JPH07500487A

JPH07500487A - 骨形成ペプチド

Info

Publication number: JPH07500487A
Application number: JP3518322A
Authority: JP
Inventors: ハーマンオパーマン，; オズケイナック，エンジン; ルージャー，　デイビッド　シー．; クベラサンパス，　サンゲーベル
Original assignee: ストライカーコーポレイション
Priority date: 1990-10-18
Filing date: 1991-10-18
Publication date: 1995-01-19
Also published as: DE69129865D1; EP0643767B1; ATE168719T1; DE69129865T2; WO1992007073A1; CA2094027A1; ES2120964T3; AU663689B2; CA2094027C; AU8900091A; EP0643767A1; JPH11262395A; DK0643767T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】骨形成ペプチド光皿勿豊景本発明は、新規なポリペプチド鎖及び哺乳動物に於ける骨形成を誘発しうるポリペプチド鎖から成る骨形成タンパク質に係る。そして、ポリペプチド鎖をエンコードする遺伝子、ＤＮＡ遺伝子組換え技術を用いるそれらの製造方法、及び骨形成タンパク質を用いる骨および軟骨組織修復方法に関する。

哺乳動物の骨組織は、推定するに、骨の成長及び自然治癒中に活発化する軟骨内骨形成に至る細胞事象の展開カスケードを誘発し得る単−若しくは複数のタンパク質物質を含むものと知られている。この活性因子（又は因子類）は、文献では、骨形態形成タンパク質、骨誘発タンパク質、骨形成タンパク質、オステオジェニン又は骨誘発タンパク質等、様々に称名されている。

骨分化の展開カスケードは開光組繊細胞のレクリートメント、原種細胞の増殖、軟骨石灰化、管侵入、骨形成、改造そして髄分化から成る（Ｒｅｄｄｉ（１９８１）　Ｃｏｕｕ並」１．　Ｒｅｓ、　１：２０９−２２６）。

これ等の表現型変換の基礎となる正確な機構は不明確であるが、骨マトリックスの自然軟骨内骨分化活性は分離的に抽出することができ、不活性の残照コラーゲンマトリックスと再構成され完全な骨誘導活動を回復する（Ｓａａ＋ｐａｔｈ　ａｎｄ　Ｒｅｄｄｉ。

（１９８１）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７８ニア５９９−７６０３）　、これにより、生体軟骨内骨誘発能力を試す実験方法が提供される。

数種の哺乳動物は、異種移植実験で示されるように、密接に関連するタンパク質を生成する（Ｓａｓ＋ｐａｔｈ　ａｎｄ　Ｒｅｄｄｉ　（１９８３）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪｓＡ　８０：６５９１−９５９５）。

これ等のタンパク質の潜在的有用性は広く認められてきた。

これ等タンパク質が入手可能になれば、整形外科、ある種のプラスティック外科と種々の歯周及び頭顔処置を改革することになろう。

これ等タンパク質両分の性質が観測されると、種々の研究所で、骨形成活動の原因になる純粋な因子、あるいは因子類を分離し、特定しようとする強力な研究努力が惹起した。＠乳動物の骨から骨形成タンパク質を純粋化しようとする技術の現状は、Ｓａｍｐａ　ｔｈ等により示されている。（（１９８７）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４ニア１０９−７１１３）。Ｕｒｉｓｔ等は（１９８４）力透旦、五匹よ」組り一堕」Ｌ−６世よ　Ｈ匙１９４ −１９９で、塩化カルシウム−尿素からなる無機−有機溶剤混合物により脱塩皮質骨から抽出され、グアニジン−塩酸塩と調製ゲル電気泳動で分別沈澱により回収されたヒトの骨形成タンパク質両分を開示している。彼らの報告によれば、このタンパク質両分は酸性ポリペプチドのアミノ酸成分をもち、１７４８ｋＤ　領域の分子量を有する。

Ｕｒｉｓｔ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８１：３７１−３７５は酸性ポリペプチドの性質をもち、分子量が約１８ｋＤの牛の骨形前形成のタンパク質を開示している。その著者等の報告によれば、このタンパク質はヒドロキシアパタイト・スの体後半部の筋肉内に骨形成、そしてラットと犬の頭骨内の冠状欠陥に骨再生を誘発した。骨から抽出物を得る彼等の方法は、生成物が不明瞭で、不純物を含んでいる。

１９８５年１０月７日公開の欧州特許出願第１４８．１５５号は、牛、豚及びヒト由来の骨形成タンパク質を開示している０発明者等によって２２−２４ｋＤの分子量をもつＰ３タンパク質と名付けられたタンパク質の一つは、本質的に均一な状態に純化されたと述べられている。この物質は動物に埋め込まれたとき、骨形成を誘発すると報告されている。

１９８８年１月１４日発行の国際出＃ＰＣＴ１０８？１０１５３７は、骨誘導性質をもつ、牛の骨からの未精製画分を開示している。出願人は又、ＤＮＡ組換え技術によって生成された推定上の「骨誘導ファクターＪを開示している。４個のＤＮＡシーケンスがヒト又は牛ゲノム或いはｃＤＮＡライブラリーから回収され遺伝子組換えのホストセル内に発現されている。出願人は発現されたタンパク質が骨形前形成のタンパク質であり得ると述べているが、骨誘導は示されていす、遺伝子組換えタンパク質は骨形成性のものではないことを示唆している。同じグループはその後、４個のファクターのうち３個は軟骨形成を誘発すると報告し、そして骨形成活動は「調整分子の混合によるものであり」そして「骨形成は０１．これ等分子の相互作用よって制御されるというのが極めて有り得ることである」と仮定する。再び、如何なる骨形成もｃＤＮＡの発現生成物に起因されなかった。「骨形前形成に伴う因子」を名称とするＵｒｉｓＬ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＰＯ２１２＋４７４についても参照のこと。

’Ａａｎｇ等は、（１９８８）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ　８５．で、ゲル濾過から決定した３０ｋＤの分子量に対応する塩基性タンパク質の軟骨及び骨形成活性を有する脱塩骨のグアニジン抽出物からの牛の骨形前形成タンパク質の精製を開示している。このタンパク質の精製により、分離して不活性となった３０．１８及び１６ｋＤのタンパク質を得た。この結果から、活性物質の正確な同定はできなかったことを認めている。

１４ａｎｇ等は、（１９９０）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、＾ｓｉ、　ＵＳＡ　８７：　２２２０−２２２７で、ＰＣＴ　８７１０１５３７に記載されたｃＤＮＡ鎖の一つの発現と部分精製を記載している。軟骨組織及び／又は骨形成をこのタンパク質で首尾一貫して行おうとすると純度５０％の物質の最低６００ｎｇを要する。

１９９０年４月１９日刊行の国際出願第ＰＣＴ／８９１０４４５８（Ｉｎｔ、　Ｐｕｂ。

Ｎｏ、　ｌ［１９０１００３７３３）は、ｒ３１−３４のＰ３Ｊと呼ばれる一骨形成因子ファミリーの純化と分析を記載している。このタンパク質ファミリーは、ペプチド断片配列により特徴づけられる少なくとも４個のタンパク質を含む。

不純混合物ｒ３１−３４のＰ３Ｊは骨形成活性により検定される。個々のタンパク質の活性は評価されず、また論議もされていない。

本発明の一つの目的は、ヒトを含む哺乳動物での同種および異種移植に於ける軟骨内骨形成が可能な二量体骨形成タンパク質のサブ・ユニットとして有用な新規なポリペプチド鎖の提供にある。他の目的は、これらのポリペプチド鎖をコードする遺伝子、及びＤＮＡ組換え技術を用いてこれ等のポリペプチド鎖から成る骨形成タンパク質の製造方法の提供、そしてこれ等タンパク質に特異的に結合できる抗体の提供にある。

本発明のこれら及び他の目的と特徴は、以下の記載、図面及び続くクレームから明らかになろう。

主班坐塁要本発明は、マトリックスと連携して補乳動物内に埋め込まれたとき、埋め込み位置に軟骨内骨形成と骨髄分化の十分な展開カスケードを誘発できる二量体骨形成タンパク質の一方または両方のサブ・ユニットとして有用な、新規なポリペプチド連鎖を提供する。

これ等の展開の鍵は、天然牛骨形成タンパク質のアミノ酸シーケンスと構造データの解明にあった。活発な、実質上純粋な骨形成タンパク質を、移植物のｍｇ当たり約０．８から１．０ｎｇの半量大骨形成活性を有する牛骨から回収するに至るプロトコルが開発された。物質が入手可能であったので、本発明者等は骨形成を達成するに必要なタンパク質の重要な構造的詳細を解明することができた。タンパク質のアミノ酸シーケンスと他の構造的特徴の知識はヒトのゲノムに於ける天然遺伝子の特定とクローニングを可能にした。

部分シーケンスデータに基づくコンセンサスＤＮＡシーケンスと文献に示された調節タンパク質の観測ホモロジーを、ヒトのゲノム及びｃＤＮＡライブラリーから骨形成タンパク質をコードする遺伝子を抽出するためのプローブとして用いた。コンセンサス・シーケンスの一つは、これまで未特定であった遺伝子を分離するのに用いた。この遺伝子は、適切に修正され、適切なマトリックスに挿入され、そしてここに開示されたように埋め込まれるとき、軟骨内骨形成が可能な領域から成るタンパク質をコードし、発現する。ｒｈＯＰ１］又はｒＯＰ−ＩＪと呼ばれる遺伝子は、係属中の米国４２２．６９９に詳細に記載されており、引例によって一体化されて開示している。

その天然型では、ｈＯＰ　１発現は、約４００アミノ酸の未成熟翻訳物（ｒｈＯＰｌ−ＰＰＪここでｒｐｐｌは「プレプロ形式」を言う）を得られ、１３９アミノ酸の成熟配列として（ｒＯＰ　１−１８４　）その後プロセッシングされる。

このタンパク質の活性領域（機能ドメイン）はｈＯＰ　１シーケンス（ｒＯＰｓＪ）のＣ末端９７アミノ酸から成る。長い活性シーケンスはＯＦ２　（Ｃ末端１０２アミノ酸から成る）である。

哺乳動物のｃＤＮＡライブラリーをｈＯＰ　１に固有なシーケンスで更に調べると、ここで’０Ｐ２Ｊ　（ｒｈＯＰ２Ｊ又はｒｍＯＰ２」）と称する新規なＯＰ１類似のシーケンスが特定された。このＯＰ２タンパク質は約７４％の有意のアミノ酸シーケンスホモロジーをＯＰＩタンパク質の活動領域（例えば０Ｐ７）と共有し、又少なくとも成熟型とは２０％のホモロジーを有する。ホモロジーを健全な成長形式（例えば０Ｐ１−１８．５８％アミノ酸ホモロジー）と共有する。

ここに開示する骨形成タンパク質のアミノ酸シーケンスは、コンセンサス・プローブをモデル化した調節タンパク質の変異体とも有意なホモロジーを共有する。

特に、これ等タンパク質は、骨形成タンパク質の活性領域から成るそれ等のＣ末端シーケンスに於いて有意義にホモロジーの共有をする。

（例えば、ＯＰＩをショウジヨウバエのＤＰＰとＸｅｎ０ＰｕｓのＶｇｌと比較。例えば、米国特許第５．０１１，６９１号参照。）更に、これらのタンパク質は共通して、この領域に６又は７の保存システィン骨格構造をもつ（例えば、これ等Ｃ末端のシスティン残基の直列配置は異なるタンパク質中に保存され　・ている。）例えば、そのシーケンスが７システイン骨格構造をもつＯＦ２又はそのシーケンスが６システイン骨格構造をもつＯＰＳ参照、ＯＰ２タンパク質も、この領域に付加システィン残基を一つ含む。

このように、一つの好ましい俸禄として、本発明は、対立因子とその変種及び生化学合成突然変異を含む、シーケンスＩＤ第３番または第５番によって記述されたアミノ酸シーケンスから成るポリペプチド鎖から成る骨形成タンパク質にあり、このポリペプチド鎖から成る二量体タンパク質は、適切なマトリックスと連携して哺乳動物に埋め込まれたとき、軟骨内骨形成を誘発できる配座を有するものである。有用なタンパク質は全長タンパク質、成熟タンパク質及びＣ末端によって記述される機能範囲から成る切頭タンパク質を含む。

更に、本発明はこれ等特定の構造体に限らない、即ち、これ等のポリペプチド連鎖のいずれかから成る本発明の骨形成タンパク質は、種々のグリコジル化パターン、種りのＮ末端を有する形態、自然発生可能な又は生化学的合成でできるアミノ酸シーケンスの領域を有する一連の関連タンパク質、原核細胞又は真核細胞のホストセル内で組み替えＤＮＡの発現によってつくられる活性な切頭または突然変異型原アミノ酸シーケンスを有する形態でも良い。本発明の骨形成タンパク質として有用な活性シーケンスは、マトリックスと連携して哺乳動物に埋め込まれたとき、軟骨内骨形成を誘発でき、０ＰＳのアミノ酸シーケンスと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％のシーケンス・ホモロジーを有するタンパク質を含むものとする。これは、あるタンパク質のより長い形態と共に、対立因子変種及び保存Ｃ−ターミナル・システィン骨格構造を変更することのあるものであってこの変更が尚、タンパク質をして、マトリックスと連携して哺乳動物に埋め込まれたとき、該哺乳動物内に骨形成を誘発できる配座を有する二量体種を形成せしめるような追加及び削除の突然変異体を含む。

新規なポリペプチド鎖及びそれらを構成する骨形成タンパク質は、原核細胞又は真核細胞のホストセル内で未変の又は切頭ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｓあるいは合成りＮＡから発現され、しかる後精製ミ切断、リフォールディング、二量体化して実験動物に移植し得るものである。現在の所より好ましいホストセルはＥ、ｃｏｌｉ又はＣＨＯ１ＣＯ３又はＢＳＣ細胞のような哺乳動物細胞を含む０本発明の骨形成タンパク質は、種々のグリコジル化パターン、種々のＮ末端、アミノ酸シーケンス・ホモロジーの領域を有する関連するタンパク質ファミリー、及びホストセル内の姐換えＤＮＡによってつくられる天然又は生合成タンパク質の活性な切頭又は突然変異形を含んでも良い。

かくして、この開示により、熟練した遺伝子工学者は、適切なアミノ酸シーケンスをコードする様々の異なる種のｃＤＮＡ又はゲノム・ライブラリーから遺伝子を分離でき、若しくはオリゴヌクレチオドからＤＮＡを構築でき、そして原核細胞及び真核細胞を含む種々の形態のホストセル内でそれ等を発現し、ヒトを含む哺乳動物内で骨形成を誘発できる活性タンパク質を大量に調製できる。この開示により、当該技術分野の習熟者は、標準の免疫学を用いて、ここに開示された骨形成タンパク質とその断片に特異的に結合し得る抗体を創ることができよう。

骨形成タンパク質は、適切な受け渡し又は支持システム（マトリックス）とともにして臨床応用に有用である。マトリックスは多孔性材料の粒子から成る。孔は原種細胞移動とそれに引き続く分化と拡散を許容する寸法でなければならない０粒子の大きさは、ＴＯ−８５０ｖ＋＋、より好ましくは１５０−４２０ｍｍの範囲内であるべきである。粒状材料を骨欠損にまたがる形状に密接に詰め込み、或いは材料を適宜生体適合性（非炎症性）に構成し、「臨時的骨格」と移動原種細胞の補充のための基盤として作用し、引き続（それ等の固定と拡散のための土台として作用するため、生体内分解可能に構成する。現在の所より好ましい担体は、粒子状の、脱塩化、グアニヂン抽出、種特異的（同種性）骨、及び特別に処理された粒子状、タンパク質抽出、脱塩化異種発生骨を含む、任意には、かかる異種発生粉状マトリックスは又、粒子間侵入の体積と表面積を増大するため、トリプシン及び／又は原繊維変性剤のようなプロテアーゼで処理しても良い、有用な層剤はジクロロメタン、トリクロロ酢酸、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸やふう化水素のような酸を含む、或いは、マトリックスは加熱酸性水溶液を含む、温度範囲を約３７℃から７５℃とした加熱水溶液で処理しても良い、他の利用可能なマトリックス材料は、コラーゲン、モノポリマー、グリコール酸と乳酸のコーポリマー、ヒドロオキシアパタイト、燐酸トリカルシウム及び他の燐酸カルシウムから成る。

ここで可能になり、開示された骨形成タンパク質及び埋め込み可能な骨形成装置により、医師は例えば先天性及び後天性の頭顔及び他の骨格又は歯の異常（Ｇｌｏｗａｃｋｉ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８１）Ｌａｎｃｅｔ　１：９５９−９６３）の修正をすることができる。装置は、動物実験で示された癒着不良の破砕や、骨形成を要する歯科及び歯周応用を含む他の臨床応用に使用できる。他の潜在的臨床応用は、例えば、骨関節炎の治療に於ける軟骨修復にある。

皿血坐呈単星脱皿本発明の以上に述べた目的とその他目的、そして種々の特徴は、本発明自体と同様、添付する図面とともに読まれるとき、以下の説明から、より充分に理解されよう。図面に於いて、図１は、成長ｍ０Ｐ−２及びｈＯＰ−２ポリペプチド鎖：ｂＯＰ２−Ａ及びｍ０Ｐ−Ａのアミノ酸シーケンスを比較している。

図２は、成長ＯＰＩ及びＯＰ２ポリペプチドＩＮ　：　ＯＰ　１−１８、ｍ０Ｐ１−３．ｂＯＰ２−Ａ及びｍ０Ｐ２　Ａのアミノ酸シーケンスを比較している。

返−里先ず、哺乳動物からの未処理タンパク質抽出物中に存在する骨形成タンパク質の分離を可能にする精製プロトコルを開発した。（１９８９年１０月１９日刊行のＰＣＴ　Ｎｏ　８９１０９７８７及び１９８８年４月８日出願の米国出願第１７９．４０６号参照）。処置の展開は、新鮮な子牛の骨が入手可能であったことと相俟って、実質的に純粋な牛骨形成タンパク質（ｂＯＰ）の単離を可能にした。

ｂＯＰは明確に特徴づけられた。それが猫、兎及びラットに於いて軟骨を誘発し、ついに軟骨内の骨成長をし得ることが示され、検討された。異種の骨抽出中の、以前には未知のタンパク質に帰せられていた骨形成の完全な展開カスケードを誘発し得ることが示された。この適用量依存且つ高度に特定な活動は、タンパク質がグリコジル化しているいないに関わらず存在した（Ｓａｍｐａｔｈ　ｅｔ　ａｌ、＋　（１９９０）Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ。

２６５：　１３１９Ｂ−１３２０５）。牛由来の物から得られたシーケンスデータは、ヒトの遺伝子を分離するのに用いられるプローブ設計を示唆した。ＯＰヒト同等物タンパク質は今、発現され、広範に特徴づけられている。

これ等の発見は、個々にホモ二量体として、又ヘテロニ量体として他の種を結合して、真の軟骨内骨創製を可能にする全く新規且つ非天然タンパク質構成物をコードするＤＮＡの作成を可能にした（１９８９年１０月１９日刊行のＰＣＴ−００９７８８及び全米国特許第５，０１１，６９１号となっている１９８９年２月２３日出願の米国出願第３１５．３４２号参照）。それ等は又、天然源から回収されたｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡからの、そしてここに開示された技術及び自動化した市場で入手可能な装置を用いて作成された合成りＮＡからの天然型、切頭型、ミューティン、アナログ、融合タンパク質及び様々な他の変種と構成物の発現を許容した。ＤＮＡは、充分に確立されている分子生物学と組換えＤＮＡ技術を用い、原核細胞又は真核細胞をホストセルとして発現され、生物学的に活性なタンパク質を製造するため、必要に応じ、インビトロで酸化及びリフォールディングされても良い。

ヒトのゲノム及びｃＤＮＡライブラリーから分離したＤＮＡシーケンスは、ここでＯＰＩと言及するこれまで未特定だった遺伝子をエンコードする。分離されたＤＮＡによってコードされるタンパク質は初め、ＴＧＦ−βファミリー中のタンパク質をもつアミノ酸ホモロジーにより特定化された。コンセンサス接合信号はアミノ酸ホモロジーが終わり、エキソンーイントロン境界を表示するところに見いだされた。三個のエキソンが組み合わされ、七個のシスティンを含む機能的ＴＧＦ−β状領域を得た。（例えば、米国特許第５，０１１，６９１号又は０ｚｋａｙｎａｋ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、（１９９０）ＥＭＢｏ、　９：　２０８５ −２０９３参照）。

ｈＯＰ　１の全長ｃＤＮＡシーケンスとＮ末端シグナルペプチドシーケンスを含むエンコードされた”ｐｒｅｐｒｏ”型ｒｈＯＰ　１−ｐＰＪは、シーケンスＩＤ第１番（残基１−４３１）、に開示されている。哺乳動物細胞に発現されたｈＯＰ　１タンパク質の成熟型ｒＯＰ１−１８Ｊは、シーケンスＩＤ第１番のアミノ酸残基２９３−４３１によって記述される。ｈｏｐｉの全長型は、遺伝子の種々の切頭型及び融合遺伝子と同様、Ｅ。

匹且と無数の哺乳動物細胞に発現されている（例えば、１９９１年５月２日刊行のＰＣＴ出願り０９４１０５８０２参照）。

そして、全て適切なマトリックスとともに哺乳動物に埋め込まれたとき骨形成活性を有することが示されている。

以上のアミノ酸及びＤＮＡシーケンス情報が与えられると、ｈＯＰタンパク質（例えば、ＯＰＳ又は０Ｐ７）の少なくとも活性領域及びその種々のアナログ（対立因子及びその変種と遺伝子工学的に創られた突然変異体を含む変種を含む）と共に融合タンパク質、成長タンパク質の切頭型及び同様な構成体をエンコードする種々の核酸（ＲＮＡ及びＤＮＡ）が創られる。更に、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブがｈＯＰＩＤＮＡの断片から創られ、又はｈＯＰＩＤＮＡ又はアミノ酸シーケンスに基づき新たに設計される。これ等のプローブは次に、追加の骨形成タンパク質を特定するため、異なるゲノム及びｃＤＮＡライブラリーをふるい分けるのに用いられる。

ＤＮＡは当該技術分野の熟練者によって、ゲノム及びｃＤＮＡ分離、合成されたオリゴヌクレオチドからの合成りＮＡの構築及びカセット変異発生技術を含む良く知られたＤＮＡ操作技術を用いて創られる。１５−Ｌｏｏｓｅｒオリゴヌクレオチドは旧ｏｓｅａｒｃｈ　ＤＮＡ　Ｍｏｄｅｌ　８６００５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒによって合成され、Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡバッファー中でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により純化される。ＤＮＡは次に、ゲルから電気溶出される。重畳するオリゴマーはＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼにより加燐酸作用を受け、ＰＡＧＥにより精製できるより大きなブロックにライゲーションされる。

ハイブリダイゼーションプローブとして用いられるＤＮＡはラベルを付けても良く（例えば、ラヂオアイソトープで、ニックトランスレーションによって）当該技術分野で良く知られている技術に従って、プローブがハイブリダイズするＤＮＡを含む与えられたライブラリー中のクローンを特定するのに用いられる。ライブラリーは市場で得ても良く、或いは従来の分子生物学技術を用い新たに創っても良い。ＤＮＡライブラリー構成に係る更なる情報及び交配技術は当該技術分野の熟練者に良く知られている多くのテキストに見いだされる０例えば、Ｆ、　Ｍ、八ｕｓｕｂｅ１．＋　ｅｄ、＋　Ｃｕｒｒｅｎｔｎ　Ｐｒｏｒｏｃｏｌｓ頂し１■且りはよっ影」士、１式１１．１　（１９８９）参照。特に、ユニット５＋　”Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”及びユニット６”Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、”適切に特定したクローンは次に分離でき、サブ・クローン化でき、（好ましくは、発現ベクトルに）そしてシーケンスすることができる。目的のシーケンスを含むプラスミドは次に、タンパク質の発現と更なる特性化のため、適切なホストセルにトランスフェクトすることができる。非グリコジル化タンパク質であってもタンパク質の骨形成活動に支障は無いから、ホストは原核細胞でも真核細胞でも良い。有用なホストセルハ、Ｌ芯匪け、ハ匹框■１匹競、昆虫／バキュロウィルス細胞系、骨髄腫細胞及び種々の哺乳動物の細胞を含む。ベクターは更に、遺伝子組換えタンパク質の正確な発現を促進するため種々のシーケンスをエンコードできる。シーケンスは、転写プロモーター及びシーケンス、エンハンサ−シーケンス、優先レボシーム結合サイトシーケンス、ｍＲＮＡリーダーシーケンス、タンパク質分泌のための好ましいシグナルシーケンス等を含む。目的の遺伝子をエンコードするＤＮＡシーケンスは又、潜在的阻害配列を除去若しくは不必要な二次的構造形成を最小化するため操作できる。

遺伝子組換え骨形成タンパク質は又、融合タンパク質として発現されても良い。

翻訳後、タンパク質は細胞自体から純化しても良く、又培養物から回収しても良い。全ての生物学的に活性なタンパク質形式は、ＳＳ結合によって結合、或いは個々のサブ・ユニットの発現後、適切な真核細胞または生体内の種々の組換えポリペプチド鎖の一以上の酸化又はリフォールディングによって連携、創生された二量体種からなる。Ｅ、ｃｏｌｔ中で遺伝子組換えＤＮＡから発現された骨形成タンパク質の詳細な説明は、ここで言及により挿入する１９９１年２月２７日出願の米国出願第６６０．１６２号に開示されている。多（の異なる哺乳動物細胞内で遺伝子組換えＤＮＡから発現された骨形成タンパク質の詳細な説明は、ここでまた言及により挿入するＰＣＴ　ＷＯ９１１０５８０２に開示されている。

最後に、本文中になされた開示に鑑み、そしてこの技術分野で公知な標準的方法を用いることによって、本技術分野の熟練者は、ここに開示されたポリペプチド鎖の全て又は一部に対するポリクロナール及びモノクロナール抗体を得ることができる。該抗体はポリペプチド鎖上のエピトープ特異的に結合できる。有用なプロトコルは、例えば、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｉｎ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、　ｅｄｓ、、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　２ｎｄ　ｅｄ、　１９８９）　、　Ｂｏｏｋ３＋　５ｅｃｔｉｏｎ　１８参照。

■−丞骨形成タンパク質をエンコードする追加ＤＮＡシーケンスを同定するため、成長０Ｐ−１のＤＮＡのＣ末端に特異的なハイブリダイゼーションプローブを、当該技術分野で記述されているとおり、０Ｐ−１の５ｔｕｌ−ＥｃｏＲ１ダイジェスト断片（シーケンスＩＤ第１番中のベースペア１０３４−１３５４）を用いて作成し、当該分野で記述されているとおり、ニックトランスレーションにより３１ｐのラベルを付した。上述したように、０Ｐ−Ｉ　Ｃ末端は、キー機能領域、例えば、骨形成活性のための「活性領域」をエンコードする。Ｃ末端は又、そのアミノ酸シーケンスがアミノ酸シーケンスホモロジーを調整タンパク質ＴＧＦ−β スーパーファミリー中の特定タンパク質と共有し、その蛋白質は保存システィン骨格構造を含んでいる。

１７．５日齢ｐ、ｃ、マウス胚由来の５゛ストレツチｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｔｌＯ）ライブラリー（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ、　Ｉｎｃ、＋　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ）をプライムしたオリゴｄＴファージ７　ｘ　１０’をラベル化プローブで選別した。これは、次の厳密なハイブリダイゼーション条件を用いて行った：４０％フォルマリン、５　ｘ　５ＳＰＥ、　５χＤｅｎｈａｒｔ溶液、０．１％ＳＯＳ、３７℃　１晩、次いで０．１％５ＳＰＥ洗浄５０℃で０．１％ＳＯＳ　。

スクリーニングを３度行って、５個の遺伝子組換えファージを純化した。ファージＤＮＡは、５個のファージ全てから作られ、ＥｃｏＲ１ダイジェストし、ジングルストランドシーケンシングができるようにモディファイされた通常のｐＵＣタイププラスミドのＥｃｏＲ１サイトにサブ・クローニングし、そして当該技術分野で良く知られた手段を用いてシーケンスした。

この処置によって、二つの異なるＤＮＡが同定された。ここでｍ０Ｐ１とする第一のＤＮＡは成熟形０ＰＩ（約９８％）に対する実質的ホモロジーを有し、１９９０年１０月１８日出願の係属中の米国出願第６００．０２４号に詳述されている。この処置で同定された第二のＤＮＡは、関連遺伝子のＣ末端をエンコードしており、ここではｍ０Ｐ２とする。遺伝子符号化ｍ０Ｐ２のＮ末端は、引き続き行われた第二のマウスｃＤＮＡライブラリー（マウス　ＰＣＣ４ｃＤＮＡ　（ＺＡＰ）ライブラリー、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｉｎｃ、、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）のスクリーニングによって同定された。

マウスＯＰ２　（ｍＯＰ２）タンパク質は、明らかにアミノ酸シーケンス・ホモロジーを約７４％のｈＯＰ　１活性領域（例えば、ＯＰＳ又は０Ｐ７）アミノ酸シーケンスと共有し、少くともホモロジーを約５８％の完全な成熟形（例えば、０Ｐ１−１０）と共有している。フルレングスｍ０Ｐ−２タンパク質について、ｃＤＮＡシーケンスとコードされたアミノ酸シーケンスは、シーケンスＩＤ第３番に描写されている。タンパク質のフルレングスタイプはｍ０Ｐ−２１ｍ０Ｐ２ −ＰＰ）のプレプロ型として示されており、そのＮ末端にシグナルのペプチドシーケンスを含む、アミノ酸シーケンスＬｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−＾１ａ −Ｌｅｕ（シーケンスＩＤ第３番のアミノ酸残基１３−１８）は、シグナルペプチドシーケンスの除去のための切断位置を構成し、発現する細胞から分泌されるべき中間形式のタンパク質、ｒＰｒ　ＯＪ形を残すものと思われる。アミノ酸シーケンス＾ｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ　（シーケンスＩＤ第３番のアミノ酸残基２５５−２５９）は、ここでｒｍＯＰ２−ＡＪと言い、シーケンスＩＤ第３番の残基２５９−３９７によって記述される成熟形タンパク質を生成する位置を構成するものと思われる。シーケンスＩＤ第３番の残基３０１−３９７は、保存された６個のシスティン骨格構造を決める領域に対応する。シーケンスＩＤ第３番の残基２９６−３９７は、保存された７個のシスティン骨格構造を決める領域に対応する。

ｍ０Ｐ２のプロ領域から作られたプローブ（ＥｃｏＲＬダイジェスト断片、シーケンスＩＤ第３番ｂｐ４６フー７７１）を用い、マウス・ライブラリー・スクリーンに対するのと本質的に同一の処理に従い、ヒト海馬ライブラリーをふるむ）わけた（ヒト海馬ｃＤＮＡ　ｌ　ａｍｂｄａ　（ＺＡＰライブラリー　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ＋　Ｉｎｃ、、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）　、この処理によって、ｍ０Ｐ２の系列ホモロジーをもつアミノ酸シーケンスをエンコードする新規なりＮＡのＮ末端が同定された。遺伝子のＣ末端は次に、ヒト・ゲノム・ライブラリー（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ、　１ｎＣ１＋　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ＋　Ｃ＾のｌａｍｂｄａファージＥＭＢＬ−３）を前記の新規なヒトＤＮＡでプローブして同定した。このＤＮＡにより符号化した新規なポリペプチド鎖は、ここでｈＯＰ２タン）＜り質とし、殆ど完全なアミノ酸同定（約９３χのアミノ酸シーケンスホモロジー）をｍ０Ｐ２−Ａと共有する（図１及び以下参照）。

プレプロ形式のｈＯＰ２、ｒｈＯＰ２−ＰＩＩＩＪのｃＤＮＡシーケンス、符号化されたアミノ酸シーケンスは、シーケンスＩＤ第５番中に記述されている。このフルレングス形タンパク質は又、そのＮ末端にシグナルペプチドシーケンスを含む。アミノ酸シーケンスＬｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−＾１ａ−Ｌｅｕ　（シーケンスＩＤ第５番のアミノ酸残１１３−１８）は、シグナルペプチドシーケンススの除去のための切断位置を構成し、発現する細胞から分泌される中間形式のタンパク質、プロ形式を残すものと思われる。アミノ酸シーケンスＡｒｇ− Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ（シーケンスＩＤ第５番のアミノ酸残基２５７ −２６１）４よ、ここでｈＯＰ２−Ａ”と言い、シーケンスＩＤ第５番の残基２６１−３９９によって記述される成熟形のタンパク質と考えられるものを生成する切断位置を構成するものと思われる。

活動的と思われる他のｈＯＰ２成熟種は切頭形シーケンス、ｒｈＯＰ２−ＰＪ　（シーケンスＩＤ第５番の残基２６４−３９９によって記述される）及びｒｈＯＰ２−ＲＪ　（シーケンスＩＤ第５番の残基２６７−３９９によって記述される）、そして僅かに長いシーケンスｒｈＯＰ２−３Ｊ　（シーケンスＩＤ第５番の残基２４０−３９９によって記述される）を含む。シーケンスＩＤ第５番の残基３０３−３９９は保存された６個のシスティン骨格構造を決める領域に対応する。シーケンスＩＤ第５番の残基２９７−３９９は保存された７個のシスティン骨格構造を決める領域に対応する。

注目すべきことは、ｍ０Ｐ２とｈＯＰ２の両方のプレプロ形式のＮ末端をエンコードする核酸配列はグアニジンとシトシンの塩基対が豊富なことである。当該技術分野の熟練者により理解されるように、かかるｒＧ−Ｃリッチ」領域をシーケンスすることには、活動の進行を休ませがちにする及び／又は停滞の理由で問題がある。従って、この領域内では、シーケンシングに誤差が生じる可能性は排除できない、しかしながら、これ等及び他の同様に同定されるタンパク質に対する決定的アミノ酸シーケンスは、例えば、ここに開示される手段のいずれかを用いることにより遺伝子操作ＤＮＡからタンパク質を発現せしめ、当該技術分野で良く知られた従来のペプチドシーケンスの諸方法によりポリペプチド鎖の配列を容易に決定できる。

図１は、成熟ｍ０Ｐ２とｈＯＰのアミノ酸シーケンスを比較する。一致はｍ０Ｐ２シーケンス中の三つの点（、、、）によって示されている。図から明かなように、これ等二つのタンパク質の成熟型間のアミノ酸シーケンスホモロジーは、かなりなものである（成熟シーケンス間の９２％のホモロジー、Ｃ−ターミナル活性領域内では約９５％のホモロジー（例えば、図１の残基３８−１３９又は４２ −１３９）。

図２は、ＯＰＩとＯＰ２タンパク質の４種全ての成長形式のアミノ酸シーケンスを比較する。ここでも又、一致は三つの点（、、、）によって示されている。ｍ０Ｐ２タンノ々り質と同じように、ｈＯＰ２タンパク質は有意のホモロジー（約７４％）をＯＰＩ活性領域を決めるアミノ酸シーケンスと共有しくＯＰＳ又はＯＦ２、図２中それぞれ残基４３−１３９及び３Ｂ−１３９）、０ＰＩ−１８とはホモロジーは少なし）（約５８％ホモロジー）、、両ＯＰ２タンパク質はＯＰＩタンノ（り質に見られる保存された７個のシスティン骨格構造を共有する。

更に、ＯＰ２タンパク質は、この領域内の８個のシスティン残基から成る（図２の位置７８参照）。

マトリックスと連携して哺乳動物にに埋め込まれたとき、軟骨内骨または軟骨形成を誘発できる二量体骨形成タンノでり質のサブ・ユニットとして有用であり、同定されたＯＰＩ及びＯＰ２タンパク質間の最大ホモロジーを取り込んだより好ましい包括的なアミノ酸シーケンスは、ここでｒＯＰＸＪとするシーケンスによって記述され、以下及びシーケンス第７番に示されている。

Ｃｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｘａａ　ＰｈｅＸａａ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｘａａ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｘａａ　ＩｌｅＡｌａ　Ｐｒｏ　Ｘａａ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｘａａ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　ＣｙｓＧｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｘａａ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｘａａ　ＳｅｒＸａａ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　ｌｉｅ　ＸａａＧｉｎ　Ｘａａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｐｒｏ　ＸａａＸａａ　Ｖａｔ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｘａａ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　ＴｈｒＸａａ　Ｌｅｕ　Ｘａａ　Ａｌａ　Ｘａａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　ＸａａＡｓｐ　Ｘａａ　Ｓｅｒ　Ｘａａ＾ｓｎ　Ｖａｌ　Ｘａａ　Ｌｅａ　Ｘａａ　ＬｙｓＸａａ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｘａａ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙそしもここで、Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、　２　＝　（Ｌｙｓ　ｏｒ　Ａｒｇ）；　Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ。

３　＝　（Ｌｙｓ　ｏｒ　Ａｒｇ）；　Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、　９　＝　（Ｓｅｒ　ｏｒ　Ａｒｇ）；　Ｘａａ　ａｔｒｅｓ、　１１　＝　（＾ｒｇ　ｏｒ　Ｇｉｎ）；　Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、　１６　＝　（Ｇｉｎ　ｏｒ　Ｌｅｕ）；Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、　１９　＝　（Ｉｌｅ　ｏｒ　Ｖａｌ）；　Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、　２３　＊　（ＧｌｕＯｒ　Ｇｉｎ）；　Ｘａａ　ａｒ　ｒｅｓ、　２６　＝　（Ａｌａ　ｏｒ　５ｅｒ）；　Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、３５＝　（Ａｌａ　ｏｒ　５ｅｒ）；　Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、３９　＝　（Ａｓｎ　ｏｒ　Ａｓｐ）；　Ｘａａ　ａｔｒｅｓ、４１　＝　（Ｔｙｒ　ｏｒ　Ｃｙｓ）；　Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、５０　＝　（Ｖａｌ　ｏｒ　Ｌｅｕ）；Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、５２　＝　（Ｓｅｔ　ｏｒ　Ｔｈｒ）；　Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、５６　＝　（Ｐｈｅｏｒ　Ｌｅｕ）；　Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、５７　＝　（Ｉｌｅ　ｏｒ　Ｍｅｔ）；　Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、５Ｂ＝　（Ａｓｎ　ｏｒ　Ｌｙｓ）；　Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、６０　＝　（Ｇｌｕ、Ａｓｐ　ｏｒ　Ａｓｎ）；Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、６１　＝　（Ｔｈｒ、Ａｌａ　ｏｒ　Ｖａｌ）；　Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、６５　＝（Ｐｒｏ　ｏｒ　Ａｌａ）；　Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、７１　＝　（Ｇｌｎ　ｏｒ　Ｌｙｓ）；　Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ。

７３＝　（＾ｓｎ　ｏｒ　５ｅｒ）；　Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、　７５　＝　（ｌｉｅ　ｏｒ　Ｔｈｒ）；　Ｘａａａｔ　ｒｅｓ、８０　＝　（Ｐｈｅ　ｏｒ　Ｔｙｒ）：　Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、８２　＝　（Ａｓｐ　ｏｒ　５ｅｒ）；Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、８４　＝　（Ｓｅｒ　ｏｒ　Ａｓｎ）　；　Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、８７　＝　（ｌｉｅｏｒ　Ａｓｐ）；　Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、８９　＝　（Ｌｙｓ　ｏｒ　Ａｒｇ）：　Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、９１＝　（Ｔｙｒ、　Ａｌａ　ｏｒ　Ｈｉｓ）；　そして　Ｘａａ　ａｔ　ｒｅｓ、　９７　＝　（Ａｒｇｏｒ　Ｌｙｓ）である。

種々のＯＰＩ及びＯＰ２タンパク質問に示される高度のホモロジーは、ここに同定される一新規な骨形成タンパク質が本質的にはＯＰＩと同様、或いはＯＰＩにたいし開示されたプロトコルの僅かな修正で純化できることを示唆している。同様に、精製ｍ０Ｐ１、ｍ０Ｐ２及びｈＯＰ２タンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドの電気泳動ゲルに関する分子量基準との比較により測ると、還元された単一のサブ・ユニットとして約１８ｋＤａの見かけ上の分子量を、又酸化された二量体として約３６ｋＤａの見かけ上の分子量をもつことが予示される。

未グリコジル化二量体（例えば、Ｅ、ｃｏｌｉでの組換え発現によって生成されたタンパク質）は、約２７ｋＤａの見かけ上の分子量をもつことが推定される。

成熟型のｍ０Ｐ２とｈＯＰ２タンパク質には、一つの潜在的Ｎグリコジル化位置があるようである。

８個のシスティン残基から成る活性領域をもつ骨形成タンパク質が特定されると、以下の鋳型アミノ酸シーケンスいずれかに基づいて骨形成ポリペプチド鎖を構築したり、このシーケンスをもつその他の骨形成タンパク質を特定できる。考えられる鋳型シーケンスは、保存された６個のシスティン骨格構造とＯＰ２タンパク質中に特定される追加システィン残基から成るｒＯＰＸ−７Ｃ］及び保存された７個のシスティン骨格構造とＯＰ２タンパク質中に特定される追加システィン残基から成るｒＯＰＸ−８Ｃ，である。ｒＯＰＸ−７Ｃ。

及びｒＯＰＸ−８ＣＪシーケンスは以下及びシーケンスＩＤ第８．９番に記述されている。これ等の鋳型シーケンス中の各χａａは２０個の天然型り型、αアミノ酸又はその誘導体の一つを表す。この鋳型に基づく生合成構造体は、当該分野で良く知られた従来のＤＮＡ合成又はペプチド合成技術を用いて容易に作られる。これ等のポリペプチド鎖から成る骨形成タンパク質は、一旦構築されると、ここに開示されるように試験することができる。

ｒＯＰＸ−７Ｃ，（シーケンスＩＤ第８番）：Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ１５１゜Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＸａａＸａａ　Ｘａａ　Ｃｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｃｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＸａａＸａａ　Ｘａａ　Ｃｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＸａａＸａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＸａａＸａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＸａａＸａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＸａａＸａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＸａａＸａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｃｙｓ　Ｘａａ　Ｃｙｓ　Ｘａａｒｏｐｘ−８ＣＪ　（保存されたシスティン残基を含む、Ｎ末端に更に５個の残基から成るシーケンスＩＤ第９番）：Ｃｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ５１ＯＸａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＸａａＸａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｃｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＸａａＣｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｃｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＸａａＸａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＸａａＸａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＣｙｓＣｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＸａａＸａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＸａａＸａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＣｙｓＸａａ　Ｃｙｓ　Ｘａａマトリックスの調製Ａ、マトリックス特性の一般的考察現在の所より好ましい担体材料は、ここに開示されるように処理された移植性骨誘導の粒状材料である。この担体は、生体内分解可能−合成または合成−無機母体（例えば、ヒドロオキシルアパタイト（ＨＡＰ）　、コラーゲン、燐酸トリカルシウム又はポリ乳酸、ポリグリコール酸及びこれ等の種々なコーポリマー）で置き換えても良い。

研究によれば、表面電荷、粒子サイズ、鉱物の存在及びマトリックスと骨形成タンパク質を結合する方法等は全て、骨誘導を上手（達成するための役割を果たす。化学的変異による電荷の摂動は、誘導反応を撤廃する０粒子サイズは、新しい骨の定量的応答に影響を与える。７５μ蒙から４２０μｍの粒子は最大の応答を引き出す。マトリックスの骨ミネラルによる汚染は、骨の形成を阻害する。極めて重要なこととして、ＯＰを母体に作り出すのに用いられる処理は、骨形成タンパク質とマトリックス両者の物理的及び化学的状態に極めて敏感に作用する。

骨マトリックス／骨形成タンパク質移植物の界面に於ける順次の細胞反応は複雑である。多段階カスケードは、フィブリンとフィブロネクチンの埋め込まれたマトリ・ノクスへの結合、細胞の化学的刺激によって起こる移動運動、フイプロフ゛ラストの増殖、コンドロブラストへの分化、軟骨形成、管侵入、骨形成、改造及び骨髄の分化を含む。

骨形成タンパク質に適応した担体は、いくつかの重要な機能を果たさねばならない。それは、骨形成タンノマク質を結合し、緩慢な放出送り出しシステムとして作用し、骨の発達中細胞応答の各段階を場節し、そして骨形成タン／（り質を非特異的なタンパク質加水分解から保護しなければならな０゜更に、選ばれた材料は生体適合性であって、好ましくは生体内再分解でなければならない。担体は、新しし）骨によって完全に置き換えられるまで、％Ｚ時の骨格として作用しなけれｂｉならない。ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）及び種々の組み合わせは、生体内で分解速度を異にする。骨中、分解速度は、移植物が埋め込まれるのが皮層又番よ柱状骨かどうかによって変化する。

マトリックス形状、粒子サイズ、表面電荷の存在及び粒子内と粒子間の多孔度の程度は全て、適応したマトリ・ンクス遂行能力にたいして重要である。母体を新し０骨の望まれる形状に成形し、癒着不良の欠陥にまたがるように寸法化することが好ましい。ラットを使った研究によれば、新しく１骨Ｇよ本質的に、埋め込まれた装置の寸法をもって形成される。

マトリックスは、疎に接着した粒子材料、例え番ヨコラーゲンでできた形状保持固体で構成されても良い、それは又、型造された多孔性固体から成っても良く、或いは単に包囲する組織によって位置付けられた密語粒子の集合であっても良い。

砕いて練った筋肉や他の組織も又、用いられる。大きな同所骨移植体は、その骨髄腔を清浄化し、粒子と分散する骨形成タンパク質で埋めれば、母体の担体として作用できる。

移植性骨から作られ、ここに開示のとおり処理されたより好ましいマトリックス材料は、種々の臨床設定に於いて有用な移植材料を土製する。種々の整形、歯周及び改造処置に於ける骨形成のためのマトリックスとしての用途に加えて、マトリックスは又、持続する放出担体として或いはインブラントのコラーゲン被覆として用いられる。マトリックスは、手術に先駆けて望ましいように成形されても良く、又手術中に　−医師又は技術手によって成形されても良い、このように、材料は局所的、皮下、腹腔又は筋肉内移植物としζ用いられる。　−癒着不良の破砕にまたがるように又は骨欠陥を詰めるように成形できる。骨形成または誘導処置に於いて、材料は緩つくつと身体に吸収され、そして移植物の形状又はそれに極めて近い形状の骨によって置き換えられる。

種々の成長ファクター、ホルモン、酵素、治療組成物、抗生物質及び他の身体処理剤もまた担体材料の吸収されても良（、埋め込まれると、マトリックス材料が緩つくりと吸収されるにしたがって、時間をかけて放出されることになる。即ち、ＥＦＧ、　ＰＤＧＦ、　ｒＧＦ、　ＦＧＦ、　ＴＦＧ−α及びＴＧＦ−βのような種々の公知の成長ファクターが生体内で放出される。材料は化学療法剤、インシュリン、酵素又は酵素抑制遺伝子を放出するのに用いることができる。

Ｂ、骨誘導マトリックス１、脱塩化骨の調製脱塩化骨マトリックス、好ましくはウシ骨マドＩＪ　、ンクス番よ公知の処理方法でつくられる（Ｓａｍｐａｔｈ　ａｎｄ　Ｒｅｄｄｉ　（１９８３）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０：　６５９１−６５９５）。ウシの長骨幹骨（エイジ：　Ｌ−１０日）を地域の屠殺場から得、そのまま用いる。骨は、筋肉と脂肪を除去し、骨膜を取り、骨髄を加圧冷水で取り去り、冷たい無水エタノールに浸し、−２０°Ｃで貯蔵する。骨は次に、乾燥し、粉砕により破断し、そして大型のミルで粉末化する。液体窒素を用い加熱を防く′ようにン主意を払う。粉末化した骨は、７０−８５０μｍ、好ましく番よ１５０−４２０μｍの範囲の粒子サイズに製粉し、３量のクロロホルムとメタノール（３：１）で約２時間の洗浄を２回行って脱月旨する。

粒子状の骨は次に、１量の無水アルコール水エーテルで乾燥し、脱脂骨粉を生ずる。脱月旨骨粉番よ次に、４　”Ｃで４０分間、ＩＯ量の０．５　Ｎ　ＨＣＩを使った弓１き続く４回の処理によって脱塩化する。最後に、大量の水を用し）、脱塩化骨粉に中性化洗浄を施す。

２、グアニジン抽出このような処理を行った脱塩化骨マトリ・ノクスを、４°Ｃで１６時間ｐＨ７．０の５０ｍＭのトリス−塩酸に熔解した４Ｍグアニジン−塩酸５容量で抽出した。！Ｉ！′／＠液を濾過した。不溶物を集め、マトリックスの調製に使用した。

材料は殆どが天然のコラーゲン性の物質であり、骨形成活性または軟骨形成活性を有していない。

３、マトリックスの処理全ての骨マトリックスの主要成分は、タイプ−Ｉ型コラーゲンである。コラーゲンに加えて、上に示したように抽出した脱塩化骨は、その容積あたり５％の非コラーゲン性蛋白質を含んでいる。異種移植性マトリックスでは、これらの非コラーゲン性成分は強い抗原となる可能性があり、免疫原及び／または拒絶成分となる可能性がある。これらの成分も、骨の分化の展開的カスケードに伴う干渉によって同種性の移植物の骨形成を阻害する可能性がある。コラーゲン繊維変質剤によるマトリッス粒子の処理は、マトリックスから望ましくない成分を潜在的に除去し、マトリックス材料の表面構造を変質させることを見出した。有用性のある薬剤としては、酸、有機溶媒、加熱水溶性溶媒を含む。種々の処理を以下に述べる。これらの繊維改質剤の作用の詳細な物理的分析は脱塩作用に基づいており、グアニジン抽出管コラーゲン性子は１９９０年９月７日公開のＰＣＴ　Ｗｏ　９０／１００１８に開示されている。

繊維改質剤と接触後、処理されたマトリックスを、以下に述べる一形式の処理によって、何れの抽出成分をも除去するため洗浄する。

１、Ｔ　Ｂ　Ｓ　（Ｔｒｉｓｌｌ衝含塩物）　Ｉｇ／２００中で懸濁し、４°Ｃで２時間かき混ぜる；若しくは６Ｍ尿素、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、５００　ｍＭ　ＮａＣＩ、ｐＨ７．０（ＬＩＴＢＳ）または水中で懸濁し、室温（ＲＴ）で３０分間（ｐＨを中和するに十分な時間）かき混ぜる；２、　遠心分離し、洗浄ステップを繰り返す１そして３、　遠心分離し、浮遊物を放棄し、残しを水洗しそして凍結乾燥する。

３．１　鼠処理１、トリフルオロ酢酸トリフルオロ酢酸は、強い非酸化性酸で、タンパク質にたいする公知の膨潤剤であって、コラーゲンの原繊維を改変する。

上述のようにして作られたウシ骨残渣（滓）を篩いにかけ、適切な粒子サイズの粒子を回収する。これ等の粒子を、０°Ｃ又は室温で、終始かき混ぜながら、■ −２時間、様々の比率（１，０％−１００％）のトリフルオロアセテート及び水（ｖ／ｖ）を用い抽出する。処理されたマトリックスは、濾過し、凍結乾燥し又は水／塩で洗浄してから凍結乾燥する。

２、ぶつ化水素トリフルオロ酢酸と同様、ぶつ化水素は、強酸で膨潤剤であり、また粒子内表面構造を変更できる。かくして、ＨＦは、グアニヂン抽出後、マトリックスと更に連携する何れの糖タンパク質の抗原性炭水化物成分をも除去することにより、これ等マトリックスの骨形成活性を増大するように機能する。

上述のようにして作られたウシ骨残渣（滓）を篩いにかけ、適切な粒子サイズの粒子を回収する。サンプルは、Ｐ　ｚ　Ｏｓ上で真空乾燥し、反応容器に移送し、−７０°Ｃでの蒸留による無水ぶつ化水素（母体の１０−２０　ｍｌ／ｇ）に晒す。容器は０℃まで加温し、反応混合物は同温度で１２０分間攪拌する。真空中でぶつ化水素の蒸発後、残渣（滓）は、どんな微量の酸をも除去するため、ＫＯＨのペレット上で充分に真空乾燥される。

脱グリコジル化の程度は、非共有結合的に結合する炭水化物を除去するためサンプルを適切に洗浄した後、ぶつ化水素による処理の前後のマトリックスサンプルの炭水化物分析から決定できる。ＨＦにより処理された材料からのＳＤＳ抽出タンパク質は、Ｃｏｎ　Ａブロッティングを行った場合と、炭水化物反応は陰性である。

脱グリコジル化骨マトリックスは次に、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝含塩物）又はＵＴＢＳ中で２回洗浄し、水洗浄後、凍結乾燥する。

他の酸処理も、ＨＦ及びＴＦＡと同様におこなえる。ＴＦＡはこれ等の処理で、その揮発性故に現在の所より好ましい酸性化反応物質である。しかしながら、酢酸や蟻酸のような、他の可能性きして腐食性がより少ない酸も用い得ることが理解される。

３．２１ｍ”理１、ジクロロメタンジクロロメタン（ＤＭＣ）はタンパク質を、その−次構造に影響せず、変性できる有機溶媒である。この膨潤剤は、自動化ペプチド合成で通例の反応物質であり、成分除去のため洗浄工程で用いられる。

上述のようにして作られたウシ骨残渣（滓）を篩いにかけ、適切な粒子サイスの粒子を１００％ＤＣＭ中で、又、より好ましくは９９．９％ＤＣＭ１０．１％ＴＦＡ中でインキュベーションする。マトリックスは、膨潤剤を用い、０″Ｃ又は室温にて１〜２時間培養する。或いは、マトリックスはインキュベーションせず、上記剤で短時間洗浄を３回（各２０分）行って処理する。

２、アセトニトリルアセトニトリルは（ＡＣＮ）はタンパク質を、その−次構造に影響せず、変性できる有機溶媒である。それは、高速液体クロマトグラフィーに用いられる通例の反応物質であり、疎水性相互作用に摂動を起こさせることによってシリカをベースとするカラムからタンパク質を溶出するのに用いられる。

上述のようにして作られた適切な粒子サイズのウシ骨残渣（滓）粒子を、１００％八ＣＮへ１．０ｇ／３０ｍ１）を用い、又、より好ましくは、９９．９％ＡＣＮ１０．１％ＴＦＡを用い、室温で１〜２時間、終始かき混ぜながら処理する。

処理したマトリックスは次に、水洗し又は尿素緩衝剤或いは４Ｍ　ＮａＣ１で洗浄した後、凍結乾燥する。或いは、ＡＣＮ又はＡＣＮ／ＴＦ＾処理マＴＦＡクスは洗浄せずに凍結乾燥しても良い。

３、イソプロパツールイソプロパノールもまた、タンパク質をその一次構造に影響せず変性できる有機溶媒である。それは、シリカＨＰＬＣカラムからタンパク質を溶出するのに用いられる通例の反応物質である。

上述のようにして作られた適切な粒子サイズのウシ骨残渣（滓）粒子を、１００％イソプロパツール（１，０ｇ／３０ｍ１）を用い、又、より好ましくは、０．１％ＴＦＡ存在下で１、室温で１〜２時間、終始かき混ぜながら処理する。母体は次に、凍結乾燥する前に、水洗若しくは尿素緩衝剤又は４　Ｍ　ＮａＣｌで洗浄する。

４、クロロフォルムクロロフォルムもまた、上述の反応物質と同様、単独又は酸性化して後、骨母体の表面積を増大するため、用いても良い。

上述の処理は、材料が埋め込まれる前、病原体の無いようにすることを確実にするために有効である。

３．３　熱処理現在の所最も好ましい月割は、水のような加熱された水溶性繊維改質剤で、マトリックス粒子の表面積と多孔度を増大する。現在のところ最も好ましい水溶性媒体は、ｐＨが４．５以下、例えばｐＨ２−ｐＨ４、の酸性水溶性媒体で、加熱前のコラーゲンの膨潤を助長する。ｐＨが約３の０．１％酢酸が、現在の所、より好ましい、　０．１Ｍ酢酸を用いても良い。

様々の量の脱脂、脱塩、グアニヂン抽出骨コラーゲンを、水ジャケットを有するガラス・フラスコ内の上記水溶性媒体（Ｉｇマトリックス／３０ｍ１水溶性媒体）の中で、終始がき混ぜながら加熱し、一定温度に一定時間維持する。好ましい処理時間は約１時間だが、０．５〜２時間の晒し時間は許容できるようである。

採用される温度は一般に約３７℃−７５℃の範囲内の温度で一定に保たれる。現在の所より好ましい熱処理温度は４５℃−６０°Ｃの範囲内にある。

熱処理後、マトリックスは濾過され、洗浄され、凍結乾燥の後、移植物として用いられる。酸性水溶性媒体を用いるとき、マトリックスはまた、好ましくは、洗浄と凍結乾燥前に中和される。現在の所好ましい中和緩衝剤はｐＨ７，０の２００＋ｍＭ燐酸ナトリウムである。マトリックスを中和するため、マトリックスは、好ましくは先ず、熱処理に続いて冷却され、酸性水溶性媒体（例えば、０．１％酢酸）は除かれ、中和緩衝剤で置き換えられ、これとマトリックスは３０分間かき混ぜられる。

次に、中和緩衝剤は除かれ、マトリックスは洗浄され、凍結乾燥される（以下参照）。

マトリックスはまた、金属イオンキレート剤に晒すこと等によって、汚染重金属を取り除くように処理されても良い。

例えば、０．１χ酢酸を用いた熱処理に引き続き、マトリックスは例えば２００ｍＭ燐酸ナトリウム、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，０のＥＤＴＡ（ナトリウム −エチレンデアミンチトラアセテート酸）を含む中和緩衝剤中で中和されても良い。５　ｍＭ　ＥＤＴＡは、約１００倍モル過剰のキレート剤をこれまで試験された最も汚染されたマトリックス中に存在する残留重金属に提供する。中和化に続く次の洗浄はＥＤＴＡの大半を取り除くようである。マトリックス粒子のＥＤＴＡ処理は試験された全ての金属（Ｓｂ。

Ａｓ＋　Ｂｅｌ　Ｃｄ、　Ｃｒ、　ＣＨＩ　Ｃｏ、　ｐｂ、　Ｈｇ＋　Ｎｉ、　Ｓｅ＋　Ａｇ＋　Ｚｎ、　ＴＩ）の残留重金属成分を約ｔ　ｐｐｍ以下に減少せしめる。ＥＤＴＡ処理マトリックスの生化学分析によれば、金属イオンキレート剤による処理は骨誘導活性を抑止しない。

コラーゲンマトリックス材料は好ましくは、非不溶性で、非接着性粒子から成る微細粉末の形式を取る。それは、新しい骨成長又は持続放出が望まれる容積内に単に詰め込むようにして用い、包囲する組織によって固定される。或いは、身体によって容易に吸収される、例えば、シェラチン又はポリ乳酸のカプセルに収納されても良い。粉末は、所定の体積に成形されて、例えば、可溶性の種−生体適合性のコラーゲンを用い、粒子間接着をすることによってその形状に維持されるようにしても良い。材料はまた、シート状、棒状、ビーズ状又は他の微小形状に製作されても良い。

ここに開示された実験の成るものに同種マトリックスとして用いられる脱塩化ラット骨マトリックスを、ここに開示されたとおり、鼠の大腿部及び頚骨の脱水骨幹の幾つかから製作し、４２０μ慴の篩いを通過するサイズの骨粒子を作成する。

骨粒子は、４ＭグアニヂンーＨＣｌで分離的抽出にさらす。かかる処理によって、骨母体の固有の軟骨内で骨分化を誘発する能力が完全に無くなる。残る非溶性材料が、マトリックスを製作するのにもちいられる。材料は殆どコラーゲンの性質を有し、埋め込み後、軟骨及び骨を誘発しない。新しい製作物の全ては、使用前、ミネラル成分及び骨形成活性につき試験される。骨マトリックスの生化学活性の全面的喪失は、活性な骨形成タンパク質両分又は純粋な骨形成タンパク質調製物が生化学的不活性非溶性コラーゲンマトリックスで再構成されるとき、回復する。

骨形成物の製作上述のような自然界に源を有し遺伝子操作で作られるタンパク質及び他の構造物は、以下に記載する方法の何れかを用いて適切なマトリックス製作物に組み合わされ、分散される。

一般に、５５０−１Ｏ０ｎの活性タンパク質は不活性担体マトリックス（例えば、ラットのバイオアッセイにだいし２５ｓ＋ｇ　）と組み合わされる。

より大きな移植物にだいし、より多量が用いられる。

１、エタノール沈澱母体を、グアニヂンーＨＣＩに溶解されている骨形成タンパク質に加える。サンプルは攪拌され、低温（例えば、４°Ｃ）でインキュベートされる。そして、サンプルは更に攪拌される。冷温の無水エタノール（５量）が混合物に添加され、後者は次に、かき混ぜられ、−２０°Ｃで、好ましくは３０分間培養される。遠心分離（マイクロフユージ、高速）の後、浮遊物はを除去する。再構成されたマトリックスは、水中で低温高濃度エタノールにより２回洗浄され、次に凍結乾燥される。

２、アセトニトリル・トリフルオロ酢酸の凍結乾燥この処理では、アセトニトリル・トリフルオロアセチック（ＡＣＮ／ＴＦＡ）溶液を担体材料に添加する。サンプルは何度も激しく攪拌され、そして凍結乾燥される。この方法は現在の所より好ましく、種々の濃度と異なる純粋度レベルに於いて骨形成タンパク質で試験された。

３、尿素凍結乾燥尿素緩衝側中で作られる骨形成タンパク質にたいし、タンパク質はマトリックス材料と混合され、何度も攪拌され、そして凍結乾燥される。凍結乾燥された材料は「そのまま」移植物として用いられる。

４、緩衝食塩水凍結乾燥生理食塩水中のＯＰＩ及びＯＰ２生成物はまた、マトリックスと攪拌され、そして凍結乾燥されて骨形成活性材料を生成する。

これ等の処理はまた、他の活性治療薬、ホルモン及び種々させるのに用いることができる。

バイオアッセイ本発明の種々のタンパク質と装置（デバイス）の機能は、インビボバイオアッセイで評価できる。ラットでの研究は適切な母体に於ける骨形成効果がマトリックス中に分散する骨形成タンパク質の適用量に依存することを示す。マトリックスだけが埋め込まれるときには、如何なる活性も観測されない。ラットモデルで行われたインビボバイオアッセイが示すところでは、文献に記載された形式の脱塩化、グアニヂン抽出自然発生的骨マトリックス材料は、上に開示したように処理されなければ、埋め込まれても、担体として有効でなく、骨を誘発せず、また炎症性応答と生体過敏反応を生ずる。ある種では（例えば、猿）、同種マトリックス材料はまた、担体として無効のようである。以下、上述のようにして作られたタンパク質とマトリックス材料から骨形成デバイスを製作するための種々の方法とそれ等の骨形成の有用性を評価する方法を述べる。

Ａ、ラットモデル１、埋め込みここで言及により挿入するＳａｍｐａ　ｔｈとＲｅｄｄ　ｉにより記述された骨形成にたいするバイオアッセイ（（１９８３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０：　６５９１−６５９５）は、軟骨内骨分化活性をモニターするのに用いられる。このアッセイは、テストサンプルをエーテル麻酔下のレシピエンド・ラットの皮下位置に埋め込むことにより成る。２Ｂ −３２日齢の雄のＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラットが用いられた。胸部領域に亘る皮膚に、無菌状態で、縦の切り込み（１ｃｍ）をつくり、鈍い切開によるくぼみを用意する、約２５冒ｇのテスト・サンプルをくぼみに深く埋め込み、切れ込みは金属製皮膚クリップで密閉する。埋め込み日は、実験の第１日と指定する。埋め込みは１２２日目除去する。

異型位置は、直交異方性の位置の場合起こる曖昧さの無い骨誘導の検討を許容する。ここに開示するとおり、同種（ラット骨母体）と異種（生材動物骨母体）移植の両方を分析した。

２、細胞事象成功した移植は、タンパク質誘導軟骨内骨発展の複数段階を通して制御された進行を示し、これは：　（１）第１日日の多形核の白血球による暫時浸潤；　（２）第２．３日目の開光組繊細胞の移動と拡散；　（３）第５，６日目の軟骨細胞の出現；　（４）第７日日の軟骨母体形成；　（５）第８日日の軟骨石灰化；　（６）第９．１００日目管侵入、遺骨細胞の出現及び新しい骨の形成；　（７）第１２〜１８日日の遺骨細胞と骨改造の出現と埋め込まれたマトリックスの溶出；及び（８）第２１日日の小骨内の増血骨髄分化を含む。結果は、新しい骨の形状が埋め込まれた母体（マトリックス）の形状に順応することを示している。

３、組織構造評価組織構造の区分化と染色は移植物内の骨形成の程度を決定するため好ましい。移植物はＢｏｕ　ｉｎｓ溶液中で固定され、パラフィン中に埋没され、そして６− ８μｍの区画に切断される。

トルイジン・ブルー又はヘモトキシリン／エオシンを用いる染色は、軟骨内の骨の究極的発展を明瞭に示す。２００日目移植物は、移植物が新たに誘導された骨を含んでいるかを決定するのに、通常充分である。

４、生物学的マーカーアルカリ性ホスファターゼ活性は、骨形成のマーカーとして用い得る。この酵素活動は、移植物の均質化後、スペクトル分光によって決定される。活動は、第９〜１ｏ日目に生体中最高に達し、その後緩やかに低下する。組織構造による骨の発展を全く示さない移植物は、これら等の分析条件下でアルカリ性ホスファターゼ活動を殆ど又は全く有しない０分析は、定量化と、移植物をラットから取り除いた後、速やかに骨形成の見積を得るため、有用である。或いは、骨形成の量は、移植物のカルシウム成分を測ることによって、決定できる。

本発明は、その精神と本質的特性から離れることなく、他の特定形式で具体化できる。本実施例は、従って、あらゆる観点で例示的と考えるべきであり、限定的とされるべきではない。本発明の範囲は、以上の記載によるよりはむしろ添付する請求項によって指定されるものであり、請求項の意味および等価の範囲に入るあらゆる変更は、従って、それ等に包括されるものと意図するものである。

配列表（１）一般情報（ｉｉ）発明の名称：骨形成器具（ｉｉｉ　）配列数：９（ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ（ｉｉｉ　）ハイポセティカル：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ（ｘｉ）配列記号：配列番号ｌ（２）配列番号２の情報（１１）配列の種類：蛋白質（１ｘ）配列の特徴（Ｄ）その他の情報：物質＝ｈＯＰ　１−ＰＰ（ｘｉ）配列記号：配列番号２Ｘ１ｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　）ｌｉｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｓ■ Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｉ’ｒｏ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｃ；ｌｕ　Ｖａｌ　Ｈｌｓ　Ｐ■P Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｘ１ｅ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　５ｅｒＡｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｌｙ；　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔ）ｒ■ Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ＾ｌａ　Ｐｒｏ　ＧｌｕＧｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　ＡＬａ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｉ’ｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｓ■ ３５５　３６０　、　３６５Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｉ’ｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇ１■ Ｌｅｕ　Ａｓｎ　入１ａ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　ｌ１ｅＬｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　ｌ１ｅｔ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　ｌ１ｅ（２）配列番号３の情報（ｉｉ　）配列の種類：　ｃＤＮＡ（ｘｉ　）配列記号：配列番号３ＣＡＡＴｒＣＣＧＣＴ　ＧＣＣＡＧＧＣＡＣＡ　ＧＧＴＧＣＧＣＣＧＴ　ＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＣＣＧＴＣＴＧＧＣＧ　ＴＣＡＧＣＣＧＡＧb６０ＧＣＣＡＧＴ　ＧＡＣＣＧＡ　ＴにＧ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＡＡＣＣＡＴ　ＣＡＣＡＡＧ　ＧＡＣＣＴＧ　ＧＧＡ　ＣＴＣＣＧＣ７３８Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｈｌｓ　Ｈｌｓ　Ｌｙｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　ＡｒｇＴにＣＴＴＣＴＡＣＴ　ＡＣＣＴＴＡＣＣＡＴ　ＣＴＧＣ；ＣＣＧＣＧＣＣＣＣＴＣＴＣＣＡに　Ａ（−ＧＣＡＣＡＡＡＣＣ口ＴＣＴＡＴにs　１３７］ τＡＴＣＡＴＡＧＣＴ　ＣＡＧＡＣＡＧＧＧＧ　ＣＡＡＴＧＧＧＡＧＧ　ＣＣＣＴＴＣＡＣＴＴ　ＣＣＣＣＴＧＧＣＣＡ　ＣＴＴＣＣＴＧＣsＡ　１４３３ＡＡＡＡＡＡＡＡＣＧ　ＧＡＡＴ？（１９２９（２）配列番号４の情報（ｉｉ）配列の種類：蛋白質（ｘｉ）配列記号：配列番号４Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓｌ　５　１０　１５Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｈｌｓ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇ１ｎＡｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ＾ｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ＰｈｅＭｅｔ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｈｌｓ　ＡｌａＡｌａ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｔｈｒｌｏｏ　１０５　１１０（２）配列番号５の情報（ｘｉ）　５ＥＯＵＥＮＣＥ　ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ０ｓ５：Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　！’ｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌ＠ｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｒ■ ＣＣ（１；　ＡＡＧ　Ａ入Ａ　ＡＣ，ＣＡＡＣＣ，ＡＧ　ＣＴＧ　ＣＣＩ：、ＣＡ（、（１，ＣＣＡＡＣＣＧＡ　１３４９Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　にｉｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｇｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ａ；ｎ　ａｒｇ（２）配列番号６の情報（ｉｉ　）配列の種類：蛍白質Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　５ｅｒ２２５　２３０　２３５　２４ＯＡＸｇ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｉ’ｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌ７r Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　工１ｅ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇ１ｎＳｅｒ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　）ｌｉｓ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｈ１■ （２）配列番号７の情報（ｉｉ）配列の種類：蛋白質（ｘｉ　）配列記号：配列番号７特表千７−５００４８７　（１６）（２）配列番号８の情報（ｉｉ）配列の種類：蛋白質（ｘｉ）配列記号：配列番号８（ｘｉ）　５ＥＱＵＥＮＣＥ　ＤＥＳＣＲ工ＦＴＩＯＮ＝　ｓｒ：ｑ　ＸＤ　ＮＯ：８＝Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｃｙｓ　Ｘａａ　Ｃｙｓａａ（２）配列番号９の情報（ｉｉ　）配列の種類：蛋白質（ｘｉ）配列記号：配列番号９Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｃｙｓ　Ｘａａ　ＸａａＸａａ　Ｃｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｃｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＸａａｈＯＰＩ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　工１ｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ０Ｐ１ｈＯＰ２　、、、、、、、、、、、、、、、Ｌｅｕ、、、Ｓｅｒ、、。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の７第１項）平成５年４月１６日

Claims

【特許請求の範囲】

１．配列表配列番号５の残基３０３−３９９によって記述されたアミノ酸シーケンスから成るポリペプチ鎖。
２．配列表配列番号５の残基２９７−３９９によって記述されたアミノ酸シーケンスから成る請求項１のポリペプチド鎖。
３．配列表配列番号５の残基２６７−３９９によって記述されたアミノ酸シーケンスから成る請求項２のポリペプチド鎖。
４．配列表配列番号５の残基２６４−３９９によって記述されたアミノ酸シーケンスから成る請求項３のポリペプチド鎖。
５．配列表配列番号５の残基２４０−３９９によって記述されたアミノ酸シーケンスから成る請求項４のポリペプチド鎖。
６．配列表配列番号５の残基１−３９９によって記述されたアミノ酸シーケンスから成る請求項５のポリペプチド鎖。
７．配列表配列番号３の残基３０１−３９７によって記述されたアミノ酸シーケンスから成るポリペプチド鎖。
８．配列表配列番号３の残基２９６−３９７によって記述されたアミノ酸シーケンスから成る請求項７のポリペプチド鎖。
９．配列表配列番号３の残基２５９−３９７によって記述されたアミノ酸シーケンスから成る請求項８のポリペプチド鎖。
１０．配列表配列番号３の残基１−３９７によって記述されたアミノ酸シーケンスから成る請求項９のポリペプチド鎖。
１１．一対のＳＳ結合ポリペプチド鎖から成る二量体骨形成タンパク質のサブ・ユニットとして有用なポリペプチド鎖であって、対立遺伝子及びその変種を含む配列表配列番号５の残基３０３−３９９によって記述されたアミノ酸シーケンスを有し、前記ポリペプチド鎖から成る二量体骨形成タンパク質が、マトリックスと連携して哺乳動物に埋め込まれたとき、軟骨内骨形成を誘発できる配座を有するような前記ポリペプチド鎖。
１２．前記アミノ酸シーケンスが配列表配列番号５の残基２６１−３９９から成る請求項１１のポリペプチド鎖。
１３．前記アミノ酸シーケンスが配列表配列番号３の残基３０１−３９７から成る請求項１１のポリペプチド鎖。
１４．前記アミノ酸シーケンスが配列表配列番号３の残基２５９−３９７から成る請求項１３のポリペプチド鎖。
１５．マトリックスと連携して哺乳動物に埋め込まれたとき、前記哺乳動物内で軟骨内骨形成を誘発できる二量体骨形成タンパク質であって、二量体種を構成する一対のＳＳ結合ポリペプチド鎖から成り、各前記のポリペプチド鎖は請求項１１のポリペプチド鎖である前記タンパク質。
１６．ホストセル内で組換えＤＮＡの発現によって生成される請求項３または１１のポリペプチド鎖。
１７．前記ホストセルが原核細胞である請求項１６のポリペプチド鎖。
１８．前記ホストセルが哺乳動物細胞である請求項１６のポリペプチド鎖。
１９．グリコシル基をもつ請求項１、３または１１のポリペプチド。
２０．請求項１、３または１１のポリペプチド鎖をコードする核酸。
２１．対立遺伝子及びその変種を含み、配列表配列番号３又は５によって記述されたＤＮＡシーケンスから発現される一対のポリペプチド鎖から成る二量体タンパク質であって、前記ポリペプチド鎖が酸化されてＳＳ結合二量体種を生じるとき、該二量体種がマトリックス内に置かれそして哺乳動物内に埋め込まれたとき軟骨内骨又は軟骨形成を誘発できる配座を有するような前記タンパク質。