DK172503B1

DK172503B1 - Gen, som koder for BMP-3-protein, vektor indeholdende et sådant gen, celle transformeret med en sådan vektor, BMP-3-protein

Info

Publication number: DK172503B1
Application number: DK199700534A
Authority: DK
Inventors: Elizabeth A Wang; John M Wozney; Vicki A Rosen
Original assignee: Genetics Inst
Priority date: 1986-07-01
Filing date: 1997-05-09
Publication date: 1998-10-26
Also published as: WO1988000205A1; EP0688869A1; ATE419349T1; EP0313578B1; DK106288A; NZ220894A; GR871028B; PT85225B; IE75881B1; PT85225A; DE3752364T2; IL83003A; JPH02500241A; JP2713715B2; LU91005I2; AU613314B2; DE3752364D1; JPH06298800A; DE3751887D1; ATE234921T1

Description

i DK PR 172503 B1

Den foreliggende opfindelse angår et gen, som koder for BMP-3-protein, en vektor indeholdende et sådant gen, en celle transformeret med en sådan vektor, et BMP-3-protein, en fremgangsmåde til dets fremstilling, et farmaceutisk 5 præparat deraf og en anvendelse deraf. Dette protein er i stand til at inducere bindevævsdannelse og benvævsdannelse.

Benvæv er højt specialiseret væv, som er karakteriseret ved en ekstensiv matriksstruktur dannet af fibrøse bundter af proteinet kollagen og proteoglycaner, ikke-kol-10 lageniske proteiner, lipider og sure proteiner. Processerne med bendannelse og fornyelse/reparation af benvæv, som sker kontinuerligt gennem hele livet, udføres af specialiserede celler. Før den normale udvikling af lange knogler hos fostre dannes der en bindevævsmodel. Knoglevæksten medieres for-15 mentiig af osteoblaster (benvævsdannende celler), medens gendannelse af knogler tilsyneladende sker ved de forenede aktiviteter af benvævsresorberende celler, betegnet osteo-klaster, og osteoblaster. Forskellige osteogene, bindevævsinducerende og benvævsinducerende faktorer er blevet be-20 skrevet, se f.eks. EP patentansøgning nr. 148.155 og 169.016.

Den foreliggende opfindelse angår følgende: 1. Et gen, som koder for bovint BMP-3 og omfatter DNA-sekvensen anført i krav 1.

2. Et gen, som koder for et protein, som udviser egen-25 skaber af humant BMP-3, og omfatter en DNA-sekvens: (a) som adskiller sig fra en DNA-sekvens anført i krav 1 i kodonsekvens på grund af degenerationen af den genetiske kode, (b) som hybridiserer med en DNA-sekvens anført i 30 krav 1 eller afsnit (a) ovenfor, eller (c) udgør et fragment, en allelisk eller anden variation af en DNA-sekvens anført i krav 1, hvad enten denne variation medfører ændringer i peptidsekvensen eller ej.

35 3. En vektor indeholdende et gen eller en DNA-se kvens ifølge opfindelsen i operativ forbindelse med en eks- 2 DK PR 172503 B1 pressionskontrolsekvens.

4. En celle transformeret med en vektor ifølge opfindelsen.

5. Et protein, som udviser egenskaber af BMP-3, og 5 som kodes af et gen eller en DNA-sekvens ifølge opfindelsen.

6. En fremgangsmåde til fremstilling af et protein ifølge opfindelsen, omfattende dyrkning i et egnet dyrkningsmedium af en celle ifølge opfindelsen og isolering af proteinet fra dyrkningsmediet.

10 7. Et farmaceutisk præparat indeholdende et protein ifølge opfindelsen og et farmaceutisk acceptabelt bærestof.

8. Anvendelsen af et protein ifølge opfindelsen til fremstilling af et farmaceutisk præparat til fremkaldelse af knogle- eller bindevævsdannelse.

15 Den foreliggende opfindelse angår således bl.a. hidtil ukendte proteiner i renset form, som nærmere bestemt betegnes BMP-3, hvor BMP betyder ben-morfogent protein. Disse proteiner er karakteriseret ved peptidsekvenser, der er de samme som eller i det væsentlige er homologe med aminosyrese-20 kvenser, der er illustreret i tabel II nedenfor. De er i stand til at fremkalde bendannelse på et forudbestemt sted.

Disse beninducerende faktorer er yderligere karakteriseret ved biokemiske og biologiske egenskaber omfattende aktivitet ved en koncentration på 10-1000 ng/g knogle ved en knogle-25 dannelsesbestemmelse in vivo hos rotter, der er beskrevet nedenfor. Proteinerne ifølge opfindelsen kan kodes af DNA-sekvenserne, der er vist i tabellerne, eller af sekvenser, der er i stand til at hybridisere dertil og kode for poly-peptider med knoglevækstfaktor-biologiske egenskaber eller 30 andre på forskellig måde modificerede sekvenser, der udviser sådanne egenskaber.

Den beninducerende faktor ifølge opfindelsen, BMP-3, er repræsenteret af den bovine homolog bBMP-3. bBMP-3 er karakteriseret ved DNA-sekvensen og aminosyresekvensen i 35 tabel II A og B, der repræsenterer den bovine genomiske sekvens. Den er karakteriseret ved i det mindste en del af 3 DK PR 172503 B1 en peptidsekvens, der er den samme eller i det væsentlige den samme som aminosyre nr. 1 til aminosyre nr. 175 i tabel II A og B. BMP-3 er yderligere karakteriseret ved evnen til at inducere bendannelse. Den bovine faktor kan anvendes som 5 et værktøj til tilvejebringelse af det analoge humane BMP- 3-protein eller andre proteiner, der er inducerer bendannelse hos pattedyr. Den rette karakterisering af denne bovine beninducerende faktor giver det afgørende startpunkt for metoden, hvorved denne sekvens anvendes. Metoden, hvorved 10 der anvendes teknikker, der er kendt af en fagmand inden for området genteknologi, involverer anvendelse af den bovine DNA-sekvens som en sonde til at screene et humant genomisk eller cDNA-bibliotek og identifikation af DNA-sekvenser, som hybridiseres til sonderne. En klon med en hybridiserbar 15 sekvens plague-renses, og DNA isoleres derfra, subklones og underkastes DNA-sekvensanalyse. Således er et andet aspekt af opfindelsen et humant protein, hBMP-3, fremstillet ved denne metode.

Ifølge et andet aspekt af opfindelsen tilvejebringes 20 farmaceutiske præparater indeholdende en terapeutisk effektiv mængde af et knoglevækstfaktor-polypeptid ifølge opfindelsen i et farmaceutisk acceptabelt bærestof. Disse præparater kan yderligere indeholde andre terapeutisk nyttige midler.

De kan også omfatte en passende matriks til at føre prote-25 inerne til stedet for knogledefekten og til tilvejebringelse af en struktur til benvækst. Disse præparater kan anvendes ved metoder til behandling af et antal knogledefekter og periodontal sygdom. Disse metoder involverer indgivelse til en patient, der har behov for en sådan bendannelse, af en 30 effektiv mængde af det hidtil ukendte protein BMP-3 som beskrevet i den foreliggende beskrivelse.

Ifølge endnu et aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes DNA-sekvenser, der ved ekspression koder for et humant eller bovint polypeptid, der har evnen til at 35 inducere benvævsdannelse. Sådanne sekvenser omfatter sekvensen af nukleotider i retningen fra 5' til 3’, der er il- 4 DK PR 172503 B1 lustreret i tabel II. Alternativt omfatter den foreliggende opfindelse en DNA-sekvens, der hybridiserer under stringente betingelser med DNA-sekvenserne i tabel II, eller en DNA-sekvens, der hybridiserer under ikke-stringente betingelser 5 med de illustrerede DNA-sekvenser, og som ved ekspression koder for et protein, der har mindst én knoglevækstfaktor-biologisk egenskab. Endelig omfatter den foreliggende opfindelse allele eller andre variationer af sekvenserne i tabel II, hvadenten sådanne nukleotidændringer medfører ændringer 10 af peptidsekvensen eller ej.

Et yderligere aspekt af opfindelsen er en vektor indeholdende en DNA-sekvens som ovenfor beskrevet bundet operativt til en ekspressionskontrolsekvens. En sådan vektor kan anvendes ved en særlig fremgangsmåde til fremstilling 15 af et knoglevækstfaktor-polypeptid, hvorved en cellelinie transformeret med en DNA-sekvens, der koder for ekspression af et knoglevækstfaktor-polypeptid bundet operativt til en ekspressionskontrolsekvens derfor, dyrkes. Ved denne fremgangsmåde kan et antal kendte celler anvendes som værtsceller 20 til ekspression af polypeptidet. I øjeblikket foretrukne cellelinier er pattedyr-cellelinier og bakterieceller.

Andre aspekter af og fordele ved den foreliggende opfindelse vil fremgå af den følgende detaljerede beskrivelse og de foretrukne udførelsesformer derfor.

25 Proteinerne ifølge den foreliggende opfindelse er karakteriseret ved aminosyresekvenser eller dele deraf, som er de samme som eller i det væsentlige homologe med sekvenserne anført i tabel II nedenfor. Disse proteiner er også karakteriseret ved evnen til at inducere bendannelse.

30 De her omhandlede knoglevækstfaktorer omfatter også faktorer, som kodes af sekvenser, der ligner de i tabel II anførte, men hvori modifikationer er fremkommet naturligt (f.eks. allele variationer i nukleotidsekvensen, der medføre aminosyreændringer i polypeptidet) eller er tilvejebragt 35 tilsigtet. F.eks. kan syntetiske polypeptider helt eller delvis være kopier af kontinuerlige sekvenser af aminosyre- 5 DK PR 172503 B1 resterne i tabel II. Disse sekvenser kan, fordi de har prinæ-re, sekundære eller tertiære strukturelle og konformations -mæssige karakteristika fælles med knoglevækstfaktor-polypep-tider i tabel II, have knoglevækstfaktor-biologiske egenska-5 ber fælles dermed. De kan således anvendes som biologisk aktive erstatninger for naturligt forekommende knoglevækst-faktor-polypeptider ved terapeutiske metoder.

Andre specifikke mutationer af sekvenserne af de her beskrevne knoglevækstfaktorer omfatter modifikationer ved 10 det ene eller begge glycosyleringssteder. Manglende glyco-sylering eller kun delvis glycosylering skyldes aminosyre-substitution eller -udeladelser ved det ene eller begge de asparagin-bundne glycosylerings-genkendelsessteder, der er til stede i sekvenserne af knoglevækstfaktorerne vist i 15 tabel II. De asparagin-bundne glycosylerings-genkendelses-steder omfatter tripeptidsekvenser, der genkendes specifikt af passende cellulære glycosyleringsenzymer. Disse tripeptid-sekvenser er enten asparagin-X-threonin eller asparagin-X-serin, hvori X sædvanligvis er enhver aminosyre. Forskellige 20 aminosyresubstitutioner eller -udeladelser ved den første eller tredje aminosyreposition eller ved begge positioner af et glycosylerings-genkendelsessted (og/eller aminosyreude-ladelse ved den anden position) medfører ikke-glycosylering ved den modificerede tripeptidsekvens.

25 Den foreliggende opfindelse omfatter også de hidtil ukendte DNA-sekvenser, der er frie for tilknytning til DNA-sekvenser, der koder for andre proteinmaterialer, og som ved ekspression koder for knoglevækstfaktorer. Disse DNA-sekvenser omfatter de sekvenser, der er vist i tabel II i en 30 retning fra 5' til 3' og de sekvenser, der hybridiseres under stringente hybridiseringsbetingelser (jf. T. Maniatis et al., Molecular cloning (A Laboratory Manual) . Cold Spring Harbor Laboratory (1982), side 387-389) til DNA-sekvenserne i tabel II.

35 DNA-Sekvenser, som hybridiseres til sekvenserne i tabel II under ikke-stringente hybridiseringsbetingelser, 6 DK PR 172503 B1 og som ved ekspression koder for knoglevækstfaktorer, der har knoglevækstfaktor-biologiske egenskaber, koder også for knoglevækstfaktorer ifølge opfindelsen. F.eks. vil en DNA-sekvens, som har regioner med væsentlig homologi, f.eks.

5 glycosyleringssteder eller disulfidbindinger, fælles med sekvenserne i tabel II og koder for en knoglevækstfaktor, der har en eller flere knoglevækstfaktor-biologiske egenskaber, klart kode for et medlem af denne hidtil ukendte gruppe af vækstfaktorer, selv om en sådan DNA-sekvens ikke vil 10 hybridiseres stringent til sekvensen i tabel II.

På lignende måde vil DNA-sekvenser, der koder for knoglevækstfaktor-polypeptider, som kodes af sekvenserne i tabel II, men som adskiller sig med hensyn til kodonsekvens på grund af degeneration af den genetiske kode eller allele 15 variationer (naturligt forekommende baseændringer i artspopulationen, der eventuelt kan medføre en aminosyreændring), også kode for de her omhandlede hidtil ukendte vækstfaktorer. Variationer i DNA-sekvenserne i tabel II, som forårsages af punktmutationer eller af inducerede modifikationer for at 20 forøge aktiviteten, halveringstiden eller produktionen af polypeptiderne, der kodes deraf, er også omfattet af opfindelsen.

Ifølge et andet aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes en fremgangsmåde til fremstilling af de hidtil 25 ukendte osteoinduktive faktorer. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen involverer dyrkning af en egnet celle eller cellelinie, der er blevet transformeret med en DNA-sekvens, der ved ekspression koder for et knoglevækstfaktor-polypeptid ifølge opfindelsen under kontrol af kendte regulatoriske 30 sekvenser. Egnede celler eller cellelinier kan være pattedyrceller, såsom ovarieceller af kinesisk hamster (CHO-celler). Selektionen af egnede pattedyr-værtsceller og metoder til transformation, dyrkning, forstærkning, screening og produktproduktion og -rensning er kendte, jf. f.eks. Gething og 35 Sambrock, Nature, 293:620-625 (1981), eller alternativt

Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 5(7):1750-1759 (1985) eller 7 DK PR 172503 B1 US patentskrift nr. 4.419.446. En anden egnet pattedyrcellelinie, som beskrives i eksemplerne nedenfor, er abe-COS-1-cellelinien. En på lignende måde anvendelig pattedyr-cellelinie er CV-l-cellelinien.

5 Bakterieceller er egnede værtsorganismer. F.eks. er forskellige stammer af E. coli (f.eks. HB101, MC1061) velkendte som værtsceller inden for det bioteknologiske område. Forskellige stammer af B. subtilis, Pseudomonas, andre ba-cillusarter og lignende kan også anvendes ved denne frem-10 gangsmåde.

Mange stammer af gærceller, der er kendt af fagmanden, står også til rådighed som værtsceller til ekspression af polypeptiderne ifølge den foreliggende opfindelse. Desuden kan der om ønsket anvendes insektceller som værtsceller ved 15 fremgangsmåden ifølge opfindelsen, jf. f.eks. Miller et al., Genetic Engineering £:277-298 (Plenum Press 1986) og deri anførte litteraturhenvisninger.

Ifølge et andet aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes vektorer til anvendelse ved fremgangsmåden 20 til ekspression af disse hidtil ukendte osteoinduktive po-lypeptider. Vektorerne indeholder fortrinsvis de fuldstændige, hidtil ukendte DNA-sekvenser, som er beskrevet ovenfor, og som koder for de her omhandlede faktorer. Desuden indeholder vektorerne også passende ekspressionskontrolse-25 kvenser, der muliggør ekspression af de beninducerende proteinsekvenser. Alternativt er vektorer, der indeholder modificerede sekvenser som ovenfor beskrevet, også udførelsesformer for den foreliggende opfindelse og anvendelige ved fremstilling af de beninducerende proteiner. Vektorerne kan 30 anvendes ved metoden til transformering af cellelinier og indeholder udvalgte regulatoriske sekvenser knyttet operativt til de kodende DNA-sekvenser ifølge opfindelsen, som er i stand til at styre replikationen og ekspressionen deraf i udvalgte værtsceller. Anvendelige regulatoriske sekvenser 35 til sådanne vektorer er kendte af fagmanden og kan vælges afhængigt af de valgte værtsceller. En sådan udvælgelse er 8 DK PR 172503 B1 rutinemæssig og udgør ikke en del af den foreliggende opfindelse .

Et protein ifølge den foreliggende opfindelse, som inducerer knoglevækst under omstændigheder, hvor der ikke 5 normalt dannes knogle, finder anvendelse ved heling af knoglebrud. Et osteogent præparat, hvori der anvendes et eller flere af proteinerne ifølge opfindelsen, kan finde profylaktisk anvendelse ved heling af lukkede såvel som åbne brud samt ved forbedret fiksering af kunstige led. Ny bendannelse 10 fremkaldt af et osteogent middel bidrager til reparation af craniofaciale defekter, som er medfødte, fremkaldt af trauma eller fremkaldt ved onkologisk resektion, og er også nyttig ved kosmetisk plastisk kirurgi. En osteogen faktor ifølge opfindelsen kan være værdifuld ved behandling af periodontal 15 sygdom og ved andre tandreparationsprocesser. Sådanne midler kan tilvejebringe omgivelser, der tiltrækker bendannende celler, stimulerer vækst af bendannende celler eller fremkalder differentiering af afkom af bendannende celler. Naturligvis kan proteinerne ifølge opfindelsen have andre 20 terapeutiske anvendelser.

Et yderligere aspekt af opfindelsen er et terapeutisk præparat til heling af frakturer og andre tilstande, der er knyttet til knogledefekter eller periodontale sygdomme. Et sådant præparat indeholder en terapeutisk effektiv mængde 25 af et knoglevækstfaktor-protein ifølge opfindelsen. Knoglevækstfaktoren ifølge opfindelsen kan være til stede i et terapeutisk præparat i blanding med et farmaceutisk acceptabelt bærestof eller matriks. Desuden kan proteinerne ifølge opfindelsen eller en kombination af proteiner ifølge opfin-30 delsen indgives sammen med en eller flere andre osteoinduk-tive faktorer, som de kan vekselvirke med. Endvidere kan de beninducerende proteiner kombineres med andre midler, der er gunstige for behandlingen af de omhandlede knogledefekter.

Sådanne midler omfatter, men er ikke begrænset til, forskel-35 lige vækstfaktorer. Fremstillingen af sådanne fysiologisk acceptable proteinpræparater, hvor der tages behørigt hensyn 9 DK PR 172503 B1 til pH-værdi, isotonicitet, stabilitet og lignende, ligger inden for fagmandens rækkevidde.

Det terapeutiske præparat kan anvendes ved lokal indgivelse af præparatet som et implantat eller en anordning.

5 Ved indgivelsen er det terapeutiske præparat til anvendelse ifølge opfindelsen naturligvis i en pyrogenfri, fysiologisk acceptabel form. Endvidere kan præparatet ønskeligt være indkapslet eller blive indsprøjtet i viskos form til tilførsel på stedet for knogleskade. Fortrinsvis vil præparatet 10 af knoglevækstfremkaldende faktor omfatte en matriks, der er i stand til at føre den knoglevækstfremkaldende faktor til stedet for knogleskade, tilvejebringe en struktur for den udviklende knogle og bindevævet og være optimalt i stand til at blive resorberet i kroppen. Sådanne matrikser kan 15 være dannet af andre materialer, der i øjeblikket anvendes til andre medicinske implantationsformål.

Materialet vælges på basis af f.eks. biologisk forenelighed, biologisk nedbrydelighed, mekaniske egenskaber, kosmetisk udseende og grænsefladeegenskaber. På lignende 20 måde vil anvendelsen af de osteoinduktive faktorer bestemme den rette formulering. Mulige matrikser for de osteoinduktive faktorer kan være biologisk nedbrydelige og kemisk defineret, men ikke begrænset til f.eks. calciumsulfat, tricalcium-phosphat, hydroxyapatit, polymælkesyre, polyanhydrider, 25 eller de kan være biologisk nedbrydelige og biologisk vel-definerede, såsom knogle- eller hudkollagen, andre rene proteiner eller ekstracellulære matrikskomponenter, eller de kan være ikke-bionedbrydelige og kemisk definerede, såsom sintret hydroxyapatit, bioglas, aluminater eller andre kera-30 miske materialer, eller kombinationer af enhver af de ovennævnte typer af materialer, såsom polymælkesyre og hydroxyapatit eller kollagen og tricalciumphosphat. De biokeramiske materialer kan eventuelt også ændres i sammensætning, såsom i calcium-aluminium-phosphat, og forarbejdning til ændring 35 af f.eks. porestørrelse, partikelstørrelse, partikelform og biologisk nedbrydelighed.

10 DK PR 172503 B1

Dosisplanen vil blive bestemt af den pågældende læge på baggrund af forskellige faktorer, der modificerer virkningen af en sådan vækstfaktor, f.eks. den vægtmængde knogle der ønskes dannet, stedet for knogleskaden, tilstanden af 5 den beskadigede knogle, patientens alder, køn og diæt, sværhedsgraden af en eventuel infektion, tidspunktet for indgivelse og andre kliniske faktorer. Doseringen kan variere med typen af matriks anvendt ved rekonstitueringen. Tilsætning af andre kendte vækstfaktorer, IGF-1 (insulinlignende 10 vækstfaktor 1) , til det færdige præparat kan også påvirke doseringen. Generelt bør doseringen være i området ca. 10 til 106 ng protein pr. ønsket gram knoglevægt. Fremskridtet kan overvåges ved periodisk vurdering af knoglevæksten og/-eller -reparationen, f.eks. ved røntgenfotografering. Sådanne 15 terapeutiske præparater er også anvendelige til veterinære formål på grund af den manglende artsspecificitet hos beninducerende faktorer. Foruden mennekser er især husdyr og raceheste ønskede patienter til en sådan behandling med de knogleinducerende faktorer ifølge opfindelsen.

20 De følgende eksempler illustrerer den foreliggende opfindelse med hensyn til udvinding og karakterisering af de bovine proteiner og anvendelsen af disse til udvinding af de humane proteiner, tilvejebringelsen af de humane proteiner og exprimeringen af proteiner ved rekombinante meto-25 der.

Eksempel 1

Isolering af bovin benvævsinducerende faktor.

30 Formalet bovint knoglepulver (20-120 mesh, Helitrex) præpareres ved procedurerne ifølge M. R. Urist et al., Proc.

Natl Acad. Sci USA 70:3511 (1973) med udeladelse af visse ekstraktionstrin som nedenfor anført. 10 kg af det formalede pulver demineraliseres ved successive udskiftninger af 35 0,6 N saltsyre ved 4°C over et tidsrum på 48 timer under kraftig omrøring. Den fremkomne suspension ekstraheres i 16 11 DK PR 172503 B1 timer ved 4°C med 50 liter 2 M calciumchlorid og 10 mM ethy-lendiamintetraeddikesyre (EDTA), hvorefter der ekstraheres i 4 timer med 50 liter 0,5 M EDTA. Remanensen vaskes tre gange med destilleret vand, før den resuspenderes i 20 liter 5 4 M guanidinhydrochlorid (GuCl) , 20 mM Tris (pH-værdi 7,4) 1 mM N-ethylmaleimid, 1 mM iodacetamid, 1 mM phenylmethyl-sulfonylfluorid som beskrevet i Clin. Orthop. Rel. Res.

171:213 (1982). Efter 16-20 timer fjernes den ovenstående væske og erstattes med yderligere 10 liter GuCl-puffer.

10 Remanensen ekstraheres i yderligere 24 timer.

De rå GuCl-ekstrakter forenes, koncentreres ca. 20 gange på et Pellicon-apparat med en membran med en molekyl-vægtsafskæring på 10.000 og dialyseres derefter i 50 mM Tris, 0,1 M NaCl, 6 M urinstof (pH-værdi 7,2), som er start-15 pufferen for den første søjle. Efter omfattende dialyse anbringes proteinet på en 4 liters DEAE-cellulosesøjle, og de ikke-bundne fraktioner opsamles.

De ikke-bundne fraktioner koncentreres og dialyseres mod 50 mM NaAc, 50 mM NaCl (pH-værdi 4,6) i 6 M urinstof.

20 De ikke-bundne fraktioner anbringes på en carboxymethylcel-lulose-søjle. Protein, som ikke bindes til søjlen, fjernes ved grundig vaskning med startpuffer, og materialet indeholdende beninducerende faktor desorberes fra søjlen med 50 mM NaAc, 0,25 mM NaCl, 6 M urinstof (pH-værdi 4,6). Proteinet 25 fra dette elueringstrin koncentreres 20-40 gange, hvorefter det fortyndes 5 gange med 80 mM KP04, 6 M urinstof (pH-værdi 6,0). pH-Værdien af opløsningen indstilles til 6,0 med 500 mM K2HPO4. Prøven anbringes på en hydroxylapatitsøjle (LKB) ækvilibreret i 80 mM KPO4, 6 M urinstof (pH-værdi 30 6,0), og alt ikke-bundet protein fjernes ved vaskning af søjlen med den samme puffer. Knoglevækstfaktor-aktivitet elueres med 100 mM KP04 (pH-værdi 7,4) og 6 M urinstof.

Proteinet koncentreres ca. 10 gange, og der tilsættes fast NaCl til en slutkoncentration på 0,15 M. Dette materiale 35 anbringes på en heparin-"Sepharose"-søjle, der er bragt i ligevægt i 50 mM KP04, 150 mM NaCl, 6 M urinstof (pH-værdi 12 DK PR 172503 B1 7,4). Efter grundig vaskning af søjlen med startpuffer elu-eres et protein med knoglevækstfaktoraktivitet med 50 mM KPO4, 700 mM NaCl, 6 M urinstof (pH-værdi 7,4). Denne fraktion koncentreres til et minimalt volumen, og 0,4 ml's por-5 tioner anbringes på "Superose 6"- og "Superose 12"-søjler, der er forbundet i serie og bragt i ligevægt med 4 M GuCl, 20 mM Tris (pH-værdi 7,2), og søjlerne elueres med en strømningshastighed på 0,25 ml/min. Proteinet, der udviser beninducerende faktor-aktivitet har en relativ vandring svarende 10 til et protein på ca. 30.000 dalton.

De ovenfor anførte fraktioner pooles, dialyseres mod 50 mM NaAc, 6 M urinstof (pH-værdi 4,6) og anbringes på en Pharmacia "MonoS HR"-søjle. Søjlen elueres med en gradient op til 1,0 M NaCl, 50 mM NaAc, 6 M urinstof (pH-værdi 4,6).

15 Aktive fraktioner forenes og indstilles til en pH-værdi på 3,0 med 10%'s trifluoreddikesyre (TFA). Materialet anbringes på en 0,46 x 25 cm's "Vydac C4"-søjle i 0,1% TFA, og søjlen elueres med en gradient op til 90% acetonitril, 0,1% TFA (31,5% acetonitril, 0,1% TFA til 49,5% acetonitril, 0,1% 20 TFA i 60 minutter ved 1 ml/minut). Aktivt materiale elueres ved ca. 40-44% acetonitril. Portioner af de aktive fraktioner ioderes ved en af de følgende metoder: P. J. McConahey et al., Int. Arch. Allergy, 29:185-189 (1956); A. E. Bolton et al., Biochem J. . 133:529 (1973); og D. F. Bowen-Pope, 25 Biol. Chem. . 237:5161 (1982). De ioderede proteiner, der er til stede i disse fraktioner, analyseres ved SDS-gelelektro-forese og urinstof-"Triton X-100"-isoelektrisk fokusering.

På dette stadium vurderes den beninducerende faktor til at være ca. 10-50% ren.

30

Eksempel 2

Karakterisering af bovin beninducerende faktor A. Molekylvægt.

35 Ca. 20 μg protein fra eksempel 1 frysetørres og gen opløses i IX SDS-prøvepuffer. Efter 15 minutters opvarmning 13 DK PR 172503 B1 til 37°C anbringes prøven på en 15%'s SDS-polyacrylamidgel og underkastes derefter elektroforese under afkøling. Molekylvægten bestemmes i forhold til for-farvede molekylvægtsstandarder (Bethesda Research Labs). Umiddelbart efter endt 5 elektroforese opskæres gelbanen indeholdende beninducerende faktor i 0,3 cm's stykker. Hvert stykke knuses, og der tilsættes 1,4 ml 0,1%'s SDS. Prøverne omrystes forsigtigt natten over ved stuetemperatur til eluering af proteinet. Hver gelskive afsaltes for at forhindre interferens ved den bio-10 logiske bestemmelse. Den ovenstående væske fra hver prøve gøres sur til en pH-værdi på 3,0 med 10%'s TFA, filtreres gennem en 0,4 5 μτη membran og anbringes på en 0,4 6 x 5 cm's "Vydac C4"-søjle, hvorefter der elueres med en en gradient af 0,1% TFA til 0,1% TFA, 90% acetonitril. De rette knogle-15 vækstfaktor-holdige fraktioner forenes og rekonstitueres med 20 mg rottematrix. I dette gelsystem har størstedelen af knoglevækstfaktorfraktionerne mobilitet som et protein med en molekylvægt på ca. 28.000-30.000 dalton.

20 B. Isoelektrisk fokusering.

Det isoelektriske punkt af knoglevækstfaktoraktivitet bestemmes i et denaturerende isoelektrisk fokuseringssystem.

"Triton X-100"-urinstof-gelsystemet (Hoeffer Scientific) modificeres på følgende måde: 1) 40% af de anvendte amfolyter 25 er "Servalyte 3/10", 60% er "Servalyte 7-9". 2) Den anvendte katolyt er 4 0 mM natriumhydroxid. Ca. 20 μg protein fra eksempel 1 frysetørres, opløses i prøvepuffer og anbringes på isoelektrofokuseringsgelen. Gelen underkastes isoelektrisk fokusering ved 20 watt, 10°C i ca. 3 timer. Derefter opskæres 30 banen indeholdende knoglevækstfaktor i en 0,5 cm's skiver.

Hver skive knuses i 1,0 ml 6 M urinstof, 5 mM Tris (pH-værdi 7,8) , og prøverne omrøres ved stuetemperatur. Prøverne gøres sure, filtreres, afsaltes og underkastes bestemmelse som ovenfor beskrevet. Størstedelen af aktiviteten som bestemt 35 ved bestemmelsen beskrevet i eksempel 3 vandrer på en måde, der stemmer overens med en pi-værdi på 8,8-9,2.

14 DK PR 172503 B1 C. Underenheds-karakterisering.

Underenhedssammensætningen af knoglevækstfaktor bestemmes også. Ren knoglevækstfaktor isoleres fra en præparativ 15%'s SDS-gel som ovenfor beskrevet. En del af prøven 5 reduceres derefter med 5 mM DTT i prøvepuffer og underkastes igen elektroforese på en 15%'s SDS-gel. Proteinet på ca.

30 kd giver to hovedbånd ved ca. 20 kd og 18 kd samt et mindre bånd ved 30 kd. Bredden af de to bånd viser en heterogenitet, der mest sandsynligt forårsages af glycosylering, 10 anden modifikation efter translation, proteolytisk nedbrydning eller carbamylering.

Eksempel 3 15 Biologisk aktivitet af beninducerende faktor

En knogledannelsesbestemmelse hos rotter ved den generelle procedure ifølge Sampath og Reddi, Proc. Natl.

Acad. Sci. U.S.A., 80:6591-6595 (1983) benyttes til at vurdere den osteogene aktivitet af den bovine beninducerende 20 faktor ifølge den foreliggende opfindelse, der er fremstillet i eksempel 1. Denne bestemmelse kan også anvendes til at vurdere beninducerende faktorer fra andre arter. Ethanolud-fældningstrinet erstattes med en dialyse af fraktionen, der skal underkastes bestemmelse, mod vand. Opløsningen eller 25 suspensionen genopløses derefter i et flygtigt opløsningsmiddel, f.eks. 0,1-0,2%'s TFA, og den fremkomne opløsning sættes til 20 mg rotte-matriks. Dette materiale fryses og frysetørres, og det fremkomne pulver indesluttes i gelatine-kapsler nr. 5. Kapslerne implanteres subcutant i det ab-30 dominale thoraxområde af 21-49 dage gamle Evans-hanrotter. Implantaterne fjernes efter 7-14 dage. Halvdelen af hvert implantat anvendes til analyse for alkalisk phosphatase (jf. A. H. Reddi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 69:1601 (1972)), og halvdelen fikseres og forberedes til histologisk 35 analyse. 1 μπι glycolmethacrylat-snit farves rutinemæssigt med Von Kossa-medium og syrefuchsin til påvisning af nyt 15 DK PR 172503 B1 benmateriale. Alkalisk phosphatase, et enzym, som produceres af chondroblaster og osteoblaster under matriksdannelse, bestemmes også. Ny bindevævs- og benvævsdannelse følger ofte niveauerne af alkalisk phosphatase. Tabel I nedenfor 5 illustrerer dosis-reaktionen af rottematriksprøverne inklusive en kontrol, der ikke er behandlet med beninducerende faktor.

Tabel I

10

Alkalisk phosphatase,

Implanteret protein*, μg Bindevæv enheder/liter 15 7,5 2 Ikke bestemt 2,5 3 445,7 0,83 3 77,4 0,28 0 32,5 0,00 0 31,0 20 *) På dette stadium er den beninducerende faktor ca. 10-15% ren.

Det dannede benvæv eller bindevæv er fysisk begrænset 25 til rummet, der optages af matriksen. Prøverne analyseres også ved SDS-gelelektroforese og isoelektrofokusering som beskrevet ovenfor, efterfulgt af autoradiografi. Analyse viser en korrelation af aktivitet med proteinbånd ved 28-30 kD og en pi-værdi 9,0. En ekstinktionskoefficient på 30 1 OD/mg-cm anvendes som et estimat for protein og til til nærmelsesvis bestemmelse af renheden af beninducerende faktor i en bestemt fraktion. Ved bendannelsesbestemmelserne hos rotter in vivo på fortyndinger som ovenfor beskrevet er proteinet aktivt in vivo i en mængde på 10-200 ng protein/-35 gram ben til formentlig mere end 1 μg protein/gram ben.

Eksempel 4

Proteinsammensætning af bovin beninducerende faktor 40 Proteinmaterialet fra eksempel 2A med en molekylvægt på 28-30 kD reduceres som beskrevet i eksempel 2C og nedbry- 16 DK PR 172503 B1 des med trypsin. Der isoleres ved standardprocedurer otte tryptiske fragmenter, der har følgende aminosyresekvenser:

5 Fragment 1: AAFLGDIALDEEDLG

Fragment 2: AFQVQQAADL

Fragment 3: NYQDMVVEG

Fragment 4*. STPAQDVSR

Fragment 5: N Q E A L R

10 Fragment 6: LSEPDPSHTLEE

Fragment 7: F D A Y Y

Fragment 8 s LKPSN7ATIQS IVE

15

Et mindre høj renset præparat af protein fra okseknogle fremstilles ifølge et rensningskema, der ligner det i eksempel 1 beskrevne. Rensningen adskiller sig i det væsentlige fra den ovenfor beskrevne ved udeladelsen af nDE-52"-søjlen, 20 "CM-cellulose"-søjlen og "mono S"-søjlen samt ved en ombytning af rækkefølgen af hydroxylapatit- og heparin-"Sepharo-se"-søjlerne. Kort fortalt indstilles den koncentrerede rå 4 M ekstrakt til en slutkoncentration af ethanol på 85% ved 4°C. Blandingen centrifugeres derefter, og bundfaldet genop-25 løses i 50 mM Tris, 0,15 M natriumchlorid, 6,0 M urinstof.

Dette materiale fraktioneres derefter på heparin-"Sepharose" som beskrevet. Det heparinbundne materiale fraktioneres på hydroxyapatit som beskrevet. De aktive fraktioner pooles, koncentreres og fraktioneres ved højopløsnings-gelfiltrering 30 (TSK 30.000 i 6 M guanidiumchlorid, 50 mM Tris, pH-værdi 7,2). De aktive fraktioner pooles, dialyseres mod 0,1% TFA og fraktioneres derefter på en "C4 Vydac" revers-fase-søjle som beskrevet. Præparatet reduceres og underkastes elektro-forese på en acrylamidgel. Proteinet svarende til 18 K-båndet 35 elueres og nedbrydes med trypsin. Der isoleres tryptiske fragmenter med følgende aminosyresekvenser: 17 DK PR 172503 B1

Fragment 9: SLKPSNHATIQS7V Fragment 10: SFDAYYCS7A Fragment 11: VYPNMTVESCA Fragment 12: VDFADI7W

5

Det bemærkes, at de tryptiske fragmenter 7 og 8 i det væsentlige er de samme som fragmenterne 10 henholdsvis 9.

10 bBMP-3

Sonder bestående af pools af oligonukleotider udformes på basis af aminosyresekvenserne af de tryptiske fragmenter 9 (sonde nr. 3), 10 (sonde nr. 2) og 11 (sonde nr. 1) og 15 syntetiseres på et automatiseret DNA-synteseapparat.

Sonde nr. 1: ACNGTCAT [A/G] T T N G G [A/G] T A

Sonde nr. 2: C A [A/G] T A [A/G] T A N G C [A/G] T C

[A/G] A A

20 Sonde nr. 3: TG [A/G/T] ATNGTNGC [A/G] T G

[A/G] T T

Et rekombinant bovint genomisk bibliotek konstrueret i EMBL3 screenes ved TMAC-hybridiseringsproceduren, hvor 25 sonderne behandles med kinase og hybridiseres til et sæt af filtre i 3 M tetramethylammoniumchlorid (TMAC) , 0,1 M na- triumphosphat, pH-værdi 6,5, 1 mM EDTA, 5X Denhardts, 0,6% SDS, 100 μg/ml laksemælk-DNA ved 48°C og vaskes i 3 M TMAC, 50 mM Tris, pH-værdi 8,0, ved 50°C. Disse betingelser mini-30 merer påvisningen af materialer, der ikke passer til sondepoolen (se Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 82: 1585-1588 (1985)). 400.000 rekombinanter screenes dobbelt med sonde nr. 1, der er mærket med Alle rekombinanter, som hybridiserer til denne sonde, genudplades til dannelse 35 af sekundære. Nitrocellulose-replikaer i tre eksemplarer fremstilles ud fra de sekundære plader og forstærkes som 18 DK PR 172503 B1 beskrevet. De tre sæt af filtre hybridiseres til sonderne nr. 1, nr. 2 og nr. 3, igen under TMAC- -betingelser. En klon, λ bP-819, hybridiserer til alle tre sonder og plaque-renses, og DNA isoleres fra et pladelysat. Bakteriofag λ-5 bP-819 er deponeret hos ATCC den 16. juni 1987 under depone ringsnummeret 40344. Denne bP-819-klon koder for den bovine knoglevækstfaktor betegnet bBMP-3.

Regionen af bP-819, der hybridiserer til sonde nr.

2, er lokaliseret og sekvensbestemt. Den delvise DNA-sekvens 10 og den afledte aminosyresekvens af denne region er vist i tabel IIA. Aminosyresekvenserne svarende til de tryptiske fragmenter 10 og 12 er understreget. Den første understregede sekvens svarer til fragment 12, medens den anden understregede sekvens svarer til fragment 10. Denne region af bP-819, 15 som hybridiserer til sonde nr. 2, koder derfor mindst 111 aminosyrer. Denne aminosyresekvens kodes af DNA-sekvensen fra nukleotid nr. 414 til nr. 746.

19 DK PR 172503 B1

Tabel IIA

383 393 403 413 (1) 428

GAGGAGGAAG CX3G1CEAOQG GGCTCCITCT GOCTCIGCAG AAC AAT GAG CIT CCT GGG GCA

Asn Asn Glu Leu Pro Gly Ala 443 458 473 488

GAA TAT GAG TAC AAG GAG GAT GAA GEA TGG GAG GAG AGG AAG CCT TAC AAG ACT

Glu Tyr Gin Tyr lys Glu Asp Glu Val Trp Glu Glu Arg lys Pro Tyr Lys Thr 503 518 533

CIT CAG ACT CAG CCC CCT GAT AAG ACT AAG AAC AAA AAG AAA CAG AGG AAG GGA

Leu Gin Thr Gin Pro Pro Asp Lys Ser Lys Asn Lys Lys Lys Gin Arg Lys Gly 548 563 578 593

CCT CAG CAG AAG AGT CAG AOG CIC CAG ITT GAT GAA CAG ACC CIG AAG AAG GCA

Pro Gin Gin Lys Ser Gin Thr Leu Gin Fhe Asp Glu Gin Thr Leu Lys lys Ala 608 623 638

AGA AGA AAG CAA TGG ATT GAA CCC OGG AAT TCT GCC AGA CGG TAC CIT AAA GIG

Arg Arg lys Gin Trp Ile Glu Pro Arg Asn Cys Ala Arg Arg Tyr Leu Lys Val 653 668 683 698

GAC TTC GCA GAT ATT GGC TGG AGC GAA TGG ATT ATT TCC CCC AAG TCC TTC GAT

Asp Ehe Ala Asp Ile Giv Tro Ser Glu Trp Ile Ile Ser Pro lys Ser Fhe Asp 713 728 743 (111) 756

GCC* TAT TAC TGC TCC GGA GCG TGC CAG TTC CCC ATG CCA AAG CTAGCCATIG

Ala Tyr Tyr Cvs Ser Giv Ala Cys Gin Rie Pro MET Pro lys 766 776 786 tttutgioc tgtocitooc aittocatag 20 DK PR 172503 B1

Regionen af bP-819, som hybridiserer til sonde nr. 1 og nr. 3, lokaliseres og sekvensbestemmes. Den delvise DNA--sekvens og den afledte aminosyresekvens af denne region er vist i tabel IIB. Aminosyresekvenserne svarende til de tryp-5 tiske fragmenter 9 og li er understreget. Den første understregede sekvens svarer til fragment 9, medens den anden understregede sekvens svarer til fragment 11. Peptidsekvensen af denne region af bP-819, som hybridiserer til sonde nr. 1 og nr. 3, har en længde på 64 aminosyrer og kodes af nu-10 kleotid nr. 305 til nr. 493 i tabel IIB. Argininresten, der kodes af AGA-tripletten, formodes at være carboxyterminussen af proteinet baseret på tilstedeværelsen af et stopkodon (TAA) i tilslutning dertil. Nukleinsyresekvensen, som går forud for parret TC (positionerne 305-306), formodes at være 15 et intron (en ikke-kodende sekvens) baseret på tilstedeværelsen af en consensus-acceptorsekvens (dvs. en pyrimidinrig del, TTCTCCCTTTTCGTTCCT, efterfulgt af AG) og tilstedeværelsen af et stop snarere end en basisk rest på det pågældende sted i den afledte aminosyresekvens.

20 bBMP-3 er derfor karakteriseret ved DNA-sekvensen og aminosyresekvensen i.tabel IIA og tabel IIB. Peptidsekvensen af denne klon har en længde på 175 aminosyrer og kodes af DNA-sekvensen fra nukleotid nr. 414 til nukleotid nr. 746 i tabel IIA og nukleotid nr. 305 til nukleotid nr. 493 i tabel 25 IIB.

284 294 304 (112) 319

CTAAOCTCTG TrCTOOCOT TOGITCCIAG TCT TIG AAG CCA TCA AAT CAC GCT AOC

Ser Leu Lvs Pro Ser Asn His Ala Thr 21 DK PR 172503 B1

Tabel IIB

5 334 349 364 379

ATC CAG AGT ATA GIG AGA GCT GIG GGG GTC GDC CCT GGA ATC COC GAG CCT TGC

Ile Gin Ser Ile Val Arg Ala Val Gly Val Val Pro Gly Ile Pro Glu Pro Cys 394 409 424 439

TGT GIG OCA GAA AAG ATG TCC TCA CTC AGC ATC TIA TTC TIT GAT GAA AAC AAG

cys Val Pro Glu Lys MET Ser Ser Leu Ser Ile Leu Ehe Rie Asp Glu Asn lys 10 454 469 484 (175)

AAT GIG GEA CTT AAA GIA TAT CCA AAC ATG ACA GEA GAG TCT TGT GCT TGC AGA

Asn Val Val Lau Lys Val Tvr Pro Asn MET Thr Val Glu Ser Cvs Ala cys Arg 503 513 523 533

TAACCIGGIG AAGAACTCAT CIGGA3GCIT AACTCAATCG

15

Eksempel 5

Human beninducerende faktor

Sekvenserne af BMP-3 som vist i tabel II har væsentlig homologi med S-(B)- og β-(A)-underenhederne af inhibiner.

20 Inhibiner er en familie af hormoner, som i øjeblikket udforskes med henblik på anvendelse ved svangerskabsforebyggelse, jf. A. J. Mason et al., Nature, 318:659-663 (1985).

I mindre omfang er de også homologe med Muller's inhiberende substans (MIS), et testikel-glycoprotein, som forårsager 25 regression af de Mullerske gange under udviklingen af drengefostre og transformerende vækstfaktor-S-(TGF-b), som kan hæmme eller stimulere vækst af celler eller få dem til at differentiere.

30 BMP-3

Da bovine og humane knoglevækstfaktor-gener formodes at være væsentligt homologe, anvendes oligonukleotidsonder, som har vist sig at hybridisere til den bovine DNA-sekvens i tabel IIA og UB, til at screene et humant genomisk bib- 35 liotek. Et humant genomisk bibliotek (Toole et al., se ovenfor) screenes ved anvendelse af disse sonder, og formodede 22 DK PR 172503 B1 positive isoleres, og DNA-sekvensen bestemmes som ovenfor beskrevet. Beviset for, at denne rekombinant koder en del af molekylet af human benvævsinducerende faktor, bygger på bovine/humane protein- og genstruktur-homologier.

5 Efter tilvejebringelse af en rekombinant bakteriofag indeholdende DNA, der koder for en del af det humane BMP-3--molekyle, anvendes den humane kodende sekvens som en sonde som beskrevet i eksempel 5 A til identificering af en human cellelinie eller væv, som syntetiserer BMP-3. mRNA udvælges 10 ved oligo-(dT)-cellulosechromatografi, og cDNA syntetiseres og klones i λ gtlO ved velkendte metoder (Toole et al., se ovenfor).

Alternativt kan hele genet, der koder for denne humane benvævsinducerende faktor, identificeres og fås i yderligere 15 rekombinante kloner, hvis det er nødvendigt. Yderligere rekombinanter, der indeholder yderligere 3'- eller 5'-regioner af dette gen for human benvævsinducerende faktor, kan fås ved at identificere særlige DNA-sekvenser ved enden eller enderne af den oprindelige klon og anvende disse som 20 sonder til igen at screene det humane genomiske bibliotek.

Genet kan derefter samles igen i et enkelt plasmid ved stan-dard-molekylærbiologiske metoder og forstærkes i bakterier.

Hele genet for human BMP-3-faktor kan derefter overføres til en passende ekspressionsvektor. Ekspressionsvektoren 25 indeholdende genet transficeres derefter til en pattedyrcelle, f.eks. abe-COS-celler, hvor det humane gen transkri-beres, og RNA splejses korrekt. Medium for de transficerede celler undersøges for aktivitet af benvævsinducerende faktor som beskrevet, hvilket er et tegn på, at genet er fuldstæn-30 digt. mRNA udvindes fra disse celler, og cDNA syntetiseres ud fra denne mRNA-kilde og klones. De ovenfor beskrevne procedurer kan på lignende måde anvendes til at isolere benvævsinducerende faktor fra andre arter af interesse ved anvendelse af den bovine benvævsinducerende faktor og/eller 35 den humane benvævsinducerende faktor som sonde-kilde. Sådanne benvævsinducerende faktorer fra andre arter kan finde lig- 23 DK PR 172503 B1 nende anvendelse til blandt andet reparation af knoglebrud.

Eksempel 6 5 Ekspression af benvævsinducerende faktorer

Til fremstilling af bovine, humane eller andre pat-tedyr-benvævsinducerende faktorer overføres DNA'et, som koder derfor, til en passende ekspressionsvektor og indføres i pattedyrceller ved konventionelle genmanipuleringsmetoder.

10 En fagmand kan konstruere pattedyr-ekspressionsvek torer ved at anvende sekvensen anført i tabel II eller andre modificerede sekvenser og kendte vektorer, såsom pCD [Okayama et al., Mol. Cell Biol., 2:161-170 (1982)] og pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4:645-653 (1985)]. Transformationen 15 af disse vektorer i egnede værtsceller kan medføre ekspression af osteoinduktive faktorer. En fagmand kan manipulere sekvenserne anført i tabel II ved at fjerne eller erstatte de pattedyr-regulatoriske sekvenser, der flankerer den kodende sekvens, med bakteriesekvenser til dannelse af bakterie-20 vektorer til intracellulær eller ekstracellulær ekspression af bakterieceller. F.eks. kan de kodende sekvenser manipuleres yderligere (f.eks. ligeres til andre kendte linkere eller modificeres ved udeladelse af ikke-kodende sekvenser derfra eller ændring af nukleotider deri ved andre kendte 25 metoder). Den modificerede sekvens, der koder for benvævsin-ducerende faktor, kan derefter indføjes i en kendt bakteriel vektor ved anvendelse af procedurer som f.eks. beskrevet af T. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5230-5233 (1980). Denne eksempelvise bakterielle vektor kan der-30 efter transformeres i bakterielle værtsceller, og der kan derved eksprimeres benvævsinducerende faktor. Vedrørende en strategi til tilvejebringelse af ekstracellulær ekspression af benvævsinducerende faktor i bakterieceller kan der f.eks. henvises til EP patentansøgning nr. 177.343.

35 Lignende manipulationer kan gennemføres til konstruk tion af en insektvektor (se f.eks. procedurerne beskrevet i 24 DK PR 172503 B1 offentliggjort EP patentansøgning nr. 155.476) til ekspression i insektceller. En gærvektor kan også konstrueres ved anvendelse af gær-regulatoriske sekvenser til intracellulær eller ekstracellulær ekspression af faktorerne ifølge den 5 foreliggende opfindelse af gærceller (se f.eks. procedurerne beskrevet i den offentliggjorte internationale ansøgning nr. W086/00639 og EP patentansøgning nr. 123.289).

En metode til opnåelse af høje niveauer af en osteo-induktiv faktor ifølge opfindelsen ud fra pattedyrceller 10 involverer konstruktion af celler, der indeholder flere kopier af det heterologe gen for benvævsinducerende faktor.

Det heterologe gen kan bindes til en forstærkelig markør, f.eks. genet for dihydrofolat-reduktase (DHFR), ved hjælp af hvilket celler, der indeholder et forøget antal genkopier, 15 kan udvælges til formering i stigende koncentrationer af methotrexat (MTX) ved procedurerne ifølge Kaufman og Sharp.

J. Mol. Biol., 159:601-629 (1982). Denne metode kan anvendes med et antal forskellige celletyper.

F.eks. kan et plasmid indeholdende en DNA-sekvens 20 for en benvævsinducerende faktor ifølge opfindelsen knyttet operativt til andre plasmidsekvenser, der muliggør ekspression deraf, og DHFR-ekspressionsplasmidet pAdA26SV(A)3 [Kaufman og Sharp, Mol. Cell. Biol., 2:1304 (1982)] sammen indføres i DHFR-defekte CHO-celler, DUKX-BII, ved calciumphos-25 phat-copræcipitation og transfektion. Transformanter, der eksprimerer DHFR, udvælges til vækst i a-medium med dialyseret kalvefosterserum, og selekteres derefter til forstærkning ved vækst i stigende koncentrationer af MTX (successive trin i 0,02, 0,2, 1,0 og 5 μΜ MTX) som beskrevet af Kaufman 30 et al., Mol Cell Biol., 5:1750 (1983). Transformanterne klones, og ekspressionen af biologisk aktiv benvævsinducerende faktor overvåges ved en rotte-bendannelsesbestemmelse. Ekspressionen af benvævsinducerende faktor bør stige med stigende niveauer af MTX-resistens. Lignende procedurer kan 35 anvendes til fremstilling af andre benvævsinducerende faktorer .

DK PR 172503 B1 25

Alternativt eksprimeres det humane gen direkte som ovenfor beskrevet. Aktiv benvævsinducerende faktor kan produceres i bakterier eller gærceller. Imidlertid er det i øjeblikket foretrukne ekspressionssystem til biologisk aktiv, 5 rekombinant human benvævsinducerende faktor stabilt transformerede CHO-celler.

Eksempel 7 10 Biologisk aktivitet af eksprimeret benvævsinducerende faktor

Til måling af den biologiske aktivitet af den ekspri-merede benvævs inducerende faktor (hBMP-3) , der er fremstillet i eksempel 6 ovenfor, renses faktoren delvis på en heparin-"Sepharose"-søjle. 4 ml transfektions-supernatant fra en 15 100 mm skål koncentreres ca. 10 gange ved ultrafiltrering på en YM 10-membran og dialyseres derefter mod 20 mM tris, 0,15 M natriumchlorid, pH-værdi 7,4 {startpuffer). Dette materiale anbringes derefter på en 1,1 ml heparin-"Sepharo-se"-søjle i startpuffer. Ikke-bundne proteiner fjernes ved 20 vaskning med 8 ml startpuffer, og bundne proteiner, herunder BMP-1, desorberes ved vaskning med 3-4 ml 20 mM tris, 2,0 M natriumchlorid, pH-værdi 7,4.

Proteinerne bundet af heparin-søjlen koncentreres ca. 10 gange på en "Centricon 10", og saltet reduceres ved 25 diafiltrering med 0,1% trifluoreddikesyre. En passende mængde af denne opløsning blandes med 20 mg rottematriks og undersøges derefter for benvævs- og bindevævsdannelse in vivo som ovenfor beskrevet i eksempel 3. En supernatant-fraktion fra en "falsk" transfektion anvendes som kontrol.

30 Implantaterne indeholdende rottematriks, hvortil der er sat specifikke mængder af humant BMP-3, fjernes fra rotterne efter 7 dage og forarbejdes til histologisk vurdering. Repræsentative snit af hvert implantat farves til undersøgelse af tilstedeværelsen af nyt knoglemineral med von 35 Kossa-reagens og syrefuchsin, og for tilstedeværelsen af bindevævs-specifik matriksdannelse under anvendelse af tolui- 26 DK PR 172503 B1 dinblåt. Celletyperne, som er til stede i snittet, samt det omfang, hvori disse celler udviser fænotype, vurderes.

Tilsætning af humant BMP-3 til matriksmaterialet medfører dannelse af bindevævslignende noduler 7 dage efter 5 implantation. Celler af chondroblast-type kan genkendes ved hjælp af formen og ekspresionen af metakromatisk matriks.

Graden af aktivitet, der observeres for humant BMP-1, er afhængig af mængden af humant BMP-3-protein, der er sat til matriksen.

10

Claims

1. Gen, som koder for bovint BMP-3 og omfatter følgende DNA-sekvens: 383 393 403 413 428 GAGGAGGAAG CGGTCTACGG GGGICCITCT GCCTCIGCAG AAC AKT GAG CIT CCT GGG GCA Asn Asn Glu Lea Pro Gly Ala 443 458 473 488 GAA TAT CAG TAC AAG GAG GAT GAA GIA TGG GAG GAG AGG AAG CCT TAG AAG ACT Glu lyr Gin Tyr lys Glu Asp Glu Val Trp Glu Glu Arg lys Pro Tyr lys Thr 503 518 533 CIT CAG ACT CAG OOC CCT GAT AAG AGT AAG AAC AAA AAG AAA CAG AGG AAG GGA Lau Gin Hor Gin Pro Pro Asp lys Ser lys Asn lys lys lys Gin Arg lys Gly 548 563 578 593 CCT CAG CAG AAG AGT CAG ACG CTC CAG TIT GAT GAA CAG AOC CIG AAG AAG GCA Pro Gin Gin lys Ser Gin Thr Leu Gin Phe Asp Glu Gin Thr Lau lys Lys Ala 608 623 638 AGA AGA AAG CAA TGG ATT GAA CQC CGG AAT TGI GOC AGA OGG TAC CIT AAA GIG Arg Arg lys Gin Trp Ile Glu Pro Arg Asn Cys Ala Arg Arg Tyr Leu Lys Val 653 668 683 698 GAC TTC GCA GAT ATT GGC TGG AGC GAA TGG ATT ATT TOC COC AAG TOC TIC GAT Asp fhe Ala Asp Ile Gly Trp Ser Glu Trp Ile Ile Ser Pro lys Ser Ihe Asp 713 728 743 756 766 GCC TAT TAC..TGC TCC GGA GOG TGC CAG TTC COC ATS OCA AAG GIAGCCATIG TTTTTIGICC Ala Tyr Tyr cys Ser Gly Ala Cys Gin Phe Pro MET Pro lys 776 786 TGIGCITCOC ATTTOCAIAG ; . og 284 294 304 319 CTAACCIGTC ΤΓΟίαΧΤΓΓ TOGITCCEAG TCT TIG AAG OCA TCA AAT CAC GCT AOC Ser Leu lys Pro Ser Asn His Ala Thr 334 349 364 379 ATC CAG AGT ΑΤΆ GTG AGA GCT GTG GGG GIC GTC OCT GGA ATC OCC GAG CCT TGC Ile Gin Ser Ile Val Arg Ala Val Gly Val Val Pro Gly Ile Pro Glu Pro Cys 394 409 424 439 TCT GIG OCA GAA AAG ATS TOC TCA CTC AGC ATC TTA TTC TTT GAT GAA AAC AAG Cys Val Pro Glu lys MET Ser Ser Leu Ser Ile Leu Ehe Phe Asp Glu Asn Lys 454 469 484 AAT GIG GTA CIT AAA GEA TAT CCA AAC ATG ACA GTA GAG TCT TCT GCT TGC AGA Asn Val Val Lsu lys Val Tyr Pro Asn MET Thr Val Glu Ser Cys Ala Cys Arg 503 513 523 533 TAAOCIGGIG AAGAACTCAT CIGGATGCIT AACTCAATOG. DK PR 172503 B1

2. Gen, som koder for bovint BMP-3 og har aminosyre-sekvensen anført i krav 1.

3. Gen, som koder for et protein, som udviser egenskaber af humant BMP-3, og omfatter en DNA-sekvens: 5 (a) som adskiller sig fra en DNA-sekvens ifølge krav 1 i kodonsekvens på grund af degenerationen af den genetiske kode, (b) som hybridiserer med en DNA-sekvens ifølge krav 1 eller afsnit (a) ovenfor, eller 10 (c) udgør et fragment, en allelisk eller anden varia tion af en DNA-sekvens ifølge krav 1, hvad enten denne variation medfører ændringer i peptidsekvensen eller ej.

4. DNA-Sekvens ifølge krav 3, som koder for humant

5. DNA-Sekvens ifølge krav 3 eller 4, som er en geno-misk DNA-sekvens.

6. DNA-Sekvens ifølge krav 3 eller 4, som er en cDNA-sekvens.

7. Vektor indeholdende genet eller DNA-sekvensen ifølge ethvert af kravene 1-6 i operativ forbindelse med en ekspressionskontrolsekvens.

8. Celle transformeret med en vektor ifølge krav 7.

9. Celle ifølge krav 8, som er en pattedyrcelle, en 25 bakteriecelle, en insektcelle eller en gærcelle.

10. Celle ifølge krav 9, som er en CHO-celle.

11. Protein, som udviser egenskaber af BMP-3, og som kodes af et gen eller en DNA-sekvens ifølge ethvert af kravene 1 - 6.

12. Protein, som udviser egenskaber af BMP-3, og som kan fås ved dyrkning i et egnet dyrkningsmedium af en celle transformeret med en ekspressionsvektor indeholdende et gen eller en DNA-sekvens ifølge ethvert af kravene 1-6 og udvinding af proteinet fra dyrkningsmediet.

13. Fremgangsmåde til fremstilling af proteinet ifølge krav 11 eller 12, omfattende dyrkning i et egnet dyrkningsme- DK PR 172503 B1 dium af cellen ifølge krav 9 og isolering af proteinet fra dyrkningsmediet.

14. Farmaceutisk præparat indeholdende proteinet ifølge krav 11 eller 12 og et farmaceutisk acceptabelt bære- 5 stof.

15. Farmaceutisk præparat ifølge krav 14, yderligere omfattende en matriks, som er i stand til at føre præparatet til stedet for knogle- eller bindevævsdefekten og danne en struktur til fremkaldelse af knogle- eller bindevævsdannelse.

15 BMP-3.

16. Farmaceutisk præparat ifølge krav 15, hvor ma- triksen omfatter hydroxyapatit, kollagen, polymælkesyre eller tricalciumphosphat.

17. Anvendelse af et protein ifølge krav 11 eller 12 til fremstilling af et farmaceutisk præparat til fremkal-15 delse af knogle- eller bindevævsdannelse.