JP3504259B2

JP3504259B2 - 骨誘導組成物

Info

Publication number: JP3504259B2
Application number: JP50554990A
Authority: JP
Inventors: ウァング、エリザベス・エイ; ウォズニー、ジョン・エム; ローゼン、ビッキィ・エイ; セレステ、アンソニー・ジェイ
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1989-03-28
Filing date: 1990-03-27
Publication date: 2004-03-08
Anticipated expiration: 2019-03-08
Also published as: JPH03505098A; JP2004073208A

Description

【発明の詳細な説明】この発明は、硬骨および／または軟骨の形成に有用な
蛋白質に関するものである。特に、この発明は、BMP−
５、BMP−６およびBMP−７蛋白質群（ここで、BMPと
は、骨形成蛋白質である）と呼ばれる若干の群の精製蛋
白質並びにそれらを得る方法に関するものである。これ
らの蛋白質は、軟骨および／または硬骨形成誘導能力を
呈し得る。それらは、硬骨および／または軟骨形成の誘
導、創傷治癒および組織修復に使用され得る。

この発明は、一群のBMP−５蛋白質を提供する。精製
ひとBMP−５蛋白質は、それらと共に生成される他の蛋
白質を実質的に含まず、また第３表に示されたアミノ酸
＃323〜アミノ酸＃454を含むアミノ酸配列を特徴とす
る。このアミノ酸配列＃323〜＃454は、第３表のヌクレ
オチド＃1665〜ヌクレオチド＃2060を含むDNA配列によ
りコードされる。さらにBMP−５蛋白質は、ドデシル硫
酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（SD
S−PAGE）により測定された28000−30000ダルトンの見
かけ上の分子量を特徴とし得る。SDS−PAGEにおける還
元条件下では、前記蛋白質は、約14000−20000ダルトン
の分子量により電気泳動する。これらの蛋白質は、軟骨
および／または硬骨形成を刺激、促進または他の形で誘
導することができると考えられる。

さらにこの発明は、第１表に記載されたアミノ酸＃９
〜アミノ酸＃140を含むうしBMP−５蛋白質を提供する。
アミノ酸配列＃９〜＃140は、第１表のヌクレオチド＃3
2〜＃427を含むDNA配列によりコードされる。さらに、
これらの蛋白質は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアク
リルアミド・ゲル電気泳動（SDS−PAGE）により測定さ
れた28000−30000ダルトンの見かけ上の分子量を特徴と
し得る。SDS−PAGEにおける還元条件下では、前記蛋白
質は、約14000−20000ダルトンの分子量により電気泳動
する。これらの蛋白質は、軟骨および／または硬骨形成
を誘導し得ると考えられる。

この発明のひとBMP−５蛋白質は、ヌクレオチド＃699
〜ヌクレオチド＃2060を含む第３表に示されたヌクレオ
チド配列と同一または実質的に同じヌクレオチド配列を
含むDNA配列により形質転換された細胞を培養すること
により製造され得る。アミノ酸＃323〜アミノ酸＃454ま
での第３表に示された配列と同一または実質的に同じア
ミノ酸配列を含むBMP−５蛋白質を培養培地から回収
し、分離し、精製する。

うしBMP−５蛋白質は、ヌクレオチド＃８〜ヌクレオ
チド＃427を含む第１表に示された配列と同一または実
質的に同じヌクレオチド配列を含むDNA配列により形質
転換された細胞を培養し、アミノ酸＃９〜アミノ酸＃14
0を含む第１表に示されたアミノ酸配列またはその一部
分を含む蛋白質を、培養培地から回収および精製するこ
とにより製造され得る。

この発明は、一群のBMP−６蛋白質を提供する。精製
ひとBMP−６蛋白質は、それらと共に生成される他の蛋
白質を実質的に含まず、また第４表に示されたアミノ酸
＃382〜アミノ酸＃513を含むアミノ酸配列を特徴とす
る。アミノ酸＃382〜＃513を含むアミノ酸配列は、第４
表のヌクレオチド＃1303〜ヌクレオチド＃1698までのDN
A配列によりコードされる。さらにこれらの蛋白質は、
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電
気泳動（SDS−PAGE）により測定された28000−30000ダ
ルトンの見かけ上の分子量を特徴とし得る。SDS−PAGE
における還元条件下では、前記蛋白質は、約14000−200
00ダルトンの分子量により電気泳動する。これらの蛋白
質は、軟骨および／または硬骨形成を刺激、促進または
他の形で誘導することができると考えられる。

さらに、この発明は、第２表に示されたアミノ酸＃12
1〜アミノ酸＃222を含むアミノ酸配列を特徴とするうし
BMP−６蛋白質を提供する。＃121〜＃222までのアミノ
酸配列は、第２表のヌクレオチド＃361〜ヌクレオチド
＃666までの第２表のDNA配列によりコードされる。さら
にこれらの蛋白質は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリア
クリルアミド・ゲル電気泳動（SDS−PAGE）により測定
された28000−30000ダルトンの見かけ上の分子量を特徴
とし得る。SDS−PAGEにおける還元条件下では、前記蛋
白質は、約14000−20000ダルトンの分子量により電気泳
動する。これらの蛋白質は、軟骨および／または硬骨形
成を誘導し得ると考えられる。

この発明のひとBMP−６蛋白質は、第３表に示された
ヌクレオチド＃160〜ヌクレオチド＃1698を含むDNA配列
または実質的に似た配列により形質転換された細胞を培
養することにより製造され得る。アミノ酸＃382〜アミ
ノ酸＃513または実質的に似た配列を含むBMP−６蛋白質
を培養培地から回収し、分離し、精製する。

うしBMP−６蛋白質は、第２表に示されたヌクレオチ
ド＃361ないしヌクレオチド＃666を含む第１表に示され
た配置と同一または実質的に同じヌクレオチド配列を含
むDNAまたは実質的に似た配列により形質転換された細
胞を培養し、第２表に示されたアミノ酸＃121〜アミノ
酸＃222を含む蛋白質を、培養培地から回収および精製
することにより製造され得る。

この発明は、一群のBMP−７蛋白質を提供する。精製
ひとBMP−７蛋白質は、それらと共に生成される他の蛋
白質を実質的に含まない。ひとBMP−７蛋白質は、第５
表に示されたアミノ酸＃300〜アミノ酸＃431を含むアミ
ノ酸配列を特徴とする。このアミノ酸配列＃300〜＃431
は、第５表のヌクレオチド＃994〜ヌクレオチド＃1389
までのDNA配列によりコードされる。さらに、BMP−７蛋
白質は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド
・ゲル電気泳動（SDS−PAGE）により測定された28000−
30000ダルトンの見かけ上の分子量を特徴とし得る。SDS
−PAGEにおける還元条件下では，前記蛋白質は、約1400
0−20000ダルトンの分子量により電気泳動する。これら
の蛋白質は、軟骨および／または硬骨形成を刺激、促進
または他の形で誘導することができると考えられる。

この発明のひとBMP−７蛋白質は、ヌクレオチド＃97
〜ヌクレオチド＃1389を含む第５表に示されたヌクレオ
チド配列と同一または実質的に同じヌクレオチド配列を
含むDNA配列により形質転換された細胞を培養すること
により製造され得る。アミノ酸＃300〜アミノ酸＃431の
第５表に示された配列と同一または実質的に同じアミノ
酸配列を含むBMP−７蛋白質を、培養培地から回収し、
分離し、精製する。

さらにこの発明は、上記蛋白質を利用することによ
り、関連ひと蛋白質（複数も可）または他のほ乳類軟骨
および／または軟骨形成蛋白質（複数も可）を得る方法
を提供する。上記方法は、遺伝子工学技術分野における
熟練者には周知である。上記蛋白質を得るための一方法
では、ひとBMP−５、BMP−６およびBMP−７暗号化配列
またはその一部分を利用して、ひとゲノムおよび／また
はcDNAライブラリーを好くリーニングするためのプロー
ブを設計することにより、ひとゲノムおよび／またはcD
NA配列を分離する。当技術分野の範囲内に含まれる別の
方法では、この発明のうしおよびひとBMP蛋白質を用い
ることにより、他のほ乳類BMP軟骨および／または硬骨
形成蛋白質を得ることができる。

ヌクレオチド配列を同定した後、上記ヌクレオチド配
列により形質転換した細胞を培養することにより蛋白質
を製造する。この配列またはその一部分、厳密な条件下
でBMP−５、BMP−６またはBMP−７蛋白質のヌクレオチ
ド配列とハイブリダイゼーションし、軟骨および／また
は硬骨形成活性を呈する蛋白質をコードする。発現され
た蛋白質を培地培養から回収および精製する。精製BMP
蛋白質は、それらと共に生成される他の蛋白質性物質お
よび他の汚染物質を実質的に含まない。

BMP−５、BMP−６およびBMP−７蛋白質は、軟骨およ
び／または硬骨形成を促進、刺激または他の方法で誘導
する能力を特徴とし得る。さらに、これらの蛋白質の軟
骨および／または軟骨形成誘導能力は、後記ラット骨形
成検定で軟骨および／または硬骨形成活性を立証し得る
ことにより示され得ると考えられる。さらに、この発明
の蛋白質は、このラット骨形成検定において形成された
骨１グラム当たり10μｇ−500μｇの濃度で活性を示す
と考えられる。さらに具体的には、これらの蛋白質は、
原型または修正得点方法を用いた後記ラット骨形成検定
において蛋白質１μｇで少なくとも＋２のスコアが得ら
れることを特徴とし得ると考えられる。

この発明の別の態様は、医薬的に許容し得る賦形剤ま
たは担体中に治療有効量のBMP−５、BMP−６またはBMP
−７蛋白質を含む医薬組成物を提供する。さらに別の組
成物は、少なくとも１種のBMP−５、BMP−６またBMP−
７蛋白質を含む。従って、BMP−５、BMP−６およびBMP
−７蛋白質は互いに協調または恐らくは相乗的に作用し
得るため、上記組成物はこの発明の複数のBMP蛋白質を
含み得ると考えられる。この発明の組成物は、硬骨およ
び／または軟骨形成の誘導に使用される。これらの組成
物は、また、創傷治癒および組織修復に使用され得る。

この発明のさらに別の組成物は、この発明のBMP−
５、BMP−６またはBMP−７蛋白質の加えて、少なくとも
１種の他の治療上有用な薬剤、例えば共用所有の1988年
１月14日公開の国際公開WO88/00205および1989年11月２
日公開の国際公開WO89/10409に開示されたBMP−１、BMP
−２（これらはまた、過去にBMP−2A、BMP−２Ｉ類と
命名されている）、BMP−３およびBMP−４（これらはま
た、過去にBMP−2B、BMP−２ II類と命名されている）
と呼ばれる蛋白質を含み得る。他の治療上有用な薬剤と
しては、成長因子、例えば表皮成長因子（EGF）、線維
芽細胞成長因子（FGF）、腫よう増殖因子（TGF−αおよ
びTGF−β）および血小板由来増殖因子（PDGF）があ
る。

この発明の組成物また、例えば組成物の伝達および／
または支持を目的とし、および／または硬骨および／ま
たは軟骨形成用表面を提供する適当なマトリックスを含
み得る。上記マトリックスは、BMP蛋白質の緩慢な放出
および／またはこの発明のBMP蛋白質を呈するのに適当
な環境を提供し得る。

この発明の組成物は、若干の硬骨および／または軟骨
欠損および歯周病の処置方法で使用され得る。それらは
また、様々なタイプの創傷の処置および組織修復方法に
おいて使用され得る。この発明によると、これらの方法
は、上述の硬骨および／または軟骨形成、創傷治癒また
は組織修復を要する患者にこの発明の組成物を投与する
ことを必要とする。従って、この方法は、この発明の蛋
白質の治療有効量の投与を含む。また、これらの方法
は、この発明の蛋白質を上記共同所有出願で開示された
「BMP」蛋白質の少なくとも１種と連係的に投与するこ
とを含み得る。さらに、これらの方法はまた、EGF、FG
F、TGF−α、TGF−βおよびPDGFを含む他の成長因子と
共にこの発明の蛋白質を投与することを含み得る。

また、この発明のさらに別の態様は、この発明の蛋白
質の発現を暗号化するDNA配列である。上記配列は、第
１−５表に示された５´−３´方向のヌクレオチド配
列、または厳密な条件下で第１−５表のDNA配列とハイ
ブリダイゼーションするDNA配列を含み、軟骨および／
または軟骨形成誘導能力を示す蛋白質をコードする。上
記軟骨および／または硬骨形成は、後記ラット骨形成検
定で立証され得る。これらの蛋白質は、この検定におい
て形成される骨１グラム当たり10μｇ−500μｇの濃度
で活性を示し得ると考えられる。さらに詳しくは、これ
らの蛋白質は、ラット骨形成検定において蛋白質１μｇ
で少なくとも＋２のスコアを得る能力を示すと考えられ
る。最後に、第１−５表の配列の対立遺伝子または他の
変異型もまた、上記ヌクレオチド改編の結果ペプチド配
列が変化しようと否とに拘わらず、この発明に包含され
る。

この発明の別の態様は、発現制御配列と機能し得るよ
うに結合された上記DNA配列を含むベクターを提供す
る。これらのベクターは、この発明の蛋白質の新規製造
方法であって、発現制御配列と機能し得るように結合さ
れたこの発明の蛋白質の発現を指図するDNA配列により
形質転換されたセルラインを、適当な培養培地で培養
し、そこからこの発明の蛋白質を回収および精製する方
法において使用され得る。この主張されている方法は、
ポリペプチド発現用宿主細胞として、若干の原核生物お
よび真核生物の両既知細胞を使用し得る。回収されたBM
P蛋白質は、それらと共に生成される他の蛋白質性物質
および他の汚染物質からそれらを分離することにより精
製される。

下記の詳細な記載およびその好ましい実施態様を熟考
すれば、この発明の別の態様および利点は明白である。

発明の詳細な記載精製ひとBMP−５蛋白質は、第３表のDNA配列により形
質転換された宿主細胞を培養することにより製造され得
る。発現されたBMP−５蛋白質は、培養培地から分離お
よび精製された。精製ひとBMP−５蛋白質は、第３表に
示されたアミノ酸＃323〜＃454を含むアミノ酸配列を特
徴とすることが予想される。従って、この発明の精製BM
P−５ひと軟骨および／または硬骨蛋白質は、異種調節
制御配列と機能し得るように結合された、第３表に示さ
れたヌクレオチド＃699〜ヌクレオチド＃2060を含むDNA
配列または実質的に相同性の配列により形質転換された
宿主細胞を培養し、第３表に示されたアミノ酸＃323か
らアミノ酸＃454までのアミノ酸配列または実質的に相
同性の配列を含む蛋白質を培養倍力回収および精製する
ことにより製造される。

別の実施態様では、DNA配列は、アミノ酸＃323−＃45
4をコードするヌクレオチドを含む。従って、BMP−５蛋
白質は、異種調節制御配列と機能し得るように結合され
た、第３表に示されたヌクレオチド＃1665〜ヌクレオチ
ド＃2060を含むDNA配列または実質的に相同性の配列に
より形質転換された宿主細胞を培養し、第３表に示され
たアミノ酸＃323からアミノ酸＃454を含むアミノ酸配列
または実質的に相同性の配列を含む蛋白質を培養培地か
ら回収および精製することにより製造される。精製ひと
BMP−５蛋白質は、それらと共に生成される他の蛋白質
性物質および他の汚染物質を実質的に含まない。

この発明の精製BMP−５うし軟骨および／または硬骨
蛋白質は、第１表に示されたヌクレオチド＃８〜ヌクレ
オチド＃578までのDNA配列または実質的に相同性の配列
により形質転換された宿主細胞を培養し、第１表に示さ
れたアミノ酸＃９からアミノ酸＃140を含むアミノ酸配
列または実質的に相同性の配列を含む蛋白質を培養培地
から回収および精製することにより製造される。精製BM
P−５うし蛋白質およびこの発明のBMP蛋白質は全て、そ
れらと共に生成される他の蛋白質性物質及び他の汚染物
質を実質的に含まない。

精製ひとBMP−６蛋白質は、第４表のDNA配列により形
質転換された宿主細胞を培養することにより製造され得
る。発現された蛋白質は、培養培地から分離および精製
される。この発明の精製ひとBMP−６蛋白質は、第４表
に示されたアミノ酸＃382〜＃513を含むアミノ酸配列を
特徴とすることが予想される。従って、この発明のこれ
らの精製BMP−６ひと軟骨／硬骨蛋白質は、異種調節制
御配列と機能し得るように結合された、第４表に示され
たヌクレオチド＃160〜ヌクレオチド＃1698を含むDNA配
列または実質的に相同性の配列により形質転換された宿
主細胞を培養し、第４表に示されたアミノ酸＃382から
アミノ酸＃513までのアミノ酸配列または実質的に相同
性の配列を含む蛋白質を培養培地から回収、分離および
精製することにより製造される。

別の実施態様は、アミノ酸＃382−＃513をコードする
ヌクレオチドを含むDNA配列を利用し得る。従って、精
製ひとBNP−６蛋白質は、異種調節制御配列と機能し得
るように結合された、第４表に示されたヌクレオチド＃
1303〜ヌクレオチド＃1698を含むDNA配列または実質的
に相同性の配列により形質転換された宿主細胞を培養
し、第４表に示されたアミノ酸＃382からアミノ酸＃513
を含むアミノ酸配列または実質的に相同性の配列を含む
蛋白質を培地培養から回収および精製することにより製
造され得る。精製ひとBMP−６蛋白質は、それらと共に
生成される他の蛋白質性物質および他の汚染物質を実質
的に含まない。

この発明の精製BMP−６うし軟骨／硬骨蛋白質は、第
２表に示されたヌクレオチド＃361〜ヌクレオチド＃666
を含むDNA配列または実質的に相同性の配列により形質
転換された宿主細胞を培養し、第２表に示されたアミノ
酸＃121からアミノ酸＃222を含むアミノ酸配列または実
質的に相同性の配列を含む蛋白質を培養培地から回収す
ることにより製造される。別の実施態様では、うし蛋白
質は、第２表のヌクレオチド＃289〜＃666を含む配列に
より形質転換された宿主細胞を培養し、アミノ酸＃97〜
アミノ酸＃222を含む蛋白質を回収および精製すること
により製造される。精製BMP−６うし蛋白質は、それら
と共に生成される他の蛋白質性物質および他の汚染物質
を実質的に含まない。

精製ひとBMP−７蛋白質は、第５表のDNA配列により形
質転換された宿主細胞を培養することにより製造され得
る。発現された蛋白質は、培養培地から分離および精製
される。精製ひとBMP−７蛋白質は、第５表に示された
アミノ酸＃300〜＃431を含むアミノ酸配列を特徴とする
ことが予想される。従って、この発明のこれらの精製BM
P−７ひと軟骨／硬骨蛋白質は、異種調整制御配列と機
能し得るように結合された、第５表に示されたヌクレオ
チド＃97〜ヌクレオチド＃1389を含むDNA配列または実
質的に相同性の配列により形質転換された宿主細胞を培
養し、第５表に示されたアミノ酸＃300からアミノ酸＃4
31までのアミノ酸配列または実質的に相同性の配列を含
む蛋白質を培養培地から回収、分離および精製すること
により製造される。

別の実施態様は、アミノ酸＃300−＃431をコードする
ヌクレオチドを含むDNA配列を利用し得る。精製BMP−７
蛋白質は、異種調整制御配列と機能し得るように結合さ
れた、第５表に示されたヌクレオチド＃994〜＃1389を
含むDNA配列または実質的に相同性の配列により形質転
換された宿主細胞を培養し、第５表に示されたアミノ酸
＃300からアミノ酸＃431を含むアミノ酸配列または実質
的に相同性の配列を含む蛋白質を培養培地から回収およ
び精製することにより製造され得る。精製ひとBMP−７
蛋白質は、それらと共に生成される他の蛋白質性物質お
よび他の汚染物質を実質的に含まない。

さらにBMP−５、BMP−６およびBMP−７蛋白質は、軟
骨および／または硬骨形成活性を示す能力を特徴とし得
る。この活性は、例えば実施例３記載のラット骨形成検
定において立証され得る。さらに、これらの蛋白質は、
検定において形成される骨１グラム当たり10μｇ−500
lgの濃度で活性を示すと考えられる。さらにこれらの
蛋白質は、さらに詳しく後述されている原型または修正
得点方法を用いたこの検定において１μｇで少なくとも
＋２のスコアを得る能力を特徴とし得る。

さらにBMP−５、BMP−６およびBMP−７蛋白質は、ド
デシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気
泳動（SDS−PAGE）により測定された28000−30000ダル
トンの見かけ上の分子量を特徴とし得る。SDS−PAGEに
おける還元条件下では、上記蛋白質は約14000−20000ダ
ルトンの分子量により電気泳動する。

また、この明細書で規定する蛋白質は、第１−５表の
配列と似ているが、天然になされて（例、ポリペプチド
においてアミノ酸変化を生じさせ得るヌクレオチド配列
の対立遺伝子変異型）または故意に操作されて修飾が加
えられた配列によりコードされる因子を含む。同様に、
第１−５表のアミノ酸残基の連続配列を全体的または部
分的に複製する合成ポリペプチドもこの発明に包含され
る。これらの配列は、この発明の他の軟骨／硬骨蛋白質
と１次、２次または３次構造および立体配座特性を共有
することにより、それらと共通した硬骨および／または
軟骨成長因子生物特性を有し得る。すなわち、それら
は、治療プロセスにおいて天然蛋白質に代わる生物活性
代用物として使用され得る。

この明細書に記載されているこの発明の蛋白質の配列
の他の特異的突然変異としては、グリコシル化部位の修
飾がある。これらの修飾は、Ｏ−結合またはＮ−結合グ
リコシル化部位を含み得る。例えば、グリコシル化の非
存在または一部のみのグリコシル化は、第１−５表に示
された通り、この発明の蛋白質の配列に存在するアルパ
ラギン結合グリコシル認識部位におけるアミノ酸置換ま
たは欠失によるものである。アスパラギン−結合グリコ
シル化認識部位は、適当な細胞性グリコシル化酵素によ
り特異的に認識されるトリペプチド配列を含む。これら
のトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−トレオニン
またはアスパラギン−Ｘ−セリン（ただし、Ｘは通常任
意のアミノ酸である）である。グリコシル化認識部位の
第１または第３のアミノ酸位置の一方または両方におけ
る様々なアミノ酸置換または欠失（および／または第２
位におけるアミノ酸欠失）の結果、修飾されたトリペプ
チド配列が非グリコシル化される。その改編されたヌク
レオチド配列の発現により、その部位がグリコシル化さ
れていない変異体が生成される。

この発明はまた、他の蛋白性質物質をコードするDNA
配列の随伴がなく、この発明の蛋白質の発現をコードす
る新規DNA配列を包含する。これらのDNA配列は、第１−
５表において５´−３´方向に描かれた配列を含む。さ
らに、厳密なハイブリダイゼーション条件下［T.マニア
チス等、「モレキュラー・クローニング（ア・ラボラト
リー・マニュアル）」、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー（1982）、387−389頁参照］、第１−
５表のDNA配列とハイブリダイゼーションし、ラット骨
形成検定において軟骨および／または硬骨形成活性を立
証する配列が含まれる。上記の厳密な一ハイブリダイゼ
ーション条件の一例は、［６〜４×SCC中65℃でのハイ
ブリダイゼーションであり、次いで0.1×SCC中65℃で１
時間洗浄を行う。別法として、典型的な厳密なハイブリ
ダイゼーション条件は、50％ホルムアミド中、４×SC
C、42℃である。

同様に、第１−５表の配列によりコードされる蛋白質
に似た蛋白質をコードするが、遺伝子コードの同義性ま
たは対立遺伝子変異（アミノ酸変化を生じる場合も生じ
ない場合もあり得る種集団における天然塩基改編）故に
コドン配列が異なるDNA配列もまた、この明細書に記載
されているこの発明の蛋白質をコードする。活性、半減
期またはコードされるポリペプチドの生産性を高めるた
めの点突然変異または誘導性修飾（挿入、欠失および置
換を含む）に起因する第１−５表のDNA配列における変
異型もまた、この発明に包含される。

別の態様において、この発明は、関連ひと蛋白質また
は他のほ乳類 BMP−５、BMP−６およびBMP−７蛋白質
を得る方法を提供する。上記蛋白質を得る一方法では、
例えば、この明細書で開示されているひとBMP−５、BMP
−６およびBMP−７暗号化配列を利用することにより、
ひと遺伝子またはそのフラグメントに関して標準技術を
用いてひとゲノム・ライブラリーを厳密に調べる。ま
た、こうして同定された配列をプローブとして使用する
ことにより、類似軟骨／硬骨蛋白質を合成するひとセル
ラインまたは組織を同定することができる。cDNAライブ
ラリーを合成し、ひとまたはうし暗号化配列から誘導さ
れたプローブによりスクリーニングする。こうして同定
されたひと配列を宿主細胞に形質転換し、宿主細胞を培
養し、培養培地から蛋白質を回収、分離および精製す
る。精製蛋白質は、実施例３のラット骨形成検定におい
て軟骨および／または硬骨形成活性を呈することが予想
される。

この発明の別の態様は、この発明のBMP−５、BMP−６
およびBMP−７蛋白質の新規製造方法を提供する。この
発明の方法は、既知調節配列の制御下、この発明の蛋白
質の発現をコードする上記DNA配列により形質転換され
た適当な細胞またはセルラインを培養することを含む。
調節配列は、プロモーター・フラグメント・ターミネー
ター・フラグメントおよび適当な宿主細胞において蛋白
質の発現を指示する他の適当な配列を含む。適当なセル
ラインを培養する方法は、当業界の技術範囲内に含まれ
る。形質転換細胞を培養し、それにより発現されたBMP
蛋白質を、当業界の熟練者に周知の精製技術を用いて培
養培地から回収し、分離し、精製する。精製BMP蛋白質
は、それらと共に生成される他の蛋白質性物質および他
の汚染物質を実質的に含まない。この発明の精製BMP蛋
白質は、この発明の蛋白質と天然で共存する物質を実質
的に含まない。

適当な細胞またはセルラインは、ほ乳類細胞、例えば
チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（CHO）であり得
る。適当なほ乳類宿主細胞の選択並びに形質転換、培
養、増幅、スクリーニングおよび産物の製造および精製
の方法は、当業界において公知である。例えば、ゲシン
グおよびサムブルック、「ネイチャー」、293:620−625
（1981）、または別法として、カウフマン等、Mol.Cel
l.Biol.、５（７）:1750−1759（1985）またはハウリー
等、アメリカ合衆国特許4419446号参照。他の適当なほ
乳類セルラインには、さるCOS−１セルラインおよびCV
−１セルラインがあるが、これらに限定はされない。

細菌細胞もまた適当な宿主であり得る。例えば、エシ
ェリヒア・コリの様々な株（例、HB101、MC1061）は、
バイオテクノロジー分野における宿主細胞としてよく知
られている。また、バチシルス・スブチリス・シュード
モナス、他の細菌などの様々な株もこの方法で使用され
得る。

当業界の熟練者に周知の酵母細胞の多くの株もまた、
この発明のポリペプチド発現用宿主細胞として利用可能
であり得る。さらに、所望ならば、昆虫細胞が、この発
明の方法における宿主細胞として利用され得る。例え
ば、ミラー等、「ジュネティック・エンジニアリン
グ」、8:277−298（プレナム・プレス1986）およびそこ
に引用されている参考文献参照。

この発明の別の態様は、この発明の蛋白質発現方法で
使用されるベクターを提供する。前記ベクターは、この
発明のBMP−５、BMP−６およびBMP−７蛋白質をコード
する新規DNA配列を含む。さらに、前記ベクターはま
た、蛋白質配列の発現を可能にする適当な発現制御配列
を含む。別法として、上述の切頭または修飾配列が組み
込まれたベクターはまた、この発明の実施態様であり、
この発明の蛋白質の製造に有用である。前記ベクター
は、セルラインを形質転換する方法で使用され得、選択
された宿主細胞における複製および発現を指示し得るこ
の発明のDNA暗号化配列を機能し得るように随伴した選
択された調節配列を含み得る。前記ベクターに有用な調
節配列は、当業界の熟練者に周知であり、選ばれた宿主
細胞により選択され得る。前記選択は常用の手順で行な
われ、この発明の一部を形成するものではない。BMP−
５、BMP−６およびBMP−７蛋白質の製造に使用される前
記ベクターにより形質転換された宿主細胞およびその子
孫もまた、この発明により提供される。

当業界に精通しておれば、この発明のDNA配列および
既知ベクター、例えばpCD［岡山等、Mol.Cell.Biol.、
2:161−170（1982）］およびpJL3、pJL4［ガフ等、EMBO
ジャーナル、4:645:−653（1985）］の使用によるほ乳
類発言ベクターの構築は可能である。同様に当業界の熟
練者であれば、暗号化配列に近接するほ乳類調節配列を
削除または細菌配列と置き換えこの発明の配列を操作す
ることにより、細菌細胞による細胞内または細胞外発現
用細菌ベクターを作成することができる。例えば、前記
暗号化配列はさらに操作され得る（例、他の既知リンカ
ーに結合または非暗号化配列をそこから欠失させるか、
または他の既知技術によりそこに存在するヌクレオチド
を改編することによる修飾）。次いで、修飾された暗号
化配列は、例えばT.谷口等、「プロシーディングス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシー
ズ・オブ・ザ・ユー・エス・エー」、77:5230−5233（1
980）に記載された方法を用いて既知細菌ベクターに挿
入され得る。次いで、この例証的細菌ベクターは、細菌
宿主細胞に形質転換され、それによりこの発明の蛋白質
が発現され得る。細菌細胞におけるこの発明の軟骨およ
び／または硬骨蛋白質の細胞外発現を行うための戦略に
ついては、例えばヨーロッパ特許出願EPA177343参照。

同様の操作は、昆虫細胞での発現を目的とする昆虫ベ
クター［例えば公開されたヨーロッパ特許出願155476号
に記載された方法参照］の構築についても実施され得
る。また、酵母ベクターは、酵母細胞によるこの発明の
因子の細胞内または細胞外発現用酵母調節配列を用いて
構築され得る。［例、公開されたPCT出願WO86/00639お
よびヨーロッパ特許出願EPA123289に記載された方法参
照］。

ほ乳類細胞からこの発明の蛋白質を高レベルで製造す
る方法は、この発明の蛋白質をコードする異種遺伝子の
多数のコピーを含む細胞の構築を必要とする。異種遺伝
子は、カウフマンおよびシャープ、「ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー」、159:60 １−629（1
982）の方法に従い、増幅可能なマーカー、例えば、そ
れによって多数の遺伝子コピーを含む細胞が増加濃度の
メトトレキセイト（MTX）における伸長用に選択され得
るジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子に結合され得
る。この方法は、若干の異なる細胞タイプにより使用さ
れ得る。

例えば、発現を可能にする他のプラスミド配列を機能
し得るように随伴したこの発明の蛋白質のDNA配列を含
むプラスミドおよびDHFR発現プラスミドpAdA26SV（Ａ）
３「カウフマンおよび♯、Mol.Cell.Biol.、2:1304（19
82）」は、燐酸カルシウム共沈澱およびトランスフェク
ション、電気操作またはプロトプラスト融合により、DH
FR欠失CHO細胞、DUKX−B IIへ共に導入され得る。カウ
フマン等、Mol.Cell.Biol.、5:1750（1983）の記載に従
い、DHFR発現形質転換体を、透析した胎児牛血清を含む
アルファ培地における生長について選択し、続いて増加
濃度のMTX（0.02、0.2、1.0、および５μＭ MTXにおけ
る一連の段階）中での生長による増幅について選択す
る。蛋白質発現は、MTX耐性のレベル増加に従い増すべ
きである。

形質転換体をクローン化し、培養培地からこの発明の
蛋白質を回収し、分離し、精製する。発現された蛋白質
の特性検定は、標準技術を用いて実施され得る。例え
ば、特性検定には、［₃₅S］メチオニンまたはシステイ
ンによるパルス標識、またはポリアクリルアミド・ゲル
電気泳動が含まれ得る。実施例３における上記ローゼン
−修飾サンパス−レディ・ラット骨形成検定により生物
活性蛋白質発現をモニターする。似た方法に従うことに
より、他の関連蛋白質も製造され得る。

この発明の蛋白質は、硬骨および／または軟骨が正常
に形成されていない環境において軟骨および／または硬
骨形成を誘導するため、ひとおよび他の動物における骨
折および軟骨欠損の治療適用性を有する。この発明の蛋
白質を用いた製剤は、閉鎖および複雑骨折の縮小並びに
人工関節の固定改良における予防的用途を有し得る。骨
形成剤により誘導される新たな骨形成は、先天的、外傷
誘発性または腫よう切除による頭蓋および顔面欠損の修
復に貢献し、また美容形成手術にも有用である。この発
明の蛋白質は、歯周病の処置および他の歯科修復方法に
おいて使用され得る。上記薬剤は、骨形成細胞を誘引
し、骨形成細胞の生長を刺激し、または骨形成細胞の原
種の分化を誘導するための環境を提供し得る。これまで
に様々な骨形成、軟骨誘導および硬骨誘導因子が記載さ
れている。それらの検討については、例えば、ヨーロッ
パ特許出願148155および169016参照。

この発明の蛋白質はまた、創傷治癒および関連組織修
復において使用され得る。創傷のタイプには、火傷、切
り傷および潰ようがあるが、これらに限定されない。創
傷治癒および関連組織修復の検討については、例えば、
PCT公開WO84/01106参照。

この発明の別の態様は、骨折および硬骨および／また
は軟骨欠損または歯周病に関連した他の状態を修復する
ための治療方法および組成物を含む。さらに、この発明
は、創傷治癒および組織修復を目的とする治療方法およ
び組成物を含む。上記組成物は、この発明のBMP蛋白
質、BMP−５、BMP−６およびBMP−７の少なくとも１種
の治療有効量を、医薬的に許容し得る賦形剤、担体また
はマトリックスと混合した形で含む。

この発明の蛋白質は、互いにまたは他の関連蛋白質お
よび成長因子と協調して、または恐らくは相乗的に作用
し得ると予想される。従って、この発明の治療方法およ
び組成物は、この発明の蛋白質の１種またはそれ以上を
含む。従って、この発明のさらに別の治療方法および組
成物は、この発明の少なくとも１種の蛋白質の治療有効
量を上述した共同所有の公開国際出願WO88/00205および
WO89/10409に開示された他の「BMP」蛋白質BMP−１、BM
P−２、BMP−３およびBMP−４の少なくとも１種の治療
有効量と共に含む。この発明の上記方法および組成物
は、上述の「BMP」蛋白質またはその一部分と組み合わ
せた形でこの発明の蛋白質またはその一部分を含み得
る。

上記組み合わせ剤は、蛋白質の個々の独立した分子ま
たはヘテロ分子、例えば各蛋白質の一部分により形成さ
れたヘテロダイマーを含み得る。例えば、この発明の方
法および組成物は、この発明のBMP蛋白質またはその一
部分が別の「BMP」蛋白質の一部分と結合して形成され
たヘテロ分子を含み得る。

この発明のさらに別の治療方法および組成物は、この
発明の蛋白質またはその一部分を、問題の硬骨および／
または軟骨欠損、創傷または組織の処置に有益な他の薬
剤と組み合わせた形で含む。これらの薬剤には、様々な
成長因子、例えば表皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成
長因子（FGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、腫よう
増殖因子（TGF−αおよびTGF−β）、Ｋ−線維芽細胞成
長因子（KFGF）、副甲状腺ホルモン（PTH）、白血病阻
害因子（LIF/HILDA、DIA）およびインシュリン様成長因
子（IGF−ＩおよびIGF−II）が含まれる。これらの薬剤
の一部分もまた、この発明の組成物中で使用され得る。

pH、等張性、安定性などを充分考慮した上で生理学的
に許容し得る蛋白質組成物の製品および製剤は、当業界
の技術範囲内に含まれる。また、上記治療用組成物は、
軟骨および硬骨成長因子蛋白質における種特異性が見た
ところ欠如しているため、目下獣医学的適用についても
貴重である。ひとに加えて家畜および純血馬は、この発
明の蛋白質による上記処置に望ましい患者である。

上記治療方法は、組成物を局所的、全身的またはイン
プラントもしくは装置として局部的に投与することを含
む。投与時、この発明で使用される治療組成物は、勿
論、発熱物質を含まず、生理学的に許容し得る形態であ
る。さらに、上記組成物は、望ましくは軟骨および／ま
たは硬骨または組織傷害部位への送達に適した粘ちゅう
性形態で封入または注射され得る。局所投与は、創傷治
癒および組織修復に好適であり得る。

好ましくは、硬骨および／または軟骨形成を目的とす
る場合、上記組成物は、この発明のBMP蛋白質を硬骨お
よび／または軟骨損傷部位に送達し、硬骨および軟骨発
生用の構造を提供し得、また最適には体内へ吸収され得
るマトリックスを含み得る。上記マトリックスは、BMP
蛋白質または組成物を含む他の因子をゆっくりと放出さ
せ得る。上記マトリックスは、他の内植による医学適用
法において現在使用されている材料で形成され得る。

マトリックス材料は、生物学的適合性、生物分解性、
機械的特性、外見上の体裁および界面特性に基づいて選
択される。この発明の組成物の特別な適用性により、適
当な製剤が規定される。組成物に使用可能なマトリック
スは、生物分解性で化学的に規定された硫酸カルシウ
ム、燐酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ酪
酸およびポリ無水物であり得る。他の可能な材料は、生
物分解性で生物学的に充分定義された、例えば骨または
皮膚コラーゲンである。さらに別のマトリックスは、純
粋な蛋白質または細胞外マトリックス成分により構成さ
れる。他の可能なマトリックスは、非生物分解性で化学
的に定義された例えば焼結ヒドロキシアパタイト、生体
ガラス、アルミン酸塩または他のセラミックである。マ
トリックスは、上記タイプの材料のいずれかの組み合わ
せ、例えばポリ酪酸およびヒドロキシアパタイトまたは
コラーゲンおよび燐酸三カルシウムにより構成され得
る。生体セラミックは、組成物、例えばカルシウム−ア
ルミナート−ホスフェートにおいて改変され得、そして
加工処理によって孔のサイズ、粒子サイズ、粒子形状お
よび生物分解性が改変され得る。

投与体制は、この発明の蛋白質の作用を修飾する様々
な因子を考慮した上で担当医により決定される。この発
明の蛋白質の作用を修飾し得る因子には、形成が望まれ
る骨の重量、骨損傷の部位、損傷骨の状態、傷のサイ
ズ、損傷組織のタイプ、患者の年齢、性別および食餌療
法、感染がある場合にはその重さ、投与の時間および他
の臨床的因子がある。用量は、再構成で使用されるマト
リックスのタイプおよび組成物中に存在する硬骨および
／または軟骨蛋白質のタイプにより変動し得る。また、
最終組成物への他の既知成長因子、例えばEGF、PDGF、T
GF−α、TGF−β並びにIGF−ＩおよびIGF−IIの添加
も、用量に影響を与え得る。

軟骨および／または硬骨の成長および／または修復の
定期的評価により、進行状況をモニターすることができ
る。たとえば、ｘ−線、組織形態計測測定法およびテト
ラサイクリン標識を用いて推移をモニターすることがで
きる。

以下、実施例により、この発明のうし軟骨および／ま
たは硬骨蛋白質の回収および特定検定およびこれらの蛋
白質の使用による対応するひと蛋白質（複数も可）の回
収並びに組換え技術による前記蛋白質の発現におけるこ
の発明の実践方法を説明する。

実施例Ｉ牛の軟骨／骨誘導蛋白の単離 M.R.ウリスト等、プロシーディングス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ユ
ーエスエイ第70巻:3511頁（1973）の方法に従い、下記
のように幾つかの抽出工程を割愛して、粉砕牛骨粉末
（20〜120メッシュ、ヘリトレックス）を調節する。こ
の粉砕した粉末10kgを、激しく撹拌しながら4 1/2Cで48
時間0.6NHClの連続的変化に付して脱ミネラル化する。
得られた懸濁液を4Cで50の2MCaCl₂およびエチレンジ
アミン四酢酸（EDTA）10mMで16時間抽出し、次いで0.5M
EDTA50中で４時間抽出する。残留物を蒸留水で３回洗
浄した後、クリニカル・オーソペディックス・アンド・
リレイテッド・リサーチ第171巻:213頁（1982）に記載
のように、4M塩酸グアニジン（GuCl）20、20mMトリス
（pH7.4）、1mMN−エチルマレイミド、1mMヨードアセト
アミド、1mMフッ化フェニルメエチルスルホニルに再懸
濁する。16〜20時間後に上清を取り除き、さらに、10
のGuCl緩衝液中に移す。残留物をさらに24時間抽出す
る。粗GuCl抽出物を合し、10000分子量遮断膜を付けた
ペリコン装置でおよそ20倍に濃縮し、次いで50mMトリ
ス、0.1MNaCl、6M尿素（pH7.2）、最初のカラムの始発
緩衝液で透析する。長時間の透析の後、蛋白を４DEAE
セルロースカラムにロードし、非結合分画を集める。

非結合分画を濃縮し、6M尿素中の50mMNaAC、50mMNaCl
（pH4.6）に対して透析する。この非結合分画をカルボ
キシメチルセルローカラムに適用する。カラムに結合し
なかった蛋白を始発緩衝液でよく洗浄することにより除
去し、ローゼン改良サンパス−レディ検定（下の実施例
IIIに記載）により測定される骨および／または軟骨形
成活性を有する淡白をふくむ物質を、50mMNaAc、0.25mM
NaCl、6M尿素（pH4.6）によりカラムから脱着する。こ
の段階的溶出から得られた蛋白を20〜40倍に濃縮し、次
いで80mMKPO₄、6M尿素（pH6.0）で５倍に希釈する。こ
の溶液のpHを500mMK₂PO₄で6.0に調節する。この試料を8
0mMKPO₄6M尿素（pH6.0）で平衡に達したヒドロキシアパ
タイトカラム（LKB）に適用し、同緩衝液でカラムを洗
浄することにより全ての非結合蛋白を除去する。骨およ
び／または軟骨形成活性を有する蛋白を100mMKPO₄（pH
7.4）および6M尿素で溶出する。

この蛋白をおよそ10倍に濃縮し、個体NaClを最終濃度
0.15Mとなるまで加える。この物質を、50mMKPO₄、50mMN
aCl、6M尿素（pH7.4）で平衡に達したヘパリン−セファ
ロースカラムに適用する。カラムを始発緩衝液で良く洗
浄した後、骨および／または軟骨誘導活性を有する蛋白
を50mMKPO₄、700mMNaCl、6M尿素（pH7.4）によって溶出
する。この分画を最小容量まで濃縮し、0.4mlの等分試
料を、4MGuCl、20mMトリス（pH7.2）で平衡させたスー
パーローズ６およびスーパーローズ12カラムを連続接続
したものに適用し、カラムを流速0.25ml/分で展開す
る。骨および／または軟骨揺動活性を示す蛋白はおよそ
30000ダルトンの蛋白に相当する。

スーパーローズカラムからの上記分画をプールし、50
mMNaAc、6M尿素（pH4.6）に対して透析し、ファーマシ
ア・モノＳ HRカラムに適用する。このカラムを1.0MNa
Cl、50mMNaAc、6M尿素（pH4.6）への勾配にて展開す
る。活性な骨および／または軟骨形成分画をプールす
る。この物質を0.1％TFA中で0.46×25cmのヴィダックC4
カラムに適用し、90％アセトニトリル、0.1％TFAへの勾
配によってカラムを展開する（1ml/分で60分間のうちに
31.5％アセトニトリル、0.1％TFAから49.5％アセトニト
リル、0.1％TFAに至る）。活性物質はおよそ40〜44％ア
セトニトリルの時点で溶出する。分画を軟骨および／ま
たは骨形成活性について検定する。活性物質をモノＱカ
ラムでさらに分画する。この蛋白を6M尿素、25mMジエタ
ノールアミン（pH8.6）に対して透析し、次に0.5×5cn
モノＱカラム（ファーマシア）に適用し、6M尿素、25mM
ジエタノールアミン（pH8.6）および0.5MNaCl、6M尿
素、25mMジエタノールアミン（pH8.6）の勾配にて展開
する。分画を10％トリフルオロ酢酸（TFA）でpH3.0にす
る。適当な分画の等分試料を以下の方法のうちの１つに
よってヨウ素化する:P.J.マコーネイ等インターナショ
ナル・アーカイブス・オブ・アレルギー第29巻:185〜18
9頁（1966）;A.E.ボルトン等、Biochem J.第133巻:529
頁（1973）；およびD.F.ボーエン−ポープ、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第237巻:5161頁
（1982）。これらの分画に存在するヨウ素化された蛋白
をSDSゲル電気泳動により分析する。

実施例II 牛の軟骨／骨誘導因子の特性決定 A.分子量 6M尿素、25mMジエタノールアミン（pH8.6）、およそ
0.3MのNaCl中の実施例Ｉ由来の蛋白およそ５μｇをSDS
に関して0.1％とし、50mMトリス/HCl0.1％SDS（pH7.5）
に対して16時間透析する。次いで透析した物質を、少量
のI¹²⁵標識対応物とともに透析膜で電気泳動的に濃縮す
る〔フンカピラー等、メソッズ・イン・エンチモロジー
第91巻:227〜236頁（1983）〕。この物質（容量はおよ
そ100μｌ）を12％ポリアクリルアミドゲルにロードし
ジチオトレイトールで試料を還元することなくSDS−PAG
Eに付す〔ラムリ、U.K.ネイチュア、第227巻:680〜685
ページ（1970）〕。予め染色した分子量標準（ベセスダ
・リサーチ・ラブズ）に比較した分子量を決定する。固
定していないゲルのオートラジオグラフィーの後、およ
そ28000〜30000ダルトンのバンドを削り取り、蛋白を電
気泳動的にゲルから溶出する（フンカピラー等、上
記）。骨および／または軟骨活性が28000〜30000の領域
に見いだされるとする、上記同時出願の「BMP」出願に
記載の類似の精製骨分画を根拠とすると、このバンドが
骨および／または軟骨誘導分画を含むことが推論され
る。

B.サブユニットの特性決定単離された牛骨蛋白のサブユニットの組成もまた決定
される。上記の溶出した蛋白を完全に還元し、ヨウドア
セタートおよび標準的方法を用いて２％SDS中でアルキ
ル化し、電気泳動パッキング（packing）により再濃縮
する。次に、完全に還元されたアルキル化された試料を
さらに12％ゲル上のSDS−PAGEに付し、二重線の様相を
有する得られたおよそ14000〜20000ダルトンの領域を、
非固定ゲルのオートラジオグラフィーにより位置決定す
る。したがって、この28000〜30000領域に残る。微弱な
バンドが28000〜30000領域に入る。したがって、この28
000〜30000ダルトンの蛋白が14000〜20000の広い領域を
生成するか、さもなければこれはおよそ14000〜16000お
よび16000〜20000ダルトンの２個の広いバンドを含むと
いうふうに解釈および表現をすることもできる。

実施例III ローゼン改良サンパス−レディ検定サンパスおよびレディ、プロシーディングス・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オ
ブ・ユーエスエイ第80巻:6591〜6595頁（1983）に記載
のラット骨形成検定の改良法を、本発明に係る蛋白の骨
および／または軟骨活性の評価に使用する。この改良検
定を本明細書中のローゼン改良サンパス−レディ検定と
称する。サンパス−レディ法のエタノール沈澱工程を、
検定されるべき分画の水に対する透析（組成物が溶液の
場合）または透析濾過（組成物が懸濁液の場合）に置き
換える。溶液または懸濁液を次いで0.1％TFAに再溶解
し、得られる溶液をラットのマトリックス20mgに添加す
る。この蛋白で処理していない偽のラットマトリックス
試料を対照として用いる。この物質を凍結し凍結乾燥し
て得られる粉末を＃５のゼラチンカプセルに封入する。
カプセルを、21〜49日令の雄ロングエヴァンスラットの
腹胸部位の皮下に植え付ける。移植物は７〜14日後に除
去する。各移植物の半分をアルカリホスファターゼ分析
［A.H.レディ等、プロシーディングス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ第69巻:1601
頁（1972）参照］に使用する。

各移植物の他の半分は固定し、組織学的分析用に加工
する。グリコールメタアクリレート切片（１μｍ）をフ
ォン・コッサおよび酸フスチンまたはトルイジン・ブル
ーで染色し、各移植物中に存在する誘導された骨および
軟骨の形成量を評点付ける。＋１から＋５までの語は、
移植物の各組織学的切片の領域が新しい骨および／また
は軟骨細胞ならびに新しく形成された骨およびマトリッ
クスで占められていたことを表わす。２種類の評点法を
っここに記載する。第１の評点法の場合、評点＋５は移
植物の50％以上がこの移植物内の蛋白の直接結果として
生成された新しい骨および／または軟骨であることを示
す。評点＋４、＋３、＋２および＋１は各々移植物の40
％、30％、20％および10％以上が新しい軟骨および／ま
たは骨を含んでいることを示す。第２の評点法（これ以
降、改良評点法と称する）は以下の通りである：各移植
物からの隣接していない３個の切片を評価し平均する。
「＋／−」は軟骨または骨の不確かな固定を示し、「＋
１」は各切片の＞10％が新しい軟骨または骨であること
を示し、「＋２」は＞25％、「＋３」は＞50％、「＋
４」は〜75％、「＋５」は＞80％を示す。個々の移植物
の評点を、検定の変化性を表わすために表にする。

マトリックス試料中の試料を含む軟骨および／または
骨誘導性蛋白の用量反応特性は、形成される骨および／
または軟骨の量は、試料中の軟骨／骨誘導性蛋白の量と
共に増加することを示すという事が考えられる。対照試
料は骨および／または軟骨形成を全くもたらさないとい
うことが考えられる。

上記「BMP」蛋白のような他の軟骨および／または骨
誘導性蛋白と同様に、形成された骨および／または軟骨
は、マトリックスの占める空間に物理的に閉じ込められ
ると予想される。試料はさらにSDSゲル電気泳動および
等電点電気泳動、引き続きオートラジオグラフィーによ
る分析も行なう。活性は蛋白のバンド行なうp Iと相関
がある。特定の分画における蛋白の純度を評価するた
め、吸光係数10D/mg/cmを蛋白の評価基準として使用
し、この蛋白をSDS−PAGE、引き続き銀染色または放射
ヨウ素化行なうオートラジオグラフィーにかける。

実施例IV A.牛の蛋白組成実施令II Bに記載したおよそ14000〜20000ダルトン領
域のゲル薄片を標準的方法を用いてメタノール−酢酸−
水で固定し、水で短時間すすぎ、次いで0.1M重炭酸アン
モニウムで中和する。このゲル薄片をかみそりの刃でさ
いの目に切った後、TPCK処理トリプシン（ワーシングト
ン）0.2μｇを加えゲルを摂氏37度で16時間インキュベ
ートすることにより、蛋白をゲルマトリックスから消化
する。次いで、得られた消化物をC4ヴィダックRPHPLCカ
ラムおよび0.1％TFA−水、0.1％TFA、水−アセトニトリ
ルの勾配を用いるRPHPLCに付す。得られたペプチドのピ
ークを214および280nmのUV吸収により監視し、アプライ
ド・バイオシステムズの気相シークエネーター（モデル
470A）を用いる直接網の末端アミノ酸配列解析に付す。
標準的な３文字記号によってアミノ酸を表現するとき以
下のようなアミノ酸配列を有する１個のトリプシン分解
によるフラグメントを標準的方法によって単離する。こ
の配列中、「Xaa」は未知のアミノ酸であり、かっこ内
のアミノ酸はその配列における不確実性を示す： Xaa−His−Glu−Leu−Tyr−Val−Ser−Phe−（Ser）以下の４個のオリゴヌクレオチドプローブを上で固定
されたトリプシン分解によるフラグメントのアミノ酸配
列に基づいて設計し、自動DNA合成機で合成する。

プローブ＃1:GTRCTYGANATRCANTC プローブ＃2:GTRCTYGANATRCANAG プローブ＃3:GTRCTYAAYATRCANTC プローブ＃4:GTRCTYAAYATRCANAG 上に規定されたプローブにおいて標準的ヌクレオチド
記号は以下の通りである:A、アデノシン;C、シトシン;
G、グアニン;T、チミン;N、アデノシンまたはシトシン
またはグアニンまたはチミン;R、アデノシンまたはグア
ニン；そしてＹ、シトシンまたはチミン。

このプローブの各々がオリゴヌクレオチドの集まりか
ら成っている。遺伝暗号は同義性を有する（１以上のコ
ドンが同一のアミノ酸をコードし得る）ので、トリプシ
ン分解されたアミノ酸配列をコードする全ての可能なヌ
クレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物を合
成する。これらのプローブを放射活性標識し、下記の牛
cDNAライブラリーのスクリーニングに使用する。

B.牛のBMP−５ゲーロン−ロベイ等の方法［カレント・アドバンシズ
・イン・スケルトジェネシス、エルセヴィア・サイエン
ス・パブリシャーズ（1985）］によって牛胎児骨細胞か
ら単離された全DNAから、オリゴ（dT）セルロースクロ
マトグラフィーにより、ポリ（Ａ）含有RNAを単離す
る。この全RNAはマリオン・ヤング博士（ナショナル・
インスティテュート・オブ・デンタル・リサーチ、ナシ
ョナル・インスティテューツ・オブ・ヘルス）から入手
した。ラムダgt10（トゥール等、上記）においてcDNAラ
イブラリーを作成し、１平板に付き8000組替え体の割合
で50枚の平板に蒔く。これらの組替え体（400000）を、
テトラメチルアンモニウムクロリド（TMAC）ハイブリダ
イゼーション法［ウズニイ等、サイエンス、第242巻:15
28〜1534頁（1988）を参照］を用いて、プローブ１、
２、３および４の組み合わせを使用した二重のニトロセ
ルロースフィルター上でスクリーニングする。陽性物質
が28個得られ、これらを第２回目のために再び蒔く。再
び二重にトロセルロースレプリカ（写し）を作成する。
１組のフィルターはプローブ＃１および＃２について、
他方はプローブ＃３および＃４についてスクリーニング
する。前者に関して６個、後者では21個の陽性物質が得
られる。６個のうちHEL5と呼ばれる１個から病原菌を除
いてファージ平板ストックを作成し、バクテリオファー
ジDNAを単離する。このDNAをEcoR Iで消化し、M13およ
びpSP65中にサブクローニングする（プロメガ・バイオ
テク、マジソン、ウィスコンシン）［メルトン等、ヌク
レイック・アシッズ・リサーチ第12巻:7035〜7056頁（1
984）］。このフラグメントのDNA配列および導き出されたア
ミノ酸配列を表Ｉに示す。

M13におけるこのフラグメントのDNA配列解析は、これ
が上に開示した所望のトリプシン分解ペプチド配列をコ
ードしており、かっこの導き出されるアミノ酸配列は、
トリプシンの特異性により予想される通り塩基性残基
（Lys）が先行するということを示すものである。表Ｉ
の配列中、下線を付したアミノ酸＃42〜＃48の部分は上
で同定されたトリプシン分解フラグメントに相当し、こ
れからオリゴヌクレオチドプローブを設計する。表Ｉに
開示されているアミノ酸＃15〜＃23の誘導されるアミノ
酸配列Ser−Gly−Ser−His−Gln−Asp−Ser−Ser−Arg
は、上に述べた「BMP」公開第WO88/00205およびWO89/10
409号に記載された28000〜30000ダルトンの精製骨調整
物中に見出されるトリプシン分解フラグメント配列Ser
−Thr−Pro−Ala−Gln−Asp−Val−Ser−Argに類似して
いることが注目される。表Ｉに開示されるこのフラグメ
ントは牛のBMP−５蛋白をコードしているDNA配列の一部
である。表Ｉに示したDNA配列は、140アミノ酸残基から
なる部分的ペプチドをコードしている（最初の７個のヌ
クレオチドはクローニング過程で使用されるアダプター
のものである）420塩基対のクローンの５´未満からの
開放読み取り枠を示す。枠内の停止コドン（TAA）は、
このクローンが牛BMP−５のカルボキシ未満部分をコー
ドしていることを示している。

C.牛のBMP−６上記プローブ＃１、＃２、＃３および＃４によって単
離された残りの陽性クローン（21個の陽性物質を含む第
２の群）をHEL5によりスクリーニングし、還元ハイブリ
ダイゼーション条件下でハイブリダイズするさらにもう
１個のクローンを同定する［５×SSC、0.1％SDS、５×
デンハート、65℃で100μg/mのサケ精子DNA標準ハイ
ブリダイゼーション緩衝液（SHB）、２×SSC0.1％SDS中
65℃で洗浄］。このクローンの病原菌を除き、ファージ
平板ストックを作成し、バクテリオファージDNAを単離
する。DNA配列およびこのクローンの一部から導かれた
アミノ酸配列を表IIに示す。この配列は、本発明に係る
牛のBMP−６軟骨／骨蛋白をコードしているDNA配列の一
部を表わしている。

表IIの配列中、最初に下線を付したアミノ酸＃97〜ア
ミノ酸＃105の部分は、上に述べた「BMP」公開第WO88/0
0205およびWO89/10409号に記載された28000〜30000ダル
トンの精製牛骨調製物（およびおよそ18000〜20000ダル
トン還元型におけるその還元型）中に見出されるトリプ
シン分解フラグメントに相当する。表IIにおいて第２に
下線を付したアミノ酸＃124〜アミノ酸＃130の配列は、
上で同定されたトリプシン分解フラグメントに相当し、
ここからオリゴヌクレオチドプローブを設計する。

表IIのDNA配列は、222アミノ酸残基からなる部分的ペ
プチドをコードしている表IIの配列５´末端から始まる
666塩基対の開放読み取り枠を示す。枠内の停止コドン
（TRA）は、このクローンが牛のBMP−６蛋白のカルボキ
シ末端部分をコードしていることを示している。他のBM
P蛋白および他のTGF−β科の蛋白についての知識に基づ
くと、前躯体ポリペプチドは３個の塩基性残基の箇所
（ArgArgArg）が開裂して表IIの配列の残基90または91
で始まる成熟ペプチドを生成することが予想される。

実施例Ｖ A.ヒトの蛋白組成 BMP−５および／またはBMP−６のmRNAを合成するヒト
のセルラインを以下の方法で同定する。RNAを種々のヒ
トセルラインから単離し、オリゴdTセルロース上のクロ
マトグラフィーによりポリＡ含有RNAを選択し、ホルム
アルデヒド−アガロースゲル上で電気泳動し、ニトロセ
ルロースに移す。このゲルのニトロセルロースレプリカ
を、表Ｉの配列のヌクレオチド１〜465を含む上記BMP−
5EcoR I−Bgl IIフラグメントに対応する一本鎖M13³²P
標識プローブにハイブリダイズする。強くハイブリダイ
ズしているバンドがヒトの骨肉腫セルラインＵ−20SRNA
に相当するレーンに検出される。もう１個のニトロセル
ロースレプリカを、牛BMP−６のPst I−Sma Iフラグメ
ントを含む一本鎖M13³²P標識プローブ（表IIのヌクレオ
チド106〜261に対応）にハイブリダイズする。Ｕ−20SR
NAに対応するレーン中の幾つかのRNA種がこのプローブ
とハイブリダイズすることがわかる。

確立されている技術（トゥール等）を用いてＵ−20S
ポリＡ含有RNAからベクターラムダZAP（ストラタジー
ン）にcDNAライブラリーを作成する。このライブラリー
の組替え体750000を平板に蒔き、二重のニトロセルロー
スレプリカを作成する。表IIのヌクレオチド259〜751に
相当する牛BMP−６のSma Iフラグメントをニック翻訳に
よって標識し、SHB中65−Ｔで両方の組のフィルターに
ハイブリダイズする。一方の組のフィルターは緊縮（ス
トリンジェント）条件下（0.2×SSC、0.1％SDS、65−
Ｔ）で、他方は緊縮性の低い条件下（１×SSC、0.1％SD
S、65−Ｔ）で洗浄する。多くの写しが組替え体とハイ
ブリダイズしている（およそ162）のに注目できる。24
個を選んで第２回目のために再播種する。各平板につき
３個のニトロセルロースレプリカを作成する。１個はBM
P−6Sma Iプローブにハイブリダイズし、１個はニック
翻訳されたBMP−6Pst I−Sac Iフラグメント（表IIのヌ
クレオチド106〜378）に、そして第３番目はニック翻訳
されたBMP−5Xba Iフラグメント（表Ｉのヌクレオチド
１〜76）にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーショ
ンおよび洗浄は緊縮条件下で行なう。

B.ヒトのBMP−５蛋白第２のプローブより強く第３のプローブにハイブリダ
イズしている17個のクローンの斑を除く。これらのうち
の１個、U2−16のDNA配列解析は、これがヒトBMP−５を
コードしていることを示す。U2−16はアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（ATCC）（ロックビル、
メリーランド）に1989年６月22日、入手番号ATCC68109
のもとで寄託された。この寄託および本明細書中に記載
されている他の寄託は、特許手続の目的のための微生物
の寄託の国際承認に関するブダペスト条約およびその規
則（ブダペスト条約）の規定に基づいて行なわれる。U2
−16はおよそ2.1Kbの挿入部を含む。U2−16のDNA配列お
よび誘導されるアミノ酸配列を以下の表IIIに示す。こ
のクローンは、ヒトのBMP−５蛋白をコードするのに必
要な全ヌクレオチド配列を含んでいると予想される。表
IIIのcDNA配列は、アミノ酸454個の蛋白をコードし、全
ての枠において停止コドンを伴う700bpの５´非翻訳領
域が先行する、1362bpの転写解読枠、および枠内停止コ
ドン（TAA）に続く90bpの３´非翻訳領域を含んでい
る。

アミノ酸454個のこの蛋白はそのアミノ酸配列によっ
て予言できるようにおよそ52000ダルトンの分子量を有
し、必要な翻訳生成物であると考えられる。他のBMP蛋
白およびTGF−β科内の他の蛋白についての知識に基づ
くと、この前躯体ポリペプチドは３塩基性ペプチドLys
Arg Lysにおいて開裂し、アミノ酸＃323「Asn」で始ま
る132アミノ酸成熟ペプチドを生成するであろうと予測
される。BMP−５の成熟型へのプロセシングは、関連蛋
白TGF−βのプロセシングと類似の方法による二量重合
およびＮ末端領域の脱離を含んでいると予想される［L.
E.ジェントリー等、モレキュラー・アンド・セルラー・
バイオロジー8:4162（1988）;R.ダーニック等、ネイチ
ャー316:701（1985）］。

したがって、BMP−５の成熟活性種は２個のポリペプ
チドサブユニットのホモ二量体を含み、各サブユニット
が予想分子量およそ15000ダルトンのアミノ酸＃323〜＃
454からなるという事が考えられる。さらに活性BMP−５
種は例えば成熟サブユニットに結合したプロ蛋白サブユ
ニットまたはプロ蛋白二量体が考えられる。また別の活
性種は、アミノ酸＃329〜＃454を含むことができ、かか
る種は牛の精製した材料中に見出される相同性のトリプ
シン分解配列を含んでいる。さらにまた考えられるの
は、アミノ酸＃353〜＃454からなり、故に最初の保存さ
れたシステイン残基を含む、BMP−５蛋白である。

表IIIの下線を付したアミノ酸＃329〜＃337の配列Ser
−Ser−Ser−His−Gln−Asp−Ser−Ser−Argは、上記実
施例IVで述べた表Ｉのアミノ酸＃15〜＃23の牛の配列と
相同性を分かち合っている。これら各々の配列は、上記
の「BMP」公開出願第WO88/00205およびWO89/10409号に
記載のように、28000〜30000ダルトンの精製された骨の
調製物中に見出されるトリプシン分解フラグメント配列
Ser−Thr−Pro−Ala−Gln−Asp−Val−Ser−Arg（およ
びおよそ18000〜20000ダルトンにおけるその還元型）と
相同性を分かち合っている。

表IIIの下線を付したアミノ酸＃356〜＃362の配列His
−Glu−Leu−Tyr−Val−Ser−Pheは上で述べた牛骨調製
物中に同定されるトリプシン分解フラグメントに相当
し、これよりオリゴヌクレオチドプローブを設計する。

上記のトリプシン分解配列His−Glu−Leu−Tyr−Val
−Ser−Phe−（Ser）は、例えば公開第WO88/00205号に
記載されるように牛およびヒトの軟骨／骨蛋白BMP−2A
配列中に見出せる配列His−Pro−Leu−Tyr−Val−Asp−
Phe−Serと類似することが注目される。ヒトのBMP−５
は、他のBMP分子およびTGF−β分子の超科の他の構成員
と相同性を分かち合っている。ヒトBMP−５のシステイ
ンに富むカルボキシ末端102アミノ酸残基は、本明細書
ならびに上記公開第WO88/00205およびWO89/10409号中に
開示されるBMP蛋白と、以下の相同性を分かち合ってい
る:BMP−２と61％の一致;BMP−３と43％の一致;BMP−４
と59％の一致;BMP−６と91％の一致；そしてBMP−７と8
8％の一致。ヒトBMP−５はさらに以下の相同性を分かち
合っている:TGF−β３と38％の一致;TGF−β２と37％の
一致;TGF−β１と36％の一致；ミュラー阻害物質（MI
S）、即ち雄の胚の発達中ミュラー管の退行をもたらす
精巣の糖蛋白と25％の一致；インヒビンαと25％の一
致；インヒビンβ_B38％の一致；インヒビンβ_Ａと45％
の一致;Vgl、即ち胚発生初期における中胚葉の誘導に関
与し得るツメガエルの因子［ウィークスおよびメルト
ン、セル第51巻861〜867頁（1987）］と56％の一致；胚
発生初期における背腹の特定に必要であり、発達後期に
おいて他の様々な発達過程に関与している。ショウジョ
ウバエのドロソフイラ・デカペンタプレジック・ローカ
スの産物であるDppと57％の一致［パジェット等、ネイ
チャー第325巻81〜84頁（1987）］。

C.ヒトのBMP−６蛋白実施例V Aに記載の第２のプローブに対し第３のプロ
ーブに対するより強くハイブリダイズする６個のクロー
ンを取り、プラスミド中に誘導する。これらのプラスミ
ドの制限地図作成、サザンブロット分析およびDNA配列
分析は、２種類のクローンがあることを示す。クローン
U2−７およびU2−10は、他の４個のクローンよりも第２
のプローブより強くハイブリダイズし、かつ表IIの牛BM
P−６に対しより近接したDNA相同性を持つという事に基
づくと、ヒトのBMP−６をコードする配列を含んでい
る。これらのクローンから導かれるDNA配列のデータ
は、それらがヒトのBMP−６蛋白のカルボキシ末端を含
む132のアミノ酸から成る部分的ポリペプチドをコード
していることを示す。U2−７は、ブタペスト条約の規定
のもとで、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（ATCC）（ロックビル、メリーランド）に1989年６
月23日、丹生旬番号68021のもとで寄託された。

プライマー延長cDNAライブラリーを、その配列がクロ
ーンU2−10由来のヒトBNP−６の３´非翻訳配列に基づ
いているオリゴヌクレオチドGGAATCCAAGGCAGAATGTGを用
いてＵ−２ OSから作成する。このライブラリーを、U2
−７およびU2−10のBMP−６をコードしている配列から
誘導される配列CAGAGTCGTAATCGCのオリゴヌクレオチド
によりスクリーニングする。ハイブリダイゼーションは
標準ハイブリダイゼーション緩衝液（SHB）中、摂氏42
度で、洗浄条件として摂氏42度、５×SSC、0.1％SDSの
もとで行う。明確にハイブリダイズしているクローンを
単離する。これらのクローンのうち１個のDNA挿入部PEH
6−２は、これがU2−７やU2−10よりもさらに５´方向
へ伸長することを示す。上記のＵ−20SmRNAから組み立
てられたプライマー伸長cDNAライブラリーを、PEH6−２
の５´末端付近の配列から誘導された配列GCCTCTCCCCCT
CCGACGCCCCGTCCTCGTのオリゴヌクレオチドによりスクリ
ーニングする。ハイブリダイゼーションはSHB中摂氏65
度で、洗浄は２×SSC、0.1％SDS中摂氏65で行なう。明
確にハイブリダイズしている組替え体を単離し、制限地
図の作成およびDNA配列解析によて分析する。

この明確にハイブリダイズしている組替え体のうちの
１個PE5834＃７の挿入物の５´配列を、配列CTGCTGCTCC
TCCTGCTGCCGGAGCGCのオリゴヌクレオチドの設計に使用
する。任意のプライマーを使用したcDNAライブラリー
［（dN）_６をプライマーとして用いる外はオリゴ（dT）
をプライマーとするライブラリーとして合成］を、この
オリゴヌクレオチドを用いて、SHB中摂氏65度でハイブ
リダイゼーションし、1XSSC、0.1％SDS中摂氏65度で洗
浄することによりスクリーニングする。明確にハイブリ
ダイズしているクローンRP10を同定し、単離し、その挿
入部の５´末端からのDNA配列を決定する。この配列
は、配列TCGGGCTTCCTGTACCGGCGGCTCAAGACGCAGGAGAAGCGG
GAGATGCAを有するオリゴヌクレオチドの設計に使用す
る。ヒト胎盤のcDNAライブラリー（ストラタジーンのカ
タログ＃936203）を、このオリゴヌクレオチドを用い
て、SHB 中摂氏65度でハイブリダイゼーションし、0.2×SSC、0.
1％SDSにて摂氏65度で洗浄することによりスクリーニン
グする。BMP6C35と命名された明確にハイブリダイズす
る組替え体を単離する。この組替え体の挿入部のDNA配
列分析は、これが完全なヒトBMP−６蛋白をコードして
いることを示す。BMP6C35は、ブタペスト条約の規定の
もとにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（12301パークローン・ドライブ、ロックビル、メリー
ランド、USA）に1990年３月１日、入手番号68245のもと
で寄託された。

BMP6C35の挿入部の大部分のDNA配列およびここから誘
導されるアミノ酸配列を表IVに示す。このDNA配列は、5
13個のアミノ酸を持つヒトBMP−６蛋白前躯体をコード
している、1539塩基対の開放読み取り枠を含む。考え得
るイニシエーターであるメチオニンコドンには、３個全
ての読み取り枠において停止コドンを伴う159塩基対の
５´非翻訳配列が先行する。ヌクレオチド1699〜1701に
おける停止コドンには少なくとも1222塩基対の３´非翻
訳配列が続く。U2−７は、BMP6C35の1221位において、
Ｔ基に相当する位置にＣ基があり、U2−７もまた、BMP6
C35K1253位において、Ｇ基を有するということに留意さ
れたい。これらはコードされている蛋白にアミノ酸の相
違を招く訳ではなく、恐らくは対立遺伝子による変異を
意味するものである。

オリゴヌクレオチドTCGGGCTTCCTGTACCGGCGGCTCAAGACG
CAGGAGAAGCGGGAGATGCAを使用して、１×10⁶の組替え体
のニトロセルロースレプリカをSHB中摂氏65度でこのオ
リゴヌクレオチドにハイブリダイズし0.2×SSC、0.1＆S
DSで摂氏65度で洗浄することにより、ヒトのゲノムライ
ブラリー（トゥール等、上記）をスクリーニングする。
明確にハイブリダイズするクローンを精製する。オリゴ
ヌクレオチドのハイブリダイズする領域はおよそ1.5kbP
stフラグメントに位置する。このフラグメントのDNA配
列解析により、表IVに示される５´配列が確認される。

表IVにおいて最初に下線を付した部分であるアミノ酸
＃388から＃396の配列Ser−Thr−Gln−Ser−Gln−Asp−
Val−Ala−Argは、上に記載した表IIに開示された牛の
配列中の類似配列Ser−Thr−Pro−Alg−Gln−Asp−Val
−Ser−Argに対応する。表IVにおいて第２に下線を付し
たアミノ酸＃415から＃421の配列His−Glu−Leu−Tyr−
Val−Ser−Pheは、上で同定されたトリプシン分解フラ
グメントに対応し、ここからオリゴヌクレオチドプロー
ブを設計する。トリプシン分解配列His−Glu−Leu−Tyr
−Val−Ser−Phe−（Ser）は、他のBMP蛋白中に見出さ
れる配列、例えば牛に見出される配列His−Pro−Leu−T
yr−Val−Asp−Phe−Serおよび公開第WO88/00205号に記
載されているヒトの軟骨／骨蛋白BMP−２に類似してい
ることが注目される。故にBMP−６はTGF−β様分子のBM
P亜科の新しい構成員をなし、これは公開第WO88/00205
およびWO89/10409号に記載されている分子BMP−２、BMP
−３、BMP−４、ならびに本明細書中に記載されるBMP−
５およびBMP−７を含む。

他のBMP他のおよびTGF−β科の他の蛋白についての知
識に基づくと、BMP−６は前躯体分子として合成され、
この前躯体ポリペプチドはアミノ酸＃381およびアミノ
酸＃382の間で開裂して理論的分子量およそ15kdを有す
る132個のアミノ酸からなる成熟ポリペプチドを生成す
ると予想される。BMP−６の成熟型はBMP−５と同様、ポ
リペプチド鎖１個当たり考え得るＮ結合糖蛋白化部位３
個を含む。

成熟型へのBMP−６のプロセシングは、関連蛋白TGF−
βのプロセシングと類似の方法の二量体形成およびＮ末
端領域の脱離を含んでいると予想される［L.E.ジェント
リー等、（1988）;R.ダーニック等、（1985）、上
記］。活性BMP−６蛋白分子は二量体であると考えられ
る。さらに、BMP−５の成熟活性種は、蛋白分子が２個
のポリペプチドサブユニットからなるホモニ量体であっ
て各サブユニットが表IVに開示されるアミノ酸＃382〜
＃513を含んでいるということが考えられる。この他のB
MP−５の活性種は、例えばフォ蛋白二量体またはプロ蛋
白サブユニットおよび成熟サブユニットであると考えら
れる。もう一つの活性BNP−５蛋白はアミノ酸＃388〜＃
513から成り、よって精製した牛の材料に見出されるト
リプシン分解フラグメントを含み得る。本発明に係る別
のBMP−５蛋白はアミノ酸＃412〜＃513からなり、よっ
て最初の保存されたシステイン残基を含む。

ネズミのVgr−１の配列［リヨンズ等、PNAS第86巻4554
頁（1989）］をヒトのBMP−６と比較することにより、
アミノ酸配列の一致の程度は92％以上であることが示さ
れる。ネズミのVgr−１はBMP−６のネズミにおける相同
体のようである。ヒトのBMP−６は、他のBMP分子および
TGF−β超科分子の他の構成員と相同性を分かち合って
いる。ヒトBMP−６のシステインに富むカルボキシ末端
の102個のアミノ酸残基は、本明細書中ならびに公開第W
O88/00205およびWO89/10409号中に開示されるBMP蛋白
と、以下の相同性を分かち合っている:BMP−２と61％の
一致;BMP−３と44％の一致;BMP−４と60％の一致;BMP−
５と91％の一致；そしてBMP−７と87％の一致。ヒトのB
MP−６はさらに以下の相同性を分かち合っている:TGF−
β３と41％の一致;TGF−β２と39％の一致;TGF−β１と
37％の一致；ミュラー阻害物質（MIS）、即ち雄の胚の
発達中ミュラー管の退行をもたらす精巣の糖蛋白と26％
の一致；インヒビンαと25％の一致；インヒビンβ_Ｂと
43％の一致；インヒビンβ_Ａと49％の一致;Vgl、即ち胚
発生初期における中胚葉の誘導に関与し得るツメガエル
の因子［ウィークスおよびメルトン（1987）、上記］と
58％の一致；そして胚発生初期における背腹の特定に必
要であり、発達後期において他の様々な発達過程に関与
する、ショウジョウバエのドロソフイラ・デカペンタプ
レジック・ローカスの産物であるDppと57％の一致［パ
ジェット等、（1987）、上記］。

D.ひとBMP−７蛋白クローンの第２群を代表する上記実施例V Cの残る４
種のクローンはBMP−７として示す新規ポリペプチドを
コード化している。これらのクローンの１つであるU2−
５は、ブダペスト条約規定に基づいて受託番号ATCC6802
0号として1989年６月22日にATCCに受託された。本クロ
ーンはBMP−７の全コード化配列を含むものではないこ
とが決定された。配列GCGAGCAATGGAGGATCCAG（U2−５の
３´非コード化配列に基いて示した）のオリゴをＵ−２
OS mRNAからプライマー延長cDNAライブラリーを作る
のに使用した（トール等）。本ライブラリーの500,000
組換え体を42℃SHBでハイブリッド化し、42℃5X SSC、
0.1％SDS中で洗浄することによりオリゴヌクレオチドGA
TCTCGCGCTGCAT（BMP−７コード化配列に基づいて示し
た）で選別した。数種のハイブリッド化クローンを得
た。これらのクローンであるPEH7−９の１つのDNA配列
分析および誘導アミノ酸配列を第Ｖ表に示す。PEH7−９
をブダペスト条約規定に基づいて受託番号ATCC68182と
しいて1989年11月17日にメリーランド、ロックビル、ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）
で寄託した。PEH−９には1448塩基対の挿入を含む。本
クローンであるPEH7−９はBMP−７蛋白をコード化する
のに必要なヌクレオチド配列全てを含むことが予期され
た。第Ｖ表のcDNA配列は、431アミノ酸の蛋白をコード
化している1292塩基対の転写解読枠を含み、その前に全
枠の停止コドンと共に96塩基対の５´未翻訳領域があ
り、枠内停止コドンTAGの後に60塩基対の３´未翻訳領
域を含む。

431アミノ酸のこの蛋白は、そのアミノ酸配列により
予測されるように分子量49,000ダルトンであり、最初の
翻訳生成物を表すことが予測される。他のBMP蛋白およ
びTGF−βファミリー内の他の蛋白の知識に基づくと、
プレカーサーポリペプチドがアミノ酸＃299と＃300の間
で開裂して132アミノ酸成熟ペプチドを生じると予想さ
れる。

BMP−７の成熟形にするプロセシングは、関連性のあ
る蛋白TGF−Ｂのプロセシングに類似した方法でのプロ
プロテインの二量体化およびＮ末端領域の除去を含むこ
とが予想される（L.E.ジェントリー等、（1988年）前掲
およびR.デルニック等、（1985年）前掲）。それ故、BM
P−７の成熟活性種は各サブユニットが計算重量15,000
ダルトンである第Ｖ表に示すようなアミノ酸＃300−＃4
31からなる２ポリペプチドサブユニットのホモ二量体か
らなることが予想される。他の活性BMP−７種は例えば
蛋白二量体または成熟サブユニットに結合したプロプロ
テインサブユニットと予測される。付加的な活性種は第
Ｖ表の上記種のアミノ酸＃309−＃431を含み精製うし材
料中に見られるトリプチック配列を含む可能性がある。
またBMP−７蛋白がアミノ酸＃330−＃431を含みそれに
より第１保護システイン残基を含むことが予想される。

アミノ酸＃309−＃314のAsn−Gln−Glu−Ala−Leu−A
rgの第Ｖ表の下線した配列は、上記の「BMP」公開WO88/
00205号およびWO89/10409に記載したような28,000−30,
000ダルトンの精製骨製品中に見られるトリプチックフ
ラグメント＃５のアミノ酸と同じ配列である。アミノ酸
＃333−＃339His−Glu−Leu−Tyr−Val−Ser−Phe第Ｖ
表の下線した配列は、そこからオリゴヌクレオチドプロ
ーブを指定した上記記載のようなうし骨髄製品で同定し
たトリプチックフラグメントに相当する。

BMP−５およびBMP−６と同様に、ひとBMP−７は他のB
MP分子および分子のTGF−βスーパーファミリーの他の
メンバーを相同性を有する。ひとBMP−７のシステイン
豊富カルボキシ末端102アミノ酸残基は、本書に記載さ
れ上記記載のWO88/00205およびWO89/10409のBMP蛋白と
次のような相同性を有する、BMP−２に60％相同、BMP−
３に43％相同、BMP−４に58％相同、BMP−６に87％相同
およびBMP−５に88％相同である。ひとBMP−７はさらに
次の相同性を有する。TGF−β３に40％相同、TGF−β２
に40％相同、TGF−β１に36相同、雄性胚が発達する間
にミューラー管の退化をひきおこす精巣性糖蛋白である
ミューラー阻害物質（MIS）に29％相同、インヒビン−
αに25％相同、インヒビン−β_Ｂに44％相同、インヒビ
ン−β_Ａに45％相同、早期胚形成の中胚葉誘導に関する
ことができるアフリカツメガエル因子であるVg1に57％
相同（ウイークス・アンド・メルトン、（1987年）前
掲）および早期胚形成の背−腹部明確化に必要とし、発
生の後の段階での様々な他の発生段階に関与するドロソ
フイラ・デカペンタプレジック座の生産物であるDppに5
8％相同（パジェット等（1987年）、前掲）である。

本発明はBMP−５、BMP−６およびBMP−７のゲノム配
列を包含する。これらの配列を得るためには、ここに記
載したcDNA配列を当業者によく知られた技術を利用して
ゲノムライブラリーを選別するプローブとして利用す
る。

上記製法および当業者によく知られた付加的な方法
を、プローブ源としてうしまたはひと蛋白を利用するこ
とにより興味がある他の関連蛋白を単離するのに使用す
ることができる。上記他の蛋白はとりわけ破損修復、傷
治療および組織修復において同様に利用することができ
る。

実施例VI BMP蛋白の発現本発明のウシ、ヒト、またはその他の哺乳動物のBMP
−５、BMP−６もしくはBMP−７タンパクを産生するため
に、通常の遺伝子操作技術により、それをコード化した
DNAを適当な発現ベクターにトランスフェクトし、哺乳
動物細胞またはその他の好ましい真核生物もしくは原核
生物の宿主に導入する。本発明の生物学的に有効なヒト
組み換えタンパクのための好ましい発現系は、安定した
状態で形質転換された哺乳動物細胞であろうと考えられ
る。一時的な発現のために、SV40形質転換アフリカン・
グリーン・モンキー腎COS−１またはCOS−７を選択し、
通常プラスミド内でコード化タンパクを１−４日間、適
度な量産生させる。BMP−５、BMP−６またはBMP−７を
安定して高量発現させるために、チャイニーズ・ハムス
ター・オバリー（CHO）のセルラインが好ましい。従っ
て、好ましい哺乳動物細胞は、CHO細胞であると考えら
れる。

形質転換した宿主細胞を培養し、それにより発現した
本発明のBMPタンパクは、回収し、単離し、精製する。
発現タンパクは、標準的な手法を用いて確認する。例え
ば、確認には、［³⁵S］メチオニンまたはシステインで
のパルスラベル化、およびポリアクリルアミド電気泳動
による分析が含まれる。組み換えて発現したBMPタンパ
クには、共産し天然では通常共存しているタンパク様物
質がなく、培養液中に見出される物質のようなその他の
狹雑物も含まれない。

A.ベクターの構築上述のとおり、当業界で既知の、多数の発現ベクター
が、本発明のBMPタンパクの発現に利用することができ
る。以下の実施例に用いるベクターは、pMT₂の誘導体で
あるpMT21であるが、その他のベクターも、本発明の実
施に適している。

pMT₂は、ブダペスト条約の規定に従って、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）、ロック
ビル、MD（米国）に、受け入れ番号ATCC67122で寄託し
ていたpMT₂−VWFから誘導する。EcoR I消化して、pMT−
VWFに存在する相補的DNA挿入部位を切除し、直線状のpM
T2を産生するが、これは連結でき、エシェリキア・コリ
HB101またはDH−５に通常アンピシリン抵抗性を形質転換できる。プラスミドpMT2
DNAは、常法により調製することができる。

pMT21は、ループアウト／イン突然変異誘発を用いて
構築する［モリナガら、バイオテクノロジー84巻636頁
（1984年）］。これにより、塩基1075−1170（全部）が
除去される。さらに、以下の配列を挿入する:5´TCGA3
´。この配列は、新しい制限部位、Xho Iを完備する。
このプラスミドは、３個の特異なクローニング部位、Ps
t I、EcoR IおよびXho Iを含有することになる。

さらに、pMT21は、EcoR VおよびXho Iで消化し、消化
したDNAをDNAポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理し、
Ｃa Iリンカー（NEバイオ・ラブズ・CATCGATG）を連
結する。このようにして、SV40複製起点近くのHind III
部位およびpMT2のエンハンサー配列から出発して、塩基
2171−2420を除去し、唯一のＣa I部位を導入する
が、アデノウィルスVA I遺伝子は無傷のままにしてお
く。

B.BMP−５ベクターの構築第３表に示したBMP−５相補的DNA配列の誘導体は、ヌ
クレオチドNo.699−No.2070のヌクレオチド配列から成
り、特異的に増幅される。オリゴヌクレオチドCGACCTGC
AGCCACCATGCATCTGACTGTAおよびTGCCTGCAGTTTAATATTAGTG
GCAGCは、プライマーとして使用され、第３表のヌクレ
オチド配列No.699−No.2070を、実施例Ｖで記載された
クローンU₂−16の挿入部位から増幅させる。この方法に
より、ヌクレオチド配列CGACCTGCAGCCACCをヌクレオチ
ドNo.699のすぐ前に、そしてヌクレオチド配列CTGCAGGC
AをヌクレオチドNo.2070のすぐ後に導入する。これらの
配列を付加することにより、増幅されたDNA断片の両末
端で、Pst I制限エンドヌクレアーゼ認識部位を作り出
すことになる。この方法により増幅されたDNA産生物
は、制限エンドヌクレアーゼPst Iで消化し、上述のpMT
2誘導pMT21のPst I部位にサブクローン化する。得られ
たクローンは、H5/5/pMTと称する。

H5/5/pMTの挿入部位は、Pst I消化により切除し、Pst
I部位でプラスミドベクターpSP65にサブクローン化
し、その結果、BMP5/SP6が得られる。BMP5/SP6およびU₂
−16は、制限エンドヌクレアーゼNsi IとNde Iで消化
し、第III表のヌクレオチドNo.704−No.1876に対応する
挿入部位を切除する。その結果得られるクローンU₂−16
の1173ヌクレオチドNsi I−Nde I断片は、対応する1173
ヌクレオチドNsi I−Nde I断片が除去された、BMP5/SP6
のNsi I/Nde I部位に連結する。得られたクローンは、B
MP5mix/SP64と称する。

BMP5mix/SP64の直接的なDNA配列分析を行ない、増幅
により産生したヌクレオチド配列が、第III表に示され
たものと同一であることを確認する。クローンBMP5mix/
SP64は、制限エンドヌクレアーゼPst Iで消化し、第III
表のヌクレオチドNo.699−No.2070および上述のPst I認
識部位を含有する付加配列から成る挿入部位を切除す
る。その結果、1382ヌクレオチドPst I断片は、pMT2誘
導pMT21のPst I部位にサブクローン化される。このクロ
ーンは、BMP5mix/pMT21No.2と称する。

C.BMP−６ベクターの構築ヌクレオチドNo.160−No.1706のヌクレオチド配列か
ら成る、第IV表に示したBMP−６相補的DNA配列の誘導体
は、当業者に既知である一連の技術により産生される。
実施例Ｖに記載されたクローンBMP6C35は、制限エンド
ヌクレアーゼApa IおよびTaq Iで消化し、第IV表に示し
た配列の、ヌクレオチドNo.231−No.1703から成る挿入
部位の1476ヌクレオチド部分を切除する。Sal I制限エ
ンドヌクレアーゼ部位コンバータを有する合成オリゴヌ
クレオチドは、BMP−６相補的DNA配列の1476Apa I−Taq
I断片に含まれないNo.160−No.230およびNo.1704−No.
1706に対応するヌクレオチドと置換するように計画す
る。喪失した配列を置換するためのオリゴヌクレオチド/Sal Iコンバ
ータは、互いに独立してアニーリングする。次いでアニ
ーリングした５´および３´コンバーターは、上述の14
76ヌクレオチドApa I−Taq Iに連結し、第IV表のNo.160
−1706のヌクレオチド配列および両末端にSal I制限エ
ンドヌクレアーゼ部位を作るように企てた付加配列から
成る1563ヌクレオチド断片を作り出す。得られた1563ヌ
クレオチド断片は、pSP64のSal I部位にサブクローン化
する。このクローンは、BMP6/SP64No.15と称する。

BMP6/SP64No.15のDNA配列分析を行い、コンバーター
により置換された５´および３´配列が第IV表に示した
配列と同一であることを確認する。BMP6/SP64No.15の挿
入部位は、制限エンドヌクレアーゼSal Iで消化して切
除する。得られた1563ヌクレオチドSal I断片は、pMT2
誘導pMT21のXho I制限エンドヌクレアーゼ部位にサブク
ローン化し、本明細書ではBMP6/pMT21と称する。

D.BMP−７ベクターの構築ヌクレオチドNo.97−No.1402のヌクレオチド配列から
なる、第Ｖ表に示したBMP−７配列の誘導体は、特異的
に増幅される。オリゴヌクレオチドCAGGTCGACCCACCATGC
ACGTGCGCTCAおよびTCTGTCGACCTCGGAGGAGCTAGTGGCは、プ
ライマーとして、上述のクローンPEH7−９の挿入部位か
ら、第Ｖ表のヌクレオチド配列No.97−No.1402を増幅さ
せるのに使用する。この方法により、ヌクレオチド配列
CAGGTGACCCACCを、ヌクレオチドNo.97のすぐ前に、そし
てヌクレオチド配列GTCGACAGAをヌクレオチドNo.1402の
すぐ後に挿入することになる。これらの配列を付加する
ことにより、増幅したDNA断片の各末端に、Sal I制限エ
ンドヌクレアーゼ認識部位を作り出す。この方法により
得られる増幅したDNA産生物は、制限エンドヌクレアー
ゼSal Iで消化し、プラスミドベクターpSP64のSal I部
位にサブクローン化し、その結果、BMP−7/SP6No.2が得
られる。

クローンBMP−7/SP6No.2およびPEH7−９は、制限エン
ドヌクレアーゼNco IおよびStu Iで消化し、第Ｖ表ヌク
レオチドNo.363−No.1081に対応する挿入部位を切除す
る。得られるクローンPEH7−９の719ヌクレオチドNco I
−Stu I断片は、対応する719ヌクレオチド断片が除去さ
れるBMP7/SP6No.2のNco I−Stu I部位に連結する。得ら
れるクローンは、BMP7mix/SP6と称する。

BMP7mix/SP6の直接的なDNA配列分析を行い、３´部分
が第Ｖ表のNo.1082−No.1402のヌクレオチド配列と同一
であることを確認するが、５´部分には、誤って挿入さ
れた１個のヌクレオチドを含有する。

PEH7−９を鋳型として用いるヌクレオチド配列（第Ｖ
表のNo.97−No.1402）の増幅は、上述のように繰り返し
行なう。この方法により得られた増幅したDNA産生物
は、制限エンドヌクレアーゼSal IおよびPst Iで消化す
る。この消化により、第Ｖ表のヌクレオチドNo.97−No.
833から成る747ヌクレオチド断片、および前述のSal I
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を作り出した５´プラ
イミングオリゴヌクレオチドの付加配列を切除する。こ
の747Sal I−Pst I断片は、Sal I−Pst I消化pSP65ベク
ターにサブクローンし、その結果、５´BMP7/SP65が得
られる。DNA配列分析により、５´BMP7/SP65No.1の挿入
部位は、第Ｖ表のヌクレオチドNo.97−No.362と同一の
配列から成ることが示される。

クローンBMP7mix/SP6および５´BMP7/SP65は、制限エ
ンドヌクレアーゼSal IおよびNco Iで消化する。得られ
た第Ｖ表のヌクレオチドNo.363−No.1042から成るBMP7m
ix/SP65の３´Nco I−Sal I断片、および第Ｖ表のヌク
レオチドNo.97−No.362から成る５´BMP7/SP65の５´Sa
l I−Nco I断片は、Nco I制限部位で一緒に連結し、第
Ｖ表のヌクレオチドNo.97−No.1402から成る1317ヌクレ
オチド断片およびこの断片の両末端でSal I制限部位を
作り出す５´および３´オリゴヌクレオチドプライマー
から誘導した付加配列を産生する。この1317ヌクレオチ
ドSal I断片は、pMT2誘導pMT2Cla−２のSal I部位に連
結する。このクローンは、BMP7/pMT2と称する。

BMP7/pMT2の挿入部位は、制限エンドヌクレアーゼSal
Iで消化して切除する。得られた1317ヌクレオチドSal
I断片は、ベクターpSP64のSal I制限部位にサブクロー
ン化する。このクローンはBMP7/SP64No.2dと称する。BM
P7/SP64No.2dの挿入部位は、Sal Iで消化して切除し、
得られる第Ｖ表のヌクレオチドNo.97−No.1402から成る
Sal I断片は、上述のpMT2誘導pMT21のXho I制限エンド
ヌクレアーゼ部位にサブクローン化する。

実施例VII 一過性COS細胞発現 BMP−５、BMP−６およびBMP−７蛋白の一過性発現を
得るために、BMP−５、BMP−６またはBMP−７のcDNAを
含むベクターの一種である各BMP5mix/pMT21＃２、BMP6/
pMT21＃２、またはBMP7/pMTをエレクトロポレーション
法を用いてCOS−１細胞中に形質導入する。その他の適
当な形質導入法にはDEAE−デキストランおよびリポフェ
クションがある。約48時間後、細胞について、BMP−
５、BMP−６またはBMP−７蛋白の細胞内および分泌発現
の両方を、［³⁵S］メチオニンによる代謝標識およびポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により検討した。細胞内
BMPは、Ｎ−結合糖付加阻害剤であるチュニカマイシン
で処理した細胞につき検討した。チュニカマイシン処理
細胞内で、非糖付加第一次翻訳生成物は予測のつく大き
さの均一なバンドとして移動し、ポリアクリルアミドゲ
ルで、蛋白質の糖付加体よりしばしば容易に判別し得
る。各場合において、チュニカマイシン処理細胞内の蛋
白は、形質導入されてはいるが、未処理COS細胞の二重
プレート（duplicate plate）と比較する。

A.BMP−5COS発現結果は約52Kdおよび57KdのBMP−５の細胞内形がCOS細
胞により生成していることを示している。52Kd蛋白質は
BMP−５ cDNAクローンの第一次配列から予想し得る大
きさである。チュニカマイシンでの細胞処理後、BMP−
５の52Kd体のみが生成し、このことは57Kd蛋白は52Kd第
一次翻訳生成物の糖付加誘導体であることを示してい
る。57Kd蛋白は調節培地中に分泌され、明らかCOS細胞
により効果的にプロペプチドおよび成熟ペプチドにプロ
セッシングされていない。

B.BMP−６ COS発現細胞内BMP−６は未処理COS−１細胞内に約61Kdおよび
65Kdのダブレットとして存在する。チュニカマイシンの
存在下で、61Kd蛋白のみが観察され、これは65Kd蛋白が
61Kd第一次翻訳生成物の糖付加誘導体であることを示し
ている。これはBMP−６のcDNAクローンにから予想され
る分子量に近似している。チュニカマイシンの不存在下
では、COS−１細胞から分泌される主要成分蛋白はBMP−
６の65Kdの糖付加、未プロセッシング切断体である。さ
らに65Kdより少量で46Kdおよび20Kdペプチドも存在し、
これは各々プロセッシングされたプロペプチドおよび成
熟ペプチドを示している可能性がある。

C.BMP−７ COS発現チュニカマイシン処理COS−１細胞内のBMP−７蛋白は
44Kdおよび46Kdとダブレットして現われる。チュニカマ
イシンの不存在下では、46Kdおよびおそらく348Kdの蛋
白が生産される。これらはおそらくBMP−７第一次翻訳
生成物の糖付加誘導体の可能性を示している。48Kd蛋白
はCOS−１細胞から分泌される主要BMP成分であり、この
ことはプロペプチド二塩基性切断部位における非能率的
なBMP−７の切断を示している。

実施例VIII CHO細胞発現 DHFR欠乏CHO細胞（DUKX B11）に、上記のBMP−５、B
MP−６またはBMP−７発現ベクターの一種をエレクトロ
ポレーションにより形質導入し、ヌクレオチド無含有培
地中での発育によりDHER発現を選択する。形質導入の他
の方法として、CaPO₄沈澱法、プロトプラスト融合法、
マイクロインジェクション法およびリポフェクションな
どを用いることができるがこれらに限定されない。より
便宜的に高い発現を得るために、細胞は5nM、20nMまた
は100nM MTXを補足したヌクレオチド無含有培地中で選
択することができる。DHFR選択可能マーカーはビシスト
ロンコードづけ領域の第二遺伝子としてBMP cDNAに物
理的に結合しているから、DHFRを発現する細胞は上流シ
ストロン内にコード化されたBMPも発現するはずであ
る。単一のクローン、または合併クローンの集合のいず
れもBMP蛋白の発現につき増殖および分析する。細胞はM
TX濃度の増大（5nM、20nM、100nM、500nM、2nM、10nMお
よび100nM）とともに段階的に選択され、遺伝子増幅に
よる発現ベクターDNAの多数複写を含み、従って多量のB
MP蛋白を分泌する細胞株を得る。

標準的技術を用いて、BMPのRNAおよび蛋白の発現また
は活性につき選別し、高発現細胞株を、適当な選択水準
でクローニングまたは再クローニングして細胞のより均
一な集団のものを得る。ついで得られた細胞株BMP DNA
配列、BMPのRNAおよび蛋白の発現につき検討する。つい
で、適当な細胞株を組換えBMP蛋白の生産に用いること
ができる。

A.BMP−５のCHO発現上記のBMP−５ベクターBMP5mix/PMT21＃２をエレクト
ロポレーションによりCHO細胞中に形態導入し、DHFR発
現のための細胞を選択する。クローナル細胞株はMTX耐
性につき段階的に選択された個々のコロニーから得、BM
P−５蛋白分泌につき検討する。ある種の場合には、細
胞株を集団として保持し、MTX選択のより遅い段階でク
ローニングすることができる。

実施例V.B.に記載のように、BMP−５のcDNAは約52Kd
の蛋白をコード化している。プロペプチド切断、糖付
加、および二量体または多量体生成を含むがこれに限定
されない細胞内プロセッシングの後、多数のBMP−５ペ
プチドが生成する。還元条件下で、SDS PAGEにより判
別可能なBMP−５蛋白プロセッシング形として少なくと
も４種のペプチド候補が存在する:65Kdペプチド、35Kd
ペプチドおよび約22Kd分子量のタブレットである。他に
より少量のBMP−５ペプチド類が存在し得る。他の同類
のBMP分子および同類の蛋白TGF−ベータのプロセッシン
グと比較すると、65Kd蛋白は未プロセッシングBMP−５
に相当し、35Kd体はプロペプチドに相当し、22Kdダブレ
ットは成熟ペプチドに相当する可能性がある。

BMP−５細胞株からの物質は２次元ゲル系により分析
する。第一次元で、蛋白を非還元条件下で電気泳動す
る。ついで還元し、第二のポリアクリルアミドゲル中で
電気泳動する。ジスルフィド結合した二量体または多量
体は第二の還元ゲルを横切る対角線の下を通過する。BM
P−５蛋白の分析結果は、大量の成熟BMP−５ペプチド
が、一次元還元ゲルで観察される22Kdダブレットに変形
する約30−35Kdのホモ二量体を生成し得ることを示して
いる。性軸ペプチドの画分は明らかにプロペプチドとの
ジスルフィド結合複合体中にある。この複合体の量は成
熟ホモ二量体と比較するとより少量である。さらに、未
プロセッシング蛋白のうちあるものは明らかにホモ二量
体またはホモ多量体を生成し得る。

B.BNP−６のCHO発現上記のBMP−６発現ベクターBMP6/pMT21をCHO細胞中に
形質導入し、上記BMP−５に関するＡ部に記載したと同
様の方法でのDHFR発現を経て安定な形質転換対を選択す
る。BMP−６の成熟活性体は、第IV表のアミノ酸＃382−
＃513を含むものと予測される。分泌BMP−６蛋白は、BM
P−５、他の同類のBMP分子および同類の蛋白TGF−βに
関して上記に記載したと同様の方法でプロセッシングさ
れると予測される［ジェントリーら；デルニックら、上
掲］。

C.BMP−７のCHO発現上記のBMP−７発現ベクターBMP7/pMT21をCHO細胞中に
形質導入し、BMP−５に関し、上記と同様の方法でのDHF
R発現を経て安定な形質転換体を選択する。BMP−７の成
熟活性体は、第Ｖ表のアミノ酸＃300−＃431を含むもの
と予測される。分泌BMP−７蛋白は、BMP−５、他の同類
のBMP分子および同類の蛋白TGF−βに関して上記に記載
したと同様の方法でプロセッシングされると予測される
［ジェントリーら；デルニックら、上掲］。

実施例IX 発現BMP蛋白の生物学的活性上記の実施例VIIおよびVIIIで得た発現BMP−５、BMP
−６およびBMP−７蛋白の生物学的活性測定のために、B
MP蛋白を培養培地から回収し、共産生した蛋白質性物質
および他の汚染物質からBMP蛋白を分離精製する。蛋白
はヘパリンセファローズカラム上で一部精製し、当業者
に公知の標準的精製技術を用いてさらに精製する。

例えば、培養物から集めた形質導入後調整培地上清
を、YM10膜上限外濾過により約10倍に濃縮しついで、20
mMトリス、0.15M NaCl、pH7.5（出発緩衝液）に対して
透析する。ついでこの物質を出発緩衝液中ヘパリンセフ
ァローズカラムにかける。非吸着蛋白を出発緩衝液で洗
浄して除去し、吸着蛋白は、本発明の蛋白を含んでお
り、20mMトリス、20M NaCl、pH7.4で洗浄して吸着す
る。ヘパリンカラムにより吸着された蛋白は、例えば、
セントリコン10で約10倍に濃縮し、および例えば0.1％
トリフルオロ酢酸による透析濾過により塩を減少させ
る。得られた溶液の適当量をラットマトリックス20mgと
混合し、ついでインビボの骨および／または軟骨形成活
性につき、ローゼン修正サムパス−レッジ測定法により
測定する。模擬形質導入上清画分を対照として使用す
る。

調製用NaDodSO₄/PAGEによりさらに精製を行うことが
できる［エムリ、ネイチュア（Nature）第227巻第680−
685頁（1970年）］。例えば蛋白約300μｇを厚さ1.5m
m、15％ゲルに適用し、上記と同様にヘパリン−セファ
ローズ上で精製したＬ−［³⁵S］メチオニン−標識BMP蛋
白を添加することにより回収が可能である。蛋白は隣接
するレーンの銅染色により可視化できる［リーら、アナ
リティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）第1
66巻第308−312頁（1987年）］。適当なバンドを削り取
り、0.1％NaDodSO₄/20mM トリス、pH8.0にて抽出す
る。上清を10％CF₃COOHを用いてpH3に酸性化することが
でき、蛋白は5.0x0.46cm Vydac C₄ カラム上で脱塩
し、（ザ・セパレーション・グループ・ヘスペリア、カ
リホルニア）、0.1％CF₃COOHから90％アセトニトリル/
0.1％CF₃COOHの傾斜溶媒にて展開する。

本発明のひとBMP−５、BMP−６またはBMP−７の特定
量を付加したラットマトリックスを含む移植組織をおよ
そ７日後除去し、発生学的評価を行なう。各移植組織か
らの代表的切片について、ホン・コサおよび酸性フクシ
ンを用いて新しい骨ミネラル部分を染色し、トルイジン
ブルーを用いて軟骨に該当するマトリックス形成の部分
を染める。切片内に存在する細胞の型およびこれらの細
胞が表現型を示す程度につき評価し、実施例III中に記
載と同様に数字で示した。

活性度は宿主細胞抽出物により試験することもでき
る。精製はすべての緩衝液に尿素6Mを含ませる以外は上
記と同様の方法で行う。

前記の説明は本発明の好ましい具体例を詳細に述べた
ものである。実際には、これらの記載を検討することに
より当業者に多くの修正および変更が想起されることが
予想される。これらの修正および変更はここに付した請
求の範囲内に含まれる。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 Ａ (31)優先権主張番号３７０，５４４ (32)優先日平成１年６月23日(1989．6．23) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号３７０，５４７ (32)優先日平成１年６月23日(1989．6．23) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号３７０，５４９ (32)優先日平成１年６月23日(1989．6．23) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号４３７，４０９ (32)優先日平成１年11月15日(1989．11．15) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号４３８，９１９ (32)優先日平成１年11月17日(1989．11．17) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (72)発明者ウァング、エリザベス・エイアメリカ合衆国01741 マサチューセッツ、カーリスル、ウルフ・ロック・ロード 136番 (72)発明者ウォズニー、ジョン・エムアメリカ合衆国01749 マサチューセッツ、ハドソン、オールド・ボルトン・ロード 59番 (72)発明者ローゼン、ビッキィ・エイアメリカ合衆国02116 マサチューセッツ、ボストン、アパートメント４、マールバロウ・ストリート 344番 (72)発明者セレステ、アンソニー・ジェイアメリカ合衆国01479 マサチューセッツ、ハドソン、パッカード・ストリート 86番 (56)参考文献国際公開88／00205（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/00 C12N 15/00

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】次の群から選択されたDNA配列を有する、
軟骨および／または硬骨形成揺動能力を持つBMP（Bone
Morphogenic Protein）タンパク質をコードするDNA: （ａ）BMP−５をコードするDNA配列であって、（ｉ）第３表のヌクレオチド＃699〜＃2060を含むか、（ii）第３表のヌクレオチド位置＃1665〜＃2060を含む
か、（iii）厳密なハイブリダイゼーション条件下、（ｉ）
の配列にハイブリダイズし、かつBMP−５の生物学的特
性を持つ蛋白質をコードする配列を含むか、（iv）（ｉ）〜（iii）のいずれか１つの配列に関し
て、同義性（degenerate）であるかまたは対立性（alle
lic）である配列を含むか、または（ｖ）第３表のアミノ酸＃323〜＃454のアミノ酸配列を
コードするヌクレオチド配列を持つもの；（ｂ）BMP−６をコードするDNA配列であって、（ｉ）第４表のヌクレオチド位置＃160〜＃1698を含む
か、（ii）第４表のヌクレオチド位置＃1303〜＃1698を含む
か、（iii）厳密なハイブリダイゼーション条件下、（ｉ）
の配列にハイブリダイズし、かつBMP−６の生物学的特
性を持つ蛋白質をコードする配列を含むか、（iv）（ｉ）〜（iii）のいずれか１つの配列に関し
て、同義性であるかまたは対立性である配列を含むか、
または（ｖ）第４表のアミノ酸＃382〜＃513のアミノ酸配列を
コードするヌクレオチド配列を持つもの；および（ｃ）BMP−７をコードするDNA配列であって、（ｉ）第５表のヌクレオチド位置＃994〜＃1389を含む
か、（ii）厳密なハイブリダイゼーション条件下、（ｉ）の
配列にハイブリダイズし、ヌクレオチド位置＃994で始
まるコドンによりコードされるアミノ酸位置に対応する
Ｎ−末端位置のアミノ酸配列をコードし、かつBMP−７
の生物学的特性を持つ蛋白質をコードする配列を含む
か、（iii）（ｉ）〜（ii）のいずれか１つの配列に関し
て、同義性であるかまたは対立性である配列を含むか、
または（iv）第５表のアミノ酸＃300〜＃431のアミノ酸配列を
コードするヌクレオチド配列を持つもの。
【請求項２】発現制御配列を機能し得るように随伴した
請求項１記載のDNAを含むベクター。
【請求項３】請求項２記載のベクターにより形質転換さ
れた宿主細胞。
【請求項４】哺乳動物細胞である、請求項３記載の宿主
細胞。
【請求項５】CHO細胞である、請求項４記載の宿主細
胞。
【請求項６】第３表に示したヌクレオチド＃１〜＃2153
を含むDNA。
【請求項７】第４表に示したヌクレオチド＃１〜＃2923
を含むDNA。
【請求項８】第５表に示したヌクレオチド＃１〜＃1448
を含むDNA。