DE3752364T2

DE3752364T2 - Osteoinduktive Zusammensetzungen

Info

Publication number: DE3752364T2
Application number: DE3752364T
Authority: DE
Inventors: Elizabeth A. Carlisle Wang; John M. Hudson Wozney; Vicki A. Boston Rosen
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1986-07-01
Filing date: 1987-06-30
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2007-07-01
Also published as: WO1988000205A1; EP0688869A1; ATE419349T1; EP0313578B1; DK106288A; NZ220894A; GR871028B; PT85225B; IE75881B1; PT85225A; IL83003A; JPH02500241A; JP2713715B2; LU91005I2; AU613314B2; DE3752364D1; JPH06298800A; DE3751887D1; ATE234921T1; DE10399007I2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Proteine und Verfahren zu deren Gewinnung. Diese Protein sind fähig, die Bildung von Knorpel und Knochen zu induzieren.
Hintergrund der Erfindung
Knochen sind ein hoch spezialisiertes Gewebe, das durch eine ausgedehnte Matrixstruktur gekennzeichnet ist, die aus fibrösen Bündeln des Proteins Kollagen und Proteoglycanen, nicht-kollagenen Proteinen, Lipiden und sauren Proteinen gebildet wird. Die Prozesse der Knochenbildung und der Erneuerung bzw. der Reparatur von Knochengewebe, die sich während des ganzen Lebens kontinuierlich vollziehen, werden von spezialisierten Zellen vorgenommen. Der normalen embryonalen Entwicklung der langen Knochen geht die Bildung eines Knorpelmodells voraus. Das Knochenwachstum wird vermutlich durch "Osteoblasten" (knochenbildende Zellen) vermittelt, während eine Erneuerung des Knochens anscheinend durch die verbundenen Aktivitäten von knochenresorbierenden Zellen, "Osteoclasten" genannt, und Osteoblasten erreicht wird. Eine Reihe osteogener, knorpelinduzierender und knocheninduzierender Faktoren sind beschrieben; vgl. hierzu z. B. die europäischen Patentanmeldungen 148 155 und 169 016.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Protein in gereinigter Form, BMP-3, bereit, wobei BMP "bone morphogenic protein" (knochen-morphogenes Protein) bedeutet. Dieses Protein ist durch Peptidsequenzen gekennzeichnet, die entweder dieselben wie die in den nachstehenden Tabellen IV A + B aufgeführten Peptidsequenzen sind oder mit diesen im wesentlichen homolog sind. Es ist fähig, die Knochenbildung an einer vorherbestimmten Stelle zu induzieren. Dieser Knochen-Induktionsfaktor ist ferner durch biochemische und biologische Merkmale, die eine Aktivität in einem nachstehend beschriebenen in vivo -Ratten-Knochenbildungs-Test bei einer Konzentration von 10 bis 1000 ng/Gramm Knochen einschließen, gekennzeichnet. Die erfindungsgemäßen Proteine können durch die in den Tabellen dargestellten DNA-Sequenzen codiert werden oder durch Sequenzen, die damit unter stringenten Bedingungen hybridisieren und Polypeptide mit biologischen Eigenschaften eines Knochen-Wachstumsfaktors codieren, oder andere auf verschiedene Weise modifizierte Sequenzen, die solche Eigenschaften aufweisen.
Der erfindungsgemäße Knochen-Induktionsfaktor, nämlich BMP-3, wird durch das Rinder-Homolg bBMP-3 dargestellt. bBMP-3 ist durch die DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz aus den Tabellen IV A und B gekennzeichnet, die die genomische Rindersequenz darstellt. Sie ist gekennzeichnet durch mindestens einen Teil einer Peptidsequenz, die zu der Aminosäure Nr. 1 bis Aminosäure Nr. 175 von den Tabellen IV A und B identisch oder im Wesentlichen identisch ist. BMP-3 ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass es die Knochenbildung induzieren kann. Der Rinderfaktor kann als Mittel zum Erhalt des analogen menschlichen BMP-3-Proteins oder anderer Säuger-Knochen-Induktionsproteine verwendet werden. Die eigentliche Charakterisierung dieses Rinder-Knochen-Induktionsfaktors stellt den wesentlichen "Ausgangspunkt" für das Verfahren dar, in dem diese Sequenz eingesetzt wird. Das Verfahren, das dem Fachmann auf dem Gebiet der Gentechnik bekannte Techniken anwendet, schließt die Verwendung der Rinder-DNA-Sequenz als Sonde zum Durchmustern einer menschlichen genomischen oder cDNA-Bank und die Identifizierung der DNA-Sequenzen, die mit den Sonden hybridisieren, mit ein. Ein Clon mit einer hybridisierbaren Sequenz wurde von Plaques gereinigt und die DNA wurde daraus isoliert, subcloniert und einer DNA-Sequenzanalyse unterzogen. Daher wird in einem anderen Aspekt dieser Erfindung ein menschliches Protein, nämlich hBMP-3, mit Hilfe dieses Verfahrens hergestellt.
Die Erfindung stellt ferner Arzneimittel bereit, die eine therapeutisch wirksame Menge des erfindungsgemäßen Knochen-Wachstumsfaktor-Polypeptids in einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten. Diese Arzneimittel können ferner andere therapeutisch nützliche Wirkstoffe enthalten. Sie können außerdem eine geeignete Matrix umfassen, um die Proteine an die Stelle des Knochendefektes zu liefern, und um eine Struktur für das Knochenwachstum bereitzustellen. Diese Arzneimittel können bei der Behandlung von Knochendefekten und Wurzelhauterkrankungen verwendet werden. Diese erfindungsgemäßen Behandlungsmethoden beinhalten die Verabreichung einer wirksamen Menge des neuen hier beschriebenen BMP-3-Proteins an einen Patienten, bei dem eine solche Knochenbildung notwendig ist.
Die Erfindung betrifft ferner DNA-Sequenzen, die bei der Expression ein Human- oder Rinderpolypeptid codieren, das die Fähigkeit aufweist, eine Knochenbildung zu induzieren. Solche Sequenzen schließen die in den Tabellen IV A + B dargestellten Nucleotide oder die Sequenz in einer 5'-3'- Richtung ein. Alternativ umfaßt die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit den DNA-Sequenzen der Tabellen IV A + B hybridisiert und bei der Expression ein Protein codiert, das mindestens eine biologische Eigenschaft eines Knochen-Wachstumsfaktors aufweist. Allelische oder andere Variationen der Sequenzen der Tabellen IV A + B fallen ebenfalls unter die vorliegende Erfindung, unabhängig davon, ob derartige Nucleotidänderungen zu einer Änderung der Peptidsequenz führen oder nicht.
Ferner betrifft die Erfindung einen Vektor, der eine DNA-Sequenz, wie sie vorstehend beschrieben wurde, in funktioneller Verknüpfung mit einer Expressionskontroll-Sequenz enthält. Ein derartiger Vektor kann in einem neuen Verfahren zur Herstellung eines Knochen-Wachstumsfaktor-Polypeptids verwendet werden. In diesem Verfahren züchtet man eine Zellinie, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die die Expression eines Knochen-Wachstumsfaktor-Polypeptids codiert, und die sich in einer funktionellen Assoziation mit einer Expressionskontroll-Sequenz dafür befindet. In diesem beanspruchten Verfahren kann man eine Reihe bekannter Zellen als Wirtszellen für die Expression des Polypeptids verwenden. Gegenwärtig verwendete Zellinien sind Säugerzelllinien und Bakterienzellen.
Andere Gesichtspunkte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden bei der Betrachtung der nachfolgenden detaillierten Beschreibung und der bevorzugten Ausführungsformen deutlich.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Das erfindungsgemäße Protein ist durch Aminosäuresequenzen oder Teile davon gekennzeichnet, die den in den Tabellen IV A + B gezeigten Sequenzen gleich oder mit ihnen im wesentlichen homolog sind. Dieses Protein ist ebenfalls durch seine Fähigkeit gekennzeichnet, Knochenbildung zu induzieren.
Die hier bereitgestellten Knochen-Wachstumsfaktoren schließen ebenfalls Faktoren ein, die durch Sequenzen co diert werden, die denen der Tabellen IV A + B ähnlich sind, die aber auf natürliche Weise mit Modifkationen (z. B. allelische Variationen in der Nucleotidsequenz, die zu Aminosäureänderungen der Peptidsequenz führen können) versehen sind, oder in die Modifikationen absichtlich hineinmanipuliert worden sind. Synthetische Polypeptide können z. B. vollständig oder teilweise zusammenhängende Sequenzen der Aminosäurereste der Tabellen IV A + B verdoppeln. Diese Sequenzen können, da sie primäre, sekundäre und tertiäre strukturelle Merkmale und Konformationsmerkmale mit den Knochen-Wachstumsfaktor-Polypeptiden der Tabellen IV A + B teilen, biologische Knochen-Wachstumsfaktor-Eigenschaften mit diesen gemein haben. Somit können sie als biologisch aktiver Ersatz für natürlich vorkommende Knochen-Wachstumsfaktor-Polypeptide in Therapieverfahren verwendet werden.
Andere spezifische Mutationen der Sequenzen des hier beschriebenen Knochen-Wachstumsfaktors beinhalten Modifikationen einer oder beider Glycosylierungsstellen. Das Fehlen einer Glycosylierung oder eine nur partielle Glycosylierung rühren von einer Aminosäuresubstitution oder -Deletion an einer oder an beiden Stellen der asparaginverbundenen Glycosylierungs-Erkennungsstellen her, die in den Sequenzen des in den Tabellen IV A + B gezeigten Knochen-Wachstumsfaktors vorhanden sind. Die asparaginverbundenen Glycosylierungs-Erkennungsstellen umfassen Tripeptidsequenzen, die von geeigneten zellulären Glycosylierungsenzymen spezifisch erkannt werden. Diese Tripeptidsequenzen sind entweder Asparagin-X-Threonin oder Asparagin-X-Serin, wobei X im allgemeinen eine beliebige Aminosäure darstellt. Eine Reihe von Aminosäuresubstitutionen oder -Deletionen in der ersten oder dritten Aminosäureposition oder in beiden Positionen (der ersten und dritten Position) einer Glycosylierungs-Erkennungsstelle (und/oder eine Aminosäuredeletion in der zweiten Position) führt zu einer Nicht-Glycosylierung in der modifizierten Tripeptidsequenz.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls die neuen DNA-Sequenzen, die frei von einer Assoziation mit DNA-Sequenzen, die anderes proteinartiges Material codieren, sind und bei der Expression Knochen-Wachstumsfaktoren codieren. Diese DNA-Sequenzen schließen diejenigen DNA-Sequenzen ein, die in den Tabellen IV A + B in 5'- nach 3'-Richtung dargestellt sind, und solche Sequenzen, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen [vgl. T. Maniatis et al,. Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbour Laboratory (1982), Seiten 387 bis 389] mit den DNA-Sequenzen der Tabellen IV A + B hybridisieren.
In ähnlicher Weise codieren solche DNA-Sequenzen, die die durch die Sequenzen der Tabellen IV A + B codierten Knochen-Wachstumsfaktor-Polypeptide codieren, sich aber infolge der Degeneriertheit des genetischen Codes in der Codonsequenz oder in allelischen Variationen (natürlich auftretende Basenänderungen in der Speziespopulation, die zu einer Aminosäureänderung führen kann, aber nicht muß) unterscheiden, ebenfalls die neuen hier beschriebenen Wachstumsfaktoren. Unter die Erfindung fallen ebenfalls die Variationen in den DNA-Sequenzen der Tabellen IV A + B, die durch Punktmutationen oder durch induzierte Modifikationen zur Steigerung der Aktivität, Halbwertszeit oder der Produktion der von ihnen codierten Polypeptide verursacht werden.
Die Erfindung stellt ferner ein neues Verfahren zur Produktion der neuen osteoinduktiven Faktoren bereit. Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet das Züchten einer geeigneten Zelle oder Zellinie, die mit einer DNA-Sequenz transformiert wurde, die bei ihrer Expression unter der Kontrolle bekannter regulatorischer Sequenzen ein neues erfindungsgemäßes Knochen-Wachstumsfaktor-Polypeptid codiert. Geeignete Zellen oder Zellinien können Säugerzellen wie Ovarzellen des chinesischen Hamsters (Chinese hamster ovary (CHO) cells) sein. Die Auswahl geeigneter Säuger-Wirtszellen und Verfahren zur Transformation, Züchtung, Amplifikation, Screening, zur Produktherstellung und zur Produktreinigung sind Stand der Technik; vgl. z. B. Gething and Sambrook, Nature, 293 (1981), 620–625 oder alternativ, Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 5(7) (1985), 1750–1759 oder Howley et al., US-Patent 4,419,446. Eine andere geeignete, in den begleitenden Beispielen beschriebene Säugerzellinie, ist die Affen-COS-1-Zellinie. Eine ähnlich nützliche Säugerzellinie ist die CV-1-Zellinie.
Bakterienzellen sind geeignete Wirte. Zum Beispiel sind die verschiedenen Stämme von E.coli (z. B. HB101, MC1061) auf dem Gebiet der Biotechnologie als Wirtszellen gut bekannt. Verschiedene Stämme von B.subtilis, Pseudomonas, andere Bacilli u. ä. können in diesem Verfahren ebenfalls verwendet werden.
Viele dem Fachmann bekannte Stämme von Hefezellen sind für die Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide ebenfalls als Wirtszellen verfügbar Ferner können, falls es erwünscht ist, im erfindungsgemäßen Verfahren auch Insektenzellen als Wirtszellen verwendet werden; vgl. z. B. Miller et al., Genetic Engineering 8, 277–298 (Plenum Press 1986) und die darin angegebenen Druckschriften.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Vektoren für das Verfahren zur Expression dieser neuen osteoinduktiven Polypeptide bereit. Bevorzugt enthalten die Vektoren die vollständigen neuen vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen, die die neuen erfindungsgemäßen Faktoren codieren. Zusätzlich enthalten die Vektoren ebenfalls geeignete Expressionskontroll-Sequenzen, die eine Expression der Knochen-Induktionsprotein-Sequenzen gestatten. Alternativ sind Vektoren, die modifizierte Sequenzen enthalten, wie sie vorstehend beschrieben wurden, ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, und sie sind für die Produktion der Knochen-Induktionsproteine verwendbar. Die Vektoren kann man zum Transformieren von Zellinien verwenden, und sie enthalten ausgewählte regulatorische Sequenzen in einer funktionellen Assoziation mit den erfindungsgemäßen codierenden DNA-Sequenzen, die dazu fähig sind, deren Replikation und Expression in ausgewählten Wirtszellen zu steuern. Nützliche regulatorische Sequenzen für derartige Vektoren sind dem Fachmann bekannt und können den gewählten Wirtszellen entsprechend ausgewählt werden. Solch eine Auswahl geschieht routinemäßig und ist nicht Teil der vorliegenden Erfindung.
Ein erfindungsgemäßes Protein, das Knochenwachstum unter Umständen induziert, unter denen normalerweise keine Knochenbildung stattfindet, hat eine Anwendung bei der Heilung von Knochenbrüchen. Ein osteogenes Mittel, in dem ein erfindungsgemäßes Protein verwendet wird kann prophylaktisch bei der Einrenkung geschlossener und offener Fraktionen und ebenfalls bei der verbesserten Fixierung künstlicher Gelenke verwendet werden. Eine durch ein osteogenes Mittel induzierte de novo-Knochenbildung trägt zur Wiederherstellung angeborener, oder durch Trauma oder onkologische Resektion induzierter kranio-facialer Defekte bei und ist ferner in der kosmetischen plastischen Chirurgie nützlich. Ein erfindungsgemäßer osteogener Faktor kann bei der Behandlung von Wurzelhauterkrankungen und bei anderen Zahnbehandlungsverfahren wertvoll sein. Derartige Mittel können eine knochenbildende Zellen anziehende Umgebung schaffen, das Wachstum knochenbildender Zellen stimulieren oder die Differenzierung von Stammzellen der knochenbildenden Zellen induzieren. Selbstverständlich können die erfindungsgemäßen Proteine auch andere therapeutische Anwendungen haben.
Ferner betrifft die Erfindung Therapieverfahren und Arzneimittel zur Heilung von Frakturen und anderen Knochendefekten und Wurzelhauterkrankungen verwandten Zuständen. Ein derartiges Arzneimittel umfaßt eine therapeutisch wirksame Menge des erfindungsgemäßen Knochen-Induktionsfaktor- Proteins. Der erfindungsgemäßen Knochen-Induktionsfaktor kann in einem Arzneimittel gemeinsam mit einem/einer pharmazeutisch verträglichen Träger oder Matrix enthalten sein. Weiterhin umfassen erfindungsgemäße Therapieverfahren und Arzneimittel eine therapeutische Menge eines erfindungsgemäßen Knochen-Induktionsfaktors gemeinsam mit einer therapeutischen Menge mindestens eines der anderen erfindungsgemäßen Knochen-Induktionsfaktoren. Außerdem kann das erfindungsgemäße Protein gemeinsam mit einem oder mehreren verschiedenen osteoinduktiven Faktoren, mit denen es interagieren kann verabreicht werden. Ferner kann das. Knochen-Induktionsprotein mit anderen Mitteln, die günstig für die Behandlung des fraglichen Knochendefektes sind, kombiniert werden. Derartige Mittel schließen eine Reihe von Wachstumsfaktoren ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Bei der Präparation derartiger physiologisch verträglicher Proteinkombinationen berücksichtigt der Fachmann pH-Wert, Isotonie, Stabilität usw.
Das Therapieverfahren schließt eine lokale Verabreichung des Arzneimittels als Implantation oder als Vorrichtung ein. Wenn es verabreicht wird, befindet sich das Arzneimittel bei der erfindungsgemäßen Verwendung selbstverständlich in einer pyrogenfreien, physiologisch verträglichen Form. Ferner kann es erwünscht sein, das Arzneimittel zu verkapseln oder es in einer viskösen Form zu injizieren, um es an den Ort der Knochenschädigung zu liefern. Bevorzugt umfaßt das Arzneimittel mit dem Knochen-Wachstums-Induktionsfaktor eine Matrix, die fähig ist, den Knochen-Induktionsfaktor an die Stelle der Knochenschädigung zu liefern und eine Struktur zur Knochen- und Knorpelentwicklung bereitzustellen, und die optimalerweise fähig ist, vom Körper resorbiert zu werden. Derartige Matrizes können aus anderen, gegenwärtig bei anderen medizinischen Anwendungen von Implantationen verwendeten Materialien gefertigt werden.
Die Wahl des Material basiert auf z. B. Biokompatibilität, biologischer Abbaubarkeit, mechanischen Eigenschaften, kosmetischer Erscheinungsform und Grenzflächeneigenschaften. In ähnlicher Weise wird die Anwendung der osteoinduktiven Faktoren die geeignete Formulierung bestimmen. Potentielle Matrizes für die osteoinduktiven Faktoren können biologisch abbaubar und chemisch definiert sein. Beispiele dafür (ohne auf diese beschränkt zu sein) sind Calciumsulfat, Tricalciumphosphat, Hydroxyapatit, Polyessigsäure und Polyanhydride. Derartige Matrizes können ebenfalls biologisch abbaubar und biologisch gut definiert sein wie Knochen- oder dermales Kollagen, wie andere reine Proteine oder extrazelluläre Matrixkomponenten. Sie können ferner biologisch nicht-abbaubar und chemisch definiert sein wie gesintertes Hydroxyapatit, Bioglas, Aluminate oder anderes keramisches Material. Ferner können sie Kombinationen jeder beliebigen der vorstehend genannten Materialien wie Polymilchsäure und Hydroxyapatit oder Kollagen und Tricalciumphosphat sein. Das bio-keramische Material kann ebenfalls in der Zusammensetzung, z. B im Calcium-Aluminat-Phosphat und der Verarbeitung geändert werden, um z. B. Porengröße, Partikelgröße, Partikelgestalt und biologische Abbaubarkeit zu ändern.
Der Dosierungsplan wird durch den behandelnden Arzt bestimmt, der verschiedene Faktoren berücksichtigt, die die Wirkung eines derartigen Wachstumsfaktors modifizieren, wie z. B. die gewünschte Menge des zu erzeugenden Knochens, die Stelle der Knochenschädigung, der Zustand des geschädigten Knochens, das Alter des Patienten, sein Geschlecht, die Diät, die Schwere irgendeiner Infektion, Zeit der Verabreichung und andere klinische Faktoren. Die Dosierung kann mit dem Typ der bei der Rekonstitution verwendeten Matrix variieren. Die Zugabe anderer bekannter Wachstumsfaktoren wie IGF 1 (insulinähnlicher Wachstumsfaktor 1) zum entgültigen Arzneimittel kann ebenfalls die Dosierung beeinflussen. Im allgemeinen sollte die Dosierung im Bereich von ungefähr 10 bis 10⁶ Nanogramm Protein pro Gramm des erwünschten Knochengewichtes sein. Der Fortschritt läßt sich durch periodische Beurteilung (z. B. durch Röntgenstrahlung) des Knochenwachstums und/oder der Knochenwiederherstellung überwachen. Wegen des Fehlens einer Artenspezifität bei Knochen-Induktionsfaktoren sind derartige Arzneimittel gegenwärtig ebenfalls in tierärztlichen Anwendungen von Nutzen. Außer Menschen sind insbesonders Haustiere und Rassepferde geeignete Patienten für eine derartige Behandlung mit den erfindungsgemäßen Knochen-Induktionsfaktoren.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Umsetzung der vorliegenden Erfindung in die Praxis. Sie beschreiben die Gewinnung und Charakterisierung der Rinderproteine und deren Verwendung zur Gewinnung der menschlichen Proteine, den Erhalt der menschlichen Proteine und die Expression der Proteine mittels rekombinanter Verfahren.
Beispiel I Isolieren des Rinder-Knochen-Induktionsfaktors
Zerriebenes Rinder-Knochenpulver (20–120 mesh, Helitrex) wird nach dem Verfahren von M. R. Urist et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70 (1973), 3511, unter Auslassung einiger Extraktionschritte wie nachstehend beschrieben präpariert. Zehn Kilogramm des zerriebenen Pulvers werden bei 4°C über einen Zeitraum von 48 Stunden durch aufeinanderfolgendes Wechseln von 0,6 N HCl unter starkem Rühren demineralisiert. Die resultierende Suspension wird 16 Stunden bei 4°C mit 50 Litern 2 M CaCl₂ und 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA] und anschließend 4 Stunden mit 50 Litern 0,5 M EDTA extrahiert. Der Rückstand wird dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen, bevor er, wie in Clin. Orthop. Rel. Res., 171 (1982), 213 beschrieben, in 20 Litern 4 M Guanidiniumhydrochlorid [GuCl], 20 mM Tris (pH 7,4), 1 mM N-Ethylmaleimid, 1 mM Jodacetamid, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid resuspendiert wird. Nach 16 bis 20 Stunden wird der Überstand entfernt und durch weitere 10 Liter GuCl-Puffer ersetzt. Der Rückstand wird über weitere 24 Stunden extrahiert. Die rohen GuCl-Extrakte werden vereinigt, unter Verwendung eines Pellicon-Apparates mit einer Membran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 10 000 ungefähr 20fach konzentriert und dann gegen 50 mM Tris, 0,1 M NaCl, 6 M Harnstoff (pH 7,2), dem Startpuffer für die erste Säule, dialysiert. Nach ausgedehnter Dialyse wird das Protein auf eine 4 Liter DEAE-Cellulosesäule geladen, und die nicht-gebundenen Fraktionen werden gesammelt.
Die nicht-gebundenen Fraktionen werden konzentriert und gegen 50 mM NaAc, 50 mM NaCl (pH 4,6) in 6 M Harnstoff dialysiert. Die nicht-gebundenen Fraktionen werden dann auf eine Carboxymethylcellulose-Säule aufgetragen. Das nicht an die Säule gebundene Protein wird durch ausgiebiges Waschen mit Start-Puffer beseitigt, und das den Knochen-Induktionsfaktor enthaltende Material eluiert von der Säule mit 50 mM NaAc, 0,25 mM NaCl, 6 M Harnstoff (pH 4,6). Das in dieser Schrittelution erhaltene Protein wird 20 bis 40fach konzentriert und dann 5fach mit 80 mM KPO₄, 6 M Harnstoff (pH 6,0) verdünnt. Der pH-Wert der Lösung wird mit 500 mM K₂HPO₄ auf 6 eingestellt. Die Probe wird auf eine mit 80 mM KPO₄, 6 M Harnstoff (pH 6,0) äquilibrierte Hydroxyapatit-Säule (LKB) gegeben, und das gesamte nicht gebundene Protein wird durch Waschen der Säule mit demselben Puffer beseitigt. Knochen-Induktionsfaktor-Aktivität wird mit 100 mM KPO₄ (pH 7,4) und 6 M Harnstoff eluiert.
Das Protein wird ungefähr 10fach konzentriert, und bis zu einer Endkonzentration von 0,15 M wird festes NaCl zugegeben. Dieses Material wird auf eine mit 50 mM KPO₄, 150 mM NaCl, 6 M Harnstoff (pH 7,4) äquilibrierte Heparinsepharose-Säule gegeben. Nach ausgedehntem Waschen der Säule mit dem Startpuffer wird mit 50 mM KPO₄, 700 mM NaCl, 6 M Harnstoff (pH 7,4) ein Protein mit Knochen-Induktionsfaktor-Aktivität eluiert. Diese Fraktion wird bis auf ein minimales Volumen konzentriert, und 0,4 ml Aliquots werden auf in Serie miteinander verbundene Superose 6- und Superose 12-Säulen, die mit 4 M GuCl, 20 mM Tris (pH 7,2) äquilibriert worden waren, aufgetragen, und die Säulen werden bei einer Flußrate von 0,25 ml/Minute entwickelt. Das Knochen-Induktionsfaktor-Aktivität zeigende Protein weist eine relative Wanderung auf, die mit einem ungefähr 30 000 Dalton-Protein korrespondiert.
Die vorstehenden Fraktionen werden vereinigt, gegen 50 mM NaAc, 6 M Harnstoff (pH 4,6) dialysiert und auf eine Pharmacia MonoS HR-Säule aufgetragen. Die Säule wird mit einem Gradienten bis 1.0 M NaCl, 50 mM NaAc, 6M Harnstoff (pH 4,6) entwickelt. Aktive Fraktionen werden vereinigt und mit 10% Trifluoressigsäure (TFA) auf einen pH-Wert von 3,0 gebracht. Das Material wird auf eine 0,46 × 25 cm Vydac C4-Säule in 0,1% TFA aufgetragen, und die Säule wird mit einem Gradienten bis 90% Acetonitril, 0,1% TFA (31,5% Acetonitril, 0,1% TFA bis 49,5% Acetonitril, 0,1% TFA in 60 Minuten mit 1 ml pro Minute) entwickelt. Aktives Material eluiert bei ungefähr 40–44% Acetonitril. Aliquots geeigneter Fraktionen werden nach einer der folgenden Verfahren jodiert: P. J. McConahey et al., Int. Arch. Allergy, 29 (1966), 185-189; A. E. Bolton et al., Biochem J., 133 (1973), 529 und D. F. Bowen-Pope, J. Biol. Chem. 237 (1982), 5161. Die in diesen Fraktionen enthaltenen jodierten Proteine werden durch SDS-Gelelektrophorese und isoelektrische Harnstoff Triton X100-Fokussierung analysiert. In diesem Stadium hat der Knocheninduktionsfaktor eine Reinheit von ungefähr 10–50%.
Beispiel II Charakterisierung des Rinder-Knochen-Induktionsfaktors
A. Molekulargewicht
Ungefähr 20 μg Protein aus Beispiel 1 wird lyophilisiert und in 1 × SDS-Probenpuffer gelöst. Nach 15 minütigem Erwärmen bei 37°C wird die Probe auf ein 15%iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen und dann unter Kühlen elektrophoretisiert. Das Molekulargewicht wird relativ zu vorweg angefärbten Molekulargewichtsstandards (Bethesda Research Labs.) bestimmt. Unmittelbar nach Beendigung wird die den Knochen-Induktionsfaktor enthaltende Gelspur in 0,3 cm Stücke geschnitten. Jedes Stück wird zerquetscht und mit 1,4 ml 0,1% SDS versetzt. Die Proben werden vorsichtig über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt, um das Protein zu eluieren. Jedes Gelstück wird entsalzt, um im biologischen Test eine Störung zu vermeiden. Der Überstand jeder Probe wird mit 10% TFA auf einen pH-Wert von 3,0 angesäuert, durch ein 0,45 Micron Membranfilter filtriert und auf eine 0,46 cm × 5 cm C4-Vydac-Säule aufgetragen. Die Säule wird mit einem Gradienten von 0,1% TFA bis 0,1% TFA 90% CH₃CN entwickelt. Die geeigneten, Knochen-Induktionsfaktor enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und mit 20 mg Rattenmatrix rekonstituiert. In diesem Gelsystem weist die Hauptmenge der Knochen-Induktionsfaktor-Fraktionen eine Mobilität eines Proteins auf, das ein Molekulargewicht von ungefähr 28 000–30 000 Dalton besitzt.
B. Isoelektrische Fokussierung
Der isoelektrische Punkt der Knochen-Induktionsfaktor-Aktivität wird in einem denaturierenden Systems durch isoelektrische Fokussierung bestimmt. Das Triton X100- Harnstoff-Gelsystem (Hoeffer Scientific) wird wie folgt modifiziert: 1) 40% der verwendeten Ampholyte sind Servalyte 3/10; 60% sind Servalyte 7–92) Der verwendete Katolyt ist 40 mM NaOH. Ungefähr 20 μg des Proteins von Beispiel 1 wird lyophilisiert, in Probenpuffer gelöst und auf das Gel für die isoelektrische Fokussierung gegeben. Die Fokussierung wird ungefähr 3 Stunden mit 20 Watt bei 10°C durchgeführt. Nach Beendigung wird die den Knochen-Induktionsfaktor enthaltende Spur in 0,5 cm breite Scheiben geschnitten. Jede Scheibe wird in 1,0 ml 6M Harnstoff, 5 mM Tris (pH 7,8) zerquetscht, und die Proben werden bei Raumtemperatur bewegt. Die Proben werden angesäuert, filtriert, entsalzen und wie vorstehend beschrieben getestet. Der Hauptteil der Aktivität, die in dem Test bestimmt wird, wie er in Beispiel 3 beschrieben wird, wandert in einer Weise, die mit einem pI von 8,8–9,2 konsistent ist.
C. Charakterisierung bezüglich der Untereinheiten
Die Zusammensetzung aus Untereinheiten des Knochen-Induktiosfaktors wird ebenfalls bestimmt. Reiner Knochen-Induktionsfaktor wird, wie vorstehend beschrieben, aus einem präparativen 15% SDS-Gel isoliert. Ein Teil der Probe wird dann mit 5 mM DTT in Probenpuffer reduziert und erneut durch ein 15% SDS-Gel elektrophoretisiert. Das Protein mit ungefähr 30 kD ergibt zwei Hauptbanden mit ungefähr 20 kD und 18 kD und eine Nebenbande mit 30 kD. Die Breite der beiden Banden weist auf eine Heterogenität hin, die sehr wahrscheinlich durch Glycosylierung, durch eine andere posttranslationale Modifikation, durch proteolytische Degradation oder Carbamylierung verursacht wird.
Beispiel III Biologische Aktivität des Knochen-Induktionsfaktors
Ein Ratten-Knochenbildungstest gemäß der allgemeinen Prozedur von Sampath und Reddi (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80 (1983), 6591-6595) wird verwendet, um die osteogene Aktivität des erfindungsgemäßen, in Beispiel 1 erhaltenen Rinder-Knochen-Induktionsfaktors zu beurteilen. Dieser Test kann ebenfalls zur Beurteilung der Knochen-Induktionsfaktoren anderer Spezies angewandt werden. Der Schritt der Ethanolfällung wird durch Dialysieren der zu untersuchenden Fraktion gegen Wasser ersetzt. Die Lösung oder Suspension wird dann erneut in einem flüchtigen Lösungsmittel, z. B. 0,1–0,2% TFA, gelöst, und die resultierende Lösung wird mit 20 mg Ratten-Matrix versetzt. Dieses Material wird gefroren und lyophilisiert, und das resultierende Pulver wird in Gelatinekapseln Nr. 5 eingeschlossen. Die Kapseln werden subkutan in den abdominalen Thoraxbereich von 21–49 Tage alten männlichen Evans Lang-Ratten implantiert. Die Implantate werden nach 7–14 Tagen entfernt. Die Hälfte eines jeden Implantats wird für eine Analyse auf alkalische Phosphatase verwendet [vgl. A. H. Reddi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 69 (1972), 1601), und die andere Hälfte wird fixiert und für die histologische Analyse bearbeitet. In der Regel werden Glycolmethacrylat-Schnitte von 1 μm mit Von Kossa und saurem Fuchsin angefärbt, um neues Knochenmaterial nachzuweisen. Alkalische Phosphatase, ein Enzym, das im Verlauf der Matrixbildung von Chondroblasten und Osteoblasten produziert wird, wird ebenfalls gemessen. Eine neue Knorpel- und Knochenbildung korreliert häufig mit dem Gehalt an alkalischer Phosphatase. Die nachstehende Tabelle I verdeutlicht die Dosisabhängigkeit der Ratten-Matrixproben einschließlich einer nicht mit Knochen-Induktionsfaktor behandelten Kontrolle Tabelle I
Der gebildete Knochen oder Knorpel ist physikalisch auf den durch die Matrix beanspruchten Raum begrenzt. Proben werden ebenfalls, wie vorstehend beschrieben, durch SDS-Gelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung und anschließende Autoradiographie analysiert. Die Analyse zeigt eine Korrelation zwischen der Aktivität und dem Protein auf, das bei 28–30 kD bandiert und einen pI von 9,0 aufweist. Ein Extinktionskoeffizient von 1 OD/mg-cm wird für die Abschätzung des Proteins und für die der Annäherung an die Reinheit des Knochen-Induktionsfaktors in einer bestimmten Fraktion verwendet. In den in vivo-Ratten-Knochenbildungstests bezüglich von Verdünnungen, wie sie vorstehend beschrieben wurden, ist das Protein in vivo bei 10 bis 200 ng Protein/Gramm Knochen bis zu wahrscheinlich mehr als 1 μg Protein/Gramm Knochen aktiv.
Beispiel IV Zusammensetzung des Rinder-Knochen-Induktionsfaktor-Proteins
Die Proteinzusammensetzung des Beispiels 2A mit dem Molekulargewicht 28–30kD wird, wie in Beispiel 2C beschrieben, reduziert und mit Trypsin verdaut. Acht tryptische Fragmente werden nach Standardverfahren isoliert. Sie haben die folgenden Aminosäuresequenzen:
Eine nicht so hoch gereinigte Präparation des Rinderknochen-Proteins wird nach einem Reinigungschema präpariert, das dem in Beispiel 1 beschriebenen ähnelt. Grundsätzlich unterscheidet sich die Reinigung von der vorstehend beschriebenen durch das Auslassen der DE-52-Säule, der CM-Cellulose-Säule und der Mono S-Säule und durch das Vertauschen der Reihenfolge der Hydroxyapatit- und der Heparin-Sepharose-Säulen. Kurz gesagt wird der konzentrierte rohe 4 M Extrakt bei vier Grad auf eine 85%-ige Endkonzentration von Ethanol gebracht. Das Gemisch wird dann zentrifugiert, und das Präzipitat wird in 50 mM Tris, 0,15 M NaCl, 6,0 M Harnstoff gelöst. Dieses Material wird dann wie beschrieben über Heparin-Sepharose fraktioniert. Das an Heparin gebundene Material wird wie beschrieben über Hydroxyapatit fraktioniert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, konzentriert und mittels einer Hochauflösungs-Gelfiltration (TSK 30000 in 6 M Guanidiniumchlorid, 50 mM Tris, pH 7,2) fraktioniert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, gegen 0,1% TFA dialysiert und dann wie beschrieben über eine C4 Vydac-Reversphasen-Säule fraktioniert. Die Präparation wird reduziert und durch ein Acrylamidgel elektrophoretisiert. Das mit der 18 kD-Bande korrespondierende Protein wird eluiert und mit Trypsin gespalten. Es werden tryptische Fragmente isoliert, die die nachfolgenden Aminosäuresequenzen aufweisen:
Es ist festzustellen, daß die tryptischen Fragmente und 8 im wesentlichen dieselben sind wie die Fragmente 10 bzw. 9.
A. bBMP-3
Sonden, die aus Pools von Oligonucleotiden bestehen, werden auf der Grundlage der Aminosäuresequenzen der tryptischen Fragmente 9 (Sonde Nr. 3), 10 (Sonde Nr. 2) und 11 (Sonde Nr. 1) und mit einem automatischen DNA-Sythesizer synthetisiert.
Eine genomische rekombinante Rinderbank wird wie folgt konstruiert: Rinderleber-DNA wird partiell mit dem Restriktionsendonucleaseenzym Sau 3A gespalten und durch einen Saccharosegradienten sedimentiert. Größenfraktionierte DNA im Bereich von 15–30 kb wird dann mit dem Bakteriophagen BamHI-Vektor EMBL3 [Frischauf et al., J. Mol. Biol., 170 (1983), 827–842] ligiert. Diese Bank wird mit 8000 Rekombinanten pro Platte ausplattiert. Von den Plaques werden zweifache Nitrocellulosefilter-Abdrücke (replicas) angefertigt, und es wird nach einem modifizierten Verfahren von Woo et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 (1978), 3688–91] amplifiziert:
Diese genomische rekombinante Rinderbank, die in EMBL3 konstruiert wurde, wird mittels des TMAC-Hybridisierungsverfahrens durchgemustert, in 3 M Tetramethylammoniumchlorid (TMAC), 0,1 M Natriumphosphat, pH 6,5, 1 mM EDTA, 5 × Denhardts, 0,6% SDS, 100 μg/ml Lachsspermien-DNA bei 48°C hybridisiert und in 3 M TMAC, 50 mM Tris, pH 8,0, bei 50°C gewaschen. Diese Bedingungen minimieren den Nachweis von Basen, die nicht mit dem 17mer Sondenpool paaren; [vgl. Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82 (1985), 1585–1588].
400.000 Rekombinanten wurden jeweils paarweise mit Sonde Nr. 1, die mit ³²P markiert war, abgesucht. Alle Rekombinaten, die mit dieser Sonde hybridisierten, wurden erneut für eine zweite Runde erneut plattiert. Dreifache Nitrocellulose-Abdrücke (Replikas) werden von den Platten der zweiten Runde angefertigt und wie beschreiben amplifiziert. Die drei Filtersätze werden mit den Sonden Nr. 1, 2 und 3 erneut unter TMAC-Bedingungen hybridisiert. Ein Clon, nämlich lambda bP-819, hybridisiert mit allen drei Sonden und ist Plaquegereinigt, und die DNA wird von einem Plattenlysat isoliert. Der Bakteriophage lamda bP-819 wurde am 16. Juni 1987 bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 40344 hinterlegt. Dieser bP-819-Clon codiert den mit bBMP-3 bezeichneten Rinder-Knochen-Wachstumsfaktor.
Die Region von bP-819, die mit Sonde Nr. 2 hybridisiert, wird lokalisiert und sequenziert. Die partielle DNA und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen dieser Region sind in Tabelle IV A gezeigt. Die den tryptischen Fragmenten 10 und 12 entsprechenden Aminosäuresequenzen sind unterstrichen. Die erste unterstrichene Sequenz entspricht Fragment 12, während die zweite Fragment 10 entspricht. Daher codiert diese Region von bP-819, die mit Sonde Nr. 2 hybridisert, mindestens 111 Aminosäuren. Diese Aminosäuresequenz wird von der DNA-Sequenz, die sich von den Nucleotiden 414 bis 746 erstreckt, codiert. Tabelle IV A
Die Region von bP-819, die mit den Sonden Nr. 1 und 3 hybridisiert, wird lokalisiert und sequenziert. Die partielle DNA und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen dieser Region sind in Tablelle IV B gezeigt. Die den tryptischen Fragmenten 9 und 11 entsprechenden Aminosäuresequenzen sind unterstrichen. Die erste unterstrichene Sequenz entspricht Fragment 9, während die zweite unterstrichene Sequenz Fragment 11 entspricht. Die Peptidsequenz dieser Region von bP-819, die mit den Sonden Nr. 1 und 3 hybridisiert, hat eine Länge von 64 Aminosäuren und wird von der Nucleotiden 305 bis 493 aus Tabelle IV B codiert. Es wird angenommen, dass der durch das AGA-Triplet codierte Argininrest der Carboxy-Terminus des Proteins ist, basierend auf dem Vorhandensein eines benachbarten Stopp-Codons (TAA). Die dem Paar TC (Positionen 305–306) vorangehende Nucleinsäuresequenz ist vermutlich ein Intron (nicht-codierende Sequenz), basierend auf dem Vorhandensein einer Konsensus-Akzeptorsequenz (d. h. eines Pyrimidin-reichen Abschnitts, TTCTCCCTTTTCGTTCCT, gefolgt von AG) und dem Vorhandensein eines Stopps eher als eines basischen Rests in der geeigneten Position der abgeleiteten Amiosäuresequenz.
bBMP-3 ist daher gekennzeichnet durch die DNA- und Aminosäuresequenz von Tabelle IV A und Tabelle IV B. Die Peptidsequenz dieses Clons hat eine Länge von 175 Aminosäuren und wird durch die DNA-Sequenz, die sich von den Nucleotiden 414 bis 746 von Tabelle IV A und den Nucleotiden 305 bis 493 von Tabelle IV B erstreckt, codiert. Tabelle IV B
Beispiel V
Menschliches BMP-3
Die in den Tabellen IV A + B gezeigten Sequenzen von BMP-3 weisen eine signifikante Homologie mit den Untereinheiten beta (B) und beta (A) der Inhibine auf. Die Inhibine sind eine Familie von Hormonen, die gegenwärtig auf ihre Verwendbarkeit als Kontrazeptiva hin erforscht werden; vgl. A. J. Mason et al., Nature, 318 (1985), 659–663. In einem geringeren Ausmaß sind sie auch mit dem Müllerschen Hemmstoff (Mullerian inhibitory substance, MIS), einem testikularen Glycoprotein, das eine Regression des Müllerschen Ganges (Mullerian duct) während der Entwicklung des männlichen Embryos verursacht, und dem Transformations-Wachstumsfaktor-beta (TGF-b) verwandt, der das Wachstum von Zellen hemmen oder stimulieren oder sie zur Differenzierung veranlassen kann.
Da die Gene des Rinder-Knochenwachstumsfaktors und des menschlichen Knochenwachstumsfaktors vermutlich im Wesentlichen homolog sind, werden Oligonucleotidsonden, von denen gezeigt wurde, dass sie mit der Rinder-DNA-Sequenz von Tabelle IV A und IV B hybridisieren, verwendet, um eine menschliche Genombank zu durchmustern. Eine menschliche Genombank (Toole et al., a.a.O.) wird unter Verwendung dieser Sonden durchmustert und vermutlich Positive werden isoliert und die DNA-Sequenz wird wie oben beschrieben erhalten. Ein Beweis, dass diese Rekombinante einen Teil des menschlichen Knochen-Induktionsfaktor-Moleküls codiert, ist auf den Homologien der Rinder/menschlichen Protein- und Genstruktur.
Wenn ein rekombinanter Bakteriophage, der DNA enthält, die einen Teil des menschlichen BMP-3-Moleküls codiert, erhalten wird, wird die menschliche codierende Sequenz als Sonde wie in Beispiel V (A) beschrieben verwendet, um eine menschliche Zelllinie oder menschliches Gewebe zu identifizieren, die oder das BMP-3 synthetisiert. mRNA wird durch Oligo (dT)-Cellulose-Chromatographie ausgewählt und cDNA wird synthetisiert und in lambda gt10 mittels bekannter Techniken (Toole et al., a.a.O.) cloniert.
Alternativ kann das gesamte diesen menschlichen Knochen-Induktionsfaktor codierende Gen identifiziert und, wenn notwendig, in zusätzlichen rekombinanten Clonen erhalten werden. Zusätzliche Rekombinante, die weitere 3'- oder 5'-Regionen dieses menschlichen Knochen-induktionsfaktor-Gens enthalten, können durch Identifizierung von einzigartigen DNA-Sequenzen am Ende (den Enden) des ursprünglichen Clons und unter Verwendung von diesen als Proben zum erneuten Durchmustern der menschlichen Genombank erhalten werden. Das Gen kann dann wieder mit Hilfe von molekularbiologischen Standardtechniken in ein einzelnes Plasmid eingebaut und in Bakterien amplifiziert werden. Das gesamte menschliche BMP-3-Faktorgen kann sodann in einen geeigneten Expressionsvektor transferiert werden. Der das Gen enthaltende Expressionsvektor wurde dann in eine Säugerzelle, z. B. Affen-COS-Zellen, transfiziert, wobei das menschliche Gen transkribiert und die RNA korrekt geschnitten wird. Medien der transfizierten Zellen werden auf Knochen-Induktionsfaktor-Aktivität wie hier beschrieben als Hinweis darauf, dass das Gen vollständig ist, getestet. mRNA wird von diesen erhalten und cDNA wird von dieser mRNA-Quelle synthetisiert und cloniert. Die oben beschriebenen Verfahren können in ähnlicher Weise verwendet werden, um einen Knochen-Induktionsfaktor anderer Spezies von Interesse unter Verwendung des Rinder-Knochen-Induktionsfaktors und/oder des menschlichen Knochen-Induktionsfaktor als Sondenquelle zu isolieren. Ein solcher Knochen-Induktionsfaktor anderer Spezies kann in ähnlicher Weise unter anderem zur Reparatur von Brüchen verwendet werden.
Beispiel VI Expression von Knochen-Induktionsfaktoren
Zur Produktion von Rinder-, menschlichem oder anderen Säuger-Knochen-Induktionsfaktoren wird die codierende DNA in einen geeigneten Expressionverktor transferiert und mit herkömmlichen gentechnologischen Verfahren in Säugerzellen eingeführt. Der Fachmann ist in der Lage, unter Verwendung der Sequenz der Tabellen IV A + B oder anderer modifizierter Sequenzen und unter Verwendung bekannter Vektoren wie pCD [Okayama et al., Mol. Cell Biol., 2 (1982), 161–170] und pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4 (1985), 645–653] Säuger-Expressionsvektoren zu konstruieren. Die Transformation geeigneter Wirtszellen mit diesen Vektoren kann zur Expression osteoinduktiver Faktoren führen. Der Fachmann ist in der Lage, die Sequenzen der Tabellen IV A + B so zu manipulieren, daß durch Beseitigen oder durch Ersetzen der die codierende Sequenz flankierenden regulatorischen Säugersequenzen durch bakterielle Sequenzen Bakterienvektoren zur intrazellulären oder extrazellulären Expression durch Bakterienzellen erzeugt werden. Die codierenden Sequenzen können z. B. weiter manipuliert werden (z. B. mit anderen bekannten Linkern ligiert oder durch Beseitigen nichtcodierender Sequenzen aus ihnen oder durch Ändern von Nucleotiden in ihnen modifiziert werden, wobei andere bekannte Verfahren angewandt werden). Die modifizierte Knochen-Induktionsfaktor codierende Sequenz kann dann mit Verfahren, wie sie von Taniguchi et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 (1980), 5230–5233] beschrieben sind, in einen bekannten Bakterien-Vektor insertiert werden. Mit diesem beispielhaften Bakterien-Vektor können dann bakterielle Wirtszellen transformiert und der Knochen-Induktionsfaktor von ihnen exprimiert werden. Bezüglich einer Strategie zur Herstellung von Knochen-Induktionsfaktor durch extrazelluläre Expression in Bakterienzellen wird z. B. auf die europäische Patentanmeldung EP-A 177 343 verwiesen.
Ähnliche Manipulationen kann man zur Konstruktion eines Insekten-Vektors für die Expression in Insektenzellen durchführen [vgl. z. B. Verfahren, die in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung 155 476 beschrieben sind]. Es läßt sich ebenfalls ein Hefevektor unter Verwendung regulatorischer Hefesequenzen zur intra- oder extrazellulären Expression der erfindungsgemäßen Faktoren durch Hefezellen konstruieren [vgl. z. B. Verfahren, die in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO86/00639 und der europäischen Patentanmeldung EP-A 123 289 beschrieben sind].
Ein Verfahren zur Produktion großer Mengen eines erfindungsgemäßen osteoinduktiven Faktors aus Säugerzellen beinhaltet die Konstruktion von Zellen, die multiple Kopien des heterologen Knochen-Induktionsfaktor-Genes enthalten. Das heterologe Gen kann mit einem amplifizierbaren Marker, z. B. dem Dihydrofolatreduktase- (DHFR-) Gen, verknüpft sein. Wenn Zellen von diesem vermehrte Genkopien enthalten, kann man nach dem Verfahren von Kaufman und Sharp [J. Mol. Biol., 159 (1982), 601–629) auf die Vermehrung in steigenden Konzentrationen von Methotrexat (MTX) hin selektionieren. Diese Vorgehensweise läßt sich bei einer Anzahl unterschiedlichen Zelltypen anwenden.
Ein Plasmid z. B, das eine DNA-Sequenz für einen erfindungsgemäßen Knochen-Induktionsfaktor in funktioneller Assoziation mit anderen Plasmidsequenzen enthält, die eine Expression dieser DNA-Sequenz gestattet und das DHFR-Expressionsplasmid pAdA26SV(A)3 [Kaufman and Sharp, Mol. Cell Biol. 2 (1982), 1304] können gemeinsam mittels Calciumphosphat-Co-Präzipitation und Transfektion in DHFR-defekte CHO-Zellen, DUKX-BII, eingeführt werden. DHFR-exprimierende Transformanten werden auf Wachstum in alpha-Medium mit dialysiertem fötalem Kälberserum hin selektioniert und anschließend auf Amplifikation hin durch Wachsen in steigenden Konzentrationen von MTX (sequentielle Schritte von 0,02, 0,2, 1,0 und 5 μM MTX) selektioniert, wie in Kaufman et al. [Mol. Cell Biol. 5, (1983), 1750] beschrieben wird. Transformanten werden cloniert und die Expression von biologisch aktivem Knochen-Induktionsfaktor wird mittels des Ratten-Knochenbildungstestes überwacht. Die Expression von Knochen-Induktionsfaktor sollte mit steigendem Grad der MTX-Resistenz zunehmen. Ähnlichen Prozeduren kann man bei der Produktion anderer Knochen-Induktionsfaktoren folgen.
Alternativ wird das menschliche Gen, wie vorstehend beschrieben, direkt exprimiert. Aktiver Knochen-Induktionsfaktor kann in Bakterien oder Hefezellen exprimiert werden. Das gegenwärtig bevorzugte Expressionssystem für biologisch aktiven rekombinanten menschlichen Knochen-Induktionsfaktor sind stabil transformierte CHO-Zellen.
Beispiel VII Biologische Aktivität von exprimiertem Knochen-Induktionsfaktor
Zur Messung der biologischen Aktivität des vorstehend in Beispiel 6 erhaltenen exprimierten Knochen-Induktionsfaktors wird der Faktor auf einer Heparin-Sepharose-Säule partiell gereinigt. 4 ml des Transfektionsüberstandes aus einer 100 mm-Schale wird durch Ultrafiltration über eine YM 10-Membran ungefähr 10fach konzentriert und dann gegen 20 mM Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,4 (Startpuffer) dialysiert. Dieses Material wird dann auf eine 1,1 ml Heparin-Sepharose-Säule in Startpuffer aufgetragen. Nichtgebundene Proteine werden durch einen Waschschritt mit 8 ml Startpuffer beseitigt, und gebundene Proteine werden durch einen Waschschritt mit 3-4 ml 20 mM Tris, 2,0 M NaCl, pH 7,4 desorbiert.
Die an die Heparinsäule gebundenen Proteine werden mittels eines Centricon 10 ungefähr 10fach konzentriert, und das Salz wird durch Diafiltration mit 0,1 Trifluoressigsäure vermindert. Die geeignete Menge dieser Lösung wird mit 20 mg Rattenmatrix vermischt und dann auf in vivo-Knochen- und Knorpelbildung hin wie vorstehend in Beispiel 3 beschrieben getestet. Als Kontrolle wird nach dem Fraktionieren der Überstand einer Blind-Transfektion (mock transfection) verwendet.
Die Rattenmatrix enthaltenden Implantate, zu denen spezifische Mengen menschlicher BMP-3 gegeben worden waren, werden nach 7 Tagen aus den Ratten entfernt und für die histologische Beurteilung bearbeitet. Repräsentative Abschnitte jedes Implantates werden mit von Kossa und saurem Fuchsin für den Nachweis neuen Knochenmaterials und mit Toluidin-Blau für den Nachweis knorpelspezifischer Matrixbildung angefärbt. Die in dem Abschnitt vorhandenen Zelltypen werden ebenso beurteilt, wie das Maß, in dem diese Zellen den Phänotyp zeigen.
Die vorstehend beschriebenen Verfahren lassen sich zum Isolieren anderer Knochen-Induktionsfaktoren von Interesse verwenden, indem die Rinder-Knochen-Induktionsfaktoren und/oder die menschlichen Knochen-Induktionsfaktoren als Quelle für eine Sonde verwendet werden. Derartig andere Knochen-Induktionsfaktoren können unter anderem eine ähnliche Anwendung bei der Heilung von Brüchen finden.

Claims

Gen, das bovines BMP-3 codiert, welches die folgende DNA-Sequenz umfasst:
Gen, das bovines BMP-3 codiert, welches die Aminosäuresequenz aufweist, die in Anspruch 1 angegeben ist.
Gen, das ein Protein codiert, das mindestens die Eigenschaft von BMP-3 aufweist, die Bildung von Knochen zu induzieren, und eine DNA-Sequenz umfasst: (a) die sich von einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 in der Codonsequenz auf Grund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheidet; (b) die mit einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder Absatz (a) oben unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert; oder (c) die ein Fragment oder eine allelische Variation einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 darstellt.
DNA-Sequenz nach Anspruch 3, die menschliches BMP-3 codiert.
DNA-Sequenz nach Anspruch 3 oder 4, die eine genomische DNA-Sequenz ist.
DNA-Sequenz nach Anspruch 3 oder 4, die eine cDNA-Sequenz ist.
Vektor, der das Gen oder die DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in funktioneller Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz enthält.
Zelle, transformiert mit einem Vektor nach Anspruch 7.
Zelle nach Anspruch 8, die eine Säugerzelle, eine Bakterienzelle, eine Insektenzelle oder eine Hefezelle ist.
Zelle nach Anspruch 9, die eine CHO-Zelle ist.
Protein, das Eigenschaften von BMP-3 aufweist, das von dem Gen oder der DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert wird.
Protein, das Eigenschaften von BMP-3 aufweist, das durch die Schritte des Züchtens in einem geeigneten Kulturmedium von einer Zelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein Gen oder eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfasst, und des Gewinnens des Proteins aus dem Kulturmedium hergestellt wird.
Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 11 oder 12, umfassend die Schritte des Züchtens der Zelle nach Anspruch 9 in einem geeigneten Kulturmedium und des Isolierens des Proteins aus dem Kulturmedium.
Arzneimittel, umfassend das Protein nach Anspruch 11 oder 12 und ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel.
Arzneimittel nach Anspruch 14, das zusätzlich eine Matrix umfasst, die das Mittel an die Stelle des Knochen- oder Knorpeldefekts bringen und eine Struktur zum Induzieren von Knochen- oder Knorpelbildung zur Verfügung stellen kann.
Arzneimittel nach Anspruch 15, wobei die Matrix Hydroxyapatit, Kollagen, Polymilchsäure oder Tricalciumphosphat umfasst.
Verwendung eines Proteins nach Anspruch 11 oder 12 für die Herstellung eines Arzneimittels zum Induzieren von Knochen- oder Knorpelbildung.