JPH02500241A - 新規骨誘導組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規前誘導組成物 この発明は、新規蛋白質およびそれらの製造方法に関するものである。これらの 蛋白質は軟骨および硬骨の形成を誘導し得る。

背景の技術 骨は、蛋白質コラーゲンの線維束、およびプロテオグリカン、非コラーゲン性蛋 白質、脂質および酸性蛋白質により形成された広範なマトリックス構造を特徴と する高度に分化した組織である。−生を通じて連続的に行なわれる骨形成および 骨組織の再生／修復のプロセスは、分化細胞により行なわれる。正常な胎長骨の 発達の前に、軟骨のひな形が形成される。骨の成長は恐らく「骨芽細胞」（骨形 成細胞）の介在によると思われるが、骨の再建は明らかに骨吸収細胞、いわゆる 「破骨細胞」および骨芽細胞の結合活性により行なわれる。

様々な前原性軟骨誘導および硬骨誘導因子が報告されている。それらに関しては 、例えばヨーロッパ特許出願第１４８１５５号および同第１６９０１６号参照。

発明の簡単な記載 この発明は、純粋形態の新規蛋白質を提供する。具体的には、４種の新規蛋白質 は、ＢＭＰ−］、ＢＭＰ−２・クラス■（またはＢＭＰ−２）、ＢＭＰ−３およ びＢＭＰ−２・クラス■（またはＢＭＰ−４０ただし、ＢＭＰは骨形態形成蛋白 質である）と称する。これらの蛋白質は、後記第２〜８表に示し１二アミノ酸配 列と同一または実質的に相同性のペプチド配列を特徴とする。それらは予め定め られた部位での骨形成を誘導し得る。さらにこれらの骨誘導因子は、後記インビ ボラット骨形成検定における１０〜１０００　ｎ９７９Ｃ骨）の濃度での活性を 含む生化学的および生物学的特性を特徴とする。

この発明の蛋白質は、表に示したＤＮＡ配列、またはそれとハイブリダイゼーシ ョンし、骨成長因子の生物学的特性を宵するポリペプチドをコードし得る配列ま たはそれらの特性を示す他の様々な修飾配列によりコードされ得る。

この発明の蛋白質の１つはＢＭＰ−１という。ひとＢＭＰ−１またはｈＢＭＰ− １の一部分は、ゲノムｈＢＭＰ−１フラグメントを表す後記第５表のアミノ酸＝ １〜アミノ酸＝３７またはｈＢＭＰ−１ｃＤＮＡを表す第６表のアミノ酸＝１〜 アミノ酸＝７３０の配列と同一または実質的に同じペプチド配列を有することを 特徴とする。

さらに、ｈＢＭＰ−１または関連前誘導因子は、これらの配列の少なくとも一部 分を有することを特徴とし得る。これらのペプチド配列は、第５表のヌクレオチ ド：３４４０〜ヌクレオチド；！３３５５０および第６表のヌクレオチド＝３６ 〜ヌクレオチド；！：２２２５にそれぞれ示された配列と同一ま１こは実質的に 同じＤＮＡ配列によりコードされる。さらに、これらのｈＢＭＰ−１ポリペプチ ドは骨形成０〜１０００ｎ９の濃度でインビボラット骨形成検定において活性を 呈する。

この発明の相同性うし成長因子（ｂＢＭＰ−１と称す）は、ゲノムｂＢＭＰ−１ フラグメントを表す後記第２表のアミノ酸＃ｌ〜アミノ酸″ｉ３７の配列と同一 まには実質的に同じ配列を含むペプチド配列を有することを特徴とする。このペ プチド配列は、後記第２表のヌクレオチド＝２９４〜ヌクレオチド＃４０４に示 された配列と同一または実質的に同じＤＮＡ配列によりコードされる。後記第２ 表で同定されたうしペプチド配列もまた３７アミノ酸長である。さらに、ｂＢＭ Ｐ−１は骨形成誘導能を特徴とする。

この発明の別の骨誘導蛋白質組成物は、ＢＭＰ−２・クラスＩ（まにはＢＭＰ− ２）と称する。それは、ｃＤＮＡ　ｈＢＭＰ−２クラスＩを表す第７表のアミノ 酸＝１〜アミノ酸＝３９６の配列と同一または実質的に同じペプチド配列の少な くとも一部分を有することを特徴とする。このペプチド配列は、第７表のヌクレ オチド＝３５６〜ヌクレオチド＃　Ｉ　Ｄ　４３に示された配列と同一または実 質的に同じＤＮＡ配列によりコードされる。第７表で同定されたひとペプチド配 列は３９６アミノ酸長である。ま１こｈＢＭＰ−２まには関連前誘導蛋白質もこ のペプチド配列の少なくとも一部分を有することを特徴とし得る。さらにｈＢＭ Ｐ−２・クラスＩは、骨形成誘導能を特徴とする。

ｂＢＭＰ−２・クラスＩ（またはｂＢＭＰ−２）と称するこの発明の相同性うし 骨誘導蛋白質は、ゲノム配列を表す後記第３表で同定されたＤＮＡ配列を有する 。このうしＤＮＡ配列は、保護１２９アミノ酸コ一ド配列、次いで約２０５個の ヌクレオチド（３°非コ一ド配列）を有する。さらにｂＢＭＰ−２・クラス■は 骨形成誘導能を特徴とする。この発明の別の骨誘導蛋白質組成物は、ＢＭＰ、− ２・クラス■またはＢＭＰ−４と称する。ひと蛋白質ｈＢＭＰ−２・クラス■（ またはｈＢＭＰ−４）は、ｈＢＭＰ−２−クラス■のｅＤＮＡを表す第８表のア ミノ酸＃ｌ〜アミノ酸；４０８間の配列と同一または実質的に同じペプチド配列 の少なくとも一部分を有することを特徴とする。このペプチド配列は、第８表の ヌクレオチド＃４０３〜ヌクレオチド；！ｆ１６２６に示された配列と同一また は実質的に同じＤＮＡ配列の少なくとも一部分によりコードされる。さらにこの 因子は、骨形成誘導能を特徴とする。

この発明のさらに別の骨誘導因子、ＢＭＰ−３は、うし相同体ｂＢＭＰ−３によ り示される。ｂＢＭＰ−３は、うしゲノム配列を表す第４ＡおよびＢ表のＤＮＡ 配列およびアミノ酸配列を有することを特徴とする。それは、第４ＡおよびＢ表 のアミノ酸＃ｌ〜アミノ酸＃１７５と同一ま１こは実質的に同じペプチド配列の 少なくとも一部分を有することを特徴とする。さらにＢＭＰ−３は、骨形成誘導 能を特徴とする。うし因子は、類縁体ひとＢＭＰ−３蛋白質または他のは乳類前 誘導蛋白質を得るｋめの道具として使用され得る。このうし骨誘導因子の特性を 正確に表すと、この配列を用いる方法における本質的「出発点」が得られる。遺 伝子工学技術分野における熟練者に周知の技術を用いるこの方法は、プローブと してうしＤＮＡ配列を使用してひとゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのスクリ ーニングを行い、このプローブとハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列を同定 することを含む。ハイブリダイゼーション可能な配列を有するクローンは精製さ れたプラークであり、ＤＮＡはそこから分離され、サブクローンされ、ＤＮＡ配 列分析が行なわれる。すなわち、この発明の別の態様は、この方法により製造さ れたひと蛋白質ｈＢＭＰ−３である。

この発明の別の態様は、医薬的に許容し得る賦形剤中にこの発明によろうし成長 因子ポリペプチドの１種またはそれ以上の治療有効量を含有する医薬組成物に関 するものである。さらに、これらの組成物は他の治療上有用な薬剤を含有し得る 。またそれるは、骨欠損部位への蛋白質送達および骨成長構造の提供に適したマ トリックスを含み得る。これらの組成物は、幾つかの骨欠損および歯周病の処置 方法において使用され得る。この発明によると、これろの方法は、骨形成を必要 とする患者に、本明細書に記載された新規蛋白質ＢＭＰ−１，ＢＭＰ−２・クラ スＩＳＢＭＰ−２・クラス■およびＢＭＰ−３の少なくとも１種の有効量を投与 することを必然的に伴う。

さらにこの発明の別の態様は、骨形成誘導能を有するひとまたはうしポリペプチ ドの発現をコードするＤＮＡ配列に関するものである。それらの配列は、第２〜 ８表に示された５°−３°方向のヌクレオチド配列を含む。他方、ストリンジェ ント条件下で第２〜８表のＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションするＤ　Ｎ　Ａ 配列、または非ストリンジェント条件下で示されたＤＮＡ配列とハイブリダイゼ ーションし、少なくとも１種の骨成長因子生物学的特性を有する蛋白質の発現を コードするＤＮＡ配列もこの発明に包含される。最後に一部２〜８表の配列の対 立遺伝子または他の変形もま１；、それらのヌクレオチド変形の結果としてのペ プチド配列の変形の存否に拘わらず、この発明に含まれる。

さろにこの発明の別の態様は、前記ＤＮＡ配列を発現制御配列と効果的に組み合 わせて含むベクターに関するものである。このベクターは、発現制御配列と効果 的に共同して骨成長因子ポリペプチドの発現’ｅコードするＤＮＡ配列により形 質転換されたセルラインが培養される、骨成長因子ポリペプチドの新規製造方法 において使用され得る。この発明の方法は、ポリペプチド発現用の宿主細胞とし て幾つかの公知細胞を使用し得る。現在好ましいセルラインはは乳類セルライン および細菌細胞である。

以下、詳細な記載および好ましい実施態様を熟考すれば、この発明の他の態様お よび利点は明らかである。

発明の詳細な記載 この発明の蛋白質は、後記第２〜８表に示された配列と同一または実質的に相同 性のアミノ酸配列またはその一部分を有することを特徴とする。これらの蛋白質 もまた骨形成誘導能を特徴とする。

また、この明細書に記載された骨成長因子は、第２〜８表の配列に類似した配列 によりコードされる因子を含むが、その配列に対する修飾は、自然に行なわれる か（例、ポリペプチドにおけるアミノ酸変更を誘導し得るヌクレオチド配列にお ける対立遺伝子約数ｇ）または慎重な工学的処理により行なわれる。例えば、合 成ポリペプチドは、第２〜８表のアミノ酸残基の連続配列を全体的または部分的 に複製し得る。これらの配列は、第２〜８表の骨成長因子ポリペプチドと共有の 一次、二次または三次構造および立体配座特性により、共通して骨成長因子生物 学的特性を宵し得る。すなわち、それらは、治療プロセスにおいて天然骨成長因 子ポリペプチドの生物学的活性代用物として使用され得る。

この明細書に記載された骨成長因子の配列の他の特異的突然変異体は、グリコジ ル化部位の一方または両方の修飾を伴う。グリコジル化の不在または一部のみの グリコジル化は、第２〜８表に示された骨成長因子の配列に存在するアスパラギ ン結合グリコジル化認識部位の一方または両方におけるアミノ酸置換または欠失 に起因する。

アスパラギン結合グリコジル化認識部位は、適当な細胞のグリコジル化酵素によ り特異的に認識されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、 アスパラギン−Ｘ−トレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリン（ｋだし、Ｘは 通常アミノ酸である）である。

グリコジル化認識部位の第一または第三アミノ数位の一方または両方における様 々なアミノ酸置換または欠失（および／または第２位におけるアミノ酸欠失）は 、修飾トリペプチド配列における非グリコジル化をもたらす。

またこの発明は、他の蛋白質性材料をコードするＤＮＡ配列との組み合わせを含 まず、骨成長因子の発現をコードする新規ＤＮＡ配列を（アレリック）包含する 。これらのＤＮＡ配列は、５°−３°方向の第２〜８表に示された配列およびス トリンジェント・ハイブリダイゼーション条件下で第２〜８表のＤＮＡ配列とハ イブリダイゼージョンする配列を含む［マニアチス等、「モレキュラー・クロー ニング（ア・ラボラトリ−・マニュアル）」、コールド・スプリング・ハーバ− ・ラボラトリ−（１９８２）、３８７〜３８９頁参照］。

緩和ハイブリダイゼーション条件下で第２〜８表の配列とハイブリダイゼーショ ンし、骨成長因子生物学的特性を有する骨成長因子の発現をコードするＤ　ＮＡ 配列はまた、この発明の骨成長因子もコードする。例えば、重要な相同性を有す る領域、例えばグリコジル化ま７二はジスルフィド結合部位を第２〜８表の配列 と共有し、１種またはそれ以上の骨成長因子生物学的特性を有する骨成長因子を コードするＤＮＡ配列は、Ｄ　Ｎ　、Ａ配列が第２〜８表の配列とストリンジェ ント的にハイブリダイゼーションしない場合でも、成長因子のこの新たな科の一 員を明らかにコードする。

同様に、第２〜８表の配列によりコードされる骨成長因子ポリペプチドをコード するが、遺伝子コードの縮重またはアレリック変異（アミノ酸変更を誘導する場 合もしない場合もあり得る種の集団における天然塩基の変形）故にコドン配列が 異なるＤＮＡ配列もまた、二の明細書に記載された新規成長因子をコードする。

点突然変異または誘導修飾によりポリペプチドの活性、半減期または生産の向上 が誘発される第２〜８表のＤ　Ｎ　、Ａ配列における変形もまたこの発明に包含 される。

この発明の別の態様は、新規成長因子の新規製造方法に関するものである。この 発明の方法は、既知調節配列の制御下、この発明の新規骨成長因子ポリペプチド の発現をコードするＤＮＡ配列により形質転換された適当な細胞またはセルライ ンの培養を含む。適当な細胞まｆ二はセルラインは、は乳類細胞、例えばチャイ ニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）であり得る。適当なは乳類宿主細胞の選 択並びに形質転換、培養、増幅、スクリーニング、および製品の製造および精製 の方法は当業界では周知である。例えば、ゲシングおよびサンプルツク、「ネイ チャームλ１１．６２０−６２５（１９８１）または別法としてカウフマン等、 １モル・セル・パイオル」、５（７）１７５０−１７５９（１９８５）またはハ ウレイ等、アメリカ合衆国特許第４４１９４４６号参照。後記実施例記載の別の 適当なは乳類セルラインは、さるＣＯ５−１セルラインである。同様に有用なは 乳類セルラインはＣＶ−ｔセルラインである。

細菌細胞は適当な宿主である。例えば、エシェリヒア・コリの様々な株（例、Ｈ ＢＩＯＩ、ＭＣ１０６１）はバイオテクノロジー分野において宿主細胞としてよ く知られている。枯草菌（バシルス・サブチリス）、プソイドモナス、他のかん 菌などの様々な株もまたこの方法において使用され得る。

当業界の熟練者には周知の多くの酵母細胞株もまた、この発明のポリペプチドの 発現用の宿主細胞として利用され得る。さらに、所望により、昆虫細胞もこの発 明の方法における宿主細胞として利用され得る。例えば、ミラー等、「ジェネテ ィック・エンジニアリング」、Ｌ　２７７−２９８（プレナム・プレス１９８６ ）およびその引用文献参照。

この発明の別の態様は、これらの新規前誘導ポリペプチド類の発現方法で使用さ れるベクターに関するものである。好ましくは、これらのベクターは、この発明 の新規因子をコードする前述の完全な新規Ｉ）ＮＡ配列を含む。ざらにま１ニ、 これらのベクターは、骨誘導蛋白質配列を発現させる適当な発現制御配列を含む 。他方、上記修飾配列が組み込まれたベクターはまた、この発明の具体例であり 、骨誘導蛋白質の製造に有用である。これらのベクターはセルラインの形質転換 方法で使用され得、選択されに宿主細胞におけるその複製および発現を指向し得 るこの発明のＤＮＡコード配列と効果的に組み合わせて選択された調節配列を含 み得る。これらのベクターに有用な調節配列は当業界の熟練者には周知であり、 選択された宿主細胞に応じて選択され得る。この選択は常套的であり、この発明 の一部を形成するものではない。

骨が正常には形成されない環境において骨の成長を誘導するこの発明の蛋白質は 、骨折の治癒に適用性を有する。この発明の蛋白質の１種またはそれ以上を用い る前原性製剤は、閉鎖および複雑骨折の縮小並びに人工関節の固定改善における 予防的用途を有し得る。

前原性薬剤により新たに誘導される骨形成は、先天的、外傷性または腫よう切除 による頭顔欠損の修復に貢献し、美容形成外科においても有用である。この発明 の骨生成因子は、歯周病の処置および他の歯修復プロセスにおいて貴重であり得 る。これらの薬剤は、骨形成細胞を誘引し、骨形成細胞の成長を刺激し、または 骨形成細胞の原種の分化を誘導する環境を提供する。勿論、この発明の蛋白質は 他の治療用途を有し得る。

この発明の別の態様は、骨折および骨欠損に関連した他の状態または歯周病の修 復を目的とする治療方法および組成物に関するものである。前記組成物は、この 発明の骨誘導因子蛋白質の少なくとも１種の治療有効量を含有する。この発明に よる骨誘導因子は、医薬的に許容し得る賦形剤またはマトリックスと混合した状 態で治療組成物中に存在し得る。さらにこの発明の治療方法および組成物は、子 の少なくとも１種の治療有効量を含む。さらに、この発明による蛋白質またはこ の発明の蛋白質の組合わせは、それが相互作用し得る１種またはそれ以上の骨誘 導因子と共に投与され得る。さらに、骨誘導蛋白質は、問題の骨欠損の処置に有 益な他の薬剤と組合わされ得る。それらの薬剤には様々な成長因子が含まれるが 、限定される訳ではない。ｐＨ１等張性、安定性などに関して生理学的に許容し 得る蛋白質組成物の製造は、当業界の技術の範囲内である。

特にＢＭＰ−１は、組成物において個々に使用され得る。Ｂ　Ｍ　Ｐ−１はまた 、この発明の他の蛋白質の１種まにはそれ以上と組合わせて使用され得る。ＢＭ Ｐ−１およびＢＭＰ−２・クラス■は組合わせて使用され得る。ＢＭＰ−１およ びＢＭＰ−２・クラス■もまた組合わせて使用され得る。ＢＭＰ−１およびＢＭ Ｐ−３もまた組合わせて使用され得る。さらに、ＢＭＰ−１は、この発明の他の 蛋白質の２種ま１こは３種と組合わせて使用され得る。例えば、ＢＭＰ−ＩＸＢ ＭＰ−２・クラスＩおよびＢＭＰ−２・クラス■は組合わされ得る。ＢＭＰ−１ はまｆこ、ＢＭＰ−２・クラスＩおよびＢＭＰ−３と組合わされ得る。さらに、 ＢＭＰ−１は、Ｂ　ＭＰ　−２・クラス■およびＢＭＰ−３と組合わさＺ−得る 。ＢＭＰ−１，ＢＭＰ−２・クラス■、ＢＭＰ−２・クラス■およびＢＭＰ−３ は組合わされ得る。

ＢＭＰ−２・クラス■は、医薬組成物において個々に使用され得る。ＢＭＰ−２ ・クラスＩもまた、この発明の他の蛋白質の１種またはそれ以上と組合わせて使 用され得る。ＢＭＰ−２・クラスＩは、ＢＭＰ−２・クラス■と組合わされ得る 。それはまた、ＢＭＰ　Ｓとも組合わされ得る。ざらにＢＭＰ−２・クラス■は 、ＢＭＰ−２・クラス■およびＢＭＰ−３と組合わされ得る。

ＢＭＰ−２・クラス■は、医薬組成物において個々に使用され得る。さらに、そ れは前述の他の蛋白質と組合わせて使用され得る。

さらに、それはＢＭＰ−３と組合わせて使用され得る。

ＢＭＰ−３は、組成物において個々に使用され得る。さらにそれは、前述の様々 な組合わせで使用され得る。

この治療方法は、インブラントまたは装置として組成物を局所投与することを含 む。投与される場合、勿論この発明で使用される治療組成物は、発熱物質を含ま ない、生理学的に許容し得る形態を呈する。さらに、この組成物は、望ましくは 骨損傷部位への送達に適し１こ粘稠性形態で封入または注射され得る。好ましく は、骨成長誘導因子組成物は、骨誘導因子を骨損傷部位に送達し、成長する硬骨 および軟骨構造を提供し得、最適状態で体内に再吸収され得るマトリックスを含 む。それらのマトリックスは、他の内植医学適応例で現在使用されている他の材 料により形成され得る。

材料の選択は、例えば、生物学的適合性、生物分解性、機構特性、表面的外観お よび界面特性に基づいて行なわれる。同様に、骨誘導因子の適用は適当な製剤を 限定する。骨誘導因子に適用され得るマトリックスは、生物分解性で化学的に定 義されるもの、例えば硫酸カルシウム、燐酸トリカルシウム、ヒドロキシアパタ イト、ポリ乳酸、ポリ無水物（ただし、これらに限定される訳ではない）、生物 分解性で生物学的に明確に定義されるもの、例えば骨もしくは皮膚コラーゲン、 他の純粋な蛋白質または細胞外マトリックス成分、非生物分解性で化学的に定義 されるもの、例えば焼結ヒドロキシアパタイト、生体ガラス、アルミン酸塩まに は他のセラミック、または前述のタイプの材料を幾つか組合わせたもの、例えば ポリ酪酸およびヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンおよび燐酸トリカルシウ ムであり得る。生体セラミックもまた組成物、例えばカルシウム−アルミン酸塩 〜燐酸塩において改変され得、例えば孔サイズ、粒子サイズ、粒子形状および生 物分解性の改変が行なわれ得る。

投与量については、この成長因子の作用を修飾する様々な要因、例えば形成が望 まれる骨の重量、管損傷の部位、損傷骨の状態、患者の年令、性別および治療食 、感染の重症度、投与時間および他の臨床要因を考慮して担当医が決定する。用 量は、再構成およびＢＭＰの組成物において使用されるマトリックスのタイプに より変動し得る。最終組成物への他の既知成長因子、例えばＩＧＦＩ（インスリ ン様成長因子１）の追加もま１こ用量に影響を与え得る。一般的に、投与量は、 所望の骨重量１ｇ当たり、蛋白質的１０−１０’ナノグラムの範囲内とすべきで ある。経過は骨成長および／まには修復の定期的評価（例、エックス線）により モニターされ得る。まに、こｉ７らの治療組成物は、骨誘導因子における種特異 性の欠如故に現在獣医学適用においても貴重である。ひとに加えて特定の家畜お よびサラブレッドのうまは、この発明の骨誘導因子による処置において望ましい 患者である。

以下、実施例により、うし蛋白質の回収および特性検定、それらの使用によるひ と蛋白質の回収、ひと蛋白質の獲得および組換え技術による蛋白質の発現におけ るこの発明の実施態様を説明する。

実施例１ うし骨誘導因子の単離 ウリスト等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステープ・才ブ・アメリカ」、７ ０：３５１１（１９７３）の方法に従い、破砕したうしの骨粉（２０−１２０メ ツシユ、へりドレックス）を製造する（乙だし、下記の通り幾つかの抽出工程は 省く）。１０ｋｇの粉末を、４℃で４８時間激しい撹はん下、０　、６　Ｎ　Ｏ ）　ＨＣ１２を連続交換しながら脱塩する。生成した懸濁液を４℃で１６時間２ モルのＣａＣＬおよび１０ミリモルのエチレンジアミン−四酢酸［ＥＤＴＡ］５ ０Ｑにより抽出し、次いで５０ｉ２の０．５モルＥＤＴＡ中で４時間抽出する。

残留物を蒸留水で３回洗浄した後、「クリニカル・オーソペディックス・アンド ・リレープツト・リサーチ」、１７１：２１３（１９８２）の記載に従い、４モ ルのグアニジン塩酸塩［Ｇｕｃｌ］、２０ミリモルのトリス（ｐＨ７，４）、１ ミリモルのＮ−エチルマレイミド、１ミリモルのヨードアセトアミド、１ミリモ ルのフェニルメチルスルホニル・フッ素２０Ｉ２に再懸濁する。１６〜２０時間 後、上清を除去し、別のＩＯＣのＧｕＣ１緩衝液と置き換える。残留物をさ・　 らに２４時間抽出する。

粗ＧｕＣ１抽出物を合わせ、１００００分子量遮断膜を備えｆこペリコン装置で 約２０倍に濃縮し、次いで５０ミリモルのトリス、０゜１モルのＮａＣ（ｌ、６ モルの尿素（ｐＨ７，２）、第一カラム用出発緩衝液に対して透析する。充分透 析後、蛋白質を４リツトルＤＥＡＥセルロースカラムに仕込み、未結合フラクシ ョンを集める。

未結合フラクションを濃縮し、６モル尿素中５０ミリモルのＮａＡｃ、５０ミリ モルのＮａＣ］（ｐＨ４，６）に対して透析する。未結合フラクションをカルボ キシメチルセルロースカラムに適用する。カラムに結合していない蛋白質を出発 緩衝液で充分洗浄することにより除去し、骨誘導因子含有材料を５０ミリモルの ＮａＡｃ、０．２５ミリモルのＮａＣ１，６モルの尿素（ｐＨ４，６）によりカ ラムから脱着させる。この段階溶離から得られた蛋白質を２０〜４０倍に濃縮し 、次いで８０ミリモルＫＰＯ，，６モル尿素（ｐＨ６、０）により５倍に希釈す る。溶液のｐＨを５００ミリモルのに、ＨＰＯ，により６．０に調節する。８０ ミリモルＫＰＯ，，６モル尿素（ｐＨ６゜０）中で平衡状態にしたヒドロキシル アパタイトカラム（ＬＫＢ）に試料を適用し、同緩衝液でカラムを洗浄すること により、未結合蛋白質を全て除去する。骨誘導因子活性蛋白質を１００ミリモル ＫＰＯ，（ｐＨ７，４）および６モル尿素により溶離させる。

この蛋白質を約１０倍に濃縮し、固体ＮａＣ１を加えて最終濃度Ｏ１１５モルと する。この材料を、５０ミリモルＫ　Ｐ　０４％　１５０ミリモルＮａＣ１，６ モル尿素（ｐＨ７、４）中で平衡状態にし几ヘパリンーセファロースカラムに適 用する。出発緩衝液でカラムを充分洗浄後、骨誘導因子活性蛋白質を５０ミリモ ルＫＰＯ，，７００ミリモルリＮａＣ１，６モル尿素（ｐＨ７，４）により溶離 させる。このフラクションを最小体積に濃縮し、４モルＧｕＣ］、２０ミリモル のトリス（ｐＨ７，２）により平衡状態にしたスーパローズ６およびスーパロー ズ１２カラム（−列に連結）に０．４πｇアリコートを適用し、カラムを流速０ ．２５πρ／分で展開する。骨誘導因子活性を示す蛋白質は、約３００００ダル トンの蛋白質に対応する相対移動を呈する。

上記フラクションをプールし、５０ミリモルＮａＡｃ、６モル尿素（ｐＨ４、６ ）に対して透析し、ファルマンア・モノＳ　ＨＲカラムに適用する。カラムを１ ．０モルＮａＣ１，５０ミリモルＮａＡｃ、６モル尿素（ｐＨ４、６）への勾配 により展開する。活性フラクションをプールし、１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦ Ａ）によりｐＨ３、０とする。

この材料を０．１％ＴＦＡ中０．４６Ｘ２５ｃｘバイダック０４カラムに適用し 、カラムを９０％アセトニトリル、０．１％ＴＰＡへの勾配により展開する（６ ０分間で３１．５％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡから４９．５％アセトニト リル、０．１％ＴＦＡ、　にだし１分間１好の速度）。活性材料を約４０−４４ ％アセトニトリルで溶離する。マツコナヘイ等、「インターナショナル・アーカ イブス・オブ・アラ−ジー」、２９：１８５−１８９（１９６６）、ポルトン等 、「バイオケミカル・ジャーナル」、１３３：５２９（１９７３）およびボーウ ェンーボーブ、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリーム　２３７ ・５１６１（１９８２）の中の一法により、適当なフラクションのアリコートを ヨウ素化する。これらのフラクション中に存在するヨウ素化蛋白質をＳＤＳゲル 電気泳動および尿素トリトンＸ１００等電点電気泳動により分析する。この段階 で、骨誘導因子を評価すると、約１０−５０％純度である。

実施例２ うし骨誘導因子の特性検定 Ａ１分子量 実施例１により得られた約２０μ９の蛋白質を凍結乾燥し、ｌ×ＳＤＳ試料緩衝 液に再溶解する。３７℃で１５分加熱後、試料を１５％ＳＤＳポリアクリルアミ ドゲルに適用し、次いで冷却しながら電気泳動させる。予め染色した分子量標準 （ベゼスダ・リサーチ・ラブダ）と比べて分子量を測定する。完了直後、骨誘導 因子含有ゲルレーンを０　、３　ｃｍ片に切断する。６片をすり潰し、１．４ｘ ｆｆの０゜１％ＳＤＳを加える。試料を室温で一夜穏やかに振り混ぜて蛋白質を 溶離させる。各ゲル片を脱塩することにより、生物学的検定における干渉を防ぐ 。各試料から得た上清をｌＯ％ＴＦＡによりｐＨ３゜０に酸性化し、０．４５ミ クロン膜によりろ過し、０．４６ｃｘｘ５ｃｘＣ４バイダツクカラムに入れ、０ ．１％ＴＦＡから０．１％ＴＰＡ１９０％ＣＨｓＣＮへの勾配により展開する。

適当な骨誘導因子含有フラクションをプールし、２０ｍｇのラット・マトリック スにより再構成する。このゲル・システムにおいて、骨誘導因子フラクションの 大部分は、約２８０００−３００００ダルトンの分子量を有する蛋白質移動度を 有する。

Ｂ９等電点電気泳動 骨誘導因子活性の等電点を変性等電点電気泳動システムにおいて測定する。トリ トンｘ１００尿素ゲルシステム（ホーファー・サイエンティフィック）を次の要 領で修正する。ｌ）使用される両性電解質の４０％はサーバライト３／ｌＯあり 、６０％はサーバライト７−９である。２）使用されるカッライト（ｃａｔｈｏ ｌｙｔｅ）は４０ミリモルＮａＯＨである。実施例１て得られた約２０μりの蛋 白質を凍結乾燥し、試料緩衝液に溶解し、等電点電気泳動ゲルに適用する。ゲル を２０ワツト、１０℃で約３時間移動させる。完了時、骨誘導因子含有レーンを ０　、５　ｃ７１片に切断する。６片を１　、０３１１２の６モル尿素、５ミリ モルのトリス（ｐＨ７、８）中ですり潰し、試料を室温で振り混ぜる。試料を上 記と同様に酸性化し、ろ過し、脱塩し、検定する。実施例３記載の検定で測定さ れに活性の大部分は、８．８−９．２のｐｌと一致する形で移動する。

Ｃ，サブユニットの特性 骨誘導因子のサブユニット組成についても測定する。純粋な骨誘導因子を上記と 同様にプレパラティブ１５％ＳＤＳゲルから分離する。次いて試料の一部を試料 緩衝液中５ミリモルＤＴＴにより還元し、１５％ＳＤＳゲルにおいて再電気泳動 させる。約３０キロダルトン蛋白質は、約２０キロダルトンおよび１８キロダル トンの箇所で２本の大きなバンド並びに３０キロダルトンの箇所で小さなバンド を生ずる。２本のバンドの広さは、恐らくはグリコジル化、他の翻訳後修飾、蛋 白質加水分解による減成またはカルバミル化に起因すると思われる不均質性を示 す。

実施例３ 骨誘導因子の生物学的活性 サンパスおよびレディ、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ ミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメ リカ」、８０：６５９１−６５９５（１９８３）の一般的方法によるラット骨形 成検定を用いることにより、実施例１で得られたこの発明のうし骨誘導因子の骨 生成活性を評価する。またこの検定を用いて他の種類の骨誘導因子を評価するこ とも可能である。エタノール沈澱工程の代わりに検定フラクションの水に対する 透析を行う。次いで、溶液または懸濁液を揮発性溶媒、例えば０．１−０．２％ ＴＦＡに再溶解し、生成した溶液を２０詩のラット・マトリックスに加える。こ の材料を冷凍し、凍結乾燥し、生成した粉末を＃５ゼラチンカプセルに封入する 。２１−４９日令の雄ロング・エバンス・ラットの腹部胸領域にカプセルを皮下 内植する。７−１４日後インブラントを除去する。各インブラントの半分を用い てアルカリ性ホスファターゼ分析［レディ等、「プロシーディングズ・オブ・ザ ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ ステーブ・オブ・アメリカＪ、６９：１６０１（１９７２）参照］を行い、半分 を固定し、組織分析を行う。

常用手順で、１μ工グリコメタクリレ一ト部分をボン・コッサおよび酸性ツーシ ン（ｆｕｓｃｈｉｎ）で染色することにより、新規前無機質を検出する。アルカ リ性ホスファターゼ、マトリックス形成プロセスにおいて軟骨芽細胞および骨芽 細胞により生産される酵素もまた測定される。新しい軟骨および硬骨形成はしば しばアルカリ性ホスファターゼレベルと相関する。下記第１表は、骨誘導因子に より処理されなかった対照を含むラット・マトリックス試料の用量応答を示す。

７．５　２　生産されず ２．５　３　４４５．７ Ｑ、８３　３　７７．４ ０．２８　０　３２．５ ０．００　０　３１．０ ＊この段階で骨誘導因子は約１０−１５％の純度である。

形成された硬骨または軟骨は、マトリックスによりふさがれに空間に物理的に閉 じ込められる。また、前記と同様にＳＤＳゲル電気泳動および等電点電気泳動に より試料を分析し、次いてオートラジオグラフィーを行う。分析は、ｐｌ　９． ０および２８−３０キロダルトンでの蛋白質バンドと活性の相関関係を示す。１ 　０Ｄ／π９−ＣＭの消衰係数を蛋白質に関する推定値として使用し、特定フラ クション中の骨誘導因子の純度を近づける。前記希釈物におけるインビボラット 骨形成検定において、蛋白質は、ｌＯ〜２００ｎｇ蛋白質／（骨）９〜恐らくは １ｕ９蛋白質／（骨）９より大の比率でインビボ活性を呈する。

実施例４ うし骨誘導因子蛋白質組成物 ２８−３０キロダルトンの分子量を有する実施例２Ａの蛋白質組成物を実施例２ Ｃの記載に従い還元し、トリプシンで消化する。下記のアミノ酸配列を宵する８ 種のトリプシンフラグメントを標準的方法により単離する。

フラグメント１：ＡＡＦＬＧＤＩＡＬＤＥＥＤＬＧフラグメント２：ＡＦＱＶＱ ＱＡＡＤＬフラグメント３：ＮＹＱＤＭＶＶＥＧ フラグメント４：５ＴＰＡＱＤＶＳＲ フラグメント５：ＮＱＥＡＬＲ フラグメント６：ＬＳＥＰＤＰＳＨＴＬＥＥフラグメント７：ＦＤＡＹＹ フラグメント８：ＬＫＰＳＮ？ＡＴＩＱＳＩＶＥ実施例１記載の方法と類似した 精製手順に従い、うじの骨由来の蛋白質の低級精製製品を製造する。この精製手 順は、ＤＥ−５２カラム、０ＭセルロースカラムおよびモノＳカラムの省略並び にヒドロキシルアパタイトおよびヘパリン・セファロースカラムの順での置゛き 換えにより前記手順からは基本的に変化する。簡単に述べると、濃縮１４モル抽 出物をエタノール（４度）に加えて８５％最終濃度とする。次いで混合物を遠心 分離し、沈澱を５０ミリモルのトリス、０．１５モルＮａＣ１，６，０モル尿素 に再溶解する。次に、この材料を前記と同様にヘパリン・セファロースにおいて 分画化する。ヘパリン結合材料を前記と同様にヒドロキシアパタイトにおいて分 画化する。活性フラクションをプールし、濃縮し、高度分離ゲルろ過において分 画化する（６モルのグアニジニウムクロリド、５０ミリモルのトリス（ｐＨ７， ２）中ＴＳＫ３００００）。活性フラクションをプールし、０．１％ＴＦＡに対 して透析し、次いで前記と同様にＣ４バイダック逆相カラムにおいて分画化する ｅ：Ａ型物を還元し、アクリルアミドゲルで電気泳動する。１８にバンドに対応 する蛋白質を溶離させ、トリプシンで消化する。下記のアミノ酸配列を有するト リプシンフラグメントが分離される。

フラグメント９：５ＬＫＰＳＮＨＡＴＩＱＳ？Ｖフラグメント１０：ＳＦ’ＤＡ ＹＹＣＳ？Ａ７ラグメント１　］　：ＶＹＰＮＭＴＶＥＳＣ，Ａフラグメントｌ 　２：ＶＤＦＡＤ　Ｉ　？Ｗただし、トリプシン・フラグメント７および８は、 実質的にそれぞれフラグメント１０および９であるものとする。

Ａ、ｂＢＭＰ−ル イズ、′ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー工、１８３（１）：１ −１２（１９８５）の方法に従い、オリゴヌクレオチドのプール（または特有の オリゴヌクレオチド）を成分とするプローブを設計し、自動ＤＮＡシンセサイザ ーで合成する。−プローブは、下記ヌクレオチド配列 ＴＣＣＴＣＡＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＡＧＧＡＡＧＧＣを有する 比較的長い（３２ヌクレオチド）「ゲスマー」［ツール等、「ネイチャー」、３ １２：３４２−３４７（１９８４）］を成分としている。

遺伝子コードは同義性であるため（複数のコドンが同じアミノ酸をコードし得る ）、プローブプールにおけるオリゴヌクレオチドの数は、真核生物におけるコド ン使用頻変、Ｇ：Ｔ塩基対の相対安定性および真核生物コード配列におけるジヌ クレオチドＣｐＧの相対的希少性に基づいて減らされる［ツール等（前出）参照 コ。第２セツトのプローブは、アミノ酸をコードし得る可能な配列を全て含む短 いオリゴヌクレオチド（長さ１７ヌクレオチド）により構成される。第２セツト のプローブは下記配列を有する。

（ａ）Ａ　［Ａ／Ｇコ　［Ａ／Ｇコ　ＴＣ［Ｔ／Ｃコ　ＴＣ［Ｔ／Ｃ］　ＴＣＩ Ａ／Ｇコ　ＴＣ［Ｔ／Ｃ］　ＡＡ（ｂ）Ａ　［Ａ／Ｇコ　［Ａ／Ｇ］　ＴＣ［Ｔ ／Ｃ］　ＴＣ［Ｔ／Ｃ］　ＴＣ［Ａ／ＧＥ　ＴＣＮＡＧ括弧内のヌクレオチドは 代替配列である。ｒＮＪはＡ、Ｔ、ＣまたはＧを意味する。

両場合において、プローブ設計に使用されるアミノ酸配列の領域は、可能ならば 高度変性コドンを避けることにより選択される。オリゴヌクレオチドを自動ＤＮ Ａシンセサイザーで合成する。次いで、ポリヌクレオチドキナーゼおよび”Ｐ− Ａ、ＴＰを用いてプローブに放射性標識を行う。

こ２−ら２セツトのプローブを用いてうしゲノム組換え体ライブラリーをスクリ ーニングする。ライブラリーは次の要領で構築される。

うし肝臓ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ酵素５ａｕ３Ａにより部分消化し、シ ョ糖勾配により沈降させる。次に、１５−３０キロ塩基の範囲でのサイズ分画Ｄ 　Ｎ　ＡをバクテリオファージＢａｍＨＩベクターＥＭＢＬ３に結合する［フリ シャラフ等、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」、１７０：８ ２７−８４２（１９８３）］。ライブラリーを１プレート当たり組換え体８００ ０個の割合で培養する。プラークの重複ニトロセルロースレプリカを作成し、ウ ー等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ エンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカ」、７５：３ ６８Ｂ−９１（１９７８）の手順の修正法に従い増幅する。

３２ｍｅｒプローブを３２ｐ−ガンマ−ＡＴＰによりキナーゼ化し、４５℃で５ ＸＳＳＣ，ｏ、ｔ％ＳＤＳ、５ｘデンハルツ、１００μ９／ｍｃのサーモン精液 ＤＮＡ中１セットのフィルターとハイブリダイゼーションし、４５℃で５ｘＳＳ Ｃ，０，１％ＳＤＳにより洗浄する。１７ｍａｒプローブをキナーゼ化し、５０ ℃で３モルのテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、０．１モルの燐 酸ナトリウム（ｐＨ６，５）、１ミリモルＥＤＴＡ、５×デンハルツ、０．６％ ＳＤＳ、１００μ９７πＱサーモン精液ＤＮＡ中他のセットのフィルターとハイ ブリダイゼーションし、５０℃で３モルＴＭＡＣ１５０ミリモルのトリス（ｐＨ ８，０）により洗浄する。これらの条件により、１７ｍａｒプローブプラーク精 製不適当な組合わせの検出は最小限となる［ウッド等、「プロシーディングズ・ オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイ テッド・ステーブ・オブ・アメリカ」、８２：１５８５−１５８８（１９８５） 参照］。この方法により４０００００個の組換え体をスクリーニングし、−デュ プリケイト陽性をプラーク精製する。ラムダｂＰ−５０と称するこの組換え体バ クテリオファージのプレートリゼイトからＤＮＡを分離するｅｂＰ−５０は、１ ９８６年１２月１６日に受託番号４０２９５としてアメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクション（アメリカ合衆国メリーランド、ロックビル、パークローン ・ドライブ１２３０１Ｘ以後「ＡＴＣＣ」と称す）に寄託された。この寄託物お よびこの明細書に含まれる他の賽託物は、特許手続きを目的とする微生物の寄託 の国際的承認に関するブダペスト条約およびその下での規則の必要条件を満たし ている。このｂＰ−５０クローンは、ｂＢＭＰ−１と称するうし骨成長因子の少 なくとも一部をコードする。

このｂＢＭＰ−１クローンのオリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション領域 は、Ｍ１３中にサブクローン化され、標準技術により配列された約８００ｂｐの ＥｃｏＲＩフラグメントに対して局在している。ラムダｂｐ−ｓｏの部分的ＤＮ Ａ配列および誘導されたアミノ酸配列を下記第２表に示す。牛骨２８〜３０ｋｄ 材料から分離されたトリプシンフラグメントに対応するアミノ酸配列は、第２表 の下線部である。この配列の最初の下線部分は、オリゴヌクレオチドプローブが 設計される上記トリプシンフラグメントｌに対応する。第二の下線部分は、上記 トリプシンフラグメント２に対応する。予測されたアミノ酸配列は、トリプシン の特異性を考慮して予想した通り、塩基性残基（Ｒ）がトリプシンフラグメント ２の前にあることを示す。第２表におけるヌクレオチド位置：２９２−２９３の カップレットＣＴに先行する核酸配列は、コンセンサス受容配列（すなわち、ピ リミジン濃厚域、ＴＣＴＣＴＣＴＣＣ，次にＡＧ）の存在および誘導されたアミ ノ酸配列の適当な位置における塩基性残基の欠如に基づきイントロン（非コード 配列）であると思われる。このｂＢＭＰ−１ゲノム配列は第２表において明白で ある。このゲノムクロ、−ンからの推定に基づ＜ｂＢＭＰ−１ペプチド配列は３ ７アミノ酸長であり、第２表におけるヌクレオチド＝２９４〜＃４０４のＤＮＡ 配列によりコードされる。

第２表 Ｂ、ｂＢＭＰ−２ フラグメント３のアミノ酸配列に基づき、オリゴヌクレオチドのプールを成分と する２種のプローブを設計し、前記と同様に自動ＤＮＡシンセサイザーで合成す る。

プローブ＝１：ＡＣＮＡＣＣＡＴＶ、Ａ／Ｇ二ＴＣ二Ｔ’／Ｃ：ＴＧ二Ａ／Ｇ３ ＡＴプローブ＝２：ＣＡＴＡ／ＧコＧＡ：Ｔ／ＣＩＡＴＧＧＴＮＧＴＮＧＡこれ らのプローブを放射性標識し、こター口を用いて、Ａ項の記載に従い（ただし、 ベクター（よラムダＪ　Ｉ　ＢａｍＨＩ　ａｒｍｓである）構築されたうしゲノ ムライブラリーをスクリーニングするロムリンズ等、「ネイチャー」、３０８： ８５６−８５８（１９８４）：。放射性標識１７−ｍｅｒプローブ＃１を、Ａ項 記載の１７ｍｅｒプローブに関する方法によるフィルターのセットとハイブリダ イゼーションする。

上記Ａ項記載の手順により４０００００個の組換え体をスクリーニングする。− デュプリケイト陽性をプラーク精製し、ＤＮＡを、ラムダｂＰ−２１と称する組 換えバクテリオファージの培養リゼイトから分離する。バクテリオファージｂＰ −２１は、１９８７年３月６日にＡＴＣＣ４０３１０の受託番号でＡＴＣＣに寄 託された。

ｂＰ−２１クローンは、ｂＢＭＰ−２と称するうし成長因子をコードする。

このｂＢＭＰ−２クローンのオリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション領域 は、Ｍ１３中にサブクローン化され、標準技術により配列決定された約１．２キ ロ塩基のＳ　ａｃ　Ｉ制限フラグメントに対して局在する。この５ａｃｌフラグ メントおよびｂＰ−２１の隣接ＨｉｎｄＩ［［−９ａｃＩ制限フラグメントの部 分的Ｄ　Ｎ　Ａ配列および誘導されたアミノ酸配列を下記第３表に示す。このク ローンからのｂＢＭＰ−２ペプチド配列は１２９アミノ酸長であり、ヌクレオチ ド＝ｌ〜ヌクレオチド＝３８７のＤＮＡ配列によりコードされる。牛骨２８〜３ ０ｋｄ材料から分離され１ニトリプシンフラグメントに対応するアミノ酸配列は 、第３表の下線部である。この配列の下線部分は、ｂＢＭＰ−２に関するオリゴ ヌクレオチドプローブが設計される上記トリプシンフラグメント３に対廃する。

予測されたアミノ酸配列は、トリプシンの特異性を考慮して予想した通り、塩基 性残基（Ｋ）がトリプシンフラグメント３の前にあることを示す。ＣＧＴトリプ レットによりコードされるアルギニン残基は、それに隣接する停止コドン（ＴＡ Ｇ）の存在に基づき恐らく蛋白質のカルボキシ末端であると思われる。

ＱＡＸＨＸＱＲ：ＫＲＬＫＳ　Ｓ　ＣＸ’ＲＨＰＬＹＶＤＦＳＤＶＧＷＮＤ １５０　−　１６５　１ε０ ＴＧＧ　λＴＣＧＴＴ　ＧＣλ　ＣＣＧ　ＣＣＧ　ＧＧＧ　τλＴＣλＴ　ＧＣ Ｃττ！　τλＣＴＧＣＣλＴ　ＣＣＧ賢　工　ＶＡＰＰＧＹＥ　ＡＦＹＣＨＧ ２４、（１，、、、、、、、、、、、２５５２７０Ｇ（Ｃ”７％ＴＴ　’　ＣＴ Ｃ’　ＣＡＡ’　ＡＣＴ　”ＣＴＧＧＴＣ−ＡＮＣ”Ｔ’ＣＡ　”ＧＴＴ”ＸＡ Ｃ”’ＴＣＴｎ’Ｇ　λＴＴ　bＣＣ λ　工　ＶＱＴＬＶＮＳＶＮＳ　Ｋ　工　ＰＫＡＣＣＶＰ置ＳＡ　工　ＳＭＬ ！ＶＶ？ＧＣＧＣＲ ４エフ　４２７　４３７　４４７　４５７Ｃ，ｂＢＭＰ−３ トリプシンフラグメント９（プローブ＝３）、１０（プローブ＃２）および１１ （プローブ＃１）のアミノ酸配列に基づいて、オリゴヌクレオチドのプールを成 分とするプローブを設計し、自動ＤＮＡシンセサイザーで合成する。

プローブ：　１　：ＡＣＮＧＴＣＡＴ［Ａ／ＧコＴ　Ｔ　Ｎ　Ｇ　Ｇ　［Ａ　／ 　Ｇ　］　Ｔ　Ａプローブ＝２：ＣＡＣＡ／Ｇ］ＴＡ［Ａ／ＧコＴＡＮＧＣＥＡ ／Ｇ］ＴＣＥＡ／　Ｇ　ｉ　Ａ　Ａ プローブ＃３：ＴＧ［Ａ／Ｇ／Ｔ］ＡＴＮＧＴＮＧＣ［Ａ／Ｇ］ＴＧ［Ａ／Ｇ］ Ｔ　Ｔ 上記Ａ項で詳述し１：　Ｔ　Ｍ　Ａ　Ｃハイブリダイゼーション方法により、Ｅ ＭＢＬ３において構築された組換えうしゲノムライブラリーをスクリーニングす る。４０００００個の組換え体を３２Ｐで標識され１こプローブ＝１により繰り 返しスクリーニングする。このプローブとハイブリダイゼーションした組換え体 は全て二次培養として再培養される。トリプリケイト・ニトロセルロース・レプ リカは二次培養物から成り、前記と同様に増幅される。３セツトのフィルターを 再びＴＭＡＣ条件下でプローブ＃１、＝２および＝３とハイブリダイゼーション する。−クローン、ラムダｂＰ−８１９は３種のプローブ全てとハイブリダイゼ ーションする。これをプラーク精製し、ＤＮＡをプレートリゼイトから分離する 。バクテリオファージラムダｂＰ−８１９は、１９８７年６月１６日にＡＴＣＣ ４０３４４の受託番号下でＡＴＣＣに寄託された。このｂＰ−８１９クローンは 、ｂＢＭＰ−３と称するうし骨成長因子をコードする。

プローブ＃２とハイブリダイゼーションするｂＰ−８１９の領域は局在して配列 している。この領域の部分的ＤＮＡおよび誘導されたアミノ酸配列を第４Ａ表に 示す。トリプシンフラグメントｌＯおよび１２に対応するアミノ酸配列は下線部 である。最初の下線部の配列はフラグメント１２に対応し、第２の下線部の配列 はフラグメント１０に対応する。従って、プローブ≠２とハイブリダイゼーショ ンするｂＰ−８１９のこの領域は、少なくとも１１１個のアミノ酸をコードする 。このアミノ酸配列は、ヌクレオチド＝４１４〜＃７４６のＤ　Ｎ　、Ａ配列に よりコードさシーる。

第４Ａ表 プローブ＝１および＝３とハイブリダイゼーションするｂＰ−８１９の領域は局 在して配列している。この領域の部分的ＤＮＡおよび誘導されたアミノ酸配列を 第４Ｂ表に示す。トリプシンフラグメント９および１１に対応するアミノ酸配列 ：よ下線部である。最初の下線部の配列はフラグメント９に対応し、第２の下線 部の配列はフラグメント１１に対応する。プローブ＃ｌおよび＝３とハイブリダ イゼーションするｂＰ−８１９のこの領域のペプチド配列は、第４Ｂ表のヌクレ オチド＃３０５〜＃４９３によりコードされる長さ６４個のアミノ酸である。Ａ ＧＡ　トリプレットによりコードされるアルギニン残基は、それに隣接する停止 コドン（ＴＡＡ）の存在に基づき蛋白質のカルボキシ末端であると思われる。カ ップレットＴＣ（３０５−３０６位）に先行する核酸配列は、コンセンサス受容 配列（すなわち、ピリミジン濃厚域、ＴＴＣＴＣＣＣＴＴＴＴＣＧＴＴＣＣＴ１ 次にＡＧ）の存在および誘導されたアミノ酸配列の適当な位置における塩基性残 基以外の停止配列の存在に基づきイントロン（非、コード配列）であると思われ る。

従って、ｂＢＭＰ−３は、第４Ａ表および第４Ｂ表のＤＮＡおよびアミノ酸配列 を有することを特徴とする。このクローンのペプチド配列は１７５アミノ酸長で あり、第４Ａ表のヌクレオチド＃４１４〜ヌクレオチド＃７４６および第４Ｂ表 のヌクレオチド＃３０５〜ヌクレオチド＝４９３のＤＮＡ配列によりコードされ る。

第４Ｂ表 実施例５ ひと骨誘導因子 Ａ、ｈＢλＩＦ−１ うしおよびひとの骨成長因子遺伝子は著しく相同性を示すと思われるため、第２ 表のうしｂＢＭＰ−Ｉ　ＤＮＡ配列（またはその一部分）をプローブとして用い ることにより、ひと遺伝子ライブラリーをスクリーニングする。うしゲノムクロ ーンの８００ｂｐ　ＥｃｏＲＩフラグメントをニック翻訳により３ｔｐで標識す るうひとゲノムライブラリ−（ツール等、前出）を、ｌプレート当たり組換え体 ４００００個の割合で２０プレートにおいて培養する。デュプリケイト・ニトロ セルロースフィルター・レプリカは、各プレートで構成されており、５０℃で約 １４時間５ｘｓｓｃ、５ｘデンハルツ、１００μ９／πρ変性サーモン精液ＤＮ Ａ、０．１％５ＤＳ（標準ハイブリダイゼーション溶液）中ニック翻訳プローブ とハイブリダイゼーションさ゛れる。次いで、フィルターを５０℃で１ｘＳＳＣ ，０，１％ＳＤＳにより洗浄し、オートラジオグラフィーに付す。５つのデュブ リケイト陽性を分離し、プラーク精製する。これらの組換えバクテリオファージ のうちの１種、ＬＰ−Ｈｌのプレート・リゼイトからＤＮＡを得る。Ｌ　Ｐ、　 −８１は１９８７年３月６日にＡＴＣＣに寄託さ、れた（受託番号４０３１１） 。このクローンは、ｈＢＭＰ−１というひとゲノム骨成長因子の少なくとも一部 分をコードする。ＬＰ−Ｈｌのハイブリダイゼーション領域は、２．５キロ塩基 ＸｂａＩ／Ｈｉｎｄ■制限フラグメントに対して局在している。

ラムダＬＰ−Ｈ１の部分的Ｄ　Ｎ　Ａ配列および誘導されたアミノ酸配列を下記 第５表に示す。このクローンからのペプチド配列は３７アミノ酸長であり、ヌク レオチド：：３４４０〜ヌクレオチド＃３５５０のＤＮＡ配列によりコードされ る。第５表のコード配列の側面には、約２８個のヌクレオチド（推定に基づく５ °非コ一ド配列）および約１９個のヌクレオチド（推定に基づく３°非コ一ド配 列）が存在する。第２表のｂＢＭＰ−１配列と第５表のｈＢＭＰ−１ゲノム配列 とを比較すると、両配列間に顕著な相同性の存在することが示される。

コード領域のサイズおよび非コード領域の位置は、一般に異なる種類の相同性遺 伝子においても保持されているため、骨誘導因子遺伝子のコードおよび非コード 領域の配置は同定され得る。相同部位においてシグナルを生じるＲＮＡが側面に 位置する、２種類の遺伝子間の相同性領域は、コード領域を示す。

１５表 τλ二り工■ ？？ｒ　ｊａａ　４’ｌ−Ｖ　聯Ｓｅ：　ｓａ−：Ｃ１ｅ　ＴＪｆＳ　Ａｌａ　 ＡＬａ第５表に示されたひとコード配列に特異的なプローブを用いることにより 、骨誘導因子を合成するひとセルラインまたは組織を同定する。このプローブは 次の方法に従い作成される。下記配列（ａ）ＧＧＧＡ　ＡＴＴＣＴＧＣＣＴＴＴ ＣＴＴＧＧＧＧ　Ａ　ＣＡＴＴＧＣＣＣＴＧＧ　Ａ　ＣＧ　Ａ　ＡＧ　ＡＧＧＡ 　ＣＣＴＧＡＧ（ｂ）ＣＧＧＧＡ　Ｔ　ＣＣＧＴＣＴＧ　ＡＧ　ＡｒｃｃＡＣＡ Ｇ　ＣＣＴＧＣＴＧＴＡ　ＣＣＴＧＧ　ＡＡＧＧ　ＣＣＣＴ　ＣＡＧＧを有する ２種のオリゴヌクレオチドを自動シンセサイザーで合成し、アニーリングし、エ シェリヒア・コリＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウ・フラグメントを用いて広げ 、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ■により消化し、Ｍ１３ベクターに挿入す る。次に、一本鎖３！Ｐ標識プローブは、標準技術によりこのサブクローンの鋳 型調製物により作成される。ツール等の方法（前出）により、様々な細胞および 組織供給源由来のポリアデニル化ＲＮＡをホルムアルデヒド−アガロースゲルに より電気泳動させ、ニトロセルロースに移動させる。次いで、このプローブを、 ４２℃で一夜５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ、４０ミリモル の燐酸ナトリウム（ｐＨ６、５）、１００μ９／πＱの変性サーモン精液ＤＮＡ および５ミリモルのバナジルリボヌクレオシド中ニトロセルロース・プロットと ハイブリダイゼーションし、０．２ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中６５℃中性５す る。オートラジオグラフィーによると、ひと骨肉腫セルラインＬｌ−２０Ｓ由来 のＲＮ　Ａを含むレーンは、約４．３および３．０キロ塩基のＲＮＡ種に対応す るハイブリダイゼーション・バンドを含んでいる。

ｃＤＮＡをＵ−２ＯＳポリアデニル化ＲＮＡから合成し、確立されＴニ技術によ り（ツール等、前出）ラムダｇｔｌｏにクローン化する。

このライブラリーからの組換え体２００００個を５０プレートの各々において培 養する。デュプリケイト・ニトロセルロース・レプリＰ−ガンマ−ＡＴＰにより キナーゼ化し、５５℃で一夜標準ハイブリダイゼーション溶液中で２セツトのレ プリカとハイブリダイゼーションする。次いで、フィルターを５５℃でｌＸ５Ｓ Ｃ，０，１％ＳＤＳにより洗浄し、オートラジオグラフィーに付す。ラムダＵ２ Ｏ５−１と称するーデュプリケイト陽性をプラーク精製する。ラムダＵ２Ｏ５− １は１９８７年６月１６日にＡＴＣＣに寄託された（受託番号４０３４３）。

ラムダＵ２Ｏ５−１の挿入体の全ヌクレオチド配列および誘導されたアミノ酸配 列を第６表に示す。このｃＤＮＡクローンは、分泌された蛋白質特有の疎水性リ ーダー配列が後に続くメチオニンをコードし、ヌクレオチド位２２２６−２２２ ８の停止コドンを含む。

このクローンは、このアミノ酸配列に基づき分子量０ｇ８３キロダルトンを有す る７３０個のアミノ酸で構成される蛋白質をコードする、２１９０ｂｐのオーブ ン・リーディング・フレームを含む。このクローンは、第５表に示したコード領 域と同じ配列を含む。この蛋白質は、分泌後開裂してｈＢＭＰ−１蛋白質を生成 する一次翻訳産物を示すと考えられる。従って、このクローンは、ゲノムｈＢＭ Ｐ−１配列ラムダＬＰ−Ｈｌに含まれるひと遺伝子フラグメントに対応するｈＢ ＭＰ−１のｃＤＮ、Ａである。１こだし、ＢＭＰ−１のアミノ酸＝５５０〜＝５ ９０は、表皮成長因子並びにプロティンＣ１第Ｘ因子および第Ｘ因子の「成長因 子」領域と相同性である。

６６５　εε０　６９５ ｐｌ−ｏＰｒｏ　ｎｅ　Ｇｌｙ　ＧＬｎ　Ａｒｇ　計Ａｒｇ　≧Ｓａｒ　Ｌｙｓ 　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　ｎｅ　Ａｌａ　Ｇ：Ｌｎ　ＡＬａ　Ｌ”■ ：ＬＯ４０１０５５：ＬＯ７０１０ε５ＴＩＮ：ＴＣ：α℃αコＣ込＝入Ｃα℃ に江αにＴ入ＣＴ（コαコＣＪ−Ｃ島Ｃ入Ｃπにσ℃πシｐｈａ　Ｓａｒ　ｓａ ｒ　≧℃Ｇｌｕ　％？　ｐｒｏ　）Ａｎ　Ｇｌｙ　ｆＪ）＋ｒ　Ｓａｒ　ＡＬａ 　芝トＰＥｒ　ｆＪ５　Ｃ’ｌ’５　uａｎ　Ｔｒｐ ｕｏｏ　１１：Ｌ５　ｕフ０ Ｃ５Ｃ入ＴＣＴ’Ｃ’ｒ　Ｇ７Ｃ入ＣＡ　Ｃ’：　Ｇ’、：　Ｇ入Ｇ入入Ｇ入ｆ ｆＣ入ＴＣＣＴＧ　入λＣＴτＣ入ＣＧ　Ｔｌ！　ＣＴＣＣ`Ｃ ）、ｒｇ　ｎｅ　Ｓａｒ　Ｖａｎ　Ｔ！＝ｘ　Ｐｚ　ＧＬｙ　ＧＬｕ　Ｌ＞−ｓ 工１ｅ工１ｅ　ｎ二勘≧ｅ　シＳｅｒ　”Ｅ４　）−５ｐ工ｌｅ　Ｖｄ　Ｓａｗ 　”：：ｘ　）ｓｐ　Ｓａｗ　ｋτ’Ｌｔｒａ　Ｔｒｐ　Ｖｄ　ＧＬｕ　？：ｒ ｅＡｒｇ　Ｓｅｘ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　■Jフ ＣコζＡ Ｂ、ｈＢＭＰ−２：クラスＩおよび■ 実施例４Ｂ記載のＨｉｎｄｎｌ−ＳａｃｌうしゲノムｂＢＭＰ−２７ラグメント をＭ１３ベクターにサブクローンする。３２Ｐ−標識一本鎖ＤＮＡプローブは、 このサブクローンの鋳型調製物から作成される。

このプローブを用いることにより、Ａ項で前述された様々な細胞および組織供給 源由来のポリアデニル化ＲＮＡをスクリーニングする。

約３．８キロ塩基のｍＲＮＡ種に対応するノーイブリダイゼーション・バンドは 、ひとセルラインＵ−２Ｏ６由来のＲＮ　Ａを含むレーンにおいて検出される。

ＨｉｎｄｌＩ［−５ａｃｌフラグメントをニック翻訳により１Ｐで標識し、これ を用いて、６５℃で一夜標準）＼イブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイ ゼーションし、次いで６５℃、でｌＸ５ＳＣ，Ｑ、１％ＳＤＳにより洗浄するこ とにより、前記Ｕ−２０ＳｃＤＮＡライブラリーのニトロセルロース・フィルタ ー・レプリカをスクリーニングする。１２個のデュブリケイト陽性クローンを取 り上げ、二次培養として再培養する。デュプリケイト・ニトロセルロース・レプ リカは二次培養物から成り、−次スクリーニングを行なっｆ二場合と同様に両セ ット共うしゲノムプローブとハイブリダイゼーションされる。次いで６５＠で一 方のセットのフィルターをｌＸ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳで洗浄し、他方のセット を０．ｌＸ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳで洗浄する。

２クラスのｈＢＭＰ−２ｃＤＮＡクローンは、高いストリンジェント洗浄条件下 （０，１ｘＳＳＣ，０，１％５ＤＳ）において、強い（４組換え体）または弱い （７組換え体）ハイブリダイゼーション・シグナルに基づき明白である。１１組 換えバクテリオファージ全部をプラーク精製し、小規模ＤＮＡ調製物を各々の培 養リゼイトから作成し、配列分析用に挿入体をｐＳＰ６５およびＭ１３にサブク ローン化する。ｈＢＭＰ−２・クラス１と称する（ＢＭＰ−２としても知られて いる）強いハイブリダイゼーションクローンの配列分析は、それらが第３表に示 された配列と強い配列相同性を有することを示す。

従ってこれらのクローンは、ｂＢＭＰ−２遺伝子（この部分配列は第３表に示さ れている）によりコードされる蛋白質のひと均等蛋白質をコードするｃＤＮＡで ある。ｈＢＭＰ−２・クラス■と称する（ＢＭＰ−４としても知られている）弱 いハイブリダイゼーション組換え体の配列分析は、それらもまた、それらのコー ド領域の３゛末端において第３表に示した配列と全く相同性である（ただし、さ らに大きい５°領域ではそれほどではない）ことを示す。すなわち、それらは、 同一ではないが、前記構造との類似構造を有するひと蛋白質をコードする。

完全長のｈＢＭＰ−２・クラスＩｃＤＮＡクローンも同様の方法で得られる。ク ラス■サブクローンの１つ（ｎ−１０−１）の１．５キロ塩基挿入体を分離し、 ニック翻訳により放射性標識する。上記でスクリーニングされｒ：Ｕ−２０Ｓ　 ｃＤＮＡライブラリーのニトロセルロース・レプリカ（５０フイルター、１００ ００００組換え体バクテリオファージに対応）の１セツトを、ストリンジェント 条件下（標準ハイブリダイゼーション緩衝液中６５°でハイブリダイゼーション 、６５°で０．２ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳで洗浄）でこのプローブとハイブリ ダイゼーションする。クラス■ブ・ローブとはハイブリダイゼーションしないう しゲノムプローブとハイブリダイゼーションする組換え体全部を選び取り、プラ ーク精製する（１０組換え体）Ｃプレートのストックを作り、小規模バクテリオ ファージＤＮＡＥＩＩ型物を作成する。Ｍｌ　３へのサブクローニング後、配列 分析は、これらのうち４つが元のクラスＩクローンと部分的に一致するクローン を表すことを示す。これらの中の１つ、ラムダＵ２Ｏ５−３９は、約１．５キロ 塩基の挿入体を含んでおり、１９８７年６月１６日付けでＡＴＣＣに寄託された （受託番号４０３４５）。部分的ＤＮＡ配列（ラムダＬｔ２０Ｓ−３９および幾 つかの他のｈＢＭＰ−２クラスＩｃＤＮＡ組換え体から編集された）および誘導 されたアミノ酸配列を下記第７表に示す。ラムダＵ２Ｏ５−３９は、その部分配 列が第３表に示さ乞−でいろうし遺伝子セグメントによりコードされる蛋白質Ｂ ＭＰ−２・クラス■のひと対応部全体をコードするのに必要なヌクレオチド配列 を全て含むものと予想される。このひとｃＤＮＡ　ｈＢＭＰ−２クラス■は、３ ９６個のアミノ酸から成る蛋白質をコードする、１１８８ｂｐのオープン・リー ディング・フレームを含む。３９６個のアミノ酸から成るこの蛋白質は、このア ミノ酸配列に基づき４５キロダルトンの分子量を有する。この配列は、−次翻訳 産物を表すものと考えられる。全フレームにおいて停止コドンを有する３４２ｂ ｐの５°未翻訳領域がこの蛋白質に先行する。

コノ５゛未翻訳領域に先行する１３ｂｐ領域は、ｃＤＮＡクローニング方法で使 用されるリンカ−を表す。

１０　２０　：！０　４０　５０　６０　７０８０　９０　１００　ｎｏ　１２ ０　１３０　１４０Ｃズ工λＣｒ′ｒ′ｒＧＣχエコα■Ｘ℃τコ℃Ｃｃ＝ス５ ０Ｉ；ＧＣ−℃ＣＴＺ＝Ｃｃ噴℃ＴＣ＝ンＳαＩ工λＯＩに℃０コニ℃１５０　 １６０　：Ｌ７０　ユＳｏ　１９０　２００　２１０、’Ｅ’ｗｅ　ＧＬｕＩｚ ａ　Ｌ、　シニＬｍ　Ｓｅｘ　ＦＥＴ　Ｆｈａ　Ｇｌｙ　’Ｌｔｒａ　Ｌｙｓ　 Ｇｂ　蝙Ｐｒｒｓ＋　’ｂｘ　Ｐ窒潤@５ａｒ ５ε０　５９５　−　６１０ λＧＳＧ入Ｃα’：：　ＧｒＧ　Ｃ’Ｍ　α工α：τλＣ島σスＧλＣＣ℃フ： α℃に℃Ｃ入Ｃ’にコＧπ）：ｑ　ＡＳＰ　Ａユａ　Ｖａｌ　Ｖａｎ　ｐ−＋　 Ｐ：０　丁’）？　Ｆｒ　二ｅａ　λｓｐ　’Ｌｔｒａ　’Ｘ−，＝　入ｒ９人 −９Ｈ■刀@Ｓｅｒ　ＧＬｙ ｃｍ５ＣＣＣＧＳ口ＴＣＡ　Ｃ０ＣＧ工に入ＧλＣＣ，−、ＣＣｍ−ｌ５τＴＧ 　ＧλＳ入：　ＧＣＡ　Ｃ−ＧＣＡ：Ｃｎ入ＧＣ０Ｇ≧≧ｖ　ＧＬｙ　Ｓｅｒで フにとｉ℃椰五恒−−ｗ　Ｇ１＊　）：耳疋ａ疋ａシ；に可にａ６ε５　７００ 　７Ｌ５ １４９５　ユ５二Ｏ：！２５　。

λυよ 完全な長さのｈＢＭＰ　２・クラス■ひとｃＤＮＡクローンは、次の要領で得ら れる。クラス■組換えＩｌ−１０−１の５゛端部からの２００ｂｐ　ＥｃｏＲｌ −５ａｃｌフラグメントをそのプラスミド・サブクローンから分離し、ニック翻 訳により標識し、Ｕ−２０ＳｃＤＮＡライブラリー（２５フイルター／セツト、 ５０００００個の組換え体を示す）の１セツトのデュプリケイト・ニトロセルロ ース・レプリカとハイブリダイゼーションする。前記ストリンジェント条件下で ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行う。１６デユプリケイト陽性を選び取り 、二次培養として再培養する。二次培養のニトロセルロース・フィルター・レプ リカを作成し、ｌｌ−１０−１の配列と対応すべく合成された、下記配列ＣＧＧ ＧＣＧＣＴＣＡＧＧＡＴＡＣＴＣＡＡＧＡＣＣＡＧＴＧＣＴＧを有するオリゴヌ クレオチドとハイブリダイゼーションする。５０℃で標準ハイブリダイゼーショ ン緩衝液中でハイブリダイゼーションし、１ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳにより５ ０°で洗浄する。このオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションする１４組 換えバクテリオファージをプラーク精製する。プラーク・ストックを作り、小規 模バクテリオファージＤＮＡＥｌｉ型物を作成する。これらの中の３つをＭ２Ｓ にサブクローニング後、配列分析は、それらが元のクラス■クラスと部分的に一 致するクローンを表すことを示す。これらの中の１つ、ラムダＵ２Ｏ５−３は１ ９８７年６月１６日付けでＡＴＣＣ＋、ニー寄託サレタ（受託番号４０３４２） 。Ｕ　２　ＯＳ　−３１ｉ約１゜８キロ塩基の挿入体を含む。Ｕ２Ｏ５−３の部 分的ＤＮＡ配列および誘導されたアミノ酸配列を下記第８表に示す。このクロー ンは、全ひとＢＭＰ−２・クラス■蛋白質をコードするのに必要なヌクレオチド 配列の全てを含むものと予想される。このｃＤＮＡは、全フレームにおいて停止 コドンを有する３９４ｂｐの５′未翻訳領域が先行し、４０８個のアミノ酸から 成る蛋白質をコードする、１２２４ｂｐのオーブン・リーディング・フレームを 含み、イン−フレーム停止コドンの後に３０８ｂｐの３°未翻訳領域を含む。５ °未翻訳頌域に先行する８ｂｐ領域は、ｃＤＮＡクローニング方法で使用される リンカ−を表す。４０８個のアミノ酸から成る蛋白質は４７キロダルトンの分子 量を有し、−次翻訳産物を表すものと考えられる。

にコーｅ、？ｘｓ ＦＴ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ＧｌｙＣＹＳ　ＧＩＹ　Ｃ）％　ｋ７ＣＤＣみ ご■二λα工込に：℃ 第３．４．７および８表に示されｆ二ＢＭＰ−２・クラスＩおよび■並びにＢＭ Ｐ−３の配列は、インヒビンのベータ（Ｂ）およびベータ（Ａ）サブユニットと 顕著な相同性を有する。インヒビンは、避妊における使用に関して現在研究され ているホルモンの一種である。

メゾン等、「ネイチャー」、３１８：６５９−６６３（１９８５）参照。

さらに範囲を狭めると、それらはまた、ムレリアン阻害物質（ＭＩＳ）、雄性胚 の成長中におけるムレリアン導管の退行を誘発する精巣性糖蛋白質、および細胞 の成長を阻害まには刺激し得、またはそれらを分化させ得る形質転換成長因子− ベータ（ＴＦＧ−ｂ）とも相同性を呈する。さらに、ｈＢＭＰ　２・クラス■を コードする第７表の配列は、ドロソフィラ・デカペンタブレシック（ＤＰＰ−Ｃ ）遺伝子座転写体と顕著な相同性を有する。マツサーブ、「セル」、４９：４３ ７−４３８（１９８７）、バジェット等、「ネイチャー」、３２５：８ｌ−８４ （１９８７）、ケート等、「セル」、４５：６８５−６９８（１９８６）参照。

従って、ＢＭＰ−２・クラス■が、この発生的突然変異遺伝子座からのこの転写 体から作られた蛋白質のひと相同体であり得ることが考えられる。

Ｃ，ＢＭＰ−３ うしおよびひとの骨成長因子遺伝子が顕著な相同性を有すると思われるにめ、第 ４Ａ表および第４Ｂ表のうしＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションすることが示 されたオリゴヌクレオチド・プローブを用いてひとゲノム・ライブラリーをスク リーニングする。これらのプローブを用いてひとゲノムライブラリー（ツール等 、前出）をスクリーニングし、仮定的陽性を分離すると、前記と同様にＤＮＡ配 列が得られる。この組換え体がひと骨誘導因子分子の一部をコードするという証 拠は、うし／ひと蛋白質および遺伝子構造相同性に存する。

、　一旦ひとＢＭＰ−３分子の一部をコードするＤ　Ｎ　Ａを含む組換えバタテ リオファージが得られると、実施例５（Ａ）の記載と同様にひとコード配列をプ ローブとして用いることにより、ＢＭＰ−３を合成するひとセルラインまたは組 織を同定する。ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロース・クロマトグラフィーによ り選択し、ｃＤＮＡを確立され几技術により（ツール等、前出）合成し、ラムダ ｇｔｌＯにおいてクローン化する。

別法として、このひと骨誘導因子をコードする全遺伝子は、必要ならば追加の組 換えクローンにおいて同定および生成され得る。このひと骨成長因子遺伝子のさ らに別の３゛または５°領域を含む追加の組換え体は、元のクローンの端部（複 数も可）における独特のＤＮＡ配列を同定し、これらをプローブに用いてひとゲ ノムライブラリーを再スクリーニングすることにより生産され得る。次いで、こ の遺伝子は、標準的分子生物学技術により単一プラスミドにおいて再会合され、 細菌において増幅され得る。次に、全ひとＢＭＰ−３因子遺伝子は適当な発現ベ クターに移入され得る。次いで、この遺伝子を含む発現ベクターによりは乳類細 胞、例えばさるＣＯ６細胞をトランスフェクションし、その細胞においてひと遺 伝子が転写され、ＲＮ　Ａは正確にスプライシングされる。トランスフェクショ ンされに細胞の培地を、遺伝子が完全であることの指標としてこの明細書に記載 されに骨誘導因子活性に関して検定する。これらの細胞からｌ１ｌＲＮＡを得、 このｍＲＮＡ供給源からｃＤＮＡを合成し、クローン化する。同様に上記方法を 用い、プローブ供給源とし云うし骨誘導因子および／またはひと骨誘導因子を利 用することにより、興味の対象である他の種類の骨誘導因子を分離することが可 能である。これらの他の種類の骨誘導因子は、特に骨折修復において似１；有用 性を有し得る。　。

実施例６ 骨誘導因子の発現 うし、ひとまたは他のは乳類の骨誘導因子を製造する几めに、常用的遺伝子工学 技術により、それをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに移入し、は乳類細 胞に導入する。

当業界の熟練者であれば、第２〜８表の配列または他の修飾配列並びに既知ベク ター、例えばｐＣＤ［岡山等、「モル、セル・パイオル、」、２：１６１−１７ ０（１９８２）］およびｐＪＬ３、Ｉ）Ｊ　Ｌ　４　Ｃボッ等、ｒＥＭＢＯ−ジ ャーナル」、４：６４５−６５３（１９８５）］を用いることによるは乳類発現 ベクターの構築は可能である。これらのベクターを用いた適当な宿主細胞の形質 転換により、骨誘導因子が発現され得る。当業界の熟練者であれば、コード配列 の側面に位置するは乳類調節配列を削除またはこれを細菌性配列と置き換えるこ とにより第２〜８表の配列を操作し、細菌細胞による細胞内または細胞外発現用 細菌性ベクターを構築することが可能である。例えば、コード配列はさらに操作 （例、他の既知リンカ−と結合または他の公知技術によるそこからの非コード配 列の欠失もしくは存在するヌクレオチドの改編による修飾）され得る。次いで、 修飾前誘導因子コード配列は、例えば呑口等、「プロシーディングズ・オブ・ザ ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ ステーブ・オブ・アメリカ」、７７：５２３０−５２３３（１９８０）に記載さ れ１；方法を用いて既知細菌性ベクターに挿入され得る。次いで、この実例的細 菌性ベクターにより細菌宿主細胞を形質転換し、骨誘導因子を発現させ得る。細 菌細胞における骨誘導因子の細胞外発現の実施戦略については、例えばヨーロッ パ特許出願ＥＰＡ１７７３４３を参照。

昆虫細胞で発現させる昆虫性ベクターの構築についても同様の操作が実施され得 る［例えば、公開されたヨーロッパ特許出願１５５４７６記載の方法を参照］。

酵母ベクターもまｒニ、酵母細胞によるこの発明の因子の細胞内または細胞外発 現を目的とする酵母調節配列を用いて構築され得る。［例えば、公開ＰＣＴ出願 ＷＯ３６１００６３９およびヨーロッパ特許出願ＥＰＡ　１２３２８９参照］。

は乳類細胞から高レベルの本発明前誘導因子を製造する方法は、異種前誘導因子 遺伝子の多数のコピーを含む細胞の構築を含む。異種遺伝子は、増幅可能なマー カー、例えばジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＰＲ）遺伝子（この場合、カウフマン およびシャープ、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジーｊ、１５９ ：６０１−６２９（１９８２）の方法に従い、多量の遺伝子コピーを含む細胞が 、メトトレキセート（ＭＴＸ）の高濃縮液における伸長に関して選択され得る） に結合され得る。この方法は幾つかの異なる細胞タイプにより使用され得る。

例えば、この発明の骨誘導因子に関するＤ　Ｎ　、Ａ配列を含むプラスミドは、 その発現を可能にする他のプラスミド配列およびＤＨＰＲ発現プラスミドｐＡｄ Ａ２６ＳＶ（Ａ）３ｒカウフマンおよびシャープ、「モレキュラー・アンド・セ ルラー・バイオロジーコ、２：１３０４（１９８２）］と効果的に組合わされて 、燐酸カルシウム共沈澱およびトランスフェクションによりＤＨＦＲ−欠失ＣＨ Ｏ細胞、ＤＵＫＸ−Ｂ１１中に共に導入され得る。ＤＨＰＲ発現形質転換体を、 透析うし胎児血清を含むアルファ培地での成長に関して選択し、続いてＭＴＸ高 濃縮液（０，０２，０，２、ｌ　Ｏおよび５マイクロモルのＭＴＸにおける連続 段階）での成長による増幅に関して選択する［カウフマン等、「モレキュラー・ アンド・セラー・バイオロジーｊ、５：１７５０（１９８３）の記載による；。

形質転換体をクローン化し、ラット骨形成検定により生物学的活性前誘導因子発 現をモニターする。

骨誘導因子発現はＭＴＸ耐性のレベルが高くなると、増加すべきである。同様の 方法は、他の骨誘導因子の製造にも使用され得る。

別法として、ひと遺伝子は前記に従い直接的に発現される。活性前誘導因子は細 菌または酵母細胞において製造され得る。しかしながら、生物学的活性組換えひ と骨誘導因子に対して現在好ましい発現系は、安定して形質転換されたＣＨＯ細 胞である。

一実施態様として、実施例５のひと骨誘導因子（ｈＢＭＰ−１）を製造するため には、５ａｌＩ消化によりＵ２Ｏ５−１の挿入体をベクターａｒｍｓから放出さ せ、Ｘｈｏｌにより消化されたは乳類発現ベクターｐＭＴ２ＣＸにサブクローン 化する。ＤＥＡＥ−デキストラン方７５−７５７８（１９８１）、ルトマンおよ びマグヌッソン、「ニュクレイック・アシッズ・リサーチ」、１１：１２９５− １３０８（１９８３）］、このサブクローンからのプラスミドＤＮＡによりＣＯ ５細胞をトランスフェクションする。血清不含有２４時間条件培地を細胞から集 める（トランスフェクションの４０−７０時間後開始）。

は乳類発現ベクターｐＭＴ２　Ｃ１ａ−Ｘｈｏ（ｐＭＴ２ＣＸ）は、ｐ９１０２ ３　（ｂＸウォング等、「サイエンス」、主２８：８１０−８１４、ではなくア ンピシリン耐性遺伝子を含み、さらにｃＤＮＡクローンの挿入に関するＸｈｏＩ 部位を含む点で相異する。ｐＭＴ２　Ｃ１ａ−ＸｈＯの機能的要素については既 に記載されており（カウフマン、１９８５年、プロシーディングズ・オブ・ザ・ ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンンーズ・才ブ・ザ・ユナイテッド・ス テーブ・オブ・アメリカ１．８２：６８９−６９３）、アデノウィルスＶＡ遺伝 子、７２ｂｐエンハンサ−を含むＳＶ４０複製開始点、５゛スプライス位を含む アデノウィルス主後期プロモーターおよびアデノウィルス三部分リーダー配列の 大部分（アデノウィルス後期ｍＲＮＡに存在）、３°スプライス受容部位、ＤＨ ＰＲ挿入体、ＳＶ４０早期ポリアゾニレ−ジョン部位（ＳＶ４０）並びにエシェ リヒア・コリにおける伸長に必要とされるｐＢＲ３２２配列が含まれる。

プラスミドｐＭＴ２　Ｃ１ａ−Ｘｈｏは、ｐＭＴ２−ＶＷＦのＥｃｏＲＩ消化に より得られる［アメリカ合衆国、メリーランド、ロックビルのアメリカン・タイ プ・カルチャー・コレクション（Ａ　Ｔ　ＣＣ）に寄託された（受託番号ＡＴＣ Ｃ６７１２２）コ。ＥｃｏＲＩ消化によりＩ）ＭＴ２−ＶＷＦに存在するｃ　Ｄ 　Ｎ　Ａ挿入体が切除され、線状形態のｐＭＴ２が生成する。これを結合して用 いることにより、エシェリヒア・コリ）（ＢＩＯＩまたはＤＨ−５をアンピシリ ン耐性に形質転換することができる。プラスミドｐＭＴ２ＤＮＡは常法により製 造され得る。次に、ｐＭＴ２をＥｃｏＲＶおよびＸｂａｌで消化し、消化され？ ＝　Ｄ　Ｎ　ｐ、をＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ・フラグメントで処理し、 Ｃ１ａリンカ−（ネバイオラブズ、ＣＡＴＣＧＡＴＧ）を結合することによりｐ ＭＴ２ＣＸが構築される。これは、ＳＶ４０複製開始点付近のＨｉｎｄｌＩ［部 位から出発する塩基２２６６〜２４２１およびｐＭＴ２のエンハンサ−配列を除 く。次に、プラスミドＤＮＡをＥｃ。

Ｒ１で消化し、前記と同様にプラント化し、ＥｃｏＲＩアダプターに結合し、 ５°　ＰＯ，−ＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴ　３゜３’　ＧＧＡＧＣＴＣＴ ＣＧＡ　５’ Ｘｈｏｌで消化し、結合することによりｐＭＴ２　Ｃ１ａ−Ｘｈｏが得られ、次 いでこれを用いてエシェリヒア・コリをアンピシリン耐性に形質転換することが できる。プラスミドｐＭＴ２　Ｃ１ａ−Ｘｈｏ　ＤＮＡは常法により製造され得 る。

実施例７ 発現した骨誘導因子の生物学的活性 Ａ、ＢＭＰ−１ 上記実施例６で得られた発現し凡骨誘導因子（ｈＢＭＰ−１）の生物学的活性を 測定する。因子をヘパリン・セファロースカラムにおいて部分的に精製するｅ　 １枚の１００１Ｒｘ皿から得たトランスフェクション上清４ｎＱを、ＹＭＩＯ膜 を用いに限外ろ過により約１０倍に濃縮し、次いで２０ミリモルのトリス、０． １５モルＮａ０ｆｆ（ｐＨ７−４）（出発緩衝液）に対して透析する。次に、こ の材料を出発緩衝液中１，１πＱヘパリン・セファロースカラムに適用する。出 発緩衝液の８ｖＱ洗浄液により未結合蛋白質を除去し、２０ミリモルのトリス、 ２．０モルＮａＣＱ（ｐＨ７，４）の３−４　ｘ（ｌ洗浄液によりＢＭＰ−１を 含む結合蛋白質を脱着させる。

ヘパリンカラムにより結合しに蛋白質をセントリコン１０において約１０倍に濃 縮し、０．１％トリフルオロ酢酸を用いてシアフィルトレージョンすることによ り塩を還元する。この溶液の適量を２０ｍｇのラットマトリックスと混合し、次 いで前記実施例３の記載に従いインビボ骨および軟骨形成に関して検定する。Ｍ ＯＣＫ（モック）トランスフェクション上清分画を対照として使用する。

特定量のひとＢＭＰ−１が加えられたラットマトリックスを含むインブラントを ７日後にラットから除去し、組織評価を行う。各インブラントからの代表的部分 を、新規骨無機質の存在に対してボン・コッサおよび酸性ツーシンにより染色し 、軟骨特異的マトリックス形成の存在に対してトルイジンブルーにより染色する 。その部分内に存在する細胞のタイプおよびこれらの細胞が表現型を示す程度、 を評価する。

ひとＢＭＰ−１をマトリックス材料に加えると、内植の７日後に軟骨様小節が形 成された。軟骨芽（細胞）型細胞は、形状および異染性マトリックスの発現によ り認識され得る。ひとＢＭＰ−１において観察される活性の量は、マトリックス に加えられたひとＢＭＰ−１蛋白質の量により異なっ几。第９表は、観察された 骨誘導量に対するひとＢＭＰ−１蛋白質の用量応答関係を示す。

第９表 インブラント番号　処ｊ［ｉ（トランスフエフ　組織学的スコアジョン培地ｌπ ｇの当量） ８７６−１３４−１　１０ＢＭＰ−Ｉ　Ｃ＋２８７６−１３４−２　３ＢＭＰ− １ｃ＋１８７６−１３４−３　１ＢＭＰ−Ｉ　Ｃ＋／−８７６−１３４−４１０ Ｍ０ＣＫ　Ｃ−８７６−１３４−５３Ｍ０ＣＫ　Ｃ− ８７６−１３４−６１Ｍ０ＣＫ　Ｃ− 軟骨（ｃ）活性を０（−）〜５の尺度に基づいて評価した。

類似レベルの活性は、ヘパリンセファロース分画ＣｏＳ細胞抽出物においても観 察される。６モル尿素が全緩衝液に含まれること以外は前記方法と同様の方法で 部分精製を実施する。さらに、上記ラット骨形成検定において、ＢＭＰ−２も同 様に軟骨形成活性を示した。

上記方法を用い、プローブ供給源としてうし骨誘導因子および／またはひと骨誘 導因子を利用することにより興味深い他の骨誘導因子を分離することができる。

それらの他の骨誘導因子は、特に骨折修復において似ｆこ有用性を呈し得る。

以上、この発明の好ましい実施態様について詳細に記載した。その実施に際し、 これらの記載事項を考慮して多くの修正および変更が行なわれることは当業界の 熟練者であれば容易に想到し得るはずである。それらの修正および変更も後記請 求の範囲内に包含されるものと考えられる。

微生物 寄託機関の名称 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクンヨン寄託機関の住所 １２３０１　パークローン・ドライブ ロックビル、メリーランド２０８５２、アメリカ合衆国ＬＰ−Ｈ１４０３１１２ ９／２０　１９８７年３月４日ｂＰ５０　４０２９５　２０／３　１９８Ｂ年１ ２月１５日ｂＰ−２１４０３１０２２／１８　１９８７年３月４日Ｕ２Ｏ５−３ ４０３４２４４／２２　１９８７年６月１６日ラムダう：２−０３−１４０３４ ３　３２／３３　１９８７年６月１６日ラムダうＰ８１９　４０３４４　２５／ ２３　１９８７年６月１６日Ｌｉ２０Ｓ−３９４０３４５３９／２１　１９８７ 年６月１６日補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の７第１項） 昭和６３年１２月２９日

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）医薬的に許容し得る賦形剤中に、（ａ）ＢＭＰ−１、 （ｂ）ＢＭＰ−２・クラスＩ、 （ｃ）ＢＭＰ−２・クラスＩＩ、 （ｄ）ＢＭＰ−３、および それらの混合物から成る群から選ばれる蛋白質を含有して成る医薬組成物。
2. （２）蛋白質がＢＭＰ−１である、請求項１記載の組成物。
3. （３）蛋白質がＢＭＰ−２・クラスＩである請求項１記載の組成物。
4. （４）蛋白質がＢＭＰ−２・クラスＩＩである請求項１記載の組成物。
5. （５）蛋白質がＢＭＰ−３である、請求項１記載の組成物。
6. （６）さらに、骨欠損部位に組成物を送達し、骨形成誘導構造を提供し得るマト リックスを含む、請求項１記載の医薬組成物。
7. （７）マトリックスが、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン、ポリ乳酸および燐 酸三カルシウムから成る群から選択される材料を含む、請求項６記載の組成物。
8. （８）骨形成を必要とする患者における骨形成誘導方法であって、請求項１−７ のいずれか１項記載の組成物の有効量を患者に投与することを含む方法。
9. （９）ＢＭＰ−１をコードするＤＮＡ配列により形質転換されたセルラインを適 当な培養培地で培養し（ただし、前記ＤＮＡ配列は適切な発現制御配列と組合わ されている）、培養培地からＢＭＰ−１を分離することを含むＢＭＰ−１の製造 方法。
10. （１０）ＤＮＡ配列が実質的に第６表のヌクレオチド配列を含んでいる、請求項 ９記載の方法。
11. （１１）ＢＭＰ−２クラスＩをコードするＤＮＡ配列により形質転換されたセル ラインを適当な培養培地で培養し（ただし、前記ＤＮＡ配列は適切な発現制御配 列と組合わされている）、培養培地からＢＭＰ−２・クラスＩを分離することを 含むＢＭＰ−２・クラスＩの製造方法。
12. （１２）ＤＮＡ配列が実質的に第７表のヌクレオチド配列を含んでいる、請求項 １１記載の方法。
13. （１３）ＢＭＰ−２・クラスＩＩをコードするＤＮＡ配列により形質転換された セルラインを適当な培養培地で培養し（ただし、前記ＤＮＡ配列は適切な発現制 御配列と組合わされている）、培養培地からＢＭＰ−２・クラスＩＩを分離する ことを含むＢＭＰ−２・クラスＩＩの製造方法。
14. （１４）ＤＮＡ配列が実質的に第８表のヌクレオチド配列を含んでいる、請求項 １３記載の方法。
15. （１５）ＢＭＰ−３をコードするＤＮＡ配列により形質転換されたセルラインを 適当な培養培地で培養し（ただし、前記ＤＮＡ配列は適切な発現制御配列と組合 わされている）、培養培地からＢＭＰ−３を分離することを含むＢＭＰ−３の製 造方法。
16. （１６）ＤＮＡ配列が実質的に第４Ａおよび４Ｂ表のヌクレオチド配列を含んで いる、請求項１５記載の方法。
17. （１７）実質的に第６表記載のヌクレオチド配列または厳密な条件下でそれとハ イブリダイズし、発現時にＢＭＰ−１の実質的特性を呈する蛋白質をコードする 配列を含むＢＭＰ−１をコードするｃＤＮＡ配列。
18. （１８）実質的に第７表記載のヌクレオチド配列または厳密な条件下でそれとハ イブリダイズし、発現時にＢＭＰ−２・クラスＩの実質的特性を呈する蛋白質を コードする配列を含むＢＭＰ−２・クラスＩをコードするｃＤＮＡ配列。
19. （１９）実質的に第８表記載のヌクレオチド配列または厳密な条件下でそれとハ イブリダイズし、発現時にＢＭＰ−２・クラスＩＩの実質的特性を呈する蛋白質 をコードする配列を含むＢＭＰ−２・クラスＩＩをコードするｃＤＮＡ配列。
20. （２０）実質的に第４Ａ表および第４Ｂ表記載のヌクレオチド配列または厳密な 条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−３の実質的特性を呈する蛋 白質をコードする配列を含むＢＭＰ−３をコードするｃＤＮＡ配列。