KR100214740B1 - 골유도조성물 - Google Patents

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KR100214740B1
KR100214740B1 KR1019900702523A KR900702523A KR100214740B1 KR 100214740 B1 KR100214740 B1 KR 100214740B1 KR 1019900702523 A KR1019900702523 A KR 1019900702523A KR 900702523 A KR900702523 A KR 900702523A KR 100214740 B1 KR100214740 B1 KR 100214740B1
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존 엠 우즈니
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브루스 엠. 에이센, 토마스 제이 데스로저
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Abstract

정제된 BMP-5, BMP-6, 및 BMP-7 단백질들 및 그들의 제조 방법이 개시되었다. 본 단백질들은 골 및 /또는 연골 손상의 치료에 그리고 상처치료 및 관련된 조직회복에 사용될 수 있다.

Description

[발명의 명칭]
골 유도 조성물
본 발명은 골(骨) 및/또는 연골의 형성에 유용한 단백질에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 BMP-5, BMP-6 및 BMP-7 단백질 족들 ( 여기에서 BMP 는 골 형성 단백질임 )로 명명된 정체 단백질의 일군의 족들에 관한 것이다. 상기 단백질들은 연골 및/ 또는 골 형성 유도 능을 나타낼 수도 있다. 그들은 골 및/ 또는 연골 형성을 유도하기 위해, 그리고 상처치료 및 조직회복에 사용될 수 있다.
본 발명은 BMP-5 단백질 족을 제공한다. 정제된 인간 BMP-5 단백질들은 그와 함께 공동 - 생성된 다른 단백질들을 실질적으로 포함하지 않고, 표 III 에 나타낸 아미노산 # 323 내지 아미노산 # 454로 구성된 아미노산 서열을 특징으로 한다. 상기 아미노산 서열 # 323 내지 # 454 는 표 III 에 나타낸 뉴클레오타이드 # 1665 내지 뉴 클레오타이드 # 2060으로 구성된 DNA 서열에 의해 코딩된다.
BMP-5는 더 나아가 소디움 도데실 술페이트 플리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 에 의해 측정된 것과 같이 28,000 ∼30,000 달톤의 뚜렷한 분자량을 또 다른 특징으로 한다. SDS -PAGE에서 환원조건 하에서는, 단백질은 약 14,000 ∼ 20,000 달톤의 분자량으로 전기영동 된다. 상기 단백질들이 연골 및/ 또는 골 형성을 자극하고, 촉진하거나 그렇지 않으면 유도할 수 있음이 관찰되었다. 본 발명은 더 나아가 표 I 에 나타낸 아미노산 #9 내지 아미노산 #140으로 구성된 소의 BMP-5 단백질들을 제공한다. 아미노산 서열 #9 내지 #140 은 표 I 의 뉴클레오타이드 #32 내지 #427 로 구성된 DNA 서열에 의해 코딩된다. 상기 단백질들은 또한 소 디움 도 데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS - PAGE) 에 의해 측정된 것과 같이 28.000∼30,000 달톤의 뚜렷한 분자량을 또 다른 특징으로 한다. SDS-PAGE에서 환원조건 하에서는, 단백질은 약 14,000∼20,000 달 톤의 분자량으로 전기 영동 된다. 상기 단백질들이 연골 및 / 또는 골 형성을 유도할 수 있음이 관찰되었다. 본 발명의 인간 BMP-5 단백질들은 표 III 에 나타낸 뉴클레오타이드 # 699 내지 뉴클레오타이드 #2060 으로 구성된 뉴 클 레오 타이드 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열로 형질 전환된 세포를 배양함으로써 생성될 수 있다. 표 Ⅲ 에 나타낸 아미노산 #323 내지 아미노산 # 454 과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성된 BMP-5 단백질들은 배양 배지로부터 회수되고, 단리 되고 정제된다.
소의 BMP-5 단백질들은 표 I 에 나타낸 뉴클레오타이드 #8 내지 뉴 클 레오 타이드 #427 과 동일하거나 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열로 형질 전환된 세포를 배양하고 배양배지로부터 표 I 에 나타낸 것과 같이 아미노산 #9 내지 아미노산 #140으로 구성된 아미노산 서열 또는 그의 일부를 포함하는 단백질을 회수하고 정제함으로써 생성될 수 있다. 본 발명은 BMP-6 단백질 족을 제공한다. 정제된 인간 BMP-6 단백질들은 그와 함께 공동 -생성된 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않고, 표 IV 에 나타낸 아미노산 #382 내지 아미노산 # 513으로 구성된 아미노산 서열을 특징으로 한다. 아미노산 서열 아미노산 #382 내지 #513은 표Ⅳ의 뉴클레오타이드 #1303 내지 뉴클레오타이드 #1698 의 DNA 서열0에 의해 코딩된다. 상기 단백질들은 또한 소디움 도 데실 술페이트 폴리아미드 겔 전기영동 ( SDS-PAGE )에 의해 측정된 것과 같이 28,000 ∼ 30,000 달톤의 뚜렷한 분자량을 또 다른 특징으로 한다. SDS - PAGE에서 환원조건 하에서는, 단백질은 약 14,000 ∼20,000 달톤의 분자량으로 전기 영동된다.
상기 단백질들이 연골 및 / 또는 골 형성을 유도할 수 있음이 관찰되었다. 본 발명의 인간 BMP-6 단백질들은 표 III 에 나타 낸 것과 같은 뉴 클레오타이드 #160 내지 뉴클레오타이드 #160 내지 뉴클레오타이드 #1698로 구성 된 DNA 서열 또는 실질적으로 유사한 서열로 형질전환 된 세포를 배양함으로써 생성된다. 아미노산 #382 내지 아미노산 #513 또는 실질적으로 유사한 서열로 구성된 BMP-6 단백질들은 배양배지로부터 희수 되고, 단리되고 정제된다. 소의 BMP-6 단백질들은 표 Ⅱ에 나타낸 뉴클레오타이드 #361 내지 뉴클레오타이드 #666 또는 실질적으로 유사한 서열로 구성 된 DNA로 형질전환 된 세포를 배양하고 배양 배지로부터 표Ⅱ에 나타낸 것과 같이 아미노산 #121 내지 아미노산 #222로 구성된 단백질을 회수하고 정제함으로써 생성될 수 있다. 존 발명은 BMP-7 단백질 족을 제공한다.
이는 그와 함께 공동-생성된 다른 단백질들을 실질적으로 포함하지 않는 정제된 인간 BMP-7 단백질들을 포함한다. 인간 BMP-7 단백질들은 표 V 나타낸 아미노산 #300 내지 아미노산 #431로 구성된 아미노산 서열을 특징으로 한다. 상기 아미노산 서열 #300 내지 #431 은 표의 뉴클레오타이드 #994 내지 #1389 의 DNA 서열에 의해 코딩된다. BMP-7 단백질들은 또한 소디움 도 데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 측정 된 것과 같이 28,000 ∼ 30,000 달톤의 뚜렷한 분자량을 또 다른 특징으로 한다. SDS -PAGE에서 환원 조건하에서는, 단백질은 약 14,000 ∼ 20,000 달톤의 분자량으로 전기 영동 된다. 상기 단백질들이 연골 및 / 또는 골 형성을 자극하고, 촉진하거나, 그렇지 않으면 유도 할 수 있음이 관찰되었다. 본 발명의 인간 BMP-7 단백질들은 표 V 에 나타낸 뉴클레오타이드 #97 내지 뉴클레오타이드 #1389로 구성 된 뉴클레오타이드 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 서열로 형질전환 된 세포를 배양함으로써 생성 될 수 있다. 표 V 에 나타낸 아미노산 #300 내지 아미노산 # 431 과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 BMP-7 단백질들은 배양 배지로부터 회수되고, 단리 되고, 정제된다.
본 발명은 또한 상기에서 기술된 단백질들이 관련 인간 단백질(들)을 수득하기 위해 사용되는 방법을 제공한다. 그러한 방법들은 유전공학의 기술에 숙달된 자들에게 공지되어 있다. 그러한 단백질들을 수득하기 위한 한 가지 방법은 인간 게놈 및 / 또는 cDNA서열을 단리하기 위해서 인간 게놈 및 / 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 탐침을 설계하기 위해 인간 BMP-5, BMP-6 및 BMP-7 코딩서열 또는 그의 일부를 사용함을 포함한다. 당 기술내의 부가적인 방법은 다른 포유 동물의 BMP 연골 및/ 또는 골 형성 단백질을 수득하기 위해 본 발명의 소 및 인간 BMP 단백질들을 사용할 수 도 있다. 뉴클레오타이드 서열이 확인되면, 상기 뉴클레오타이드 서열로 형질 전환 된 세포를 배양함으로써 단백질들이 생성된다. 상기 서열 또는 그의 부분들은 엄중한 조건하에서 BMP-5, BMP-6 또는 BMP-7 단백질들 중 하나의 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화 되고 연골 및 / 또는 골형성 활성을 나타내는 단백질을 코팅한다. 발현된 단백질은 배양 배지로부터 회수 및 정제된다. 정재된 BMP 단백질들은 다른 오염물질들 뿐만 아니라 그와 함께 공동-생성된 다른 단백질성 물질을 실질적으로 포함하지 않는다. BMP-5, BMP-6 및 BMP-7 단백질들은 연골의 형성 및 / 또는 골 형성을 촉진하고, 자극하거나 그렇지 않으면 유도할 수 있는 능력을 특징으로 한다.
더 나아가 연골 및 / 또는 골 형성을 유도하는 상기 단백질들의 능력은 하기에 기술된 쥐 골 형성 측정에서 연골 및 / 또는 골 형성 활성 나타내는 능력에 의해 드러낼 수 있다. 더 나아가 본 발명의 단백질들이 이 쥐 골 형성 측정에서 10㎍-500㎍ / 형성된 골의 g 의 농도로 활성을 나타냄이 관찰되었다. 보다 상세하게는, 상기 단백질들이 하기에 기술한 쥐 골 형성 측정에서 원형 또는 변형된 득점기록범을 사용하여 1㎍의 단백질이 적어도 + 2를 기록하는 능력을 특징으로 함이 관찰되었다.
본 발명의 다른 국면은 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체 내에 약학적 유효량의 BMP-5 ,BMP-6 또는 BMP-7 단백질은 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 조성물들은 적어도 일종의 BMP-5 , BMP-6 또는 BMP-7 단백질을 함유한다. BMP-5,BMP-6 및 BMP-7 단백질은 협조하여 또는 아마도 서로 공동 작용하여 작용할 수 있으므로 조성물은 일종이상의 본 발명의 조성물은 일종이상의 본 발명의 BMP 단백질들을 함유할 수 있을 것으로 기대된다. 본 발명의 조성물은 골 및/ 또는 연골 형성을 유도하기 위해 사용된다. 이 조성물들은 또한 상처치료 및 조직회복을 위해서도 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 조성물들은 본 발명의 BMP-5 , BMP-6 또는 BMP-7 단백질 외에도 공동-소유된 국제 공개 제 WO88/00205호 ( 1988SYS 1월 14일 공개 ) 및 국제 공개 제 WO 89 / 10409 호 ( 1989년 11월 2일 공개 )에 개시된 BMP-1, BMP-2 (과거에는 BMP-2A, BMP-2 클래스 I으로 역시 명명됨 ), BMP-3 및 BMP-4 (과거에는 프BMP-2B 및 BMP-2 클레스 Ⅱ로 역시 명명됨) 명명된 단백질들과 같은 다른 치료적으로 유용한 약품의 적어도 일종을 호함할 수도 있다. 다른 치료적으로 유용한 약품으로는 표피 성장인자 (epidermal growth factor, EGF ), 섬유 아세포 성장인자 (fibroblast growth factor, FGF), 변환 성장 인자 ( transforming growth factoars, TGF -α TGF - β ) 및 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF) 와 같은 성장인자들이 포함된다.
본 발명의 조성물은 또한 예를 들면, 조성물의 전달 및 / 또는 지지를 위해서 및 / 또는 골 및 / 연골형성을 위한 표면을 제공하기 위해 적절한 매트릭스 ( matrix )를 포함할 수 있다.
매트릭스는 BMP 단백질의 느린 방출 및 / 또는 본 발명의 BMP 단백질의 제공을 위한 적적한 환경을 제공한다.
본 발명의 조성물은 조성물 다수의 골 및 / 또는 연골 결손 및 치금막 질환을 치료하기 위한 방법들에 사용될 수 있다. 그들은 또한 각종형태의 상처의 치료법 및 조직 회복에 사용될 수 있다. 상기 방법들은, 본 발명에 따라, 본 발명의 조성물을 그러한 골 및 / 또는 연골형성, 상처 치료 또는 조직 회복을 필요로 하는 환자에게 투여함을 수반한다. 따라서 그 방법은 단백질의 치료적 유효량의 투여를 포함한다. 상기 방법들은 또한 본 발명의 단백질을 상기에서 기술된 공동 - 소유된 출원들에 개시된 적어도 일종의 BMP 단백질들과 함께 결합하여 투 여함을 수반한다. 덧붙여서, 상기 방법들은 또한 본 발명의 단백질을 EGF, FGF, TGF -α , TGF - β PDGF를 포함한 다른 성장인자와 함께 투여함을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 국면은 본 발명의 단백질의 발현을 코딩하는 DNA 서열들 이다. 그러한 서열들은 표 I -Ⅴ 에 나타낸 5'내지 3' 방향인 뉴클레오타이드 서열들은 표 I -V 에 나타낸 5' 내지 3' 방향인뉴 글 레오타이드 서열 또는 엄중한 조건하에서 표 I -V 의 DNA 서열과 하이브리드화되고 연골 및 / 또는 골 형성 유도능을 보이는 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함한다.
그러한 연골 및 / 또는 골 형성은 하기에 기술된 쥐 골 형성측정에서 나타낼 수 있다. 상기 단백질이 본 측정에서 10㎍∼500 ㎍ / 형성된 골의 g 이 농도에서 활성을 나타낼 수 있음이 관찰되었다. 보다 상세하게는, 상기 단백질들이 쥐 골 형성 측정에 1 ㎍ 의 단백질이 적어도 +2를 기록하는 능력을 나타냄이 관찰되었다. 최종적으로 표 I -v 의 서열의 대립유전자 또는 다른 변형체들은 그러한 뉴클레오 타이드 변화가 펩타이드 서열의 변화를 야기하든 않든 간에 본 발명에 역시 포함된다. 본 발명의 또 다른 국면은 발현 지배 서열과 함께 작동가능 하도록 결합된 상기에서 기술 된 DNA 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터들은 발현 지배 서열과 함께 작동 가능하도록 결합된, 본 발명의 단백질의 발현을 지시하는 DNA 서열로 형질전환 된 세포 계를 적절한 배양 배지 내에서 배양하고 그로부터 본 발명의 단백질을 회수하고 정제하는 본 발명의 단백질을 생성하기 위한 신규방법에 사용 될 수 있다. 상기 특허 청구 된 방법은 다수의 공지 된 세포들, 원 핵 및 진핵세포 양자를 폴리 펩티드의 발현을 위한 숙주 세포로서 사용 할 수 있다. 회수 된 BMP 단백질들은 그들은 다른 오염 물질들로부터 뿐만 아니라 그들과 함께 공동-생성 된 다른 단백질 성 물질로부터 단리 함으로써 정제된다. 본 발명의 다른 국면들 및 장점들은 하기의 상세 한 설명 및 거들의 바람직한 구현 예를 고려함으로써 분명해질 것이다.
[발명의 상세한 설명]
정제된 인간 BMP-5 단백질들은 표 III의 DNA 서열로 형질전환 된 숙주 세포를 배양함으로써 생성 될 수 있다. 발현된 BMP-5 단백질들은 배양 배지로부터 단리 및 정제된다. 정제 된 인간 BMP-5 단백질들은 표 III에 에 나타낸 것과 같이 아미노산 #323 내지 #454 로 구성 된 아미노산 서열을 특징으로 합이 예상된다. 본 발명의 정제 된 BMP-5 인간 연골/ 골 단백질들은 따라서, 이종 조절 지배서열에 작동가능 하도록 결합 된, 표 III 에 나타낸 것과 같은 뉴 클레오 타이드 #699 내지 뉴 클 레오 타이드 #2060으로 구성 된 인간 BMP-5 단백질들은 표 III 에 나타낸 것과 같이 아미노산 #323 내지 #454로 구성된 아미노산 설열을 특징으로 함이 예상된다. 본 발명의 정제된 BNP-5 인간 연골 / 골 단백질들은 따라서, 이종 조절 지배 설열에 작동가능 하도록 결합된, 표Ⅲ 에 나타낸 것과 같은 뉴 클레오 타이드 #699 내지 뉴 클 레오타이드 #2060으로 구성된 DNA 서열 또는 실질적으로 상동인 서열로 형질 전환된 수주 세포를 배양하고, 표 III 에 나타낸 것과 같이 아미노산 #454 인 아미노산 서열 또는 실질적으로 상동인 서열로 구성된 단백질을 배양배지로부터 회수 및 정제함으로써 생성된다.
또 다른 구현 예들에서, DNA 서열은 아미노산 #323∼ #454를 코딩하는 뉴 클레오 타이드로 구성된다. 따라서 BMP-5 단백질들은 이종 조절 지배서열에 작동가능 하도록 결합된, 표 III에 나타낸 것과 같이 뉴클레오 타이드 #1665 내지 뉴클레오타이드 #2060으로 구성된 DNA 서열 또는 실질적으로 상동인 서열로 형질 전환된 숙주 세포를 배양하고, 표 Ⅲ에 나타낸 것과 같이 아미노산 #323 내지 아미노산 #454 또는 실질적으로 상동인 서열로 구성된 단백질을 배양 배지로부터 회수 및 정제함으로써 생성된다. 정제된 인간 BMP-5 단백질들은, 다른 오염물질들 뿐만 아니라, 그들과 함께 공동-생성된 다른 단백질성 물질들을 실질적으로 포함하지 않는다. 본 발명의 정제된 BMP-5 TH 연골 / 골 단백질들은 표 I 에 나타낸 것과 같이 뉴 클레오 타이드 #8 내지 뉴클레오타이드 #578 인 DNA 서열 또는 실질적으로 상동인 서열로 구성된 DNA 서열로 형질 전환된 숙주세포를 배양하고, 표 I 에 나타낸 것과 같이 아미노산 #9 내지 아미노산 #140 인 아미노산 서열 또는 실질적으로 상동인 서열로 구성 된 단백질을 배양 배지로부터 회수 및 정제함으로 써 생성된다. 본 발명의 모든 BMP 단백질들뿐만 아니라 정제된 BMP-5 소 단백질은, 다른 오염 물질들뿐만 아니라, 그들과 함께 공동 생성 된 다른 단백질 성 물질들을 실질적으로 포함하지 않는다.
정제 된 인간 BMP-6 단백질들은 표 Ⅳ의 DNA 서열로 형질 전환 된 숙주 세포를 배양함으로 써 생성 될 수 있다. 발현 된 단백질들은 배양 배지로부터 단리 정제된다. 본 발명의 정제 된 인간 BMP-6 단백질들은 표 Ⅳ에 나타낸 것과 같이 아미노산 #382 내지 #513으로 구성 된 아미노산 서열을 특징으로 합이 예상된다. 본 발명의 상기 정제 된 BMP-6 인간 연골 /골 단백질들은 따라서 이종 조절 지배 서열에 작동 가능하도록 결합된, 표Ⅳ에 나타낸 것과 같은 뉴클레오 타이드 # 160 내지 뉴클레오타이드 #1698로 구성 된 DNA 서열 또는 실질적으로 상동인 서열로 형질 전환 된 숙주 세포를 배양하고, 표 Ⅳ에 나타낸 것과 같은 아미노산 #382 내지 아미노산 #513 또는 실질 적으로 상동인 서열로 구성 된 단백질을 배양 배지로부터 회수, 단리 및 정제함으로써 생성된다. 또 다른 구현 예들에서, 아미노산 #382∼#513을 코딩하는 뉴클레오 타이드로 구성 된 DNA 서열을 사용 할 수 있다. 따라서, 정제 된 인간 BMP-6 단백질들은 이종 조절지배 서열에 작동 가능하도록 결합 된, 표 Ⅳ에서 나타낸 것과 같이 뉴클레오 타이드 #1303 내지 뉴클레오 타이드 #1698로 구성 된 DNA 서열 또는 실질적으로 상동인 서열로 형질 전환된 숙주 세포를 배양하고, 표 Ⅳ에서 나타낸 것과 같이 아미노산 #382 내지 #513 또는 실질적으로 상동인 성려로 구성된 단백질을 배양 배지로부터 회수 및 정제함으로 써 생성 될 수 있다. 정제 된 인간 BMP-6 단백질들은 다른 오염물질들 뿐만 아니라 그들과 함께 공동-생성 된 다른 단백질성 물질을 실질적으로 포함하지 않는다.
본 발명의 정제 된 BMP-6 소 연골/골 단백질은 표 II 에 나타낸 것과 같이 뉴클레오 타이드 #361 내지 뉴클레오 타이드 #666으로 구성 된 DNA 서열 또는 실질적으로 상동인 서열로 형질 전환 된 숙주 세포를 배양하고, 표2에 나타낸 것과 같이 아미노산 #121 내지 아미노산 #222 또는 실질적으로 상동인 서열로 구성 된 단백질을 배양배지로부터 회수함으로써 생성 될 수 있다. 또 다른 구현 예에서 소 단백질은 표 II 의 뉴 클 레오 타이드 #289 내지 #666으로 구성 된 서열로 형질 전환된 숙주 세포를 배양하고, 아미노산 #97 내지 아미노산 #222로 구성된 단백질을 회수 및 정제함으로써 생성된다. 정제된 BMP-6 소 단백질은 다른 오염물질들 뿐만 아니라, 그와 함께 공동-생성 된 다른 단백질성 물질을 실질적으로 포함하지 않는다. 정제된 인간 BMP-7 단백질들은 표 V 의 DNA 서열로 형질 전환 된 숙주 세포를 배양함으로써 생성 될 수 있다. 발현 된 단백질들은 배양 배지로부터 단리 및 정제된다. 정제 된 인간 BMP-7 단백질들은 표 V 에 나타낸 것과 같이 아미노산 #300∼#431로 구성 된 아미노산 서열을 특징으로 함이 예상된다. 따라서, 본 발명의 상기 정제 된 BMP-7 인간 연골 / 골 단백질들은 이종 조절 지배서열에 작동 가능하도록 연결 된, 표 V 에 나타낸 거소가 같이 뉴 클 레오 타이드 #97 내지 뉴클레오 타이드 #1389로 구성 된 DNA 서열 또는 실질적으로 상동인 서열로 형질전환 된 숙주 세포를 배양하고, 표 V 에 나타낸 것과 같이 아미노산 #300 내지 아미노산 #431 인 아미노산 서열 또는 실질적으로 상동인 서열로 구성 된 단백질을 배양 배지로부터 회수, 단리 및 정제함으로써 생성된다. 또 다른 구현 예들은, 아미노산 #300∼#431을 코딩하는 뉴클레오 타이드로 구성 된 DNA 서열을 사용 할 수 있다.
정제 된 BMP-7 단백질들은 이종 조절지배 서열에 작동 가능하도록 연결 된, 표 V 에 나타낸 것과 같이 뉴클레오 타이드 #994∼#1389 인 DNA 서열 또는 실질적으로 상동인 서열로 구성된 DNAFH 형질전환 된 숙주 세포를 배양하고, 표V에 나타난 것과 같이 아미노산 #300 내지 아미노산 #431 인 아미노산 서열 또는 실질적으로 상동인 서열로 구성된 단백질을 배양배지로부터 회수 및 정제함으로써 생성될 수 있다. 정제된 인간 BMP-7 단백질들은 다른 오염물질 뿐만 아니라, 그들과 함께 공동-생성된 다른 단백질성 다른 단백질성 물질들을 실질적으로 포함하지 않는다.
BMP-5, BMP-6 및 BMP-7단백질들은 연골 및/또는 골 형성 활성을 나타내는 능력을 또 다른 특징으로 한다. 상기 활성은 예를 들면, 실시에 Ⅲ에서 기술된 것과 같은 쥐 골 형성 측정에서 나타날 수 있다. 더 나아가 상기 단백질들이 측정에서 10㎍∼500㎍/ 형성된 골의 g의 농도에서 활성을 나타냄이 관찰되었다. 단백질들은 하기에 더 상세히 기술된 원형 또는 변형된 득점, 기록법을 사용한 본 측정에서 1㎍이 적어도 +2를 기록하는 능력을 또 다른 특징으로 한다. BMP-5, BMP-6 및 BMP-7 단백질들은 소디움 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 측정된 것과 같이 28,000∼30,000달톤의 뚜렷한 분자량을 또 다른 특징으로 한다. SDS-PAGE에서 환원조건하에서는, 단백질은 약14,000∼20,000달톤의 분자량으로 전기 영동된다.
여기에서 제공된 단백질들은 또한 표 I-V의 것들과 비슷하지만 그 안에 자연적으로 변형이 제공되거나(예를 들면, 뉴클레오 타이드 서열내의 대립 유전자 변화로 폴리 펩티드 내의 아미노산이 변할 수 있음)정교하게 처리된 서열에 의해 코팅된 요소들은 포함한다.
유사하게, 표 I-V의 아미노산 잔기들의 연속적인 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 복제하는 합성 폴리펩티드는 본 발명에 포함된다. 상기 서열들은, 본 발명의 다른 연골/골 단백질들과 함께 일차, 이차 또는 삼차 구조적 및 형태적 특성들을 공유함으로써 그들 사이에 공통적으로 골 및/또는 연골 성장인자 생물학적 특성을 가질 수 있다. 따라서, 그들은 치료 방법에 있어서, 자연산 단백질에 대한 생물학적으로 활성인 치환제로서 사용될 수 있다.
여기에 기술된 본 발명의 단백질의 서열의 다른 특정한 돌연변이는 글리코실화 위치의 변조를 포함한다. 상기 변조는 0-연결된 또는 N-연결된 글리코실화 위치를 포함할 수 있다. 예를 들면, 글 리코 실화의 결여 또는 단지 부분적인 글 리 코 실화는 표 I-V에 나타낸 것과 같이 본 발명의 단백질의 서열 내에 존재하는 아스파라긴-연결 된 글리코실화 인지 위치에서 아미노산 치환 또는 삭제의 결과이다. 아스파라긴-연결 된 글리코실화 인지 위치는 적절한 세포 글리코 실화 효소에 의해 특이적으로 인지되는 트리펩티드 서열로 구성된다. 상기 트립펩티드 서열은 아스파라긴 - X - 트레오닌 또는 아스파라긴 - X - 세린이며, 여기에서 X 는 항상 어느 아미노산이다. 그리코실화 인지 위치의 첫 번째 또는 세 번째 아미노산 위치중 하나 또는 양쪽에서 각종의 아미노산 치환 또는(삭제 및/ 또는 두 번째 위치에서 아미노산 삭제) 는 변경된 트리펩티드 서열의 발현은 그 위치에 글리코실화되지 않은 변종을 생성한다.
본 발명은 또한 다른 단백질성 물질을 코딩하는 DNA 서열과 결합되어 있지 않고 본 발명의 단백질에 대한 발현을 코딩하는 신규 DNA 서열을 포함한다. 상기 DNA 서열들은 표 I-V에서 5、 내지 3、 방향으로 서술된 것들을 포함한다. 또한 엄중한 하이브리드화조건 [T.Maniatis et al, Molecular Cloning(A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory(1982), pp387∼389참고] 하에서 표 I-V 의 DNA서열과 하이브리드화하고 쥐 골 형성 측정에서 연골 및/또는 골 형성활성을 나타내는 서열들을 포함한다. 그러한 엄중한 하이브리드화 조건 중의 한 예는 65℃에서 6∼4×SSC에서 하이브리드화 한 후, 65℃에서 한시간 동안 0.1×SCC 내에서 세척하는 것이다. 다른 한편으로는, 전형적인 엄중한 하이브리드화 조건은 42℃의 50% 포름 아미드, 4×SCC 내에서이다. 유사하게, 표 I-V의 서열에 의해 코팅된 단백질과 유사한 단백질들을 코팅하지만, 유전자 암호의 퇴화 또는 대립유전자 변화(아미노산 변화를 일으키거나 일으키지 않는 종 집단 내에서의 자연 발생적 염기 변화) 때문에 코든 서열이 상이한 DNA 서열은 또한 여기에 기술된 본 발명의 단백질을 코팅한다. 점 돌연변이(point mutation) 또는 유도된 변경(삽입, 삭제 및 치환 포함)에 의하여 그로부터 코팅되는 폴리펩티드의 활성, 반감기 또는 생성을 향상시키기 위해 만들어진 표I-V의 DNA서열에 있어서의 변형체 역시 본 발명에 포함된다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 관련된 인간 단백질들 또는 다른 포유동물 BMP-5, BMP-6 및 BMP-7 단백질들을 수득하기 위한 방법들을 제공한다. 그러한 단백질들을 수득하기 위한 한가지 방법은, 예를 들면, 인간 유전자 또는 그의 단편들을 위한 표준 방법을 상용하여 인간 게놈 라이브러리를 탐침으로 찾기 위해 여기에서 게시된 인간 BMP-5, BMP-6 및 BMP-7 코팅 서열을 사용하는 것을 필요로 한다. 이렇게 하여 확인된 서열들은 유사한 연골/ 골 단백질을 합성하는 인간세포계 또는 조직을 확인하기 위한 탐침으로서도 역시 사용될 수 있다. cDNA 라이브러리는 인간 또는 소 코팅 서열로부터 유도된 탐침으로 합성되고 스크리닝된다. 이렇게 확인된 인간서열을 숙주 세포 내로 형질전환 시키고, 숙주 세포를 배양하고 단백질을 배양배지로부터 회수, 단리 및 정제한다. 정제된 단백질은 실시 예Ⅲ의 쥐 골 형성 측정에서 연골 및/또는 골 형성 활성을 나타낼 것으로 예상된다.
본 발명의 또 다른 국면은 본 발명의 BMP-5, BMP-6 및 BMP-7 단백질들을 생성하기 위한 신규방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 공지된 조절 서열의 지배하에, 본 발명의 단백질의 발현을 코딩하는 상기에 기술된 DNA서열로 형질 전환된 적절한 세포 또는 세포계를 배양하는 것을 포함한다. 조절 서열들은 적절한 숙주세포 내에서 단백질의 발현을 지시하는 프로모터 단편, 터미네이터 단편 및 다른 적절한 서열들을 포함한다. 적절한 세포 계를 배양하기 위한 방법은 당 분야의 기술내에 있다. 형질 전환된 세포들을 배양하고, 그로부터 발현된 BMP 단백질들을 회수하고, 단리하고 당 분야에 숙달된 자에게 공지된 정제기술을 사용하여 배양배지로부터 정제한다. 정제된 BMP단백질들은, 다른 오염물질 뿐만 아니라, 그와 함께 공동-생성된 다른 단백질성 물질들을 실질적으로 포함하지 않는다.
본 발명의 정제된 BMP단백질들은 본 발명의 단백질들과 자연에서 함께 존재하는 물질을 포함하지 않는다.
적절한 세포 또는 세포 계를 중국 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 포유동물 세포일 수 있다. 적절한 포유동물 숙주 세포의 선택 및 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 생성물 생성을 위한 방법 및 정제는 당 분야에 공지되어 있다[예를 들면, Gething and Sambrook, Nature, 293: 620∼625(1981), 또는 다른 한편으로는, Kaufman et al, Mol. Cell. Biol., 5(7) : 1750∼1759 (1985)또는 Howley et al, 미합중국 특허 제4,419,446호 참고] ·다른 적절한 포유동물 세포 계는 원숭이 COS-1 세포 계 및 CV-1 세포 계를 포함하지만 그에 한정되지는 않는다.
박테리아 세포들도 역시 적절한 숙주가 될 수 있다. 예를 들면, 이. 클리의 각종 균주(예를 들면, HB101, MC1061)는 생명공학 분야에서 숙주 세포로서 잘 공지되어 있다. 비. 서브틸리스, 슈도모나스, 다른 세균 등의 각종 균주는 본 방법에서 역시 사용될 수 있다.
당 분야에 숙달된 자들에게 공지된 효모의 많은 균주들도 역시 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 덧붙여서, 필요하다면, 곤충세포도 본 발명의 방법에서 숙주세포로서 사용될 수 있다.[ Miller et al, Genetic Engineering, 8 : 277∼298 (Plenum Press 1986) 및 그 참고 문헌 참조]
본 발명의 또 다른 국면은 본 발명의 단백질의 발현 방법에 사용하기 위한 벡터를 제공한다. 벡터들은 본 발명의 BMP-5, BMP-6 및 BMP-7 단백질들을 코팅하는 신규 DNA 서열들을 포함한다.
덧붙여서, 벡터들은 또한 단백질 서열들을 발현되게 하는 적절한 발현 지배 서열들을 역시 포함한다.
다른 한편으로, 상기에서 기술된 바와 같이 끝을 자른 또는 변조된 서열을 포함하는 벡터들 역시 본 발명의 구현 예이며 본 발명의 단백질의 생성에 유용하다. 벡터들은 세포 계를 형질 전환하는 방법에 사용될 수 있고 선택된 숙주 세포 내에서 복제 및 발현을 지시할 수 있는 본 발명의 DNA코딩 서열과 작동 가능하도록 결합된 선택된 조절서열을 포함한다. 그러한 벡터를 위한 유용한 조절서열은 당 분야에 숙달된 자들에게 공지되어 있고 선택된 숙주 세포에 따라 선택될 수 있다. 공지되어 있고 선택된 숙주세포에 따라 선택될 수 있다. 그러한 선택은 일상적인 것이며 본 발명의 일부를 형성하지는 않는다. BMP-5, BMP-6 및 BMP-7 단백질들을 생성하는 데 사용하기 위해 그러한 벡터로 형질 전환된 숙주 세포에 따라 선택될 수 있다. 그러한 선택은 일상적인 것이며 본 발명의 일부를 형성하지는 않는다. BMP-5, BMP-6 및 BMP-7 단백질들을 생성하는데 사용하기 위해 그러한 벡터로 형질 전환된 숙주 세포 또는 그의 자손은 또한 본 발명에 의해 제공된다.
당 분야에 숙달된 자는 본 발명의 DNA서열 및 pCD[okayama et al., Mol. Cell Biol,2:161∼170(1982)] 및 pJL3, pJL4 [Gough et al, EMBO J.4:645∼653 (1985)]와 같은 공지된 벡터들을 사용함으로써 포유동물 발현 벡터들을 구축할 수 있다. 유사하게, 당 분야에 숙달된 자는 제거 또는 코딩 서열에 접한 포유동물 조절 서열을 박테리아 서열로 대체함으로써 본 발명의 서열을 조작하여 박테리아 세포에 의한 세포 내 또는 세포의 발현을 위한 박테리아 벡터를 만들 수 있다. 예를 들면, 코딩 서열은 더 조작 될 수 있다.
(예를 들면, 다른 공지 된 링커에 결찰되거나 다른 공지 된 기술에 의해 그로부터 비-코딩 서열을 삭제하거나 뉴클레오 타이드를 변경함으로써 변조 됨.) 그리고 나서 변경된 코딩 서열은 문헌[T.Taniguchi et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:5230∼5233(1980)]에 기술 된 바와 같은 방법을 사용하여 공지 된 박테리아 벡터 내로 삽입된다. 그리고 나서 상기 전형적인 박테리아 벡터는 박테리아 숙주 세포 내로 형질전환 될 수 있고 그로부터 본 발명의 단백질이 발현된다. 박테리아 세포 내에서 본 발명의 연골 및 / 또는 골 단백질의 세포 외 발현을 일으키기 위한 전략에 대해서는, 예를 들면, 유럽특허출원 EPA 제 177,343호를 참고하라. 곤충 세포 내에서의 발현을 위한 곤충 벡터 [예를 들면 공개 된 유럽특허출원 제 155,476호 참조]를 구축하기 위해 유사한 조작이 수행 될 수 있다. 효모 세포에 의한 본 발명의 요소들의 세포 내 또는 세포의 발현을 위해 효모 조절 서열을 사용하여 효모 벡터도 역시 구축 될 수 있다. [예를 들면, 공개 된 PCT 출원 제 WO 86 / 00639호 및 유럽특허출원 EPA 제 123,289호에 기술 된 방법 참조]. 포유동물 세포로부터 고농도의 본 발명의 단백질을 생성하는 방법은 본 발명의 단백질을 코딩하는 이형 유전자의 여러 사본을 포함하는 세포의 구축을 포함한다. 이형 유전자들은 증폭 가능한 마커, 예를 들면 디히드로 폴 레이트 환원효소 (DHFR) 유전자에 연결 될 수 있고 그에 따라 증가 된 유전자 사본을 포함하는 세포들은 문헌 [Kaufman and sharp, J. Mol. Biol.159：601∼629(1982)]의 방법에 따라 증가되는 농도의 메토 트렉세이트 (MTX) 안에서 증폭을 위해 선택 될 수 있다. 상기 접근방법은 다수의 상이한 세포 타입과 함께 사용 될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 단백질을 위한 DNA 서열을 그의 발현을 가능케 하는 다른 플라스미드 서열과 함께 작동가능 하도록 결합하여 포함하는 플라스미드 및 DHFR 발현 플라스미드 pAdA26SV (A)3 [Kaufman and sharp, Mol. Cell Biol, 2:1304 (1982)]는 인산칼슘 공 침전 및 형질감염, 일렉트로 퍼레이션(electroperation) 또는 원형질체 융합에 의해 DHFR-결핍 CHO 세포, DUKX-BII 내로 공동 도입 될 수 있다. DHFR 발현 형질전환 체들은 투석된 소 태아 혈청을 포함한 알파메디 아에서의 성장에 의해 선택되고, 계속해서 문헌 [Kaufman et al, Mol. Cell Biol,5：1750 (1983)]에서 기술 된 것과 같이 MTX의 증가하는 농도 (0.02, 0.2,1.0 및 5㎛ MTX 의 연속적 단계)에서 성장에 의해 증폭됨을 이유로 선택된다. 단백질 발현은 MTX 내성 정도가 증가함에 따라 증가 할 것이다. 형질 전환체를 클론화하고, 본 발명의 단백질을 배양 배지로부터 회수, 단리 및 정제한다. 발현 된 단백질의 특성 확인은 표준 기술을 사용하여 수행 될 수 있다. 예를 들면, 특성 확인은 [35;S] 메티오닌 또는 시스테인을 사용한 펄스 표지와 (pulse labeling) 또는 폴리 아크릴 아미드 겔 전기영동을 포함 할 수 있다. 생물학적으로 활성인 단백질 발현은 하기 실시에 III에서 기술 된 로슨 (Rosen)-변조 된 삼 파트 (Sampath)- 레디 (Reddi) 쥐 골 형성 측정에 의해 모니터된다.
다른 관련 단백질을 생성하기 위해 유사한 방법들을 따를 수 있다. 골 및 / 또는 연골이 정상적으로 형성되지 않는 환경에서 연골 및/또는 골 형성을 유도하는 본 발명의 단백질은 인간 및 다른 동물들에 있어서 뼈 골절 및 연골 결손의 치료에 사용된다. 본 발명의 단백질을 사용하는 제제는 폐쇄뿐만 아니라 개방 골절에 및 또한 인공관절의 개선 된 고정에 있어서 예방적 용도를 가질 수 있다. 골 형 성제에 의해 유도 된 새로운 골 형성은 선천적인, 외상 유도 된, 또는 종양학적 절제로 유도 된 두 개 안면의 ( Cranio facial) 손상의 회복에 기여하고 또한 미용 성형술에 유용하다. 본 발명의 단백질은 치근막 질병의 치료에 및 다른 치아 회복방법에 사용 될 수 있다. 그러한 약품은 골-형성 세포들을 끌어들이고, 골-형성 세포들의 성장을 자극하거나 골-형성 세포의 원본(progenitor)의 분화를 유도하는 환경을 제공 할 수 있다.
각종의 골 형성, 연골-유도 및 골 유도 인자들이 기술되었다. [유럽특허출원 제 148,155 호 및 제 169,016 호 참고] 본 발명의 단백질들은 또한 상처 치료 관련 된 조직 회복에도 사용 될 수 있다. 상처의 형태는 화상, 절상 및 궤양을 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다.[예를 들면, 상처 치료 및 관련 된 조직 회복의 논의에 대하여 PCT 공개 제 WO84 / 01106 호 참고]. 본 발명의 또 다른 국면은 골절 및 골 및 / 또는 연골 손상 또는 치근막 질병과 관련 된 다른 상태를 회복하기 위한 치료법 및 조성물을 포함한다. 게다가, 본 발명은 상처치료 및 조직 회복을 위한 치료법 및 조성물을 포함한다. 게다가, 본 발명은 상처치료 및 조직 회복을 위한 치료법 및 조성물을 포함한다. 그러한 조성물은 치료적 유효량의 본 발명의 BMP 단백질들 BMP-5, BMP-6 및 BMP-7의 적어도 일종을 약학적으로 허용할 수 있는 부 형제, 담체 또는 매트릭스와의 혼합물로 포함한다. 본 발명의 단백질들은 서로 또는 다른 관련 단백질들 및 성장 인자들과 함께 협조하여 또는 아마도 공동작용으로 작용 할 것으로 예상된다. 본 발명의 치료법 및 조성물들은 따라서 본 발명의 일종 이상의 단백질을 포함한다. 더 나아가 본 발명의 치료법 및 조성물은 따라서 치료적 양의 본 발명의 적어도 일종 단백질과 함께 상기에서 언급한 것과 같이 공동-소유 된 공개 된 국제 출원 제 WO88/00205호 및 제 WO89/10409호에 개시 된 치료적 양의 적어도 일종의 다른 BMP 단백질들 BMP-1, BMP-2, BMP-3 및 BMP-4를 포함한다.
본 발명의 그러한 방법들 및 조성물들은 본 발명의 단백질들 또는 그들의 일부를 상기에서 언급한 BMP 단백질들 또는 그들의 일부와 함께 결합하여 포함한다. 그러한 결합은 단백질의 개별적인 분리 된 분자 또는 개별적인 단백질의 일부에 의해 형성 된 이종 이량제(heterodimer) 와 같은 이종분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 치료방법 및 조성물들은 본 발명의 단백질 또는 그의 일부를 문제의 골 및 / 또는 연골 손상, 상처 또는 조직의 치료에 이로운 다른 약품과 결합하여 포함 할 수 있다. 치료에 이로운 약품과 결합하여 포함할 수 있다. 상기 약품에는 표피 성장인자 (FGF ), 혈소판 유도된 성장인자 (PDGF), 변환 성장인자 (TGF - α 및 TGF- β), K -섬유 아세포 성장 인자 (KFGF ), 부 갑상선 호르몬 (PTH), 백혈병 억제 /인자 (LIF /HILDA, DIA) 및 인슐린 - 유사 성장 인자 (IGF - I 및 IGF -Ⅱ) 와 같은 각종 성장 인자들이 포함된다. 상기 약품들의 일부도 역시 본 발명의 조성물에 사용 될 수 있다.
pH, 등장성, 안정성 등에 관하여 적당한 그러한 생리학적으로 허용 가능한 단백질 조성물의 제조 및 조제는 당 분야의 기술에 속한다. 치료 조성물은 또한 연골 및 골 성장 인자 현재 가치가 있다. 인간 외에도 가축 및 순종말이 본 발명의 단백질을 이용한 그러한 치료를 위한 목적 환자이다. 치료법은 이식 (implant ) 또는 장치로서 조성물을 국소적, 전신적 또는 국부적으로 투여함을 포함한다. 투여될 때, 본 발명에 사용하기 위한 치료 조성물은, 당연히, 세균성 발열물질이 없고, 생리학적으로 허용 가능한 형태이다. 더 나아가, 조성물은 바람직하게는 연골 및 / 또는 골 또는 조직 손상의 부위까지 전달되도록 하기 위해서 캡슐로 싸거나 점성 형태로 주입될 수 있다. 국소적 투여는 상처치료 및 조직회복 에 적당할 것이다.
바람직하게는, 골 및 / 또는 연골 형성을 위해서, 조성물은 본 발명의 BMP 단백질을 골 및 / 또는 연골 손상 부위로 전달하고, 골 및 연골을 발육시키기 위한 구조를 제공할 수 있고 임의적으로 체내로 제 흡수될 수 있는 매트릭스 포함하는 것이 좋다. 매트릭스 BMP 단백질 또는 조성물을 구성하는 다른 인자들의 느린 방출을 제공 할 수 있다. 그러한 매트릭스들은 다른 이식된 의학적 응용을 위해 현재 사용되고 있는 물질들로 형성될 수 있다.
매트릭스 물질은 생물 융합성, 생물 분해성, 기계적 성질, 미용 외관 및 계면 성질에 기초하여 선택된다. 본 발명의 조성물의 특별한 사용은 적절한 조제를 한정할 것이다. 조성물을 위한 유망한 매트릭스들은 생물 분해 가능하고 화학적으로 규정된 황산 칼슘, 인산삼칼슘, 히드록 시 아파티트, 폴 리락트산, 및 다무수물 ( polyanhydride )일 수 있다. 다른 가능한 물질들은 골 또는 표피콜라겐과 같은 생물분 해 가능하고 생물학적으로 잘 규정된 것들이다. 더 나아가 기반들은 순수 단백질 또는 세포의 매트릭스 성분들로 구성된다. 다른 가능한 매트릭스들은 반용융 히드록 시 아파티트, 생유리(dioglass) 알루 미늄 산염 또는 다른 세라믹과 같은 생물 분해되지 않고 화학적으로 규정된 것들이다. 매트릭스 포리락트산 및 히드록 시 아파티트 또는 콜라겐 및 트리칼슘포스페이트왕 같은, 상기에서 언급산 타입의 물질 중 어떤 것들의 결합으로도 구성될 수 있다. 바이오 세라믹들은 칼슘 - 알푸 미늄산염 - 인산에서와 같이 조성물 내에서 변경될 수 있고 동공크 기, 입자크기, 입자형상 및 생물 분해성을 변경시키기 위해 가공된다.
투약 계획은 본 발명의 단백질의 작용을 변경하는 각종 요소를 고려하여 주치외에 의해 결정될 것이다. 본 발명의 단백질의 활성을 변경할 수 있는 요소로서 형성되길 바라는 골의 중량, 골 손상부위, 손상된 골의 상태, 상처의 크기, 손상된 조직의 타입, 환자의 나이, 성별 및 식이요법, 어떠한 감염의 위중함, 투여시간 및 다른 임상적 요소가 포함된다. 일회 투여량은 재구성에 사용된 매트릭스의 타입 및 조성물 내에 존재하는 골 및/ 또는 연골 단백질의 타입 (들) 에 따라 변할 수 있다. EGF, PDGF, TGF-α, TGF-β 및 IGF-I 및 IGF-II 와 같은 다른 공지된 성장 인자를 최종 조성물에 첨가하는 것도 역시 일회 투여량에 영향을 줄 수 있다. 결과는 연골 및 / 또는 골 성장 및 / 또는 회복의 주기적인 평가에 의해 모니터 할 수 있다. 결과는, 예를 들면, Χ- 선, 조직 형태 측정법적 결정적 결정 및 테드라사이클린 표지화를 사용하여 모니터 될 수 있다.
하기의 실시 예들은 본 발명의 소연골 및/또는 골 단백질들은 회수하고 특성을 규명하고 상기 단백질을 상응하는 인간 단백질 (들)을 회수하기 윙해 사용하는 데 있어서 및 제조합 기술을 통하여 단백질을 발현시키는 데 있어서 본 발명의 실행을 상세히 설명한다.
[실시예 I]
빻는 소 뼈 분말 (20∼120 메쉬, Helitrex )을 하기에 확인된 것과 같이 몇몇 추출단계를 제거하고 유리스트의 방법 (M.R. Uristet al., proc, Natl Acad Sci. USA, 70 : 3511 (19s73))에 따라 제조한다. 10Kg 의 빻은 분말을 격렬한 교반과 함께 48 시간의 기간에 걸쳐 0.6N HCl을 4½C씩 연속적으로 교환하여 탈광한다. 생성된 현탁액을 16시간동안 450ℓ의 2 M CaCl2및 10mM 에틸렌디아민 - 테트라아세트산[EDTA]으로 추출하고 나서 4시간 동안 50ℓ의 0.5M EDTA로 추출한다. 잔류물을 증류수로 3회 세척한 후 문헌[Clin. orthop. Rel. Res., 171: 213 (1982)]에 기술된 대로 20ℓ의 구아니딘 히드로클로라이드[GuCl], 20 mM 트리스(pH 7.4), 1 mM N-에틸말레이미드, 1mM 요오도아세트아미드, 1mM 페닐메틸술포닐플루오린에 재현탁 시킨다. 16∼20시간 후에 상충액을 제거하고 또 다른 10ℓ의 GuCl 완충액으로 대체한다. 잔류물을 다시 24시간동안 추출한다.
조 GuCl 추출물을 결합시키고 1,000 분자량 분리막(membrane)을 가진 펠리컨(Pellicon) 장치에서 약20배 농축시키고 나서, 50mM 트리스, 0.1M NaCl, 6M 요소(pH 7.2) 첫 번째 칼럼의 출발 완충액에서 투석한다. 광범위한 투석 후에 단백질을 4ℓ DEAE 셀룰로오즈 컬럼위의 얹고 결합되지 않은 분획을 수집한다.
결합되지 않은 분획을 농축시키고 6M 요소 내에서 50mM NaAc, 50mM NaCl (pH 4.6)에 대해서 투석한다. 결합되지 않은 분획을 카르복시메틸 셀룰로오즈 컬럼에 얹는다. 컬럼에 결합되지 않은 단백질을 출발 완충액으로 충분히 세척함으로써 제거하고, 로슨-변조 된 삼파트-레디측정(하기의 실시 예Ⅲ에 기술)에 의해 측정된 것과 같이 골 및/또는 연골 형성 활성을 가진 단백질을 포함하는 물질은 50mM NaAc, 0.25mM NaCl, 6M 요소(pH4.6)에 의해 컬럼으로부터 탈착된다. 상기 단계용출로부터 얻은 단백질을 20∼40배 농축시키고 나서 80mM KPO4, 6M 요소(pH6.0)로 5배 희석한다. 용액의 pH를 50mM K2HPO4로 6.0으로 조정한다. 시료를 80mM KPO4, 6M 요소(pH6.0)에서 평형화 된 히드록시 아파티드컬럼(LKB)에 가하고 모든 결합되지 않는 단백질을 동일한 완충액으로 컬럼을 세척함으로써 제거한다. 골 및/또는 연골 형성 활성을 가진 단백질은 10mM KPO4, (pH7.4) 및 6M 요소로 용출된다.
단백질을 약10배 농축하고 최종 농도가 0.15M이 되도록 고체 NaCl을 가한다. 상기물질을 50mM KPO4, 150mM NaCl, 6M 요소(pH7.4)에서 평형화된 헤파린-세파로스 컬럼에 가한다. 컬럼을 출발 완충액으로 충분히 세척한 후 골 및/또는 연골 유도활성을 가진 단백질은 50mM KPO4,700mM NaCl, 6M 요소(pH7.4)에 의해 용출된다. 상기 계획을 최소부피까지 농축시키고, 0.4 ㎖ 부분을 4M CuCl, 20mM 트리스(pH 7.2)로 평형화된, 직렬로 연결된 슈퍼로스6 및 슈퍼로스 12컬럼에 가하고 0.25㎖/분의 유속으로 컬럼을 전개시킨다. 골 및/또는 연골 유도활성을 나타내는 단백질은 약30,000 달톤 단백질에 해당한다.
슈퍼로스 컬럼으로부터 얻은 상기 분획들을 모으고, 5mM NaAc, 6M 요소(pH4.6)에 대하여 투석하고 파마시아모노에스 에이치알 컬럼(Pharmacia Monos HR 컬럼)에 가한다. 컬럼을 1.0M NaCl, 50mM NaAc,6M 요소(pH4.6)까지의 구배로 전개시킨다. 활성 골 및/또는 연골 형성 분획들을 모은다. 상기 물질을 0.1% TFA내 0.46×25㎝ 비닥(Vydac) C4컬럼에 가하고 90% 아세토니트릴, 0.1% TFA까지의 구배(31.5% 아세토 니트릴, 0.1% 아세토니트릴, TFA까지 60분 동안 분당 1㎖로)를 사용하여 전개시킨다. 활성 물질은 약 40∼40% 아세토니트릴에서 용출된다. 분획을 연골 및/또는 골 형성 활성에 대하여 측정한다. 활성물질은 모노 큐(Mono Q) 컬럼에서 더 분획화 된다. 단배질은 6M 요소, 25mM 디에탄올 아민, pH8.6에 대하여 투석되고 나서 0.5×5㎝ 모노 규 컬럼(pharmacia)에 가해지고, 6M 요소, 25mM 디에탄올 아민, pH 8.6 및 0.5 M NaCl, 6M 요소, 25mM 디에탄올 아민, pH 8.6 및 0.5 M NaCl, 6M 요소, 25mM 디에탄을 아민, pH 8.6 의 구배를 사용하여 전개된다. 분획을 10 % 트리플루오로 아세트산 ( TFA )을 사용하여 pH 3.0으로 만든다. 적적한 분획의 일부를 하기 방법중 하나에 의해서 요오드화 반응시킨다: 멕코나헤이의 방법 [ P. J. McConey et, al, Int Arch. Aooergy 29:185 ∼1890 (1966)] : 블톤의 방법 [ A. E. Bolton et al, Biochem J. 133 : 529 (1973) ] ; 및 보웬 -포우프의 방법 [ D.F. Bowen -Pope, J. Biol. Chem., 237 : 5161 ( 1982 ) ] · 상기 분획에 있는 요오드화된 단백질들은 SDS 전기영동에 의해 분석된다.
[실시예 Ⅱ]
소 연골 / 골 유도인자의 특성확인
[A. 분자량]
6M 요소, 25mM 디에탄올 아민 pH8.6 ,약 o.3M NaCl에 용해된 실시에 I에서 얻은 약 5 μg 단백질을 SDS 에 대하여 0.1%로 만들고 50mM 트리스 / HCl 0.1 % SDS pH 7.5 에 대하여 16 시간 동안 투석한다. 그리고 나서 투석된 물질을 소량의 I 125 표지된 상대 물과 함께 투석막 [Hunkapiller et al Meth. Enzymol., 91: 227∼236 ( 1983 ) ] 에 대하여 전기 영동적으로 농축시킨다. 상기물질 ( 약 100 ㎕ 부피 )을 12 % 폴리아크릴아미노겔 위에 얹고 시료를 디티오트레 이톨로 환원하지 않고 SDS - PAGE [Laemmli, Nature, 227 : 680 ∼ 685 ( 1970 ) ]를 수행한다. 분자량은 미리 염색된 분자량 표준물질( Bethesda Research Labe ) 과 비교하여 결정한다. 고정되지 않은 겔의 방사선 사진술 후에 약 38,000 ∼ 30,000 달톤 밴드를 잘라내고 단백질은 겔로부터 전기 영동적으로 용출된다. (Hunkapillar et al, 상동 ). 골 및/또는 연골활성이 28,000 ∼ 30,000 영역에서 발견된 상기에서 기술된 공동 -현안의 BMP 응용에서 기술된 것과 같이 유사한 정개골 분획에 기초하여, 상기 밴드가 골 및 / 또는 연골 유도 분획을 포함한다는 것이 추정된다.
[서브유닛 특성확인]
단리 된 소 골 단백질의 서브유닛 조성이 또한 결정된다. 상기에서 기술된 용출 단백질은 2% SDS 내에서 요오드아세테이트 및 표준 방법들을 사용하여 완전히 환원 및 알킬화되고 전기 영동적 충전 (packing ) 에 의해 재농축 된다 그리고 나서 완전히 환원 및 알킬화 된 시료를 12% 겔상에서 SSDS -PAGE를 더 거치게 하고 결과로 생긴 이중선 외양을 가진 약 14,000 ∼ 20,000 달톤 영역은 고정되지 않은 겔의 방사선 사진술에 의해 위치가 확인된다. 희미한 밴드가 28,000 ∼ 30,000영역에 남아있다. 따라서 28,000 ∼ 30,000 달톤 단백질은, 달리 약 14,000 ∼ 16,000 및 16,000 ∼ 20,000 달톤의 두 개의 넓은 밴드로 구성된 것처럼 해석되고 설명될 수 있는 14,000∼20,000의 넓은 영역을 산출한다.
[실시예Ⅲ]
로슨 변조된 삼파트-레디 측정법
삼파트 및 레디Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 80:6591∼6595 (1983)]에 의해 기술된 쥐 골 형성 측정법의 변조된 이형이 본 발명의 단백질들의 골 및/또는 연골 활성을 평가하기 위해 사용된다. 상기 변조된 측정법은 여기에서는 로슨-변조된 삼파트-레디 측정법으로 불리운다. 삼파트-레디 방법의 에탄올 침전단계는 측정되어야 할 분획의 물에 대한 투석(조성물이 용액이면) 또는 투여과(diafiltration) (조성물이 현탁액이면)에 의해 대체된다. 그리고 나서 용액 또는 현탁액을 0.1% TFA에 재용해 시키고, 생성된 용액을 20㎎의 쥐 매트릭스에 가한다.
단백질로 처리되지 않은 모의 쥐 매트릭스 시료가 대조 표준으로서 사용된다. 상기 물질은 냉동되고 동결 건조되고 생성된 분말을 #5젤라틴 캡슐에 넣는다. 캡슐을 생후21∼49일된 숫컷 롱 에반스 쥐(long Evans rats)의 복부의 흉곽 영역에 피학적으로 이식한다. 이식물은 7∼14일 후에 제거된다. 이식물의 반을 알카리 포스파타아제 분석을 위해 사용한다[A. H. Reddi et al., proc. Natl Acad Sci., 69 : 1601(1972) 참조].
각 이식물의 다른 반은 고정되고 조직학적 분석을 위해 가공된다. 각 이식물 내에 존재하는 유도된 골 및 연골 형성의 양을 기록하기 위하여 글리콜메타크릴레이트 절편(1㎛)을 폰 코사(Von Kossa) 및 산푸스친(acid fuschin) 또는 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색한다. +1 내지 +5의 값은 새로운 골 및/또는 연골세포 및 새롭게 형성된 골 및 기반에 의해 점유된 이식물의 각 조직학적 절편의 범위를 나타낸다. 여기에 두가지의 득점 기록법이 기술된다. 첫 번째 득점 기록법에 있어서 +5의 점수는 이식물의 50%이상이 이식물 내의 단백질의 직접적인 결과로서 생성된 새로운 골 및/또는 연골인 것을 나타낸다. +4, +3, +2 및 +1의 점수는 각각 이식물의 40%, 30%,20% 및 10% 이상이 새로운 연골 및 또는 골을 포함하는 것을 나타낸다.
두 번째 득점 기록법(이는 이후에는 변조된 득점 기록법으로서 언급된다.)은 다음과 같다. : 각각의 이식물로부터 세 개의 인접하지 않은 절편을 평가하고 평균한다. +/-는 연골 또는 골의 일시적인 확인을 나타낸다. ; +1은 각 절편의 10%이 새로운 연골 또는 골인 것을 나타낸다. ; +2, 25%, +3, 50% ; +4,∼75% “+5 ”. 80% . 개별적인 이식물들의 점수는 측정 가변성을 나타내기 위해 도표로 만든다. 매트릭스 시료의 연골 및 / 또는 골 유도 단백질 함유 시료의 일회 투여량 반응 특성은 형성된 골 및 / 또는 연골의 양이 시료증의 연골 / 골 유도 단백질의 양에 따라 증가함을 나타낸 것이 관찰된다. 대조표준 시료는 어떠한 골 및 / 또는 연골 형성도 야기하지 않음이 관찰된다.
상기에서 언급된 BMP 단백질들과 같은 다른 연골 및 / 또는 골 유도 단백질을 사용할 때 형성된 골 및 / 또는 연골은 매트릭스에 의해 점유된 공간에 물리적으로 한정될 것으로 예상한다. 시료들은 또한 SDS 겔 전기영동 및 등전 집중법에 의해 역시 분석된 후 방사선 사진술을 거친다. 활성은 단백질 밴드 및 pI 와 관련되어 있다. 특정 분획 내의 단백질의 순도를 평가하기 위하여 10D / ㎎-㎝ 의 흡광 개수가 단백질에 대한 평가로서 사용되고 단백질은 SDS - PAGE를 거친 후 은 염색 또는 방사성 요오드화 반응 및 방사선 사진술을 거친다.
[실시예 Ⅳ]
[소단백질 조성물]
실시예 ⅡB에서 기술된 약14,000∼20,000 달톤 영역의 겔 조각을 표준 방법을 사용하여 메탄올-아세트산-물로 고정시키고, 물로 가볍게 씻어내고 나서, 0.1M 중탄산 암모늄으로 중화시킨다.
겔조각을 면도날을 사용하여 주사위 모양으로 썬 후 0.2㎍의 TPCK-처리된 트리신(Worthington)을 가하고 겔을 37℃에서 16시간 동안 배양함으로써 겔매트릭스로부터 단백질을 소화시킨다. 그리고 나서 생성된 소화물을 C4 비닥 RPHPLC 컬럼 및 0.1% TFA - 물0.1 % TFA 물-아세토니트릴 구배를 사용하여 RPHPLC한다. 결과로 생긴 펩타이드 피크를 214 및 280㎚에서 UV흡광에 의해 모니터하고 응용 생물 시스템 기체상 서열 분석기(Applied Biosystems gas phase sequenator Model 70 A)를 사용하여 직접적인 아미노 말단 아미노산 서열 분석을 행한다. 아미노산 표준 삼-문자 기호에 의해 표시된 하기의 아미노산 서열(여기에서Xaa는 밝혀지지 않은 아미노산을 나타내고 괄호 안의 아미노산은 불확실함을 나타냄)을 갖는 하나의 트립신 분해 단면이 표준 방법에 의해 분리된다.
Xaa - His - Glu - Leu - Tyr - Val - Ser - Phe - (Ser)
하기의 4가지 올리고 뉴클레오타이드 탐침들은 상기에서 확인된 트립신 분해 단면의 아미노산 서열에 근거하여 고안되고 자동 DNA합성기에서 합성된다.
탐침 #1 : GTRCTYGANATRCANTC
탐침 #2 : GTRCTYGANATRCANAG
탐침 #3 : GTRCTYAAYATRCANTC
탐침 #4 : GTRCTYAAYATRCANAG
상기에서 확인된 탐침들 중에 있는 표준 뉴클레오타이드 기호들은 하기와 같다 : A, 아데노신 ; C, 시토신 ; 구아닌; T, 티민 ; N, 아데노신 또는 시토신 또는 구아닌 또는 티민 ; R, 아데노신 또는 구아닌; 및 Y,시토신 또는 티민.
각각의 탐침은 올리고뉴클레오타이드의 집단으로 구성된다.
유전자 암호가 퇴화되므로 (하나 이상의 코돈이 동일한 아미노산을 코딩할 수 있음), 트립신의 아미노산 서열을 코딩하는 모든 가능한 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고 뉴클레오타이드의 혼합물이 합성된다.
상기 탐침들은 방사성 표지 되고 하기에 기술된 것과 같이 소 DNA 라이브러리를 스크린 하는데
사용된다.
[소 BMP-5]
개론- 로베이의 방법[Gehron-Robey et al, Current Advances in Skeletogenesis, Elsevier Science Publishers (1985)]에 의하여 소 태아 골세포로부터 단리한 총 RNA로부터 올리고(dT) 셀룰로오즈 크로마토그래피에 의해 폴리(A)함유 RNA를 단리한다.
총 RNA는 NIH의 국립치과 연구소(National Institute of Dental Research)의 마리온 영 박사(Dr. Marion Young)로부터 얻었다. cDNA 라이브러리는 2 gt10 (Toole et al, 상동)로 만들어지고 50 플레이트에 플레이트당 8000 제조 합체를 깐다.
테트 라메틸암모튬 클로라이드(TMAC) 하이브리드화 방법 [Wozney et al, Science, 242 : 1528 - 1534 (1988)]을 사용하여 탐침1, 2, 3 및 4의 조합을 가진 이중 니트로 셀룰로오스 여과지 위에서 상기 제조 합체 (400,000)를 스크린한다. 28개의 양성체를 수득하고, 2차 시험을 위해 다스 플레이트에 깐다. 다시 이중 니트로 셀룰로오스 복사가 만들어진다. 한 세트의 여과지를 탐침 #1 및 #2를 사용하여 스크린한다. 전자에서 6개의 양성체가 수득되고 후자에서 21개의 양성체가 수득된다. HEL5로 명명된, 여섯 개중의 하나를 플라크 정제하고 파지 플레이트 군체를 만들고 박테리오 파지 DNA를 단리한다.
상기 DNA를 EcdRI으로 소화시키고 M13 및 pSP65 (Promega Biotec, Madison, Wisconsin) 내로 서브클론 한다.
[Melton, et al, Nucl. Acids Res. 12 : 7035-7056 (1984)]
상기 단편의 DNA 서열 및 유도 된 아미노산 서열이 표 I에 나타나 있다.
M13 내에서 상기 단편의 DNA 서열 분석은 그것이 상기에 나타낸 목적 트립신 분해 펩타이드 서열을 코딩하고, 상기 유도된 아미노산 서열은 트립신의 특이성에 의해 예상 된 바대로 선행하는 염기성 잔기 (Lys)를 가진다. 표 I에서 서열의 밑줄 친 부분인 아미노산 #42-#48은 올리고 뉴 클레오 타이드 탐침이 그로부터 고안되는 상기에서 확인 된 트립신 분해 단편에 해당한다. 표 I에 나타낸 바와 같이 아미노산 서열 #15 -#23 인 유도된 아미노산 서열 Ser-Gly-Ser-His-Gln-Asp - Ser-Arg 은 상기에서 언급한 BMP 공개들제 WO 88 / 00205 호 및 제 WO 89 / 10409 호에서 기술된 바와 같이 28,000 ∼ 30.000 달톤 정제된 골 제제에서 발견되는 트립신분해 단편 서열 Ser-Pro-Ala-Gln-Asp-Val-Ser-Arg와 유사한 것이 주목된다. 표 I 에 나타낸 상기 단편은 소 BMP-5 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 일부이다. 표 I 에 나타낸 DNA 서열은 140 아미노산 잔기 ( 최초 7 뉴클레오타이드는 클로닝 방법에 사용된 어댑터의 것이다 ) 의 부분적 펩타이드를 코딩하는420 염기쌍의 클론의 5' 말단으로부터 개방된 판독 프레임을 나타낸다. 프레임 내의 정지 코돈 (TAA) 은 상기 클론이 소 BMP-5 의 카르복시 -말단부분을 코딩함을 나타낸다.
상기에서 기술된 참침 #1, #2, #3 및 #4를 사용하여 단리 남아있는 양성 클론들 (두번WO 세트는 21 개 양성체 포함)을 HELR를 사용하여 스크린하고 그후의 클론은 환원되 하이브리드화 조건 [65 C에서 5 X SSC, 0.1% SDS, 5 멘하르츠 (DEnhardt:'S) 100 ㎍ / ml 송이 정충 DNA 표준 하이브리드화 완충액 (SHB),65。C에서 2 x SSC, 0.1% SDS 내에서 세척] 하에서 하이브리드화하는 것으로 확인된다. 상기 클론을 플라크 정제하고, 파지 플레이트 군체를 만들고 박테리리오 파지 DNA 서열 및 유도된 아미노산 서역이 표 II 에 나타나 있다. 상기서열 본 발명의 소 BMP-6 연골/골 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 일부를 나타난다.
표 II에서 아미노산 #97 -아미노산 # 105인 서열의 최초의 밑줄 친 부분은 상기에서 BMP 공개들 제 WO88 / 00205 호 및 제 WO89 /10409 호에서 기술된 바와 같이 28,000 ∼ 30,000 달톤 정제된 소 골 제제 ( 및 약 18,000 ∼ 20,000 달톤 환원된 형태에서 그의 환원된 형태)에서 발견되는 트립신 분해 단편에 해당한다. 표Ⅱ에서 아미노산 #124 ∼ 아미노산 #130 인 두 번째 밑줄 친 서열은 올리고뉴클레오 자이드 탐침드이 그로부터 고안되는 상기에서 확인된 트립신 분해단편에 해당하다.
표 II 의 DNA 서열은 222 아미노산 잔기의 부분적 펩타이드를 코딩하는 표II 의 서열의 5 말단으로부터 시작하는 666 염기상의 개방된 판독 프레임을 나타낸다. 프레임내 정지코돈 ( TGA ) 은 상기 클론이 소 BMF-6 단백질은 카트복사 - 말단부분을 코딩함을 나타낸다. 다른 BMP 단백질들 및 TGF-β 족내의 다른 단백질들에 대한 지식에 기초하여, 전구체 폴리펩티드가 세계의 염기성 잔기들(ArgArgArg )에서 절단되어 표Ⅱ의 서열의 잔기 90 또는 91에서 시작하는 성숙한 펩타이드를 낼것이라고 예상된다.
[실시예 Ⅴ]
[인간 단백질 조성물]
BMP-5 및/또는 BMP-6 mRNAs를 합성하는 인간 세포계는 하기의 방법으로 확인된다. 올리고(dT) 셀룰로오즈 상에서의 크로마토그래피에 의해 폴리(A) -함유 RNA에 대해 선택 된 각종의 인간 세포계로부터 RNA를 단리하고, 포름알데히드- 아가로스겔상에서 전기영동하고, 니트로 셀룰로오즈로 옮긴다. 겔의 니트로 셀룰로우즈 복사물을 상기에서 언급한 표I의 서열의 뉴클레오 타이드 1-465를 포함하는 BMP-5 EcoRI-BglII 단편에 해당하는 단쇄 M13 32P- 표지된 탐침에 하이브리드화 한다. 강하게 하이브리드화하는 밴드가 인간 골육종 세포 계 U-20S RNA에 해당하는 선에서 검출된다. 다른 니트로셀룰로오즈 복사물을 소 BMP-6의 PstI-SmaI 단편(표Ⅱ 의 뉴클레오타이드 106∼261에 해당)을 포함하는 단쇄 M13 32P- 표지된 탐침에 하이브리드화 한다. U-20S RNA에 해당하는 선에 있는 몇몇 RNA 종들이 상기 탐침에 하이브리드화 함이 발견되었다.
확립된 기술(Toole et al. )을 사용하여 u-20S 폴리(A)-포함 RNA로부터 벡터 2 ZAP (Stratagene)내에 cDNA 라이브러리를 만든다. 상기 라이브러리의 7,50,000 재조 합체가 플레이트에서 배양되고 이중 니트로 셀룰로오스 복사물이 만들어진다. 표Ⅱ의 뉴클레오타이드 259-751에 해당하는 소 BMP-6의 SmaI 단편을 틱 번역(nick- translation)에 의해 표지하고 65℃에서 SHB에 있는 여과지의 양쪽세트에 하이브리들화 한다. 한세트의 여과지를 엄중한 조건(65℃에서 0.2×SSC, 0.1% SDS) 하에서 세척한다. 다수의 이중 하이브리드화 재조 합체(약162)가 눈에 뛴다. 24개를 골라 2차 시험을 위해 플레이트에서 다시 배양한다. 각 플레이트로부터 세 개의 니트로 셀룰로오스 복사물이 만들어진다. 하나는 닉-번역된 BMP-6 PstI - SacI 단편(표 Ⅱ의 뉴클레오타이드 106-378)에 하이브리드화되고, 세 번째 것은 닉-번역된 BMP-5 XbaI 단편(표 I 의 뉴클레오타이드 1-76)에 하이브리드화 된다. 하이브리드화 및 세척은 엄중한 조건하에서 실행된다.
[인간 BMP-5 단백질]
두 번째 탐침에보다 세 번째 탐침에 더 강하게 하이브리드화 하는 17 클론들을 플라크 정제한다. 이들중 하나, U2-16은 1989년 6월 22일자로 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, Maryland)에 수탁번호 ATCC 68109로 기탁되었다. 여기에 기술된 다른 기탁 뿐만 아니라 상기 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약(부다페스트 조약)의 조항하에 이루어 졌다. U2-16은 약2.1 kb의 삽입물을 포함한다. U2-16의 DNA서열 및 유도된 아미노산 서열이 하기의 표Ⅲ에 나타나 있다. 상기 클론은 인간 BMP-5 단백질을 코딩하는데 필요한 모든 뉴클레오라이드 서열을 포함할 것으로 예상된다. 표 Ⅲ의 cDNA 서열은 모든 프레임에 정지코든을 가진 700bp의 5' 미번역 영역을 뒤따르는, 454 아미노산의 단백질을 코딩하는 1326 bp의 개방된 판독 프레임 및 프레임내 정지 콘돈(TAA)이후의 90 bp의 3' 미번역 영역을 포함한다. 454 아미노산의 상기 단백질은 그의 아미노산 서열에 의해 예측된 대로 약52,000달톤의 분자량을 가지고 이는 일차 번역 생성물을 나타낸다는 것이 관찰되었다.
다른 BMP단백질들 및 TGF-β족 내의 다른 단백질들에 대한 지식에 기초하여, 전구체 포리펩티드가 삼염기서 펩타이드 Lys Arg Lys에서 절단되어 아미노산 #323 Asn으로 시작하는 132 아미노산 성숙 펩타이드를 낼 것으로 예상된다. BMP-5가 성숙한 형태로 되는 공정은 관련된 단백질 TGF-β의 공정[L. E. Gentry, et , al., Molec. ＆ Cell Biol., 8 : 4162 (1988) : R. Dernyck, et al.; Nature 316 : 701 (1985)]과 유사한 방법으로 이량체화 및 N - 말탄 영역의 제거를 포함할 것으로 예상된다. 따라서 BMP-5의 성숙한 활성 종들은 각 서브 유닛이 약15,000 달톤의 예상된 분자량을 가진 아미노산 #323∼#454로 구성된 2개의 폴리펩티드 서브 유닛의 동종 이량체로 구성될 것으로 예상된다. 또 다른 활성 BMP-5 종들은, 예를 들면, 전단백질 이량체 또는 성숙한 서브 유닛에 연결된 프로 단백질 서브 유닛으로 생각된다.
부가적인 활성 종들은 정제된 소 물질에서 발견된 트립신 분해 서열과 동일한 것을 포함하는 그러한 종들로 아미노산 #329∼#454로 구성된다. 또한 아미노산 #353∼#454로 구성되고 그에 의하여 첫 번째 보존된 시스테인 잔기를 포함하는 BMP-5 단백질이 관찰된다.
표3의 밑줄친 서열, 아미노산 #329∼#337 Ser - Ser - Ser - His - Gln - Asp - Ser - Ser - Arg 는 상기 실시예 Ⅳ에서 논의된 바와 같이 표I의 아미노산 #15∼#23의 소서열과 유사하다. 각각의 상기 서열들은 상기에서 언급된 BMP 공개된 출원 제WO 88/00205호 WO 89/10409호에 기술된 것과 같이 28,000∼30,000 달톤 정제된 골 제제( 및 약 18,000∼20,000 달톤에서 그의 환원된 형태 )에서 발견된 트립신 분해 단편 서열 Ser - Thr - Pro - Ala - Gln - Asp - Val - Ser - Arg 와 상동성을 가진다. 표Ⅲ의 밑줄 친 서열 #356∼#362 His - Glu - Leu - Tyr - Val - Ser - Phe는 올리고뉴클레오타이드 탐침이 그로부터 고안되는, 상기에서 기술된 소골 제제내에서 확인된 트립신 분해 단편에 해당한다.
상기에서 기술된 트립신분해 서열 His - Glu - Leu - Tyr - Val - Ser - Phe -(Ser)은 예를 들면 공개 제 WO 88/00205 호에서 기술된 것과 같이 소 및 인간 연골 / 골 단백질 BMP -2A 서열에서 발견되 서열 His -Pro -Leu - Tyr -Val -Asp -Phe - Ser과 유사한 것이 눈에 띈다. 인간 BMP-5 는 분자의 TGF -β상위족 ( Superfamily ) 의 다른 구성원들 뿐만 아니라 다른 BMP 분자와도 상동성이 있다. 인간 BMP-5 의 시스테인이 풍부한 카르복시말단 102 아미노산 잔기는 여기에 및 상기에서 기술한 공개 WO 88/00205호 및 WO89/10409호에 개시된 BMP 단백질들과 하기의 상동성을 공유한다. : BMP-2와 61% 동일성 ; BMP-3 과 43%동일성, BMP-4 와 59% 동일성 ; BMP-6과 91% 동일성 ; 및 BMP-7과 88% 동일성. 인간 BMP-5는 하기의 상동성을 더 가진다 : TGF -β3과 36% 동일성; FGF-β2와 37% 동일성 ; TGF - β1과 36% 동일성 ; 남자 태아의 발육 도중 뮬러관(Mullerians duct)의 퇴화를 일으키는 고환의 당단백질인 물러 억제 물질(MIS) 과 25% 동일성; 인히빈(inhibin) α와 25% 동일성; 인히빈 β와 38% 동일성 ; 인히빈 β와 45% 동일성 ; 초기 배발생에서 중배엽 유도예 관여할 수 있는 제노푸스(Xenopus) 인자인 Vgl [Weeks and Melton, Cell 51 : 861∼867 (1987)]과 56% 동일성; 초기 배발생에서 등-배특정화에 필요하며 발육의 후기 단계에서 각종의 다른 발생과정에 관여하는 초파리 데카펜타플레직(decapentaplegic) 위치의 생성물인 Dpp[Padgett, et al., Nature 325 : 81-84(1987)]와 57% 동일성.
[인간 BMP-6 단백질]
실시예 V. A. 에 기술된 세 번째 탐침에 보다 두 번째 탐침에 더욱 강하게 하이브리드화하는 6개의 클론을 골라내고 플라스미드 내로 형질 전환한다. 이 플라스미드들의 제한 지도 작성, 서던 블롯 분석 및 DNA 서열분석은 두 종류의 클론들이 있음을 나타낸다.
클론 U2-7 및 U2-10 은 다른 4클론들 보다 두 번째 탐침에 대한 더욱 강한 하이브리드화 및 표Ⅱ의 소 BMP-6 코딩 서열을 포함한다.
상기 클론들로부터 유도된 DNA 서열 데이터는 그들이 인간 BMP-6 단백질의 카르복시- 말단으로 구성된 132 아미노산 의 부분적 폴리펩티드를 코딩함을 나타낸다. U2-7은 부다페스트 조약의 조항하에, 1989년 6월 23일자로 ATCC에 수탁번호 68021로 기탁되었다.
클론 U2-10으로부터 유도된 인간 BMP-6의 3' 미번역 서열에 기초한 서열인 올리고 뉴클레오타이드 GGAATCCAAGGCAGAATGTG를 사용하여 U-2 OS mRNA로부터 프라이더 연장된 cDNA 라이브러리를 만든다. 상기 라이브러리는 U2-7 및 U2-10의 BMP-6 코딩 서열로부터 유도된 서열 CAGAGTAATCGC의 올리고 뉴클레오타이드로 스크리닝 된다. 하이브리드화는 42℃에서 표준 하이브리드화 완충액(SHB)내에서, 42℃, 5×SSC, 0.1% SDS의 세척조건과 함께 이루어진다. 확실히 하이브리드화는 클론들을 단리한다. 상기 클론들 중 하나의 DNA삽입물은 그것이 U2-7 또는 U2-10보다 5' 방향에서 더 연장됨을 나타낸다. 상기에서와 같이 U-20S mRNA로 구축된 프라이머 연장된 cDNA 라이브러리는 P도 6-2의 5' 말단 근처의 서열로부터 유도된 서열
GCCTCTCCCCCTCCGACGCCCCGTCCTCGT의 올리고 뉴클레오타이드로 스크리닝한다. 하이브리드화는 SHB 내의 65℃에서, 2×SSC, 0.1% SDS 내의 65℃에서의 세척과 함께 이루어진다. 확실히 하이브리드화하는 재조합체들을 단리하고 제한지도 작성 및 DNA 서열 분석에 의해 분석한다.
확실히 하이브리드화하는 재조합체 중 하나 PE5834 #7의 삽입물의 5' 서열 CTGCTGCTCCTCCTGCTGCCGGAGCGC의 올리고 뉴클레오타이드를 고안하는데 사용된다. 임의로 프라이머가 붙은 cDNA 라이브러리[(dN)가 프라이머로서 사용된 것을 제외하고는 올리고(dT) 프라이머가 붙은 라이브러리와 같이 합성됨. ]를 SHB내의 65℃에서의 하이브리드화와 함께 1×SSC, 0.1% SDS내의 65℃에서의 세척에 의해 상기 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 스크리닝한. 확실히 하이브리드화하는 클론 RP10을 확인하고, 단리하고 그의 삽입물의 5' 말단으로부터 DNA 서열을 결정한다. 상기 서열은 서열 TCGGGCTTCCTGTACCGGCGGCTCAAGACGCAGGAGAAGCGGGAGATGCA의 올리고뉴클레오타이드를 고안하는 데 사용된다. 인간 태반 cDNA 라이브러리(Stratagene Catalog #936203)를 SHB내 65℃에서의 하이브리드화 및 0.2×SCC, 0,1% SDS를 사용한 ℃에서의 세척에 의하여 상기 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 스크리닝 한다.
BMP6C35로 명명된 확실히 하이브리드화 하는 제조합체를 달리한다.
상기 재조합체의 삽입물의 DNA 서열 분석은 그것이 완전한 인간 BMP-6 단백질을 코딩함을 나타낸다. BMP6C35는 부다페스트 조약의 조항 하에, 1990년 3월 1일자로, ATCC에 수탁번호 68245로 기탁되어 있다. BM6C35의 삽입물의 대부분의 DNA 및 유도된 아미노산 서열이 표Ⅳ에 나타나 있다. 상기 DNA 서열은 513 아미노산 인간 BMP-6 단백질 전구체를 코딩하는 1539 염기쌍의 개방된 판독 프레임을 포함한다. 가정된 개시 메티오닌 코돈에 선행하여 모든 세 개의 판독 프레임에 정지 코돈을 가진 159 염기 쌍의 5' 미번역 서열이 있다. 뉴클레오타이드 1699-1701에 있는 정지 코돈 후에 3' 미번역 서열의 적어도 1222 염기쌍이 뒤따른다. U2-7 이 BMP6C35 의 위치 122L 에 있는 T 잔기에 해당하는 위치에 C 잔기를 가진다는 것이 밝혀졌다.; U2-7 은 또한 BMP6C35 의 위치에 C 잔기를 가진다. 상기는 코딩된 단백질에서 아미노산 차이를 야기하지 않고, 아미도 대립 유전자 변화를 나타낸다.
올리고뉴클레오타이드
TCGGCTTCCTGTACCGGCGGCTCAGACGCAGGAGAAGCGGGAGATGCA는 1 X 10б 재조합체의 니트로 셀룰로오tm 복사물을 65。C에서 0.2 X SSC, 0.1% SDS를 사용하여 세척함으로써 인간 게놈 라이브러리 (Toole al al, 상동)를 스크린 하는데 사용한다. 확실히 하이브리드화 하는 클론들을 정제한다. 올리고뉴클레오타이드 하이브리드화 영역은 약1.5kb pstI 단편에 위치한다. 상기 단편의 DNA 서열 분석은 표Ⅳ에 지시된 5' 서열을 확증한다.
표Ⅳ에 있는 서열의 최초의 밑줄 친 부분인 아미노산 #388 내지 #396, Ser - Thr -Gln -Ser - Gln-Asp - Val - Ala -Arg는, 표Ⅱ에 나타나 있고 상기에서 기술된 소 서열의 유사한 서열 Ser - Thr - Pro - Alg - Gln - Asp - Val - Ser- Arg 에 해당한다. 표 Ⅳ에 있는 두 번째 밑줄친 서열인 아미노산 #415내지 #421 His - Glu - Leu - Tyr - Val - Ser - phe는, 그로부터 올리고뉴클레오타이드 탐침이 고안되는 상기에서 확인된 트립신 분해 단편에 해당한다. 트립신 분해서열 His - Glu - Leu - Tyr - Val - Ser - phe - (Ser)는 다른 BMP 단백질에서 발견되는 서열, 예를 들면, 공개 제 WO 88/00205호에 기술된 것과 같이 소 및 인간 연골/골 단백질 BMP-2 서열에서 발견되는 서열 His - Pro - Leu - Tyr - Asp- phe - Ser과 유사한 것으로 밝혀졌다. BMP-6는 따라서 공개 제 WO88/00205호 및 제 WO89/10409 오에 기술된 분자 BMP-2, BMP-3, BMP-4 뿐만 아니라 여기에 기술된 BMP-5 및 BMP-7을 포함하는 TGF - β 분자들의 BMP 하위족의 새로운 구성원을 나타낸다.
TGF - β족에 있는 다른 단백질들 뿐만 아니라, 다른 BMP 단백질들에 대한 지식에 기초하여, BMP-6 는 전구체분자로서 합성되고 전구체 폴리펩티드는 아미노산 #381 및 아미노산 #382 사이에서 절잔되어 약 15 kD 의 계산된 분자량을 가진 132 아미노산 성숙한 폴리 펩티드를 낼 것으로 예산된다. BMP - 6 의 성숙한 형태는 BMP -5 가 그런 것처럼 폴리펩티드 사슬당 세 개의 가은한 N - 연결된 글리코실화 위치을 포함한다.
성숙한 형태로 되는 BMP-6 의 처리는 이량체화 및 관련된 단백질 TGF -β 의 처리[ L. E. Gentry, et al., ( 1988 ) ; R. Dernyck, et al., ( 1985) 상동 ] 와 유사한 방법으로 N -말단 영역의 제거를 호함할 것으로 예상된다. 활성 BMP-6 단백질 분자는 이량체임이 관찰되었다. 더 나아가 단백질 분자를 포함하는 BMP-R 의 성숙한 활성 종들은 가 서브유닛이 표IV 에 나타낸 SRJT처럼 아미노산 #382 ∼#512를 포함할 수 있고, 그에 의하여 정제된 소 물질에서 발견된 트립신분해 단편들을 포함한다. 본 발명의 다른 BMP -5 단백질은 아미노산 #412 ∼ #513을 포함할 수 있고, 그에 의하여 최초의 보존된 시스틴 잔기를 포함한다.
인간 BMP -6 에 대한 쥐 Vgr -1 [Lyons, et al., PNAS 86: 4554 (1989) ] 의 서열의 비교는 92 % 보다큰 아미노산 서열 동일성으 정도를 나타낸다. 쥐 Vgr-1 은 BMP-6 의 쥐 상동물인 듯 하다. 인간 BMP-6 는 분자의 TGF -β 상위 족의 다른 구성원 들 뿐만 아니라 다른 BMP 분자들과도 상동성을 가진다. 인간 BMP-6 의 시스테인 풍부한 카트복시 -말단 102 아미노산 잔기는 여기에 및 공개 제 WO 88 / 00205 호 및 제 WO 89 / 10409 호 에 개시된 BMP 단백질들과 하기의 상동성을 공유한다. BMP-2 와 61% 동일성 ; BMP-3과 44% 동일성, BMP-60% 동일성, BMP-5와 91% 동일성; 및 BMP-7과 87% 동일성. 인간 BMP-6는 더 나아가 하기의 상동성을 공유한다 : TGF-β3와 41% 동일성 ; TGF- β2 와 39% 동일성 ; TGF -β1과 37% 동일성 ; 남자 태아의 발육도중 물러관의 퇴화를 야기하는 고환의 당단백질인 물러억제물질(MIS)과 26% 동일성 ; 인히빈 α와 25% 동일성 ; 인히빈β와 43% 동일성 ; 인히빈 β와 49% 동일성 ; 초기 배발생에서 중배엽 유도에 관여할 수 있는 제노푸스 인자인 Vg1 [Weeks and Melton, (1987), 상동]과 58% 동일성 ; 초기 배발생에서 등-배 특정화에 필요하며 발육의 후기단계에서 각종의 다른 발육 과정에 관여하는 초파리 데카펜타플레직 위치의 생성물인 Dpp [Padgett, et al., (1987) 상동]와 59% 동일성.
[인간 BMP-7 단백질]
두 번째 종류의 클론을 나타내는 것으로 보이는 상기의 실시예 V. C.의 다른 4개의 클론들은 BMP-7으로 명명된 신규 폴리펩티드를 코디한다. 상기 클론들 중 하나인 U2-5는 부다페스트 조약의 조항 하에 1989년 6월 22일자로 ATCC에 수탁번호 68020으로 기탁되었다.
상기 클론은 BMP-7에 대한 완전한 코딩 서열을 포함하는 것은 아니라고 확정되었다. 서열 GC GAGCAATGGAGGATCCAG의 올리고(U2-5의 3' 비코딩 서열에 기초하여 고안됨)는 U-2 OS mRNA (Toole, et, al.,)로부터 프라이머- 연장된 cDNA 라이브러리를 만들기 위해 사용된다. 상기 라이브러리의 500,000 재조합체를 42℃에서 5×SSC, 0.1% SDS에서 세척함으로써 올리고뉴클레오타이드 GATCTCGCTGCAT(BMP-7 코팅서열에 기초하여 고안 됨)를 사용하여 스크리닝 한다. 몇 개의 하이브리드화 클론들이 수득된다. 상기 클론들 중의 하나 PEH7-9의 DNA 서열 분석 및 유도된 아미노산 서열은 표Ⅴ에 나타나 있다. PEH7-9는 부다페스트 조약의 조항하에 1989년 11월 17일자로 ATCC에 수탁번호 68182로 기탁되었다. PEH7-9는 1448 염기쌍의 삽입물을 포함한다. 상기 클론, PEH7-9는 BMP-7 단백질을 코딩하는 데 필요한 모든 뉴클레오 타이드 서열을 포함할 것으로 예상된다. 표Ⅴ의 cDNA 서열은 431 아미노산의 단백질을 코딩하는 1292 염기쌍의 개방된 판독 프레임, 그에 선행하여 모든 프레임에 정지 코톤을 가진 96 염기쌍의 5' 미번역 영역 및 프레임내 정지 코돈 TAG 이후의 60 염아의 3' 미번역 영역을 포함한다.
431 아미노산 상기 단백질은 그의 아미노산 서열에 의해 예상된 것과 같이 49,000 달톤의 분자량을 가지며 일차 번역 생성물을 나타내는 것으로 예상된다. TGF - β 족내의 다른 단백질들 뿐만 아니라 다른 BMP 단백질들에 대한 지식에 기초하여, 전구체 폴리펩티드는 아미노산 #299 및 #300 사이에서 절단되어 132 아미노산 성숙 펩타이드를 낼 것으로 예상된다. BMP-7 이 성숙한 형태로 되는 공정은 관련된 단백질 TGF-B의 공정[L. E. Gentry et al., (1988) 상동 및 ; R. Dernyck, et, al., (1985) 상동]과 유사한 방법으로 이량체화 및 N - 말탄 영역의 제거를 포함할 것으로 예상된다. 따라서 BMP-7 의 성숙한 활성 종들은 각 서브유닛이 15,000 달톤의 계산된 중량을 가진 표Ⅴ에 나타낸 것과 같은 아미노산 #300#431로 구성된 2개의 폴리펩티드 서브유닛의 동종 이량체로 구성될 것으로 예상된다. 다른 활성 BMP-7 종들은, 예를 들면, 단백질 이량체 또는 성숙한 서브 유닛에 연결된 전 단백질 서브유닛으로 예상된다. 부가적인 활성 종들은 정제된 소 물질에서 발견된 트립신 분해 서열을 포함하는 그러한 종들로 표Ⅴ의 아미노산 #309#431로 구성될 수 있다. 따라서 BMP-7 단백질은 아미노산 #309#431로 구성되고 따라서 첫 번째 보존된 시스테인 잔기를 포함할 것으로 예상된다.
표5의 밑줄 친 서열인 아미노산 #309#314 Asn - Gln - Glu - Ala - Leu - Arg는 상기에서 언급한 BMP 공개 제WO88/00205호 및 제 WO89/ 10409호에 기술된 것과 같이 28,000∼30,000 달톤 정제된 골 제제에서 발견된 트립신 분해 단편 #5의 것과 동일한 서열이다. 표Ⅴ의 밑줄 친 서열인 아미노산 #333#339 His - Glu - Leu - Tyr - Val - Ser - phe는 그로부터 올리고뉴클레오타이드 탐침이 고안되는, 상기에 기술된 소골 제제에서 확인된 트립신 분해 단편에 해당한다.
BMP - 5 및 BMP - 6와 같이, 인간 BMP -7은 분자의 TGF - β 상위족의 다른 구성원들 뿐만 아니라 다른 BMP 분자들과 상동성을 공유한다. 인간 BMP-7의 시스테인이 풍부한 카르복시 -말단 102 아미노산 잔기는 여기에 및 상기에서 기술된 공개 제 WO 88/00205호 및 제 WO 89/10409호에 있는 BMP 단백질들과 하기의 상동성들을 공유한다 : BMP-2와 60% 동일성 ; BMP-3 와 43% 동일성, BMP-4와 58% 동일성, BMP - 6와 87% 동일성 ; 및 BMP - 5와 88% 동일성. 인간 BMP-7은 더 나아가 하기의 상동성을 공유한다. TGF-β1과 36% 동일성 남자 태아의 발육 도중 뮬러관의 퇴화를 야기하는 고환의 당단백질인 뮬러 억제 물질(MIS)과 29% 동일성 ; 인히빈 -α와 25% 동일성; 인히빈 - β와 44% 동일성 ; 인히빈 - β와 45% 동일성 ; 초기 배발생에서 등 - 배 특정화에 필요하며 발육의 후기 단계에서 각종의 다른 발육 과정에서 관여하는 초파리 데키펜타플레직 위치의 생성물인 Dpp [Padgett, et al., (1987) 상동] 와 58% 동일성.
본 발명은 BMP-5, BMP-6 및 BMP-7의 게놈 서열을 포함한다. 상기 서열들을 수득하기 위하여, 여기에 기술된 cDNA 서열들이 당 분야에 숙련된 자들에게 공지된 기술을 사용하여 게놈 라이브러리를 스크리닝하기 위한 탐침으로서 사용된다.
상기에 기술된 방법들 및 당 분야에 숙련된 자들에게 공지된 추가적인 방법들은 소 또는 인간 단백질들을 탐침원으로서 사용함으로써 관심의 대상인 다른 관련된 단백질들을 단리하기 위해 사용된다.
그러한 다른 단백질들은 인터 알리아(inter alia), 굴절 회복, 상처 치료 및 조직 회복에 있어서 유사한 용도를 찾을 수 있다.
[실시예Ⅵ]
[BMP 단백질들의 발현]
본 발명의 소, 인간 또는 다른 포유 동물 BMP-5, BMP-6 또는 BMP-7을 생성하기 위해서는, 그것을 코딩하는 DNA를 적절한 발현 벡터 내로 형질 감염시키고 통상적인 유전 공학 기술에 의해 포유 동물 세포 또는 다른 바람직한 진핵 또는 원핵 숙주 내로 도입시킨다.
본 발명의 생물학적으로 활성인 재조합 인간 단백질에 대한 바람직한 발현 시스템은 포유 동물 세포를 안정하게 형질 전환시킬 것으로 예상된다.
일시적인 발현을 위해서, 통상적으로 1∼4일의 기간 동안 플라즈미드 내에 코딩된 적당한 양의 단백질을 생성하는 SV40으로 형질 전환된 아프리카 녹색 원숭이 신장 COS-1 또는 COS-7 의 세포 주가 선택된다. BMP-5, BMP-6 또는 BMP-7의 안전한 고수준 발현을 위해서 바람직한 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO)이다. 따라서 바람직한 포유 동물 세포 CHO 세포일 것으로 예상된다.
형질 전환된 숙주 세포를 배양하고 그로부터 발현된 본 발명의 BMP 단백질들을 회수, 단리 및 정제한다. 발현된 단백질의 특성 확인은 표준 기술을 사용하여 수행된다. 예를 들면, 특성 확인된[3] 메티오닌 또는 시스테인을 사용한 펄스 표지화 및 폴리아크릴아미드 전기 영동에 의한 분석을 포함할 수 있다.
재조합에 의해 발현된 BMP 단백질들은 배양 배지에서 발견되는 물질과 같은 다른 오염 물질들 뿐만 아니라 그들과 함께 공동-생성되고 자연에서는 정상적으로 그와 함께 결합되어 있는 단백질성 물질들을 포함하지 않는다.
[벡터 구축]
상기에서 기술된 것처럼, 당분야에 공지된 수 많은 발현 벡터들이 본 발명의 BMP 단백질의 발현에 사용될 수 있다. 하기 실시예들에서 사용된 벡터는, 비록 다른 벡터들이 발명의 실시에 적절할 수 있더라도, pMT₂의 유도체인 pMT21이다.
pMT₂는 부다페스트 조약의 조항하에 ATCC에 수탁번호 67122로 기탁된 pMT-VWF로부터 유도된다. EcoRI소화는 pMT - VWF에 존재하는 cDNA 삽입물을 절단하여, 암피 실린 내성을 갖도록 이. 콜리 HB101 또는 DH -5를 형질 전환하기 위해 결찰되고 사용될 수 있는 PMT2 DNA는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
그리고 나서 PMT21은 루프 아웃/ 인 돌연변이 유발
[Morinaga, et al., Biotechnology 84: 636 (1984)]을 사용하여 구측된다. 이는 염기 1075∼1170(포함)을 제거한다. 게디가 그것은 하기 서열을 삽입시킨다. : 5 'TCGA 3' 상기 서열은 새로운 제한 위치, XhoI을 완성한다. 상기 플라스미드는 이제 3개의 독특한 클로닝 위치 PstI, EcoRI 및 XhoI을 포함한다.
덧붙여서, pMT21은 EcoRV 및 XhoI 으로 소화되고, 동시에 소화된 DNA을 DNA 포리머라제 I의 클레노우 단편으로 처리하고 CLaI 링커(NEBio Labs, CATCGATG)를 결찰 시킨다. 이는 아데노비루스 VAI 유전자를 완전하게 남겨두면서, 복제의 SV40 시점(Origin) 및 pMT2의 증진자(enhancer) 서열 근처에 있는 Hind Ⅲ 위치로부터 시작하여 염기2171∼2420을 제거하고 독특한 Cla I 위치를 도입시킨다.
[BMP - 5 벡터 구축]
표Ⅲ에 나타나 있는 뉴클레오타이드 # 699∼# 2070을 포함하는 BMP - 5 cDNA 서열의 유도체를 특별히 증폭시킨다.
상기 실시예Ⅴ에서 기술된 클로 U2-16의 삽입물로부터 표Ⅴ의 뉴클레오타이드 서열 # 699∼# 2070이 증폭되도록 올리고뉴클레오타이드 CGACCTGCAGCCACCATGCATCTGACTGTA 및 TGCCTGCAGTTTAATATTAGTGGCAGC 가 프라이머로서 사용된다. 이 방법은 뉴클레오타이드 #699 바로 앞에 뉴클레오타이드 서열 CGACCTGCAGCCACC를 도입시키고 뉴클레오타이드 #2070 바로 다음에 뉴클레오타이드 서열CTGCAGGCA를 도입시킨다. 상기 서열들을 첨가한 결과 증폭된 DNA 단편의 양끝에 pst I 제한 엔도뉴클레아제 인가 위치가 만들어 진다. 상기 방법으로 생성된 증폭된 DNA 생성물을 제한 엔드뉴클레아제 Pst I으로 소화시키고 상기에 기술된 pMT2 유도체 pMT21의 pstI 위치로 서브클론 한다.
생성된 클론을 H5 / 5 / pMT로 명명한다.
H5 / 5 / pMT의 삽입물은 PstI 소화에 의해 절단되고 플라스미드 벡터 pSP65의 PstI 위치 내로 서브클론 되어 BMP5/SP6를 생성한다. 제한 엔도뉴클레아제 NsiI 및 Ndel으로 BMP5/SP6 및 U2-16을 소화시켜 표Ⅲ의 뉴클레오타이드 #704 ∼ #1876에 해당하는 그들의 삽입물의 일부를 절단해 낸다. 클론 U2-16의 생성된 1173 뉴클레오타이드 NsiI - NdeI 단편은 상응하는 1173 뉴클레오타이드 NsiI - Ndei 단편이 제거된 BMP5 / SP6의 NsiI - NdeI 위치내로 결찰된다. 생성된 클론을 BMP5 mix/ sp64로 명명한다.
BMP5 mix/ Sp64의 직접적인 DNA 서열 분석은 표Ⅲ에 나타낸 것들에 대한 증폭에 의해 생성된 뉴클레오타이드 서열들의 동일성을 확인하기 위해 수행된다. 클론 BMP5 mix/sp64를 제한 엔토뉴클레아제 pstI으로 소화시킨 결과 표Ⅲ의 뉴클레오타이드# 699 ∼ # 2070으로 구성된 삽입물 및 상기에서 기술된 바와 같이 PstI 인지 위치를 포함하는 추가적인 서열이 절단된다. 생성된 1382 뉴클레오타이드 Psti 단편을 pMT2 유도체 pMT21의 PstI 위치 내로 서브 클론한다.
상기 클론을 BMP5 mix / pMT21 #2로 명명한다.
[BMP - 6 벡터구축]
표Ⅳ에 나타낸 뉴클레오타이드 #160 내지 # 1706의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 BMP -6 cDNA 서열의 유도체는 당 분야에 숙련된 자들에게 공지된 일련의 기술에 의해 생성된다.
실시예Ⅴ 상기에서 기술된 클론 BMP6C35를 제한 엔도 뉴클레아제 ApaI 및 TaqI으로 소화시켜 표Ⅳ에 나타낸 서열의 뉴클레오타이드 #231∼#1703을 포함하는 삽입물의 1476 뉴클레오타이드 부분을 잘라낸다. SalI 제한 엔도 뉴클레아제 위치 전환자(converters)를 가진 합성 올리고뉴클레오 타이드는 BMP-6 cDNA 서열의 1476 ApaI - TaqI 단편에 포함되어 있지 않는 #160∼#230 및 #1704∼#1706에 해당하는 뉴클레오타이드들을 대체하기 위해 고안된다.
잃어버린 5'(TCGACCCACCATGCCGGGGCTGGGGCGGAGGGCGCAGTGGCTGTGCTGGTGGT GGGGGCTGTGCTGCAGCTGCTGCGGGCC 및 CGCAGCAGCTGCACAGCAGCCCCCACCACCAGCACAGCCACTGCGCCCTGCCCTCCGCCCCAC CCCCGGCATGGTGGG) 및 3'(TCGACTGGTTT 및 CGAAACCAG) 서열들을 대체한다고 생각되는 올리고뉴클레오타이드/SalI 전환자는 독립적으로 서로에게 결합된다. 그리고 나서 결합된 5' 및 3' 전환자들은 상기에서 기술된 1476 뉴클레오타이드 ApaI - TaqI에 결찰되어 표Ⅳ의 #160∼#1706 뉴클레오타이드 서열 및 양 말단에 SalI 제한 엔도뉴틀레아제를 만들기 위해 고안된 추가적인 서열로 구성된 1563 뉴틀레오라이드 단편을 만든다. 생성된 1563 뉴클레오타이드 SalI 단편을 pTM 유도체 pMT21의 XhoI 제한엔도뉴클리아제 내로 서브클론하고 여기에서 BMP6/ pMT21로 명명한다.
[BMP -7 벡터 구축]
표1에 나타낸 뉴클레오타이드 #97∼#1402 의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 BMP-7 서열의 유도체를 특별히 증폭시킨다.
올리고뉴클레오타이드 서열 #97∼1042가 상기에서 기술된 클론 PEH7 - 9의 삽입물로부터 증폭되도록 한다. 이 방법은 뉴클레오타이드#97 바로 앞에 뉴클레오타이드 서열 CAGGTCGACCCACC를 삽입시키고 뉴틀레오타이드 #1402 바로 다음에 뉴클레오타이드 서열 GTCGACAGA를 삽입시킨다. 상기 서열들을 첨가한 결과, 증폭된 DNA 단편의 양 끝에 SalI 제한 엔도뉴클레아제 인지 위치가 만들어 진다. 상기 방법으로 생성된 증폭된 DNA 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 SalI으로 소화시키고 플라즈미드 벡터 pSP64의 SalI 위치 내로 서브클론 하여 BMP7/SP6#2를 만든다.
클론 BMP7/SP6#2 및 PEH7-9을 제한 엔도뉴클리아제 NcoI 및 StuI으로 소화시켜 표Ⅴ의 뉴클레오타이드 #363∼#1081에 해당하는 그들의 삽입물의 일부를 절단해낸다.
클론 PEH7-9의 생성된 719 뉴클레오타이드 NcoI -StuI 단편을 상응하는 719 뉴클레오타이드 단편이 제거된 BMP7/SP6#2의 NcoI - StuI 위치 내로 결찰시킨다. 생성된 클론을 BMP7 mix SP6로 명명한다.
BMP7 mix/ SP6의 직접적인 DNA 서열 분석은 표Ⅴ의 #1082#1402 뉴클레오타이드 서열에 대한 3' 영역의 동일성을 확증하지만 5' 영역은 잘못 편입된 하나의 뉴클레오타이드를 포함한다.
P도-9을 주형으로서 사용하는 뉴클레오타이드 서열(표Ⅴ의 #97#1402의 증폭은 상기에 기술된 바와 같이 반복된다.
이 방법에 의해 생성된 증폭된 DNA 생성물은 제한 엔도 뉴클레아제 SalI 및 PstI 으로 소화된다. 상기 소화의 결과 표Ⅴ의 뉴클레오타이드 #97#833으로 구성된 747뉴클레오 타이드 단편 및 상기에서 기술된 SalI 제한 엔도 뉴클레아제인지 위치를 만드는데 사용된 5' 프라임화 올리고뉴크레오타이드의 추가적인 서열이 절단된다. 상기 747 SalI-PstI 단편은 SalI- PstI 소화된 pSP65 벡터 내로 서브클론하여 5' BMP7/ SP65를 만든다.
DNA서열 분석은 5' BMP7/ SP65#1의 삽입물의 표Ⅴ의 뉴클레오타이드 #97#362 와 동일한 서열을 포함함을 보여준다.
클론 BMP7 mix/SP6 및 5' BMP7/ SP65를 제한 엔도뉴클레아제 SalI 및 NcoI으로 소화시킨다. 표Ⅴ의 뉴클레오타이드 #363#1402를 포함하는 BMP7 mix/ SP6의 생성된 3' NcoI - SalI 단편 및 표 Ⅴ의 뉴클레오타이드 #97#1402 및 상기 단편의 양말단에 SalI 제한 위치가 만들어지도록 하는 5' 및 3'을 올리고뉴클레오타이드 프라이머로부터 유도된 추가적 서열로 구성된 1317 뉴클레오타이드 단편을 생성한다. 상기 1317 뉴클레오타이드 SalI 단편을 pMT2 유도체 pMT2침-2dml SalI 위치 내로 결찰시킨다. 이 클론을 BMP7 /pMT2 로 명명한다.
BMP7 / pMT2의 삽입물은 제한 엔도 뉴클리아제 SalI으로 소화시킴으로써 절단된다. 생성된 1317 뉴틀레아제 SaiI으로 소화시킴으로써 절단된다. 생성된 1317뉴클레오타이드 SalI 단편을 벡터 pSP64의 SalI제한 위치 내로 서브클론 한다.
이 클론을 BMP7/SP64# 2d로 명명한다. BMP7/SP64# 2d 의 삽입물 SalI으로 소화시킴으로써 절단하고 표Ⅴ의 뉴클레오타이드 #97∼#1402로 구성되어 생성된 SalI 단편을 상기에서 기술된 pMT2 유도체 pMT21의 XhoI 제한 엔도뉴클레아제 위치 내로 서브클론 한다.
[실시예Ⅶ]
[일시적인 COS 세포 발현]
BMP-5, BMP-6 및 BMP-7 단백질의 일시적인 발현을 얻기 위하여 BMP-5, BMP-6, 또는 BMP-7에 대한 cDNA를 포함하는 벡터들, BMP5 mix/ pMT21 #2 또는 BMP7/pMT21 중 하나를 각각, 일렉트로포레이션(electroporation)법을 사용하여 cos-1 세포 내로 형질 감염시킨다. 다른 저절한 형질 감염법에는 DEAE- 덱스트란 및 지방 감염(lipfection)이 있다. 약 48시간 후에, [35s]메리오닌을 사용한 대사 표지화(metabolic labeling) 및 폴리아크릴 아미드 겔 전기 영동에 의해 세포내 및 분비된 BMP-5, BMP-6 또는 BMP-7 단백질 양쪽의 발현에 대해서 세포를 분석한다. 세포내 BMP는 N- 연결된 글리코실화의 억제적인 투니카마이신(tunicamycin)으로 처리된 세포내에서 분석된다. 투니카마이신 - 처리된 세포에서, 비글리코실화 일차 번역 생성물은 예측 가능한 크기의 동종 밴드로서 이동하고 폴리아크릴아미드 겔 내에서 단백질의 글리코실화된 형태보다 식별하기가 종종 더 쉽다. 각 경우에, 투니카마이신- 처리된 세포 내의 세포내 단백질은 형질 감염된, 그러나 미처리된 COS-1 세포들의 복제 플레이트에 비교된다.
[BMP-5 COS 발현]
결과는 약 52Kd 및 57Kd 의 BMP-5의 세포내 형태가 COS 세포로부터 만들어짐을 나타낸다. 52Kd 단백질은 BMP-5 cDNA 클론의 일차 서열에 의해 예상된 크기이다. 세포를 투니카마이신으로 처리함에 따라, 단지 52Kd 형의 BMP-5 만이 만들어지고, 이는 57Kd 단백질이 52Kd 일차 번역 생성물의 글리코실화 유도체임을 암시한다. 57Kd 단백질은 조절된 배지 내로 분비되고 분명히 COS-1 세포에 의해 예비 또는 성숙한 펩타이드로 효과적으로 처리되지 않는다.
[BMP-6 COS 발현]
세포내 BMP-6는 미처리된 COS-1 세포 내에서 약 61Kd 및 65Kd의 쌍으로서 존재한다. 투니카마이신의 존재하에서는 , 단지 61Kd 단백질만이 관찰되고, 이는 65Kd 단백질이 61Kd 일차 번역 생성무의 글리코실화된 유도체임을 나타낸다. 이는 BMP-6에 대한 cDNA 클론에 의해 예상된 분자량과 유사하다. 투니카마이신이 존재하지 않을 때, COS-1 세포로부터 분비된 우세한 단백질은 BMP-6의 65Kd 글리코실화된, 미처리된 잘린 형태이다. 또한 65Kd 보다 적은 양으로 46Kd 및 20 KKd의 펩타이드들이 존재하고 이는 각각 처리된 예비 및 성숙한 펩타이드를 나타내는 것 같다.
[BMP-7 COS 발현]
투니카마이신- 처리된 COS-1 세포내의 세포내 BMP-7 단백질은 44Kd 및 46Kd의 쌍으로 검출된다. 투니카마이신이 존재하지 않을 때, 46Kd 및 아마도 48Kd의 단백질들이 합성된다.
이는 BMP -7 일차번역 생성물의 글리코실화된 유도체를 나타내는 것 같다. 48Kd 단백질은 COS-1 세포로부터 분비되는 주요 BMP 종들이고, 이는 다시 예비 펩타이드 이염기성 절단 위치에서 BMP-7이 비효율적인 절단을 암시한다.
[실시예Ⅷ]
[CHO) 세포 발현]
상기에서 기술 된 BMP-5, BMP-6, 또는 BMP-7, 발현벡터들 중의 하나로 일렉트로포레이션에 의해 DHFR 결핍 CHO 세포들(DUKX BLL)을 형질 감염시키놓고 뉴클레오사이드가 없는 배지에서 성장하는 것에 의해 DHFR을 발현시키는 것들을 선택한다.
CaPO₄침전법, 원형질체융합, 미량주사, 지방 감염 등을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 형질감염의 다른 방법들도 역시 사용될 수 있다. 고수준의 발현을 보다 쉽게 얻기 위해서는 5nM, 20nM 또는 100nM MTX로 보충된 뉴클레오 사이가 없는 배지에서 세포들을 선택할 수 있다. DHFR 선택적 마커는 이시스트론 코딩 영역의 두 번째 유전자로소 BMP cDNA에 물리적으로 연관되어 있으므로, DHFR을 발현하는 세포들은 또한 상류시스트론 내에 코딩된 BMP를 발현할 것이다. 단일 클론들 또는 결합된 클론들의 군집중 한쪽을 성장시키고 BMP 단백질의 발현에 대해 분석한다. 유전자 증폭에 의해 발현벡터 DNA 의 많은 사본들을 포함하고 따라서 대량의 MTX 단백질을 분비하는 세포계를 수득하기 위하여 MTX의 단게적으로 증가하는 농도(5nM, 20nM, 100nM, 500nM, 2㎛, 10㎛ 및 100㎛에서 세포들을 선택한다.
표준 기술들을 사용하여 BMP RNA 단백질 또는 활성의 발현에 대하여 세포 계들을 스크리닝하고, 고도로 발현하는 세포 계들을 적절한 수준의 선택으로 클론화 또는 재클론화하여 보다 동일한 세포의 집단을 수득한다. 그리고 나서 결과로 얻은 세포 계를 BMP DNA서열 및 BMP RNA 및 단백질의 발현에 대해서 특성을 더 확인한다. 그리고 나서 적절한 세포계들은 재조합체 BMP 단백질을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
[BMP-5의 CHO 발현]
상기에 기술된 BMP-5 벡터 BMP5mix/ pMT21#2을 일렉트로포레이션에 의해 CHO 세포 내로 형질 감염시키고 DFHR을 발현시키는 세포를 선택한다. MTX에 대한 내성에 대해 단계적으로 선택된 개별적인 클로니들로부터 클론성 세포 계를 수득하고, BMP-5 단백질의 분비에 대해 분석한다.
몇몇 경우에는 세포계들은 군집으로서 유지되고 MTX 선택의 후기 단계에서 클론화될 수 있다.
실시예Ⅴ. B.에서 기술된 것과 같이 BMP-5에 대한 cDNA는 약 52Kd의 단백질을 코딩한다. 예비 펩타이드 절단, 글리코실화 및 이량체 또는 다량체 형성등을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 세포내의 공정을 거친 후, 다수의 BMP-5 펩타이드가 생성된다. 환원조건하의 SDS PAGE에 따라 구별될 수 있는 BMP-5 단백질의 처리된 형태가 될만한 적어도 4개의 펩타이드가 있다 ; 65Kd 펩타이드, 35Kd 펩타이드 및 약22Kd 분자량의 한 쌍. 다른 더 적은 량의 BMP-5 펩타이드들도 역시 존재할 수 있다. 다른 관련된 BMP 분자들 및 관련된 단백질 TGF-β의 처리(Processing)와 비교 함으로써, 65Kd 단백질은 처리되지 않은 BMP-5를 나타내고, 35Kd 종들은 예비펩타이드를 나타내고, 22Kd 쌍은 성숙한 펩타이드를 나타내는 것 같다.
BMP-5 세포 계로부터의 물질은 2 - 차원 겔 시스템에서 분석된다. 첫 번째 차원에서, 단백질은 비환원 조건하에서 전기영동된다. 그리고 나서 물질을 환원시키고 두 번째 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동된다. 이황화- 결합된 이량체 또는 다량체를 형성하는 단백질들은 두 번째 환원된 겔을 가로지른 대각선 아래로 전개될 것이다. BMP-5 단백질의 분석으로부터 얻은 결과는 상당한 양의 성숙한 BMP-5 펩타이드들이 일차원 환원된 겔에서 관찰된 22Kd 쌍으로 환원되는 약30∼35Kd의 동종이량체를 형성할 수 있음을 나타낸다. 성숙한 펩타이드들의 소량은 예비 펩티이드와의 이 황화- 결합된 복합체로 뚜렷이 존재한다. 상디 복합체의 양은 성숙한 동종 이량체에 비하여 소수이다. 게다가, 미처리 된 단백질의 몇몇은 분명히 동종 이량체 또는 동종 다량체를 형성할 수 있다.
[BMP -6의 CHO 발현]
상기에 기슬된 BMP-6 발현 벡터 BMP6 / pMT 21을 CHO 세포 내로 형질 감염시키고, 상기 부분 A에서 BMP-6 와 관련하여 기술된 것과 같은 방법으로 DHFR 발현을 통해 안정한 형질 전환체를 선택한자. BMP -6 의 성숙한 활성종들은 표 Ⅳ 의 아미노산 #382#513을 포함할 것으로 예상된다. 분비된 BMP-6 단백질은 다른 관련된 BMP 분자인 BMP-5 에 대하여 상기에서 기술된 것과 비슷환 방법 및 관련된 BMP 분자인 BMP-5 에 대해서 상기에서 기술된 것과 비슷한 방법 및 관련된 단백질 TGF-β 의 처리 [Gentry. et al.; Dernyck, et al.,상동]와 유사한 방법으로 처리될 것으로 예상된다.
[BMP - 7의 CHO 발현]
상기에서 기술된 BMP -7 발현 벡터 BMP7/pMT21을 CHO 세포내로 형질 감염 시키고, 상기에서 NBMP-5 와 관련하여 기술된 것과 같은 방법으로 DHFR 발현을 통해 안정한 형질 전환체를 선택한다. BMP- 7 의 성숙한 활성종들은 표 Ⅴ 의 아미노산 #300#431을 포함할 것으로 예상된다. 분비된 BMP- 7 단백질은 다른 관련된 BMP 분자인 BMP- 5에 대하여 상기에서 기술된 것과 비슷한 방법 및 관련된 단백질 TGF-β 의 처리 [Gentry, et al., Dernyck, et al, 상동]와 유사한 방법으로 처리될 것으로 예상된다.
[실시예Ⅸ]
[발현된 BMP 단백질들의 생물학적 활성 상기 실시예Ⅶ 및Ⅷ에서 수득 발현된 BMP- 5, BMP- 6 및 BMP- 7 단백질들의 생물학적 활성을 측정하기 위해서, BMP 단백질들을 배양배지로부터 회수하고, 다른 오염 물질들뿐만 아니라, 그와 함께 공동 생성된 다른 단백질성 물질로부터 BMP 단백질들을 단리 함으로써 정제한다. 단백질들은 헤파린 세파로스 컬럼상에서 부분적으로 정제될 수 있고 당분야에 숙련된 자들에게 공지된 표준 정제 기술을 사용하여 더 정제될 수 있다. 예를 들면, 배양물로부터 수거된 형질 감염 후 조절된 배지 상층액은 YM10 막(membrane) 상의 한의여과 (ultrafiltration)에 의해서 약 10배로 농축되고 그리고 나서 20 ㎚. 트리스, 0.15M NaCl, pH 7.4 (출발 완충액)에 대하여 투석된다. 그리고 나서 상기 물질은 출발 완충액에 용해되어 헤파린 세파로스 컬럼에 가해진다. 결합되지 않은 단백질들은 출발 완충액의 세척에 의해 제거되고, 본 발명의 단백질을 포함하는 결합된 단백질들을 20㎚ 트리스, 2.0 M NaCl, pH 7.4에 의해 탈착된다. 헤파린 컬럼에 의해 결합된 단백질들은 예를 들면, 센트리콘 10(Centricon 10) 위에서 약 10배 농축되고, 염은 예를 들면, 0.1% 트리플루오로아세트산을 사용하여 투여과(diafiltration) 함으로써 감소된다. 적절한 양의 생성된 용액을 20㎎의 쥐 매트릭스와 혼합하고 그리고 나서 로슨 - 변조된 삼파트 - 레디 측정에 의해 생체내(in vivo) 골 및/ 또는 연골 형성 활성에 대해 측정한다. 모의 형질 감염 상충액 분획이 대조 표준으로서 사용된다. 예비(preparative) NaDodSO₄/ PAGE [aemmli, Nature 227 : 680∼685 (1970)]에 의해 더 정제할 수도 있다.
예를 들면, 약 300㎍의 단백질을 1.5㎜ 두께12.5% 겔에 가한다 : 상기에서 기술된 바와 같이 헤파린 - 세파로스에 의해 정제된 L -[35s] 메티오닌- 표지된 BMP 단백질에 의해 회수율을 평가한다. 단백질은 인접한 열의 구리 염색 [Lee, et al., Anal. Biochem. 166 : 308∼312 (1987)]에 의해 가시화 될 수 있다. 적절한 밴드를 잘라내고 0.1 NaDodSo₄/20mM 트리스, pH 8.0에서 추출한다. 10% CF3COOH를 사용하여 상충액을 pH 3으로 산성화할 수 있고 단백질은 0.1% CF3COOH 내지 90% 아세토니트릴/0.1 % CF3COOH의 구배를 사용하여 전개되는 5.0×0.46㎝ 비닥 C₄컬럼 (The Separations Group, Hesperia, CA)상에서 염분이 제거된다.
특정량의 본 발명의 인간 BMP-5, BMP-6, 또는 BMP-7 단백질들이 첨가된 쥐 매트릭스를 포함하는 이 식물은 약 7일 후에 쥐로부터 제기되고 조직학적 평가를 위해 처리된다. 각 이식물로부터 얻은 대표적인 단편들을 새로운 골 물질들의 존재를 찾기 위해 폰 코싸 및 산 푸스친으로 염색하고, 연골-특이적 기반 형성의 존재를 찾기 위해서는 톨루이딘 블루를 사용하여 염색한다. 단편 내에 존재하는 세포들의 타입 뿐만 아니라 상기 세포들이 표현형을 나타내는 정도를 실시예Ⅲ에 기술된 것과 같이 평가하고 점수를 매긴다.
활성의 수준은 또한 숙주 세포 추출물에 대해서도 시험될 수 있다. 모든 완충액내에 6M 요소가 포함된 것을 제외하고는 상기에서 기술된 것과 유사한 방법으로 정제를 실행한다.
전술한 설명들은 본 발명의 바람직한 구현예들을 즉시 상세히 설명한다. 실제상으로는 그의 수많은 변경 및 변화가 상기 설명을 참작하는 당 분야에 숙련된 자들에게 일어날 것으로 예상된다. 그러한 변경 및 변화는 여기에 첨부된 특허청구의 범위 내에 포함되는 것으로 생각된다.

Claims (15)

  1. 표3의 아미노산 #323 - #454로 구성된 아미노산 서열을 특징으로 하는 정제된 인간 BMP-5 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, ⒤ 표3의 뉴클레오타이드 #1665 - #2060으로 구성된 DNA서열 또는 실질적으로 그와 동일한 서열로 형질 전환된 세포를 배양하고 ; (ii) 상기 배양배지로부터 표3에 나타낸 것과 같은 아미노산 #323 - #454 또는 실질적으로 그와 동일한 서열로 구성된 단백질을 회수하고, 단리하고, 정제히는 단계들에 의해 생성된 정제된 인간BMP-5 단백질.
  3. 표3의 뉴클레오타이드 #699 - #2060으로 구성된 DNA 서열 또는 실질적으로 그와 동일한 서열로 형질 전환된 세포를 배양하고 ; (ii) 상기배양 배지로부터 BMP-5 단백질을 회수하고, 단리하고, 정제하는 단계들에 의해 생성된 인간 BMP-5 단백질.
  4. 제1항의 단백질을 코딩하는 DNA 서열.
  5. 제4항에 있어서, 표3의 뉴클레오타이드 #1665- #2060으로 구성된 BMP-5 단백질을 코딩하는 DNA서열.
  6. 제4항에 있어서, 표3의 뉴클레오타이드 #660 - #2060으로 구성된 BMP-5 단백질을 코딩하는 DNA 서열.
  7. 제4항의 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터.
  8. 제5항의 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터.
  9. 제6항의 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터.
  10. 제7항의 벡터로 형질 전환된 E.coli, B.subtilis, Pseudomonas, COS, CHO 세포 및 포유 동물세포로 이루어진 군에서 선택된 숙주 세포.
  11. 제8항의 벡터로 형질 전환된 E.coli, B.subtilis, Pseudomonas, COS, CHO 세포 및 포유 동물세포로 이루어진 군에서 선택된 숙주 세포.
  12. 제9항의 벡터로 형질 전환된 E.coli, B.subtilis, Pseudomonas, COS, CHO 세포 및 포유 동물세포로 이루어진 군에서 선택된 숙주 세포.
  13. ⒜ 적절한 배양 배지내에서 제10항의 형질 전환된 숙주 세포를 배양하고; ⒝상기 배양 배지로부터 단백질을 회수하고, 단리하고, 정제하는 단계들로 구성된 BMP 단백질의 제조 방법.
  14. ⒜ 적절한 배양 배지내에서 제11항의 형질 전환된 숙주 세포를 배양하고; ⒝상기 배양 배지로부터 단백질을 회수하고, 단리하고, 정제하는 단계들로 구성된 BMP 단백질의 제조 방법.
  15. ⒜ 적절한 배양 배지내에서 제12항의 형질 전환된 숙주 세포를 배양하고; ⒝상기 배양 배지로부터 단백질을 회수하고, 단리하고, 정제하는 단계들로 구성된 BMP 단백질의 제조 방법.
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