JP2713715B2 - 新規骨誘導組成物 - Google Patents
新規骨誘導組成物Info
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- JP2713715B2 JP2713715B2 JP62504617A JP50461787A JP2713715B2 JP 2713715 B2 JP2713715 B2 JP 2713715B2 JP 62504617 A JP62504617 A JP 62504617A JP 50461787 A JP50461787 A JP 50461787A JP 2713715 B2 JP2713715 B2 JP 2713715B2
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Description
【発明の詳細な説明】
この発明は、新規蛋白質およびそれらの製造方法に関
するものである。これらの蛋白質は軟骨および硬骨の形
成を誘導し得る。 背景の技術 骨は、蛋白質コラーゲンの線維束、およびプロテオグ
リカン、非コラーゲン性蛋白質、脂質および酸性蛋白質
により形成された広範なマトリックス構造を特徴とする
高度に分化した組織である。一生を通じて連続的に行な
われる骨形成および骨組織の再生／修復のプロセスは、
分化細胞により行なわれる。正常な胎長骨の発達の前
に、軟骨のひな形が形成される。骨の成長は恐らく「骨
芽細胞（骨形成細胞）の介在によると思われる、骨の再
建は明らかに骨吸収細胞、いわゆる「破骨細胞」および
骨芽細胞の結合活性により行なれる。様々な骨原性軟骨
誘導および硬骨誘導因子が報告されている。それらに関
しては、例えばヨーロッパ特許出願第148155号および同
第169016号参照。 発明の簡単な記載 この発明は、純粋形態の新規蛋白質を提供する。具体
的には、４種の新規蛋白質は、BMP−１、BMP−２・クラ
スＩ（またはBMP−２）、BMP−３およびBMP−２・クラ
スII（またはBMP−４）（ただし、BMPは骨形態形成蛋白
質である）と称する。これらの蛋白質は、後記第２〜８
表に示したアミノ酸配列と同一または実質的に相同性の
ペプチド配列を特徴とする。それらは予め定められた部
位での骨形成を誘導し得る。さらにこれらの骨誘導因子
は、後記インビボラット骨形成検定における10〜1000ng
/g（骨）の濃度での活性を含む生化学的および生物学的
特性を特徴とする。この発明の蛋白質は、表に示したDN
A配列、またはそれとハイブリダイゼーションし、骨成
長因子の生物学的特性を有するポリペプチドをコードし
得る配列またはそれらの特性を示す他の様々な修飾配列
によりコードされ得る。 この発明の蛋白質の１つはBMP−１という。ひとBMP−
１またはhBMP−１の１部分は、ゲノムhBMP−１フラグメ
ントを表す後記第５表のアミノ酸＃１〜アミノ酸＃37ま
たはhBMP−1 cDNAを表す第６表のアミノ酸＃１〜アミノ
酸＃730の配列と同一または実質的に同じペプチド配列
を有することを特徴とする。さらに、hBMP−１または関
連骨誘導因子は、これらの配列の少なくとも一部分を有
することを特徴とし得る。これらのペプチド配列は、第
５表のヌクレオチド＃3440〜ヌクレオチド＃3550および
第６表のヌクレオチド＃36〜ヌクレオチド＃2225にそれ
ぞれ示された配列と同一または実質的に同じDNA配列に
よりコードされる。さらに、これらのhBMP−１ポリペプ
チドは骨形成誘導能を有することを特徴とする。nBMP−
１は、骨1g当たり10〜1000ngの濃度でインビボラット骨
形成検定において活性を呈する。 この発明の相同性うし成長因子（bBMP−１と称す）
は、ゲノムbBMP−１フラグメントを表す後記第２表のア
ミノ酸＃１〜アミノ酸＃37の配列と同一または実質的に
同じ配列を含むペプチド配列を有することを特徴とす
る。このペプチド配列は、後記第２表のヌクレオチド＃
294〜ヌクレオチド＃404に示された配列は、後記第２表
のヌクレオチド＃294〜ヌクレオチド＃404に示された配
列と同一または実質的に同じDNA配列によりコードされ
る。後記第２表で同定されたうしペプチド配列もまた37
アミノ酸長である。さらに、bBMP−１は骨形成誘導能を
特徴とする。 この発明の別の骨誘導蛋白質組成物は、BMP−２・ク
ラスＩ（またはBMP−２）と称する。それは、cDNA hBMP
−２・クラスＩを表す第７表のアミノ酸＃１〜アミノ酸
＃396の配列と同一または実質的に同じペプチド配列の
少なくとも一部分を有することを特徴とする。このペプ
チド配列は、第７表のヌクレオチド＃356〜ヌクレオチ
ド＃1543に示された配列と同一または実質的に同じDNA
配列によりコードされる。第７表で同定されたひとペプ
チド配列は396アミノ酸長である。またhBMP−２または
関連骨誘導蛋白質もこのペプチド配列の少なくとも一部
分を有することを特徴とし得る。さらにhBM−２・クラ
スＩは、骨形成誘導能を特徴とする。 hBMP−２・クラスＩ（またはhBMP−２）と称するこの
発明の相同性うし骨誘導蛋白質は、ゲノム配列を表す後
記３表で同定されたDNA配列を有する。このうしDNA配列
は、予想される129アミノ酸コード配列、次いで約205個
のヌクレオチド（３′非コード配列）を有する。さらに
hBMP−２・クラスＩは骨形成誘導能を特徴とする。この
発明の別の骨誘導蛋白質組成物は、BMP−２・クラスII
またはBMP−４と称する。ひと蛋白質hBMP−２・クラスI
I（またはhBMP−４）は、nBMP−２・クラスIIのcDNAを
表す第８表のアミノ酸＃１〜アミノ酸＃408間の配列と
同一または実質的に同じペプチド配列の少なくとも一部
分を有することを特徴とする。このペプチド配列は、第
８表のヌクレオチド＃403〜ヌクレオチド＃1626に示さ
れた配列と同一または実質的に同じDNA配列の少なくと
も一部分によりコードされる。さらにこの因子は、骨形
成誘導能を特徴とする。 この発明のさらに別の骨誘導因子、BMP−３、うし相
同体bBMP−３により示される。bBMP−３は、うしゲノム
配列を表す第4AおよびＢ表のDNA配列およびアミノ酸配
列を有することを特徴とする。それは、第4AおよびＢ表
のアミノ酸＃１〜アミノ酸＃174と同一または実質的に
同じペプチド配列の少なくとも一部分を有することを特
徴とする。さらにBMP−３は、骨形成誘導能を特徴とす
る。うし因子は、類縁体ひとBMP−３蛋白質または他の
ほ乳類骨誘導蛋白質を得るための道具として使用され得
る。このうし骨誘導因子の特性を正確に表すと、この配
列を用いる方法における本質的「出発点」が得られる。
遺伝子工学技術分野における熟練者に周知の技術を用い
るこの方法は、プローブとしてうしDNA配列を使用して
ひとゲノムまたはcDNAライブラリーのスクリーニングを
行い、このプローブとハイブリダイゼーションするDNA
配列を同定することを含む。ハイブリダイゼーション可
能な配列を有するクローンは精製されたプラークであ
り、DNAはそこから分離され、サブクローンされ、DNA配
列分析が行なわれる。すなわち、この発明の別の態様
は、この方法により製造されたひと蛋白質hBMP−３であ
る。 この発明の別の態様は、医薬的に許容し得る賦形剤中
にこの発明によるうし成長因子ポリペプチドの１種また
はそれ以上の治療有効量を含有する医薬組成物に関する
ものである。さらに、これらの組成物は他の治療上有用
な薬剤を含有し得る。またそれらは、骨欠損部位への蛋
白質送達および骨成長構造の提供に適したマトリックス
を含み得る。これらの組成物は、幾つかの骨欠損および
歯周病の処置方法において使用され得る。この発明によ
ると、これらの方法は、骨形成を必要とする患者に、本
明細書に記載された新規蛋白質BMP−１、BMP−２・クラ
スＩ、BMP−２・クラスIIおよびBMP−３の少なくとも１
種の有効量を投与することを必然的に伴う。 さらにこの発明の別の態様は、骨形成誘導能を有する
ひとまたはうしポリペプチドの発現をコードするDNA配
列に関するうものである。それらの配列は、第２〜８表
に示された５′−３′方向のヌクレオチド配列を含む。
他方、ストリンジェント条件下で第２〜８表のDNA配列
とハイブリダイゼーションするDNA配列、または非スト
リンジェント条件下で示されたDNA配列とハイブリダイ
ゼーションし、少なくとも１種の骨成長因子生物学的特
性を有する蛋白質の発現をコードするDNA配列もこの発
明に包含される。最後に、第２〜８表の配列の対立遺伝
子または他の変形もまた、それらのヌクレオチド変形の
結果としてのペプチド配列の変形の存否に拘わらず、こ
の発明に含まれる。 さらにこの発明の他の態様は、前記DNA配列を発現制
御配列と効果的に組み合わせて含むベクターに関するも
のである。このベクターは、発現制御配列と効果的に共
同して骨成長因子ポリペプチドの発現をコードするDNA
配列により形質転換されたセルラインが培養される、骨
成長因子ポリペプチドの新規製造方法において使用され
得る。この発明の方法は、ポリペプチド発現用の宿主細
胞として幾つかの公知細胞を使用し得る。現在好ましい
セルラインはほ乳類セルラインおよび細菌細胞である。 以下、詳細な記載および好ましい実施態様を熟考すれ
ば、この発明の他の態様および利点は明らかである。 発明の詳細な記載 この発明の蛋白質は、後記第２〜８表に示された配列
と同一または実質的に相同性のアミノ酸配列またその一
部分を有することを特徴とする。これらの蛋白質もまた
骨形成誘導能を特徴とする。 また、この明細書に記載された骨成長因子は、第２〜
８表の配列に類似した配列によりコードされる因子を含
むが、その配列に対する修飾は、自然に行なわれるか
（例、ポリペプチドにおけるアミノ酸変更を誘導し得る
ヌクレオチド配列における対立遺伝子的改編）または慎
重な工学的処理により行なわれる。例えば、合成ポリペ
プチドは、第２〜８表のアミノ酸残基の連続配列を全体
的または部分的に複製し得る。これらの配列は、第２〜
８表の骨成長因子ポリペプチドと共有の一次、二次また
は三次構造および立体配座特性により、共通して骨成長
因子生物学的特徴を有し得る。すなわち、それらは、治
療プロセスにおいて天然骨成長因子ポリペプチドの生物
学的活性代用物として使用され得る。 この明細書に記載された骨成長因子の配列の他の特異
的突然変異体は、グリコシル化部位の一方または両方の
修飾を伴う。グリコシル化の不在または一部のみのグリ
コシル化は、第２〜８表に示された骨成長因子の配列に
存在するアスパラギン結合グリコシル化認識部位の一方
または両方におけるアミノ酸置換または欠失に起因す
る。アルパラギン結合グリコシル化認識部位は、適当な
細胞のグリコシル化酵素により特異的に認識されるトリ
ペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、ア
スパラギン−Ｘ−トレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−
セリン（ただし、Ｘは通常アミノ酸である）である。グ
リコシル化認識部位の第一または第三アミノ酸位の一方
または両方における様々なアミノ酸置換または欠失（お
よび／または第２位におけるアミノ酸欠失）は、修飾ト
リペプチド配列における非グリコシル化をもたらす。 またこの発明は、他の蛋白質性材料をコードするDNA
配列との随伴がなく、骨成長因子の発現をコードする新
規DNA配列を（アレリック）包含する。これらのDNA配列
は、５′−３′方向の第２〜８表に示された配列および
ストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件［マニ
アチス等、「モレキュラー・クローニング（ア・ラボラ
トリー・マニュアル）」、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー（1982）、387〜389頁参照］下で第
２〜８表のDNA配列とハイブリダイゼーションする配列
を含む。 緩和ハイブリダイゼーション条件下で第２〜８表の配
列とハイブリダイゼーションし、骨成長因子生物学的特
性を有する骨成長因子の発現をコードするDNA配列はま
た、この発明の骨成長因子もコードする。例えば、重要
な相同性を有する領域、例えばグリコシル化またはジス
ルフィド結合部位を第２〜８表の配列と共有し、１種ま
たはそれ以上の骨成長因子生物学的特性を有する骨成長
因子をコードするDNA配列は、DNA配列が第２〜８表の配
列とストリンジェント的にハイブリダイゼーションしな
い場合でも、成長因子のこの新たな科の一員を明らかに
コードする。 同様に、第２〜８表の配列によりコードされる骨成長
因子ポリペプチドをコードするが、遺伝子コードの縮重
またはアレリック変異（アミノ酸変更を誘導する場合も
しない場合もあり得る種の集団における天然塩基の変
形）故にコドン配列が異なるDNA配列もまた、この明細
書に記載された新規成長因子をコードする。点突然変異
または誘導修飾によりポリペプチドの活性、半減期また
は生産の向上が誘発される第２〜８表のDNA配列におけ
る変形もまたこの発明に包含される。 この発明の別の態様は、新規骨誘導因子の新規製造方
法に関するものである。この発明の方法は、既知調節配
列の制御下、この発明の新規骨成長因子ポリペプチドの
発現をコードするDNA配列により形質転換された適当な
細胞またはセルラインの培養を含む。適当な細胞または
セルラインは、ほ乳類細胞、例えばチャイニーズ・ハム
スター卵巣細胞（CHO）であり得る。適当なほ乳類宿主
細胞の選択並びに形質転換、培養、増幅、スクリーニン
グ、および製品の製造および精製の方法は当業界では周
知である。例えば、ゲシングおよびサンブルック、「ネ
イチャー」、293、620−625（1981）または別法として
カウフマン等、「モル・セル・バイオル」、５（７）17
50−1759（1985）またはハウレイ等、アメリカ合衆国特
許第4419446号参照。後記実施例記載の別の適当なほ乳
類セルラインは、さるCOS−１セルラインである。同様
に有用なほ乳類セルラインはCV−１セルラインである。 細菌細胞は適当な宿主である。例えば、エジェリヒア
・コリの様々な株（例、HB101、MC1061）はバイオテク
ノロジー分野において宿主細胞としてよく知られてい
る。枯草菌（バシルス・サブチリス）、プソイドモナ
ス、他のかん菌などの様々な株もまたこの方法において
使用され得る。 当業界の熟練者には周知の多くの酵母細胞株もまた、
この発明のポリペプチドの発現用の宿主細胞として利用
され得る。さらに、所望により、昆虫細胞もこの発明の
方法における宿主細胞として利用され得る。例えば、ミ
ラー等、「ジェネティック・エンジニアリング」、８、
277−298（プレナム・プレス1986）およびその引用文献
参照。 この発明の別の態様は、これらの新規骨誘導ポリペプ
チド類の発現方法で使用されるベクターに関するもので
ある。好ましくは、これらのベクターは、この発明の新
規因子をコードする前述の完全な新規DNA配列を含む。
さらにまた、これらのベクターは、骨誘導蛋白質配列を
発現させる適当な発現制御配列を含む。他方、上記修飾
配列が組み込まれたベクターはまた、この発明の具体例
であり、骨誘導蛋白質の製造に有用である。これらのベ
クターはセルラインの形質転換方法で使用され得、選択
された宿主細胞におけるその複製および発現を指向し得
るこの発明のDNAコード配列と効果的に組み合わせて選
択された調節配列を含み得る。これらのベクターに有用
な調節配列は当業界の熟練者には周知であり、選択され
た宿主細胞に応じて選択され得る。この選択は常套的で
あり、この発明の一部を形成するものではない。 骨が正常に形成されない環境において骨の成長を誘導
するこの発明の蛋白質は、骨折の治療に適用性を有す
る。この発明の蛋白質の１種またはそれ以上を用いる骨
原性製剤は、閉鎖および複雑骨折の縮小並びに人工関節
の固定改善における予防的用途を有し得る。骨原性薬剤
により新たに誘導される骨形成は、先天的、外傷的また
は腫よう切除による頭顔欠損の修復に貢献し、美容形成
外科においても有用である。この発明の骨生成因子は、
歯周病の処置および他の歯修復プロセスにおいて貴重で
あり得る。これらの薬剤は、骨形成細胞を誘引し、骨形
成細胞の成長を刺激し、または骨形成細胞の原種の分化
を誘導する環境を提供する。勿論、この発明の蛋白質は
他の治療用途を有し得る。 この発明の別の態様は、骨折および骨欠損に関連した
他の状態または歯周病の修復を目的とする治療方法およ
び組成物に関するものである。前記組成物は、この発明
の骨誘導因子蛋白質の少なくとも１種の治療有効量を含
有する。この発明による骨誘導因子は、医薬的に許容し
得る賦形剤またはマトリックスと混合した状態で治療組
成物中に存在し得る。さらにこの発明の治療方法および
組成物は、この発明の骨誘導因子の治療有効量およびこ
の発明の他の骨誘導因子の少なくとも１種の治療有効量
を含む。さらに、この発明による蛋白質またはこの発明
の蛋白質の組合わせは、それが相互作用し得る１種また
はそれ以上の骨誘導因子と共に投与され得る。さらに、
骨誘導蛋白質は、問題の骨欠損の処置に有益な他の薬剤
と組合わされ得る。それらの薬剤には様々な成長因子が
含まれるが、限定される訳ではない。pH、等張性、安定
性などに関して生理学的に許容し得る蛋白質組成物の製
造は、当業界の技術の範囲内である。 特にBMP−１は、組成物において個々に使用され得
る。BMP−１はまた、この発明の他の蛋白質の１種また
はそれ以上と組合わせて使用され得る。BMP−１およびB
MP−２・クラスＩは組合わせて使用され得る。BMP−１
およびBMP−２・クラスIIもまた組合わせて使用され得
る。BMP−１およびBMP−３もまた組合わせて使用され得
る。さらに、BMP−１は、この発明の他の蛋白質の２種
または３種と組合わせて使用され得る。例えば、BMP−
１、BMP−２・クラスＩおよびBMP−２・クラスIIは組合
わされ得る。BMP−１はまた、BMP−２・クラスＩおよび
BMP−３と組合わされ得る。さらに、BMP−１は、BMP−
２・クラスIIおよびBMP−３と組合わされ得る。BMP−
１、BMP−２・クラスＩ、BMP−２・クラスIIおよびBMP
−３は組合わされ得る。 BMP−２・クラスＩは、医薬組成物において個々に使
用され得る。BMP−２・クラスＩもまた、この発明の他
の蛋白質の１種またはそれ以上と組合わせて使用され得
る。BMP−２・クラスＩは、BMP−２・クラスIIと組合わ
され得る。それはまた、BMP−３とも組合わされ得る。
さらにBMP−２・クラスＩは、BMP−２・クラスIIおよび
BMP−３と組合わされ得る。 BMP−２・クラスIIは、医薬組成物において個々に使
用され得る。さらに、それは前述の他の蛋白質と組合わ
せて使用され得る。さらに、それはBMP−３と組合わせ
て使用され得る。 この治療方法は、インプラントまたはデバイスとして
組成物を局所投与することを含む。投与される場合、勿
論この発明で使用される治療組成物は、発熱物質を含ま
ない、生理学的に許容し得る形態を呈する。さらに、こ
の組成物は、望ましくは骨損傷部位への送達に適した粘
稠性形態で封入または注射され得る。好ましくは、骨成
長誘導因子組成物は、骨誘導因子を骨損傷部位に送達
し、成長する硬骨および軟骨構造を提供し得、最適状態
で体内に再吸収され得るマトリックスを含む。それらの
マトリックスは、他の内植医学適応例で現在使用されて
いる他の材料により形成され得る。 材料の選択は、例えば、生物学的適合性、生物分解
性、機構特性、表面的外観および界面特性に基づいて行
なわれる。同様に、骨誘導因子の適用な製剤を限定す
る。骨誘導因子に適用され得るマトリックスは、生物分
解性で化学的に定義されるもの、例えば硫酸カルシウ
ム、燐酸トリカルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ
乳酸、ポリ無水物（ただし、これらに限定される訳では
ない）、生物分解性で生物学的に明確に定義されるも
の、例えば骨もしくは皮膚コラーゲン、他の純粋な蛋白
質または細胞外マトリックス成分、非生物分解性で化学
的に定義されるもの、例えば焼結ヒドロキシアパタイ
ト、生体ガラス、アルミン酸塩または他のセラミック、
または前述のタイプの材料を幾つか組合わせたもの、例
えばポリ酪酸およびヒドロキシアパタイトまたはコラー
ゲンおよび燐酸トリカルシウムであり得る。生体セラミ
ックもまた組成物、例えばカルシウム−アルミン酸塩−
燐酸塩において改変され得、例えば孔サイズ、粒子サイ
ズ、粒子形状および生物分解性の改変が行なわれ得る。 投与量については、この成長因子の作用を修飾する様
々な要因、例えば形成が望まれる骨の重量、骨損傷の部
位、損傷骨の状態、患者の年令、性別および治療食、感
染の重症度、投与時間および他の臨床要因を考慮して担
当医が決定する。用量は、再構成およびBMPの組成物に
おいて使用されるマトリックスのタイプにより変動し得
る。最終組成物への他の既知成長因子、例えばIGF1（イ
ンスリン様成長因子１）の追加もまた用量に影響を与え
得る。一般的に、投与量は、所望の骨重量1g当たり、蛋
白質約10〜106ナノグラムの範囲内とすべきである。経
過は骨成長および／または修復の定期的評価（例、エッ
クス線）によりモニターされ得る。また、これらの治療
組成物は、骨誘導因子における種特異性の欠如故に現在
獣医学適用においても貴重である。ひとに加えて特定の
家畜およびサラブレッドのうまは、この発明の骨誘導因
子による処置において望ましい患者である。 以下の、実施例により、うし蛋白質の回収および特性
検定、それらの使用によるひと蛋白質の回収、ひと蛋白
質の獲得および組換え技術による蛋白質の発現における
この発明の実施態様を説明する。 実施例１ うし骨誘導因子の単離 ウリスト等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ
・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、70:351
1（1973）の方法に従い、破砕したうしの骨粉（20−120
メッシュ、ヘリトレックス）を製造する（ただし、下記
の通り幾つかの抽出工程は省く）。10kgの粉末を、４℃
で48時間激しい撹はん下、0.6NのHClを連続交換しなが
ら脱塩する。生成した懸濁液を４℃で16時間２モルのCa
Cl2および10ミリモルのエチレンジアミン−四酢酸［EDT
A］50lにより抽出し、次いで50lの0.5モルEDTA中で４時
間抽出する。残留物を蒸留水で３回洗浄した後、「クリ
ニカル・オーソペティックス・アンド・リレーデット・
リサーチ」、171:213（1982）の記載に従い、４モルの
グアニジン塩酸塩［GuCl］、20ミリモルのトリス（pH7.
4）、１ミリモルのＮ−エチルマレイミド、１ミリモル
のヨードアセトアミド、１ミリモルのフェニルメチルス
ルホニル・フッ素20lに再懸濁する。16〜20時間後、上
清を除去し、別の10lのGuCl緩衝液と置き換える。残留
物をさらに24時間抽出する。 粗GuC1抽出物を合わせ、10000分子量遮断膜を備えた
ペリコン装置で約20倍に濃縮し、次いで50ミリモルのト
リス、0.1モルのNaCl、６モルの尿素（pH7.2）、第一カ
ラム用出発緩衝液に対して透析する。充分透析後、蛋白
質を４リットルDEAEセルロースカラムに仕込み、未結合
フラクションを集める。 未結合フラクションを濃縮し、６モル尿素中50ミリモ
ルのNaAc、50ミリモルのNaCl（pH4.6）に対して透析す
る。未結合フラクションをカルボキシメチルセルロース
カラムに適用する。カラムに結合していない蛋白質を出
発緩衝液で充分洗浄することにより除去し、骨誘導因子
含有材料を50ミリモルNaAc、0.25ミリモルのNaCl、６モ
ルの尿素（pH4.6）によりカラムから脱着させる。この
段階溶離から得られた蛋白質を20〜40倍に濃縮し、次い
で80ミリモルKPO4、６モル尿素（pH6.0）により５倍に
希釈する。溶液のpHを500ミリモルのK2HPO4により6.0に
調節する。80ミリモルKPO4、６モル尿素（pH6.0）中で
平衡状態にしたヒドロキシルアパタイトカラム（LKB）
に試料を適用し、同緩衝液でカラムを洗浄することによ
り、未結合蛋白質を全て除去する。骨誘導因子活性蛋白
質を100ミリモルKPO4（pH7.4）および６モル尿素により
溶離させる。 この蛋白質を約10倍に濃縮し、固体NaClを加えて最終
濃度0.15モルとする。この材料を、50ミリモルKPO4、15
0ミリモルNaCl、６モル尿素（pH7.4）中で平衡状態にし
たヘパリン−セファロースカラムに適用する。出発緩衝
液でカラムを充分洗浄後、骨誘導因子活性蛋白質を50ミ
リモルKPO4、700ミリモルりNaCl、６モル尿素（pH7.4）
により溶離させる。このフラクションを最小体積に濃縮
し、４モルGuCl、20ミリモルのトリス（pH7.2）により
平衡状態にしたスーパローズ６およびスーパローズ12カ
ラム（一列に連結）に0.4mlアリコートを適用し、カラ
ムを流速0.25ml/分で展開する。骨誘導因子活性を示す
蛋白質は、約30000ダルトンの蛋白質に対応する相対移
動を呈する。 上記フラクションをプールし、50ミリモルNaAc、６モ
ル尿素（pH4.6）に対して透析し、ファルマシア・モノS
HRカラムに適用する。カラムを1.0モルNaCl、50ミリモ
ルNaAc、６モル尿素（pH4.6）への勾配により展開す
る。活性フラクションをプールし、10％トリフルオロ酢
酸（TFA）によりpH3.0とする。この材料を0.1％TFA中0.
46×25cmバイダックC4カラムに適用し、カラムを90％ア
セトニトリル、0.1％TFAへの勾配により展開する（60分
間で31.5％アセトニトリル、0.1％TFAから49.5％アセト
ニトリル、0.1％TFA、ただし１分間1mlの速度）。活性
材料を約40−44％アセトニトリルで溶離する。マッコナ
ヘイ等、「インターナショナル・アーカイブス・オブ・
アラージー」29:185−189（1966）、ボルトン等、「バ
イオケミカル・ジャーナル」、133:529（1973）および
ボーウェン−ポープ、「ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー」、237;5161（1982）の中の一法に
より、適当なフラクションのアリコートをヨウ素化す
る。これらのフラクション中に存在するヨウ素化蛋白質
をSDSゲル電気泳動および尿素トリトンX100等電点電気
泳動により分析する。この段階で、骨誘導因子を評価す
ると、約10−50％純度である。 実施例２ うし骨誘導因子の特性検定 A.分子量 実施例１により得られた20μｇの蛋白質を凍結乾燥
し、１×SDS試験緩衝液に再溶解する。37℃で15分加熱
後、試料を15％SDSポリアクリルアミドゲルに適用し、
次いで冷却しながら電気泳動させる。予め染色した分子
量標準（ベゼスダ・リサーチ・ラブズ）と比べて分子量
を測定する。完了直後、骨誘導因子含有ゲルレーンを0.
3cm片に切断する。各片をすり潰し、1.4mlの0.1％SDSを
加える。試料を室温で一夜穏やかに振り混ぜて蛋白質を
溶離させる。各ゲル片を脱塩することにより、生物学的
検定における干渉を防ぐ。各試料から得た上清を10％TF
AによりpH3.0に酸性化し、0.45ミクロン膜によりろ過
し、0.46cm×5cmC4バイダックカラムに入れ、0.1％TFA
から0.1％TFA、90％CH3CNへの勾配により展開する。適
当な骨誘導因子含有フラクションをプールし、20mgのラ
ット・マトリックスにより再構成する。このゲル・シス
テムにおいて、骨誘導因子フラクションの大部分は、約
28000−30000ダルトンの分子量を有する蛋白質移動度を
有する。 B.等電点電気泳動 骨誘導因子活性の等電点を変成等電点電気泳動システ
ムにおいて測定する。トリトンX100尿素ゲルシステム
（ホーファー・サイエンティフィック）を次の要領で修
正する。１）使用される両性電解質の40％はサーバライ
ト3/10あり、60％はサーバライト７−９である。２）使
用されるカソライト（catholyte）は40ミリモルNaOHで
ある。実施例１で得られた約20μｇの蛋白質を凍結乾燥
し、試料緩衝液に溶解し、等電点電気泳動ゲルに適用す
る。ゲルを20ワット、10℃で約３時間移動させる。完了
時、骨誘導因子含有レーンを0.5cm片に切断する。各片
を1.0mlの６モル尿素、５ミリモルのトリス（pH7.8）中
ですり潰し、試料を室温で振り混ぜる。試料を上記と同
様に酸性化し、ろ過し、脱塩し、検定する。実施例３記
載の検定で測定された活性の大部分は、8.8−0.2のpIと
一致する形で移動する。 C.サブユニットの特性 骨誘導因子のサブユニット組成についても測定する。
純粋な骨誘導因子を上記と同様にプレパラティブ15％SD
Sゲルから分離する。次いで試料の一部を試料緩衝液中
５ミリモルDTTにより還元し、15％SDSゲルにおいて再電
気泳動させる。約30キロダルトン蛋白質は、約20キロダ
ルトンおよび18キロダルトンの箇所で２本の大きなバン
ド並びに30キロダルトンの箇所で小さなバンドを生ず
る。２本のバンドの広さは、恐らくはグルコシル化、他
の翻訳後修飾、蛋白質加水分解による減成またはカルバ
ミル化に起因すると思われる不均質性を示す。 実施例３ 骨誘導因子の生物学的活性 サンパスおよびレディ、「プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ
・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリ
カ」、80:6591−6595（1983）の一般的方法によるラッ
ト骨形成検定を用いることにより、実施例１で得られた
この発明のうし骨誘導因子の骨生成活性を評価する。ま
たこの検定を用いて他の種類の骨誘導因子を評価するこ
とも可能である。エタノール沈澱工程の代わりに検定フ
ラクションの水に対する透析を行う。次いで、溶液また
は懸濁液を揮発性溶媒、例えば0.1−0.2％TFAに再溶解
し、生成した溶液を20mgのラット・マトリックスに加え
る。この材料を冷凍し、凍結乾燥し、生成した粉末を＃
５ゼラチンカプセルに封入する。21−49日令の雄ロング
・エバンス・ラットの腹部胸領域にカプセルを皮下内植
する。７−14日後インプラントを除去する。各インプラ
ントの半分を用いてアルカリ性ホスファターゼ分析［レ
ディ等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナ
イテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、69:1601（197
2）参照］を行い、半分を固定し、組織分析を行う。常
用手順で、１μｍグリコメタクリレート部分をボン・コ
ッサおよび酸性フーシン（fuschin）で染色することに
より、新規骨無機質を検出する。アルカリ性ホスファタ
ーゼ、マトリックス形成プロセスにおいて軟骨芽細胞お
よび骨芽細胞により生産される酵素もまた測定される。
新しい軟骨および硬骨形成はしばしばアルカリ性ホスフ
ァターゼレベルと相関する。下記第１表は、骨誘導因子
により処理されなかった対照を含むラット・マトリック
ス試料の容量応答を示す。 形成された硬骨または軟骨は、マトリックスによりふ
さがれた空間に物理的に閉じ込められる。また、前記と
同様にSDSゲル電気泳動および等電点電気泳動により試
料を分析し、次いでオートラジオグラフィーを行う。分
析は、pI9.0および28−30キロダルトンでの蛋白質バン
ドと活性の相関関係を示す。10D/mg−cmの消衰係数を蛋
白質に関する推定値として使用し、特定フラクション中
の骨誘導因子の純度を近づける。前記希釈物におけるイ
ンビボ ラット骨形成検定において、蛋白質は、10〜20
0ng蛋白質／（骨）ｇ〜恐らくは１μｇ蛋白質／（骨）
ｇより大の比率でインビボ活性を呈する。 実施例４ うし骨誘導因子蛋白質組成物 28−30キロダルトンの分子量を有する実施例2Aの蛋白
質組成物を実施例2Cの記載に従い還元し、トリプシンで
消化する。下記のアミノ酸配列を有する８種のトリプシ
ングラフメントを標準的方法により単離する。 フラグメント1:AAFLGDIALDEEDLG フラグメント2:AFQVQQAADL フラグメント3:NYQDMVVEG フラグメント4:STPAQDVSR フラグメント5:NQEALR フラグメント6:LSEPDPSHTLEE フラグメント7:FDAYY フラグメント8:LKPSN?ATIQSIVE 実施例１記載の方法と類似した精製手順に従い、うし
の骨由来の蛋白質の低級精製製品を製造する。この精製
手順は、DE−52カラム、CMセルロースカラムおよびモノ
Ｓカラムの省略並びにヒドロキシルアパタイトおよびヘ
パリン・セファロースカラムの順での置き換えにより前
記手段からは基本的に変化する。簡単に述べると、濃縮
粗４モル抽出物をエタノール（４度）に加えて85％最終
濃度とする。次いで混合物を遠心分離し、沈澱を50ミリ
モルのトリス、0.15モルNaCl、6.0モル尿素に再溶解す
る。次に、この材料を前記と同様にヘパリン・セファロ
ースにおいて分画化する。ヘパリン結合材料を前記と同
様にヒドロキシアパタイトにおいて分画化する。活性フ
ラクションをプールし、濃縮し、高度分離ゲルろ過にお
いて分画化する（６モルのグアニジニウムクロリド、50
ミリモルのトリス（pH7.2）中TSK30000）。活性フラク
ションをプールし、0.1％TFAに対して透析し、次いで前
記と同様にC4バイダック逆相カラムにおいて分画化す
る。調製物を還元し、アクリルアミドゲルで電気泳動す
る。18Kバンドに対応する蛋白質を溶離させ、トリプシ
ンで消化する。下記のアミノ酸配列を有するトリプシン
フラグメントが分離される。 フラグメント9:SLKPSNHATIQS?V フラグメント10:SFDAYYCS?A フラグメント11:VYPNMTVESCA フラグメント12:VDFADI?W ただし、トリプシン・フラグメント７および８は、実
質的にそれぞれフラグメント10および９であるものとす
る。 A.bBMP−１ レイズ、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー」、183（１）:1−12（1985）の方法に従い、オ
リゴヌクレオチドのプール（または特有のオリゴヌクレ
オチド）を成分とするプローブを設計し、自動DNAシン
セサイザーで合成する。−プローブは、下記ヌクレオチ
ド配列 を有する比較的長い（32ヌクレオチド）「ゲスマー」
［ツール等、「ネイチャー」、312:342−347（1984）］
成分としている。 遺伝子コードは同義性であるため（複数のコドンが同
じアミノ酸をコードし得る）、プローブプールにおける
オリゴヌクレオチドの数は、真核生物におけるコドン使
用頻度、G:T塩基対の相対安定性および真核生物コード
配列におけるジヌクレオチドCpGの相対的希少性に基づ
いて減らされる［ツール等（前出）参照］。第２セット
のプローブは、アミノ酸をコードし得る可能な配列を全
て含む短いオリゴヌクレオチド（長さ17ヌクレオチド）
により構成される。第２セットのプローブは下記配列を
有する。 （ａ）Ａ［A/G］［A/G］TC［T/C］TC［T/C］TC［A/G］T
C［T/C］AA （ｂ）Ａ［A/G］［A/G］TC［T/C］TC［T/C］TC［A/G］T
CNAG 括弧内のヌクレオチドは代替配列である。「Ｎ」はＡ、
Ｔ、ＣまたはＧを意味する。 両場合において、プローブ設計に使用されるアミノ酸
配列の領域は、可能ならば高度変性コドンを避けること
により選択される。オリゴヌクレオチドを自動DNAシン
セサイザーで合成する。次いで、ポリヌクレオチドキナ
ーゼおよび32P−ATPを用いてプローブに放射性標識を行
う。 これら２セットのプローブを用いてうしゲノム組換え
体ライブラリーをスクリーニングする。ライブラリーは
次の要領で構築される。うし肝臓DNAを制限エンドヌク
レアーゼ酵素Sau 3Aにより部分消化し、ショ糖勾配によ
り沈降させる。次に、15−30キロ塩基の範囲でのサイズ
分画DNAをバクテリオファージBamHIベクターEMBL3に結
合する［フリシャウフ等、「ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー」、170:827−842（1983）］。ラ
イブラリーを１プレート当たり組換え体8000個の割合で
培養する。プラークの重複ニトロセルロースレプリカを
作成し、ウー等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・
ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、75:3
688−91（1978）の手順の修正法に従い増幅する。 32merプローブを32P−ガンマーATPによりキナーゼ化
し、45℃で５×SSC、0.1％SDS、５×デンハルツ、100μ
g/mlのサーモン精液DNA中１セットのフィルターとハイ
ブリダイゼーションし、45℃で５×SSC、0.1％SDSによ
り洗浄する。17merプローブをキナーゼ化し、50℃で３
モルのテトラメチルアンモニウムクロリド（TMAC）、0.
1モルの燐酸ナトリウム（pH6.5）、１ミリモルEDTA、５
×デンハルツ、0.6％SDS、100μg/mlサーモン精液DNA中
他のセットのフィルターとハイブリダイゼーショノし、
50℃で３モルTMAC、50ミリモルのトリス（pH8.0）によ
り洗浄する。これらの条件により、17merプローブプー
ルに対する不適当な組合わせの検出は最小限となる［ウ
ッド等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナ
イテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、82:1585−158
8（1985）参照］。この方法により400000個の組換え体
をスクリーニングし、一デュプリケイト陽性をプラーク
精製する。ラムダbP−50と称するこの組換え体バクテリ
オファージのプレートリゼイトからDNAを分離する。bp
−50は、1986年12月16日に受託番号40295としてアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（アメリカ合
衆国メリーランド・ロックビル・パークローン・ドライ
ブ12301）（以後「ATC」と称す）に寄託された。この寄
託物およびこの明細書に含まれる他の寄託物は、特許手
続きを目的とする微生物の寄託の国際的承認に関するブ
ダペスト条約およびその下での規則の必要条件を満たし
ている。このbP−50クローンは、bBMP−１と称するうし
骨成長因子の少なくとも一部をコードする。 このbBMP−１クローンのオリゴヌクレオチド・ハイブ
リダイゼーション領域は、M13中にサブクローン化さ
れ、標準技術により配列された約800bpのEcoRIフラグメ
ントに対して局在している。ラムダbP−50の部分的DNA
配列および誘導されたアミノ酸配列を下記第２表に示
す。牛骨28〜30kd材料から分離されたトリプシンフラグ
メントに対応するアミノ酸配列は、第２表の下線部であ
る。この配列の最初の下線部分は、オリゴヌクレオチド
プローブが設計される上記トリプシンフラグメント１に
対応する。第二の下線部分は、上記トリプシンフラグメ
ント２に対応する。予測されたアミノ酸配列は、トリプ
シンの特異的を考慮して予想した通り、塩基性残基
（Ｒ）がトリプシンフラグメント２の前にあることを示
す。第２表におけるヌクレオチド位置＃292−293のカッ
プレットCTに先行する核酸配列は、コンセンサス受容配
列（すなわち、ピリミジン濃度域、TCTCTCTCC、次にA
G）の存在および誘導されたアミノ酸配列の適当な位置
における塩基性残基の欠如に基づきイントロン（非コー
ド配列）であると思われる。このbBMP−１ゲノム配列は
第２表において明白である。このゲノムクローンからの
推定に基づくbBMP−１ペプチド配列は37アミノ酸長であ
り、第２表におけるヌクレオチド＃294〜＃404のDNA配
列によりコードされる。 B.bBMP−２ フラグメント３のアミノ酸配列に基づき、オリゴヌク
レオチドのプールを成分とする２種のプローブを設計
し、前記と同様に自動DNAシンセサイザーで合成する。 プローブ＃1:ACNACCAT［A/G］TC［T/C］TG［A/G］ATプ
ローブ＃2:CA［A/G］GA［T/C］ATGGTNGTNGA これらのプローブを放射性標識し、これらを用いて、Ａ
項の記載に従い（ただし、ベクターはラムダJ1BamH1arm
sである）構築されたうしゲノムライブラリーをスクリ
ーニングする［ムリンズ等、「ネイチャー」、308:856
−858（1984）］。放射性標識17−merプローブ＃１を、
Ａ項記載の17merプローブに関する方法によるフィルタ
ーのセットとハイブリダイゼーションする。 上記Ａ項記載の手順により400000個の組換え体をスク
リーニングする。−デュプリケイト陽性をプラーク精製
し、DNAを、ラムダbP−21と称する組換えバクテリオフ
ァージの培養リゼイトから分離する。バクテリオファー
ジbP−21は、1987年３月６日にATCC40310の受託番号でA
TCCに寄託された。bP−21クローンは、bBMP−２と称す
るうし成長因子をコードする。 このbBMP−２クローンのオリゴヌクレオチド・ハイブ
リダイゼーション領域は、M13中にサブクローン化さ
れ、標準技術により配列決定された約1.2キロ塩基のSac
I制限フラグメントに対して局在する。このSacIフラグ
メントおよびbP−21の隣接HindIII−SacI制限フラグメ
ントの部分的DNA配列および誘導されたアミノ酸配列を
下記第３表に示す。このクローンからのbBMP−２ペプチ
ド配列は129アミノ酸長であり、ヌクレオチド＃１〜ヌ
クレオチド＃387のDNA配列によりコードされる。牛骨28
〜30kd材料から分離されたトリプシンフラグメントに対
応するアミノ酸配列は、第３表の下線部である。この配
列の下線部分は、bBMP−２に関するオリゴヌクレオチド
プローブが設計される上記トリプシンフラグメント３に
対応する。予測されたアミノ酸配列は、トリプシンの特
異的を考慮して予想した通り、塩基性残基（Ｋ）がトリ
プシンフラグメント３の前にあることを示す。CGTトリ
プレットによりコードされるアルギニン残基は、それに
隣接する停止コドン（TAG）の存在に基づき恐らく蛋白
質のカルボキシ末端であると思われる。C.bBMP−３ トリプシンフラグメント９（プローブ＃３）、10（プ
ローブ＃２）および11（プローブ＃１）のアミノ酸配列
に基づいて、オリゴヌクレオチドのプールを成分とする
プローブを設計し、自動DNAシンセサイザーで合成す
る。 プローブ＃1:ACNGTCAT［A/G］TTNGG［A/G］TA プローブ＃2:CA［A/G］TA［A/G］TANGC［A/G］TC［A/
G］AA プローブ＃3:TG［A/G/T］ATNGTNGC［A/G］TG［A/G］TT 上記Ａ項で詳述したTMACハイブリダイゼーション方法
により、EMBL3において構築された組換えうしゲノムラ
イブラリーをスクリーニングする。400000個の組換え体
を32Pで標識されたプローブ＃１により繰り返しスクリ
ーニングする。このプローブとハイブリダイゼーション
した組換え体は全て二次培養として再培養される。トリ
プリケイト・ニトロセルロース・レプリカは二次培養物
から成り、前記と同様に増幅される。３セットのフィル
ターを再びTMAC条件下でプローブ＃１、＃２および＃３
とハイブリダイゼーションする。一クローン、ラムダbP
−819は３種のプローブ全てとハイブリダイゼーション
する。これをプラーク精製し、DNAをプレートリゼイト
から分離する。バクテリオファージ ラムダbP−819
は、1987年６月16日にATCC40344の受託番号下でATCCに
寄託された。このbP−819クローンは、bBMP−３と称す
るうし骨成長因子をコードする。 プローブ＃２とハイブリダイゼーションするbP−819
の領域は局在して配列している。この領域の部分的DNA
および誘導されたアミノ酸配列を第4A表に示す。トリプ
シンフラグメント10および12に対応するアミノ酸配列は
下線部である。最初の下線部の配列はフラグメント12に
対応し、第２の下線部の配列はフラグメント10に対応す
る。従って、プローブ＃２とハイブリダイゼーションす
るbP−819のこの領域は、少なくとも111個のアミノ酸を
コードする。このアミノ酸配列は、ヌクレオチド＃414
〜＃746のDNA配列によりコードされる。 プローブ＃１および＃３とハイブリダイゼーションす
るbP−819の領域は局在して配列している。この領域の
部分的DNAおよび誘導されたアミノ酸配列を第4B表に示
す。トリプシンフラグメント９および11に対応するアミ
ノ酸配列は下線部である。最初の下線部の配列はフラグ
メント９に対応し、第２の下線部の配列はフラグメント
11に対応する。プローブ＃１および＃３とハイブリダイ
ゼーションするbP−819のこの領域のペプチド配列は、
第4B表のヌクレオチド＃305〜＃493によりコードされる
長さ64個のアミノ酸である。AGAトリプレットによりコ
ードされるアルギニン残基は、それに隣接する停止コド
ン（TAA）の存在に基づき蛋白質のカルボキシ末端であ
ると思われる。カップレットTC（305−306位）に先行す
る核酸配列は、コンセンサス受容配列（すなわち、ポリ
ミジン濃厚域、TTCTCCCTTTTCGTTCCT、次にAG）の存在お
よび誘導されたアミノ酸配列の適当な位置における塩基
性残基以外の停止配列の存在に基づきイントロン（非コ
ード配列）であると思われる。 従って、bBMP−３は、第4A表および第4B表のDNAおよ
びアミノ酸配列を有することを特徴とする。このクロー
ンのペプチド配列は174アミノ酸長であり、第4A表のヌ
クレオチド＃414〜ヌクレオチド＃746および第4B表のヌ
クレオチド＃305〜ヌクレオチド＃493のDNA配列により
コードされる。実施例５ ひと骨誘導因子 A.hBMP−１ うしおよびひとの骨成長因子遺伝子は著しく相同性を
示すと思われるため、第２表のうしbBMP−1 DNA配列
（またはその一部分）をプローブとして用いることによ
り、ひと遺伝子ライブラリーをスクリーニングする。う
しゲノムクローンの800bp EcoRIフラグメントをニック
翻訳により32Pで標識する。ととゲノムライブラリー
（ツール等、前出）を、１プレート当たり組換え体4000
0個の割合で20プレートにおいて培養する。デュプリケ
イト・ニトロセルロースフィルター・レプリカは、各プ
レートで構成されており、50℃で約14時間５×SSC、５
×デンハルツ、100μg/ml変性サーモン精液DNA、0.1％S
DS（標準ハイブリダイゼーション溶液）中ニック翻訳プ
ローブとハイブリダイゼーションされる。次いで、フィ
ルターを50℃で１×SSC、0.1％SDSにより洗浄し、オー
トラジオグラフィーに付す。５つのデュプリケイト陽性
を分離し、プラーク精製する。これらの組換えバクテリ
オファージのうちの１種、LP−H1のプレート・リゼイト
からDNAを得る。LP−H1は1987年３月６日にATCCに寄託
された（受託番号40311）。このクローンは、hBMP−１
というひとゲノム骨成長因子の少なくとも一部分をコー
ドする。LP−H1のハイブリダイゼーション領域は、2.5
キロ塩基XbaI/HindIII制限フラグメントに対して局在し
ている。 ラムダLP−H1の部分的DNA配列および誘導されたアミ
ノ酸配列を下記第５表に示す。このクローンからのペプ
チド配列は37アミノ酸長であり、ヌクレオチド＃3440〜
ヌクレオチド＃3550のDNA配列によりコードされる。第
５表のコード配列の側面には、約28個のヌクレオチド
（推定に基づく５′非コード配列）および約19個のヌク
レオチド（推定に基づく３′非コード配列）が存在す
る。第２表のbBMP−１配列と第５表のhBMP−１ゲノム配
列とを比較すると、両配列真に顕著な相同性の存在する
ことが示される。 コード領域のサイズおよび非コード領域の位置は、一
般に異なる種類の相同性遺伝子においても保持されてい
るため、骨誘導因子遺伝子のコードおよび非コード領域
の配置は同定され得る。相同部位においてシグナルを生
じるRNAが側面に位置する、２種類の遺伝子間の相同性
領域は、コード領域を示す。 第５表に示されたひとコード配列に特異的はプローブ
を用いることにより、骨誘導因子を合成するひとセルラ
インまたは組織を同定する。このプローブは次の方法に
従い作成される。下記配列 を有する２種のオリゴヌクレオチドを自動シンセサイザ
ーで合成し、アニーリングし、エシェリヒア・コリDNA
ポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメントを用いて広
げ、制限酵素EcoRIおよびBamHIにより消化し、M13ベク
ターに挿入する。次に、一本鎖32P標識プローブは、標
準技術によりこのサブクローンの鋳型調製物により作成
される。ツール等の方法（前出）により、様々な細胞お
よび組織供給源由来のポリアデニル化RNAをホルムアル
デヒド−アガロースゲルにより電気泳動させ、ニトロセ
ルロースに移動させる。次いで、このプローブを、42℃
で一夜50％ホルムアミド、５×SSC、0.1％SDS、40ミリ
モルの燐酸ナトリウム（pH6.5）、100μg/mlの変性サー
モン精液DNAおよび５ミリモルのバナジルリボヌクレオ
シド中ニトロセルロース・ブロットとハイブリダイゼー
ションし、0.2×SSC、0.1％SDS中65℃で洗浄する。オー
トラジオグラフィーによると、ひと骨肉腫セルラインＵ
−2 OS由来のRNAを含むレーンは、約4.3および3.0キロ
塩基のRAN種に対応するハイブリダイゼーション・バン
ドを含んでいる。 cDNAをＵ−2 OSポリアデニル化RNAから合成し、確立
された技術による（ツール等、前出）ラムダgt10にクロ
ーン化する。のライブラリーからの組換え体20000個を5
0プレートの各々において培養する。デュプリケイト・
ニトロセルロース・レプリカはこれらのプレートで構成
される。前記オリゴヌクレオチドを32Pガンマ−ATPによ
りキナーゼ化し、55℃で一夜標準ハイブリダイゼーショ
ン溶液中で２セットのレプリカとハイブリダイゼーショ
ンする。次いで、フィルターを55℃で１×SSC、0.1％SD
Sにより洗浄し、オートラジオグラフィーに付す。ラム
ダU2OS−１と称する一デュプリケイト陽性をプラーク精
製する。ラムダU2OS−１は1987年６月16日にATCCに寄託
された（受託番号40343）。 ラムダUSOS−１の挿入体の全ヌクレオチド配列および
誘導されたアミノ酸配列を第６表に示す。このcDNAクロ
ーンは、分泌された蛋白質特有の疎水性リーダー配列が
後に続くメチオニンをコードし、ヌクレオチド位2226−
2228の停止コドンを含む。このクローンは、このアミノ
酸配列に基づき分子量og83キロダルトンを有する730個
のアミノ酸で構成される蛋白質をコードする、2190bpの
オープン・リーディング・フレームを含む。このクロー
ンは、第５表に示したコード領域と同じ配列を含む。こ
の蛋白質は、分泌後開裂してbBMP−１蛋白質を生成する
一次翻訳産物を示すと考えられる。従って、このクロー
ンは、ゲノムhBMP−１配列ラムダLP−H1に含まれるひと
遺伝子フラグメントに対応するhBMP−１のcDMAである。
ただし、BMP−１のアミノ酸＃550〜＃590は、表皮成長
因子並びにプロテインＣ、第Ｘ因子および第IX因子の
「成長因子」領域と相同性である。 B.hBMP−2:クラスＩおよびII 実施例4B記載のHindIII−SacIうしゲノムbBMP−２フ
ラグメントをM13ベクターにサブクローンする。32P−標
識−本鎖DNAプローブは、このサブクローンの鋳型調製
物から作成される。このプローブを用いることにより、
Ａ項で前述された様々な細胞および組織供給源由来のポ
リアデニル化RNAをスクリーニングする。約3.8キロ塩基
のmRNA種に対応するハイブリダイゼーション・バンド
は、ひとセルラインＵ−2 OS由来のRANを含むレーンに
おいて検出される。HindIII−SacIフラグメントをニッ
ク翻訳により32Pで標識し、これを用いて、65℃で一夜
標準ハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイゼ
ーションし、次いで65℃で１×SSC、0.1％SDSにより洗
浄することにより、前記Ｕ−2 OScDNAライブラリーのニ
トロセルロース・フィルター・レプリカをスクリーニン
グする。12個のデュプリケイト陽性クローンを取り上
げ、二次培養として再培養する。デュプリケイト・ニト
ロセルロース・レプリカは二次培養物から成り、一次ス
クリーニングを行なった場合と同様に両セット共うしゲ
ノムプローブとハイブリダイゼーションされる。次いで
65°で一方のセットのフィルターを１×SSC、0.1％SDS
で洗浄し、他方のセットを0.1×SSC、0.1％SDSで洗浄す
る。 ２クラスのhBMP−2 cDNAクローンは、高いストリンジ
ェント洗浄条件下（0.1×SSC、0.1％SDS）において、強
い（４組換え体）または弱い（７組換え体）ハイブリダ
イゼーション・シグナルに基づき明白である。11組換え
バクテリオファージ全部をプラーク精製し、小規模DNA
調製物を各々の培養リゼイトから作成し、配列分析用に
挿入体をpSP65およびM13にサブクローン化する。hBMP−
２・クラスＩと称する（BMP−２としても知られてい
る）強いハイブリダイゼーションクローンの配列分析
は、それらが第３表に示された配列と強い配列相同性を
有することを示す。従ってこれらのクローンは、bBMP−
２遺伝子（この部分配列は第３表に示されている）によ
りコードされる蛋白質のひと均等蛋白質をコードするcD
NAである。hBMP−２・クラスIIと称する（BMP−４とし
ても知られている）弱いハイブリダイゼーション組換え
体の配列分析は、それらもまた、それらのコード領域の
３′末端において第３表に示した配列と全く相同性であ
る（ただし、さらに大きい５′領域ではそれほどではな
い）ことを示す。すなわち、それらは、同一ではない
が、前記構造との類似構造を有するひと蛋白質をコード
する。 完全長のhBMP−２・クラスIcDNAクローンも同様の方
法で得られる。クラスIIサブクローンの１つ（II−10−
１）の1.5キロ塩基挿入体を分離し、ニック翻訳により
放射性標識する。上記でスクリーニングされたＵ−2 OS
cDNAライブラリーのニトロセルロース・レプリカ（50
フィルター、1000000組換え体バクテリオファージに対
応）の１セットを、ストリンジェント条件下（標準ハイ
ブリダイゼーション緩衝液中65°でハイブリダイゼーシ
ョン、65°で0.2×SSC、0.1％SDSで洗浄）でこのプロー
ブとハイブリダイゼーションする。クラスIIプローブと
はハイブリダイゼーションしないうしゲノムプローブと
ハイブリダイゼーションする組換え体全部を選び取り、
プラーク精製する（10組換え体）。プレートのストック
を作り、小規模バクテリオファージDNA調製物を作成す
る。M13へのサブクローニング後、配列分析は、これら
のうち４つが元のクラスＩクローンと部分的に一致する
クローンを表すことを示す。これらの中の１つ、ラムダ
U2OS−39は、約1.5キロ塩基の挿入体を含んでおり、198
7年６月16日付けでATCCに寄託された（受託番号4034
5）。部分的DNA配列（ラムダU2OS−39および幾つかの他
のhBMP−２クラスIcDNA組換え体から編集された）およ
び誘導されたアミノ酸配列を下記第７表に示す。ラムダ
U2OS−39は、その部分配列が第３表に示されているうし
遺伝子セグメントによりコードされる蛋白質BMP−２の
ひと対応部全体をコードするのに必要なヌクレオチド配
列を全て含むものと予想される。このひとcDNA hBMP−
２クラスＩは、396個のアミノ酸から成る蛋白質をコー
ドする、1188bpのオープン・リーディング・フレームを
含む。396個のアミノ酸から成るこの蛋白質は、このア
ミノ酸配列に基づき45キロダルトンの分子量を有する。
この配列は、一次翻訳産物を表すものと考えられる。全
フレームにおいて停止コドンを有する342bpの５′未翻
訳領域がこの蛋白質に先行する。この５′未翻訳領域に
先行する13bp領域は、cDNAクローニング方法で使用され
るリンカーを表す。 完全な長さのhBMP−２・クラスIIひとcDNAクローン
は、次の要領で得られる。クラスII組換えII−10−１の
５′端部からの200bp EcoRI−SacIフラグメントをその
プラスミド・サブクローンから分離し、ニック翻訳によ
り標識し、Ｕ−2 OS cDNAライブラリー（25フィルター
／セット、500000個の組換え体を示す）の１セットのデ
ュプリケイト・ニトロセルロース・レプリカとハイブリ
ダイゼーションする。前記ストリンジェント条件下でハ
イブリダイゼーションおよび洗浄を行う。16デュプリケ
イト陽性を選び取り、二次培養として再培養する。二次
培養のニトロセルロース・フィルター・レプリカを作成
し、II−10−１の配列と対応すべく合成された、下記配
列 を有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション
する。50℃で標準ハイブリダイゼーション緩衝液中でハ
イブリダイゼーションし、１×SSC、0.1％SDSにより50
°で洗浄する。このオリゴヌクレオチドとハイブリダイ
ゼーションする14組換えバクテリオファージをプラーク
精製する。プラーク・ストックを作り、小規模バクテリ
オファージDNA調製物を作成する。これらの中の３つをM
13にサブクローニング後、配列分析は、それらが元のク
ラスIIクラスと部分的に一致するクローンを表すことを
示す。これらの中の１つ、ラムダU2OS−３は1987年６月
16日付けでATCCに寄託された（受託番号40342）。U2OS
−３は約1.8キロ塩基の挿入体を含む。U2OS−３の部分
的DNA配列および誘導されたアミノ酸配列を下記第８表
に示す。このクローンは、全ひとBMP−２・クラスII蛋
白質をコードするのに必要なヌクレオチド配列の全てを
含むものと予想される。このcDNAは、全フレームにおい
て停止コドンを有する394bpの５′未翻訳領域が先行
し、408個のアミノ酸から成る蛋白質をコードする、122
4bpのオープン・リーディング・フレームを含み、イン
−フレーム停止コドンの後に308bpの３′未翻訳領域を
含む。５′未翻訳領域に先行する8bp領域は、cDNAクロ
ーニング方法で使用されるリンカーを表す。408個のア
ミノ酸から成る蛋白質は47キロダルトンの分子量を有
し、一次翻訳産物を表すものと考えられる。 第３、４、７および８表に示されたBMP−２・クラス
ＩおよびII並びにBMP−３の配列は、インヒビンのベー
タ（Ｂ）（InhβＢ）およびベータ（Ａ）（InhβＡ）サ
ブユニットと顕著な相同性を有する。インヒビンは、避
妊における使用に関して現在研究されているホルモンの
一種である。メゾン等、「ネイチャー」、318:659−663
（1985）参照。さらに範囲を狭めると、それらはまた、
ムレリアン阻害物質（MIS）、雄性胚の成長中における
ムレリアン導管の退行を誘発する精巣性糖蛋白質、およ
び細胞の成長を阻害または刺激し得、またはそれらを分
化させ得る形質転換成長因子−ベータ（TCFβ）とも相
同性を呈する。さらに、hBMP−２・クラスＩ、クラスII
をコードする第７表および第８表の配列は、ドロソフィ
ラ・デカペンタプレジック（DPP−Ｃ）遺伝子座転写体
と顕著な相同性を有する。マッサーグ、「セル」、49:4
37−438（1987）、パジェット等、「ネイチャー」、32
5:81−84（1987）、ケート等、「セル」、45:685−698
（1986）参照。従って、BMP−２が、この発生的突然変
異遺伝子座からのこの転写体から作られた蛋白質のひと
相同体であり得ることが考えられる。 以下、これらの相同性を第９表により示す。 C.BMP−３ うしおよびひとの骨成長因子遺伝子が顕著な相同性を
有すると思われるため、第4A表および第4B表のうしDNA
配列とハイブリダイゼーションすることが示されたオリ
ゴヌクレオチド・プローブを用いてひとゲノム・ライブ
ラリーをスクリーニングする。これらのプローブを用い
てひとゲノムライブラリー（ツール等、前出）をスクリ
ーニングし、仮定的陽性を分離すると、前記と同様にDN
A配列が得られる。この組換え体がひと骨誘導因子分子
の一部をコードするという証拠は、うし／ひと蛋白質お
よび遺伝子構造相同性に存する。 一旦ひとBMP−３分子の一部をコードするDNAを含む組
換えバクテリオファージが得られると、実施例５（Ａ）
の記載と同様にひとコード配列をプローブとして用いる
ことにより、BMP−３を合成するひとセルラインまたは
組織を同定する。mRNAをオリゴ（dT）セルロース・クロ
マトグラフィーにより選択し、cDNAを確立させた技術に
より（ツール等、前出）合成し、ラムダgt10においてク
ローン化する。 別法として、このひと骨誘導因子をコードする全遺伝
子は、必要ならば追加の組換えクローンにおいて同定お
よび生成され得る。このひと骨誘導因子遺伝子のさらに
別の３′または５′領域を含む追加の組換え体は、元の
クローンの端部（複数も可）における独特のDNA配列を
同定し、これらをプローブに用いてひとゲノムライブラ
リーを再スクリーニングすることにより生産され得る。
次いで、この遺伝子は、標準的分子生物学技術により単
一プラスミドにおいて再会合され、細菌において増幅さ
れ得る。次に、全ひとBMP−３因子遺伝子は適当な発現
ベクターに移入され得る。次いで、この遺伝子を含む発
現ベクターによりほ乳類細胞、例えばさるCOS細胞をト
ランスフェクションし、その細胞においてひと遺伝子が
転写され、RNAは正確にスプライシングされる。トラン
スフェクションされた細胞の培地を、遺伝子が完全であ
ることの指標としての明細書に記載された骨誘導因子活
性に関して検定する。これらの細胞からmRNAを得、この
mRNA供給源からcDNAを合成し、クローン化する。同様に
上記方法を用い、プローブ供給源としてうし骨誘導因子
および／またはひと骨誘導因子を利用することにより、
興味の対象である他の種類の骨誘導因子を分離すること
が可能である。これらの他の種類の骨誘導因子は、特に
骨折修復において似た有用性を有し得る。 実施例６ 骨誘導因子の発現 うし、ひとまたは他のほ乳類の骨誘導因子を製造する
ために、常用的遺伝子工学技術により、それをコードす
るDNAを適当な発現ベクターに移入し、ほ乳類細胞に導
入する。 当業界の熟練者であれば、第２〜８表の配列または他
の修飾配列並びに既知ベクター、例えばpCD［岡山等、
「モル．セル・バイオル．」、2:161−170（1982）］お
よびpJL3、pJL4［ゴフ等、「EMBO・ジャーナル」、4:64
5−653（1985）］を用いることによるほ乳類発現ベクタ
ーの構築は可能である。これらのベクターを用いた適当
な宿主細胞の形質転換により、骨誘導因子が発現され得
る。当業界の熟練者であれば、コード配列の側面に位置
するほ乳類調節配列を削除またはこれを細胞性配列と置
き換えることにより第２〜８表の配列を操作し、細菌細
胞により細胞内または細胞外発現用細菌性ベクターを構
築することが可能である。例えば、コード配列はさらに
操作（例、他の既知リンカーと結合または他の公知技術
によるそこからの非コード配列の欠失もしくは存在する
ヌクレオチドの改編による修飾）され得る。次いで、修
飾骨誘導因子コード配列は、例えば谷口等、「プロシー
ディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ
・オブ・アメリカ」、77:5230−5233（1980）に記載さ
れた方法を用いて既知細菌性ベクターに挿入され得る。
次いで、この実例的細菌性ベクターにより細菌宿主細胞
を形質転換し、骨誘導因子を発現させ得る。細菌細胞に
おける骨誘導因子の細胞外発現の実施戦略については、
例えばヨーロッパ特許出願EPA177344を参照。 昆虫細胞で発現させる昆虫性ベクターの構築について
も同様の操作が実施され得る［例えば、公開されたヨー
ロッパ特許出願155476記載の方法を参照］。酵母ベクタ
ーもまた、酵母細胞によるこの発明の因子の細胞内また
は細胞外発現を目的とする酵母調節配列を用いて構築さ
れ得る。［例えば、公開PCT出願WO86/00639およびヨー
ロッパ特許出願EPA123289参照］。 ほ乳類細胞から高レベルの本発明骨誘導因子を製造す
る方法は、異種骨誘導因子遺伝子の多数のコピーを含む
細胞の構築を含む。異種遺伝子は、増幅可能なマーカ
ー、例えばジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子（この
場合、カウフマンおよびシャープ、「ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー」、159:601−629（198
2）の方法に従い、多量の遺伝子コピーを含む細胞が、
メトトレキセート（MTX）の高濃縮液における伸長に関
して選択され得る）に結合され得る。この方法は幾つか
の異なる細胞タイプにより使用され得る。 例えば、この発明の骨誘導因子に関するDNA配列を含
むプラスミドは、その発現を可能にする他のプラスミド
配列およびDHFR発現プラスミドpAdA26SV（Ａ）３［カウ
フマンおよびシャープ、「モレキュラー・アンド・セル
ラー・バイオロジー」、2:1304（1982）］と効果的に組
合わされて、燐酸カルシウム共沈澱およびトランスフェ
クションによりDHFR−欠失CHO細胞、DUKX−BII中に共に
導入され得る。DHFR発現形質転換体を、透析うし胎児血
清を含むアルファ培地での成長に関して選択し、続いて
MTX高濃縮液（0.02、0.2、1.0および５マイクロモルのM
TXにおける連続段階）での成長による増幅に関して選択
する［カウフマン等、「モレキュラー・アンド・セラー
・バイオロジー」、5:1750（1983）の記事による］。形
質転換体をクローン化し、ラット骨形成検定により生物
学的活性骨誘導因子発現をモニターする。骨誘導因子発
現はMTX耐性のレベルが高くなると、増加すべきであ
る。同様の方法は、他の骨誘導因子の製造にも使用され
得る。 別法として、ひと遺伝子は前記に従い直接的に発現さ
れる。活性骨誘導因子は細菌または酵母細胞において製
造され得る。しかしながら、生物学的活性組換えひと骨
誘導因子に対して現在好ましい発現系は、安定して形質
転換されたCHO細胞である。 一実施態様として、実施例５のひと骨誘導因子（hBMP
−１）を製造するためには、SalI消化によりU2OS−１の
挿入体をベクターarmsから放出させ、XhoIにより消化さ
れたほ乳類発現ベクターpMT2CXにサブクローン化する。
DEAE−デキストラン方法を用いて［ソンパイラックおよ
びダンナ、「PNAS」、78:7575−7578（1981）、ルトマ
ンおよびマグヌッソン、「ニュクレイック・アシッズ・
リサーチ」、11:1295−1308（1983）］、このサブクロ
ーンからのプラスミドDNAによりCOS細胞をトランスフェ
クションする。血清不含有24時間条件培地を細胞から集
める（トランスフェクションの40−70時間後開始）。 ほ乳類発現ベクターpMT2 Cla−Xho（pMT2CX）は、p91
023（ｂ）（ウォング等、「サイエンス」、228:810−81
4,1985年）の誘導体であり、後者がテトラサイクリン耐
性遺伝子ではなくアンピシリン耐性遺伝子を含み、さら
にcDNAクローンの挿入に関するXhoI部位を含む点で相異
する。pMT2Cla−Xhoの機能的要素については既に記載さ
れており（カウフマン、1985年、プロシーディングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ーズ・オブ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリ
カ、82:689−693）、アデノウイルスVA遺伝子、72bpエ
ンハンサーを含むSV40複製開始点、５′スプライス部位
を含むアデノウイルス主後期プロモーターおよびアデノ
ウイルス三部分リーダー配列の大部分（アデノウイルス
後期mRNAに存在）、３′スプライス受容部位、DHFR挿入
体、SV40早期ポリアデニレーション部位（SV40）並びに
エシェリヒア・コリにおける伸長に必要とされるpBR322
配列が含まれる。 プラスミドpMT2 Cla−Xhoは、pMT2−VWFのEcoRI消化
により得られる［アメリカ合衆国、メリーランド、ロッ
クビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（ATCC）に寄託された（受託番号ATCC67122）］。Eco
RI消化によりpMT2−VWFに存在するcDNA挿入体が切除さ
れ、線状形態のpMT2が生成する。これを結合して用いる
ことにより、エシェリヒア・コリHB101またはDH−５を
アンピシリン耐性に形質転換することができる。プラス
ミドpMT2 DNAは常法により製造され得る。次に、pMT2を
EcoRVおよびXbaIで消化し、消化されたDNAをDNAポリメ
ラーゼＩのクレノウ・フラグメントで処理し、Claリン
カー（ネバイオラブズ、CATCGATG）を結合することによ
りpMT2CXが構築される。これは、SV40複製開始点付近の
HindIII部位から出発する塩基2266〜2421およびpMT2の
エンハンサー配列を除く。次に、プラスミドDNAをEcoRI
で消化し、前記と同様にプラント化し、EcoRIアダプタ
ーに結合し、 XhoIで消化し、結合することによりpMT2 Cla−Xhoが得
られ、次いでこれを用いてエシェリヒア・コリをアンピ
シリン耐性に形質転換することができる。プラスミドpM
T2 Cla−Xho DNAは常法により製造され得る。 得られた骨誘導因子は、通常の蛋白質分離・精製法に
よって分離及び精製される。これらの方法に特に限定は
なく、ゲル濾過法、アフィニティークロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグ
ラフィー、HPLC等を組み合わせて用いることができる。
分離・精製は、ラット骨形成検定による生物学的活性お
よび／または抽出ウシ骨誘導因子の特性検定結果等を指
標として効率的に用い得る。 実施例７ 発現した骨誘導因子の生物学的活性 A.BMP−１ 上記実施例６で得られた発現した骨誘導因子（hBMP−
１）の生物学的活性を測定する。因子をヘパリン・セフ
ァロースカラムにおいて部分的に精製する。１枚の100m
m皿から得たトランスフェクション上清4mlを、YM10膜を
用いた限外ろ過により約10倍に濃縮し、次いで20ミリモ
ルのトリス、0.15モルNaCl（pH7.4）（出発緩衝液）に
対して透析する。次に、この材料を出発緩衝液中1.1ml
ヘパリン・セファロースカラムに適用する。出発緩衝液
の8ml洗浄液により未結合蛋白質を除去し、20ミリモル
のトリス、2.0モルNaCl（pH7.4）の３−4ml洗浄液によ
りBMP−１を含む結合蛋白質を脱着させる。 ヘパリンカラムにより結合した蛋白質をセントリコン
10において約10倍に濃縮し、0.1％トリフルオロ酢酸を
用いてジアフィルトレーションすることにより塩を還元
する。この溶液の適量を20mgのラットマトリックスと混
合し、次いで前記実施例３の記載に従いインビボ骨およ
び軟骨形成に関して検定する。MOCK（モック）トランス
フェクション上清分画を対照として使用する。 特定量のひとBMP−１が加えられたラットマトリック
スを含むインプラントを７日後にラットから除去し、組
織評価を行う。各インプラントからの代表的部分を、新
規骨無機質の存在に対してボン・コッサおよび酸性フー
シンにより染色し、軟骨特異的マトリックス形成の存在
に対してトルイジンブルーにより染色する。その部分内
に存在する細胞のタイプおよびこれらの細胞が表現型を
示す程度を評価する。 ひとBMP−１をマトリックス材料に加えると、内植の
７日後に軟骨様小節が形成された。軟骨芽（細胞）型細
胞は、形状および異染性マトリックスの発現により認識
され得る。ひとBMP−１において観察される活性の量
は、マトリックスに加えられたひとBMP−１蛋白質の量
により異なった。第９表は、観察された骨誘導量に対す
るひとBMP−１蛋白質の用量応答関係を示す。 類似レベルの活性は、ヘパリンセファロース分画COS
細胞抽出物においても観察される。６モル尿素が全緩衝
液に含まれること以外は前記方法と同様の方法で部分精
製を実施する。さらに、上記ラット骨形成検定におい
て、BMP−２も同様に軟骨形成活性を示した。 上記方法を用い、プローブ供給源としてうし骨誘導因
子および／またはひと骨誘導因子を利用することにより
興味深い他の骨誘導因子を分離することができる。それ
らの他の骨誘導因子は、特に骨折修復において似た有用
性を呈し得る。 以上、この発明の好ましい実施態様について詳細に記
載した。その実施に際し、これらの記載事項を考慮して
多くの修正および変更が行なわれることは当業界の熟練
者であれば容易に想到し得るはずである。それらの修正
および変更も後記請求の範囲内に包含されるものと考え
られる。 微生物 寄託機関の名称 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション 寄託機関の住所 12301 パークローン・ドライブ ロックビル、メリーランド20852、アメリカ合衆国
するものである。これらの蛋白質は軟骨および硬骨の形
成を誘導し得る。 背景の技術 骨は、蛋白質コラーゲンの線維束、およびプロテオグ
リカン、非コラーゲン性蛋白質、脂質および酸性蛋白質
により形成された広範なマトリックス構造を特徴とする
高度に分化した組織である。一生を通じて連続的に行な
われる骨形成および骨組織の再生／修復のプロセスは、
分化細胞により行なわれる。正常な胎長骨の発達の前
に、軟骨のひな形が形成される。骨の成長は恐らく「骨
芽細胞（骨形成細胞）の介在によると思われる、骨の再
建は明らかに骨吸収細胞、いわゆる「破骨細胞」および
骨芽細胞の結合活性により行なれる。様々な骨原性軟骨
誘導および硬骨誘導因子が報告されている。それらに関
しては、例えばヨーロッパ特許出願第148155号および同
第169016号参照。 発明の簡単な記載 この発明は、純粋形態の新規蛋白質を提供する。具体
的には、４種の新規蛋白質は、BMP−１、BMP−２・クラ
スＩ（またはBMP−２）、BMP−３およびBMP−２・クラ
スII（またはBMP−４）（ただし、BMPは骨形態形成蛋白
質である）と称する。これらの蛋白質は、後記第２〜８
表に示したアミノ酸配列と同一または実質的に相同性の
ペプチド配列を特徴とする。それらは予め定められた部
位での骨形成を誘導し得る。さらにこれらの骨誘導因子
は、後記インビボラット骨形成検定における10〜1000ng
/g（骨）の濃度での活性を含む生化学的および生物学的
特性を特徴とする。この発明の蛋白質は、表に示したDN
A配列、またはそれとハイブリダイゼーションし、骨成
長因子の生物学的特性を有するポリペプチドをコードし
得る配列またはそれらの特性を示す他の様々な修飾配列
によりコードされ得る。 この発明の蛋白質の１つはBMP−１という。ひとBMP−
１またはhBMP−１の１部分は、ゲノムhBMP−１フラグメ
ントを表す後記第５表のアミノ酸＃１〜アミノ酸＃37ま
たはhBMP−1 cDNAを表す第６表のアミノ酸＃１〜アミノ
酸＃730の配列と同一または実質的に同じペプチド配列
を有することを特徴とする。さらに、hBMP−１または関
連骨誘導因子は、これらの配列の少なくとも一部分を有
することを特徴とし得る。これらのペプチド配列は、第
５表のヌクレオチド＃3440〜ヌクレオチド＃3550および
第６表のヌクレオチド＃36〜ヌクレオチド＃2225にそれ
ぞれ示された配列と同一または実質的に同じDNA配列に
よりコードされる。さらに、これらのhBMP−１ポリペプ
チドは骨形成誘導能を有することを特徴とする。nBMP−
１は、骨1g当たり10〜1000ngの濃度でインビボラット骨
形成検定において活性を呈する。 この発明の相同性うし成長因子（bBMP−１と称す）
は、ゲノムbBMP−１フラグメントを表す後記第２表のア
ミノ酸＃１〜アミノ酸＃37の配列と同一または実質的に
同じ配列を含むペプチド配列を有することを特徴とす
る。このペプチド配列は、後記第２表のヌクレオチド＃
294〜ヌクレオチド＃404に示された配列は、後記第２表
のヌクレオチド＃294〜ヌクレオチド＃404に示された配
列と同一または実質的に同じDNA配列によりコードされ
る。後記第２表で同定されたうしペプチド配列もまた37
アミノ酸長である。さらに、bBMP−１は骨形成誘導能を
特徴とする。 この発明の別の骨誘導蛋白質組成物は、BMP−２・ク
ラスＩ（またはBMP−２）と称する。それは、cDNA hBMP
−２・クラスＩを表す第７表のアミノ酸＃１〜アミノ酸
＃396の配列と同一または実質的に同じペプチド配列の
少なくとも一部分を有することを特徴とする。このペプ
チド配列は、第７表のヌクレオチド＃356〜ヌクレオチ
ド＃1543に示された配列と同一または実質的に同じDNA
配列によりコードされる。第７表で同定されたひとペプ
チド配列は396アミノ酸長である。またhBMP−２または
関連骨誘導蛋白質もこのペプチド配列の少なくとも一部
分を有することを特徴とし得る。さらにhBM−２・クラ
スＩは、骨形成誘導能を特徴とする。 hBMP−２・クラスＩ（またはhBMP−２）と称するこの
発明の相同性うし骨誘導蛋白質は、ゲノム配列を表す後
記３表で同定されたDNA配列を有する。このうしDNA配列
は、予想される129アミノ酸コード配列、次いで約205個
のヌクレオチド（３′非コード配列）を有する。さらに
hBMP−２・クラスＩは骨形成誘導能を特徴とする。この
発明の別の骨誘導蛋白質組成物は、BMP−２・クラスII
またはBMP−４と称する。ひと蛋白質hBMP−２・クラスI
I（またはhBMP−４）は、nBMP−２・クラスIIのcDNAを
表す第８表のアミノ酸＃１〜アミノ酸＃408間の配列と
同一または実質的に同じペプチド配列の少なくとも一部
分を有することを特徴とする。このペプチド配列は、第
８表のヌクレオチド＃403〜ヌクレオチド＃1626に示さ
れた配列と同一または実質的に同じDNA配列の少なくと
も一部分によりコードされる。さらにこの因子は、骨形
成誘導能を特徴とする。 この発明のさらに別の骨誘導因子、BMP−３、うし相
同体bBMP−３により示される。bBMP−３は、うしゲノム
配列を表す第4AおよびＢ表のDNA配列およびアミノ酸配
列を有することを特徴とする。それは、第4AおよびＢ表
のアミノ酸＃１〜アミノ酸＃174と同一または実質的に
同じペプチド配列の少なくとも一部分を有することを特
徴とする。さらにBMP−３は、骨形成誘導能を特徴とす
る。うし因子は、類縁体ひとBMP−３蛋白質または他の
ほ乳類骨誘導蛋白質を得るための道具として使用され得
る。このうし骨誘導因子の特性を正確に表すと、この配
列を用いる方法における本質的「出発点」が得られる。
遺伝子工学技術分野における熟練者に周知の技術を用い
るこの方法は、プローブとしてうしDNA配列を使用して
ひとゲノムまたはcDNAライブラリーのスクリーニングを
行い、このプローブとハイブリダイゼーションするDNA
配列を同定することを含む。ハイブリダイゼーション可
能な配列を有するクローンは精製されたプラークであ
り、DNAはそこから分離され、サブクローンされ、DNA配
列分析が行なわれる。すなわち、この発明の別の態様
は、この方法により製造されたひと蛋白質hBMP−３であ
る。 この発明の別の態様は、医薬的に許容し得る賦形剤中
にこの発明によるうし成長因子ポリペプチドの１種また
はそれ以上の治療有効量を含有する医薬組成物に関する
ものである。さらに、これらの組成物は他の治療上有用
な薬剤を含有し得る。またそれらは、骨欠損部位への蛋
白質送達および骨成長構造の提供に適したマトリックス
を含み得る。これらの組成物は、幾つかの骨欠損および
歯周病の処置方法において使用され得る。この発明によ
ると、これらの方法は、骨形成を必要とする患者に、本
明細書に記載された新規蛋白質BMP−１、BMP−２・クラ
スＩ、BMP−２・クラスIIおよびBMP−３の少なくとも１
種の有効量を投与することを必然的に伴う。 さらにこの発明の別の態様は、骨形成誘導能を有する
ひとまたはうしポリペプチドの発現をコードするDNA配
列に関するうものである。それらの配列は、第２〜８表
に示された５′−３′方向のヌクレオチド配列を含む。
他方、ストリンジェント条件下で第２〜８表のDNA配列
とハイブリダイゼーションするDNA配列、または非スト
リンジェント条件下で示されたDNA配列とハイブリダイ
ゼーションし、少なくとも１種の骨成長因子生物学的特
性を有する蛋白質の発現をコードするDNA配列もこの発
明に包含される。最後に、第２〜８表の配列の対立遺伝
子または他の変形もまた、それらのヌクレオチド変形の
結果としてのペプチド配列の変形の存否に拘わらず、こ
の発明に含まれる。 さらにこの発明の他の態様は、前記DNA配列を発現制
御配列と効果的に組み合わせて含むベクターに関するも
のである。このベクターは、発現制御配列と効果的に共
同して骨成長因子ポリペプチドの発現をコードするDNA
配列により形質転換されたセルラインが培養される、骨
成長因子ポリペプチドの新規製造方法において使用され
得る。この発明の方法は、ポリペプチド発現用の宿主細
胞として幾つかの公知細胞を使用し得る。現在好ましい
セルラインはほ乳類セルラインおよび細菌細胞である。 以下、詳細な記載および好ましい実施態様を熟考すれ
ば、この発明の他の態様および利点は明らかである。 発明の詳細な記載 この発明の蛋白質は、後記第２〜８表に示された配列
と同一または実質的に相同性のアミノ酸配列またその一
部分を有することを特徴とする。これらの蛋白質もまた
骨形成誘導能を特徴とする。 また、この明細書に記載された骨成長因子は、第２〜
８表の配列に類似した配列によりコードされる因子を含
むが、その配列に対する修飾は、自然に行なわれるか
（例、ポリペプチドにおけるアミノ酸変更を誘導し得る
ヌクレオチド配列における対立遺伝子的改編）または慎
重な工学的処理により行なわれる。例えば、合成ポリペ
プチドは、第２〜８表のアミノ酸残基の連続配列を全体
的または部分的に複製し得る。これらの配列は、第２〜
８表の骨成長因子ポリペプチドと共有の一次、二次また
は三次構造および立体配座特性により、共通して骨成長
因子生物学的特徴を有し得る。すなわち、それらは、治
療プロセスにおいて天然骨成長因子ポリペプチドの生物
学的活性代用物として使用され得る。 この明細書に記載された骨成長因子の配列の他の特異
的突然変異体は、グリコシル化部位の一方または両方の
修飾を伴う。グリコシル化の不在または一部のみのグリ
コシル化は、第２〜８表に示された骨成長因子の配列に
存在するアスパラギン結合グリコシル化認識部位の一方
または両方におけるアミノ酸置換または欠失に起因す
る。アルパラギン結合グリコシル化認識部位は、適当な
細胞のグリコシル化酵素により特異的に認識されるトリ
ペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、ア
スパラギン−Ｘ−トレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−
セリン（ただし、Ｘは通常アミノ酸である）である。グ
リコシル化認識部位の第一または第三アミノ酸位の一方
または両方における様々なアミノ酸置換または欠失（お
よび／または第２位におけるアミノ酸欠失）は、修飾ト
リペプチド配列における非グリコシル化をもたらす。 またこの発明は、他の蛋白質性材料をコードするDNA
配列との随伴がなく、骨成長因子の発現をコードする新
規DNA配列を（アレリック）包含する。これらのDNA配列
は、５′−３′方向の第２〜８表に示された配列および
ストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件［マニ
アチス等、「モレキュラー・クローニング（ア・ラボラ
トリー・マニュアル）」、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー（1982）、387〜389頁参照］下で第
２〜８表のDNA配列とハイブリダイゼーションする配列
を含む。 緩和ハイブリダイゼーション条件下で第２〜８表の配
列とハイブリダイゼーションし、骨成長因子生物学的特
性を有する骨成長因子の発現をコードするDNA配列はま
た、この発明の骨成長因子もコードする。例えば、重要
な相同性を有する領域、例えばグリコシル化またはジス
ルフィド結合部位を第２〜８表の配列と共有し、１種ま
たはそれ以上の骨成長因子生物学的特性を有する骨成長
因子をコードするDNA配列は、DNA配列が第２〜８表の配
列とストリンジェント的にハイブリダイゼーションしな
い場合でも、成長因子のこの新たな科の一員を明らかに
コードする。 同様に、第２〜８表の配列によりコードされる骨成長
因子ポリペプチドをコードするが、遺伝子コードの縮重
またはアレリック変異（アミノ酸変更を誘導する場合も
しない場合もあり得る種の集団における天然塩基の変
形）故にコドン配列が異なるDNA配列もまた、この明細
書に記載された新規成長因子をコードする。点突然変異
または誘導修飾によりポリペプチドの活性、半減期また
は生産の向上が誘発される第２〜８表のDNA配列におけ
る変形もまたこの発明に包含される。 この発明の別の態様は、新規骨誘導因子の新規製造方
法に関するものである。この発明の方法は、既知調節配
列の制御下、この発明の新規骨成長因子ポリペプチドの
発現をコードするDNA配列により形質転換された適当な
細胞またはセルラインの培養を含む。適当な細胞または
セルラインは、ほ乳類細胞、例えばチャイニーズ・ハム
スター卵巣細胞（CHO）であり得る。適当なほ乳類宿主
細胞の選択並びに形質転換、培養、増幅、スクリーニン
グ、および製品の製造および精製の方法は当業界では周
知である。例えば、ゲシングおよびサンブルック、「ネ
イチャー」、293、620−625（1981）または別法として
カウフマン等、「モル・セル・バイオル」、５（７）17
50−1759（1985）またはハウレイ等、アメリカ合衆国特
許第4419446号参照。後記実施例記載の別の適当なほ乳
類セルラインは、さるCOS−１セルラインである。同様
に有用なほ乳類セルラインはCV−１セルラインである。 細菌細胞は適当な宿主である。例えば、エジェリヒア
・コリの様々な株（例、HB101、MC1061）はバイオテク
ノロジー分野において宿主細胞としてよく知られてい
る。枯草菌（バシルス・サブチリス）、プソイドモナ
ス、他のかん菌などの様々な株もまたこの方法において
使用され得る。 当業界の熟練者には周知の多くの酵母細胞株もまた、
この発明のポリペプチドの発現用の宿主細胞として利用
され得る。さらに、所望により、昆虫細胞もこの発明の
方法における宿主細胞として利用され得る。例えば、ミ
ラー等、「ジェネティック・エンジニアリング」、８、
277−298（プレナム・プレス1986）およびその引用文献
参照。 この発明の別の態様は、これらの新規骨誘導ポリペプ
チド類の発現方法で使用されるベクターに関するもので
ある。好ましくは、これらのベクターは、この発明の新
規因子をコードする前述の完全な新規DNA配列を含む。
さらにまた、これらのベクターは、骨誘導蛋白質配列を
発現させる適当な発現制御配列を含む。他方、上記修飾
配列が組み込まれたベクターはまた、この発明の具体例
であり、骨誘導蛋白質の製造に有用である。これらのベ
クターはセルラインの形質転換方法で使用され得、選択
された宿主細胞におけるその複製および発現を指向し得
るこの発明のDNAコード配列と効果的に組み合わせて選
択された調節配列を含み得る。これらのベクターに有用
な調節配列は当業界の熟練者には周知であり、選択され
た宿主細胞に応じて選択され得る。この選択は常套的で
あり、この発明の一部を形成するものではない。 骨が正常に形成されない環境において骨の成長を誘導
するこの発明の蛋白質は、骨折の治療に適用性を有す
る。この発明の蛋白質の１種またはそれ以上を用いる骨
原性製剤は、閉鎖および複雑骨折の縮小並びに人工関節
の固定改善における予防的用途を有し得る。骨原性薬剤
により新たに誘導される骨形成は、先天的、外傷的また
は腫よう切除による頭顔欠損の修復に貢献し、美容形成
外科においても有用である。この発明の骨生成因子は、
歯周病の処置および他の歯修復プロセスにおいて貴重で
あり得る。これらの薬剤は、骨形成細胞を誘引し、骨形
成細胞の成長を刺激し、または骨形成細胞の原種の分化
を誘導する環境を提供する。勿論、この発明の蛋白質は
他の治療用途を有し得る。 この発明の別の態様は、骨折および骨欠損に関連した
他の状態または歯周病の修復を目的とする治療方法およ
び組成物に関するものである。前記組成物は、この発明
の骨誘導因子蛋白質の少なくとも１種の治療有効量を含
有する。この発明による骨誘導因子は、医薬的に許容し
得る賦形剤またはマトリックスと混合した状態で治療組
成物中に存在し得る。さらにこの発明の治療方法および
組成物は、この発明の骨誘導因子の治療有効量およびこ
の発明の他の骨誘導因子の少なくとも１種の治療有効量
を含む。さらに、この発明による蛋白質またはこの発明
の蛋白質の組合わせは、それが相互作用し得る１種また
はそれ以上の骨誘導因子と共に投与され得る。さらに、
骨誘導蛋白質は、問題の骨欠損の処置に有益な他の薬剤
と組合わされ得る。それらの薬剤には様々な成長因子が
含まれるが、限定される訳ではない。pH、等張性、安定
性などに関して生理学的に許容し得る蛋白質組成物の製
造は、当業界の技術の範囲内である。 特にBMP−１は、組成物において個々に使用され得
る。BMP−１はまた、この発明の他の蛋白質の１種また
はそれ以上と組合わせて使用され得る。BMP−１およびB
MP−２・クラスＩは組合わせて使用され得る。BMP−１
およびBMP−２・クラスIIもまた組合わせて使用され得
る。BMP−１およびBMP−３もまた組合わせて使用され得
る。さらに、BMP−１は、この発明の他の蛋白質の２種
または３種と組合わせて使用され得る。例えば、BMP−
１、BMP−２・クラスＩおよびBMP−２・クラスIIは組合
わされ得る。BMP−１はまた、BMP−２・クラスＩおよび
BMP−３と組合わされ得る。さらに、BMP−１は、BMP−
２・クラスIIおよびBMP−３と組合わされ得る。BMP−
１、BMP−２・クラスＩ、BMP−２・クラスIIおよびBMP
−３は組合わされ得る。 BMP−２・クラスＩは、医薬組成物において個々に使
用され得る。BMP−２・クラスＩもまた、この発明の他
の蛋白質の１種またはそれ以上と組合わせて使用され得
る。BMP−２・クラスＩは、BMP−２・クラスIIと組合わ
され得る。それはまた、BMP−３とも組合わされ得る。
さらにBMP−２・クラスＩは、BMP−２・クラスIIおよび
BMP−３と組合わされ得る。 BMP−２・クラスIIは、医薬組成物において個々に使
用され得る。さらに、それは前述の他の蛋白質と組合わ
せて使用され得る。さらに、それはBMP−３と組合わせ
て使用され得る。 この治療方法は、インプラントまたはデバイスとして
組成物を局所投与することを含む。投与される場合、勿
論この発明で使用される治療組成物は、発熱物質を含ま
ない、生理学的に許容し得る形態を呈する。さらに、こ
の組成物は、望ましくは骨損傷部位への送達に適した粘
稠性形態で封入または注射され得る。好ましくは、骨成
長誘導因子組成物は、骨誘導因子を骨損傷部位に送達
し、成長する硬骨および軟骨構造を提供し得、最適状態
で体内に再吸収され得るマトリックスを含む。それらの
マトリックスは、他の内植医学適応例で現在使用されて
いる他の材料により形成され得る。 材料の選択は、例えば、生物学的適合性、生物分解
性、機構特性、表面的外観および界面特性に基づいて行
なわれる。同様に、骨誘導因子の適用な製剤を限定す
る。骨誘導因子に適用され得るマトリックスは、生物分
解性で化学的に定義されるもの、例えば硫酸カルシウ
ム、燐酸トリカルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ
乳酸、ポリ無水物（ただし、これらに限定される訳では
ない）、生物分解性で生物学的に明確に定義されるも
の、例えば骨もしくは皮膚コラーゲン、他の純粋な蛋白
質または細胞外マトリックス成分、非生物分解性で化学
的に定義されるもの、例えば焼結ヒドロキシアパタイ
ト、生体ガラス、アルミン酸塩または他のセラミック、
または前述のタイプの材料を幾つか組合わせたもの、例
えばポリ酪酸およびヒドロキシアパタイトまたはコラー
ゲンおよび燐酸トリカルシウムであり得る。生体セラミ
ックもまた組成物、例えばカルシウム−アルミン酸塩−
燐酸塩において改変され得、例えば孔サイズ、粒子サイ
ズ、粒子形状および生物分解性の改変が行なわれ得る。 投与量については、この成長因子の作用を修飾する様
々な要因、例えば形成が望まれる骨の重量、骨損傷の部
位、損傷骨の状態、患者の年令、性別および治療食、感
染の重症度、投与時間および他の臨床要因を考慮して担
当医が決定する。用量は、再構成およびBMPの組成物に
おいて使用されるマトリックスのタイプにより変動し得
る。最終組成物への他の既知成長因子、例えばIGF1（イ
ンスリン様成長因子１）の追加もまた用量に影響を与え
得る。一般的に、投与量は、所望の骨重量1g当たり、蛋
白質約10〜106ナノグラムの範囲内とすべきである。経
過は骨成長および／または修復の定期的評価（例、エッ
クス線）によりモニターされ得る。また、これらの治療
組成物は、骨誘導因子における種特異性の欠如故に現在
獣医学適用においても貴重である。ひとに加えて特定の
家畜およびサラブレッドのうまは、この発明の骨誘導因
子による処置において望ましい患者である。 以下の、実施例により、うし蛋白質の回収および特性
検定、それらの使用によるひと蛋白質の回収、ひと蛋白
質の獲得および組換え技術による蛋白質の発現における
この発明の実施態様を説明する。 実施例１ うし骨誘導因子の単離 ウリスト等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ
・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、70:351
1（1973）の方法に従い、破砕したうしの骨粉（20−120
メッシュ、ヘリトレックス）を製造する（ただし、下記
の通り幾つかの抽出工程は省く）。10kgの粉末を、４℃
で48時間激しい撹はん下、0.6NのHClを連続交換しなが
ら脱塩する。生成した懸濁液を４℃で16時間２モルのCa
Cl2および10ミリモルのエチレンジアミン−四酢酸［EDT
A］50lにより抽出し、次いで50lの0.5モルEDTA中で４時
間抽出する。残留物を蒸留水で３回洗浄した後、「クリ
ニカル・オーソペティックス・アンド・リレーデット・
リサーチ」、171:213（1982）の記載に従い、４モルの
グアニジン塩酸塩［GuCl］、20ミリモルのトリス（pH7.
4）、１ミリモルのＮ−エチルマレイミド、１ミリモル
のヨードアセトアミド、１ミリモルのフェニルメチルス
ルホニル・フッ素20lに再懸濁する。16〜20時間後、上
清を除去し、別の10lのGuCl緩衝液と置き換える。残留
物をさらに24時間抽出する。 粗GuC1抽出物を合わせ、10000分子量遮断膜を備えた
ペリコン装置で約20倍に濃縮し、次いで50ミリモルのト
リス、0.1モルのNaCl、６モルの尿素（pH7.2）、第一カ
ラム用出発緩衝液に対して透析する。充分透析後、蛋白
質を４リットルDEAEセルロースカラムに仕込み、未結合
フラクションを集める。 未結合フラクションを濃縮し、６モル尿素中50ミリモ
ルのNaAc、50ミリモルのNaCl（pH4.6）に対して透析す
る。未結合フラクションをカルボキシメチルセルロース
カラムに適用する。カラムに結合していない蛋白質を出
発緩衝液で充分洗浄することにより除去し、骨誘導因子
含有材料を50ミリモルNaAc、0.25ミリモルのNaCl、６モ
ルの尿素（pH4.6）によりカラムから脱着させる。この
段階溶離から得られた蛋白質を20〜40倍に濃縮し、次い
で80ミリモルKPO4、６モル尿素（pH6.0）により５倍に
希釈する。溶液のpHを500ミリモルのK2HPO4により6.0に
調節する。80ミリモルKPO4、６モル尿素（pH6.0）中で
平衡状態にしたヒドロキシルアパタイトカラム（LKB）
に試料を適用し、同緩衝液でカラムを洗浄することによ
り、未結合蛋白質を全て除去する。骨誘導因子活性蛋白
質を100ミリモルKPO4（pH7.4）および６モル尿素により
溶離させる。 この蛋白質を約10倍に濃縮し、固体NaClを加えて最終
濃度0.15モルとする。この材料を、50ミリモルKPO4、15
0ミリモルNaCl、６モル尿素（pH7.4）中で平衡状態にし
たヘパリン−セファロースカラムに適用する。出発緩衝
液でカラムを充分洗浄後、骨誘導因子活性蛋白質を50ミ
リモルKPO4、700ミリモルりNaCl、６モル尿素（pH7.4）
により溶離させる。このフラクションを最小体積に濃縮
し、４モルGuCl、20ミリモルのトリス（pH7.2）により
平衡状態にしたスーパローズ６およびスーパローズ12カ
ラム（一列に連結）に0.4mlアリコートを適用し、カラ
ムを流速0.25ml/分で展開する。骨誘導因子活性を示す
蛋白質は、約30000ダルトンの蛋白質に対応する相対移
動を呈する。 上記フラクションをプールし、50ミリモルNaAc、６モ
ル尿素（pH4.6）に対して透析し、ファルマシア・モノS
HRカラムに適用する。カラムを1.0モルNaCl、50ミリモ
ルNaAc、６モル尿素（pH4.6）への勾配により展開す
る。活性フラクションをプールし、10％トリフルオロ酢
酸（TFA）によりpH3.0とする。この材料を0.1％TFA中0.
46×25cmバイダックC4カラムに適用し、カラムを90％ア
セトニトリル、0.1％TFAへの勾配により展開する（60分
間で31.5％アセトニトリル、0.1％TFAから49.5％アセト
ニトリル、0.1％TFA、ただし１分間1mlの速度）。活性
材料を約40−44％アセトニトリルで溶離する。マッコナ
ヘイ等、「インターナショナル・アーカイブス・オブ・
アラージー」29:185−189（1966）、ボルトン等、「バ
イオケミカル・ジャーナル」、133:529（1973）および
ボーウェン−ポープ、「ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー」、237;5161（1982）の中の一法に
より、適当なフラクションのアリコートをヨウ素化す
る。これらのフラクション中に存在するヨウ素化蛋白質
をSDSゲル電気泳動および尿素トリトンX100等電点電気
泳動により分析する。この段階で、骨誘導因子を評価す
ると、約10−50％純度である。 実施例２ うし骨誘導因子の特性検定 A.分子量 実施例１により得られた20μｇの蛋白質を凍結乾燥
し、１×SDS試験緩衝液に再溶解する。37℃で15分加熱
後、試料を15％SDSポリアクリルアミドゲルに適用し、
次いで冷却しながら電気泳動させる。予め染色した分子
量標準（ベゼスダ・リサーチ・ラブズ）と比べて分子量
を測定する。完了直後、骨誘導因子含有ゲルレーンを0.
3cm片に切断する。各片をすり潰し、1.4mlの0.1％SDSを
加える。試料を室温で一夜穏やかに振り混ぜて蛋白質を
溶離させる。各ゲル片を脱塩することにより、生物学的
検定における干渉を防ぐ。各試料から得た上清を10％TF
AによりpH3.0に酸性化し、0.45ミクロン膜によりろ過
し、0.46cm×5cmC4バイダックカラムに入れ、0.1％TFA
から0.1％TFA、90％CH3CNへの勾配により展開する。適
当な骨誘導因子含有フラクションをプールし、20mgのラ
ット・マトリックスにより再構成する。このゲル・シス
テムにおいて、骨誘導因子フラクションの大部分は、約
28000−30000ダルトンの分子量を有する蛋白質移動度を
有する。 B.等電点電気泳動 骨誘導因子活性の等電点を変成等電点電気泳動システ
ムにおいて測定する。トリトンX100尿素ゲルシステム
（ホーファー・サイエンティフィック）を次の要領で修
正する。１）使用される両性電解質の40％はサーバライ
ト3/10あり、60％はサーバライト７−９である。２）使
用されるカソライト（catholyte）は40ミリモルNaOHで
ある。実施例１で得られた約20μｇの蛋白質を凍結乾燥
し、試料緩衝液に溶解し、等電点電気泳動ゲルに適用す
る。ゲルを20ワット、10℃で約３時間移動させる。完了
時、骨誘導因子含有レーンを0.5cm片に切断する。各片
を1.0mlの６モル尿素、５ミリモルのトリス（pH7.8）中
ですり潰し、試料を室温で振り混ぜる。試料を上記と同
様に酸性化し、ろ過し、脱塩し、検定する。実施例３記
載の検定で測定された活性の大部分は、8.8−0.2のpIと
一致する形で移動する。 C.サブユニットの特性 骨誘導因子のサブユニット組成についても測定する。
純粋な骨誘導因子を上記と同様にプレパラティブ15％SD
Sゲルから分離する。次いで試料の一部を試料緩衝液中
５ミリモルDTTにより還元し、15％SDSゲルにおいて再電
気泳動させる。約30キロダルトン蛋白質は、約20キロダ
ルトンおよび18キロダルトンの箇所で２本の大きなバン
ド並びに30キロダルトンの箇所で小さなバンドを生ず
る。２本のバンドの広さは、恐らくはグルコシル化、他
の翻訳後修飾、蛋白質加水分解による減成またはカルバ
ミル化に起因すると思われる不均質性を示す。 実施例３ 骨誘導因子の生物学的活性 サンパスおよびレディ、「プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ
・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリ
カ」、80:6591−6595（1983）の一般的方法によるラッ
ト骨形成検定を用いることにより、実施例１で得られた
この発明のうし骨誘導因子の骨生成活性を評価する。ま
たこの検定を用いて他の種類の骨誘導因子を評価するこ
とも可能である。エタノール沈澱工程の代わりに検定フ
ラクションの水に対する透析を行う。次いで、溶液また
は懸濁液を揮発性溶媒、例えば0.1−0.2％TFAに再溶解
し、生成した溶液を20mgのラット・マトリックスに加え
る。この材料を冷凍し、凍結乾燥し、生成した粉末を＃
５ゼラチンカプセルに封入する。21−49日令の雄ロング
・エバンス・ラットの腹部胸領域にカプセルを皮下内植
する。７−14日後インプラントを除去する。各インプラ
ントの半分を用いてアルカリ性ホスファターゼ分析［レ
ディ等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナ
イテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、69:1601（197
2）参照］を行い、半分を固定し、組織分析を行う。常
用手順で、１μｍグリコメタクリレート部分をボン・コ
ッサおよび酸性フーシン（fuschin）で染色することに
より、新規骨無機質を検出する。アルカリ性ホスファタ
ーゼ、マトリックス形成プロセスにおいて軟骨芽細胞お
よび骨芽細胞により生産される酵素もまた測定される。
新しい軟骨および硬骨形成はしばしばアルカリ性ホスフ
ァターゼレベルと相関する。下記第１表は、骨誘導因子
により処理されなかった対照を含むラット・マトリック
ス試料の容量応答を示す。 形成された硬骨または軟骨は、マトリックスによりふ
さがれた空間に物理的に閉じ込められる。また、前記と
同様にSDSゲル電気泳動および等電点電気泳動により試
料を分析し、次いでオートラジオグラフィーを行う。分
析は、pI9.0および28−30キロダルトンでの蛋白質バン
ドと活性の相関関係を示す。10D/mg−cmの消衰係数を蛋
白質に関する推定値として使用し、特定フラクション中
の骨誘導因子の純度を近づける。前記希釈物におけるイ
ンビボ ラット骨形成検定において、蛋白質は、10〜20
0ng蛋白質／（骨）ｇ〜恐らくは１μｇ蛋白質／（骨）
ｇより大の比率でインビボ活性を呈する。 実施例４ うし骨誘導因子蛋白質組成物 28−30キロダルトンの分子量を有する実施例2Aの蛋白
質組成物を実施例2Cの記載に従い還元し、トリプシンで
消化する。下記のアミノ酸配列を有する８種のトリプシ
ングラフメントを標準的方法により単離する。 フラグメント1:AAFLGDIALDEEDLG フラグメント2:AFQVQQAADL フラグメント3:NYQDMVVEG フラグメント4:STPAQDVSR フラグメント5:NQEALR フラグメント6:LSEPDPSHTLEE フラグメント7:FDAYY フラグメント8:LKPSN?ATIQSIVE 実施例１記載の方法と類似した精製手順に従い、うし
の骨由来の蛋白質の低級精製製品を製造する。この精製
手順は、DE−52カラム、CMセルロースカラムおよびモノ
Ｓカラムの省略並びにヒドロキシルアパタイトおよびヘ
パリン・セファロースカラムの順での置き換えにより前
記手段からは基本的に変化する。簡単に述べると、濃縮
粗４モル抽出物をエタノール（４度）に加えて85％最終
濃度とする。次いで混合物を遠心分離し、沈澱を50ミリ
モルのトリス、0.15モルNaCl、6.0モル尿素に再溶解す
る。次に、この材料を前記と同様にヘパリン・セファロ
ースにおいて分画化する。ヘパリン結合材料を前記と同
様にヒドロキシアパタイトにおいて分画化する。活性フ
ラクションをプールし、濃縮し、高度分離ゲルろ過にお
いて分画化する（６モルのグアニジニウムクロリド、50
ミリモルのトリス（pH7.2）中TSK30000）。活性フラク
ションをプールし、0.1％TFAに対して透析し、次いで前
記と同様にC4バイダック逆相カラムにおいて分画化す
る。調製物を還元し、アクリルアミドゲルで電気泳動す
る。18Kバンドに対応する蛋白質を溶離させ、トリプシ
ンで消化する。下記のアミノ酸配列を有するトリプシン
フラグメントが分離される。 フラグメント9:SLKPSNHATIQS?V フラグメント10:SFDAYYCS?A フラグメント11:VYPNMTVESCA フラグメント12:VDFADI?W ただし、トリプシン・フラグメント７および８は、実
質的にそれぞれフラグメント10および９であるものとす
る。 A.bBMP−１ レイズ、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー」、183（１）:1−12（1985）の方法に従い、オ
リゴヌクレオチドのプール（または特有のオリゴヌクレ
オチド）を成分とするプローブを設計し、自動DNAシン
セサイザーで合成する。−プローブは、下記ヌクレオチ
ド配列 を有する比較的長い（32ヌクレオチド）「ゲスマー」
［ツール等、「ネイチャー」、312:342−347（1984）］
成分としている。 遺伝子コードは同義性であるため（複数のコドンが同
じアミノ酸をコードし得る）、プローブプールにおける
オリゴヌクレオチドの数は、真核生物におけるコドン使
用頻度、G:T塩基対の相対安定性および真核生物コード
配列におけるジヌクレオチドCpGの相対的希少性に基づ
いて減らされる［ツール等（前出）参照］。第２セット
のプローブは、アミノ酸をコードし得る可能な配列を全
て含む短いオリゴヌクレオチド（長さ17ヌクレオチド）
により構成される。第２セットのプローブは下記配列を
有する。 （ａ）Ａ［A/G］［A/G］TC［T/C］TC［T/C］TC［A/G］T
C［T/C］AA （ｂ）Ａ［A/G］［A/G］TC［T/C］TC［T/C］TC［A/G］T
CNAG 括弧内のヌクレオチドは代替配列である。「Ｎ」はＡ、
Ｔ、ＣまたはＧを意味する。 両場合において、プローブ設計に使用されるアミノ酸
配列の領域は、可能ならば高度変性コドンを避けること
により選択される。オリゴヌクレオチドを自動DNAシン
セサイザーで合成する。次いで、ポリヌクレオチドキナ
ーゼおよび32P−ATPを用いてプローブに放射性標識を行
う。 これら２セットのプローブを用いてうしゲノム組換え
体ライブラリーをスクリーニングする。ライブラリーは
次の要領で構築される。うし肝臓DNAを制限エンドヌク
レアーゼ酵素Sau 3Aにより部分消化し、ショ糖勾配によ
り沈降させる。次に、15−30キロ塩基の範囲でのサイズ
分画DNAをバクテリオファージBamHIベクターEMBL3に結
合する［フリシャウフ等、「ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー」、170:827−842（1983）］。ラ
イブラリーを１プレート当たり組換え体8000個の割合で
培養する。プラークの重複ニトロセルロースレプリカを
作成し、ウー等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・
ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、75:3
688−91（1978）の手順の修正法に従い増幅する。 32merプローブを32P−ガンマーATPによりキナーゼ化
し、45℃で５×SSC、0.1％SDS、５×デンハルツ、100μ
g/mlのサーモン精液DNA中１セットのフィルターとハイ
ブリダイゼーションし、45℃で５×SSC、0.1％SDSによ
り洗浄する。17merプローブをキナーゼ化し、50℃で３
モルのテトラメチルアンモニウムクロリド（TMAC）、0.
1モルの燐酸ナトリウム（pH6.5）、１ミリモルEDTA、５
×デンハルツ、0.6％SDS、100μg/mlサーモン精液DNA中
他のセットのフィルターとハイブリダイゼーショノし、
50℃で３モルTMAC、50ミリモルのトリス（pH8.0）によ
り洗浄する。これらの条件により、17merプローブプー
ルに対する不適当な組合わせの検出は最小限となる［ウ
ッド等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナ
イテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、82:1585−158
8（1985）参照］。この方法により400000個の組換え体
をスクリーニングし、一デュプリケイト陽性をプラーク
精製する。ラムダbP−50と称するこの組換え体バクテリ
オファージのプレートリゼイトからDNAを分離する。bp
−50は、1986年12月16日に受託番号40295としてアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（アメリカ合
衆国メリーランド・ロックビル・パークローン・ドライ
ブ12301）（以後「ATC」と称す）に寄託された。この寄
託物およびこの明細書に含まれる他の寄託物は、特許手
続きを目的とする微生物の寄託の国際的承認に関するブ
ダペスト条約およびその下での規則の必要条件を満たし
ている。このbP−50クローンは、bBMP−１と称するうし
骨成長因子の少なくとも一部をコードする。 このbBMP−１クローンのオリゴヌクレオチド・ハイブ
リダイゼーション領域は、M13中にサブクローン化さ
れ、標準技術により配列された約800bpのEcoRIフラグメ
ントに対して局在している。ラムダbP−50の部分的DNA
配列および誘導されたアミノ酸配列を下記第２表に示
す。牛骨28〜30kd材料から分離されたトリプシンフラグ
メントに対応するアミノ酸配列は、第２表の下線部であ
る。この配列の最初の下線部分は、オリゴヌクレオチド
プローブが設計される上記トリプシンフラグメント１に
対応する。第二の下線部分は、上記トリプシンフラグメ
ント２に対応する。予測されたアミノ酸配列は、トリプ
シンの特異的を考慮して予想した通り、塩基性残基
（Ｒ）がトリプシンフラグメント２の前にあることを示
す。第２表におけるヌクレオチド位置＃292−293のカッ
プレットCTに先行する核酸配列は、コンセンサス受容配
列（すなわち、ピリミジン濃度域、TCTCTCTCC、次にA
G）の存在および誘導されたアミノ酸配列の適当な位置
における塩基性残基の欠如に基づきイントロン（非コー
ド配列）であると思われる。このbBMP−１ゲノム配列は
第２表において明白である。このゲノムクローンからの
推定に基づくbBMP−１ペプチド配列は37アミノ酸長であ
り、第２表におけるヌクレオチド＃294〜＃404のDNA配
列によりコードされる。 B.bBMP−２ フラグメント３のアミノ酸配列に基づき、オリゴヌク
レオチドのプールを成分とする２種のプローブを設計
し、前記と同様に自動DNAシンセサイザーで合成する。 プローブ＃1:ACNACCAT［A/G］TC［T/C］TG［A/G］ATプ
ローブ＃2:CA［A/G］GA［T/C］ATGGTNGTNGA これらのプローブを放射性標識し、これらを用いて、Ａ
項の記載に従い（ただし、ベクターはラムダJ1BamH1arm
sである）構築されたうしゲノムライブラリーをスクリ
ーニングする［ムリンズ等、「ネイチャー」、308:856
−858（1984）］。放射性標識17−merプローブ＃１を、
Ａ項記載の17merプローブに関する方法によるフィルタ
ーのセットとハイブリダイゼーションする。 上記Ａ項記載の手順により400000個の組換え体をスク
リーニングする。−デュプリケイト陽性をプラーク精製
し、DNAを、ラムダbP−21と称する組換えバクテリオフ
ァージの培養リゼイトから分離する。バクテリオファー
ジbP−21は、1987年３月６日にATCC40310の受託番号でA
TCCに寄託された。bP−21クローンは、bBMP−２と称す
るうし成長因子をコードする。 このbBMP−２クローンのオリゴヌクレオチド・ハイブ
リダイゼーション領域は、M13中にサブクローン化さ
れ、標準技術により配列決定された約1.2キロ塩基のSac
I制限フラグメントに対して局在する。このSacIフラグ
メントおよびbP−21の隣接HindIII−SacI制限フラグメ
ントの部分的DNA配列および誘導されたアミノ酸配列を
下記第３表に示す。このクローンからのbBMP−２ペプチ
ド配列は129アミノ酸長であり、ヌクレオチド＃１〜ヌ
クレオチド＃387のDNA配列によりコードされる。牛骨28
〜30kd材料から分離されたトリプシンフラグメントに対
応するアミノ酸配列は、第３表の下線部である。この配
列の下線部分は、bBMP−２に関するオリゴヌクレオチド
プローブが設計される上記トリプシンフラグメント３に
対応する。予測されたアミノ酸配列は、トリプシンの特
異的を考慮して予想した通り、塩基性残基（Ｋ）がトリ
プシンフラグメント３の前にあることを示す。CGTトリ
プレットによりコードされるアルギニン残基は、それに
隣接する停止コドン（TAG）の存在に基づき恐らく蛋白
質のカルボキシ末端であると思われる。C.bBMP−３ トリプシンフラグメント９（プローブ＃３）、10（プ
ローブ＃２）および11（プローブ＃１）のアミノ酸配列
に基づいて、オリゴヌクレオチドのプールを成分とする
プローブを設計し、自動DNAシンセサイザーで合成す
る。 プローブ＃1:ACNGTCAT［A/G］TTNGG［A/G］TA プローブ＃2:CA［A/G］TA［A/G］TANGC［A/G］TC［A/
G］AA プローブ＃3:TG［A/G/T］ATNGTNGC［A/G］TG［A/G］TT 上記Ａ項で詳述したTMACハイブリダイゼーション方法
により、EMBL3において構築された組換えうしゲノムラ
イブラリーをスクリーニングする。400000個の組換え体
を32Pで標識されたプローブ＃１により繰り返しスクリ
ーニングする。このプローブとハイブリダイゼーション
した組換え体は全て二次培養として再培養される。トリ
プリケイト・ニトロセルロース・レプリカは二次培養物
から成り、前記と同様に増幅される。３セットのフィル
ターを再びTMAC条件下でプローブ＃１、＃２および＃３
とハイブリダイゼーションする。一クローン、ラムダbP
−819は３種のプローブ全てとハイブリダイゼーション
する。これをプラーク精製し、DNAをプレートリゼイト
から分離する。バクテリオファージ ラムダbP−819
は、1987年６月16日にATCC40344の受託番号下でATCCに
寄託された。このbP−819クローンは、bBMP−３と称す
るうし骨成長因子をコードする。 プローブ＃２とハイブリダイゼーションするbP−819
の領域は局在して配列している。この領域の部分的DNA
および誘導されたアミノ酸配列を第4A表に示す。トリプ
シンフラグメント10および12に対応するアミノ酸配列は
下線部である。最初の下線部の配列はフラグメント12に
対応し、第２の下線部の配列はフラグメント10に対応す
る。従って、プローブ＃２とハイブリダイゼーションす
るbP−819のこの領域は、少なくとも111個のアミノ酸を
コードする。このアミノ酸配列は、ヌクレオチド＃414
〜＃746のDNA配列によりコードされる。 プローブ＃１および＃３とハイブリダイゼーションす
るbP−819の領域は局在して配列している。この領域の
部分的DNAおよび誘導されたアミノ酸配列を第4B表に示
す。トリプシンフラグメント９および11に対応するアミ
ノ酸配列は下線部である。最初の下線部の配列はフラグ
メント９に対応し、第２の下線部の配列はフラグメント
11に対応する。プローブ＃１および＃３とハイブリダイ
ゼーションするbP−819のこの領域のペプチド配列は、
第4B表のヌクレオチド＃305〜＃493によりコードされる
長さ64個のアミノ酸である。AGAトリプレットによりコ
ードされるアルギニン残基は、それに隣接する停止コド
ン（TAA）の存在に基づき蛋白質のカルボキシ末端であ
ると思われる。カップレットTC（305−306位）に先行す
る核酸配列は、コンセンサス受容配列（すなわち、ポリ
ミジン濃厚域、TTCTCCCTTTTCGTTCCT、次にAG）の存在お
よび誘導されたアミノ酸配列の適当な位置における塩基
性残基以外の停止配列の存在に基づきイントロン（非コ
ード配列）であると思われる。 従って、bBMP−３は、第4A表および第4B表のDNAおよ
びアミノ酸配列を有することを特徴とする。このクロー
ンのペプチド配列は174アミノ酸長であり、第4A表のヌ
クレオチド＃414〜ヌクレオチド＃746および第4B表のヌ
クレオチド＃305〜ヌクレオチド＃493のDNA配列により
コードされる。実施例５ ひと骨誘導因子 A.hBMP−１ うしおよびひとの骨成長因子遺伝子は著しく相同性を
示すと思われるため、第２表のうしbBMP−1 DNA配列
（またはその一部分）をプローブとして用いることによ
り、ひと遺伝子ライブラリーをスクリーニングする。う
しゲノムクローンの800bp EcoRIフラグメントをニック
翻訳により32Pで標識する。ととゲノムライブラリー
（ツール等、前出）を、１プレート当たり組換え体4000
0個の割合で20プレートにおいて培養する。デュプリケ
イト・ニトロセルロースフィルター・レプリカは、各プ
レートで構成されており、50℃で約14時間５×SSC、５
×デンハルツ、100μg/ml変性サーモン精液DNA、0.1％S
DS（標準ハイブリダイゼーション溶液）中ニック翻訳プ
ローブとハイブリダイゼーションされる。次いで、フィ
ルターを50℃で１×SSC、0.1％SDSにより洗浄し、オー
トラジオグラフィーに付す。５つのデュプリケイト陽性
を分離し、プラーク精製する。これらの組換えバクテリ
オファージのうちの１種、LP−H1のプレート・リゼイト
からDNAを得る。LP−H1は1987年３月６日にATCCに寄託
された（受託番号40311）。このクローンは、hBMP−１
というひとゲノム骨成長因子の少なくとも一部分をコー
ドする。LP−H1のハイブリダイゼーション領域は、2.5
キロ塩基XbaI/HindIII制限フラグメントに対して局在し
ている。 ラムダLP−H1の部分的DNA配列および誘導されたアミ
ノ酸配列を下記第５表に示す。このクローンからのペプ
チド配列は37アミノ酸長であり、ヌクレオチド＃3440〜
ヌクレオチド＃3550のDNA配列によりコードされる。第
５表のコード配列の側面には、約28個のヌクレオチド
（推定に基づく５′非コード配列）および約19個のヌク
レオチド（推定に基づく３′非コード配列）が存在す
る。第２表のbBMP−１配列と第５表のhBMP−１ゲノム配
列とを比較すると、両配列真に顕著な相同性の存在する
ことが示される。 コード領域のサイズおよび非コード領域の位置は、一
般に異なる種類の相同性遺伝子においても保持されてい
るため、骨誘導因子遺伝子のコードおよび非コード領域
の配置は同定され得る。相同部位においてシグナルを生
じるRNAが側面に位置する、２種類の遺伝子間の相同性
領域は、コード領域を示す。 第５表に示されたひとコード配列に特異的はプローブ
を用いることにより、骨誘導因子を合成するひとセルラ
インまたは組織を同定する。このプローブは次の方法に
従い作成される。下記配列 を有する２種のオリゴヌクレオチドを自動シンセサイザ
ーで合成し、アニーリングし、エシェリヒア・コリDNA
ポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメントを用いて広
げ、制限酵素EcoRIおよびBamHIにより消化し、M13ベク
ターに挿入する。次に、一本鎖32P標識プローブは、標
準技術によりこのサブクローンの鋳型調製物により作成
される。ツール等の方法（前出）により、様々な細胞お
よび組織供給源由来のポリアデニル化RNAをホルムアル
デヒド−アガロースゲルにより電気泳動させ、ニトロセ
ルロースに移動させる。次いで、このプローブを、42℃
で一夜50％ホルムアミド、５×SSC、0.1％SDS、40ミリ
モルの燐酸ナトリウム（pH6.5）、100μg/mlの変性サー
モン精液DNAおよび５ミリモルのバナジルリボヌクレオ
シド中ニトロセルロース・ブロットとハイブリダイゼー
ションし、0.2×SSC、0.1％SDS中65℃で洗浄する。オー
トラジオグラフィーによると、ひと骨肉腫セルラインＵ
−2 OS由来のRNAを含むレーンは、約4.3および3.0キロ
塩基のRAN種に対応するハイブリダイゼーション・バン
ドを含んでいる。 cDNAをＵ−2 OSポリアデニル化RNAから合成し、確立
された技術による（ツール等、前出）ラムダgt10にクロ
ーン化する。のライブラリーからの組換え体20000個を5
0プレートの各々において培養する。デュプリケイト・
ニトロセルロース・レプリカはこれらのプレートで構成
される。前記オリゴヌクレオチドを32Pガンマ−ATPによ
りキナーゼ化し、55℃で一夜標準ハイブリダイゼーショ
ン溶液中で２セットのレプリカとハイブリダイゼーショ
ンする。次いで、フィルターを55℃で１×SSC、0.1％SD
Sにより洗浄し、オートラジオグラフィーに付す。ラム
ダU2OS−１と称する一デュプリケイト陽性をプラーク精
製する。ラムダU2OS−１は1987年６月16日にATCCに寄託
された（受託番号40343）。 ラムダUSOS−１の挿入体の全ヌクレオチド配列および
誘導されたアミノ酸配列を第６表に示す。このcDNAクロ
ーンは、分泌された蛋白質特有の疎水性リーダー配列が
後に続くメチオニンをコードし、ヌクレオチド位2226−
2228の停止コドンを含む。このクローンは、このアミノ
酸配列に基づき分子量og83キロダルトンを有する730個
のアミノ酸で構成される蛋白質をコードする、2190bpの
オープン・リーディング・フレームを含む。このクロー
ンは、第５表に示したコード領域と同じ配列を含む。こ
の蛋白質は、分泌後開裂してbBMP−１蛋白質を生成する
一次翻訳産物を示すと考えられる。従って、このクロー
ンは、ゲノムhBMP−１配列ラムダLP−H1に含まれるひと
遺伝子フラグメントに対応するhBMP−１のcDMAである。
ただし、BMP−１のアミノ酸＃550〜＃590は、表皮成長
因子並びにプロテインＣ、第Ｘ因子および第IX因子の
「成長因子」領域と相同性である。 B.hBMP−2:クラスＩおよびII 実施例4B記載のHindIII−SacIうしゲノムbBMP−２フ
ラグメントをM13ベクターにサブクローンする。32P−標
識−本鎖DNAプローブは、このサブクローンの鋳型調製
物から作成される。このプローブを用いることにより、
Ａ項で前述された様々な細胞および組織供給源由来のポ
リアデニル化RNAをスクリーニングする。約3.8キロ塩基
のmRNA種に対応するハイブリダイゼーション・バンド
は、ひとセルラインＵ−2 OS由来のRANを含むレーンに
おいて検出される。HindIII−SacIフラグメントをニッ
ク翻訳により32Pで標識し、これを用いて、65℃で一夜
標準ハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイゼ
ーションし、次いで65℃で１×SSC、0.1％SDSにより洗
浄することにより、前記Ｕ−2 OScDNAライブラリーのニ
トロセルロース・フィルター・レプリカをスクリーニン
グする。12個のデュプリケイト陽性クローンを取り上
げ、二次培養として再培養する。デュプリケイト・ニト
ロセルロース・レプリカは二次培養物から成り、一次ス
クリーニングを行なった場合と同様に両セット共うしゲ
ノムプローブとハイブリダイゼーションされる。次いで
65°で一方のセットのフィルターを１×SSC、0.1％SDS
で洗浄し、他方のセットを0.1×SSC、0.1％SDSで洗浄す
る。 ２クラスのhBMP−2 cDNAクローンは、高いストリンジ
ェント洗浄条件下（0.1×SSC、0.1％SDS）において、強
い（４組換え体）または弱い（７組換え体）ハイブリダ
イゼーション・シグナルに基づき明白である。11組換え
バクテリオファージ全部をプラーク精製し、小規模DNA
調製物を各々の培養リゼイトから作成し、配列分析用に
挿入体をpSP65およびM13にサブクローン化する。hBMP−
２・クラスＩと称する（BMP−２としても知られてい
る）強いハイブリダイゼーションクローンの配列分析
は、それらが第３表に示された配列と強い配列相同性を
有することを示す。従ってこれらのクローンは、bBMP−
２遺伝子（この部分配列は第３表に示されている）によ
りコードされる蛋白質のひと均等蛋白質をコードするcD
NAである。hBMP−２・クラスIIと称する（BMP−４とし
ても知られている）弱いハイブリダイゼーション組換え
体の配列分析は、それらもまた、それらのコード領域の
３′末端において第３表に示した配列と全く相同性であ
る（ただし、さらに大きい５′領域ではそれほどではな
い）ことを示す。すなわち、それらは、同一ではない
が、前記構造との類似構造を有するひと蛋白質をコード
する。 完全長のhBMP−２・クラスIcDNAクローンも同様の方
法で得られる。クラスIIサブクローンの１つ（II−10−
１）の1.5キロ塩基挿入体を分離し、ニック翻訳により
放射性標識する。上記でスクリーニングされたＵ−2 OS
cDNAライブラリーのニトロセルロース・レプリカ（50
フィルター、1000000組換え体バクテリオファージに対
応）の１セットを、ストリンジェント条件下（標準ハイ
ブリダイゼーション緩衝液中65°でハイブリダイゼーシ
ョン、65°で0.2×SSC、0.1％SDSで洗浄）でこのプロー
ブとハイブリダイゼーションする。クラスIIプローブと
はハイブリダイゼーションしないうしゲノムプローブと
ハイブリダイゼーションする組換え体全部を選び取り、
プラーク精製する（10組換え体）。プレートのストック
を作り、小規模バクテリオファージDNA調製物を作成す
る。M13へのサブクローニング後、配列分析は、これら
のうち４つが元のクラスＩクローンと部分的に一致する
クローンを表すことを示す。これらの中の１つ、ラムダ
U2OS−39は、約1.5キロ塩基の挿入体を含んでおり、198
7年６月16日付けでATCCに寄託された（受託番号4034
5）。部分的DNA配列（ラムダU2OS−39および幾つかの他
のhBMP−２クラスIcDNA組換え体から編集された）およ
び誘導されたアミノ酸配列を下記第７表に示す。ラムダ
U2OS−39は、その部分配列が第３表に示されているうし
遺伝子セグメントによりコードされる蛋白質BMP−２の
ひと対応部全体をコードするのに必要なヌクレオチド配
列を全て含むものと予想される。このひとcDNA hBMP−
２クラスＩは、396個のアミノ酸から成る蛋白質をコー
ドする、1188bpのオープン・リーディング・フレームを
含む。396個のアミノ酸から成るこの蛋白質は、このア
ミノ酸配列に基づき45キロダルトンの分子量を有する。
この配列は、一次翻訳産物を表すものと考えられる。全
フレームにおいて停止コドンを有する342bpの５′未翻
訳領域がこの蛋白質に先行する。この５′未翻訳領域に
先行する13bp領域は、cDNAクローニング方法で使用され
るリンカーを表す。 完全な長さのhBMP−２・クラスIIひとcDNAクローン
は、次の要領で得られる。クラスII組換えII−10−１の
５′端部からの200bp EcoRI−SacIフラグメントをその
プラスミド・サブクローンから分離し、ニック翻訳によ
り標識し、Ｕ−2 OS cDNAライブラリー（25フィルター
／セット、500000個の組換え体を示す）の１セットのデ
ュプリケイト・ニトロセルロース・レプリカとハイブリ
ダイゼーションする。前記ストリンジェント条件下でハ
イブリダイゼーションおよび洗浄を行う。16デュプリケ
イト陽性を選び取り、二次培養として再培養する。二次
培養のニトロセルロース・フィルター・レプリカを作成
し、II−10−１の配列と対応すべく合成された、下記配
列 を有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション
する。50℃で標準ハイブリダイゼーション緩衝液中でハ
イブリダイゼーションし、１×SSC、0.1％SDSにより50
°で洗浄する。このオリゴヌクレオチドとハイブリダイ
ゼーションする14組換えバクテリオファージをプラーク
精製する。プラーク・ストックを作り、小規模バクテリ
オファージDNA調製物を作成する。これらの中の３つをM
13にサブクローニング後、配列分析は、それらが元のク
ラスIIクラスと部分的に一致するクローンを表すことを
示す。これらの中の１つ、ラムダU2OS−３は1987年６月
16日付けでATCCに寄託された（受託番号40342）。U2OS
−３は約1.8キロ塩基の挿入体を含む。U2OS−３の部分
的DNA配列および誘導されたアミノ酸配列を下記第８表
に示す。このクローンは、全ひとBMP−２・クラスII蛋
白質をコードするのに必要なヌクレオチド配列の全てを
含むものと予想される。このcDNAは、全フレームにおい
て停止コドンを有する394bpの５′未翻訳領域が先行
し、408個のアミノ酸から成る蛋白質をコードする、122
4bpのオープン・リーディング・フレームを含み、イン
−フレーム停止コドンの後に308bpの３′未翻訳領域を
含む。５′未翻訳領域に先行する8bp領域は、cDNAクロ
ーニング方法で使用されるリンカーを表す。408個のア
ミノ酸から成る蛋白質は47キロダルトンの分子量を有
し、一次翻訳産物を表すものと考えられる。 第３、４、７および８表に示されたBMP−２・クラス
ＩおよびII並びにBMP−３の配列は、インヒビンのベー
タ（Ｂ）（InhβＢ）およびベータ（Ａ）（InhβＡ）サ
ブユニットと顕著な相同性を有する。インヒビンは、避
妊における使用に関して現在研究されているホルモンの
一種である。メゾン等、「ネイチャー」、318:659−663
（1985）参照。さらに範囲を狭めると、それらはまた、
ムレリアン阻害物質（MIS）、雄性胚の成長中における
ムレリアン導管の退行を誘発する精巣性糖蛋白質、およ
び細胞の成長を阻害または刺激し得、またはそれらを分
化させ得る形質転換成長因子−ベータ（TCFβ）とも相
同性を呈する。さらに、hBMP−２・クラスＩ、クラスII
をコードする第７表および第８表の配列は、ドロソフィ
ラ・デカペンタプレジック（DPP−Ｃ）遺伝子座転写体
と顕著な相同性を有する。マッサーグ、「セル」、49:4
37−438（1987）、パジェット等、「ネイチャー」、32
5:81−84（1987）、ケート等、「セル」、45:685−698
（1986）参照。従って、BMP−２が、この発生的突然変
異遺伝子座からのこの転写体から作られた蛋白質のひと
相同体であり得ることが考えられる。 以下、これらの相同性を第９表により示す。 C.BMP−３ うしおよびひとの骨成長因子遺伝子が顕著な相同性を
有すると思われるため、第4A表および第4B表のうしDNA
配列とハイブリダイゼーションすることが示されたオリ
ゴヌクレオチド・プローブを用いてひとゲノム・ライブ
ラリーをスクリーニングする。これらのプローブを用い
てひとゲノムライブラリー（ツール等、前出）をスクリ
ーニングし、仮定的陽性を分離すると、前記と同様にDN
A配列が得られる。この組換え体がひと骨誘導因子分子
の一部をコードするという証拠は、うし／ひと蛋白質お
よび遺伝子構造相同性に存する。 一旦ひとBMP−３分子の一部をコードするDNAを含む組
換えバクテリオファージが得られると、実施例５（Ａ）
の記載と同様にひとコード配列をプローブとして用いる
ことにより、BMP−３を合成するひとセルラインまたは
組織を同定する。mRNAをオリゴ（dT）セルロース・クロ
マトグラフィーにより選択し、cDNAを確立させた技術に
より（ツール等、前出）合成し、ラムダgt10においてク
ローン化する。 別法として、このひと骨誘導因子をコードする全遺伝
子は、必要ならば追加の組換えクローンにおいて同定お
よび生成され得る。このひと骨誘導因子遺伝子のさらに
別の３′または５′領域を含む追加の組換え体は、元の
クローンの端部（複数も可）における独特のDNA配列を
同定し、これらをプローブに用いてひとゲノムライブラ
リーを再スクリーニングすることにより生産され得る。
次いで、この遺伝子は、標準的分子生物学技術により単
一プラスミドにおいて再会合され、細菌において増幅さ
れ得る。次に、全ひとBMP−３因子遺伝子は適当な発現
ベクターに移入され得る。次いで、この遺伝子を含む発
現ベクターによりほ乳類細胞、例えばさるCOS細胞をト
ランスフェクションし、その細胞においてひと遺伝子が
転写され、RNAは正確にスプライシングされる。トラン
スフェクションされた細胞の培地を、遺伝子が完全であ
ることの指標としての明細書に記載された骨誘導因子活
性に関して検定する。これらの細胞からmRNAを得、この
mRNA供給源からcDNAを合成し、クローン化する。同様に
上記方法を用い、プローブ供給源としてうし骨誘導因子
および／またはひと骨誘導因子を利用することにより、
興味の対象である他の種類の骨誘導因子を分離すること
が可能である。これらの他の種類の骨誘導因子は、特に
骨折修復において似た有用性を有し得る。 実施例６ 骨誘導因子の発現 うし、ひとまたは他のほ乳類の骨誘導因子を製造する
ために、常用的遺伝子工学技術により、それをコードす
るDNAを適当な発現ベクターに移入し、ほ乳類細胞に導
入する。 当業界の熟練者であれば、第２〜８表の配列または他
の修飾配列並びに既知ベクター、例えばpCD［岡山等、
「モル．セル・バイオル．」、2:161−170（1982）］お
よびpJL3、pJL4［ゴフ等、「EMBO・ジャーナル」、4:64
5−653（1985）］を用いることによるほ乳類発現ベクタ
ーの構築は可能である。これらのベクターを用いた適当
な宿主細胞の形質転換により、骨誘導因子が発現され得
る。当業界の熟練者であれば、コード配列の側面に位置
するほ乳類調節配列を削除またはこれを細胞性配列と置
き換えることにより第２〜８表の配列を操作し、細菌細
胞により細胞内または細胞外発現用細菌性ベクターを構
築することが可能である。例えば、コード配列はさらに
操作（例、他の既知リンカーと結合または他の公知技術
によるそこからの非コード配列の欠失もしくは存在する
ヌクレオチドの改編による修飾）され得る。次いで、修
飾骨誘導因子コード配列は、例えば谷口等、「プロシー
ディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ
・オブ・アメリカ」、77:5230−5233（1980）に記載さ
れた方法を用いて既知細菌性ベクターに挿入され得る。
次いで、この実例的細菌性ベクターにより細菌宿主細胞
を形質転換し、骨誘導因子を発現させ得る。細菌細胞に
おける骨誘導因子の細胞外発現の実施戦略については、
例えばヨーロッパ特許出願EPA177344を参照。 昆虫細胞で発現させる昆虫性ベクターの構築について
も同様の操作が実施され得る［例えば、公開されたヨー
ロッパ特許出願155476記載の方法を参照］。酵母ベクタ
ーもまた、酵母細胞によるこの発明の因子の細胞内また
は細胞外発現を目的とする酵母調節配列を用いて構築さ
れ得る。［例えば、公開PCT出願WO86/00639およびヨー
ロッパ特許出願EPA123289参照］。 ほ乳類細胞から高レベルの本発明骨誘導因子を製造す
る方法は、異種骨誘導因子遺伝子の多数のコピーを含む
細胞の構築を含む。異種遺伝子は、増幅可能なマーカ
ー、例えばジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子（この
場合、カウフマンおよびシャープ、「ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー」、159:601−629（198
2）の方法に従い、多量の遺伝子コピーを含む細胞が、
メトトレキセート（MTX）の高濃縮液における伸長に関
して選択され得る）に結合され得る。この方法は幾つか
の異なる細胞タイプにより使用され得る。 例えば、この発明の骨誘導因子に関するDNA配列を含
むプラスミドは、その発現を可能にする他のプラスミド
配列およびDHFR発現プラスミドpAdA26SV（Ａ）３［カウ
フマンおよびシャープ、「モレキュラー・アンド・セル
ラー・バイオロジー」、2:1304（1982）］と効果的に組
合わされて、燐酸カルシウム共沈澱およびトランスフェ
クションによりDHFR−欠失CHO細胞、DUKX−BII中に共に
導入され得る。DHFR発現形質転換体を、透析うし胎児血
清を含むアルファ培地での成長に関して選択し、続いて
MTX高濃縮液（0.02、0.2、1.0および５マイクロモルのM
TXにおける連続段階）での成長による増幅に関して選択
する［カウフマン等、「モレキュラー・アンド・セラー
・バイオロジー」、5:1750（1983）の記事による］。形
質転換体をクローン化し、ラット骨形成検定により生物
学的活性骨誘導因子発現をモニターする。骨誘導因子発
現はMTX耐性のレベルが高くなると、増加すべきであ
る。同様の方法は、他の骨誘導因子の製造にも使用され
得る。 別法として、ひと遺伝子は前記に従い直接的に発現さ
れる。活性骨誘導因子は細菌または酵母細胞において製
造され得る。しかしながら、生物学的活性組換えひと骨
誘導因子に対して現在好ましい発現系は、安定して形質
転換されたCHO細胞である。 一実施態様として、実施例５のひと骨誘導因子（hBMP
−１）を製造するためには、SalI消化によりU2OS−１の
挿入体をベクターarmsから放出させ、XhoIにより消化さ
れたほ乳類発現ベクターpMT2CXにサブクローン化する。
DEAE−デキストラン方法を用いて［ソンパイラックおよ
びダンナ、「PNAS」、78:7575−7578（1981）、ルトマ
ンおよびマグヌッソン、「ニュクレイック・アシッズ・
リサーチ」、11:1295−1308（1983）］、このサブクロ
ーンからのプラスミドDNAによりCOS細胞をトランスフェ
クションする。血清不含有24時間条件培地を細胞から集
める（トランスフェクションの40−70時間後開始）。 ほ乳類発現ベクターpMT2 Cla−Xho（pMT2CX）は、p91
023（ｂ）（ウォング等、「サイエンス」、228:810−81
4,1985年）の誘導体であり、後者がテトラサイクリン耐
性遺伝子ではなくアンピシリン耐性遺伝子を含み、さら
にcDNAクローンの挿入に関するXhoI部位を含む点で相異
する。pMT2Cla−Xhoの機能的要素については既に記載さ
れており（カウフマン、1985年、プロシーディングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ーズ・オブ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリ
カ、82:689−693）、アデノウイルスVA遺伝子、72bpエ
ンハンサーを含むSV40複製開始点、５′スプライス部位
を含むアデノウイルス主後期プロモーターおよびアデノ
ウイルス三部分リーダー配列の大部分（アデノウイルス
後期mRNAに存在）、３′スプライス受容部位、DHFR挿入
体、SV40早期ポリアデニレーション部位（SV40）並びに
エシェリヒア・コリにおける伸長に必要とされるpBR322
配列が含まれる。 プラスミドpMT2 Cla−Xhoは、pMT2−VWFのEcoRI消化
により得られる［アメリカ合衆国、メリーランド、ロッ
クビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（ATCC）に寄託された（受託番号ATCC67122）］。Eco
RI消化によりpMT2−VWFに存在するcDNA挿入体が切除さ
れ、線状形態のpMT2が生成する。これを結合して用いる
ことにより、エシェリヒア・コリHB101またはDH−５を
アンピシリン耐性に形質転換することができる。プラス
ミドpMT2 DNAは常法により製造され得る。次に、pMT2を
EcoRVおよびXbaIで消化し、消化されたDNAをDNAポリメ
ラーゼＩのクレノウ・フラグメントで処理し、Claリン
カー（ネバイオラブズ、CATCGATG）を結合することによ
りpMT2CXが構築される。これは、SV40複製開始点付近の
HindIII部位から出発する塩基2266〜2421およびpMT2の
エンハンサー配列を除く。次に、プラスミドDNAをEcoRI
で消化し、前記と同様にプラント化し、EcoRIアダプタ
ーに結合し、 XhoIで消化し、結合することによりpMT2 Cla−Xhoが得
られ、次いでこれを用いてエシェリヒア・コリをアンピ
シリン耐性に形質転換することができる。プラスミドpM
T2 Cla−Xho DNAは常法により製造され得る。 得られた骨誘導因子は、通常の蛋白質分離・精製法に
よって分離及び精製される。これらの方法に特に限定は
なく、ゲル濾過法、アフィニティークロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグ
ラフィー、HPLC等を組み合わせて用いることができる。
分離・精製は、ラット骨形成検定による生物学的活性お
よび／または抽出ウシ骨誘導因子の特性検定結果等を指
標として効率的に用い得る。 実施例７ 発現した骨誘導因子の生物学的活性 A.BMP−１ 上記実施例６で得られた発現した骨誘導因子（hBMP−
１）の生物学的活性を測定する。因子をヘパリン・セフ
ァロースカラムにおいて部分的に精製する。１枚の100m
m皿から得たトランスフェクション上清4mlを、YM10膜を
用いた限外ろ過により約10倍に濃縮し、次いで20ミリモ
ルのトリス、0.15モルNaCl（pH7.4）（出発緩衝液）に
対して透析する。次に、この材料を出発緩衝液中1.1ml
ヘパリン・セファロースカラムに適用する。出発緩衝液
の8ml洗浄液により未結合蛋白質を除去し、20ミリモル
のトリス、2.0モルNaCl（pH7.4）の３−4ml洗浄液によ
りBMP−１を含む結合蛋白質を脱着させる。 ヘパリンカラムにより結合した蛋白質をセントリコン
10において約10倍に濃縮し、0.1％トリフルオロ酢酸を
用いてジアフィルトレーションすることにより塩を還元
する。この溶液の適量を20mgのラットマトリックスと混
合し、次いで前記実施例３の記載に従いインビボ骨およ
び軟骨形成に関して検定する。MOCK（モック）トランス
フェクション上清分画を対照として使用する。 特定量のひとBMP−１が加えられたラットマトリック
スを含むインプラントを７日後にラットから除去し、組
織評価を行う。各インプラントからの代表的部分を、新
規骨無機質の存在に対してボン・コッサおよび酸性フー
シンにより染色し、軟骨特異的マトリックス形成の存在
に対してトルイジンブルーにより染色する。その部分内
に存在する細胞のタイプおよびこれらの細胞が表現型を
示す程度を評価する。 ひとBMP−１をマトリックス材料に加えると、内植の
７日後に軟骨様小節が形成された。軟骨芽（細胞）型細
胞は、形状および異染性マトリックスの発現により認識
され得る。ひとBMP−１において観察される活性の量
は、マトリックスに加えられたひとBMP−１蛋白質の量
により異なった。第９表は、観察された骨誘導量に対す
るひとBMP−１蛋白質の用量応答関係を示す。 類似レベルの活性は、ヘパリンセファロース分画COS
細胞抽出物においても観察される。６モル尿素が全緩衝
液に含まれること以外は前記方法と同様の方法で部分精
製を実施する。さらに、上記ラット骨形成検定におい
て、BMP−２も同様に軟骨形成活性を示した。 上記方法を用い、プローブ供給源としてうし骨誘導因
子および／またはひと骨誘導因子を利用することにより
興味深い他の骨誘導因子を分離することができる。それ
らの他の骨誘導因子は、特に骨折修復において似た有用
性を呈し得る。 以上、この発明の好ましい実施態様について詳細に記
載した。その実施に際し、これらの記載事項を考慮して
多くの修正および変更が行なわれることは当業界の熟練
者であれば容易に想到し得るはずである。それらの修正
および変更も後記請求の範囲内に包含されるものと考え
られる。 微生物 寄託機関の名称 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション 寄託機関の住所 12301 パークローン・ドライブ ロックビル、メリーランド20852、アメリカ合衆国
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
// Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＪ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＴ
ＡＤＴ ＡＢＪ
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(31)優先権主張番号 ３１，３４６
(32)優先日 1987年３月26日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７１２２
微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０３４２
微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０３４３
微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０３４４
微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０３４５
微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０３１０
微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０２９５
微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０３１１
(72)発明者 ローゼン、ヴィッキ・エイ
アメリカ合衆国02116 マサチューセッ
ツ、ボストン、アパートメント４、マー
ルバロー・ストリート 344番
(56)参考文献 特開 昭60−226814（ＪＰ，Ａ)
特開 昭59−190919（ＪＰ，Ａ)
米国特許4563350（ＵＳ，Ａ)
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｕｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，81 （1984），Ｐ．371
−375
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．発明時に実施例３に記載されたインビボラット骨形
成検定において硬骨および／または軟骨形成誘導能を呈
することを特徴とする骨誘導因子をコードするDNAであ
って、 （但し、上記配列中、ロ）はイ）の後２個目から始ま
り、ハ）はロ）の後５個目から始まり、ニ）はハ）の後
２個目から始まる。）で示される部分アミノ酸配列を有
するポリペプチド、（但し、上記配列中、ロ）はイ）の後２個目から始ま
り、ハ）はロ）の後２個目から始まり、ニ）はハ）の後
２個目から始まり、ホ）はニ）の後２個目から始まり、
ヘ）はホ）の後２個目から始まり、ト）はヘ）の後３個
目から始まり、チ）はト）の後２個目から始まる。）で
示されるＣ末端部分アミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、または、 で示されるＣ末端アミノ酸配列を有するポリペプチド のいずれかを実質的にコードする塩基配列を含むもので
あるDNA。 ２． （上記配列中、（ ）で示されたアミノ酸配列は（ ）
中のいずれか一方のアミノ酸を示す。）で示される部分
アミノ酸配列を有するポリペプチド、または、（上記配列中、（ ）で示されたアミノ酸配列は（ ）
中のいずれか一方のアミノ酸を示す。）で示されるＣ末
端部分アミノ酸配列を有するポリペプチドのいずれかを
実質的にコードする塩基配列を含むものである請求項１
記載のDNA。 ３．（ａ）表６に記載されたアミノ酸＃１〜＃730で示
されるアミノ酸配列の全てもしくはその部分配列を有す
るポリペプチドであって、 で示される部分アミノ酸配列を有しているポリペプチ
ド、 （上記配列中、（ ）で示されたアミノ酸配列は（ ）
中のいずれか一方のアミノ酸を示す。）で示されるＣ末
端部分アミノ酸配列を有し、更に所望によりそれに先行
するＮ末端部分として表３のアミノ酸＃１〜＃28、表７
のアミノ酸＃１〜＃295または表８のアミノ酸＃１〜＃3
07のいずれかのアミノ酸配列の全もしくはＣ末端部分配
列を有していてもよいポリペプチド、または、 （ｃ）表4A及び4Bに記載されたアミノ酸＃１〜＃174で
示されるアミノ酸配列の全もしくは部分配列を有するポ
リペプチドであって、で示されるＣ末端アミノ酸配列を有するポリペプチド のいずれかを実質的にコードする塩基配列を含むもので
ある請求項１もしくは２記載のDNA。 ４．表３に記載されたアミノ酸＃１〜＃129、表７に記
載されたアミノ酸＃１〜＃396、または表８に記載され
たアミノ酸＃１〜＃408のいずれかのアミノ酸配列の全
もしくは部分配列を有するポリペプチドをコードする塩
基配列を含むものである請求項３記載のポリペプチド
（ｂ）をコードするDNA。 ５．表３に記載されたアミノ酸＃１〜＃129、表4A及び4
Bに記載されたアミノ酸＃１〜＃174、表６に記載された
アミノ酸＃１〜＃730、表７に記載されたアミノ酸＃１
〜＃396、または表８に記載されたアミノ酸＃１〜＃408
のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドする塩基配列を含むものである請求項３もしくは４記
載のDNA。 ６．発現時に実施例３に記載されたインビボラット骨形
成検定において硬骨および／または軟骨形成誘導能を呈
することを特徴とする骨誘導因子をコードするDNAであ
って、 （但し、上記配列中、ロ）はイ）の後２個目から始ま
り、ハ）はロ）の後５個目から始まり、ニ）はハ）の後
２個目から始まる。）で示される部分アミノ酸配列を有
するポリペプチド、（但し、上記配列中、ロ）はイ）の後２個目から始ま
り、ハ）はロ）の後２個目から始まり、ニ）はハ）の後
２個目から始まり、ホ）はニ）の後２個目から始まり、
ヘ）はホ）の後２個目から始まり、ト）はヘ）の後３個
目から始まり、チ）はト）の後２個目から始まる。）で
示されるＣ末端部分アミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、 または、 で示されるＣ末端アミノ酸配列を有するポリペプチド のいずれかを実質的にコードする塩基配列を含むDNAを
有するベクター。 ７．ベクターにより形質転換された細胞及びその後代細
胞：ただし、上記ベクターは、発現時に実施例３に記載
されたインビボラット骨形成検定において硬骨および／
または軟骨形成誘導能を呈することを特徴とする骨誘導
因子をコードするDNAであって、 （但し、上記配列中、ロ）はイ）の後２個目から始ま
り、ハ）はロ）の後５個目から始まり、ニ）はハ）の後
２個目から始まる。）で示される部分アミノ酸配列を有
するポリペプチド、 （但し、上記配列中、ロ）はイ）の後２個目から始ま
り、ハ）はロ）の後２個目から始まり、ニ）はハ）の後
２個目から始まり、ホ）はニ）の後２個目から始まり、
ヘ）はホ）の後２個目から始まり、ト）はヘ）の後３個
目から始まり、チ）はト）の後２個目から始まる。）で
示されるＣ末端部分アミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、 または、 で示されるＣ末端アミノ酸配列を有するポリペプチド のいずれかを実質的にコードする塩基配列を含むもので
ある。 ８．哺乳動物細胞である請求項７記載の細胞。
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