JP2002507896A

JP2002507896A - Ｗａ５４５組成物

Info

Publication number: JP2002507896A
Application number: JP50862099A
Authority: JP
Inventors: ラバリー，エドワード・アール; レイシー，リサ・エイ; サイブ，ヘイゼル; サン，ベンジャミン
Original assignee: ジェネティックス・インスチチュート・インコーポレーテッド; ザ・ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ
Priority date: 1997-07-10
Filing date: 1998-04-24
Publication date: 2002-03-12
Also published as: WO1999002678A1; EP0998558A1; AU749878B2; CA2295086A1; AU7159798A

Abstract

(57)【要約】精製ＷＡ５４５蛋白およびその製造方法を開示する。ＷＡ５４５蛋白をコードするＤＮＡ配列も開示する。成長因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーの蛋白を用いて、神経および筋肉組織を包含する中胚葉組織の形成、成長、増殖、分化、維持を誘導、促進および／または抑制してもよい。本発明の蛋白は、骨および軟骨および／または他の結合組織の欠損の治療ならびに創傷の治癒ならびに関連組織の修復にも有用でありうる。

Description

【発明の詳細な説明】ＷＡ５４５組成物本発明は、ＷＡ５４５およびＷＡ５４５関連蛋白と命名された新規ファミリーの精製蛋白、それらをコードしているＤＮＡ、ならびにそれらの製造方法に関する。これらの蛋白を用いて骨および／または軟骨または他の結合組織の形成を誘導してもよく、さらに創傷の治療および組織の修復に用いてもよい。また、これらの蛋白を他の蛋白骨形態形成蛋白活性を増大させるために用いてもよい。発明の背景骨および他の組織抽出物中に存在する骨、軟骨および他の結合組織の誘導活性に関与する分子の検索は、骨形態形成蛋白（ＢＭＰ）と呼ばれる新規セットの分子の発見につながった。ＢＭＰ−１からＢＭＰ−１６と命名されたいくつかの蛋白の構造がすでに詳細に調べられている。これらの蛋白のユニークな誘導活性は、それらが骨に存在することとあいまって、それらは骨修復プロセスにおいて重要なレギュレーターであり、骨組織の正常な維持に関与しているかもしれないということを示唆する。これらのプロセスにおいて役割を果たすさらなる蛋白が存在するかどうかを確認することが必要である。本発明は、かかる蛋白の同定に関するものであり、本発明者らはこれをＷＡ５４５と命名した。発明の概要本明細書の用語「ＷＡ５４５関連蛋白」は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するアフリカツメガエルＷＡ５４５蛋白、ならびに哺乳動物および他の種に見いだされるこの蛋白のホモログをいい、さらにＷＡ５４５に関して構造的および／または機能的に密接な関連を有する他の蛋白もいう。「ＷＡ５４５関連蛋白」の例はネズミ、ウシおよびヒトのＷＡ５４５蛋白ならびに他の種、特にヒトにおけるホモログを包含する。本明細書の用語「ＷＡ５４５活性」は、本発明ＷＡ５４５蛋白により示される１またはそれ以上の活性をいう。特に、「ＷＡ５４５活性」は、脳細胞、Schwan n細胞、グリア細胞および星状細胞のごときニューロンおよび／または神経細胞および組織、ならびに筋肉細胞および組織（これらに限らない）を包含する中胚葉組織の形成、成長、増殖、分化、維持を誘導、促進および／または抑制する能力を包含する。「ＷＡ５４５活性」は、Xbra、gsc、brachyury、Pintallavis、X notおよび筋肉アクチンのごとき内胚葉組織の分子マーカーを誘導する能力、ならびにニューロンおよび／または脳細胞、Schwann細胞、グリア細胞および星状細胞のごとき関連神経細胞および組織の形成を誘導する能力も包含する。「ＷＡ５４５活性」は、リガントとそれらの蛋白受容体との相互作用を調節する能力も包含する。さらに「ＷＡ５４５活性」は、他の細胞および／または組織、例えば、結合組織、器官の形成、分化、増殖および／または維持の調節、ならびに創傷治癒を包含する。特に、「ＷＡ５４５活性」は、血管形成の促進および／または抑制、ならびに毛細血管、動脈および他の血管の形成および成長、ならびに心臓、脾臓、肝臓、膵臓、胃、腎臓、肺および脳の細胞および組織、骨芽細胞および骨、軟骨細胞および軟骨、腱および表皮の形成、成長、増殖、分化および／または維持を促進および／または抑制する能力を包含する。アフリカツメガエルＷＡ５４５アフリカツメガエルＷＡ５４５ＤＮＡ配列（配列番号：１）およびアミノ酸配列（配列番号：２）を配列表に示す。ＷＡ５４５蛋白は、軟骨、筋肉、神経、表皮または他の結合組織、またはそれらの組み合わせの形成を誘導する能力がある。さらにＷＡ５４５蛋白は、後で説明するアッセイにおける、軟骨、骨、筋肉、神経、表皮および／または他の結合組織の形成活性によっても特徴づけられる。配列番号：１に示すヌクレオチド５５、７７５または８１１からヌクレオチド１１１３または１１１６までを含む、成熟ＷＡ５４５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ配列で形質転換された細胞を培養し、次いで、配列番号：２に示すアミノ酸−２４０、１または１３からアミノ酸１１３または１１４までを含むアミノ酸配列により特徴づけられ、同時生成される他の蛋白性物質を実質的に含まない蛋白を培地から回収し精製することにより、アフリカツメガエルＷＡ５４５を製造してもよい。哺乳動物細胞における製造のためには、ＤＮＡ配列は、成熟ＷＡ５４５ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列にインフレーム（in frame）で結合している適当な５’側のプロペプチドをコードしているＤＮＡ配列をさらに含む。プロペプチドは本来のＷＡ５４５プロペプチドであってもよく、あるいはＴＧＦ−βスーパーファミリーの別の蛋白由来のプロペプチドであってもよい。ヒトＷＡ５４５他の種、特にヒト種は、アフリカツメガエルＷＡ５４５蛋白に対して相同的なＤＮＡ配列を有すると考えられる。それゆえ、本発明は、ヒトＷＡ５４５蛋白をコードしているＤＮＡ配列、それらの方法により得られるＤＮＡ配列、およびそれらのＤＮＡ配列によりコードされるヒト蛋白の取得方法を包含する。この方法は、ヒト遺伝子またはコーディグ配列またはそのフラグメントを求めて標準的方法を用いてライブラリーをスクリーニングするためのプローブを設計するための、アフリカツメガエルＷＡ５４５蛋白のヌクレオチド配列またはその一部分の使用を伴う。よって、本発明は、アフリカツメガエルＷＡ５４５に対して相同的であり、アフリカツメガエルＷＡ５４５配列を用いて得ることのできる、他の種、特にヒト由来のＤＮＡ配列を包含する。完全成熟ヒトＷＡ５４５蛋白および対応アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を、本明細書にて説明する方法を用いて得ることができる。本明細書にて説明するように、アフリカツメガエルＷＡ５４５配列をプローブとして使用して、これらの配列を得ることができる。ヒトＷＡ５４５配列を用いて、標準的方法により、完全ヒトＷＡ５４５遺伝子またはコーディング配列を得るためのプローブを設計してもよい。アフリカツメガエルＷＡ５４５およびヒトＷＡ５４５配列、またはそれらの一部分をプローブとして使用して、あるいはプローブを設計するために使用して、他の種由来のホモログのごとき他の関連ＤＮＡ配列を得てもよい。ＷＡ５４５ＤＮＡ配列のごとき関係のあるＤＮＡ配列で形質転換された細胞を培養し、ついで、蛋白を培地から回収することにより、ヒトＷＡ５４５のごとき本発明のＷＡ５４５蛋白を製造してもよい。精製された発現蛋白は、同時生成される他の蛋白性物質ならびに他の混入物質を実質的に含まない。回収された精製蛋白は、軟骨、骨、筋肉、神経、表皮および／または結合組織の形成活性を示すと考えられる。よって、後に説明するアッセイにおいて軟骨、骨、筋肉、神経、表皮および／または他の結合組織の形成活性を示す能力により、本発明蛋白をさらに特徴づけてもよい。本発明のもう１つの態様は、医薬上許容される賦形剤または担体中の、治療上有効量のアフリカツメガエルまたはヒトのＷＡ５４５蛋白のごときＷＡ５４５蛋白を含有する医薬組成物を提供する。これらの本発明組成物を骨、軟骨、筋肉、神経、表皮および／または腱、靭帯および半月板を包含する他の結合組織の形成、ならびに上記のものの組み合わせの形成、例えば、腱と骨との結合装置の再生に使用してもよい。ヒトＷＡ５４５の組成物ごとき本発明組成物を創傷の治療および組織の修復に用いてもよい。さらに本発明組成物は、少なくとも１種の他の治療上有用な作用剤、例えば、米国特許第５,１０８,９２２、５,０１３,６４９、５,１１６,７３８、５,１０６,７４８、５,１８７,０７６ならびに５,１４１, ９０５号に開示のＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ− ５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７；ＰＣＴ出願公開ＷＯ９３／１８０９８に開示のＢＭＰ−８；およびＰＣＴ出願公開ＷＯ９３／００４３２に開示のＢＭＰ−９；ＰＣＴ出願公開ＷＯ９４／２６８９３に開示のＢＭＰ−１０；ＰＣＴ出願公開ＷＯ９４／２６８９２に開示のＢＭＰ−１１、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９５／１６０３５号に開示のＢＭＰ−１２またはＢＭＰ−１３、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９６／３６７１０に開示されたＢＭＰ−１５、または１９９６年９月１８日出願の同時係属特許出願第０８／７１５／２０２号に開示されたＢＭＰ−１６を含んでいてもよい。有用でありうる他の組成物は、Ｖｇｒ−２およびＧＤＦ（ＰＣＴ出願公開ＷＯ９４／００３１４０；ＷＯ９４／１５９４９；ＷＯ９５／０１８０１；ＷＯ９５／０１８０２；ＷＯ９４／２１６８１；ＷＯ９４／１５９６６および他のものに記載されているものを含む）を含んでいてもよい。ＷＯ９４／０１５５７に開示のＢＩＰ；およびＰＣＴ出願公開ＷＯ９３／１６０９９に開示のＭＰ５２も本発明において有用でありうる。上記の全出願の開示を、参照により本明細書に記載されているものとみなす。本発明組成物は、ＷＡ５４５蛋白のほかに、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、 wnt蛋白、sonic、indianおよびdesertのhedgehogのごときhedgehog蛋白、アクチビン、インヒビン、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）を包含する他の治療上有用な作用剤を含んでなっていてもよい。また、組成物は、適当なマトリックス、例えば、組成物を保持し、骨および／または軟骨の成長のための表面を提供するようなマトリックスを含有していてもよい。マトリックスは、骨誘導性蛋白のゆっくりとした放出および／またはその存在のための適切な環境を提供しうるものであってもよい。ＷＡ５４５組成物を、多くの骨、軟骨、筋肉、神経、表皮および／または結合組織の欠損、ならびに歯周病、および種々のタイプの組織の治癒および創傷の治癒に使用してもよい。治療されうる組織および創傷は、表皮、神経（脊髄を包含）、筋肉（心筋、横紋筋または平滑筋を包含）、および他の組織および創傷、ならびに肝臓、肺、心臓、膵臓および腎臓組織のごとき他の器官を包含する。本発明によれば、これらの方法は、かかる骨、軟骨、筋肉、表皮および／または他の結合組織の形成、創傷の治癒あるいは組織の修復を必要とする患者に有効量のＷＡ５４５蛋白を投与することを含む。ＷＡ５４５含有組成物を用いて、骨関節炎、骨粗鬆症のごとき症状を治療または予防し、ならびに骨、軟骨、脾臓、肺、心臓および腎臓のごとき器官および他の組織を治療してもよい。またこれらの方法は、上記の少なくとも１種の他のＢＭＰ蛋白と組み合わせて本発明蛋白を投与することを伴う。さらに、これらの方法は、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ −β、wnt、hedgehog、アクチビン、インヒビンおよびＩＧＦを包含する他の増殖因子とともにＷＡ５４５蛋白を投与することも含む。本発明のさらなる態様は、ＷＡ５４５蛋白の発現をコードするＤＮＡ配列である。かかる配列は、配列番号：１に示された３’から５’方向へのヌクレオチド配列、遺伝コードの縮重を除いては配列番号：１のＤＮＡ配列と同じＤＮＡ配列であって配列番号：２の蛋白をコードしているＤＮＡ配列を包含する。さらに、ストリンジェントな条件下で配列番号：１のＤＮＡ配列とハイブリダイズし、軟骨、骨、筋肉、神経、表皮および／または他の結合組織、あるいは肝臓、膵臓、脳、脾臓、肺、心臓および腎臓組織のごとき他の器官の形成を誘導する能力を有する蛋白をコードしているＤＮＡ配列も本発明に包含される。好ましいＤＮＡ配列は、ストリンジェントな条件下［T.Maniatis et al，Molecular Cloning(A La boratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory 1982，387〜389参照］でハイブリダイズするＤＮＡ配列である。かかるＤＮＡ配列が、配列番号：２に示す成熟ヒトＷＡ５４５のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性を有するポリペプチドをコードしていることが一般的に好ましい。結局、配列番号：１の配列の対立遺伝子変種または他の変種も、ヌクレオチド変化がペプチド配列の変化をもたらすか否かにかかわらず、その配列がＷＡ５４５の活性を有する場合には本発明に包含される。また本発明は、ＷＡ５４５蛋白の活性を保持しているポリペプチドをコードする、配列番号：１に示すＷＡ５４５のＤＮＡ配列のフラグメントも包含する。本発明のＷＡ５４５蛋白の特定の変種またはフラグメントがＷＡ５４５活性を維持するかどうかの決定は、実施例および明細書に記載のアッセイを用いて常套的に行われる。本発明ＤＮＡ配列は、例えば、細胞集団中のＷＡ５４５をコードするｍＲＮＡの検出用プローブとして有用である。本発明ＤＮＡ配列は、後で説明する遺伝子治療に適用されるベクターの調製にも有用である。本発明のさらなる態様は、作動するように発現調節配列に連結された上記ＤＮＡ配列を含むベクターを包含する。作動するように発現調節配列に連結されたＷＡ５４５蛋白をコードしているＤＮＡ配列で形質転換された細胞系を適当な培地で培養し、そこからＷＡ５４５蛋白を回収し精製する、本発明のＷＡ５４５蛋白の製造方法において、これらのベクターを使用することができる。この方法には、多くの知られた真核細胞および原核細胞双方を該ポリペプチド発現のための宿主として使用することができる。ベクターを遺伝子治療に適用してもよい。かかる使用において、エクスビボでベクターを患者の細胞中にトランスフェクションし、次いで、細胞を患者に再導入することができる。別法として、標的トランスフェクションにより、インビボでベクターを患者に導入してもよい。本発明のさらなる態様はＷＡ５４５蛋白またはポリペプチドである。かかるポリペプチドは、配列番号：２に示す配列を含むアミノ酸配列、配列番号：２のアミノ酸配列の変種（天然に存在する対立遺伝子変種を包含）、ならびに他の変種（軟骨および／または骨および／または他の結合組織、あるいは肝臓、肺、心臓、膵臓および腎臓組織のごとき他の器官の形成を誘導する能力、あるいはＷＡ５４５に特徴的な他の活性を保持している）のアミノ酸配列を有することによって特徴づけられる。好ましいポリペプチドは、配列番号：２に示す成熟アフリカツメガエルＷＡ５４５のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性を有するポリペプチドを包含する。結局のところ、かかるアミノ酸の変化が突然変異、化学的変化またはＤＮＡ配列の変化により誘発されたかどうかにかかわらず、配列番号：２の配列の対立遺伝子変種または他の変種も本発明に包含される。また本発明は、ＷＡ５４５蛋白の活性を保持している、配列番号：２に示すＷＡ５４５のアミノ酸配列のフラグメントを包含する。抗体製造の分野において知られている方法を用い、本発明精製蛋白を用いてヒトＷＡ５４５および／または他のＷＡ５４５関連蛋白に対する抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を得てもよい。よって、本発明は、ヒトＷＡ５４５および／または他のＷＡ５４５蛋白に対する抗体も包含する。抗体はＷＡ５４５および／または他のＷＡ５４５蛋白の精製、あるいはＷＡ５４５蛋白の効果の抑制または防止に有用でありうる。ＷＡ５４５蛋白および関連蛋白は、ＷＡ５４５に結合する受容体蛋白の同定および単離、ならびに胚性細胞および／または幹細胞の成長および／または分化の誘導に有用でありうる。よって、本発明は、ＷＡ５４５受容体、受容体の同定方法、ならびに胚性細胞または幹細胞のごとき比較的分化していない細胞集団を処理して細胞の増殖および／または分化を促進することも包含する。処理された細胞集団は遺伝子治療への適用に有用でありうる。寄託物の説明全長のアフリカツメガエルＷＡ５４５蛋白をコードするクローンを、American Type Culture Collection（ATCC）12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 2085 2に、１９９７年５月９日に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号９８４２８を付与された。この寄託はブダペスト条約の規定を完全に満たすものである。配列番号：１は成熟アフリカツメガエルＷＡ５４５ポリペプチド全体をコードするヌクレオチド配列である。配列番号：２は成熟アフリカツメガエルＷＡ５４５ポリペプチドを含有するアミノ酸配列である。配列番号：３はアフリカツメガエルＷＡ５４５シグナル配列に対するオリゴヌクレオチドプローブである。配列番号：４はアフリカツメガエルＷＡ５４５シグナル配列に対するオリゴヌクレオチドプローブである。配列番号：５はＢＭＰ／ＴＧＦ／Ｖｇ−１蛋白の高度に保存された領域由来のコンセンサスアミノ酸配列である。配列番号：６は上記の配列番号：５のコンセンサスアミノ酸配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドである。配列番号：７はＢＭＰ／ＴＧＦ／Ｖｇ−１蛋白の高度に保存された領域由来のコンセンサスアミノ酸配列である。配列番号：８は上記の配列番号：７のコンセンサスアミノ酸配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドである。配列番号：９はアフリカツメガエルＷＡ５４５成熟ペプチド配列に対するオリゴヌクレオチドプローブである。配列番号：１０はアフリカツメガエルＷＡ５４５成熟ペプチド配列に対するオリゴヌクレオチドプローブである。図面の簡単な説明図１ＷＡ５４５の発現パターン。ＷＡ５４５は周辺帯（中胚葉）および植物細胞（vegetal cell）で発現され、ついで、後部に限定される。ＷＡ５４５に対するジゴキシゲニン標識ＲＮＡとアフリカツメガエル胚とのインシトゥハイブリダイゼーションの標本は、ＷＡ５４５ＲＮＡの局在化を示す。映像は、植物極または後部（最終的には植物極は後部となる）からのものである。（ａ）ＷＡ５４５は先ず、中期ないし後期胞胚（段階９）までに、開裂中に発現される。（ｂ）周辺帯全体（中胚葉）ならびに植物細胞において、初期原腸胚（段階１０＋）までに発現が増大する。（ｃ，ｄ）この高レベルの発現は原腸形成期間中維持される。（ｅ）原腸形成後期段階において発現レベルは低下し始める。この段階に至るまで、発現は側方および腹側組織においてやはり存在するが、脊索を形成する背側の大部分の領域からは存在しなくなる。（ｆ）初期神経胚までに、発現は減少し、閉じつつある原口のちょうど隣の領域にさらに限定される。図２ＷＡ５４５は原腸形成期間中に発現される。逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によるアッセイを用いるＷＡ５４５ＲＮＡの発現タイミング。図示された段階からＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲ用に処理した。ＷＡ５４５に特異的なプライマーまたはオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）に特異的なプライマー（ローディング対照として使用）を用いて、全部の試料につきＰＣＲ反応を２１サイクル行った。ＷＡ５４５発現は段階９（胞胚）において検出され、段階１３（初期神経胚）まで高レベルであった。段階８は中期胞胚、段階１０．２５は初期原腸胚、段階１１．２５は中期原腸胚、段階１９は尾の生え始め、段階３５は孵化である。３つの試料（未受精卵、段階８および段階９）の反応も３０サイクル行って少量のＲＮＡを検出した。卵および段階８の試料の両方において、３０サイクル後においてさえもシグナルは検出されなかった。このことは、ＷＡ５４５は母系転写物を有しておらず、中期胞胚遷移（段階８．５）はでは発現されないことを示す。図３．ＷＡ５４５は、胚の腹側において誤発現された場合、後部二次脊椎を誘導する。４細胞段階の胚の一方の腹側の割球の周辺帯にインビトロ転写ＲＮＡとして５０または１００ｐｇのＷＡ５４５を注入し、あるいは対照としてグロビンＲＮＡを注入した。８０ｐｇのｌａｃＺＲＮＡをトレーサーとして含有させて、ＷＡ５４５ＲＮＡが局在かするかどうかを調べた。軒化（段階３５）するまで胚をインキュベーションし、ついで、固定し、Ｘ−ｇａｌ染色した。矢印は、注入部位に誘導された二次脊椎を示し、胚の青色染色により示される。二次的な頭部は観察されなかった。このことは、ＷＡ５４５は後部領域を誘導できるが、前部領域を誘導できないことを示す。二次脊椎は中胚葉および神経組織を含んでいる。図４ＷＡ５４５は、胚の背側で誤発現された場合、小頭症を引き起こす。４細胞段階の胚の一方の背側の割球の周辺帯に１００ｐｇのＷＡ５４５またはグロビンのＲＮＡを８０ｐｇのｌａｃＺＲＮＡ（トレーサー）とともに注入した。尾の生え始める段階（段階２２）まで胚をインキュベーションし、ついで、）を示す。「対照」パネルはグロビンＲＮＡを注入された胚を示す。「ＷＡ５４５」パネルはＷＡ５４５ＲＮＡを注入された胚を示す。ＷＡ５４５注入胚において、小さなサイズのセメント腺により示されるように、前部構造が抑制されている。後のほうの段階においても、目および前脳は存在しない。このことは、ＷＡ５４５は前部組織をより多くの後部組織に変換しうることを示す。図５アニマルキャップアッセイにおいて、ＷＡ５４５は中胚葉後部マーカーを誘導する。ＷＡ５４５は中胚葉後部を誘導する。中胚葉前部および神経遺伝子の発現はこの遺伝子によっては活性化されなかった。２細胞段階の胚の一方の割球に４００ｐｇのＷＡ５４５またはグロビンのＲＮＡを注入した。図示したようにアニマルキャップを単離し、マーカー遺伝子が最大に発現される段階１４（神経胚）または段階１９（尾の生え始め）に至るまで子孫胚を培養した。グロビン注入キャップ、ＷＡ５４５注入キャップおよび胚全体から全ＲＮＡを調製した。ＲＴ−ＰＣＲを用いてマーカー遺伝子の発現をアッセイした。レーン１、２および３は段階１４において収穫した試料である。Ｘｂｒａは中胚葉全体のマーカーであり、ｇｓｃは中胚葉前部マーカーであり、PintallavisおよびＸｎｏｔは中胚葉後部マーカーである。すべての遺伝子が誘導されたが、ｇｓｃの誘導は非常に弱く、主に中胚葉後部が誘導されている（レーン１および２を比較）。Ｘｖｅｎｔ−１およびｏｄｃはローディング対照である。レーン４、５および６は段階１９において収穫された試料である。筋肉特異的アクチンは中胚葉側方マーカーであり、強く誘導された。中胚葉後部マーカーであるＨｏｘＢ９も誘導された。後脳で発現される神経マーカーであるＫｒｏｘ２０および神経全体のマーカーであるＮ−ＣＡＭは誘導されなかった。図６ＷＡ５４５はアニマルキャップにおいて筋肉を誘導する。ＷＡ５４５異所性発現後、組織学的レベルでの筋肉の形成が観察できる。２細胞段階の胚の一方の割球のアニマルキャップに４００ｐｇのＷＡ５４５またはグロビンのＲＮＡを注入した。図示したようにアニマルキャップを単離し、子孫胚が孵化段階（段階３５）に至るまで培養し、組織学的に分析した。（ａ）グロビン注入キャップは小胞状であり、表皮分化のみが観察される。（ｂ）ＷＡ５４５注入キャップはさらなる組織形成を示す。（ｃ）高倍率にすれば、ＷＡ５４５注入キャップが筋肉塊およびおそらくは血液を形成していることが示される。発明の詳細な説明ＷＡ５４５アフリカツメガエルＷＡ５４５ヌクレオチド配列（配列番号：１）およびコードされるアミノ酸配列（配列番号：２）を本明細書の配列表に示す。成熟アフリカツメガエルＷＡ５４５蛋白のコーディング配列はヌクレオチド５５から開始し、ヌクレオチド１１１６まで続く。本発明の精製アフリカツメガエルＷＡ５４５蛋白は、配列番号：１のヌクレオチド５５から１１１６まで、またはヌクレオチド７７５から１１１６までの配列をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を培養し、配列番号：２のアミノ酸−２４０から１１４まで、または１から１１４までにより示される配列またはこれらと実質的に相同的な配列を含む蛋白を培地から回収し、精製することにより得られる。他の種、特にヒトはアフリカツメガエルＷＡ５４５に対して相同的なＤＮＡ配列を有すると考えられる。ヒトＷＡ５４５をコードするＤＮＡ配列は、当該分野において知られた種々の方法により単離される。それゆえ、本発明は、ヒトＷＡ５４５をコードするＤＮＡ配列を得る方法を包含する。該方法は、標準的方法を用いてヒト遺伝子またはコーディング配列あるいはそれらのフラグメントを求めてライブラリーをスクーニングするためのプローブの設計においてアフリカツメガエルＷＡ５４５ヌクレオチド配列またはその一部分を使用する。蛋白のＷＡ５４５ファミリー内で高度に保存されたアミノ酸配列を含む領域を同定し、これらの高度に保存された領域のコンセンサスアミノ酸配列を、個々のＷＡ５４５蛋白の対応領域の類似性に基づいて構築する。かかる保存された配列のアミノ酸配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーは、ヒトＷＡ５４５をコードする配列の特異的増幅を可能にする。ヒトＷＡ５４５のＤＮＡコーディング部分を含む組み換えバクテリオファージを得たならば、ヒトのコーディング配列をプローブとして使用して、ＷＡ５４５ｍＲＮＡを合成するヒト細胞系または組織を同定することができる。別法として、アフリカツメガエルのコーディング配列をプローブとして使用して、かかるヒト細胞系または組織を同定することもできる。別法として、アフリカツメガエルＷＡ５４５コーディング配列を用いて、特異的増幅反応を行うために使用するプライマー間に存在する領域に存するＷＡ５４５をコードする配列の一部分を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。アフリカツメガエルおよびヒトＷＡ５４５配列を用いて、対応ヒトＷＡ５４５をコードする配列をｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ鋳型から特異的に増幅することができる。上記方法の１つにより陽性の源が同定されたならば、オリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーによりｍＲＮＡを選択し、ｃＤＮＡを合成し、確立された方法により当業者に知られたＸｇｔ１０または他のバクテリオファージベクター、例えばＺＡＰ中にクローンする。上記のオリゴヌクレオチドプライマーによる増幅を、バクテリオファージベクター中にクローンされた、すでに確立されているヒトｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーに対して直接行うことができる。そのような場合、ヒトＷＡ５４５の一部をコードする、特異的に増幅されたＤＮＡ生成物を生じるライブラリーを、増幅されたＷＡ５４５をコードするＤＮＡのフラグメントをプローブとして用いて、直接スクリーニングする。アフリカツメガエルＷＡ５４５ＤＮＡ配列の全体またはフラグメント、または部分ヒトＷＡ５４５配列をプローブとして用いて本発明のヒトＷＡ５４５配列を得る。したがって、ヒトＷＡ５４５ＤＮＡ配列は、配列番号：１に示すアフリカツメガエルＷＡ５４５ＤＮＡ配列のヌクレオチド５５または７７５から１１１６までのＤＮＡ配列を含むと考えられる。ヒトＷＡ５４５蛋白のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸−２４０または１から１１４までの配列に非常に相同的なアミノ酸配列を含むと考えられる。ＷＡ５４５蛋白は、ＣＨＯ細胞のごとき哺乳動物細胞により発現された場合、種々のＮ末端を有するＷＡ５４５蛋白の活性種の不均一な集団として存在すると考えられる。活性種は、配列番号：２のアミノ酸１３のシステイン残基から開始するアミノ酸配列を含むか、あるいはＮ末端方向のさらなるアミノ酸配列を含むであろうと考えられる。よって、活性ＷＡ５４５蛋白をコードしているＤＮＡ配列は、配列番号：１のヌクレオチド７７５または８１１から１１１３または１１１６まで、ならびに５’末端のさらなるヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含むと考えられる。したがって、ＷＡ５４５の活性種は、配列番号：２のアミノ酸１または１３から１１３または１１４まで、ならびにＮ末端のさらなるアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むと考えられる。宿主細胞による蛋白の分泌に適するプロペプチドをコードしているコーディグ配列であって成熟ＷＡ５４５蛋白に対するコーディング配列の正しい読み枠において連結されているコーディング配列で宿主細胞を形質転換してもよい。例えば、米国特許第５,１６８,０５０号には、ＢＭＰ−２以外の哺乳動物蛋白の前駆体部分をコードしているＤＮＡが成熟ＢＭＰ−２部分をコードしているＤＮＡに融合されていることが開示されており、参照によりその開示を本明細書に記載されているものとみなす。ＢＭＰ−２のプロペプチドをコードする配列が成熟ＢＭＰ −１２蛋白をコードするＤＮＡに融合されているＰＣＴ出願ＷＯ９５／１６０３５の明細書も参照。よって、本発明は、ＷＡ５４５以外の、ＴＧＦ−β蛋白のごとき蛋白由来のプロペプチドまたは調節配列をコードしているＤＮＡ配列であって、ＷＡ５４５蛋白をコードしているＤＮＡ配列に正しい読み枠にて連結しているＤＮＡ配列を含むキメラＤＮＡ分子を包含する。「キメラ」なる用語は、プロペプチドがＷＡ５４５蛋白とは異なるポリペプチド由来であることを意味するために用いられる。もともと本来のＷＡ５４５を発現する宿主細胞を、高度に発現される、あるいは調節可能な発現配列でトランスフェクションして、ＷＡ５４５発現を増加または変化させるために組み換えてもよい。イー・コリ（E．coli）で発現させることによりＷＡ５４５の１の活性種のＮ末端は実験的に次のように決定されると考えられる：［Ｍ］ＳＴＨＳＳＰＰＴＰ。よって、このＷＡ５４５種のＮ末端は配列番号：１のアミノ酸１におけるものであり、該ＷＡ５４５種をコードしているＤＮＡ配列は配列番号：１のヌクレオチド７７５から１１１６までを含むであろう。ＷＡ５４５モノマーの見かけの分子量はNovex １６％トリシンゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約１０〜１５ｋｄ、より詳細には約１３ｋｄと決定される。ＷＡ５４５蛋白は、無色透明の０. １％トリフルオロ酢酸溶液として存在すると考えられる。ダイマーは約２０〜３０ｋｄの分子量を有すると考えられる。また、ＣＨＯ細胞のごとき哺乳動物細胞により発現される他のＷＡ５４５蛋白は、種々のＮ末端を有するＷＡ５４５蛋白の活性種の不均一集団として存在する。例えば、ＷＡ５４５の活性種は、配列番号：２のアミノ酸１３におけるシステイン残基から開始するアミノ酸配列を含むか、あるいはＮ末端方向のさらなるアミノ酸配列を含むであろう。よって、活性ＷＡ５４５蛋白をコードしているＤＮＡ配列は、配列番号：１のヌクレオチド５５，７７５，８１１から１１１３または１１１６までを含むヌクレオチド配列を含むと考えられる。したがって、活性ＷＡ５４５蛋白は、−２４０、１または１３から１１３または１１４までを含むアミノ酸配列を含む。本発明のＷＡ５４５蛋白は、モノマー形態で約１０〜１５ｋｄの分子量を有するポリペプチドを包含し、該ポリペプチドは配列番号：２のアミノ酸配列を含み、後で説明するローゼン改変サムパス−レディ異所性インプラントアッセイ（Ro sen-Modified Sampath-Reddi ectopic implant assay）または他のアッセイにおいて、軟骨、骨、腱、靭帯、筋肉、神経、表皮および／または他の結合組織の形成を誘導する能力を有する。培地から回収されたＷＡ５４５蛋白を、同時産生される他の蛋白性物質および存在する他の汚染物質から単離することにより精製する。例えば、後で説明するアッセイにおける軟骨、骨、腱、靭帯、筋肉、神経、表皮および／または結合組織の形成を誘導する能力により、ＷＡ５４５蛋白を特徴づけてもよい。本発明により提供されるＷＡ５４５蛋白は、配列番号：１と類似の配列によりコードされているが天然に修飾がなされている（例えば、ポリペプチドにおけるアミノ酸変化を引き起こしうるヌクレオチド配列中の対立遺伝子変種）かまたは人工的に誘導体化されている因子も包含する。例えば、合成ポリペプチドが、配列番号：２のアミノ酸残基の連続した配列のすべてまたは一部分を複製したものであってもよい。これらの配列は、一次、二次または三次構造およびコンホーメーションの特徴を配列番号:２の骨増殖因子ポリペプチドと共有することにより、それらに共通した骨増殖因子の生物学的特性を有することができる。よって、本来のＷＡ５４５に対するこれらの修飾物および欠失物を天然に存在するＷＡ５４５および他のポリペプチドの生物学的活性置換物として治療プロセスに用いてもよい。ＷＡ５４５およびＷＡ５４５変種の両方を実施例記載のアッセイに供することにより、ＷＡ５４５変種がＷＡ５４５の生物学的活性を有しているかどうかを容易に決定することができる。本明細書記載のＷＡ５４５連蛋白の配列に対する他の特別な変異は、グリコシレーション部位の修飾を包含する。これらの修飾は、Ｏ−結合型またはＮ−結合型グリコシレーション部位を包含する。例えば、グリコシレーションの不存在または部分的にのみ行われたグリコシレーションは、アスパラギン結合型グリコシレーション認識部位におけるアミノ酸の置換もしくは欠失から生じる。アスパラギン結合型グリコシレーション認識部位は、細胞の適当なグリコシレーション酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリンのいずれかである（通常、Ｘはいかなるアミノ酸であってもよい）。グリコシレーション認識部位における第１または第３のアミノ酸の位置の一方または両方における種々のアミノ酸置換もしくは欠失（および／または第２の位置におけるアミノ酸の欠失）は、修飾されたトリペプチド配列におけるグリコシレーションを生じさせない。さらに、細菌細胞におけるＷＡ５４５蛋白の発現は、グリコシレーション認識部位が未修飾であっても、グリコシレーションされていない蛋白を生じる。さらに本発明は、他の蛋白性物質をコードしているＤＮＡ配列と結合していない、ＷＡ５４５蛋白の発現をコードしている新規ＤＮＡ配列を包含する。これらのＤＮＡ配列は、配列番号：１に示された５’から３’方向への配列、およびストリンジェントな条件下、例えば、６５℃における０.１ＸＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ［Maniatis，et al.，Molecular Cloning(A Laboratory Manual)，Cold Sprin g Harbor Laboratory（1982）pages 387〜389参照］においてそれらの配列にハイブリダイズし、軟骨、骨、腱、靭帯、筋肉、神経、表皮および／または他の結合組織を誘導する活性を有する蛋白をコードしている配列を包含する。本明細書の用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、最初の低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（６ＸＳＳＣ，０.５％ＳＤＳ，約６０℃で一晩のごとき）およびその後のより高いストリンジェンジー洗浄条件（２ＸＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ，約２０℃のごとき）、あるいはさらに高い洗浄ストリンジェンシー（０.１ＸＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ，約６５℃で１時間未満のごとき）についてもいう。またこれらのＤＮＡ配列は、配列番号：１のＤＮＡ配列を含む配列、ならびにストリンジェントな条件下においてそれらにハイブリダイズし、軟骨、骨、腱、靭帯、筋肉、神経、表皮および／または結合組織の誘導活性を有する蛋白をコードする配列を包含する。同様に、配列番号：１の配列によりコードされるＷＡ５４５蛋白あるいは配列番号：２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列であるが、遺伝暗号の縮重または対立遺伝子変異（種の集団において天然に存在する塩基の変化であってアミノ酸の変化を生じることも生じないこともある）によりコドン配列が異なるＤＮＡ配列も、本明細書記載の新規因子をコードする。活性、半減期もしくはコードされているポリペプチドの産生を増大するための、点突然変異または誘発された修飾（挿入、欠失および置換を包含）により引き起こされる配列番号：１のＤＮＡ配列における変化も本発明に包含される。本発明の別の態様は、ＷＡ５４５蛋白の新規製造方法を提供する。本発明方法は、既知調節配列の調節下に置かれた本発明のＷＡ５４５蛋白をコードしているＤＮＡ配列で形質転換された適当な細胞系を培養することを包含する。形質転換された宿主細胞を培養し、ＷＡ５４５蛋白を培地から回収し精製する。精製蛋白は、同時産生される他の蛋白ならびに他の混入物質を実質的に含まない。適当な細胞または細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のごとき哺乳動物細胞であってもよい。適当な哺乳動物宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、生成物の生産ならびに精製方法は当該分野において知られている。例えば、Gething and Sambrook，Nature，293:620〜625(1 981)、あるいは、Kaufman et al.，Mol．Cell．Biol.，5(7):1750〜1759(1985) もしくはHowleyらの米国特許第４,４１９,４４６号参照。付記した実施例に記載した別の適当な哺乳動物細胞系は、サルＣＯＳ−１細胞系である。哺乳動物細胞ＣＶ−１も適当でありうる。細菌細胞も適当な宿主である。例えば、種々のイー・コリ（E.coli）株（例えば、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１）は、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞としてよく知られている。ビー・ズブチリス（B.subtilis）、シュードモナス（Pseudomonas）、他の枯草菌類等の種々の株も、この方法に使用することができる。一般的には、細菌細胞における蛋白の発現のためにはＷＡ５４５のプロペプチドをコードしているＤＮＡは必要ない。当業者に知られた多くの酵母細胞も、本発明ポリペプチドの発現用宿主細胞として利用できる。さらに、所望ならば、昆虫細胞を本発明方法における宿主細胞として使用することもできる。例えば、Miller et al.，Genetic Engineering， 8:277〜298(Plenum Press 1986)およびその中で引用されている文献参照。本発明の別の態様は、これらの新規ＷＡ５４５ポリペプチドの発現方法に用いるベクターを提供する。好ましくは、ベクターは、本発明の新規因子コードしている上記の新規ＤＮＡ配列の全体を含むものである。さらに、ベクターは、ＷＡ５４５蛋白配列の発現を可能にする適当な発現調節配列を含む。また、上記修飾配列を含むベクターも、本発明の具体例である。さらに、配列番号：１の配列またはＷＡ５４５蛋白をコードしている他の配列を処理して、ＷＡ５４５のプロペプチド配列を欠失させ、それらを他のＢＭＰ蛋白もしくはＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーの完全なプロペプチドをコードしている配列と置換することにより成熟ＷＡ５４５蛋白を発現するようにすることもできよう。よって、本発明は、ＷＡ５４５ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列の正しい読み枠に連結されたＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー由来のプロペプチドをコードしているキメラＤＮＡ分子を包含する。ベクターを細胞系の形質転換方法に使用することができ、ベクターは選択された宿主細胞において本発明ＤＮＡ配列の複製および発現を指令しうる、作動するように本発明配列に連結されている選択された調節配列を有している。かかるベクターのための調節配列は当業者に知られており、宿主細胞に応じて選択することができる。よって、かかる特殊なベクターは本発明の一部分を形成する。組織が正常に形成されない環境における軟骨、骨、腱、靭帯、筋肉、神経、表皮および／または他の結合組織の形成を誘導する本発明蛋白は、ヒトおよび他の哺乳動物における骨折および軟骨の損傷または他の結合組織の欠損の治癒に適用される。ＷＡ５４５蛋白を用いたかかる標品は、閉鎖性ならびに解放性の骨折の減少および人工関節の定着の改善にも予防的に使用することができる。骨形成性薬剤により誘導されるドゥノボ骨形成は、先天性の脳顔面頭蓋の欠損、外傷または腫瘍学的切除術により誘発される脳顔面頭蓋の欠損に対して貢献し、さらに美容整形手術にも有用である。ＷＡ５４５蛋白を歯周病の治療、およびその他の歯の治療工程に使用してもよい。かかる薬剤は、骨形成細胞を引き寄せるための環境を提供し、骨形成細胞の増殖を刺激し、あるいは骨形成細胞の前駆細胞の分化を誘導することができる。本発明のＷＡ５４５ポリペプチドは骨粗鬆症に治療においても有用でありうる。種々の骨原性、軟骨誘導性および骨誘導性因子が記載されている。その議論については、例えば、欧州特許出願第１４８,１５５号および第１６９,０１６号参照。本発明蛋白を創傷の治癒および関連組織の修復にも使用することができる。創傷のタイプは、熱傷、切り傷、潰瘍を包含するが、これらに限定しない（傷の治癒および関連組織の治療の議論については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８４／０１１０６参照）。さらに本発明蛋白は神経細胞、星状細胞およびグリア細胞の生存率を高めるうるとも考えられ、それゆえ、移植および神経生存率および修復の低下を示す症状の治療において有用でありうると考えられる。さらに本発明蛋白は、神経（脊髄を包含）、表皮および筋肉（心筋、横紋筋および平滑筋を包含）のごとき他のタイプの組織、ならびに肝臓、膵臓、脳、脾臓、肺、心臓および腎臓組織のごとき他の器官に関連した症状の治療にも有用でありうる。また本発明蛋白は食事療法の添加物、または細胞培地の成分としても価値を有する可能性がある。この用途には、蛋白は無処理の形態であってもよく、あるいはより吸収されやすい添加物となるように前消化されていてもよい。さらに本発明の蛋白は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの蛋白に特徴的な他の有用な特性を有する可能性がある。かかる特性は、血管形成、化学走性および／または化学誘引性、ならびにコラーゲン合成、線維増多、分化応答、細胞増殖応答および細胞付着、移動および細胞外マトリックスの応答の誘導をはじめとする細胞に対する影響を包含する。これらの特性は、本発明蛋白を傷の治癒、線維増多の抑制および瘢痕組織形成の抑制のための潜在的な作用剤としている。他のＢＭＰ、他のＴＧＦ−βスーパーファミリーの蛋白、またはインヒビン− α蛋白もしくはインヒビン−β蛋白とともにホモダイマーまたはヘテロダイマーとしてダイマー化する場合、本明細書においてさらに説明するように、ＷＡ５４５ヘテロダイマーは卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の産生に対する影響を示すと考えられる。ＦＳＨは哺乳動物卵巣中の卵の発達を刺激し（Ross et al.，in Text book of Endocrinology，ed．Williams．p．355(1981)）、卵巣に対するＦＳＨでの過剰な刺激は多発性の排卵を誘発するであろうと認識されている。ＦＳＨは精巣機能においても重要である。よって、メスの哺乳動物における受精能を抑制し、オスの哺乳動物における精子形成を抑制するインヒビンの能力に基づいた避妊薬として、ＷＡ５４５は有用でありうる。充分量の他のインヒビン類の投与により哺乳動物における不妊を誘導することができる。またＷＡ５４５は、下垂体前葉の細胞からのＦＳＨ放出刺激におけるアクチビン分子の能力に基づいた受精能誘導治療薬としても有用でありうる。例えば、米国特許第４７９８８８５号参照。ＷＡ５４５は、性的に未成熟な哺乳動物における受精を促進して、ウシ、ヒツジおよびブタのごとき家畜の一生の間の繁殖能を改善することも可能である。さらに、ＷＡ５４５は、赤血球細胞の分化を誘導することにより、造血の転調において（例えば、Broxmeyer et al，Ptoc．Natl．Acad．Sci．USA，85:90 52-9056(1998)またはEto et al，Biochem．Biophys．Res．Comm.，142:1095-110 3(1987)参照）、あるいは生殖腺腫瘍の発達を抑制することにおいて（例えば、M atzuk et al.，Nature，360:313-319(1992)参照）、あるいは骨形態形成蛋白の活性を増大させること（例えば、Ogawa et al.，J．Biol．Chem，267:14233-142 37(1992)参照）において有用でありうると考えられる。ＷＡ５４５蛋白は、記載されているように（例えば、Vale et al，Endocrinol ogy，91:562-572(1972);Ling et al.，Nature，321:779-782(1986)またはVale e t al.，Nature，321:776-779(1986)参照）、ラット下垂体前葉細胞を用いる確立されたインビトロバイオアッセイにおける卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を転調させる能力によってさらに特徴づけられる。本発明のＷＡ５４５蛋白は、インヒビンαまたはインヒビン−β鎖とヘテロダイマーを構成する場合、記載されているように（Ling et al.，Nature，321:779-782(1986);Vale et al.，Nature ，321:776-779（1986）またはVale et al，Endocrinology，91:562-572(1972)）、下垂体前葉細胞からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出に対して刺激的または抑制的な調節効果を示すであろう。それゆえ、個々の構成によっては、本発明のＷＡ５４５蛋白は、下垂体前葉細胞からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出に対して対比的および逆の効果を有する可能性がある。アクチビンＡ（インヒビンβ_Aのホモダイマー構成物）は赤血球刺激活性を有することが示されている（例えば、Eto et al.，Biochem．Biophys．Res．Commu n.，142:1095-1103(1987)およびMurata et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA. ，85:2434-2438(1988)およびYu et al.，Nature，330:765-767(1987)参照）。本発明のＷＡ５４５蛋白は類似の赤血球刺激活性を有する可能性があると考えられる。ＷＡ５４５蛋白のこの活性は、Lozzio et al.，Blood，45:321-334(1975)および米国特許第５０７１８３４号により記載されたようなヒトＫ−５６２細胞系を用いて行われる生物学的アッセイにおいてエリスロポイエチン活性を示す能力によっても特徴づけることができる。本発明のさらなる態様は、骨折の治療ならびに軟骨の修復および／または骨の欠損もしくは歯周病に関連した他の症状の治療のための方法および組成物である。さらに本発明は、傷の治癒および組織修復のための方法および組成物を含む。かかる組成物は、医薬上許容される賦形剤、担体もしくはマトリックスと混合された治療上有効量の少なくとも１種の本発明のＷＡ５４５蛋白を含む。さらに本発明組成物は神経生存率を高めることができると考えられ、それゆえ、移植および神経生存率の低下を示す症状の治療において有用でありうると考えられる。本発明組成物は、さらに少なくとも１種の他の治療上有用な薬剤（例えば、ＴＧＦ −βスーパーファミリーの蛋白）を含有していてもよく、その有用な薬剤には、ＢＭＰ蛋白、例えば、米国特許第５,１０８,９２２、５,０１３,６４９、５,１１６,７３８、５,１０６,７４８、５,１８７,０７６ならびに５,１４１,９０５号に開示のＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７；ＰＣＴ出願公開ＷＯ９３／１８０９８に開示のＢＭＰ−８；およびＰＣＴ出願公開ＷＯ９３／００４３２に開示のＢＭＰ−９;ＰＣＴ出願公開ＷＯ９４／２６８９３に開示のＢＭＰ−１０;ＰＣＴ出願公開ＷＯ９４／２６８９２に開示のＢＭＰ−１１、１９９４年１２月２２日出願の同時係属出願第０８／３６２６７０号に開示のＢＭＰ−１２またはＢＭＰ−１３）、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９６／３６７１０に開示のＢＭＰ−１５、または１９９６年９月１８日出願の同時係属特許出願第０８／７１５／２０２号に開示のＢＭＰ−１６が包含される。有用でありうる他の組成物は、Ｖｇｒ−２およびＧＤＦｓ（ＰＣＴ出願公開ＷＯ９４／００３１４０；ＷＯ９４／１５９４９；ＷＯ９５／０１８０１；ＷＯ９５／０１８０２;ＷＯ９４／２１６８１;ＷＯ９４／１５９６６；ＷＯ９５／１０５３９；ＷＯ９６／０１８４５；ＷＯ９６／０２５５９および他のものに記載されているものを含む）を含んでいてもよい。ＷＯ９４／０１５５７に開示のＢＩＰ；ならびにＰＣＴ出願公開ＷＯ９３／１６０９９に開示のＭＰ５２も本発明において有用でありうる。上記出願の開示を参照により本明細書に記載されているものとみなす。ＷＡ５４５蛋白は、その性質上、ホモダイマーまたはヘテロダイマーとして存在しうると考えられる。安定性の向上したＷＡ５４５のダイマー形成を促進するためには、一般的には、配列番号：１のＤＮＡ配列を処理して１個またはそれ以上のさらなるシステイン残基を有するようにし、ダイマー形成の可能性を高めることができる。得られるＤＮＡ配列は、ＷＡ５４５蛋白の「システイン付加変種」を生じうるであろう。別法として、アミノ酸配列の１個またはそれ以上のアミノ酸残基をＣｙｓに変化させることにより、ＷＡ５４５蛋白の「システイン付加変種」を得ることもできる。蛋白の「システイン付加変種」の製造につては米国特許第５１６６３２２号に記載されており、参照によりその開示を本明細書に記載されているものとみなす。本発明の蛋白は、他の関連蛋白および増殖因子と協同して、あるいはおそらく相乗的に作用しうると期待される。それゆえ、本発明のさらなる治療方法および組成物は、上記出願に開示されたＢＭＰ蛋白のごときＴＧＦ−βスーパーファミリー蛋白の少なくとも１つのメンバーと混合された治療量の少なくとも１種の本発明のＷＡ５４５蛋白を含んでなる。かかる混合物は、個々のＢＭＰ蛋白分子または異なるＢＭＰ部分よりなる異種分子を含みうる。例えば、本発明方法および組成物が、ＷＡ５４５蛋白のサブユニットおよび上記「ＢＭＰ」蛋白のうちの１種に由来するサブユニットよりなるジスルフィド結合したダイマーからなっていてもよい。かくして、本発明は精製ＷＡ５４５ポリペプチドを包含し、該ポリペプチドは、一方のサブユニットが配列番号：２のアミノ酸配列を含み、もう一方のサブユニットがＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ− ５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ −１１またはＢＭＰ−１２またはＢＭＰ−１３（ＰＣＴ出願ＷＯ９５／１６０３５に開示）、ＢＭＰ−１５（ＰＣＴ出願公開ＷＯ９６／３６７１０に開示）、または１９９６年９月１８日出願の同時係属特許出願第０８／７１５２０２号に開示のＢＭＰ−１６からなる群より選択される骨形態形成蛋白に関するアミノ酸配列を含むヘテロダイマーである。さらなる具体例は、ＷＡ５４５の一部分、例えばアフリカツメガエルＷＡ５４５およびアフリカツメガエルＷＡ５４５蛋白のヒトホモログを含むヘテロダイマーを包含しうる。さらに、ＷＡ５４５を、骨、軟骨、腱、靭帯、筋肉、神経、表皮および／または他の結合組織の欠損、創傷、もしくは問題となっている組織の治療に有益な他の薬剤と混合してもよい。これらの薬剤は、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、ならびにｋ−線維芽細胞増殖因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ／ＨＩＬＤＡ／ＤＩＡ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−II）を包含する。これらの薬剤の一部分も、本発明組成物に使用することができる。ｐＨ、等張性、安定性等に関するかかる生理学的に許容される蛋白組成物の調製および処方は当該分野の範囲内である。さらに、本発明治療組成物は、ＢＭＰ蛋白が種特異性を欠くことから、獣医学にも適用価値がある。特に、人以外には家畜およびサラブレッドのウマが、本発明のＷＡ５４５蛋白での治療に関する望ましい対象である。本発明の治療方法は、組成物を、局所的に、全身的に、または移植もしくはデバイスのように部分的に投与することを包含する。もちろん、本発明に使用する治療組成物は、投与する場合にはパイロジェンがなく、生理学的に許容される形態である。さらに、望ましくは、組成物を、骨、軟骨または組織の損傷部位にデリバリーするためにカプセル封入するか、あるいは粘度のある形態として注射する。傷の治癒および組織の修復には局所投与が適当であろう。上記組成物中に含有されていてもよいＷＡ５４５蛋白以外の治療上有用な薬剤を、本発明方法において、本発明ＢＭＰ組成物と同時または逐次的に、ＢＭＰ組成物に代えて、あるいはこれに追加して投与してもよい。好ましくは、骨、軟骨、腱、靭帯、筋肉、神経、表皮および／または他の結合組織の形成のためには、組成物は、損傷を受けて修復を必要とする組織の部位にＷＡ５４５蛋白または他のＢＭＰ蛋白をデリバリーし、骨および軟骨の発達のための構造を提供し、最適には体内に吸収されうるマトリックスを含有する。該マトリックスが、ＷＡ５４５および／または他の誘導性蛋白の遅延した放出、ならびに細胞の浸潤のための正しい構造および適切な環境を提供するものであってもよい。かかるマトリックスは、他の移植される医療用具に使用する材料から作られる。マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容上の外観および界面の特性に基づく。ＷＡ５４５組成物のそれぞれの適用により適切な処方が決定されるであろう。組成物に有用なマトリックスは生分解性であり、化学的に知られている硫酸カルシウム、リン酸三石灰、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であってもよい。他の有用な材料は生分解性であり、骨、腱または皮膚コラーゲンのごとき生物学的に十分に知られているものである。さらなるマトリックスは純粋蛋白または細胞外マトリックス成分を含む。他の有用なマトリックスは非生分解性で、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸、または他のセラミックスのごとき化学的に知られているものである。マトリックスが、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンおよびリン酸三石灰のごとき、上記タイプの材料のいずれかの混合物からなっていてもよい。例えば、カルシウム−アルミン酸−リン酸のような組成物中においてバイオセラミックスを変更してもよく、さらにその孔サイズ、粒子形態および生分解性を変化させてもよい。ＷＡ５４５蛋白の作用を変化させる種々の因子、例えば、形成が望まれる骨の重量、骨損傷部位、損傷した骨の状態、傷のサイズ、損傷を受けた組織のタイプ、患者の年齢、性別ならびに食事、感染があればその程度、投与期間、および他の臨床的因子を医師が考慮することにより、投与規則が決定されよう。再構成に用いるマトリックスのタイプおよび組成物中のＢＭＰ蛋白のタイプに応じて用量を変更してもよい。ＩＧＦ−Ｉ（インスリン様増殖因子Ｉ）のごとき他の知られた因子を最終組成物に添加することも、投薬を有効にする可能性がある。骨の成長および／または修復を定期的に評価することにより、進行をモニターすることができる。例えば、Ｘ線、組織形態学的測定、およびテトラサイクリン標識により、進行をモニターすることができる。以下の実施例は、アフリカツメガエルＷＡ５４５蛋白の回収ならびに特徴付け、およびヒトＷＡ５４５蛋白を回収するためのＤＮＡの使用、組み換え法によるヒト蛋白の取得および蛋白の発現に関して、本発明の実施につき説明する。実施例は限定的なものではなく、本発明は本明細書記載のごとく多くのバリエーションを含み、あるいは本明細書の記載および好ましい具体例の詳細な説明を考慮すれば、当業者に明らかになるであろう。かかるバリレーションのための方法および道具は当業者に知られており、かかるバリエーションは本発明の一部を構成する。実施例実施例１アフリカツメガエルｃＤＮＡの単離プラスミドベクターＣＳ２＋中に構築されたｄＴ−プライムドｃＤＮＡライブラリーからアフリカツメガエルＷＡ５４５全長ｃＤＮＡを単離した。アフリカツメガエル胚（段階１１．５〜１２）からｃＤＮＡを作成した。クローン単離に使用したプローブ配列はＥＳＴ由来のものであり、該ＥＳＴはシグナル配列トラップ中のインベルターゼ分泌を可能にするために使用されたものであり、米国特許第５５３６６３７号に記載されており、参照によりその開示を本明細書に記載されているものとみなす。ＷＡ５４５に対するプローブの配列は以下のとおり：両方のプローブはＥＳＴに対するアンチセンス配列である。ＤＮＡプローブを³² Ｐで放射性標識し、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション／洗浄条件下でアフリカツメガエルｄＴ−プライムドｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用して、ＷＡ５４５遺伝子配列を含有するクローンを同定した。約６１０００個のライブラリーの形質転換体を、プレート１枚あたり４３５０個の密度で選択プレートに撒いてＷＡ５４５をスクリーニングした。標準的ハイブリダイゼーションバッファー（６ＸＳＳＣ,０.５％ＳＤＳ,５Ｘデンハーツ, １０ｍＭＥＤＴＡｐＨ８,１００ｍｇ／ｍｌパン酵母リボ核酸）中で形質転換コロニーのニトロセルロースレプリカを³²Ｐ標識ＤＮＡプローブにハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションさせてから２時間後、ハイブリダイゼーション溶液からフィルターを取り出し、高ストリンジェンシー条件下（２ＸＳＳＣ,０.５％ＳＤＳ、２１℃、５分、ついで、２ＸＳＳＣ,０.１％ＳＤＳ、２１℃、１５分、ついで、２回目の２ＸＳＳＣ,０.１％ＳＤＳ、２１℃、１５分、ついで、２ＸＳＳＣ,０.１％ＳＤＳ、６５℃、１０分）で洗浄した。フィルターをサランラップで包み、室温で３日間Ｘ線フィルムに曝露した。オートラジオグラフを現像し、種々のシグナル強度の陽性ハイブリダイゼーションした形質転換体を確認した。これらの陽性クローンを拾い、選択培地で５時間増殖させ、低密度（プレート１枚あたり約１００コロニー）でプレートに撒いた。標準的ハイブリダイゼーションバッファー（６ＸＳＳＣ,０.５％ＳＤＳ,５Ｘデンハーツｍ１０ｍＭＥＤＴＡｐＨ８,１００ｍｇ／ｍｌパン酵母リボ核酸）中でコロニーのニトロセルロースレプリカを³²Ｐ標識プローブとハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションさせてから２時間後、ハイブリダイゼーション溶液からフィルターを取り出し、高ストリンジェンシー条件下（２ＸＳＳＣ,０.５％ＳＤＳ、２１℃、５分、ついで、２ＸＳＳＣ,０.１％ＳＤＳ、２１℃、１５分、ついで、２回目の２ＸＳＳＣ,０.１％ＳＤＳ、２１℃、１５分、ついで、２ＸＳＳＣ,０.１％ＳＤＳ、６５℃、１０分）で洗浄した。フィルターをサランラップで包み、室温で３日間Ｘ線フィルムに曝露した。オートラジオグラフを現像し、種々のシグナル強度の陽性ハイブリダイゼーションした形質転換体を確認した。精製ハイブリダイゼーション陽性クローンの細菌ストックを作成し、プラスミドＤＮＡを単離した。ｃＤＮＡインサートの配列を決定した。ｃＤＮＡインサートは、ハイブリダイゼーションに使用したＤＮＡプローブの配列を含んでいた。実施例２ＷＡ５４５ホモログの単離新たに単離されたＷＡ５４５蛋白に関して本明細書に記載のＤＮＡ配列を用い、当業者に知られた種々の方法により、ＷＡ５４５ホモログならびにネズミおよびヒトのＷＡ５４５蛋白のごとき関連蛋白をコードするＤＮＡ配列を単離することができる。下記のごとく、他のＢＭＰ蛋白、Ｖｇ−１関連蛋白およびＴＧＦ− βスーパーファミリーの他の蛋白中に存在するアミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。蛋白のＢＭＰファミリーおよび蛋白のＴＧＦ −βスーパーファミリーの他のメンバー中において高度に保存されたアミノ酸配列を有する領域を同定し、ＢＭＰ／ＴＧＦ−β／Ｖｇ−１蛋白それぞれの対応領域の類似性に基づいて、これらの高度に保存された領域のコンセンサスアミノ酸配列を構築することができる。本発明のＷＡ５４５蛋白および他のＢＭＰ／ＴＧＦ−β／Ｖｇ−１関連蛋白は上記コンセンサスアミノ酸配列に類似したアミノ酸配列を含む可能性があり、ＷＡ５４５蛋白または他の新規関連蛋白中のそれらの配列の位置は、それらが由来した蛋白中の関連した位置に対応していると考えられる。他のＢＭＰ／ＴＧＦ−β／Ｖｇ−１蛋白の構造およびコンセンサスアミノ酸配列が由来したオリゴヌクレオチド配列から得られる、このような位置の情報を用いて、ＷＡ５４５蛋白または他のＢＭＰ／ＴＧＦ−β／Ｖｇ−１関連蛋白の対応アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を特異的に増幅することができる。かかるコンセンサス配列の一例を以下に示す。コンセンサスアミノ酸配列：ＴｒｐＸａａＸａａＴｒｐＩｌｅＸａａＡｌａ（配列番号：５）。式中、１番目のＸａａはＧｌｕ、ＡｓｎまたはＡｓｐであり、２番目のＸａａはＡｓｐ、ＧｌｕまたはＡｓｎであり、３番目のＸａａはＶａｌまたはＩｌｅである。Ｘ／Ｙは、いずれのアミノ酸がその位置にあってもよいことを示す。上記コンセンサスアミノ酸配列（１）に基づいて下記オリゴヌクレオチドを設計した：このオリゴヌクレオチドを自動ＤＮＡ合成装置で合成した。上記オリゴヌクレオチドプライマー中の標準的ヌクレオチドシンボルは以下のとおり：Ａはアデノシン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン、Ｎはアデノシンまたはシトシンまたはグアニンまたはチミン、Ｒはアデノシンまたはシトシン、Ｙはシトシンまたはチミン、Ｈはアデノシンまたはシトシンまたはチミン、Ｖはアデノシンまたはシトシンまたはグアニン、Ｄはアデノシンまたはグアニンまたはチミン。オリゴヌクレオチド＃１の最初の８個のヌクレオチド（下線部）は制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識配列を含み、ＷＡ５４５またはＷＡ５４５関連蛋白をコードする、特異的に増幅されたＤＮＡ配列の取り扱いを容易にするものであり、よって上記コンセンサスアミノ酸配列（１）由来ではない。第２のコンセンサスアミノ酸配列は下記のとおりであり、ＢＭＰ／ＴＧＦ−β ／Ｖｇ−１蛋白の別の高度に保存された領域に由来する：ＡｓｎＨｉｓＡｌａＩｌｅＸａａＧｌｎＴｈｒ（配列番号：７）。式中、ＸａａはＶａｌまたはＬｅｕである。上記コンセンサスアミノ酸配列（２）に基づいて下記オリゴヌクレオチドを設計した：このオリゴヌクレオチドを自動ＤＮＡ合成装置で合成した。上と同じヌクレオチドシンボルを使用する。オリゴヌクレオチド＃２の最初の８個のヌクレオチド（下線部）は制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩの認識配列を含み、ＷＡ５４５またはＷＡ５４５関連蛋白をコードする、特異的に増幅されたＤＮＡ配列の取り扱いを容易にするものであり、よって上記コンセンサスアミノ酸配列（２）由来ではない。本発明のＷＡ５４５またはＷＡ５４５関連蛋白および他のＢＭＰ／ＴＧＦ−β ／Ｖｇ−１関連蛋白は上記コンセンサスアミノ酸配列に類似したアミノ酸配列を含む可能性があり、ＷＡ５４５またはＷＡ５４５関連蛋白または他の新規関連蛋白中のそれらの配列の位置は、それらが由来した蛋白中の関連した位置に対応していると考えられる。他のＢＭＰ／ＴＧＦ−β／Ｖｇ−１蛋白の構造ならびにコンセンサスアミノ酸配列（１）および（２）がそれぞれ由来したオリゴヌクレオチド配列から得られるこの位置の情報を用いて、ＷＡ５４５またはＷＡ５４５関連蛋白または他のＢＭＰ／ＴＧＦ−β／Ｖｇ−１関連蛋白の対応アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を特異的に増幅することができる。ＢＭＰ／ＴＧＦ−β／Ｖｇ−１蛋白の構造についての知識に基づけば、アフリカツメガエル、ヒトまたはネズミのゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、ＷＡ５４５をコードする配列およびＷＡ５４５蛋白の同定を可能にする特異的増幅反応を行うことができる。ヒトまたはネズミのゲノムＤＮＡ鋳型のかかる特異的増幅反応を、前記オリゴヌクレオチドプライマーを使用すて開始させることができる。配列番号：６および配列番号：８に示すようなオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、アフリカツメガエル、ヒト、ネズミまたは他のゲノムＤＮＡ由来の特定のヌクレオチド配列を特異的に増幅することが可能である。増幅反応を下記のごとく行う：ゲノムＤＮＡを２５ゲージの注射針に繰り返し通すことにより剪断し、１００ ℃で５分間変性させ、ついで、氷で冷却し、その後、２００μＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸(dATP，dGTP，dCTPおよびdTTP),10mM Tris-HCl pH8.3,50mM KCl,1.5mM MgCl₂,0.001%ゼラチン,1.25ユニットのTaq DNAポリメラーゼ，50pMの各オリゴヌクレオチド（例えば、配列番号：６および配列番号：８に示すものであって、コンセンサス配列に対するもの）を含有する反応混合物に添加する（全体で５０μｌ）。この反応混合物を次のようなサーマルサイクリングに供する：９４℃で１分３７℃で１分、７２℃で２分を３０サイクル、ついで、７２℃で７分。この反応により特異的に増幅されるＤＮＡをエタノール沈殿させ、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動にかける。ヒトまたはネズミのＷＡ５４５またはＷＡ５４５関連蛋白をコードするＤＮＡフラグメントの予想サイズに対応するゲルの領域を切り出し、その中の特異的に増幅されたＤＮＡフラグメントを電気溶出させ、適当なベクター、例えば、プラスミドベクターｐＧＥＭ−３のポリリンカーのＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位間にサブクローンする。得られたヒトまたはネズミのＷＡ５４５またはＷＡ５４５関連サブクローンのＤＮＡ配列の分析を行って、特異的に増幅されたＤＮＡ配列の生成物が本発明のヒトまたはネズミのＷＡ５４５またはＷＡ５４５関連蛋白をコードする部分を含んでいるかどうかを調べる。オリゴヌクレオチドプローブ、好ましくは３０〜５０ヌクレオチドの長さのものを、上記のヒトまたはネズミのＷＡ５４５またはＷＡ５４５関連蛋白をコードする、特異的に増幅されたＤＮＡ配列に基づいて設計することができる。オリゴヌクレオチドプローブを³²Ｐで放射性標識し、ベクターλＦＩＸＩＩ（Stratag eneカタログ番号９４６３０９）または相当する代用品中に構築されたネズミまたはヒトのゲノムライブラリーをスクリーニングする。ヒトゲノムライブラリーの５０００００個の組み換え体を、プレート１枚あたり約１００００個の組み換え体の密度として、５０枚のプレートに撒く。組み換えバクテリオファージに対して２系のニトロセルロースレプリカを作成し、ニトロセルロースフィルターの一方のセットを１のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションさせ、ニトロセルロースフィルターのもう一方のセットをもう１つのオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションさせ、両方を、５ＸＳＳＣ,１％ＳＤＳ, １０％デキストラン硫酸,２Ｘデンハーツ,１００μｇ／ｍｌ剪断サケ精子ＤＮＡからなるハイブリダイゼーションバッファー中に、６０℃で一晩置く。翌日、放射性標識オリゴヌクレオチドを含有するハイブリダイゼーション溶液を除去し、フィルターを５ＸＳＳＣ,０.１％ＳＤＳで、６０℃において洗浄する。両方のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイゼーションした組み換え体を同定し、プラーク精製する。アフリカツメガエルＷＡ５４５オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイゼーションするプラーク精製された組み換えバクテリオファージクローンを分析して、本明細書にて説明する配列分析およびアッセイを用いて、本発明のＷＡ５４５蛋白をコードしていることを確認する。バクテリオファージストックを作成し、バクテリオファージＤＮＡをネズミまたはヒトのゲノムクローンから単離する。ネズミまたはヒトのゲノム組み換え体の完全なインサートを制限エンドヌクレアーゼで切り出し、プラスミドベクター（pBluescript）中にサブクローンし、ＤＮＡ配列の分析を行う。他のＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−βファミリーの他の蛋白に関する知識に基づけば、アフリカツメガエルＷＡ５４５前駆体ポリペプチドは、コンセンサス蛋白分解プロセッシング配列Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇに当てはまる多塩基配列Ａｒｇ− Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇにおいて開裂されるであろう。アフリカツメガエルＷＡ５４５前駆体ポリペプチドの開裂は、配列番号：２の位置１のアミノ酸Ｓｅｒから始まる１１４個のアミノ酸の成熟ペプチドを生じると考えられる。アフリカツメガエルおよび哺乳動物のＷＡ５４５およびＷＡ５４５関連蛋白の成熟形態へのプロセッシングは、関連蛋白ＴＧＦ−βのプロセッシング［Gentry et al.，Mol ec & Cell．Biol．8:4162(1988);Derynck et al．Nature，316:701 (1985)］と類似の様式でのダイマー化およびＮ末端の除去を含むと考えられる。それゆえ、哺乳動物ＷＡ５４５蛋白の成熟活性種は２つのポリペプチドのサブユニットからなるホモダイマーを含むと考えられ、各サブユニットは配列番号：２の一部分、例えば、アミノ酸１から１１４までに関連したアミノ酸配列を含有するであろう。さらなる活性種は、少なくとも配列番号：２のアミノ酸１３から１１４までを含有し、それゆえ、最初の保存されたシステイン残基を含むと考えられる。ＴＧＦ−β／ＢＭＰファミリーの蛋白の他のメンバーについては、ネズミＷＡ５４５蛋白のカルボキシ末端部分はアミノ末端部分よりも大きな配列保存性を示す。システイン豊富Ｃ末端ドメイン（配列番号：２のアミノ酸２４から１２５まで）におけるアフリカツメガエルＷＡ５４５蛋白の、ヒトＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−βファミリーの他の蛋白の対応領域に対するアミノ酸同一性パーセンテージは次のとおり：ＢＭＰ−２,６０％；ＢＭＰ−３,４３％；ＢＭＰ−４,５７％；ＢＭＰ−５,５７％；ＢＭＰ−６,５９％；ＢＭＰ−７,５７％；ＢＭＰ− ８,５５％；ＢＭＰ−９,４９％；ＢＭＰ−１０,５１％；ＢＭＰ−１１,４１％；ＢＭＰ−１２，５１％；Ｖｇ１,８２％；ＧＤＦ−１,６３％；ＴＧＦ−β１,３９％；ＴＧＦ−β２,４０％；ＴＧＦ−β３,４３％；インヒビンβ（Ｂ），４２％；インヒビンβ（Ａ）,４３％。アフリカツメガエルＷＡ５４５ＤＮＡ配列（配列番号：１）またはその一部分、例えば、成熟ペプチドをコードする部分に対応するアフリカツメガエルＷＡ５４５配列の一部分をプローブとして使用して、ヒトまたはネズミのＷＡ５４５またはＷＡ５４５関連蛋白のごとき対応ホモログまたは関連蛋白を同定することができる。アフリカツメガエルＷＡ５４５配列（配列番号：１）に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列番号：１のヌクレオチド７７５から１１１６までを特異的に増幅することができる。下記オリゴヌクレオチドプライマーを、配列番号：１に示すＤＮＡ配列のヌクレオチド７７５から７９４までのヌクレオチドに基づいて設計し、自動ＤＮＡ合成装置で合成する：下記オリゴヌクレオチドプライマーを、配列番号：１に示すＤＮＡ配列のヌクレオチド１１１６から１０９７までのヌクレオチドに基づいて設計し、自動ＤＮＡ合成装置で合成する：増幅反応を下記のごとく行う：アフリカツメガエルＷＡ５４５全長ｃＤＮＡを含有する１０ｎｇの細菌プラスミドＤＮＡを、２００μＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸(dATP，dGTP，dCTPおよびdTTP)，10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl ，1.5mM MgCl₂，0.001%ゼラチン，1.25ユニットのTaq DNAポリメラーゼ，１００ pMの各オリゴヌクレオチドプライマーを含有する反応混合物に添加する。ついで、反応混合物を下記のサーマルサイクリングに供する：９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分を３０サイクル。この増幅反応により、本発明のアフリカツメガエルＷＡ５４５蛋白の成熟ペプチド全体をコードする約３４４塩基対のＤＮＡフラグメントが得られると考えられよう。反応生成物を２％アガロースゲルで電気泳動した後、３４４塩基対のＤＮＡ生成物を可視化する。３４４塩基対のアフリカツメガエルＷＡ５４５ＤＮＡフラグメントを含有するゲルの領域を切り出し、その中に含まれる特異的に増幅されたＤＮＡフラグメントを抽出する（電気溶出または当業者に知られた方法により）。ゲルから抽出された３４４塩基対のＤＮＡ増幅生成物を³²Ｐで放射性標識し、ベクターｅＤＡＳＨＩＩ（Stratag eneカタログ番号９４５２０３）中に構築されたヒトゲノムライブラリーのスクリーニングに使用する。同じプローブを用いて、ｅＦＩＸＩＩ（Stratageneカタログ番号９４６３０９）中に構築されたネズミゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。ネズミまたはヒトのＷＡ５４５またはＷＡ５４５関連遺伝子ヒトまたはネズミのゲノムライブラリーの１００万個の組み換え体を、プレート１枚あたり約２００００個の密度として、５０枚のプレートに撒く。組み換えバクテリオファージプラークの２系のニトロセルロースレプリカを、標準的なハイブリダイゼーションバッファー（ＳＨＢ＝５ＸＳＳＣ,０.１％ＳＤＳ,５Ｘデンハーツ,１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）中、ストリンジェンシーを減じた条件下で、³²Ｐ標識された、特異的に増幅された３４４塩基対のプローブと、６０℃で一晩ハイブリダイゼーションさせる。翌日、放射性標識オリゴヌクレオチドを含有するハイブリダイゼーション溶液を除去し、ストリンジェンシーを減じた条件下で、２ＸＳＳＣ,０.１％ＳＤＳで、６０℃においてフィルターを洗浄する。陽性ハイブリダイゼーションした複数の形質転換体を同定し、プラーク精製することができる。これらのプラーク精製組み換えバクテリオファージを用いてバクテリオファージストックを調製し、そこから組み換えバクテイオファージＤＮＡを単離し、精製することができる。ネズミまたはヒトのゲノムクローン（もともと、アフリカツメガエルＷＡ５４５プローブに対するハイブリダイゼーションにより同定されたもの）から単離して得られたバクテリオファージＤＮＡを、ヒトまたはネズミのＷＡ５４５またはＷＡ５４５関連配列の存在について、ＤＮＡ配列の特徴付けにより分析する。アフリカツメガエルＷＡ５４５ＤＮＡ配列（配列番号：１）またはその一部分をプローブとして用いて、ＷＡ５４５ｍＲＮＡを合成するヒト細胞系または組織を同定することができる。簡単に説明すると、選択した細胞または組織源からＲＮＡを抽出し、ホルムアルデヒドアガロースゲルで電気泳動してからニトロセルロースに移すか、あるいはホルムアルデヒドと反応させ、ニトロセルロースに直接スポットする。ついで、ニトロセルロースを、アフリカツメガエルＷＡ５４５ＤＮＡのコーディング配列由来のプローブとハイブリダイゼーションさせる。別法として、アフリカツメガエルＷＡ５４５配列を用いて、特異的増幅反応を行うために使用されるヒトまたはネズミのプライマー間の領域に存在するヒトまたはネズミのＷＡ５４５またはＷＡ５４５関連蛋白をコードする配列の一部分を特異的増幅するであろうオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。これらのアフリカツメガエルＷＡ５４５由来のプライマーは、ｍＲＮＡ、ｃＤＭＡまたはゲノムＤＮＡ鋳型から対応ヒトＷＡ５４５または他の哺乳動物ＷＡ５４５をコードする配列を特異的に増幅することを可能にするであろう。上記方法の１つにより陽性の源が同定されたならば、オリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーによりｍＲＮＡを選択し、ｃＤＮＡを合成し、確立された方法（Tooleら、上記）により当業者に知られたＸｇｔ１０または他のバクテリオファージベクター、例えばλＺＡＰ中にクローンする。上記のオリゴヌクレオチドプライマーによる増幅を、バクテリオファージベクター中にクローンされた、すでに確立されているヒトｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーに対して直接行うこともできる。そのような場合、ヒトＷＡ５４５の一部をコードする、特異的に増幅されたＤＮＡ生成物を生じるライブラリーを、増幅されたＷＡ５４５をコードするＤＮＡのフラグメントをプローブとして用いて、直接スクリーニングすることができる。アフリカツメガエルＷＡ５４５ゲノムクローンのＤＮＡ配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーは、一般的に利用可能な、すでに確立されているヒトｃＤＮＡライブラリー（すなわち、Stratagene，La Jolla，CAまたはCl onethch Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA）由来のヒトＷＡ５４５をコードするＤＮＡ配列の増幅を可能にすると予想される。配列番号：１に示す配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、自動ＤＮＡ合成装置で合成する。プライマーに対応するヒトｃＤＮＡインサートを含有する約１ｘ１０⁶ｐｆｕ（プラーク形成単位）のλバクテリオファージライブラリーを９５℃で５分間変性させ、、ついで、２００μＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸(dATP，dGTP ，dCTPおよびdTTP)，10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，0.001%ゼラチン，1.25ユニットのTaq DNAポリメラーゼ，１００pMの各オリゴヌクレオチドプライマーを含有する反応混合物に添加する。ついで、反応混合物を下記サーマルサイクリングに供する：９４℃で１分、５０℃で１分、７２℃で１分を３９サイクル、ついで、７２℃で１０分。この反応により特異的に増幅して得られたＤＮＡ生成物を２％アガロースゲルで電気泳動した後、可視化する。このようにして陽性ｃＤＮＡ源が確認されたならば、ＷＡ５４５特異的配列が増幅された対応ｃＤＮＡライブラリーを、他のＷＡ５４５特異的プローブを用いて直接スクリーニングして、本発明の全長ＷＡ５４５蛋白をコードするｃＤＮＡクローンを同定および単離することができる。当業者に知られたさらなる方法を用いて、ヒトＷＡ５４５蛋白をコードする他の全長ｃＤＮＡ、または本発明のＷＡ５４５蛋白をコードする全長ｃＤＮＡクローンを、ヒト以外の種、特に、他の哺乳動物種から単離してもよい。別法として、オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、アフリカツメガエルＷＡ５４５をコードするプラスミドからヒトまたはネズミのＷＡ５４５に特異的なヌクレオチド配列を特異的に増幅することができる。以下のようにして増幅反応を行う：約２５ｎｇのアフリカツメガエルＷＡ５４５ＤＮＡを、２００ μＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸(dATP，dGTP，dCTPおよびdTTP)，10mM T ris-HCl pH8.3,50mM KCl,1.5mM MgCl₂,0.001%ゼラチン,1.25ユニットのTaq DNA ポリメラーゼ，１００pMの各オリゴヌクレオチドプライマー（アフリカツメガエルＷＡ５４５ＤＮＡセンスおよび相補的方向のものに対する）を含有する反応混合物に添加する。ついで、反応混合物を下記サーマルサイクリングに供する：９４℃で１分、５３℃で１分、７２℃で１分を３０サイクル。この反応により特異的に増幅されるＤＮＡは、ＷＡ５４５をコードする生成物を生じると考えられる。生じたＤＮＡ生成物を２％アガロースゲルで電気泳動した後、可視化する。ＷＡ５４５ＤＮＡフラグメントを含有するゲルの領域を切り出し、その中に含まれる特異的に増幅されたＤＮＡフラグメントを抽出する（電気溶出または当業者に知られた方法により）。ゲルから抽出されたＤＮＡ増幅生成物を³²Ｐで放射性標識し、ベクターλＤＡＳＨＩＩ（Stratageneカタログ番号９４５２０３）中に構築されたヒトゲノムライブラリーのスクリーニングに使用する。当業者に知られたさらなる方法を用い、本発明のＤＮＡおよびアミノ酸配列を使用して、ヒトおよび他の種のＷＡ５４５ホモログならびに関連蛋白を単離することもできる。実施例３Ｗ−２０バイオアッセイＡ．Ｗ−２０細胞の説明インジケーター細胞系としてのＷ−２０骨髄基質細胞の使用は、ＢＭＰ蛋白での処理後のこれらの細胞の骨芽細胞への変換に基づく［Thies et al.，Journal of Bone and Minaral Research，5:305（1990）;およびThieset al.，Endocrino logy，130:1318(1992)］。詳細には、Ｗ−２０細胞は、マサチューセッツ州ボストンのチルドレンズホスピタル（Children's Hospital）のD．Nathan博士の研究室の研究者により成体マウスから取られたクローン化された骨髄基質細胞系である。ある種のＢＭＰ蛋白でのＷ−２０細胞の処理は、（１）アルカリ性ホスファターゼ産生増加、（２）ＰＴＨにより刺激されるｃＡＭＰの誘導、および（３）細胞によるオステオカルシン（osteocalcin）合成の誘導を引き起こす。（１）および（２）は骨芽細胞の表現形に関連した特徴を示すが、オステオカルシン合成能は成熟骨芽細胞によってのみ示される特性である。さらにそのうえ、現在まで、我々は、ＢＭＰで処理した場合のみ起こるＷ−２０基質細胞の骨芽細胞様への変換を観察してきた。この様式において、ＢＭＰ処理されたＷ−２０細胞により示されるインビトロ活性は、ＢＭＰについて知られているインビボでの骨形成活性と相関がある。ＷＡ５４５のごとき新規骨誘導分子のＢＭＰ活性を比較することにおいて有用な２種のインビトロでの分析を以下に説明する。Ｂ．Ｗ−２０アルカリ性ホスファターゼ分析のプロトコールＷ−２０細胞を、９６ウェルの組織培養プレートにウェルあたり２００μｌの培地（１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび１００ユニット／ｍｌペニシリン＋１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥ）中１００００個の割合で撒く。９５％空気、５％ＣＯ₂のインキュベーター中３７ ℃において細胞を一晩付着させる。マルチチャンネルピペッターで各ウェルから２００μｌの培地を除去し、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤＭＥ中の同体積の試験試料で置換した。試験物質を３系で分析する。試験試料および標準をＷ−２０インジケーター細胞とともに２４時間インキュベーションする。２４時間後、３７℃のインキュベーターからプレートを取り出し、試験培地細胞をから除去する。Ｗ−２０細胞層をウェルあたり２００μｌのカルシウム／マグネシウム不含リン酸緩衝化セイラインで３回洗浄し、これらの洗液を捨てる。ガラス製装置で蒸留された５０μｌの水を各ウェルに添加し、次いで、分析プレートを急速に冷凍するためにドライアイス／エタノール浴に置く。凍結したら、分析プレートをドライアイス／エタノール浴から取り出し、３７℃で融解させる。この工程を２回以上繰り返して全部で３回の凍結融解工程を行う。工程終了後、膜結合アルカリ性ホスファターゼを測定に供する。５０μｌの分析混合物（５０ｍＭグリシン、０.０５％ Triton X-100、４ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭリン酸ｐ−ニトロフェノール、ｐＨ＝１０.３）を各分析ウェルに添加し、次いで、分析プレートを、１分間に６０回振盪しながら３７℃で３０分インキュベーションする。３０分間のインキュベーションの終わりに、１００μｌの０.２ＮＮａＯＨを各ウェルに添加し、分析プレートを氷上に置くことにより反応を停止する。各ウェルの分光学的吸光度を４０５ナノメーターの波長において読む。次いで、これらの値を既知標準と比較して各試料のアルカリ性ホスファターゼ活性の評価を行う。例えば、既知量のリン酸ｐ−ニトロフェノールを用いると、吸光度値が得られる。これを表Ｉに示す。既知量のＢＭＰに関する吸光度値を決定し、表ＩＩに示すような単位時間あたり開裂されたリン酸ｐ−ニトロフェノールのμモル数に変換することができる。次いで、これらの値を用いて既知量のＷＡ５４５の活性をＢＭＰ−２の活性と比較する。Ｃ．オステオカルシンＲＩＡプロトコールＷ−２０細胞を、２４ウェルのマルチウェル組織培養ディッシュの各ウェルに、２ｍｌのＤＭＥ（１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンを含有）中１０⁶個となるように撒く。９５％空気、５％ＣＯ₂中３７℃において細胞を一晩付着させる。翌日、培地を、２ｍｌの全体積中１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび試験物質を含有するＤＭＥに交換する。各試験物質を３系のウェルに入れる。試験物質をＷ−２０細胞とともに合計９６時間（４８時間目に同じ培地で培地交換）インキュベーションする。９６時間のインキュベーションの終わりに、各ウェルから５０μｌの試験培地を取り、マウスオステオカルシンについてのラジオイムノ分析を用いてオステオカルシン産生について分析を行う。分析の詳細は、マサチューセッツ州０２０７２、スタウトン、ペイジ・ストリート３７８のバイオメディカル・テクノロジーズ・インコーポレイテッド（Biomedical Techologies Inc.）により製造されたキットに説明がある。分析のための試薬は、製品番号ＢＴ−４３１（マウスオステオカルシン標準）、ＢＴ−４３２（ヤギ抗−マウスオステオカルシン）、ＢＴ −４３１Ｒ(ヨウ素化されたマウスオステオカルシン)、ＢＴ−４１５（正常ヤギ血清）およびＢＴ−４１４（ロバ抗−ヤギＩｇＧ）として見いだされる。ＢＭＰ処理に応答したＷ−２０細胞により合成されたオステオカルシンについてのＲＩＡを、製造者により提供されるプロトコールに記載されたようにして行う。試験試料に関して得られた値をマウスオステオカルシンの既知標準に関する値と比較し、既知量のＢＭＰ−２での処理に応答してＷ−２０細胞により産生されたオステオカルシン量と比較する。ＢＭＰ−２により誘導されたＷ−２０によるオステオカルシン合成量を表ＩＩＩに示す。実施例４ローゼン改変サムパス−レディアッセイ Sampath and Reddi，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，80:6591-6595(1983)に記載されたラット骨形成アッセイの改変バージョンを用いて骨および／または軟骨および／または他の結合組織におけるＢＭＰ蛋白の活性を評価する。サムパス− レディ法のエタノール沈殿工程を、アッセイすべきフラクションを水に対して透析（組成物が溶液の場合）または限界濾過（組成物が懸濁液の場合）することに置き換える。次いで、溶液または懸濁液を０.１％ＴＦＡに対して平衡化させる。得られた溶液を２０ｍｇのラットのマトリックスに添加する。蛋白処理していない疑似ラットマトリックス試料は対照として役立つ。この材料を凍結し、凍結乾燥して得られた粉末を５番のゼラチンカプセルに封入する。２１〜４９日齢のロング・エバンズ・ラット（Long Evans rat）の腹胸部の皮下にカプセルを移植する。インプラントを７〜１４日後に取る。各インプラントの半分をアルカリ性ホスファターゼアッセイ［Proc．Natl．Acad．Sci.，69:1601(1972)］に用いる。各インプラントのもう半分を固定し、組織学的分析用に処理する。１ミクロンのグリコメタクリレート切片をフォン・コッサおよび酸フクシンで染色して各インプラントにおいて誘導された骨および軟骨の形成の評点をつける。＋１ないし＋５は、新たな骨および／または軟骨細胞ならびにマトリックスにより占められたインプラントの各組織学的切片の面積を表す。＋５の評点は、インプラントの５０％よりも多くの部分が、インプラントにおける蛋白の直接の結果として生成された新たな骨および／または軟骨であることを示す。評点＋４、＋３、＋２および＋１は、それぞれ、インプラントの４０％、３０％、２０％および１０％よりも多くの部分が新たな軟骨および／または骨を含んでいることを示す。別法として、同じ方向に集密になった線維芽細胞の高密度の束の存在により容易に認識される胚性の腱に似た組織の出現についてインプラントを検査する［腱／靭帯様組織は、例えば、Ham and Cormack，Histology(JB Lippincott Co.)，1 979,pp.367-369に記載されており、その開示を参照により本明細書に記載されているものとみなす］。ＷＡ５４５蛋白含有インプラントにおいて腱／靭帯様組織を観察する、さらなるアッセイにおいてこれらの知見は再現されうる。本発明のＷＡ５４５蛋白をこの活性に関して評価してもよい。実施例５ＷＡ５４５の発現ネズミ、ヒトまたは他の哺乳動物のＷＡ５４５蛋白を製造するために、該蛋白をコードしているＤＮＡを適当な発現ベクター中に移し、慣用的な遺伝子工学的方法により哺乳動物細胞または他の好ましい真核細胞宿主もしくは原核細胞宿主中に導入する。生物学的に活性のある組み換えヒトＷＡ５４５の好ましい発現系は、安定に形質転換された哺乳動物細胞であると考えられる。当業者は、配列番号：１の配列、もしくはＷＡ５４５蛋白をコードしている他のＤＮＡ配列、あるいは他の修飾された配列およびｐＣＤ［Okayama et al.，Mo l．Cell Biol.，2:161〜170(1982)］、ｐＪＬ３、ｐＪＬ４［Gough et al.，EMB O J.，4:645〜653(1985)］ならびにｐＭＴ２ＣＸＭのごとき知られたベクターを用いることにより、哺乳動物発現ベクターを構築することができる。哺乳動物発現ベクターｐＭＴ２ＣＸＭは、ｐ９１０２３（ｂ）(Wong et al. ，Science，228:810〜815，1985)の誘導体であるが、テトラサイクリン耐性遺伝子の代わりにアンピシリン耐性遺伝子を有し、さらにｃＤＮＡクローン挿入のためのＸｈｏＩ部位を有することにおいてｐ９１０２３（ｂ）とは異なる。ｐＭＴ２ＣＸＭの機能的エレメントは記載されており（Kaufman，R．J．et al. ， 1985，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，82:689〜693）、アデノウイルスＶＡ遺伝子、７２塩基対のエンハンサーを含むＳＶ４０複製開始点、５’スプライス部位ならびにアデノウイルス後期ｍＲＮＡ上に存在するアデノウイルス三分節リーダー配列の大部分を含むアデノウイルス大後期プロモーター、３’スプライス受容部位、ＤＨＦＲ挿入断片、ＳＶ４０初期ポリアデニル化部位（ＳＶ４０）、およびイー・コリ（E．coli）中での増殖に必要なｐＢＲ３２２配列を含んでいる。ｐＭＴ２−ＶＷＦのＥｃｏＲＩ消化によりプラスミドｐＭＴ２ＣＸＭを得る。ｐＭＴ２−ＶＷＦは、受託番号ＡＴＣＣ６７１２２の下で、American Type Cu lture Collection(ATCC)，Rockville，MD(USA)に寄託されている。ＥｃｏＲＩ消化により、ｐＭＴ２−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡ挿入断片を切り出し、連結してイー・コリＨＢ１０１またはＤＨ−５をアンピシリン耐性へと形質転換するのに用いる直鎖状のｐＭＴ２を得る。プラスミドｐＭＴ２ＤＮＡを慣用的方法により調製することができる。次いで、ループアウト／イン変異誘発（loopout/in m utagenesis）［Morinaga et al.,Bio-technology,84:636(1984)］を用いてｐＭＴ２ＣＸＭを構築する。これにより、ｐＭＴ２のＳＶ４０複製開始点ならびにエンハンサー配列近傍のＨｉｎｄＩＩＩ部位に対応する塩基１０７５〜１１４５が除去される。さらに、そのヌクレオチド１１４５の位置に下記配列: を挿入する。この配列は制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩの認識部位を有する。ｐＭＴ２３と命名されたｐＭＴ２ＣＸＭの誘導体は、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩの認識部位を有する。プラスミドｐＭＴ２ＣＸＭおよびｐＭＴ２３ＤＮＡを慣用的方法により調製することができる。ｐＭＴ２１由来のｐＥＭＣ２β１も本発明の実施に適する。ｐＭＴ２１は、ｐＭＴ２−ＶＷＦ由来のｐＭＴ２に由来する。上記のごとく、ＥｃｏＲＩ消化により、ｐＭＴ−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡ挿入断片を切り出し、連結してイー・コリＨＢ１０１またはＤＨ−５をアンピシリン耐性へと形質転換するのに用いることのできる直鎖状のｐＭＴ２を得る。プラスミドｐＭＴ２ＤＮＡを慣用的方法により調製することができる。ｐＭＴ２１は、以下の２つの修飾を経てｐＭＴ２から誘導される。最初に、ｃＤＮＡクローニングのためのＧ／Ｃテイリングから伸長した１９個のＧ残基を含む、ＤＨＦＲｃＤＮＡの７６塩基対の５’非翻訳領域を欠失させる。この工程において、ＸｈｏＩ部位を挿入してＤＨＦＲのすぐ上流に下記配列：を得る。次いで、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩでの消化、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでの処理、そしてＣｌａＩリンカー（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）への連結により、単一のＣｌａＩ部位を導入する。これにより、２５０塩基対の断片がアデノウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡＩ）領域から欠失されるが、ＶＡＩＲＮＡ遺伝子の発現または機能は阻害されない。ｐＭＴ２１をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ベクターｐＥＭＣ２Ｂ１を得るために用いる。ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩでの消化により、ＥＭＣＶリーダーの一部がｐＭＴ２−ＥＣＡＴＩ［S．K．Jung et al.，J．Virol，63:1651〜1660（1989）］から得られ、これは２７５２塩基対のフラグメントである。このフラグメントをＴａｑＩで消化し、５０８塩基対のＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩフラグメントを得、これを低融点アガロースゲル上の電気泳動により精製する。下記配列を有する５’ＴａｑＩ突出末端および３’ＸｈｏＩ突出末端：を用いて６８塩基対のアダプターおよびその相補鎖を合成する。この配列は、ヌクレオチド７６３ないし８２７由来のＥＭＣウイルスリーダー配列に合致する。さらにこの配列は、ＥＭＣウイルスリーダー内の位置１０におけるＡＴＧがＡＴＴに変化しており、ＸｈｏＩ部位が後に続いている。ｐＭＴ２１のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメント、ＥＭＣウイルスのＥｃｏＲＩ −ＴａｑＩフラグメント、および６８塩基対のオリゴヌクレオチドアダプターの３つを連結してベクターｐＥＭＣ２β１を得る。このベクターは、ＳＶ４０複製開始点ならびにエンハンサー、アデノウイルス大後期プロモーター、アデノウイルス三分節リーダー配列の大部分のｃＤＮＡコピー、小型のハイブリッド介在配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルならびにアデノウイルスＶＡＩ遺伝子、ＤＨＦＲならびにβ−ラクタマーゼマーカーおよびＥＭＣ配列を含み、哺乳動物細胞における高レベルの所望ｃＤＮＡの発現の指令に適当に関連している。ベクターの構築はＷＡ５４５ＤＮＡ配列の修飾を包含する。例えば、コーディング領域の５’および３’末端上の非コーディングヌクレオチドを除去することにより、ＷＡ５４５ｃＤＮＡを修飾してもよい。欠失された非コーディングヌクレオチドを、発現に有益であることが知られている他の配列で置換してもよく、置換しなくてもよい。これらのベクターを、ＷＡ５４５蛋白の発現にとり適当な宿主細胞中に形質転換する。さらに、ＷＡ５４５をコードしているプロペプチド配列を欠失させ、他のＢＭＰ蛋白の完全なプロペプチドをコードしている配列に置き換えることにより成熟ＷＡ５４５蛋白を発現するように、配列番号：１の配列またはＷＡ５４５蛋白をコードしている他の配列を処理してもよい。当業者は、コーディング配列に隣接している哺乳動物の調節配列を除去するかまたは細菌の配列に置き換えて、細菌細胞による細胞内または細胞外発現用の細菌ベクターを作成することにより、配列番号：１の配列を処理することができる。例えば、コーディング配列をさらに処理することができる（例えば、他の既知リンカーに連結する、あるいはその非コーディング配列を欠失させるかまたは他の既知方法によりそのヌクレオチドを変化させる）。次いで、T．Taniguchi et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77:5230〜5233(1980)に記載されたような方法を用いて修飾されたＷＡ５４５コーディング配列を既知細菌ベクター中に挿入することができよう。次いで、この典型的な細菌ベクターを細菌宿主細胞中に形質転換し、それによりＷＡ５４５蛋白を発現させる。細菌細胞においてＷＡ５４５蛋白を細胞外発現させるための方法については、欧州特許公開ＥＰＡ１７７ ,３４３参照。昆虫細胞における発現には、昆虫ベクター構築のために同様の処理を行うことができる［例えば、公開された欧州特許出願第１５５,４７６号記載の方法参照］。酵母細胞による本発明因子の細胞内または細胞外発現のための酵母の調節配列を用いて、酵母ベクターを構築することもできる［例えば、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８６／００６３９および欧州特許出願公開ＥＰＡ１２３,２８９号記載の方法参照］。高レベルの本発明のＷＡ５４５蛋白を哺乳動物細胞において製造する方法は、異種ＷＡ５４５遺伝子の多数のコピーを有する細胞の構築を包含する。異種遺伝子を増幅可能なマーカー、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子に連結し、Kaufman and Sharp，J．Mol．Biol.，159:601〜629(1982)の方法により、メトトレキセート（ＭＸＴ）濃度を上昇させていって増加した遺伝子コピーを有する細胞を該マーカー関して選択できる。このアプローチを種々の異なる細胞タイプに使用することができる。例えば、リン酸カルシウム共沈ならびにトランスフェクション、エレクトロポーレーションまたはプロトプラスト融合をはじめとする種々の方法により、ＷＡ５４５蛋白の発現を可能にする他のプラスミドの配列に作動するように結合された本発明のＷＡ５４５蛋白に対するＤＮＡ配列を含むプラスミドと、ＤＨＦＲ発現プラスミドｐＡｄＡ２６ＳＶ（Ａ）３［Kaufman and Sharp，Mol．Cell．Biol .，2:1304(1982)］とを、ＤＨＦＲ欠損細胞ＤＵＫＸ−ＢＩＩ中に同時に導入することができる。ＤＨＦＲを発現する形質転換体を、透析されたウシ胎児血清を含むアルファ培地における増殖に関して選択し、次いで、Kaufman et al.,Mol.C ell.Biol.,5:1750(1983)記載のごとく、ＭＴＸ濃度を増加させていった場合（例えば順次、０.０２、０.２、１.０ついで５μＭのＭＴＸ）の増殖による増幅について選択を行う。形質転換体を増殖させ、生物学的に活性のあるＷＡ５４５の発現を、上記実施例３記載のローゼンにより改変されたサムパス− レディのラット骨形成分析によりモニターする。ＷＡ５４５蛋白の発現はＭＴＸ耐性レベルの増加に伴って増加するはずである。［³⁵Ｓ］メチオニンまたはシステインでのパルスラベリングおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動のごとき当該分野で知られた標準的方法を用いて、ＷＡ５４５ポリペプチドを特徴づける。同様の方法により他の関連ＷＡ５４５蛋白を製造することができる。実施例６発現されたＷＡ５４５の生物学的活性上記実施例５において得られた、発現されたＷＡ５４５蛋白の生物学的活性を測定するために、蛋白を細胞培養物から回収し、同時に産生された他の蛋白性物質ならびに他の混入物質からＷＡ５４５蛋白を単離することにより精製する。実施例４記載のラット骨形成分析により、精製蛋白を分析してもよい。当業者に知られた標準的方法を用いて精製を行う。銀染色［Oakley et al.，Anal．Biochem.，105:361(1980)］で染色されるＳＤＳ−ＰＡＧＥアクリルアミド［Laemmli，Nature，227:680(1970)］およびイムノブロット［Towbin et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，76:4350(1979)］のごとき標準的方法を用いて蛋白の分析を行う。実施例７ＷＡ５４５のノーザン分析ノーザン分析を用いて、ＷＡ５４５蛋白を、種々の細胞系に対する影響について試験することができる。適当な細胞系は、Ｅ１３マウス肢芽由来の細胞系を包含する。ＷＡ５４５蛋白での処理から１０日後、組織分化の状態について表現型を組織学的に調べる。さらに、ＷＡ５４５蛋白で処理した細胞由来のｍＲＮＡのノーザン分析を、表ＩＶに記載する骨、軟骨および／または腱／靭帯に関する下記マーカーの１つまたはそれ以上を包含する種々のマーカーについて行うこともできる。１−初期にマーカーが観察され、成熟骨組織が形成されるにつれマーカーが見られなくなる。２−マーカーは腱の部位に依存し、骨界面において最強。３−低レベルのマーカーが見られる。実施例８胚性幹細胞アッセイ本発明のＷＡ５４５蛋白の効果をアッセイするために、多くの利用可能な幹細胞系に対するインビボにおける増殖および分化の効果をアッセイすることが可能である。１のかかる細胞系はＥＳ−Ｅ１４ＴＧ２であり、Rockville，MDのAmeri can Type Culture Collectionから利用可能である。アッセイを行うために、１００ユニットのＬＩＦ存在下で細胞を増殖させて未分化状態に維持する。まず、ＬＩＦを除去し、細胞を凝集させて懸濁させる（胚様体として知られる状態）ことによりアッセイをセットアップする。３日後、胚様体をゼラチン被覆プレートに撒き（ＰＣＲ分析のためには１２ウェルプレート、免疫細胞化学的分析のためには２４ウェルプレートを用いる）、アッセイすべき蛋白で処理する。細胞に栄養分を与え、２〜３日毎に蛋白性因子で処理する。１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）補足培地またはずっと少量のＦＢＳを含有するＣＤＭ限定培地においてアッセイを行えるように細胞を適応させる。処理期間（７〜２１日の範囲）の終了時に細胞からＲＮＡを集め、以下のマーカーに関して定量的マルチプレックスＰＣＲにより分析する：中胚葉マーカーBr achyury、外胚葉マーカーＡＰ−２、および内胚葉マーカーＨＮＦ−３α。免疫細胞化学的分析により、神経細胞（グリア細胞およびニューロン細胞）、筋肉細胞（心筋細胞、骨格筋細胞および平滑筋細胞）分化を検出することができ、さらにプロテオグリカンコア蛋白（軟骨）およびサイトケラチン（表皮）のごとき種々の他の表現型マーカーの検出が可能である。これらの細胞はＬＩＦが除去された場合に自律的に分化する傾向があるので、常に無処理対照に対する比較により結果を定量する。実施例９ＷＡ５４５とアフリカツメガエル幼生胚とのインシトゥハイブリダイゼーションアルビノ胚を種々の段階において集め、固定し、プロテイナーゼＫで透過性にし、プレハイブリダイゼーションさせた。ついで、それらをジゴキシゲニン標識リボプローブと一晩ハイブリダイゼーションさせた。胚を洗浄し、ＲＮａｓｅＡおよびＴ１で処理してバックグラウンドを除去し、Boehringer Mannheim Blocki ng Reagentでブロックした。胚をアルカリ性ホスファターゼ抱合抗ジゴキシゲニン抗体とともに、室温で４時間インキュベーションし、徹底的に洗浄し、ついで、アルカリ性ホスファターゼ基質を用いる発色反応を行った。ついで、胚を再固定し、写真用に脱色してバックグラウンドを除去した。結果：発現の特徴インシトゥハイブリダイゼーションの結果（図１）およびＲＴ−ＰＣＲの現像結果（図２）は、ＷＡ５４５が母系転写物を有しておらず、後期胞胚の周辺帯およびいくつかの植物細胞において最初に発現されることを示す。原腸形成開始時に発現レベルが増大する。この高レベル発現は、原腸形成期間中は維持され、原腸形成後期段階において低下する。後期原腸胚までは、ＷＡ５４５発現は中胚葉側方および腹側においてやはり存在するが、脊索を形成する背側の大部分の領域からは排除される。周辺帯全体におけるこの遺伝子の初期の発現および後になってからの前部での制限は、ＷＡ５４５が前部の特徴を有する中胚葉の誘導および神経組織形成の修飾に関与しているという結論とよく対応する。実施例１０ＷＡ５４５の胚全体でのアッセイインビトロ合成された、キャップの付いたＲＮＡ５０ｐｇまたは１００ｐｇを、２細胞または４細胞段階のカエルの胚にマイクロインジェクションした。β− ガラクトシダーゼＲＮＡをトレーサーとして含ませて、注入したＲＮＡの拡散の程度を調べた。Ｘ−ｇａｌ染色によりβ−ｇａｌＲＮＡの生成物を組織化学的に可視化した。これらのマイクロインジェクションの標的領域は、２または４細胞のうち１の細胞の背側周辺帯または腹側周辺帯であった。胚を放置して所望段階まで発達させて、ついで、収穫して固定し、Ｘ−ｇａｌ染色および写真をとった。結果：胚全体におけるＷＡ５４５のゲイン−オブ−ファンクション（gain-of-fu nction）表現型初期胚の腹側へのマイクロインジェクションは、後の段階において二次脊椎の形成を引き起こす（図３）。この二次脊椎は頭部を含んでおらず、ＷＡ５４５は中胚葉後部のインデューサーであることが示される。初期胚の背側へのマイクロ部構造の損失を引き起こす（図４）。この観察結果は、ＷＡ５４５は前方組織をより後部の組織に変換させうることを示す。実施例１１アニマルキャップアッセイ２細胞段階の胚の１の細胞の動物極に５０ないし４００ｐｇのキャップしたＲＮＡをマイクロインジェクションした。グロビンＲＮＡを対照として使用した。胚を放置して段階８まで発達させた。胚の動物極の細胞を顕微解剖し（アニマルキャップ）、無傷の子孫が得られるまで培養し、マイクロインジェクションしない胚を段階１４または１９まで到達させた。同じＲＮＡ（実験系またはグロビン）をマイクロインジェクションした１５個のアニマルキャップをプールし、全ＲＮＡ調製に備えた。５個の無傷の胚を胚の対照全ＲＮＡの調製に使用した。ランダムヘキサマーをｃＤＮＡ用プライマーとして使用して、これらのＲＮＡ試料を逆転写した。これらのＤＮＡ試料を、³²Ｐ−ｄＣＴＰ存在下で遺伝子特異的プライマーペアーを用いるＰＣＲに供して、元のＲＮＡ試料中の対応ｍＲＮＡの存在についてアッセイした。使用プライマーペアーおよびサイクル数を従来通り最適化した。ついで、これらのＰＣＲ反応の生成物をポリアクリルアミドゲルで分離した。結果：アニマルキャップのゲイン−オブ−ファンクションアッセイ分子マーカーについての試験は、大部分の中胚葉マーカーがアニマルキャップのアッセイにおいて誘導されることを示す（図５）。これらのマーカーは、brac hyury、Pintallavis、Xnotおよび筋肉アクチンを包含する。組織学的には、筋肉の大きな塊が形成される。試験した神経マーカーのうち、Ｋｒｏｘ２０は誘導されないが、ＨｏｘＢ９は誘導される。通常には、Ｋｒｏｘ２０は菱脳神経小片３および５において発現され、ＨｏｘＢ９は脊髄後部で発現される。これらの結果は、ＷＡ５４５は中胚葉後部を誘導するが、中胚葉前部（ゴーセコイド）を誘導せず、神経（ＮＣＡＭ）遺伝子は活性化されないことを示す。さらにこのことは、ＷＡ５４５は中胚葉の後部の特徴のインデューサーであり、脳から脊髄に至るまでの神経の運命を変化させうるものであるという考えを支持する。実施例１２ＷＡ５４５に関する結果のまとめＷＡ５４５は後期胞胚から中胚葉および内胚葉までの期間において発現される。それは後になって中胚葉後部において発現される。よって、ＷＡ５４５は後部領域の形成に関与している可能性があり、筋肉および脊髄の発達における異所性活性化に有用である可能性がある。上記説明は本発明の目下好ましい具体例を詳細に説明する。これらの説明を考慮すれば、本発明の実施に際し、多くの修飾および変更が当業者によりなされると考えられる。それらの修飾および変更は本発明の一部であり、添付した請求の範囲に包含されると確信する。本明細書で引用されたすべての刊行物および特許出願の開示を、参照により本明細書に記載されているものとみなす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １１１Ｃ０７Ｋ 14/51 Ｃ０７Ｋ 14/46 16/22 14/51 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/22 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ラバリー，エドワード・アールアメリカ合衆国01876マサチューセッツ州トゥークスベリー、グリーン・メドー・ドライブ90番 (72)発明者レイシー，リサ・エイアメリカ合衆国01720マサチューセッツ州アクトン、スクール・ストリート124番 (72)発明者サイブ，ヘイゼルアメリカ合衆国02158マサチューセッツ州ニュートン、サン・ヒル・レイン６番 (72)発明者サン，ベンジャミンアメリカ合衆国21043メリーランド州エリコット・シティ、ロックバーン7771番

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）配列番号：１に示すヌクレオチド５５、７７５または８１１からヌクレオチド１１１３または１１１６まで；（ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）にハイブリダイゼーションし、ＷＡ５４５活性を示す蛋白をコードしている配列からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む、ＷＡ５４５関連蛋白をコードする単離ＤＮＡ配列。２．（ａ）配列番号：２に示すアミノ酸−２４０、１または１３から１１３または１１４までをコードするヌクレオチド；（ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）にハイブリダイゼーションし、ＷＡ５４５活性を示す蛋白をコードする配列からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む、ＷＡ５４５蛋白をコードする単離ＤＮＡ配列。３．発現制御配列に作動するように連結された請求項１のＤＮＡ分子を含むベクター。４．発現制御配列に作動するように連結された請求項２のＤＮＡ分子を含むベクター。５．請求項３のベクターで形質転換された宿主細胞。６．請求項４のベクターで形質転換された宿主細胞。７．中胚葉または関連組織の形成を誘導する能力により特徴づけられる蛋白をコードする配列を有する単離ＤＮＡ分子であって、（ａ）配列番号：１に示すヌクレオチド５５、７７５または８１１からヌクレオチド１１１６まで；および（ｂ）（ａ）の天然に存在する対立遺伝子配列および等価な縮重コドン配列からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子。８．発現制御配列に作動するように連結された請求項７のＤＮＡ分子を含むベクター。９．請求項８のベクターで形質転換された宿主細胞。１０．ＷＡ５４５蛋白をコードする単離ＤＮＡ分子であって、配列番号：２に示すアミノ酸−２４０、１または１３から１１４までを含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含む単離ＤＮＡ分子。１１．ＤＮＡコーディング配列の５’側の適当なプロペプチドをコードしており、ＤＮＡコーディング配列にインフレームで連結されているヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１０記載の単離ＤＮＡ分子。１２．発現制御配列に作動するように連結された請求項１１のＤＮＡ分子を含むベクター。１３．請求項１２のベクターで形質転換された宿主細胞。１４．下記工程：（ａ）ＷＡ５４５蛋白をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を培養し；ついで、（ｂ）該ＷＡ５４５蛋白を培地から回収し、精製するを含む、精製ＷＡ５４５蛋白の製造方法。１５．下記工程：（ａ）ＷＡ５４５蛋白をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２記載のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を培養し；ついで、（ｂ）該ＷＡ５４５蛋白を培地から回収し、精製するを含む、精製ＷＡ５４５蛋白の製造方法。１６．下記工程：（ａ）ＷＡ５４５蛋白をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項７記載のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を培養し；ついで、（ｂ）該ＷＡ５４５蛋白を培地から回収し、精製するを含む、精製ＷＡ５４５蛋白の製造方法。１７．配列番号：１のＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸を必須として含むアミノ酸配列を含み、ＷＡ５４５活性を示す精製ＷＡ５４５ポリペプチド。１８．アミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸配列の機能的フラグメントを含むものであり、ＷＡ５４５活性を示す請求項１７のＷＡ５４５ポリペプチド。１９．ポリペプチドがダイマーであり、各サブユニットが配列番号：２のアミノ酸１から１１４までのアミノ酸配列を必須として含むアミノ酸配列を含むものである請求項１７の精製ＷＡ５４５ポリペプチド。２０．ポリペプチドがダイマーであり、１のサブユニットが配列番号：２のアミノ酸１から１１４までのアミノ酸配列を含み、もう１つのサブユニットがＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５およびＢＭＰ−１６からなる群より選択される骨形態形成蛋白のアミノ酸配列を含むものである請求項１７の精製ＷＡ５４５ポリペプチド。２１．下記工程：（ａ）配列番号：１に示すヌクレオチド７７５からヌクレオチド１１１６までのヌクレオチド配列を含むＤＮＡで形質転換された細胞を培養し、ついで、（ｂ）配列番号：２のアミノ酸１から１１４までのアミノ酸配列を含む蛋白を培地から回収し、精製するにより製造される精製ＷＡ５４５蛋白。２２．治療量の請求項１７記載の少なくとも１種のＷＡ５４５蛋白を含む組成物。２３．該組成物を支持し、組織成長を誘導するための表面を提供するマトリックスをさらに含む請求項２２の組成物。２４．該マトリックスがヒドロキシアパタイト、ヒアルロン酸、コラーゲン、ポリ乳酸およびリン酸三石灰からなる群より選択される材料を含むものである請求項２３の組成物。２５．組織形成を必要とする患者における組織形成を誘導する方法であって、有効量の請求項２２の組成物を患者に投与することを含む方法。２６．ＷＡ５４５ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に正しい読み枠で連結された、蛋白のＴＧＦ−βファミリーのメンバー由来のプロペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むキメラＤＮＡ分子。２７．配列番号：２のアミノ酸１から１１４までのアミノ酸配列を含む精製ＷＡ５４５蛋白。２８．約１０〜１５ｋｄの分子量を有するモノマー形態の精製ＷＡ５４５蛋白であって、配列番号：２のアミノ酸配列を含み、中胚葉組織の形成を誘導する能力を有する蛋白。２９．請求項１７記載の精製ＷＡ５４５蛋白に対する抗体。