung neuen, organspezifischen Gewebes kulminiert, fördert und wenigstens das konservative C-terminate 6-Cystein-Skelett oder dessen funktionelles Äquivalent (siehe oben) enthält. Insbesondere können Morphogene in einer morphogenetisch permissiven Umgebung in der Regel alle folgenden biologischen Funktionen erfüllen: Stimulierung der Vermehrung von Vorläuferzellen, Stimulierung der Differenzierung von Vorläuferzellen, Stimulierung der Vermehrung von differenzierten Zellen sowie die Unterstützung des Wachstums und die Erhaltung der differenzierten Zellen, einschließlich der „Redifferenzierung" transformierter Zellen. Einzelheiten, wie die bei der Erfindung brauchbaren Morphogene zuerst identifiziert wurden, sowie eine Beschreibung für deren Herstellung, Anwendung und Prüfung auf Morphogenaktivität sind in USSN 667.274, eingereicht am 11. März 1991, und in USSN 752.764, eingereicht am 30. August 1991, offengelegt. Wie darin beschrieben ist, können die Morphogene aus natürlich vorkommendem Material in reiner Form (isoliert) oder mit Hilfe der hier offengelegten genetischen Sequenzen durch Rekombinationsmethoden in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen produziert werden Alternativ können mit Hilfe der darin offengelegten Methoden neue Morphogen-Sequenzen induziert werden.
Besonders nützliche Proteine sind solche, die die aus der Natur abgeleiteten und in Tabelle II offengelegten Sequenzen enthalten. Weitere nützliche Sequenzen sind z. B. die in US-Patent 5.0110691 offengelegten biosynthetischen Konstruktionen (z. B. COP-1, COP-3, COP-4, Cop-5, Cop-7 und COP-16).
Die für die Erfindung nützlichen Morphogene können weiterhin durch irgendeine der hier offengelegten 6 generischen Sequenzen (generische Sequenzen 1, 2, 3, 4, 5 und 6) beschrieben werden. Die generischen Sequenzen 1 und 2 können außerdem an ihrem N-Terminus die Sequenz
aufweisen.
In der unten stehenden Tabelle II werden die Aminosäuresequenzen der aktiven Regionen von nativen, als Morphogene identifizierten Proteinen verglichen, einschließlich Human-OP-1 (hOP-1, Seq.-ID-Nr. 5 sowie 16–17), Maus-OP-1 (mOP-1, Seq.-ID-Nr. 6 und 18–19), Human- und Maus-OP-2 (Seq.-ID-Nr. 7, 8 und 20–22), CMBP2A (Seq.-ID-Nr. 9), CBMP2B (Seq.-ID-Nr. 10), BMP3 (Seq.-ID-Nr. 26), DPP (von Drosophila, Seq.-ID-Nr. 11), Vgl (von Xenopus, Seq.-ID-Nr. 12), Vgr-1 (von der Maus, Seq.-ID-Nr. 13); GDF-1 (von der Maus, Seq.-ID-Nr. 14, 32 und 33), 60A-Protein (von Drosophila, Seq.-ID-Nr. 24 und 25), BMP5 (Seq.-ID-Nr. 27) und BMP6 (Seq.-ID-Nr. 28). Die Sequenzen wurden im Wesentlichen nach der Methode von Needleman et al., J. Mol., Biol. 48: 443–453 (1970), ausgerichtet, wobei die Berechnungen mit dem Align-Programm (DNAstar, Inc.) erfolgten. In der Tabelle bedeuten drei Punkte, dass die Aminosäure an dieser Position dieselbe ist wie die entsprechend Aminosäure in hOP-1. Drei Bindestriche zeigen an, dass in dieser Position keine Aminosäure vorhanden ist und dienen der besseren Darstellung von Homologien. So „fehlt" z. B. in CBMP-2A und CMBP-2B der Aminosäurerest 60. Natürlich enthalten beide diese Aminosäuresequenzen in dieser Region Asn-Ser (Pos. 58, 59), wobei CBMP-2A anschließend Lys und Ile enthält, während CBMP-2B Ser und Ile enthält.
Tabelle II
Derzeit am meisten bevorzugte, als erfindungsgemäße Morphogene nützliche Proteinsequenzen schließen die Aminosäuresequenz ein, die das konservierte 6-Cystein-Skelett von hOP1 (z. B. Aminosäurereste 43–139 von Seq.-ID-Nr. 5) festlegt. Zusätzlich schließen die am meisten bevorzugten Sequenzen sowohl allelische als auch artenspezifische Varianten der OP-1- und OP-2-Proteine ein, einschließlich Drosophila-Protein 60A. Dementsprechend fallen, unter einem weiteren bevorzugten Aspekt, alle Morphogene unter dieses Patent, die sich aus Polypeptidkettenvarianten mit der hier als „OPX" bezeichneten generischen Sequenz zusammensetzen, wobei „OPX" das 7-Cystein-Skelett festlegt und die Aminosäureidentitäten zwischen den verschiedenen identifizierten Maus- und Human-OP1- und OP-2-Sequenzen repräsentiert. OPX ist in Seq.-ID-Nr. 29 wiedergegeben. Wie dort beschrieben, werden die einzelnen Aminosäurereste Xaa für die jeweiligen Positionen unabhängig voneinander aufgrund der in den entsprechenden Positionen in der C-terminalen Sequenz von Maus- oder Human-OP1 bzw. -OP-2 gewählt (siehe Seq.-ID-Nr. 5–8 und/oder Seq.-ID-Nr. 16–23).
II. Formulierungen und Methoden für die Verabreichung therapeutischer Mittel
Die Morphogene können einem Individuum mt jeder nur denkbaren, geeigneten Methode verabreicht werden, bevorzugt direkt (d. h. lokal, durch Injektion in oder topische Auftragung auf eine bestimmte Gewebestelle) oder systemisch (d. h. parenteral oder oral). Wenn das Morphogen parenteral verabreicht werden soll, also z. B. durch intravenöse, subkutane, intramuskuläre, intraorbitale, ophthalmische, intraventrikuläre, intrakraniale, interkapsuläre, intraspinale, intrazisternale, intraperitoneale, bukkale, rektale, vaginale, intranasale Verabreichung oder durch Aerosole, liegt das Morphogen vorzugsweise in Form einer wäßrigen Lösung vor. Die Lösung ist physiologisch akzeptabel, so daß die Lösung nicht zusätzlich zu der gewünschten Verabreichung des Morphogens an den Patienten einen negativen Effekt auf das Elektrolyten- und Volumengleichgewicht des Patienten hat. Das wäßrige Medium des Morphogens kann deshalb aus normaler, physiologischer Kochsalzlösung (9,85% NaCl, 0,15 M) bestehen. Die wäßrige, das Morphogen enthaltende Lösung kann z. B. durch Auflösen des Proteins in 50%igem, Ethanol enthaltendem Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA), 1%iger Salzsäure oder einem ähnlichen Lösungsmittel hergestellt werden. Ein Teil der so erhaltenen Lösung wird dann z. B. mit zehn Teilen phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gemischt, wobei dem Ganzen noch 0,1–2,0% Humanserumalbumin (HSA) zugesetzt werden kann. Die erhaltene Lösung wird vorzugsweise auf einem Wirbelschüttler (Vortex) gründlich durchgemischt. Wenn dies gewünscht wird, kann ein gegebenes Morphogen durch Assoziation mit einem geeigneten Molekül leichter löslich gemacht werden. So kann z. B. das Morphogen durch Assoziation des maturierten Dimeren mit der Prodomäne des Morphogen in physiologischen Puffern in Lösung gehalten werden. Tatsächlich wird angenommen, daß das endogene Protein in dieser Form transportiert wird. Ein weiteres, zur Verbesserung der Löslichkeit und besonders für orale Anwendungen nützliches Molekül ist Casein. So wird z. B. die Löslichkeit der maturierten, aktiven Form von OP-1 durch Zusatz von 0,2% Casein um 80% gesteigert. Weitere Milchkomponenten und/oder verschiedene Serumproteine könnten sich ebenfalls als nützlich erweisen.
Für parenterale Verabreichung nützliche Lösungen können nach irgendeiner beliebigen, der pharmazeutischen Fachwelt gut bekannten Methoden hergestellt werden und sind z. B. beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences (Herausgeber: Gennaro, A.), Mack Pub., 1990. Die Formulierungen können z. B. Polalkylenglykole wie Polyethylenglykol, Pflanzenöle, hydrogenierte Naphthaline und dergleichen enthaften. Insbesondere Formulierungen für die direkte Auftragung können außerdem Glycerin und andere hochviskose Substanzen zugesetzt werden, um das Morphogen an der gewünschten Stelle zu fixieren. Biokompatible und vorzugsweise bioresorbierbare Polymere wie z. B. Hyaluronsäure, Kollagen, Tricalciumphosphat, Polybuttersäure, Lactid- und Glykolpolymere sowie Lactid/Glykol-Copolymere sind u. U. nützliche Vehikel zur kontrollierten Freisetzung der Morphogene in vivo. Andere potentiell nützliche parenterale Depotpräparate für diese Morphogene sind Ethylen/Vinylacetat-Copolymerpartikel, osmotische Pumpen, implantierbare Infusionssysteme und Liposome. Formulierungen zur Verabreichung durch Inhalation können als Vehikel z. B. Lactose enthalten oder aus wäßrigen, Polyoxyethylen-9-laurylether, Glycocholat oder Deoxycholat enthaltenden Lösungen bestehen, oder können ölige Lösungen zur Verabreichung in Form von Nasentropfen oder Gele für die intranasale Applikation sein. Formulierungen für die parenterale Verabreichung können weiterhin Glycocholat für bukkale Verabreichungen, Methoxysalicylat für rektale Verabreichung oder CUTRIC ACID [citric acid, Zitronensäure?] für vaginale Verabreichungen enthalten.
Zäpfchen für rektale Anwendungen können auch durch Mischen des Morphogens bzw. des Morphogen-stimulierenden Mittels mit einem nichtreizenden Vehikel wie Kakaobutter oder anderen Zusammensetzungen, die bei Raumtemperatur fest und bei Körpertemperatur flüssig sind, hergestellt werden.
Formulierungen für topische Auftragungen auf die Hautoberfläche können durch Dispergieren des Morphogens oder Morphogen-stimulierenden Mittels in einem dermal verträglichen Vehikel wie einer Lotion, Creme, Salbengrundlage oder Seife hergestellt werden. Besonders nützlich sind Vehikel, die einen Film oder eine Schicht über der Haut bilden können, so daß das aufgetragene Mittel lokalisiert bleibt und vor [unerwünschter] Entfernung geschützt ist. Für die topische Verabreichung auf interne Gewebeoberflächen kann das Morphogen in einem flüssigen Gewebekleber oder in einer anderen Substanz, die bekanntermaßen die Adsorption an eine Gewebeoberfläche fördert, dispergiert werden. So können z. B. Hydroxypropylcellulose oder Fibrinogen/Thrombin-Lösungen mit Vorteil angewandt werden. Alternativ können Gewebeüberzuglösungen wie pektinhaltige Formulierungen verwendet werden.
Alternativ können die hier beschriebenen Morphogene oral verabreicht werden. Die orale Verabreichung von Proteinen als Therapeutika ist in der Regel nicht üblich, da die meisten Proteine durch die im Verdauungssystem von Säugetieren vorhandenen Verdauungsenzyme und Säuren abgebaut werden, bevor sie in den Blutstrom absorbiert werden können. Die hier beschriebenen Morphogene sind jedoch in der Regel säurestabil und Protease-resistent (siehe z. B. US-Patent Nr. 4.968.590). Außerdem konnte wenigstens ein Morphogen, nämlich OP-1, in Brustdrüsenextrakt, Colostrum und 57-Tage-Milch nachgewiesen werden. Aus. dem Brustdrüsenextrakt in reiner Form isoliertes OP-1 ist darüber hinaus morphogenetisch aktiv. Genauer gesagt induziert dieses Protein, wenn es zusammen mit einem geeigneten Matrixmaterial subkutan implantiert wird, in Säugetieren die endochondrale Knochenbildung, nachweisbar durch einen gängigen In-vivo-Knochentest, wie er in US-Patent Nr. 4.968.590 offengelegt ist. Darüber hinaus kann das Morphogen auch im Blutstrom nachgewiesen werden. Schließlich ist die lösliche Morphogenform, d. h. das maturierte und mit der Prodomäne assoziierte Morphogen, morphogenetisch aktiv: Diese Beobachtungen machen deutlich, daß es möglich ist, Morphogene an Individuen oral und parenteral zu verabreichen, ohne die Morphogene zu inaktivieren. Während die endgültigen Formen bestimmter hier beschriebener Morphogene typischerweise nur schwer löslich sind, ist die in Milch (sowie im Brustdrüsenextrakt und Colostrum) gefundene Form leicht löslich, vermutlich aufgrund der Anlagerung der endgültigen, morphogenetisch aktiven Form an einen Teil oder die vollständige Prodomäne der intakten Sequenz und/oder durch Assoziation mit einer oder mehreren Milchkomponenten. Dementsprechend können die hier bereitgestellten Verbindungen auch mit Molekülen assoziiert sein, die die Löslichkeit der Morphogene in vitro oder in vivo verbessern.
In Fällen, wo das Morphogen oder das Morphogen-stimulierende Mittel Teil einer Gewebe- oder Organkonservierungslösung ist, kann mit Vorteil von jeder beliebigen, kommerziell erhältlichen Konservierungslösung Gebrauch gemacht werden. Fachleuten bekannte nützliche Lösungen sind z. B. Collins Lösung, Wisconsin-Lösung, Belzer-Lösung, Eurocollins-Lösung und mit Lactat versetzte Ringer-Lösung. In der Regel besitzt eine Organkonservierungslösung eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften: a) einen osmotischen Druck, der im wesentlichen dem Druck in einer Säugetierzelle entspricht (die Lösungen sind in der Regel hyperosmolar und enthalten K+ und Mg++-Ionen in ausreichend hoher Menge, daß ein osmotischer Druck erzeugt wird, der geringfügig höher als der in einer Säugetierzelle ist), b) die Lösung ist in der Regel in der Lage, im wesentlichen normale ATP-Spiegel in der Zelle aufrechtzuerhalten, und c) die Lösung gestattet in der Regel eine optimale Aufrechterhaltung des Glucose-Metabolismus in der Zelle. Darüber hinaus können Organkonservierungslösungen Antikoagulantien, Energiequellen wie Glucose, Fructose oder andere Zucker, Metaboliten, Schwermetall-Komplexbildner, Glycerin und andere Substanzen mit hoher Viskosität zur Verbesserung der Überlebenschancen bei tiefen Temperaturen, Radikalinhibitoren und einen pH-Wert-Indikator enthalten. Eine detaillierte Beschreibung von Konservierungslösungen und nützlichen Bestandteilen kann z. B. in US-Patent 5.002.965 nachgelesen werden.
Die hier beschriebenen Verbindungen können darüber hinaus mit Molekülen assoziiert sein, die das Morphogen bzw. das Morphogen-stimulierende Mittel zum gewünschten Gewebetarget steuern. So kann z. B. ein Antikörper, eine Antikörperfragment oder ein sonstiges Bindungsprotein verwendet werden, das spezifisch mit einem Oberflächenmolekül von Zellen auf dem gewünschten Gewebe wechselwirkt. Nützliche Targeting-Moleküle können z. B. mit der in US-Patent Nr. 5.091.513 offengelegten Einzelketten-Bindungstellen-Methode konstruiert werden.
Wie oben beschrieben, haben die hier bereitgestellten Morphogene eine bedeutende Sequenzhomologie in der C-terminalen, aktiven Domäne gemeinsam. Im Gegensatz dazu weichen die die Prodomänen definierenden Sequenzen in der Regel deutlich voneinander ab. Daher wird angenommen, daß die Prodomäne Morphogenspezifisch ist. Wie ebenfalls oben beschrieben, ist weiterhin bekannt, daß die verschiedenen bisher identifizierten Morphogene in unterschiedlichen Geweben unterschiedlich exprimiert werden. Wenngleich dieses Patent nicht durch irgendeine Theorie eingeschränkt werden soll, ist es dennoch vernünftig anzunehmen, daß unter natürlichen Bedingungen im Körper in der Regel auf ein bestimmtes Gewebe [nur] ausgewählte Morphogene wirken. Daher können die Prodomänen, die in Assoziation mit den aktiven Formen der Morphogene in Lösung identifiziert worden sind, komplett oder partiell als Targeting-Moleküle für die hier beschriebenen Morphogene fungieren. So können z. B. die Prodomänen spezifisch mit einem oder mehreren Molekülen auf dem Target-Gewebe wechselwirken, um das mit der Prodomäne assoziierte Morphogen zu diesem Gewebe zu steuern. Daher stellen Morphogen-Prodomänen, in kompletter oder partieller Form, weitere nützliche Targeting-Moleküle für die Zielsteuerung von Morphogenen zum gewünschten Gewebe dar. So kann z. B. die komplette oder partielle Prodomäne von GDF-1 zur Steuerung von Morphogenen zum Nervengewebe benutzt werden. Alternativ können die Prodomänen von OP-1 bzw. CBMP2, die beide natürlich mit Knochengewebe assoziiert gefunden wurden, komplett oder partiell dazu verwandt werden, ein Morphogen zum Knochengewebe zu steuern.
Die hier beschriebenen Morphogene haben sich als nützlich für die Bereitstellung Nervenzellen-schützender Wirkungen zur Verringerung der mit der Immunantwort/Entzündungsreaktion des Körpers auf eine anfängliche Nervenzellenschädigung verbundenen Nervenwegsschäden erwiesen. Hier wird unter einem "Nervenweg" ein Nervenkreislauf für die Weiterleitung elektrischer Signale von einer Quelle zu einem Targetzellenort verstanden und umfaßt sowohl das Zentralnervensystem (CNS) als auch das periphere Nervensystem (PNS). Zum Nervenweg werden die die elektrischen Impulse weiterleitenden Neuronen und untereinander verbundener Neuronengruppen, die durch die gebündelten neuronalen Axone gebildeten Nervenfasern sowie die die Neuronen umgebenden und mit ihnen verbundenen Gliazellen gerechnet. Eine Entzündungsreaktion auf eine Nervenzellschädigung kann auf ein Nervenzellentrauma erfolgen, das seinerseits z. B. durch eine Autoimmun-Dysfunktion (einschließlich Autoantikörpern), neoplastische Läsionen, Infektionen, chemisch oder mechanisch verursachte Trauma oder andere Krankheiten verursacht worden sein kann. Ein Lehrbuchbeispiel einer nervenbedingten inflammatorischen Erkrankung ist die multiple Sklerose. Eine Nervenwegsschädigung kann weiterhin das Ergebnis einer Verringerung oder Unterbrechung, z. B. einer Okklusion, der Blutversorgung des Nervengewebes sein, wie dies z. B. bei einem embolischen Gehirnschlag (z. B. bei Ischämie oder bei durch Hypoxie verursachten Schäden) der Fall ist, oder irgendeines anderen Nerventraumas oder eines Traumas der den Nerv umgebenden Matrix. Außerdem scheint wenigstens ein Teil der mit einer Reihe von primären Gehirntumoren verbundenen Gewebeschäden immunologisch verursacht zu sein. Eine Applikation des Morphogens direkt auf die zu behandelnden Zellen oder die systemische Verabreichung des Morphogens an das Säugetier, z. B. intravenös oder indirekt durch orale Verabreichung, kann dazu dienen, die mit einer Nervenschädigung verbundene Immunreaktion abzuschwächen oder gar zu unterbinden. Alternativ kann auch ein Mittel, das die Morphogen-Expression und/oder Sekretion in vivo stimuliert, vorzugsweise an der geschädigten Stelle, benutzt werden. In Fällen, bei denen die Verletzung bewusst vorgenommen wird, wie dies z. B. während eines chirurgischen Eingriffs oder bei einer aggressiven klinischen Behandlung der Fall ist, kann das Morphogen bzw. das Morphogen-stimulierende Mittel vor Beginn der Verletzung verabreicht werden, sodass das bedrohte Nervengewebe von vornherein geschützt wird.
In Fällen, wo der Einsatz des Morphogens als Therapeutikum zur Verringerung von mit Immun-/Entzündungsreaktionen im Zentralnervensystem verbundenen Nervenschäden vorgesehen ist, muss ein weiteres Problem angesprochen werden: Die Überwindung der so genannten „Blut-Hirn-Schranke", der Gehirnkapillaren-Wandstruktur also, die praktisch alle im Blut vorhandenen Moleküle bis auf wenige ausgewählte Kategorien ausfiltert und damit deren Passage in das Gehirn verhindert. Die Blut-Hirn-Schranke kann durch direkte Infusion des Morphogens oder Morphogen-stimulierenden Mittels in das Gehirn wirkungsvoll umgangen werden. Alternativ kann das Morphogen bzw. das Morphogenstimulierende Mittel so modifiziert werden, dass dessen Transport durch die Blut-Hirn-Schranke beschleunigt wird. In dieser Beziehung könnten trunkierte Formen des Morphogens oder Morphogen-stimulierenden Mittels am erfolgreichsten sein. Alternativ kann das Morphogen oder Morphogen-stimulierende Mittel so modifiziert werden, dass es lipophiler wird, oder es kann mit einem anderen Molekül konjugiert werden, das natürlicherweise durch die Schranke transportiert wird, wobei die üblichen Methoden verwendet werden, die dem Experten bekannt sind und die z. B. in Pardridge, Endocrine Reviews 7: 314–330 (1986) sowie US-Patent Nr. 4.801.575 beschrieben werden.
Schließlich können die hier zur Verfügung gestellten Morphogene allein oder kombiniert mit anderen Molekülen verabreicht werden, die in den hier beschriebenen Therapiearten und Behandlungsmethoden als vorteilhaft geschildert werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Antikoagulantien, freie Sauerstoffradikale hemmende Wirkstoffe, Salycyisäure, Vitamin D und andere entzündungshemmende Wirkstoffe. Die Behandlung von Psoriasis kann auch die Behandlung mit ultraviolettem Licht, Zinkoxid und Retinoiden einschließen.
Die hier zur Verfügung gestellten Verbindungen können durch Beimischung von pharmazeutisch akzetablen, nicht-giftigen Bindemitteln und Trägern zu Arzneimitteln verarbeitet werden. Wie oben erwähnt, können solche Kompositionen für die parenterale Verabreichung insbesondere als flüssige Lösungen oder Suspensionen oder für die orale Verabreichung insbesondere in Tabletten- oder Kapselform, oder für die intra-nasale Verabreichung in Form von Puder, Nasentropfen oder Aerosol-Sprays zubereitet werden.
Die Kompositionen können für die parenterale oder orale Verabreichung zu Menschen oder anderen Säugetieren in therapeutisch effektiven Mengen zubereitet werden, d. h. in Mengen, die für eine bestimmte Zeit in einer angemessenen Konzentration die mit entzündlichen Reaktionen einhergehenden gewebezerstörenden Wirkungen lindern, und überdies eine vorbeugende, gewebeschützende Wirkung haben.
Alle die in dieser Branche Tätigen werden wissen, dass die Konzentration der in einer therapeutischen Komposition beschriebenen Verbindungen variiert, was von einer Reihe von Faktoren abhängt, zu denen die Dosierung der zu verabreichenden Arznei gehört, sowie die chemischen Charakteristika (z. B. Hydrophobizität) der verwendeten Verbindungen, und die Verabreichungsart. Die bevorzugte Dosierung der zu verabreichenden Arznei hängt wahrscheinlich auch von solchen Variablen wie der Art und dem Stadium/Ausmaß der Gewebsverletzung, dem allgemeinen Gesundheitszustand des jeweiligen Patienten, der relativen biologischen Wirksamkeit der gewählten Verbindung, der Zusammensetzung der jeweiligen Bindemittel und der Verabreichungsart ab. Im Allgemeinen können die Verbindungen dieser Erfindung in einer wässrigen physiologischen Pufferlösung, die etwa 0,001% bis 10% w/v der Verbindung enthält, für parenterale Verabreichung zur Verfügung gestellt werden. Typische Dosierungen rangieren von etwa 10 ng/kg bis zu etwa 1 g/kg Körpergewicht pro Tag, wobei der bevorzugte Dosisbereich zwischen etwa 0,1 μg/kg bis zu 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag liegt. Optimalerweise liegt die Morphogen-Dosis zwischen 0,1 –100 μg Protein für jedes Kilo Körpergewicht des Patienten. Keinerlei offensichtlich Morphogen-induzierte pathologische Läsionen werden hervorgerufen, wenn reifes Morphogen (z. B. OP-1, 20 μg) täglich normal wachsenden Ratten 21 Tage nacheinander verabreicht wird. Darüber hinaus produzieren 10 μg systemische Morphogen-Injektionen (z. B. OP-1), die normalen Mäusen täglich 10 Tage nacheinander verabreicht wurden, keinerlei auffällige Anormalitäten.
Bei der systemischen Verabreichung wird die Behandlung mit der Gabe einer größeren Dosis begonnen. Danach wird die Behandlung mit einer Erhaltungsdosis fortgesetzt. Weitere Verabreichungen können durch regelmäßige Beobachtung des Morphogenspiegels im Blut festgesetzt werden.
Bei absichtlich herbeigeführten Gewebeverletzungen, wie dies beispielsweise bei Operationen der Fall ist, wird das Morphogen vorzugsweise unmittelbar vor oder gleichzeitig mit der Trauma-Induktion verabreicht. Vorzugsweise wird das Morphogen als prophylaktische Maßnahme während der Operation verabreicht.
Als Alternative kann eine wirksame Menge eines den endogenen Morphogenspiegel stimulierenden Wirkstoffs auf eine der oben beschriebenen Arten verabreicht werden. Beispielsweise kann ein Wirkstoff, der imstande ist, die Morphogen-Produktion und/oder Sekretion von Zellen des betroffenen Gewebes und/oder von Transplantat-Gewebe zu stimulieren, einem Säugetier zur Verfügung gestellt werden, beispielsweise durch direkte Verabreichung des Wirkstoffs in das zu behandelnde Gewebe. Eine Methode zur Identifizierung und zum Testen von Wirkstoffen, die in der Lage sind, den endogenen Morphogenspiegel eines bestimmten Gewebes zu stimulieren, wie in Beispiel 15 beschrieben, und detailliert in USSN 752.859, gleichzeitig angemeldetes Patent, eingereicht am 30. August 1991. Kurz gesagt, können in Frage kommende Verbindungen identifiziert und getestet werden, und zwar durch in vitro Inkubation der Verbindung mit einem Testgewebe oder Zellen eines Testgewebes für einen gewissen Zeitraum, der für die Produktion, d. h. die Absonderung und/oder die Sekretion eines von den Zellen des betreffenden Gewebes produzierten Morphogens ausreicht.
Für die Zwecke der hier vorgestellten Erfindung werden die oben beschriebenen Morphogene, die bei der Linderung von durch ischämische Reperfusions-Verletzungen hervorgerufenen Gewebeverletzungen wirksam sind, vor oder während der Wiederherstellung von Sauerstoff (d. h. der Wiederherstellung des Blutflusses, Reperfusion) verabreicht. Im Falle der Behandlung bereits existierender Verletzungen wird der therapeutische Wirkstoff vorzugsweise als intravenöse Injektion, und zwar sofort nach Eintritt des hypoxischen oder ischämischen Vorfalls verabreicht. Beispielsweise kann der therapeutische Wirkstoff durch eine intravenöse Infusion unmittelbar nach Eintritt eines Gehirninfarkts, eines Myokardinfarkts, bei Asphyxia, oder bei Herz/Lungen Stillstand verabreicht werden. In Fällen, bei denen ischämische oder hypoxische Verletzungen absichtlich und/oder unvermeidbar herbeigeführt werden, wie beispielsweise bei einem chirurgischen Eingriff, während dessen die Zirkulation eines Organs oder eines Organsystems absichtlich und/oder vorübergehend unterbrochen werden muss, wie beispielsweise bei einer karotiden Enterektomie, einem koronaren Bypass, bei Gewebstransplantationen, Organverpflanzungen, fibrinolytischer Therapie usw., wird der therapeutische Wirkstoff vorzugsweise unmittelbar vor oder zugleich mit der Sauerstoffreduktion dem Gewebe zugefügt. Vorzugsweise wird das Morphogen prophylaktisch während der Operation verabreicht.
In vergleichbarer Weise wird in Fällen, in denen eine durch Hypertoxie herbeigeführte Verletzung bereits vorhanden ist, das Morphogen nach der Diagnosestellung verabreicht. Wenn eine hyperoxische Verletzung, beispielsweise während der Behandlung von Frühgeborenen oder von an pulmonalen Krankheiten wie Emphysema leidenden Patienten herbeigeführt wird, sollte der therapeutische Wirkstoff vorzugsweise vor der Verabreichung des Sauerstoffs, d. h. prophylaktisch gegeben werden.
III. Beispiele
Beispiel 1. Identifizierung von Morphogene absonderndem Gewebe
Durch die Bestimmung der Verteilung von Morphogenen innerhalb des Gewebes können verschiedene Morphogene, die in einem bestimmten Gewebe abgesondert werden, identifiziert werden, so wie auch neue, verbundene Morphogene ausgemacht werden. Die Gewebeverteilung dient auch der Identifkation nützlichen, Morphogen-produzierenden Gewebes bei der Suche und Identifizierung möglicherweise Morphogene stimulierender Wirkstoffe. Die Morphogene (oder deren mRNA Transkripte) können mittels Standard-Methoden einfach in verschiedenen Geweben identifiziert werden, und bei Geweben mit geringer Absonderung mit leicht abweichenden Methoden. Die Protein-Verteilung kann beispielsweise mit Hilfe der im Western Blot-Analyse (Immunoblot) oder immuno-fluoreszenter Techniken, oder durch die speziellen Antikörper der jeweils interessanten Morphogene bestimmt werden. In gleicher Weise kann die Verteilung der Morphogen-Transkripte mittels der standardmäßig angewandten Northern Hybridisierungsverfahren und transkriptspezifischer Sondierung festgestellt werden.
Jede beliebige Sonde, die spezifisch für ein Transkript hybridisert werden kann und das jeweils interessante Transkript von anderen, verwandten Transkripten zu unterscheiden in der Lage ist, kann benutzt werden. Weil die hier beschriebenen Morphogene sich durch eine so hoch-sequentielle Homologie in ihren aktiven- C-terminalen Domänen auszeichnen, kann die Gewebeverteilung eines bestimmten Morphogen-Transkripts am besten mittels einer für die pro Region des unreifen Proteins und/oder die N-terminale Region des reifen Proteins spezifischen- Sonde bestimmt werden. Eine weitere nützliche Sequenz ist die 3'nicht-kodierende Region, die den Stop-Codon flankiert oder ihm unmittelbar folgt. Diese Teile der Sequenz variieren sehr bei den Morphogenen dieser Erfindung und sind dementsprechend spezifisch für jedes Protein. Eine besonders nützliche Vgr-1-spezifische Sondierungssequenz ist beispielsweise das PvuII-SacI-Fragment, ein 265 b Fragment, das sowohl einen Teil der nicht umgesetzten pro-Region und den N-Terminus der reifen Sequenz kodiert (siehe Lyons und andere (1989) PNAS 86: 4554–4558, wo sich eine Beschreibung de cDNA Sequenz befindet). Vergleichbar nützliche mOP-1-spezifische Sondierungsequenzen sind das BstX1-BglI Fragment, eine 0,68 kb Sequenz, die ungefähr 2/3 der mOP-1 pro-Region abdeckt; ein StuI-StuI Fragment, eine 0,2 Kb Sequenz unmittelbar oberhalb der 7-Cystein Domäne; und das Ear1-Pst1 Fragment, bei dem es sich um ein 0,3 Kb Fragment handelt, das einen Teil der 3' nicht umgesetzten Sequenz enthält (siehe Seq. ID Nr. 18, wo die pro-Region im Wesentlichen durch 30–291 Rückstände definiert ist). Ähnliche Ansätze können beispielsweise für hOP-1 (Seq ID Nr. 16) oder Mensch oder Maus OP-2 (Seq. ID Nr. 20 und 22) angewendet werden.
Mit Hilfe dieser morphogen-spezifischen Sonden, die künstlich hergestellt oder durch klonierte Sequenzen erhalten werden können, kann man unter Anwendung von Standardmethoden morphogene Transkripte als Säugetiergewebe identifizieren. Kurz gesagt wird die Gesamt RNA aus verschiedenen erwachsenen murinen Geweben hergestellt (z. B. Leber, Niere, Testis, Herz, Gehirn, Thymus und Magen), und zwar mittels von Standardtechiken wie der Methode von Chomoczyaski und anderer ((1987) Anal. Biochem 162: 156–159), unten beschrieben. Poly (A)+ RNA wird mittels der oligo- Zellulose(dT)-Chromatographie (z. B. Typ 7 von Pharmacia LKB Biotechnology, Inc) zubereitet. Poly (A)+ RNA (im Allgemeinen 15 μg) von jedem Gewebe wird auf einem 1%igen Agarose/Formaldehyd Gel fraktioniert und auf eine Nytran-Membran übertragen (Schleicher & Schuell). Nach dem Transfer wird die Membran bei 80°C gebacken und die RNA wird unter UV-Licht (im Allgemeinen 30 Sekunden bei 1 mW/cm²) strahlenvernetzt. Vor der Hybridisierung wird die in Frage kommende Sonde durch Erhitzung denaturiert. Diese Hybridisierung wird in einem Plexiglas-Zylinder, der in einer Rollenflaschenvorrichtung rotiert, ausgeführt, und zwar bei ungefähr 1 Umdrehung pro Minute, 15 Stunden lang, und bei einer Temperatur von 37°C, unter Verwendung einer Hybridisierungsmischung aus 40% Formamid, 5 × Denhardts, 5 × SSPE und 0,1% SDS. Nach der Hybridisierung werden nicht-spezifische Ergebnisse aus den Filtern in 0,1 SSPE, 0,1% SDS bei 50°C ausgespült.
Beispiele, die die Verteilung verschiedener Morphogene bei noch im Wachstum befindlichen und erwachsenen. Geweben zeigen, einschließlich Vgr-1, OP-1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, GDF-1 und OP-2, werden in der gleichzeitig zum Patent angemeldeten Schrift USSN 752 764 und bei Ozkaynak und anderen (1991) Biochem. Biophys. Res. Commn. 179: 116–123 beschrieben, sowie bei Ozkaynak und anderen (1992) (JBC, im Druck). Unter Verwendung des hier beschriebenen allgemeinen Sondierungsverfahrens, konnten die Northern Blot Hybridisierungen, die speziell auf diese Morphogene zugeschnittenen Sondierungen benutzen, um Gehirn-, Milz-, Lungen-, Herz-, Leber- und Nierengewebe zu untersuchen zeigen, dass mit den Nieren verbundenes Gewebe die primäre Absonderungsquelle für OP-1 zu sein scheint, und Hirn, Herz und Lungengewebe sekundäre Quellen darstellen. OP-1 mRNA wurde mit dieser Sondierungstechnik auch in den Speicheldrüsen, besonders in der Ohrspeicheldrüse von Ratten identifiziert. Lungengewebe scheint die primäre Absonderungsquelle von Vgr-1, BMP5, BMP4 und BMP3 zu sein. Geringere Mengen von Vgr-1 wurden auch im Nieren-und Herzgewebe entdeckt, während die Leber eine sekundäre Absonderungsquelle von BMP5, und die Milz die sekundäre Absonderungsquelle von BMP4 zu sein scheinen. GDF-1 scheint vorwiegend im Gehirngewebe abgesondert zu werden. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt scheint OP-2 primär in früh-embryonalem Gewebe ausgedrückt zu werden. In besonderem Maße zeigen Northern Blots von murinen Embryos und sechs Tage nach der Geburt eine Fülle von OP-2 Absonderung, besonders bei Tieren acht Tage alten Embryos. Die Absonderung nimmt deutlich bei 17 Tage alten Embryos ab und ist nach der Geburt in Tieren nicht mehr zu entdecken.
Beispiel 2: Aktive Morphogene in Körpersäften
OP-1 Absonderung (Expression) wurde im Speichel identifiziert (insbesondere in der Ohrspeicheldrüse der Ratte, siehe Beispiel 1), sowie im menschlichen Blutserum und verschiedenen Milchformen, einschließlich im Extrakt der Brustdrüsen, im Kolostrum und in Rindermilch von 57 Tage alten Rindern. Darüberhinaus ist, wie in USSN 923780 dargelegt, das aus den Körpersäften extrahierte Protein morphogenetisch aktiv. Die Entdeckung, dass das Morphogen natürlicherweise in der Milch und im Speichel vorhanden ist, sowie die bereits bekannte Beobachtung, dass reife, aktive OP-1 säurebeständig und Protease-resistent ist, weisen daraufhin, dass bei Säugetieren die orale Verabreichung von Morphogenen die empfehlenswerte Form ist. Die orale Verabreichung ist typischerweise die bevorzugte Art der Verabreichung für längere oder prophylaktische Behandlungen. Ausserdem legt die Identifizierung von Morphogenen in allen Milchformen, einschließlich des Kolostrums nahe, dass Protein ein wichtige Rolle bei der Gewebeentwicklung, einschließlich der Skelettausbildung von Jugendlichen spielt.
2.1 Die Entdeckung von Morphogenen in der Milch
OP-1 wurde teilweise aus dem Extrakt von den Brustdrüsen von Ratten und Rinder-Kolostrum und der Milch von 57 Tage alten Rindern geklärt, indem diese Flüssigkeiten über eine Reihe von chromatografischen Säulen geleitet wurden: (z. B. Kationen-Austausch, Affinität und Reverse-Phase). Bei jedem Schritt wurde das Eluierungsmittel in Fraktionen gesammelt, und diese wurden auf das Vorhandensein von OP-1 getestet, und zwar durch Standard Immunoblot-Test. Immunoreaktive Teile wurden dann kombinert und weiter geklärt. Das teilweise geklärte Endprodukt wurde dann mittels der Western Blot-Analyse unter Verwendung OP-spezifischer Antiseren auf das Vorhandensein von OP-1 sowie auf in vivo und in vitro Aktivität getestet.
Aus verschiedenen Milchquellen geklärtes OP-1 wurde mittels der Western Blot Technik und unter Verwendung von Antikörpern gegen OP-1 und BMP2 untersucht.
Antikörper wurden unter Anwendung von in der Branche wohlbekannter Standard-Immunologie Verfahren hergestellt, wobei, wie im Beispiel 15 unten beschrieben, durch E-coli erzeugte OP-1 voller Länge und BMP2 als Immunogene benutzt wurden. In allen Fällen reagierte die geklärte OP-1 nur mit dem anti-OP-1 Antikörper, nicht aber mit dem anti-BMP2 Antikörper.
Die morphogenische Aktivität des aus Brustdrüsen-Extrakt geklärten OP-1 wurde in vivo im wesentlichen gemäß dem Rattenmodell-Versuch bewertet, der in US Patent Nr. 4 968 590 beschrieben wird. Kurz gesagt, es wurde eine Probe von jeder OP-1 immuno-aktiven Fraktion des aus dem Brustdrüsen-Extrakt gewonnenen OP-1 Endprodukts durch Lyuphilisierung eines Teils (33%) der Fraktion und erneuter Suspensierung des Proteins in 220 μl 50% igem Acetonnitril/0,1% TFA hergestellt. Die Proben wurden über Nacht lyophilisiert und dann in Long Evans Ratten verpflanzt (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, 28–35 Tage alt.) Jede Fraktion wurde doppelt verpflanzt. Einzelheiten über das Kollagen-Matrix-Impiantationsverfahren findet man z. B. im U.S. Patent Nr. 4 968 590. Nach 12 Tagen wurden die Implantate entfernt und durch histologische Beobachtungen auf neue Knochenbildungen hin untersucht, wie in U.S. Patent Nr. 4 968 590 beschrieben. In allen Fällen waren die immunoaktiven Fraktionen osteogenisch aktiv.
2.2 Die Entdeckung von Morphogenen im Serum
Morphogene können im Serum mittels morphogen-spezifischer Antikörper entdeckt werden. Der Versuch kann mittels beliebiger Standard Immuntests, wie etwa dem Western Blot (Immunoblot) und ähnlichem durchgeführt werden. Vorzugsweise wird der Versuch unter Verwendung einer Affinitätssäule durchgeführt, an die der morphogen-spezifische Antikörper gebunden und durch die das Proben-Serum dann gegossen wird, um die jeweils interessanten Morphngene selektiv zu extrahieren. Dann wird das Morphogen eluiert. Ein geeigneter Eluierungspuffer kann empirisch bestimmt werden durch Determinierung von Bindungs-und Eluierungsbedingungen mit einer Kontrolle (z. B. einem geklärten, durch Neukombiniertung erzeugten Morphogen.) Fraktionen werden auf das Vorhandensein des Morphogens mittels Standardimmunoblot-Tests überprüft, wobei die Ergebnisse durch N-terminales Klassifizieren bestätigt werden. Vorzugsweise wird die Affinitätssäule durch Verwendung monoklonaler Antikörper bebildet. Konzentrationen von Morphogenen im Serum oder anderen Flüssigkeitesproben können dann mittels Standard Protein-Quantifizierungstechniken bestimmt werden, wozu auch die spektrophotometrische Absorbierung und der quantitative Nachweis konjugierter Antikörper gehören.
Unten findet sich ein Beispielsverfahren für die Identifkation von OP-1 im Serum. Nach diesem generellen Verfahren können weitere Morphogene in Körpersäften entdeckt werden, auch im Serum. Die Identifizierung des Morphogens im Serum weist ausserdem darauf hin, dass die systemische Verabreichung die geeignte Form ist, in der therapeutische Konzentrationen eines Morphogens Individuen zugeführt werden kann, und dass Morphogene sich wahrscheinlich systemisch wie endokrinartige Faktoren verhalten. Und schließlich können mit Hilfe dieses Verfahrens Schwankungen im endogenen Morphogenspiegel entdeckt werden, und diese veränderten Spiegel können durch Beobachtung der Transkript-Spiegel der Morphogene bewertet werden, entweder durch die standardmäßige Northern Blot Analyse, die in Beispiel 1 beschrieben wurde, oder durch Hybridisierung in situ, und zwar mittels einer markiertert Sonde, die speziell für die Hybridisierung von morphogenem mRNA geignet ist, und durch Standard RNA Hybridisierungsverfahren, die in der Branche wohlbekannt sind und allgemein im Beispiel 1 beschrieben werden.
OP-1 wurde im menschlichen Serum mit Hilfe der folgenden Versuchsanordnung entdeckt. Ein monoklonaler Antikörper gegen Säugetiere, durch Neukombination und mittels wohlbekannter und beschriebenen, hier besonders in Beispiel 15 exemplifizerter Standard-Immunolgietechniken erzeugtes OP-1 wurde durch Überführen des Antikörpers über ein Agarose-aktiviertes Gel (z. B. Affi-Gel^TM, von Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien, hergestellt nach Angaben des Herstellers) immobilisiert und für die Klärung von OP-1 aus dem Serum verwendet. Dann wurde menschliches Serum über die Säule geführt und mit 3 M K-Thiocyanat eluiert. Fraktionen des K-Thiocyanats wurden dann in 8 M (unlesbar dialysiert 20 (unlesbar) einer C8HPLC Säule zugeführt und mit einem 20 minütigem, 25–50%igem Acetonnitril/0,1% TFA Gradienten eluiert. Reife, durch Neukombination erzeugte OP-1 Homodimers eluieren zwischen 20 und 22 Minuten. Dann wurden Fraktionen gesammelt und auf Vorhandensein von OP-1 untersucht, und zwar mittels Standard Immunoblot Test, bei dem ein OP-1 spezifischer Antikörper wie für Beispiel 2 verwendet wurde.
Die Überwachung der Mengen des verabreichten oder endogenen Morphogens kann anhand der hier beschriebenen Therapien erfolgen, indem die Menge an Morphogen, die in einer Flüssigkeitsprobe aus dem Körper vorhanden ist, mit einem vorher bestimmten Vergleichswert verglichen wird, beispielsweise zur Auswertung der Wirksamkeit einer therapeutischen Behandlungsmethode, und so weiter. Darüber hinaus kann Fluktuation der Mengen von endogenen Morphogen-Antikörpern mit Hilfe dieser Methode bestimmt werden, höchst wahrscheinlich im Serum, und zwar unter Verwendung eines Antikörpers oder eines anderen Bindungsproteins, welches die Möglichkeit der spezifischen Interaktion mit dem endogenen Morphogen-Antikörper bietet. Festgestellte Fluktuationen in den Mengen des Morphogens oder des endogenen Antikörpers sind zum Beispiel als Indikatoren für eine Änderung im Zustand des Gewebes brauchbar. Zum Beispiel sind unter Umständen niedrige Dosen des Morphogens nötig, wenn das beschädigte Gewebe regeneriert ist und das Gewebe oder die Organfunktion bei Abwesenheit von zusätzlichen Schädigungen des Gewebes wieder ,normalisiert' wird, und daher kann eine gesteigerte Menge an zirkulierendem Morphogen-Antikörper gemessen werden.
Beispiel 3: Effekt des Morphogens nach Beginn des ischämischen Prozesses
Der das Herz schützende Effekt von Morphogenen im Anschluss an eine Schädigung durch Ischämie und anschließende Reperfusion in einem Säugetier kann in einem Modell mit Ratten einfach veranschaulicht werden. In diesem Beispiel wird ein Morphogen (beispielsweise OP-1) direkt vor dem Beginn des ischämischen Prozesses bei experimentell induzierten Myokardinfarkten in Rasten verabreicht, und zwar im Wesentlichen gemäss der Methode von Lefer, et al. (1990) Science, 249: 61– 64 und (1992), J. Mol. Cell. Cardiol. 24: 385–393. Kurzum, der Verlust der Herzgewebsfunktion im Anschluss an Ischämie und die Reperfusion wird experimentell bestimmt durch Messung des Verlustes der Myokard Creatinkinase Aktivität (CK) und des Verlustes der vom Endothel abhängigen Funktion der Blutgefäßentspannung. (siehe Beispiel 4, nachfolgend).
In einer ersten Gruppe von mit Äther betäubten Ratten wurde die linke Koronararterie in direkter Nachbarschaft zu der ersten Hauptverzweigung mit einem Seidenfaden vernäht und damit ein Arterienverschluss verursacht, um einen Myokardinfarkt (MI) hervor zu rufen. Die Fäden wurden 10 Minuten nach dem Erzeugen des Verschlusses gezogen, um die Koronar-Reperfusion zu ermöglichen. Diese erste Gruppe wird hier als die „Gruppe mit Myokardinfarkt" (MI) bezeichnet. Eine zweite Gruppe von Ratten wurde der gleichen Prozedur unterzogen, jedoch wurde kein Arterienverschluss der Koronararterie erzeugt, und daher wurde kein Myokardinfarkt ausgelöst. Diese zweite Gruppe von Ratten wird hier als die „Gruppe mit vorgetäuschtem Myokardinfarkt" (SHAM MI) bezeichnet.
Die erste Gruppe von Ratten, die MI-Gruppe der Ratten, wurde weiter aufgeteilt in drei Untergruppen: Die erste Untergruppe der MI-Ratten erhielt eine intravenöse Injektion von 2 μg Morphogen (OP-1) 10 Minuten nach der Ligatur, und unmittelbar vor der Reperfusion. Die zweite Untergruppe der MI-Ratten erhielt eine intravenöse Injektion von 20 μg OP-1 10 Minuten nach der Ligatur und direkt vor der Reperfusion. Und die dritte Untergruppe der MI-Ratten (Kontrolle) erhielt eine Injektion der Lösung ohne Substrat, z B. 0,9%ige NaCl, wie diese auch für die mit OP-1 behandelten Tiere verwendet wurde.
Vierundzwanzig Stunden später wurden die Herzen aus allen Ratten entfernt und die Mengen an verbleibender Creatinkinase (CK) in dem linken Ventrikel (der Region mit dem Infarkt) und aus dem Septum interventriculare (die nicht ischämische Region als Kontrolle) mit Standardmethoden bestimmt. Nach Vergleich der Differenz in CK-Aktivitäten in beiden Regionen wurde der Wert für den Verlust an CK-Aktivität aus der Region mit dem Infarkt als Indikation für die Schädigung der Herzzellen in der Region mit dem Infarkt verwendet.
Wie in 1 zu sehen ist, zeigen die Ergebnisse, dass Morphogene (wie beispielsweise OP-1) eine erhebliche, schützende Wirkung auf das Herzgewebes haben kann, wenn sie dem ischämischen Gewebe bereitgestellt werden. In der Abbildung ist der Verlust der CK-Aktivität als Differenz in spezifischer CK-Aktivität zwischen dem Ventrikelseptum und dem linken Ventrikel aufgetragen.
Der Verlust an CK-Aktivität in der Untergruppe der MI-Ratten, welche 2 μg OP-1 direkt vor der Reperfusion erhielt, zeigte ein wenig Schutz im Vergleich mit der Kontrollgruppe der MI-Ratten, welche nur eine Injektionen der Lösung ohne Substrat erhielt, wenn die Mengen aus beiden Untergruppen gegen die Mengen gemessen werden, die aus den SHAM MI Kontrollratten erhalten wurden. Erheblicher Schutz des Herzgewebes konnte in der Untergruppe der MI-Ratten beobachtet werden, welche 20 μg OP-1 direkt vor der Reperfusion erhielt, im Vergleich zu der Kontrollgruppe der MI-Ratten, welche nur eine Injektionen der Lösung ohne Substrat erhielt, wenn die Mengen aus beiden Untergruppen gegen die Mengen gemessen werden, die aus den SHAM MI Kontrollratten erhalten wurden.
Diese Daten zeigen, dass OP-1 einen erheblichen Schutz für Herzgewebe bietet, wenn es nach der Ischämie und vor der Reperfusion verabreicht wird.
Eine Variation dieses Beispiels kann auch durchgeführt werden, indem dem Tier das Morphogen vor der Induktion der Ischämie verabreicht wird. Diese Experimente können sowohl in normalen Ratten, als auch in Ratten mit Immundefizienz durchgeführt werden, um den schützenden Effekt für das Herzgewebe durch das vor der Ischämie verabreichte Morphogen zu bestimmen.
Beispiel 4: Vasodilatation in dem mit Mophogen behandeltem Herzgewebe mit Myokardinfarkt.
Bestimmte Vasodilatatoren wie zum Beispiel Acetylcholin (ACh) und Adenosindiphosphat (ADP, ein Vermittler der lmmunreaktion) üben ihre Vasodilatationswirkung nur in Gegenwart von intaktem Endothel aus, welches seinerseits zur Freisetzung einer Substanz mit dem Namen EDRF (endothelialer Faktor, der zur Vasodilatation führt) angeregt wird. Falls das Endothel eine Verletzung erlitt, so dass EDRF nicht freigesetzt wird, dann wird keine Vasodilatation als Antwort auf diese vom Endothel abhängigen Agenzien hervorgerufen. Im Gegensatz dazu sind einige der anderen Vasodilatatoren, einschließlich Nitroglycerin (NTG) und Nitroprussid, nicht vom Endothel abhängig, da sie die Blutgefässe direkt erweitern.
Das vorliegende Experiment demonstriert die Fähigkeit von OP-1, den Verlust der vom Endothel abhängigen Entspannungsaktivität in der Mikrovaskulärstruktur der Koronararterien im Anschluss an Reperfusion von ischämischem Myokard, und dessen Fähigkeit der Reduktion von Myokardschädigung innerhalb 24 Stunden nach Morphogenbehandlung. In Kürze: 2 bis 24 Stunden nach einer Morphogenbehandlung wird in isolierten Herzen von Ratten Reperfusion nach Ischämie induziert, dann werden die wieder durchbluteten Herzen der Vasodilatation mit entweder ACh oder NTG unterzogen. Bei Abwesenheit der Morphogenbehandlung sollte geschädigtes Gewebe die durch ACh verursachte Vasodilatation hemmen, jedoch nicht die durch NTG verursachte Vasodilatation. Morphogenbehandlung sollte erwartungsgemäß die von ACh vermittelte Vasodilatation in den erneut durchbluteten Herzen verbessern.
Dementsprechend wurden 48 ausgewachsene männliche Ratten des Stammes Spraque-Dawley in acht Gruppen von je sechs Ratten aufgeteilt. Zwölf Ratten wurden den vorgetäuschten Myokardinfarkten unterzogen (SHAM MI), wie dies unter Beispiel 3 beschrieben wurde. Die Herzen der verbleibenden 36 Ratten wurden wie folgt isoliert: ein Satz von zwölf Ratten erhielt eine intravenöse Injektion von OP-1 24 Stunden vor der Isolierung ihres Herzens; ein anderer Satz von zwölf Ratten erhellt eine intravenöse Injektion von 20 μg OP-1 2 Stunden vor der Isolierung ihres Herzens; die letzte Gruppe von Ratten erhellt eine Injektion der Lösung ohne Substrat (d. h. 0,9%ige NaCl). Die Ratten wurden dann mit Natrimpentobarbital (35 mg/kg, intraperitoneal) betäubt. Ihre Herzen wurden isoliert und mittels der Methode nach Langendorff unter einem kontinuierlichen Fluss (15 ml/min) mit sauerstoffangereicherter Krebs-Henseleit-Lösung perfusioniert (Aoki et al. (1988 J. Pharmacol. 95: 35).
Jede Gruppe von Ratten wurde dann in je zwei Untergruppen zu je sechs Ratten aufgeteilt. Zwanzig Minuten vor Reperfusion wurde die Antwort auf Koronaivasodilatatoren gemessen durch Induktion einer Konstriktion mit 0,05 μmol U-44619 (9,11-Methanoepoxy-Prostaglandin H₂), gefolgt von einer Behandlung mit einem Vasodilatator 3 Minuten später. Untergruppe eins – 15 nmol ACh, Untergruppe 2–15 nmol NTG. Danach wurde die Zunahme in Perfusionsdruck in den Koronararterien (CPP) als Indikator der Vasodilatation gemessen. Nachdem die CPP Niveaus in den Normalzustand zurück gekehrt waren, wurden die Herzen der Ischämie unterzogen durch Reduktion der Koronarinfusion auf 15% des kontrollierten Flusses für 30 Minuten, dann wurde der Normalfluss wieder hergestellt, d. h. es erfolgte Reperfusion, für weitere 20 Minuten.
Die Antwort auf die Vasodilatatoren wurde anschließend erneut durch Induktion der Konstriktion und der Verabreichung der Vasodilatatoren gemäss der obigen Beschreibung gemessen.
Die Ergebnisse dieser Experimente werden in 2 gezeigt. Vor der Ischämie zeigten ACh und NTG beide normale Vasodilatationsergebnisse bei allen Versuchsbedingungen. Die Herzen, welche OP-1 24 Stunden vor der Ischämie erhielten, zeigten etwa 70% der Antwort auf ACh, während die Herzen, welche OP-1 2 Stunden vor der Ischämie erhielten, eine Antwort von 55% auf ACh zeigten. Die Gruppe, weiche nur Lösung ohne Substrat erhalten hatte, zeigte eine Antwort von 40% auf ACh. Die Kontrollgruppe schließlich, welche nicht der Ischämie unterzogen wurde, zeigte eine Antwort auf ACh von etwa 95%. Dies zeigt, dass die vom Endothel abhängigen Vasodilatatoren eine reduzierte Antwort auf Vasodilatatoren nach Ischämie und anschließender Reperfusian aufweisen. Darüber hinaus wahrte OP-1 die endothelabhängige Vasodilatation in erheblichem Ausmaß, wenn die Behandlung 24 Stunden vor Induktion der Myokardischämie erfolgte. Keine Mängel in der Vasodilatation konnten bei der Verabreichung von einem direkten Vasodilatator (NTG) beobachtet werden. NTG-induzierte Vasodilatation lag bei 95% der ursprünglichen Aktivität bei Herzen, die der Ischämie unterzogen wurden, und bei 100% der ursprünglichen Aktivität für Herzen, die keine Ischämie erlitten.
Beispiel 5. Auswirkung des Morphogens auf die Adhärenz von neutrophilen Granulozyten
Die Rolle der Adhärenz von neutrophilen Granulozyten bei der Fehlfunktion des Endotheis und die schützenden Auswirkungen des Morphogens bei der Modulation dieser Aktivität kann bestimmt werden unter Verwendung eines Standard-Assays zur Bestimmung der Adhärenz von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN), wie beispielsweise beschrieben von Lefer et al., (1992) J. Mol., Cell, Cardiol. 24: 385– 393. In Kürze werden hierbei Segmente der Arteria mesenterica superioris aus Ratten isoliert, welche entweder mit Morphogen (OP-1, 20 μg) oder mit 0,9%iger NaCl 24 Stunden vor der Isolierung der Arterien behandelt worden waren. Die Segmente wurden gereinigt, in transversale Ringe von 1–2 mm Länge geschnitten, und diese Ringe wurden anschließend aufgeschnitten und in K-H Lösung bei 37°C und pH 7,4 inkubiert. Die neutrophiien Granulozyten wurden präpariert und erhielten ein Fluoreszenzlabel unter Anwendung der Standardverfahren (beispielsweise wurden Leukozyten aus Ratten isoliert, und zwar im Wesentlichen nach der Methode von Pertroft et al., (1968) Exp. Cell. Res. 50: 355–368, dann in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, durch Gradientenzentrifugation gereinigt und mit Hilfe der Methode von Yuan et al., (1990) Microvasc. Res. 40: 218–229, mit einem Fluoreszenzlabel versehen.). Die mit dem Label versehenen neutrophiien Granulozyten wurden dann den Inkubationen der offenen Ringe hinzugefügt und mit 100 nM Leukotrien B₄ (LTB₄) aktiviert. Die Ringe wurden für 20 Minuten inkubiert und die Zahl der an die Endotheloberfläche adhärierenden neutrophilen Granulozyten wurde dann durch Fluoreszenzmikroskopie visuell bestimmt.
Wie in 3 gezeigt wird, zeigten die Versuchsansätze mit nicht stimulierten PMN's (d. h. Zugabe von PMN alleine) keine wesentliche Adhärenz an das vaskuläre Endothel. Bei den Ringen von den Arterien aus den Ratten, welche eine Injektion von 0,9%iger NaCl erhalten hatten, erhöhte die Stimulation der neutrophilen Granuiozyten durch LTB₄ (100 nM) im Allgemeinen die Zahl der an das Endothel adhärierenden PMN's (P < 0,001). OP-1 (20 μg verabreicht 24 Stunden vorher) zeigte eine erhebliche inhibierung der Adhärenz von PMN, welche von LTB₄ aktiviert worden waren. (P < 0,01 aus der Kontrolle).
Beispiel 6: In Vivo Modelle für Schutz von Lungen-, Nerven- und Nierengewebe bei Ischämie und Reperfusion.
Andere Gewebe, die erheblich durch Schädigung bei Ischämie und Reperfusion beeinträchtigt werden, umfassen Nervengewebe, Nierengewebe und Lungengewebe. Die Auswirkung von Morphogenen auf die Linderung dieser Schädigung bei Ischämie und Reperfusion dieser Gewebe kann bestimmt werden unter Verwendung der Methoden und Modelle, welche allgemein bei sachverständigen Wissenschaftlern auf diesem Gebiet bekannt sind, und wie diese im Folgenden beschrieben werden. In ähnlicher Weise wird auch eine Methode vorgelegt, mit der die gewebsschützenden Auswirkungen von Morphogenen auf geschädigtes Lungengewebe nach Hyperoxie bestimmt werden können.
Zum Beispiel bietet das Model mit Kaninchen für Schlaganfall durch Embolie eine nützliche Methode für die Bestimmung des Effekts von Morphogenen auf Gewebsverletzung nach cerebraler Ischämie und Reperfusion. Das unten beschriebene Versuchsprotokoll stimmt im wesentlichen mit dem von Phillips et al. (1969) Annals of Neurology 25: 281–285 überein. Kurzum: weiße New England Kaninchen (2–3 kg) werden betäubt und in einen Respirator gesteckt. Die Intrakranialzirkulation wird dann selektiv katheterisiert mit Hilfe der Methode von Seldinger. Danach wird eine grundlegende Angiographie des Hirns durchgeführt unter Verwendung einer digitalen Substrateinheit. Die distale interne Arteria carotis oder ihre Verzweigungen werden dann selektiv embolisiert mit 0,035 ml eines 18 Stunden gealterten autologen Thrombus. Arterienverschluss wird durch erneute Angiographie sofort im Anschluss an die Embolisierung dokumentiert. Nachdem eine ausreichende Zeit vergangen ist, um Hirnschläge zu verursachen (15 Minuten oder 90 Minuten), wird Reperfusion durch Verabreichung eines Bolus eines Perfusionsagens, wie beispielsweise das TPA-Analog Fb-FB-CF (z. B. 0,8 mg/kg über 2 Minuten Dauer) induziert.
Die Auswirkung eines Morphogens auf Hirnschläge kann bestimmt werden durch Verabreichen unterschiedlicher Konzentrationen von Morphogenen, z. B. OP-1, zu verschiedenen Zeitpunkten vor oder nach der Embolisierung und/oder Reperfusion. Die Kaninchen werden 3–14 Tage nach der Embolisierung getötet und ihre Gehirne werden für die neiaropathologische Untersuchung vorbereitet, indem sie durch Immersion in 10% gepuffertem Formalin mit neutralem pH für mindestens 2 Wochen fixiert werden. Die Gehirne werden dann in Intervallen von 2–3 mm in einer koronalen Ebene geschnitten, nummeriert und den normalen histologischen Methoden mit Paraffin unterzogen, und der Grad der Gewebsnekrose in dem neuronalen Gewebe wird visuell bestimmt.
Die schützenden Auswirkungen der Morphogene auf Nierengewebe bei Schädigung der Nieren durch Ischämie und Reperfusion kann einfach unter Verwendung eines Mausmodeils bestimmt werden, wie es von Oueliette et al. (1990), J. Clin. Invest., 85: 766–771, beschrieben wurde. Im Überblick: Ischämie der Nieren wird operativ in 35–45 Tage alten, ausgezüchteten weißen Schweizer Mäusen erzeugt durch Ausführung einer normalen Nephrektomie der rechten Niere und Okklusion der Arterie zur linken Niere mit einer Mikroaneurismaklammer für 10–30 Minuten. Morphogen kann dann parenteral zu verschiedenen Zeitpunkten vor oder nach der Okklusion und/oder Reperfusion verabreicht werden. Die Auswirkungen des Morphogens können dann durch biologische Auswertung und histologische Auswertung unter Verwendung der auf diesem Gebiet wohlbekannten Standardmethoden erfolgen.
Die gewebsschützenden Auswirkungen des Morphogens auf Gewebe, welches hohen tödlichen Konzentrationen von Sauerstoff ausgesetzt war, können mit der folgenden Methode ermittelt werden. Ausgewachsene Ratten (275–300 Gramm) werden zuerst mit Morphogen behandelt (z. B. hOP-1), oder nur mit der Lösung ohne Substrat, und werden dann einer Sauerstoffkonzentration von 96–98% ausgesetzt, wie dies im Wesentlichen von Rinaldo et al. (1983), Am. Rev. Respir. Dis. 130: 1065 beschrieben wurde, um Hyperoxie zu erzeugen. Die Tiere werden in besonderen Plastikkäfigen untergebracht (38 cm × 48 cm × 21 cm). Ein Käfig mit 4–5 Tieren wird in einer Plexiglaskammer mit 75 Liter Volumen und von Wasser verschlossen platziert. Eine Atmosphäre von 96–98% Sauerstoff wird dann durch Einfuhr von O₂-Gas (von flüssigem O₂) aufrecht erhalten. Der Gasfluss durch die Kammer wird angepasst, um mindestens 10 Luftaustausche pro Stunde bei einer Temperatur von 22 ± 1°C und minimaler Kondensation innerhalb des Käfigs aufrecht zu erhalten, und eine Kohlendioxidkonzentration von < 0,5%, wobei diese Bedingungen mittels eines massenspektrometrischen Gasanalysegerätes gemessen werden.
Nach Ablauf von 72 Stunden werden alle Überlebenden bei normaler Raumluft für 1,5 Stunden beobachtet und für längere Zeiträume, um den Grad von Atemnot und Cyanosis, verursacht durch den ursprünglichen Insult und die anschließende, durch das Immunsystem vermittelte Schädigung, zu bestimmen. Die Zahl der Überlebenden am Ende der Stressbelastung wird aufgezeichnet und die behandelten Gruppen werden mit der nicht behandelten Kontrollgruppe durch Chi-Quadrat-Tests für Proportionen verglichen. Einige der überlebenden Tiere jeder Gruppe werden unwillkürlich für histologische Untersuchung des Lungengewebes ausgewählt.
Lungengewebe wird für histologische Verarbeitung mit einer Infusion von 10% gepuffertem Formalin durch eine Trachealkanüle unter einem konstanten Druck von 20 cm H₂O fixiert. Nach der Fixierung für 24–48 Stunden werden Sektionen von jedem der Lappen geschnitten und anschließend mit Hämatoxilin und Eosin gefärbt. Kodierte Objektträger werden dann untersucht, bevorzugter Weise mit der doppelblind Methode, und zwar auf den Nachweis der pathologischen Änderungen wie Vorhandensein von Ödemata, hinsichtlich der interstitiellen Zellbeschaffenheit und der Entzuendungserscheinungen.
Beispiel 7. Hemmung der zellulären und humoralen Immunantwort mit Hilfe von Morphogen
Die hierin beschriebenen Morphogene inhibieren die polynukleare Riesenzellbitdung von mononuklearen phagozytischen Zellen unter Bedingungen, wo diese Zelten normalerweise aktiviert werden, zum Beispiel bei einer Immunantwort auf beschädigtes Gewebe oder der Gegenwart einer fremden Substanz. Zum Beispiel wird bei der Abwesenheit von Morphogenen ein implantiertes Substratmaterial (beispietsweise nach subkutaner Implantation), wie zum Beispiel mineralisierte Knochen, ein keramisches Metall wie Titanoxid, oder ein jegliches anderes Substrat, welches die Formierung von Riesenzellen mit mehrfachen Zellkernen stimuliert, schnell von Riesenzellen mit mehrfachen Zellkernen umgeben, zum Beispiel von aktivierten Phagozyten, weiche zur Antwort stimuliert werden, um das Fremdobjekt zu zerstören. Bei der Gegenwart von Morphogenen jedoch verbleiben die herangeholten Zehen in ihrer mononuklearen Precursorform und das Matrixmaterial bleibt ungestört erhalten. 4 zeigt diesen Effekt von Morphogenen in einer schematischen Darstellung von histologischen Funden für ein subkutan implantiertes Titanoxid Substrat. In der Abbildung bedeutet ,mg' mononukleare Riesenzelle und ,ob' bedeutet Osteoblast. Das in 4B dargestellte Substrat wurde zusammen mit Morphogen (OP-1) implantiert, und neu geformte Osteoblasten sind deutlich in der Umgebung des Substrates erkennbar. Dahingegen wurde das in 4A dargestellte Substrat ohne Morphogen implantiert und eine ausgedehnte Formierung von polynuklearen Riesenzellen ist deutlich in der Umgebung des Substrates erkennbar. Dementsprechend kann die Wirkung des Morphogens bei der Hemmung des ausgedehnten Verlusts von Knochenmasse in einem Säugetier auch die Inhibierungsaktivität dieser Zellen umfassen.
Darüber hinaus haben die hierin beschriebenen Morphogene auch eine Funktion der Unterdrückung von Antikörperproduktion, welche als Antwort auf ein fremdes Antigen in einem Säugetier stimuliert wird. Insbesondere, wenn nur eine Kollagenmatrix aus Knochen der Kuh in einem Knochen implantiert wurde, wird eine normale Immunantwort auf das Kollagen in der Ratte stimuliert, wie diese durch Standard ELISA Tests für Anti-Bovin-Kollagen nachgewiesen wird, welche mit Blutproben durchgeführt wurden, die in Abständen von vier Wochen nach Implantation entnommen wurden (zum Beispiel zwischen 12 und 20 Wochen). Der Serumtiter für Antikollagen-Antikörper, gemessen mit ELISA, wobei im Wesentlichen die Methode von Nagler-Anderson et al., (1986), PNAS 83: 7443–7446 angewendet wurde, stieg stetig im Verlauf des Experiments. Wenn die Matrix jedoch zusammen mit einem Morphogen (z. B. OP-1, verteilt in der Matrix und daran absorbiert, im wesentlichen wie dies im U.S.-Patent 4,968,590 beschrieben wurde) implantiert wurde, so konnte eine erhebliche Suppression der Antikörperproduktion beobachtet werden. Diese Fähigkeit der Morphogene, die humorale Immunantwort zu unterdrücken, ist ein weiterer Beweis der Nützlichkeit der Morphogene bei der Linderung von Gewebsschädigung in Verbindung mit Autoimmunerkrankungen, einschließlich Autoantikörpererkrankungen wie beispielsweise chronische Polyarthritis (oder rheumatoide Arthritis).
Beispiel 8. Schutz der Tunica mucosa des Magen-Darm-Kanals vor Ulzeration und Entzündung mit Hilfe von Morphogenen.
Orale Schleimhautentzündung ist eine Entzündungserkrankung des Magen-Darm-Kanals, an der Ulzeration der Mundschleimhaut als Folge von beispielsweise Strahlentherapie oder Chemotherapie beteiligt ist. Während diese nicht typischer Weise eine chronische Erkrankung ist, reflektieren die gewebsschädigenden Effekte der oralen Mucositis die der chronischen Entzündungskrankheiten wie beispielsweise IBD. Das unten ausgeführte Beispiel zeigt die Wirksamkeit der Morphogene bei dem Schutz der oralen Schleimhaut vor oraler Mucositis in einem Hamstermodell, einschließlich sowohl der Inhibierung der entzündungsbedingten Ulzeration, als auch der Verbesserung der Regenerierung von ulzeriertem Gewebe. Einzelheiten des Protokolls können unter Sonis, et al., (1990) Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. 69: 437–443, nachgelesen werden. Basierend auf diesen Daten sollten die hierin beschriebenen Morphogene eine Wirksamkeit bei der Behandlung von chronischen Entzündungskrankheiten, wie beispielsweise IBD, Arhritis, Schuppenflechte, psoriatischer Arthritis, Multipler Sklerose und so weiter haben.
Syrische Goldhamster (6–8 Wochen alt, von den Charles River Laboratories in Wilmington, MA) wurden in drei Testgruppen aufgeteilt: Gruppe 1, eine Placebo Kontrollgruppe (beispielsweise Kochsalzlösung), und eine Gruppe mit niedriger Morphogendosis (100 ng) und einer Gruppe mit hoher Morphogendosis (1 μg), entsprechend Gruppen 2 und 3. Die Morphogendosen wurden in 30%igem Ethanol verabreicht. Jede Gruppe enthielt 12 Tiere.
Beginnend mit Tag 0 und bis zum Ende des Tages 5 hindurch erhielten die Gruppen 2 und 3 zweimal täglich eine Verabreichung von Morphogen. Am dritten Tag begannen alle Gruppen mit der Prozedur zur Induktion der Mucositis. 5-Fluorouracil (60 mg/kg) wurde intraperitoneal an den Tagen 3 und 5 injiziert. Am 7ten Tag wurde die Mucosa der rechten Wange an der Oberfläche irritiert mit einer kalibrierten Nadel der Feinheitsnummer 18. Bei den nicht behandelten Tieren wurde dadurch bei mindestens 80% der Tiere spätestens am 10ten Tag schwere ulzerierende Mucositis induziert.
Jede Verabreichung von Placebo in der Kontrollgruppe oder Morphogen erfolgte, indem zuerst die Mucosa der Wange leicht getrocknet wurde, und dann eine gleichmäßige Auftagung der Placebolösung oder des Morphogens auf der Oberfläche der Schleimhaut erfolgte. Zur Erhaltung des Kontakts des Morphogens mit der Mucosa wurde die Beschichtung mit einem Träger auf Hydroxypropylzeilulosebasis verwendet. Diese Auftragungsmethode bot mindestens 4 Stunden Kontakt.
Am 12ten Tag wurden zwei Tiere aus jeder Gruppe für histologische Untersuchungszwecke getötet. Die Mucosa der rechten Wangentasche und das unterliegende Bindegewebe wurden abgetrennt und diese wurden in einer 10%igen Formalinlösung fixiert unter Anwendung der Standardmethoden für die Gewebsabtrennung und histologischen Verfahren. Die Gewebsproben wurden in Paraffin auf Objektträgern fixiert und zur histologischen Untersuchung vorbereitet. Die Schnitte wurden anschließend mit Hämatoxilin und Eosin gefärbt und blind von drei Oralpathologen mit Erfahrung in der Histologie von Hamstern untersucht, und die Bewertung erfolgte blind gegen Standardobjekte mit Mucositis. Das Ausmaß der Atrophie, der Zelleninfiltration, des Abbaus von Bindegewebe, der Grad der Geschwürbildung und der Epithelbildung bei Wundheilung wurden bewertet.
Die durchschnittliche Bewertung der Mucositis für jede Gruppe wurde täglich für jede experimentelle Gruppe für einen Zeitraum von 21 Tagen durch Fotographie und visuelle Auswertung der rechten Wangentasche bestimmt. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden ermittelt unter Verwendung eines Standardtests ,t', beispielsweise des ,t'-Tests der Studenten. Darüber hinaus wurden Daten zwischen den Gruppen ausgewertet durch Vergleich der Zahl der Tiere mit schwerer Mucositis unter Anwendung der statistischen Analyse mit Chi-Quadrat-Verteilung. Die Signifikanz der Unterschiede in den Mittelwerten des täglichen Gewichtes wurde ebenfalls bestimmt.
Die experimentellen Ergebnisse werden in 5 dargestellt, wobei die Effekte des Morphogens (hohe Dosis, Quadrate; niedrige Dosis, Rauten) und des Placebos (Kreise) auf die mittlere Mucositisbewertung aufgetragen wurden. Sowohl niedrige als auch hohe Dosen inhibieren die Formierung von Läsionen in erheblicher, und dosisabhängiger Weise. Darüber hinaus zeigten die histologischen Ergebnisse in konsistenter Weise erhebliche Reduktion in der Menge von Atrophie der Läsionen, Zellabfall und Immuneffektorzellen, einschließlich Makrophagen und aktivierten neutrophilen Granulozyten bei den mit Morphogen behandelten Tieren im Vergleich mit den nicht behandelten Tieren der Kontrollgruppe.
Beispiel 9. Effekt von Morphogen auf Fibrogenese und Bildung von Narbengewebe.
Die hierin beschriebenen Morphogene induzieren Gewebsmorphogenese von beschädigtem oder verlorenem Gewebe. Die Fähigkeit dieser Proteine, neues Gewebe zu regenerieren, verstärkt den entzuhängungshemmenden Effekt dieser Proteine. im folgenden werden Serien von in-vivo Experimenten dargestellt, in denen die Fähigkeit der Morphogene zur Induktion der Wanderung und Ansammlung von mesenchymalen Zellen veranschaulicht wird. Darüber hinaus demonstrieren diese Experimente, dass Morphogene im Gegensatz zu TGF-β die Fibrogenese oder die Bildung von Narbengewebe nicht stimulieren. Insbesondere stimulieren die Morphogene nicht die Produktion von Kollagen, Hyaluronsäure (HA) oder Metallproteinasen in primären Fibroblasten, welche alle zur Fibrogenese oder der Bildung von Narbengewebe benötigt werden. Im Gegensatz dazu stimuliert TGF-β, ein bekanntes Induktionsmittel für Fibrose, jedoch nicht für Gewebsmorphogenese, die Produktion dieser Marker für Fibrose.
Chemotaxis und Wanderung von mesenchymalen Zellen der Filialgeneration wurden in abgewandelten Boyden-Kammern gemessen, und zwar im wesentlichen nach der Methode, wie sie von Fave, R. A., et al., (1991), J. Exp. Med. 173: 1121–1132 beschrieben wurde, unter Verwendung von Polykarbonat-Filtern mit Poren von 2, 3 und 8 Mikron Durchmesser zur Messung der Wanderung von neutrophilen Granulozyten, Monozyten und Fibroblasten der Filialgeneration. Chemotaxis wurde über einen weiten Bereich von Morphogenkonzentrationen gemessen, beispielsweise 10^-20 M bis 10^–12 M OP-1. Für neutrophile Granulozyten und Monozyten der Filialgeneration induzierte eine Konzentration von 10^–18 bis 10^–17 M OP-1 beständig maximale Wanderung, und 10^–14 bis 10^–13 M OP-1 induzierte die maximale Wanderung von Fibroblasten der Filialgeneration. In allen Fällen konnte die Chemotaxis-Aktivität mit Anti-OP-1 Antikörper inhibiert werden. Ähnliche Wanderungsaktivität wurde auch mit TGF-β gemessen und beobachtet.
Der Effekt der Morphogene auf die Fibrogenese wurde bestimmt durch Auswertung der Produktion von Hyaluronsäure (HA), Kollagen, Kollagenase und Gewebsinibitoren für Metallproteinasen (TIMP) durch Fibroblasten.
Menschliche Fibroblasten wurden aus Explantaten der Vorhaut von Neugeborenen gewonnen und in einer Monolayer Kultur erhalten unter Anwendung standardgemäßer Kulturverfahren. (Siehe beispielsweise (1976), J. Exp. Med. 144: 1188–1203). In Kürze: Die Fibroblasten wurden in normalem Medium bestehend aus Eagle's MEM mit einem Zusatz von nicht essentielle Aminosäuren, Ascorbinsäure (50 μg/ml), NaHCO₃ und HEPES Puffer (pH 7,2), Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (10 μg/ml), Amphotericin B (1 μg/ml) und 9% hitzeinaktiviertes FCS, kultiviert.
Fibroblasten, welche als Zielzellen zur Messung von Chemotaxis verwendet wurden, wurden in Petrischalen aus Glas von 150 mm Durchmesser kultiviert. Die Fibroblasten, welche für die Assays zur Bestimmung der Synthese von Kollagen, Hyaluronsäure, Kollagenase und Gewebsinhibitoren der Metallproteinasen (TIMP) verwendet wurden, wurden in Petrischalen aus Plastik für Zellkultur mit einem Durchmesser von 100 mm kultiviert.
Die Effekte von Morphogen auf die Produktion von Hyaluronsäure, Kollagen, Kollagenase und TIMP durch Fibroblasten wurden durch Standardassays ermittelt (Siehe beispielsweise Postiethwaite, et al. (1989), J. Clin. Invest. 83: 629–636, Postiethwaithe (1988), J. Cell Biol., 106: 311–318, und Clark, et al., (1985), Arch. Biochem. Biophys. 241: 36–44). Für diese Assays wurden Fibroblasten auf Kulturplatten für Gewebe mit 24 Wells in einer Dichte von 8 × 10⁴ Zellen pro Well übertragen. Die Fibroblasten wurden weiterhin in normalem Medium kultiviert, welches 9% FCS enthielt, und zwar für 72 Stunden, und wurden dann in serumfreien Medium für weitere 24 Stunden weiter wachsen lassen. Dann wurde das Medium aus jedem Well entfernt und verschiedene Konzentrationen von OP-1 (rekombinant hergestellt in naturierter oder löslicher Form) oder TGF-β-1 (R & D Systems, Minneapolis), aufgenommen in 50 μl PBS, wurden den verdreifachten Wells mit Fibroblast-Monolayers zugefügt. Für die Experimente, in denen die Produktion von Kollagenase und TIMP gemessen wurde, erhielt jedes Well normales Medium (450 μl) mit 5% FCS, und die Kulturüberstände wurden aus jedem Well 48 Stunden später abgenommen und bei –70°C bis zu ihrer Verwendung in einem Assay aufbewahrt. Für die Experimente zur Bestimmung von NA-Produktion wurde jedem Well normales Medium (450 μl) mit 2,5% FCS zugegeben, und die Kulturen für 48 Stunden inkubiert. Für Experimente, wobei die Produktion von Kollagenen in Fibroblasten gemessen werden sollte, erhielt jedes Well die Zugabe von serumfreiem Medium (450 μl) ohne nicht essentielle Aminosäuren, und die Kulturen wurden für 72 Stunden inkubiert. Die Produktion von HA in Fibroblasten wurde gemessen, indem neu synthetisierte Glykosaminglykane (GAG) für die letzten 24 Stunden ihrer Kultur mit [³H]-Acetat gelabelt wurden, und die abgegebene Radioaktivität nach Inkubation mit Hyaluronidase aus Streptomyces Hyalurolyiticus (ICN Biochemicals, Clevland, OH), welche spezifisch Hyaluronsäure abbaut, quantifiziert wurde. Die Gesamtproduktion von Kollagen durch Fibroblasten wurde gemessen unter Anwendung eines Assays für Kollagenase-sensitives Protein, welcher den Einbau von [³H]-Prolin in den letzten 24 Stunden der Kulturphase in neu synthetisiertes Kollagen wiedergibt. Die Mengen für die Proteine Kollagenase und TIMP wurden anhand spezifischer ELISA-Tests gemessen.
Wie in 6 gezeigt wird, stimuliert OP-1 die Produktion von Kollagen und HA nicht wesentlich im Vergleich zu den Experimenten mit TGF-β. In der Abbildung zeigt Spalte A den Effekt von OP-1 auf die Kollagenproduktion, Spalte B zeigt den Effekt von TGF-β auf die Kollagenproduktion und die Spalten C und D zeigen die Auswirkungen von OP-1 (Spalte C) und TGF-β (Spalte D). auf die Produktion von HA. Die Ergebnisse für die Morphogene waren gleich für die Verwendung von löslicher oder naturierter Form von OP-1. Im Gegensatz dazu war die latente Form von TGF-β (zum Beispiel die Form von TGF-β ohne Domänenassoztation) nicht aktiv.
Beispiel 10. Hemmung der Zellproliferation der Epithelzellen durch Morphogen.
Dieses Beispiel demonstriert die Fähigkeit der Morphogene, die Zellproliferation der Epithelzellen in vitro zu hemmen, wie dies mittels der ³H-Thymidin-Aufnahme unter Verwendung von Zellen in Kultur von einer Zellinie von Epithelzellen aus Nerzen (ATCC Nr. CCL 64) und der Anwendung normaler Verfahren für die Zellkultur von Säugetierzellen betsimmt wurde. Kurz gesagt wurden die Zellen bis zur Konfluenz in Eagle's Mindestkuiturmedium (EMEM) mit einem Zusatz von 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 200 U/ml Penicillin, und 200 μg/ml Streptomycin kultiviert und für die Beschickung von Zellkulturplatten mit 48 Wells mit einer Dichte von 200.000 Zellen pro Welt verwendet. Nachdem Konfluenz hier erreicht wurde, ersetzte man das Medium mit 0,5 ml EMEM mit 1% FBS, sowie Streptomycin/Penicillin, und die Kultur wurde für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Dann wurden Morphogenproben in EMEM mit 5% FBS zu den Wells hinzugegeben und die Zellen für weitere 18 Stunden inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden jedem Well 1,0 μCi von ³H-Thymidin in 10 μl hinzugegeben und die Zellen bei 37°C für vier Stunden inkubiert. Anschließend wurden die Medien abgenommen und die Zellen ein Mal mit eiskalter Phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen; dann wurde die DNA durch Zugabe von 0,5 ml einer 10%igen TCA in jedem Well und Inkubation bei Zimmertemperatur für 15 Minuten präzipitiert. Dann wurden die Zellen drei Mal mit eiskaltem destilliertem Wasser gewaschen, mit 0,5 ml 0,4 M NaOH lysiert und dann das Lysat aus jedem Well in ein Scintillationsgefäß überführt und die Radioaktivität unter Verwendung eines Scintillationszählers (Smith-Kline Beckman) gemessen.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle III nachfolgend dargestellt. Die Wirkung der Hemmung von Proliferation durch verschiedene getestete Morphogene wurde ausgedrückt als die Zählungen des ³H-Thymidins (× 1000), welches in DNA eingebaut wurde, im Vergleich zu nicht behandelten Zeilen (negative Kontrolle) und TGF-β (1 ng), einem örtlich handelnden Faktor, welcher ebenfalls bekannter Weise die Proliferation von Epithelzellen hemmt. COP-5 und COP-7 sind biosynthetische Konstruktionen, welche gemäss vorherigen Untersuchungen osteogene Aktivität zeigten, und welche zur Induktion der vollständigen Kaskade mit dem Endergebnis der enchondralen Knochenformation in einem Standardassay für Knochenbildung bei Ratten fähig sind (siehe U.S. Patent Nr. 5,011,691). Die Morphogene hemmen die Proliferation der Epithelzellen in erheblichem Maße. Ähnliche Experimente, welche mit den Morphogenen COP-16, bOP (bone Purified osteogenic protein – Osteogeneseprotein aus Knochen gereinigt, einem dimeres Protein bestehend aus CBMP2 und OP-1), und rekombinantem OP-1 durchgeführt wurden, hemmen die Zellproliferation ebenfalls. bOP und COP-16 induzieren auch die enchondrale Knochenformation (siehe U.S. Patent Nr. 4,968,590 und 5,011,691).
Tabelle III
Beispiel 11: Morphogen-Behandlung einer systemischen entzündlichen Erkrankung
Das folgende Beispiel stellt ein Modell einer durch Adjuvans herbeigeführten Arthritis an Ratten dar, mit Hilfe dessen die Wirksamkeit von Morphogen bei der Behandlung von Arthritis und anderen systemischen entzündlichen Erkrankungen aufgezeigt wird. Adjuvans-induzierte Arthritis bei Ratten führt eine systemische entzündliche Erkrankung mit Knochen- und Knorpelveränderungen herbei, die ähnlich sind wie die, die bei rheumatoider Arthritis beobachtet werden, jedoch in einer beschleunigten Zeitspanne (siehe beispielsweise Pearson (1964), Arth. Rheum., 7: 80). Eine detaillierte Beschreibung dieses Protokolls findet sich bei Walz et al., (1971), J. Pharmac. Exp. Ther., 178: 223–231.
In Kürze: weibliche Sprague-Dawley-Ratten (z. B. von Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA) werden randomisiert drei Gruppen zugeteilt: Kontrolle, Morphogen in niedrigen Dosen (z. B. 1–10 μg/kg Gewicht pro Tag) und Morphogen in hohen Dosen (z. B. 10–20 μg/kg Gewicht pro Tag), im folgenden als Gruppe 1, 2 bzw. 3 bezeichnet.
Adjuvans-Arthritis wird in allen drei Gruppen durch Injektion von 0,05 ml einer Suspension von 1,5% totem Mycobakterium butyricum in Mineralöl in die Fußsohienoberfläche der rechten Pfote herbeigeführt. An Tag 18 nach der Adjuvans-Injektion wird der Umfang beider Hinterbeine festgestellt. Bei Fehlen einer Behandlung mit Morphogen ist zu diesem Zeitpunkt ein systemischer arthritischer Zustand in den mit Adjuvans injizierten Ratten herbeigeführt, wie er durch signifikante Schwellung der uninjizierten Hinterbeine festgestellt wird (< 2,3 ml, Volumen wird durch Quecksilberverdrängung gemessen). Nachfolgende Feststellungen von Pfotenödemen und Röntgen-Scores werden am uninjizierten Hinterbein vorgenommen. Die Ratten der Gruppen 2 und 3 werden beginnend an Tag 1 zusätzlich täglich oral mit Morphogen behandelt. Der Umfang der Extremitäten wird an den Tagen 29 und 50 nach der Adjuvans-Injektion aufgenommen und Ödeme werden festgestellt durch den Unterschied im Volumen im Vergleich zu Tag 18. Die uninjizierten Hinterbeine aller Ratten werden an Tag 50 geröntgt und der Gelenkschaden wird in einer arbiträren Skala von 1 bis 10 geschätzt (1 = keine Schäden, 10 = maximale Schäden). Die Daten der Unterschiede zwischen Kontrollgruppe und den behandelten Gruppen (Ödeme an Tag 29, Ödeme an Tag 50 und Röntgen-Scores an Tag 50) werden mit Hilfe eines Standard-T-Tests analysiert. Mit Morphogen behandelte Ratten zeigen durchweg verminderte Gelenkschäden (z. B. verminderte Ödeme und Röntgen-Scores) im Vergleich zu den unbehandelten Ratten der Kontrollgruppe.
In einem weiteren alternativen Beispiel werden die Gruppen 2 und 3 von Tag 18 bis zu Tag 50 täglich mit Morphogen behandelt, wodurch die Wirksamkeit von Morphogenen in arthritischen Tieren demonstriert wird.
Beispiel 12: Hemmung lokalisierter Ödeme durch Morphogen
Das folgende Beispiel demonstriert die Wirksamkeit von Morphogen in der Hemmung einer lokalisierten entzündlichen Reaktion innerhalb eines Standard-Ödemmodells an Ratten. Experimentratten (z. B. Long-Evans von Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA) werden in drei Gruppen eingeteilt: Gruppe 1, eine negative Kontrollgruppe, die nur die Trägersubstanz erhält, Gruppe 2, eine positive Kontrollgruppe, die einen bekannten charakterisierten antiinflammatorischen Wirkstoff erhält (z. B. Indomethacin), und Gruppe 3, der Morphogen verabreicht wird.
Die Gruppen 2 und 3 können außerdem weiter unterteilt werden, um niedrige, mittlere und hohe Dosen zu prüfen (z. B. Gruppe 2: 1,0 mg/kg, 3,0 mg/kg und 9,0 mg/kg Indomethacin; Gruppe 3: 0,1–5 μg, 5–20 μg und 20–50 μg Morphogen). Sechzig Minuten nach der Gabe von Indomethacin oder Morphogen an die Ratten der Gruppen 2 und 3 (z. B. durch Injektion in die Schwanzvene oder durch Schlundsonde) wird bei allen Ratten eine Entzündung durch subplantare Injektion einer einprozentigen Carrageenin-Lösung (50 μl) in die rechte Hinterpfote herbeigeführt. Drei Stunden nach der Carrageenin-Gabe wird der Pfotenumfang gemessen als Indikation eines Ödems (z. B. Schwellung) und der herbeigeführten entzündlichen Reaktion auf die injizierte Carrageenin-Lösung.
Signifikante Schwellung wird bei den unbehandelten Ratten innerhalb von drei Stunden nach der Carrageenin-Injektion ersichtlich. Die Entzündung wird zudem nach der Tötung durch histologische Standardmethoden gemessen, z. B. wird die rechte Hinterpfote jedes Tieres am Knöchelgelenk abgenommen und gewogen. Das Fußballengewebe wird in zehnprozentiger neutraler gepufferter Formalinlösung fixiert und Objektträger werden zur optischen Untersuchung vorbereitet, indem das vorbereitete Gewebe mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt wird.
Die Ratten, die mit Morphogen behandelt wurden, zeigten im Vergleich zu den unbehandelten Ratten eine beträchtlich reduzierte Ödeminduktion nach der Carrageenin-Injektion.
Beispiel 13: Behandlung von allergischer Enzephalomyelitis mit Morphogen
Das folgende Beispiel demonstriert die Wirksamkeit von Morphogen bei der Behandlung von experimenteller allergischer Enzephalomyelitis (EAE) bei einer Ratte. EAE ist ein gut charakterisiertes Tiermodell für multiple Sklerose, eine Autoimmunerkrankung. Eine detaillierte Beschreibung des Protokolls findet sich bei Kuruvilla et al., (1991), PNAS 88: 2918–2921.
In Kürze: EAE wird in Ratten herbeigeführt (z. B. Long-Evans von Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA) durch die Injektion eines Gewebehomogenats des zentralen Nervensystems (z. B. Rückenmark) in komplettem Freundschem Adjuvans (KFA) an den Tagen –44, –30 und 0 (der letzte Tag der Immunisierung) durch subkutane Injektion an drei Stellen auf dem Rücken der Tiere. Morphogen wird täglich durch interperitonale Injektion von Tag –31 an gegeben. Vorzugsweise sollte eine Reihe von Morphogen-Dosisbereichen evaluiert werden (z. B. niedrige, mittlere und hohe Dosierung), wie bei Beispiel 12, s. o. Die Kontrollratten erhalten nur die Morphogen-Trägersubstanz (z. B. 0,9% NaCl oder geputferte Kochsalzlösung). Die Ratten werden täglich auf Krankheitssymptome hin untersucht und nach einer ansteigenden Schwere-Skala von 0 bis 4 eingestuft.
Bei Fehlen einer Morphogen-Behandlung ist eine signifikante neurologische Dysfunktion (z. B. Schwäche in den Hinter- und Vorderbeirten, die sich zu totaler Hinterbein-Lähmung steigert) innerhalb der Tage +7 bis +10 ersichtlich. Hämatologische, histologische und serumchemische Profile werden nach Standardvorgehensweisen unternommen, um die Schwere der Gewebsnekropsie zu evaluieren. Die Behandlung mit Morphogen hemmt die neurologische Dysfunktion, die normalerweise in einem EAE-Tier zu sehen ist, in signifikantem Maß. Außerdem fehlen die histopathologischen Marker, die normalerweise mit EAE assoziiert werden, bei den mit Morphogen behandelten Tieren.
Beispiel 14: Behandlung von Kollagen-induzierter Arthritis mit Morphogen
Das folgende Beispiel demonstriert die Wirksamkeit von Morphogenen bei der Hemmung der entzündlichen Reaktion in einer kollagen-induzierten Arthritis (KIA) bei Ratten. KIA ist ein gut charakterisieries Tiermodell für rheumatoide Arthritis, eine Autoimmunerkrankung. Das Protokoll entspricht im wesentlichen dem bei Kuruvilla et at. besprochenen Protokoll: (1991), PNAS 88: 2918–2921.
In Kürze: KIA wird in Versuchsratten (z. B. Long-Evans von Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA) durch mehrfache intradermale Injektion von bovinem Typ-II-Kollagen (z. B. 100 μg) in KFA (0,2 ml) an Tag 1. Die Tiere werden in zwei Gruppen eingeteilt: Gruppe 1, die Kontrollgruppe, die nur die Trägersubstanz erhalten und Gruppe 2, die mit Morphogen behandelten Tiere, die vorzugsweise weiterhin in niedrige, mittlere und hohe Dosisbereiche unterteilt werden, wie es im obigen Beispiel 13 beschrieben wird. Morphogen wird täglich gegeben (z. B. durch injektion in die Schwanzvene) zu verschiedenen Anfangszeitpunkten nach der Kollageninjektion, z. B. beginnend an den Tagen 7, 14, 28, 35 und 42. Die Tiere werden optisch untersucht und Pfotenumfang und Körpergewicht wird über die Dauer des Experiments hinweg beobachtet. Die Tiere werden an Tag 60 getötet und die proximalen und distalen Extremitätengelenke, sowie Ohren, Schwanz, und Rückenmark zur histologischen Evaluierung vorbereitet, wie es in den Beispielen 12 und 13 oben beschrieben. In einer Variante des Versuchs kann Morphogen über vorgeschriebene Zeiträume hinweg gegeben werden, z. B. fünftägige Zeiträume und beginnend zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Kollagen-Injektion (z. B. an den Tagen 0–4, 7–11, 14–18 und 28–32).
Bei Fehlen einer Behandlung mit Morphogen wird ein arthritischer Zustand normalerweise innerhalb von 30 Tagen nach der Kollagenijektion herbeigeführt. Bei mit Morphogen behandelten Tieren ist KIA unterdrückt und die histopathologischen Veränderungen, die typischerweise in den KIA-induzierten Kontrolltieren zu sehen sind, fehlen, z. B. Akkumulationen von aktivierten mononuklearen Entzündungszellen und fibröses Bindegewebe. In Übereinstimmung mit Beispiel 7 oben sind bei den mit Morphogen behandelten Tieren außerdem die Serum-Antikollagen-Antikörperfiter in signifikantem Maß unterdrückt.
Beispiel 15: Screening-Nachweisverfahren für Versuchszusammensetzungen die die endogenen Morphogen-Spiegel ändern
Eine oder mehrere Versuchszusammensetzungen, deren Gabe den Spiegel eines bestimmten Morphogens zu beeinflussen, können durch das folgende Screening-Nachweisverfahren ausfindig gemacht werden, in dem der Spiegel der Morphogenproduktion durch einen Zelltypus festgestellt wird der messbare Mengen an Morphogen bildet, mit und ohne Inkubation der Zelle in Kultur mit der Zusammensetzung, wodurch die Wirkung der Zusammensetzung auf die Zelle evaluiert wird. Dies kann durch die Entdeckung des Morphogens entweder auf der Protein- oder RNA-Ebene geschehen. Eine detailliertere Beschreibung ist auch bei USSN 752,861 zu finden.
15.1 Zellwachstum in Kultur
Zellkulturen der Nieren, Nebennieren, Harnblase, des Gehirns oder anderer Organs werden vorbereitet, wie es weithin in der Literatur beschrieben wird. Zum Beispiel können die Nieren von neonatalen oder neugeborenen oder jungen oder erwachsenen Nagetieren (Mäusen oder Ratten) explantiert werden und in Organkulturen als ganze oder in Scheiben geschnittene Gewebe (1 bis 4 mm dick) verwendet werden. Primäre Gewebekulturen und etablierte Zelllinien, die ebenfalls von Nieren, Nebennieren, Harnblase Gehirn, Brustgewebe oder anderen Geweben stammen, können in Mehrfachmuldenplatten (6 Mulden- oder 24 Muldenplatten) in Übereinstimmung mit herkömmlichen Zellkulturtechniken etabliert werden und werden in Ab- oder Anwesenheit des Serums für eine gewissen Zeit kultiviert (1 bis 7 Tage). Die Zellen können beispielsweise nach Wunsch in einem Serum (z. B. fötales Kalbsserum zu 1% bis 10%, Gibco), das Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium enthält (Gibco, Long Island, New York, USA) oder in einem serumfreien Medium oder einem definierten Medium kuttiviert werden (z. B. Medien, die Insulin, Transferrin, Glukose, Albumin, oder andere Wachstumsfaktoren enthalten).
Proben zur Überprüfung der Morphogenproduktion schließen aufschwimmende Kulturen oder Zell-Lysate ein, die in periodischen Abständen entnommen und auf OP-1-Produktion durch Analyse der Immunmembran evaluiert werden (Sambrook et al. (Hrsg.), 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York), oder einen Teil der Zellkultur selbst, die periodisch entnommen und zur Vorbereitung der polyA+-RNA für RNA-Analyse verwendet wird. Um de novo OP-1-Synthese zu beobachten, werden einige Kulturen nach herkömmlichen Methoden mit einer ³⁵S-Methionin/³⁵S-Cystein-Mischung sechs bis 24 Stunden lang markiert und dann durch herkömmliche Immunopräzipitations-Methoden auf OP-1-Synthese hin evaluiert.
15.2 Bestimmung des Spiegels an morphogenetischem Protein
Um die Produktion eines morphogenetischen Proteins durch einen Zelltypus zu quantifizieren, kann ein Immunoassay durchgeführt werden, wodurch das Morphogen entdeckt wird, das einen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper verwendet, der für dieses Protein spezifisch ist. Zum Beispiel wird OP-1 durch einen polyklonalen Antikörper gefunden, der in einem ELISA für OP-1 spezifisch ist, wie im folgenden dargelegt wird.
1 μg/100 μl an affinitätsgereinigtem polyklonalen Hasen-IgG, das für Op-1 spezifisch ist, wird zu jeder Mulde einer 96-Muldenpiatte gegeben und bei 37°C eine Stunde lang im Inkubator gezüchtet. Die Mulden werden vier Mal mit 0,167 M-Boraxpuffer mit 0,15 M NaCl (BSB), pH 8,2, gespült, das 0,1% Tween 20^TM enthält. Um nichtspezifische Bindung auf ein Minimum zu beschränken, werden die Mulden blockiert durch vollständige Füllung mit einprozentigem bovinem Serumalbumin (BSA) in BSB und anschließender einstündiger Inkubation bei 37°C. Dann werden die Mulden vier Mal mit BSB, das 0,1% Tween 20 enthält, gespült. 100 μl eines Aliquots in angemessener Verdünnung einer jeden Testprobe von aufschwimmender Zellkultur werden in dreifacher Ausfertigung zu jeder Mulde gegeben und 30 Minuten lang bei 37°C im Inkubator gezüchtet. Nach der Inkubation werden 100 μl biotinyliertes Hasen-Anti-OP-1-Serum wird zu jeder Mulde gegeben (Stammlösung ist ungefähr 1 mg/ml und wird vor Gebrauch im Verhältnis 1 : 400 in BSB, das 1% BSA enthält, verdünnt) und 30 Minuten lang bei 37°C im Inkubator gezüchtet. Dann werden die Mulden vier Mal mit BSB, das 0,1% Tween 20 enthält, gespült. 100 μl Strepavidin-Alkalin (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama, USA, wird vor Gebrauch im Verhältnis 1 : 2000 mit BSB verdünnt, das 1% BSA enthält) und 30 Minuten lang bei 37°C im Inkubator gezüchtet. Dann werden die Platten vier Mal mit 0,5 M dreifach gepufferter Kochsalzlösung (TBS), pH 7,2 gespült. 50 μl Substrat (ELISA Amplification System Kit, Life Technologies, Inc., Bethesda, Maryland, USA) wird jeder Mulde zugegeben und bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubiert. Dann werden 50 μl Amplifikator (aus dem gleichen Amplifikationssystem-Kit) zugegeben und weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wird gestoppt durch Zuagbe von 50 μl 0,3 M Schwefelsäure. Die OD wird bei 490 nm der Lösung in jeder Mulde aufgenommen. Zur Quantifizierung der Op-1 in Kulturmedium wird eine OP-1-Standardkurve parallel zu den Testproben durchgeführt.
Polyklonale Antikörper können wie folgt vorbereitet werden: jedem Hasen wird eine primäre Immunisierung von 100 μg/500 μl OP-1-Monomer gegeben, das durch E. Colt produziert wurde (Aminosäuren 328–431 in SEQ ID NO: 5) in 0,1% SDS gemischt mit 500 μl komplettem Freundschen Adjuvans. Das Antigen wird subkutan an mehrfachen Stellen in Rücken und Flanken der Tiere injiziert. Der Hase erhält eine Auffrischung nach einem Monat auf dieselbe Wiese unter Verwendung von inkomplettem Freundschen Adjuvans. Testblutproben werden von der Ohrvene des Hasen nach sieben Tagen entnommen. Zwei weitere Auffrischungen und Testblutproben werden in monatlichen Abständen vorgenommen, bis Antikörper gegen OP-1 im Serum durch ein ELISA-Nachweisverfahren festgestellt werden. Dann wird der Hase monatlich mit 100 μg Antigen aufgefrischt und Blut wird nach der Auffrischung an den Tagen 7 und 10 entnommen (15 ml pro Blutentnahme).
Monoklonale Antikörper, die für ein bestimmtes Morphogen spezifisch sind, können wie folgt vorbereitet werden: einer Maus werden zwei Injektionen von OP-1-Monomeren, die durch E. Colt produziert werden, gegeben. Die erste Injektion enthält 100 μg OP-1 in komplettem Freundschen Adjuvans und wird subkutan gegeben. Die zweite Injektion enthält 50 μg OP-1 in unvollständigem Adjuvans und wird intraperitonal verabreicht. Der Maus werden dann über einen Zeitraum von acht Monaten zu verschiedenen Zeitpunkten insgesamt 230 μg OP-1 (Aminosäuren 307– 431 in SEQ ID NO: 5) in vier interperitonalen Injektionen verabreicht. Eine Woche vor der Fusion werden beide Mäuse intraperitonal aufgefrischt mit 100 μg OP-1 (307–431) und 30 μg der N-terminalen Peptide (Ser₂₉₃-Asn₃₀₉-Cys), konjugiert durch zugegebenes Cystein zu dem Rinderserumalbumin mit einem SMCC-quervernetzenden Wirkstoff. Diese Aufrischung wurde wiederholt fünf Tage (IP), vier Tage (IP), drei Tage (IP) und einen Tag (IV) vor der Fusion. Die Maus-Milzzellen werden dann mit Myelomzellen (z. B. 653) in einem Verhältnis von 1 : 1 fusioniert unter Verwendung von PEG 1500 (Boeringer Mannheim) und die Zellfusion wird auf Platten gegeben und auf OP-1-spezifische Antikörper, die OP-1 (307–431) als Antigen verwenden, hin untersucht. Die Zellfusion und das monoklonale Screening erfolgen dann nach den üblichen Methoden, die in den im Fach weithin erhältlichen Standardtexten beschrieben sind.
Die Erfindung kann in anderen spezifischen Formen ausgeführt werden. Die zur Zeit vorhandenen Ausführungsformen werden daher in aller Hinsicht als illustrativ und nicht restriktiv angesehen und der Gültigkeitsbereich der Erfindung wird durch die anhängigen Ansprüche angegeben.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verwendung eines Morphogens, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus OP-1, OP-2, BMP-5, BMP-6, BMP-2, BMP-4, Dpp, Vgl, Vgr-1, GDF-1, 60A, BMP-3, COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7, COP-16 besteht; oder eines Morphogens, das ein dimeres Protein umfaßt, das bei einem Säugetier (beispielsweise einem Menschen) eine gewebsspezifische Morphogenese induziert und zwei gefaltete Polypeptide umfaßt, wobei die Aminosäure-Sequenz von jedem folgendes umfaßt: (a) die Sequenz der Sieben-Cystein-Domäne von menschlichem OP-1, Maus OP-1, menschlichem OP-2, Maus OP-2 oder 60A; oder (b) eine Aminosäure-Sequenz, die aus den Sequenz ID Nr. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 26, 27, 28 oder 29 (CBMP2A (fx), CBMP2B(fx), DPP(fx), Vgl(fx), Vgr-1(fx), GDF-1(fx), BMP3, BMP5, BMP6 oder OPX) ausgewählt ist; oder (e) eine Aminosäure-Sequenz der Reste 38–139 von Sequenz ID Nr. 5, 6, 7 oder 8 oder der Reste 354–455 von Sequenz ID Nr. 24; zur Herstellung eines Medikamentes zur: (a) Modulierung einer Entzündungsreaktion; oder (b) Verminderung der Gewebs-zerstörenden Wirkungen, die mit der Entzündungsreaktion auf eine Gewebsschädigung verbunden sind.
Verwendung nach Anspruch 1 zur Modulierung einer Entzündungsreaktion in Säugetiergewebe, wobei die Modulation der Entzündungsreaktion folgendes umfaßt: (a) Verminderung einer Fibrose oder Narbengewebsbildung; und/oder (b) Hemmung der Anhaftung von Immuneffektorzellen an vaskuläres Endothel; und/oder (c) Verminderung einer interstitiellen Entzündung; und/oder (d) Verminderung eines Ödems oder Erythems; und/oder (e) Verminderung einer entzündlichen Gewebsnekrose.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei der die Entzündungsreaktion mit einer Gewebsschädigung verbunden ist (wobei die Verletzung beispielsweise chemisch, mechanisch, biologisch oder immunologisch verursacht ist).
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Medikament: (a) zur Behandlung oder Prophylaxe der Gewebsschädigung; und/oder (b) in einer Menge, die zur Hemmung einer Fibrogenese oder zur Stimulierung einer gewebsspezifischen Regeneration des verletzten oder geschädigten Gewebes wirksam ist; und/oder (c) zur Hemmung eines Verlustes oder einer Verminderung der Funktion des Gewebes; und/oder (d) oral, parenteral oder topisch; und/oder (e) in einem flüssigen Gewebsklebstoff dispergiert; und/oder (f) in einem Aerosol verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, bei der die Gewebsschädigung: (a) eine ischämische Reperfusions-Schädigung; oder (b) Hyperoxie-Schädigung einschließt.
Verwendung gemäß Anspruch 5(a), bei der die ischämische Reperfusions- Schädigung: (a) mit Herzstillstand, Lungenarterienverschluß, Arterienverschluß (beispielsweise Nierenarterienverschluß), Koronararterienverschluß oder durch Okklusion verursachten Schlag verbunden ist; oder (b) mit einem chirurgischen Eingriff oder der Verminderung oder Unterbrechung des Blutstromes zu einem Organ bei einem klinischen Verfahren (beispielsweise einer Carotis-Enterektomie, aorto-koronarem Bypass, einem Gewebstransplantationsverfahren, einer Organtransplantations- oder fibronolytische Therapie) verbunden ist; oder (c) mit einem Gehirninfarkt, Herzinfarkt, mit Asphyxie oder Herz-/Lungenstillstand verbunden ist.
Verwendung nach Anspruch 5 (b), bei der die Hyperoxie-Schädigung mit der Behandlung: (a) eines frühgeborenen Säuglings; oder (b) Emphysems; oder (c) Asphyxie verbunden ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Gewebe Lungen-, Herz-, Leber-, Nerven-, Pankreas-, Synovial-, Haut- oder Nierengewebe ist, bei dem beispielsweise: (a) das Gewebe Nierengewebe ist und das Säugetier an glomerulärer Nephritis, Arteriosklerose oder Diabetes leidet, oder (b) das Gewebe Herzgewebe ist und das Säugetier an Arteriosklerose oder einer Gefäßerkrankung leidet, oder (c) das Gewebe Pankreasgewebe ist und das Säugetier an Diabetes leidet, oder (d) das Gewebe Synovialgewebe ist und das Säugetier an Arthritis leidet, (e) das Gewebe Hautgewebe ist und das Säugetier an Dermatitis oder Psoriasis leidet, (f) das Gewebe Lungengewebe ist und das Säugetier an Bronchitis, Emphysem, ideopathischer Lungenfibrose, Asthma, Asphyxie oder Schocklunge leidet.
Verwendung nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, bei der die Gewebsverletzung: (a) eine Immunzell-vermittelte Entzündungsreaktion; oder (b) eine entzündliche Erkrankung (beispielsweise eine chronische entzündliche Erkrankung); oder (c) eine abnormale Immunreaktion; oder (d) ein Ödem oder Erythem einschließt.
Verwendung nach Anspruch 9(a), 9(c) oder 9(d), bei der die Gewebsschädigung: (a) eine generalisierte akute entzündliche Reaktion; oder (b) Atemwegsentzündung einschließt.
Verwendung nach Anspruch 9(b), bei der die entzündliche Erkrankung: (a) eine Autoimmunerkrankung; oder (b) Arthritis, Psoriasis, Dermatitis, eine entzündliche Darmerkrankung oder Diabetes einschließt.
Verwendung nach Anspruch 10, bei der: (a) in Anspruch 10(a) die akute entzündliche Reaktion mit Asphyxie oder Schocklunge verbunden ist; oder (b) in Anspruch 10(b) die Atemwegsentzündung mit chronischer Bronchitis, Emphysem, ideopathischer Lungenfibrose oder Asthma verbunden ist.
Verwendung nach Anspruch 11, bei der: (a) in Anspruch 11(a) die Autoimmunerkrankung eine neurodegenerative Erkrankung (beispielsweise Multiple Sklerose oder amyotrophe Lateralsklerose) ist; oder (b) in Anspruch 11(b) die Arthritis eine rheumatoide, degenerative oder psoriatische Arthritis ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 13, bei der die Modulation der Entzündungsreaktion durch Verabreichung des Medikaments vor oder nach der Schädigung, beispielsweise vor oder nach der Verringerung oder Unterbrechung des Blutstromes oder nach Wiederaufnahme eines Blutstromes verabreicht wird, wenn die Schädigung eine ischämische Reperfusions-Schädigung ist.
Verwendung nach Anspruch 6(b), bei der das klinische Verfahren ein Gewebs-Transplantations-Verfahren (beispielsweise von Haut-, Knochenmark- oder Gewebe der Gastroin testinalschleimhaut) oder ein Organtransplantationsverfahren (beispielsweise von Lunge, Herz, Niere, Leber oder Pankreas) ist.
Verwendung nach Anspruch 15, bei der die Modulation der Entzündungsreaktion durch Verabreichung des Medikamentes: (a) bei oder im Anschluß an die Entfernung des Organs oder Gewebes von einem Spender; oder (b) während der Aufbewahrung oder des Transportes des Organs oder Gewebes vor Implantation in einen Empfänger; oder (c) bei oder im Anschluß an Implantation in einen Empfänger bewirkt wird.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Medikament das das Morphogen in einem physiologisch akzeptablen wässrigen Träger, der zur parenteralen Verabreichung an ein Säugetier geeignet ist, dispergiert umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Linderung einer Verletzung, die mit der Exposition von Säugetiergewebe gegenüber toxischen Sauerstoff-Konzentrationen verbunden ist, die ein Morphogen in einem physiologisch verträglichen wässrigen Träger in einer Konzentration dispergiert umfaßt, die zur Verminderung einer Extravasation von Immuneffektorzellen, einer interstitiellen Entzündung, eines Ödems, einer Nekrose oder einer Fibrogenese in Säugetiergewebe wirksam ist, das dem Risiko der Schädigung ausgesetzt ist oder darunter leidet, wobei das Morphogen aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus OP-1, OP-2, BMP-5, BMP-6, BMP-2, BMP-4, Dpp, Vgl, Vgr-1, GDF-1, 60A, BMP-3, COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7, COP-16 besteht; oder das Morphogen ein dimeres Protein umfaßt, das eine gewebsspezifische Morphogenese bei einem Säugetier induziert, wobei das dimere Protein zwei gefaltete Polypeptide umfaßt, und wobei die Aminosäure-Sequenz jedes der beiden die C-terminale Sieben-Cystein-Domäne von menschlichem OP-1 (Reste 38–139 von Seq. ID Nr. 5) umfaßt, wobei die Zusammensetzung weiterhin ein Mittel zur Hemmung freier Sauerstoff-Radikale oder ein Antikoagulanz umfaßt.
Eine Konservierungslösung zur Aufrechterhaltung der ex vivo-Lebensfähigkeit von Säugetierzellen oder -gewebe oder eines Säugetierorgans, das eine flüssige Zubereitung umfaßt, die einen im wesentlichen dem osmotischen Druck lebender Säugetierzellen äquivalenten Druck und ein in der Flüssigkeit in einer Konzentration dispergiertes Morphogen aufweist, die zur Verminderung der Extravasation von Immuneffektorzellen, einer interstitiellen Entzündung, eines Ödems, einer Nekrose oder Fibrogenese bei diesen Zellen, Gewebe oder Organ wirksam ist, wobei das Morphogen aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus OP-1, OP-2, BMP-5, BMP-6, BMP-2, BMP-4, Dpp, Vgl, Vgr-1, GDF-1, 60A, BMP-3, COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7, COP-16 besteht; oder das Morphogen ein dimeres Protein umfaßt, das eine gewebsspezifische Morphogenese bei einem Säugetier induziert, wobei das dimere Protein zwei gefaltete Polypeptide umfaßt, und wobei die Aminosäure-Sequenz von jedem die C-terminale Sieben-Cystein-Domäne von menschlichem OP-1 (Reste 38–139 von Seq. ID Nr. 5) umfaßt.
Lösung nach Anspruch 19, die weiterhin einen Zucker, ein Antikoagulanz oder ein Mittel zur Hemmung freier Sauerstoff-Radikale timfaßt; oder weiterhin zur Aufrechterhaltung von im wesentlichen normalen ATP-Spiegeln in diesen Zellen, Gewebe oder Organ formuliert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 18 oder die Lösung nach Anspruch 19 oder 20, bei der das Morphogen wie in Anspruch 1 definiert ist.
Ex-vivo-Verfahren zum Schutz eines lebenden Säugetiergewebes oder transplantierten Säugetierorganes vor einer Schädigung, die mit der Entzündungsreaktion von aktivierten Immuneffektorzellen verbunden ist, das den Schritt umfaßt, dem Gewebe oder Organ ein Morphogen, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus OP-1, OP-2, BMP-5, BMP-6, BMP-2, BMP-4, Dpp, Vgl, Vgr-1, GDF-1, 60A, BMP-3, COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7,-COP-16 besteht; oder ein Morphogen zu verabreichen, das ein dimeres Protein umfaßt, das eine gewebsspezifische Morphogenese bei einem Säugetier induziert, wobei das dimere Protein zwei gefaltete Polypeptide umfaßt, und wobei die Aminosäure-Sequenz von jedem die C-terminale Sieben-Cystein-Domäne von menschlichem OP-1 (Reste 38–139 von Seq. ID Nr. 5) umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 24, bei dem: (a) das Gewebe oder Organ wie in Anspruch 15 definiert ist; und/oder (b) das Morphogen wie in Anspruch 1 definiert ist; und/oder (c) das Morphogen in der Form einer Lösung wie in Anspruch 19 oder 20 definiert verabreicht wird.