JP2001500737A

JP2001500737A - 骨形態形成蛋白―１６（ｂｍｐ―１６）組成物

Info

Publication number: JP2001500737A
Application number: JP10514651A
Authority: JP
Inventors: セレステ，アンソニー・ジェイ; マーレー，ベス・エル
Original assignee: ジェネティックス・インスチチュート・インコーポレーテッド
Priority date: 1996-09-18
Filing date: 1997-07-09
Publication date: 2001-01-23
Also published as: WO1998012322A1; US6623934B2; FI990596A0; KR20000036012A; NO991271L; OA10997A; US20030158379A1; CA2265508A1; FI990596A; US6331612B1; CA2265508C; US5965403A; EP0941323A1; NO991271D0

Abstract

(57)【要約】ＢＭＰ−１６蛋白およびその製造方法を開示する。ＢＭＰ−１６蛋白をコードするＤＮＡ分子も開示する。骨、軟骨、腱、靭帯および半月板を含む他の結合組織の欠損および疾病の治療に、傷の治癒および関連組織の修復に、ならびに表皮、神経、心筋を含む筋肉を包含する組織、および他の組織、および肝臓、肺、心臓、膵臓および腎臓組織のごとき器官の疾病および欠損、ならびに傷の治療に本発明蛋白を使用してもよい。また本発明蛋白は未分化胚性細胞および幹細胞の増殖および／または分化の誘導にも有用でありうる。

Description

【発明の詳細な説明】骨形態形成蛋白−１６（ＢＭＰ−１６）組成物本発明は、骨形態形成蛋白−１６（ＢＭＰ−１６）およびＢＭＰ−１６関連蛋白と命名された新規ファミリーの精製蛋白、それらをコードしているＤＮＡ、ならびにそれらの製造方法に関する。これらの蛋白を用いて骨および／または軟骨または結合組織の形成を誘導してもよく、さらに傷の治療および組織の修復に用いてもよい。また、これらの蛋白を他の蛋白骨形態形成蛋白活性を増大させるために用いてもよい。発明の背景骨および他の組織抽出物中に存在する骨、軟骨および他の結合組織の誘導活性に関与する分子の検索は、骨形態形成蛋白（ＢＭＰ）と呼ばれる新規セットの分子の発見につながった。ＢＭＰ−１からＢＭＰ−１５と命名されたいくつかの蛋白の構造がすでに詳細に調べられている。これらの蛋白のユニークな誘導活性は、それらが骨に存在することとあいまって、それらは骨修復プロセスにおいて重要なレギュレーターであり、骨組織の正常な維持に関与しているかもしれないということを示唆する。これらのプロセスにおいて役割を果たすさらなる蛋白が存在するかどうかを確認することが必要である。本発明は、かかる蛋白の同定に関するものであり、本発明者らはこれをヒトＢＭＰ−１６と命名した。ヒトＢＭＰ−１６はノダル（Nodal）と呼ばれるネズミ蛋白のヒト相同体であるノダルのヌクレオチドおよびアミノ酸配列はZhou et al.，Nature，361:543-5 47(1993)に記載されている。ネズミのノダル遺伝子は原腸形成期間中のマウス結節において発現されると記載されている。ネズミのノダル遺伝子に対するレトロウイルスにより誘導される挿入的変異は、通常は原始線条に関連した中胚葉細胞タイプの不存在を引き起こし、胚にとり致命的である。Conlon et al.,Developm ent 120:1919-1928(1994);Conlon et al.,Development 111:969-981(1991)。発明の概要本明細書の用語「ＢＭＰ−１６蛋白」は、配列番号：２において特定されるアミノ酸配列を有するヒトＢＭＰ−１６蛋白をいい、さらに配列番号：１に示す生の（native）ヒト配列のごとき、ＢＭＰ−１６蛋白をコードするＤＮＡ配列もいう。配列番号：１および２の天然に存在する対立遺伝子配列、ならびに上記配列の等価な縮重コドン配列も包含される。ＢＭＰ−１６ＤＮＡ配列（配列番号：１）およびアミノ酸配列（配列番号：２）をを配列表に示す。ＢＭＰ−１６蛋白は、軟骨、骨、または他の結合組織、またはそれらの組み合わせの形成を誘導する能力がある。ラット・骨形成アッセイにおける軟骨および／または骨および／または他の結合組織の形成活性については後述する。さらにＢＭＰ−１６蛋白は、胚性細胞および／または幹細胞の増殖および／または分化に対する影響を示すことによっても特徴づけられる。よって、本発明蛋白および組成物は、胚性細胞または幹細胞の集団のごとき細胞集団を処理して細胞の増殖および／または分化を促進または豊富化させることができる。配列番号：１に示すヌクレオチド５１１からヌクレオチド８４０までを含むＤＮＡで形質転換された細胞を培養し、次いで、配列番号：２に示すアミノ酸１からアミノ酸１１０までを含むアミノ酸配列により特徴づけられ、同時生成される他の蛋白性物質を実質的に含まない蛋白を培地から回収し精製することにより、ヒトＢＭＰ−１６を製造してもよい。哺乳動物細胞における製造のためには、ＤＮＡ配列は、成熟ＢＭＰ−１６ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列にイン・フレーム(in frame)で結合している適当な５’側のプロペプチドをコードしているＤＮＡ配列をさらに含む。プロペプチドは生のＢＭＰ−１６関連プロペプチドであってもよく、あるいはＴＧＦ−βスーパーファミリーの別の蛋白由来のプロペプチドであってもよい。生のＢＭＰ−１６プロペプチドを用いる場合、配列番号：１に示すヌクレオチド１から８４０までを含む、全ＢＭＰ−１６ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を用いて形質転換された細胞を培養し、配列番号：２に示すアミノ酸−１７０から１１０までを含むアミノ酸配列（アミノ酸配列−１７０から−１まではヒトＢＭＰ−１６の生のプロペプチドを含む）により特徴づけられる蛋白を得て、ついで、配列番号：２に示すアミノ酸１から１１０までを含むアミノ酸配列により特徴づけられ、同時生成される他の蛋白性物質を実質的に含まない蛋白を培地から回収し精製することにより、ヒトＢＭＰ−１６を製造してもよい。他の種、特にヒト種はヒトＢＭＰ−１６蛋白に対して相同的なＤＮＡ配列を有すると期待される。それゆえ、本発明は、ヒトＢＭＰ−１６蛋白をコードしているＤＮＡ配列、それらの方法により得られるＤＮＡ配列、およびそれらのＤＮＡ配列によりコードされるヒト蛋白の取得方法を包含する。この方法は、ヒト遺伝子またはコーディグ配列またはそのフラグメントを求めて標準的方法を用いてライブラリーをスクリーニングするためのプローブを設計するための、ヒトＢＭＰ −１６蛋白のヌクレオチド配列またはその一部分の使用を伴う。よって、本発明は、ヒトＢＭＰ−１６に対して相同的でありヒトＢＭＰ−１６配列を用いて得ることのできる他の種由来のＤＮＡ配列を包含する。また本発明は、ヒトＢＭＰ− １６蛋白の機能的フラグメント、およびかかる機能的フラグメントをコードするＤＮＡ配列、ならびに他の関連蛋白の機能的フラグメントを包含する。かかるフラグメントを機能させる能力は、ＢＭＰ−１６蛋白のアッセイに関して説明される生物学的アッセイにおける蛋白のアッセイにより調べることができる。完全な成熟ヒトＢＭＰ−１６蛋白をコードしているＤＮＡ配列（配列番号：１）および対応アミノ酸配列（配列番号：２）を本明細書に示す。ヒトＢＭＰ−１６ＤＮＡ配列のごとき関係のあるＤＮＡ配列で形質転換された細胞を培養し、ついで、ＢＭＰ−１６のごとき蛋白を培地から回収することにより、ヒトＢＭＰ−１６のごとき本発明ＢＭＰ−１６蛋白を製造してもよい。精製された発現蛋白は、同時生成される他の蛋白性物質ならびに他の混入物質を実質的に含まない。回収された精製蛋白は、軟骨および／または骨および／または結合組織形成活性を示すと考えられる。よって、後に説明するラット・骨形成アッセイにおいて軟骨および／または骨および／または他の結合組織の形成活性を示す能力により、本発明蛋白をさらに特徴づけてもよい。さらに、胚性細胞および／または幹細胞の増殖および／または分化に対する影響を示す能力によりＢＭＰ−１６蛋白を特徴づけてもよい。よって、本発明蛋白または組成物を、細胞の増殖および／または分化を促進または豊富化する能力により特徴づけてもよい。本発明のもう１つの態様は、医薬上許容される賦形剤または担体中の治療上有効量のヒトＢＭＰ−１６蛋白を含有する医薬組成物を提供する。これらの本発明組成物を骨の形成に使用してもよい。さらに、軟骨、または腱、靭帯、半月のごとき他の結合組織、ならびに上記のものの組み合わせ、例えば、骨に対する腱の結合部分の再生のためにこれらの組成物を用いてもよい。ヒトＢＭＰ−１６の組成物ごとき本発明組成物を傷の治療および組織の修復に用いてもよい。本発明組成物はさらに、少なくとも１種の他の治療上有用な作用剤、例えば、米国特許第５,１０８,９２２、５,０１３,６４９、５,１１６,７３８、５,１０６,７４８、５,１８７,０７６ならびに５,１４１,９０５号に開示のＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７；ＰＣＴ出願公開ＷＯ９３／１８０９８に開示のＢＭＰ−８；およびＰＣＴ出願公開ＷＯ９３／００４３２に開示のＢＭＰ−９；ＰＣＴ出願公開ＷＯ９４／２６８９３に開示のＢＭＰ−１０；ＰＣＴ出願公開ＷＯ９４／２６８９２に開示のＢＭＰ−１１、１９９４年１２月２２日出願の同時係属出願第０８／３６２６７０号に開示のＢＭＰ−１２またはＢＭＰ−１３、または１９９５年５月１８日出願の同時継続出願第０８／４４６，９２４号に開示されたＢＭＰ−１５を含んでいてもよい。有用でありうる他の組成物は、Ｖｇｒ−２およびＧＤＦ（ＰＣＴ出願公開ＷＯ９４／００３１４０；ＷＯ９４／１５９４９；ＷＯ９５／０１８０１；ＷＯ９５／０１８０２；ＷＯ９４／２１６８１；ＷＯ９４／１５９６６および他のものに記載されているものを含む）を含んでいてもよい。ＷＯ９４／０１５５７に開示のＢＩＰ；およびＰＣＴ出願公開ＷＯ９３／１６０９９に開示のＭＰ５２も本発明において有用でありうる。上記の全出願の開示を、参照により本明細書に記載されているものとみなす。本発明組成物は、ＢＭＰ−１６関連蛋白のほかに、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ− β）、アクチビン、インヒビン、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）を包含する他の治療上有用な作用剤を含んでなっていてもよい。また、組成物は、適当なマトリックス、例えば、組成物を保持し、骨および／または軟骨の成長のための表面を提供するようなマトリックスを含有していてもよい。マトリックスは、骨誘導性蛋白のゆっくりとした放出および／またはその存在のための適切な環境を提供しうるものであってもよい。本発明ＢＭＰ−１６含有組成物を、多くの骨および／または軟骨の欠損、歯周病ならびに種々の形態の組織および傷の治療に使用してもよい。治療されうる組織および傷は、上皮、神経、筋肉（心筋を包含）、および他の組織および傷、ならびに肝臓、肺、心臓、膵臓および腎臓組織のごとき他の器官を包含する。本発明によれば、これらの方法は、かかる骨および／または軟骨および／または結合組織の形成、傷の治癒あるいは組織の修復を必要とする患者に有効量のＢＭＰ− １６蛋白を投与することを含む。ＢＭＰ−１６含有組成物を用いて、骨関節炎、骨粗鬆症のごとき症状、および骨、軟骨、筋肉、腱、靭帯または他の結合組織、肝臓、肺、心臓、膵臓および腎臓組織のごとき器官、ならびに他の組織の他の異常を治療または予防してもよい。またこれらの方法は、上記の少なくとも１種の他のＢＭＰ蛋白と組み合わせて本発明蛋白を投与することを伴う。さらに、これらの方法は、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、アクチビン、インヒビンおよびＩＧＦを包含する他の増殖因子とともにＢＭＰ−１６蛋白を投与することも含む。本発明のさらなる態様は、ＢＭＰ−１６蛋白の発現をコードするＤＮＡ配列である。かかる配列は、配列番号：１に示された３’から５’方向へのヌクレオチド配列、遺伝コードの縮重を除いては配列番号：１のＤＮＡ配列と同じＤＮＡ配列であって配列番号：２の蛋白をコードしているＤＮＡ配列を包含する。さらに、厳密な条件下で配列番号：１のＤＮＡ配列とハイブリダイズし、軟骨および／または骨の形成を誘導する能力を有する蛋白をコードしているＤＮＡ配列も本発明に包含される。好ましいＤＮＡ配列は、厳密な条件下［T Maniatis et al,Mol ecular Cloning(A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor Laboratory 1982,3 87〜389参照］でハイブリダイズするＤＮＡ配列である。かかるＤＮＡ配列が、配列番号：２に示す成熟ヒトＢＭＰ−１６アミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性を有するポリペプチドをコードしていることが一般的に好ましい。結局、配列番号：１の配列の対立遺伝子変種または他の変種も、ヌクレオチド変化がペプチド配列の変化をもたらすか否かにかかわらず、その配列がＢＭＰ−１６活性を有する場合には本発明に包含される。また本発明は、ＢＭＰ−１６蛋白の活性を保持しているポリペプチドをコードする、配列番号：１に示すＢＭＰ−１６のＤＮＡ配列のフラグメントも包含する。本発明ＤＮＡ配列は、例えば、細胞集団中のＢＭＰ−１６をコードするｍＲＮＡの検出用プローブとして有用である。よって、本発明は、ＢＭＰ−１６遺伝子に関連した遺伝病、あるいはＢＭＰ−１６が不規則に転写または発現される細胞、器官または組織の疾病を包含する疾病の検出または診断方法を包含する。本発明ＤＮＡ配列は、下記の遺伝子治療に適用されるベクターの調製にも有用である。本発明のさらなる態様は、作動するように発現調節配列に連結された上記ＤＮＡ配列を含むベクターを包含する。作動するように発現調節配列に連結されたＢＭＰ−１６蛋白をコードしているＤＮＡ配列で形質転換された細胞系を適当な培地で培養し、そこからＢＭＰ−１６蛋白を回収し精製する、本発明の新規ＢＭＰ −１６蛋白製造方法において、これらのベクターを使用することができる。この方法には、多くの知られた真核細胞および原核細胞双方を該ポリペプチド発現のための宿主として使用することができる。ベクターを遺伝子治療に適用してもよい。かかる使用において、インビトロでベクターを患者の細胞中にトランスフェクションし、次いで、細胞を患者に再導入することができる。別法として、標的トランスフェクションにより、インビボでベクターを患者に導入してもよい。本発明のさらなる態様はＢＭＰ−１６蛋白またはポリペプチドである。かかるポリペプチドは、配列番号：２に示す配列を含むアミノ酸配列、配列番号：２のアミノ酸配列の変種（天然に存在する対立遺伝子変種を包含）、ならびに他の変種（軟骨および／または骨および／または他の結合組織、あるいは肝臓、肺、心臓、膵臓および腎臓組織のごとき他の器官の形成を誘導する能力、あるいはＢＭＰ−１６に特徴的な他の活性を保持している）のアミノ酸配列を有することによって特徴づけられる。好ましいポリペプチドは、配列番号：２に示す成熟ヒトＢＭＰ−１６アミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性を有するポリペプチドを包含する。結局のところ、かかるアミノ酸の変化が突然変異、化学的変化またはＤＮＡ配列の変化により誘発されたかどうかにかかわらず、配列番号：２の配列の対立遺伝子変種または他の変種も本発明に包含される。また本発明は、ＢＭＰ−１６蛋白の活性を保持している、配列番号：２に示すＢＭＰ−１６のアミノ酸配列のフラグメントを包含する。抗体製造の分野において知られている方法を用い、本発明精製蛋白を用いてヒトＢＭＰ−１６および／または他のＢＭＰ−１６関連蛋白に対する抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を得てもよい。抗体はＢＭＰ−１６および／または他のＢＭＰ−１６関連蛋白の精製、あるいはＢＭＰ−１６関連蛋白の効果の抑制または防止に有用でありうる。本発明蛋白または組成物は、胚性細胞または幹細胞のごとき比較的分化していない細胞集団を処理して細胞の増殖および／または分化を促進することにも有用でありうる。処理された細胞集団は遺伝子治療への適用に有用でありうる。配列の説明配列番号：１は、成熟ヒトＢＭＰ−１６ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列である。配列番号：２は、成熟ヒトＢＭＰ−１６ポリペプチド配列を含むアミノ酸配列である。配列番号：３は、ヒトＢＭＰ−１６ポリペプチドに対するゲノムＤＮＡの第２エキソンのヌクレオチド配列である。配列番号：４は、ヒトＢＭＰ−１６ポリペプチドに対するゲノムＤＮＡの第３エキソンのヌクレオチド配列である。発明の詳細な説明ネズミＢＭＰ−１６関連ＤＮＡ配列の全体またはフラグメント、または部分ヒトＢＭＰ−１６配列をプローブとして用いて本発明ヒトＢＭＰ−１６配列を得る。したがって、ヒトＢＭＰ−１６ＤＮＡ配列は、配列番号：１のヌクレオチド１から８４０までのＤＮＡ配列を含む。このヒトＢＭＰ−１６ＤＮＡ配列は、Ge nbank受託番号Ｘ７０５１４において説明されたネズミのノダルＤＮＡ配列のヌクレオチド５２６から１３９３までとよく対応する。ヒトＢＭＰ−１６蛋白は、配列番号：２のアミノ酸−１７０から１１０までの配列を含む。成熟ヒトＢＭＰ −１６蛋白は配列番号：１のヌクレオチド５１１から８４０までによりコードされ、配列番号：２のアミノ酸１から１１０までの配列を含む。ヒトＢＭＰ−１６蛋白は、ＣＨＯ細胞のごとき哺動物細胞により発現された場合、種々のＮ末端を有するＢＭＰ−１６蛋白の不均一な集団として存在すると考えられる。活性種は、配列番号：２のアミノ酸１０のシステイン残基から開始するアミノ酸配列を含むか、あるいはＮ末端方向のさらなるアミノ酸配列を含むであろうと考えられる。かくして、活性ＢＭＰ−１６蛋白をコードしているＤＮＡ配列は、配列番号：１のヌクレオチド１、５１１もしくは５３８から８３７もしくは８４０までを含むであろう。したがって、ヒトＢＭＰ−１６の活性種は、配列番号：２のアミノ酸−１７０、１もしくは１０から１０９もしくは１１０までを含むと考えられる。宿主細胞による蛋白の分泌に適するプロペプチドをコードしているコーディグ配列であって成熟成熟ＢＭＰ−１６蛋白に対するコーディング配列の正しい読み枠において連結されているコーディング配列で宿主細胞を形質転換してもよい。例えば、米国特許第５,１６８,０５０号には、ＢＭＰ−２以外の哺乳動物蛋白の前駆体部分をコードしているＤＮＡが成熟ＢＭＰ−２部分をコードしているＤＮＡに融合されていることが開示されており、参照によりその開示を本明細書に記載されているものとみなす。かくして、本発明は、ＢＭＰ−１６以外の蛋白のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー由来のプロペプチドをコードしているＤＮＡ配列であって、ヒトＢＭＰ−１６蛋白または関連蛋白をコードしているＤＮＡ配列の正しい読み枠に連結しているＤＮＡ配列を含むキメラＤＮＡ分子を包含する。「キメラ」なる用語は、プロペプチドがＢＭＰ−１６蛋白とは異なるポリペプチド由来であることを意味するために用いられる。イー・コリ（E.coli）で発現させることによりヒトＢＭＰ−１６の１の活性種のＮ末端は実験的に次のように決定されると考えられる：［Ｍ］ＨＨＬＰＤＲＳＱＬＣ。よって、このＢＭＰ−１６種のN末端は配列番号:１のアミノ酸１におけるものであり、該ＢＭＰ−１６種をコードしているＤＮＡ配列は配列番号：１のヌクレオチド５１１から８４０までを含むであろう。ヒトＢＭＰ−１６モノマーの見かけの分子量はNovex １６％トリシンゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより実験的に１３ｋｄと決定される。ヒトＢＭＰ−１６蛋白は、無色透明の０.１％トリフルオロ酢酸溶液として存在すると考えられる。また、ＣＨＯ細胞のごとき哺乳動物細胞により発現される他のＢＭＰ−１６蛋白は、種々のＮ末端を有するＢＭＰ−１６蛋白の活性種の不均一集団として存在する。例えば、ヒトＢＭＰ−１６蛋白は、配列番号：２のアミノ酸１０におけるシステイン残基から開始するアミノ酸配列を含むか、あるいはＮ末端方向のさらなるアミノ酸配列を含むであろう。よって、活性ＢＭＰ−１６蛋白をコードしているＤＮＡ配列は、配列番号：１のヌクレオチド５１１もしくは５３８から８３７もしくは８４０までを含むヌクレオチド配列を含むと考えられる。したがって、活性ヒトＢＭＰ−１６蛋白は、配列番号：２のアミノ酸１もしくは１０から１０９もしくは１１０までを含むアミノ酸配列を含む。本発明ＢＭＰ−１６蛋白は、モノマー形態で約１３ｋｄの分子量を有するポリペプチドを包含し、該ポリペプチドは配列番号：２のアミノ酸配列を含み、実施例において説明するローゼン改変サムパス−レディ異所性インプラントアッセイ（Rosen-Modified Sampath-Reddi ectopic implant assay）において、軟骨および／または骨および／または他の結合組織の形成を誘導する能力を有する。培地から回収されたＢＭＰ−１６蛋白を、同時産生される他の蛋白性物質および存在する他の汚染物質から単離することにより精製する。例えば、下記ラット骨形成分析における軟骨および／または骨および／または結合組織の形成を誘導する能力により、ＢＭＰ−１６蛋白を特徴づけてもよい。さらに、胚性細胞および／または幹細胞の増殖および／または分化に対する影響によりＢＭＰ−１６蛋白を特徴づけてもよい。よって、本発明蛋白または組成物を下記の胚性幹細胞アッセイにより特徴づけてもよい。本発明により提供されるＢＭＰ−１６蛋白は、配列番号：１と類似の配列によりコードされているが天然に修飾がなされている（例えば、ポリペプチドにおけるアミノ酸変化を引き起こしうるヌクレオチド配列中の対立遺伝子変種）かまたは人工的に誘導体化されている因子も包含する。例えば、合成ポリペプチドが、配列番号：２のアミノ酸残基の連続した配列のすべてまたは一部分を複製したものであってもよい。これらの配列は、一次、二次または三次構造およびコンホーメーションの特徴を配列番号：２の骨増殖因子ポリペプチドと共有することにより、それらに共通した骨増殖因子の生物学的特性を有することができる。例えば、蛋白の構造およびコンホーメーションを有意に変化させず、生物学的特性を維持させつつ多くの保存的アミノ酸置換が可能であることが知られている。例えば、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）およびヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）のごとき塩基性側鎖を有するアミノ酸間；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）およびグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）のごとき酸性側鎖を有するアミノ酸間；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）およびチロシン（ＴｙｒまたはＹ）のごとき荷電していない極性側鎖を有するアミノ酸間；ならびにアラニン（ＡｌａまたはＡ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはI ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）およびシステイン（ＣｙｓまたはＣ）のごとき無極性側鎖を有するアミノ酸間において保存的アミノ酸置換が可能であることが認識されている。よって、生のＢＭＰ−１６に対するこれらの修飾物および欠失物を天然に存在するＢＭＰ−１６および他のポリペプチドの生物学的活性置換物として治療プロセスに用いてもよい。ＢＭＰ −１６およびＢＭＰ−１６変種の両方を実施例記載のアッセイに供することにより、ＢＭＰ−１６変種がＢＭＰ−１６の生物学的活性を有しているかどうかを容易に決定することができる。本明細書記載のＢＭＰ−１６連蛋白の配列に対する他の特別な変異は、グリコシレーション部位の修飾を包含する。これらの修飾は、Ｏ−結合型またはＮ−結合型グリコシレーション部位を包含する。例えば、グリコシレーションの不存在または部分的にのみ行われたグリコシレーションは、アスパラギン結合型グリコシレーション認識部位におけるアミノ酸の置換もしくは欠失から生じる。アスパラギン結合型グリコシレーション認識部位は、細胞の適当なグリコシレーション酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリンのいずれかである（通常、Ｘはいかなるアミノ酸であってもよい）。グリコシレーション認識部位における第１または第３のアミノ酸の位置の一方または両方における種々のアミノ酸置換もしくは欠失（および／または第２の位置におけるアミノ酸の欠失）は、修飾されたトリペプチド配列におけるグリコシレーションを生じさせない。さらに、細菌細胞におけるＢＭＰ−１６関連蛋白の発現は、グリコシレーション認識部位を変化させずにグリコシレーションされていない蛋白を生じる。さらに本発明は、他の蛋白性物質をコードしているＤＮＡ配列と結合していない、ＢＭＰ−１６蛋白の発現をコードしている新規ＤＮＡ配列を包含する。これらのＤＮＡ配列は、配列番号：１に示された５’から３’方向への配列、および厳密（stringent）な条件下、例えば、６５℃における０.１ＸＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ［Maniatis,etal.,Molecular Cloning(A Laboratory Manual),Cold Sprin g Harbor Laboratory(1982)pages387〜389］においてそれらの配列にハイブリダイズし、軟骨および／または骨および／または他の結合組織を誘導する活性を有する蛋白をコードしている配列を包含する。さらにこれらのＤＮＡ配列は、配列番号：１のＤＮＡ配列を含む配列、および厳密な条件下においてそれらにハイブリダイズし、ＢＭＰ−１６に関して開示された他の活性を維持している蛋白をコードしている配列を包含する。同様に、配列番号：１の配列によりコードされるＢＭＰ−１６蛋白あるいは配列番号：２のアミノ酸配列を含むＢＭＰ−１６蛋白をコードするＤＮＡ配列であるが、遺伝暗号の縮重または対立遺伝子変異（種の集団において天然に存在する塩基の変化であってアミノ酸の変化を生じることも生じないこともある）によりコドン配列が異なるＤＮＡ配列も、本明細書記載の新規因子をコードする。活性、半減期もしくはコードされているポリペプチドの産生を増大するための、点突然変異または誘発された修飾（挿入、欠失および置換を包含）により引き起こされる配列番号：１のＤＮＡ配列における変化も本発明に包含される。本発明の別の態様は、ＢＭＰ−１６蛋白の新規製造方法を提供する。本発明方法は、既知調節配列の調節下に置かれた本発明ＢＭＰ−１６蛋白をコードしているＤＮＡ配列で形質転換された適当な細胞系を培養することを包含する。形質転換された宿主細胞を培養し、ＢＭＰ−１６蛋白を培地から回収し精製する。精製蛋白は、同時産生される他の蛋白ならびに他の混入物質を実質的に含まない。適当な細胞または細胞系は、チャイニーズハムスター・卵巣細胞（ＣＨＯ）のごとき哺乳動物細胞であってもよい。適当な哺乳動物宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、生成物の生産ならびに精製方法は当該分野において知られている。例えば、Gething and Sambrook,Nature,293:620〜625(1 981)、あるいは、Kaufinan et al.,Mol.Cell.Biol.,5(7):1750〜1759(1985)もしくはHowleyらの米国特許第４,４１９,４４６号参照。付記した実施例に記載した別の適当な哺乳動物細胞系は、サル・ＣＯＳ−１細胞系である。哺乳動物細胞ＣＶ−１も適当でありうる。細菌細胞も適当な宿主である。例えば、種々のイー・コリ（E.coli）株（例えば、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１）は、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞としてよく知られている。ビー・ズブチリス（B.subtilis）、シュードモナス（Pseudomonas）、他の枯草菌類等の種々の株も、この方法に使用することができる。一般的には、細菌細胞における蛋白の発現のためにはＢＭＰ−１６プロペプチドをコードしているＤＮＡは必要ない。当業者に知られた多くの酵母細胞も、本発明ポリペプチドの発現用宿主細胞として利用できる。さらに、所望ならば、昆虫細胞を本発明方法における宿主細胞として使用することもできる。例えば、Miller et al.,Genetic Engineering,8: 277〜298(Plenum Press 1986)およびその中で引用されている文献参照。本発明の別の態様は、これらの新規ＢＭＰ−１６ポリペプチドの発現方法に用いるベクターを提供する。好ましくは、ベクターは、本発明の新規因子コードしている上記の新規ＤＮＡ配列の全体を含むものである。さらに、ベクターは、ＢＭＰ−１６蛋白配列の発現を可能にする適当な発現調節配列を含む。また、上記修飾配列を含むベクターも、本発明の具体例である。さらに、配列番号：１の配列またはＢＭＰ−１６蛋白をコードしている他の配列を加工して、ＢＭＰ−１６蛋白をコードしているプロペプチド配列を欠失させ、それらを他のＢＭＰ蛋白もしくはＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーの完全なプロペプチドをコードしている配列と置換することにより成熟ＢＭＰ−１６蛋白を発現するようにすることもできよう。かくして、本発明は、ＢＭＰ−１６ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列の正しい読み枠に連結されたＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー由来のプロペプチドをコードしているキメラＤＮＡ分子を包含する。ベクターを細胞系の形質転換方法に使用することができ、ベクターは選択された宿主細胞において本発明ＤＮＡ配列の複製および発現を指令しうる、作動するように本発明配列に連結されている選択された調節配列を有している。かかるベクターのための調節配列は当業者に知られており、宿主細胞に応じて選択することができる。かかる選択は通常行われることであり、本発明の一部分を形成することはない。骨が正常に形成されない環境における軟骨および／または骨の形成を誘導する本発明蛋白は、ヒトおよび他の哺乳動物における骨折および軟骨の損傷の治癒に適用される。ＢＭＰ−１６蛋白を用いたかかる標品は、閉鎖性ならびに解放性の骨折の減少および人工関節の定着の改善にも予防的に使用することができる。骨形成性薬剤により誘導されるデノボ骨形成は、先天性の脳顔面頭蓋の欠損、外傷または腫瘍学的切除術により誘発される脳顔面頭蓋の欠損に対して貢献し、さらに美容整形手術にも有用である。ＢＭＰ−１６関連蛋白を歯周病の治療、およびその他の歯の治療工程に使用してもよい。かかる薬剤は、骨形成細胞を引き寄せるための環境を提供し、骨形成細胞の増殖を刺激し、あるいは骨形成細胞の前駆細胞の分化を誘導することができる。本発明ＢＭＰ−１６ポリペプチドは骨粗鬆症に治療においても有用でありうる。種々の骨原性、軟骨誘導性および骨誘導性因子が記載されている。その議論については、例えば、欧州特許出願第１４８, １５５号および第１６９,０１６号参照。本発明蛋白を傷の治癒および関連組織の修復にも使用することができる。傷のタイプは、熱傷、切り傷、潰瘍を包含するが、これらに限定しない（傷の治癒および関連組織の治療の議論については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８４／０１１０６参照）。さらに本発明蛋白は神経細胞、星状細胞およびグリア細胞の生存率を高めるうるとも考えられ、それゆえ、移植および神経生存率および修復の低下を示す症状の治療において有用でありうると考えられる。さらに本発明蛋白は、神経、表皮および筋肉のごとき他のタイプの組織、ならびに肝臓、心臓、膵臓および腎臓組織のごとき他の器官に関連した症状の治療にも有用でありうる。さらに本発明蛋白は、胚性細胞または幹細胞のごとき比較的未分化の細胞集団を治療して細胞の増殖および／または分化を促進することにも有用でありうる。また本発明蛋白は食事療法の添加物、または細胞培地の成分としても価値を有する可能性がある。この用途には、蛋白は無処理の形態であってもよく、あるいはより吸収されやすい添加物となるように前消化されていてもよい。さらに本発明蛋白は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの蛋白に特徴的な他の有用な特性を有する可能性がある。かかる特性は、血管形成、化学走性および／または化学誘引性、ならびにコラーゲン合成、線維増多、分化応答、細胞増殖応答および細胞付着、移動および細胞外マトリックスの応答の誘導をはじめとする細胞に対する影響を包含する。これらの特性は、本発明蛋白を傷の治癒、線維増多の抑制および瘢痕組織形成の抑制のための潜在的な作用剤としている。他のＢＭＰ、他のＴＧＦ−βスーパーファミリーの蛋白、またはインヒビン− α蛋白もしくはインヒビン−β蛋白とともにホモダイマーまたはヘテロダイマーとしてダイマー化する場合、本明細書においてさらに説明するように、ＢＭＰ− １６ヘテロダイマーは卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の産生に対する影響を示すと考えられる。ＦＳＨは哺乳動物卵巣中の卵の発達を刺激し(Ross et al.,in Text book of Endocrinology,ed.Williams.p.355(1981))、卵巣に対するＦＳＨでの過剰な刺激は多発性の排卵を誘発するであろうと認識されている。ＦＳＨは精巣機能においても重要である。よって、メスの哺乳動物における受精能を抑制し、オスの哺乳動物における精子形成を抑制するインヒビンの能力に基づいた避妊薬として、ＢＭＰ−１６は有用でありうる。充分量の他のインヒビン類の投与により哺乳動物における不妊を誘導することができる。またＢＭＰ−１６は、下垂体前葉の細胞からのＦＳＨ放出刺激におけるアクチビン分子の能力に基づいた受精能誘導治療薬としても有用でありうる。例えば、米国特許第４７９８８８５号参照。ＢＭＰ−１６は、性的に未成熟な哺乳動物における受精を促進して、ウシ、ヒツジおよびブタのごとき家畜の一生の間の繁殖能を改善することも可能である。さらに、ＢＭＰ−１６は、赤血球細胞の分化を誘導することにより、造血の転調において（例えば、Broxmeyer et al,Ptoc.Natl.Acad.Sci.USA,85:9052-9056(1998 )またはEtoetal,Biochem.Biophys.Res.Comm.,142:1095-1103(1987)参照）、あるいは生殖腺腫瘍の発達を抑制することにおいて（例えば、Matzuk et al.,Nature ,360:313-319(1992)参照）、あるいは骨形態形成蛋白の活性を増大させること（例えば、Ogawa et al.,J.Biol.Chem.,267:14233-14237(1992)参照）において有用でありうると考えられる。ＢＭＰ−１６蛋白は、記載されているように（例えば、Vale et al,Endocrino logy,91:562-572(1972);Ling et al.,Nature,321:779-782(1986)またはVale et al.,Nature,321:776-779(1986)参照）、ラット下垂体前葉細胞を用いる確立されたインビトロバイオアッセイにおける卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を転調させる能力によってさらに特徴づけられる。本発明ＢＭＰ−１６蛋白は、インヒビンαまたはインヒビン−β鎖とヘテロダイマーを構成する場合、記載されているように(Ling et al.,Nature,321:779-782(1986);Vale et al.,Nature,321:776 -779(1986)またはVale et al,Endocrinology,91:562-572(1972))、下垂体前葉細胞からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出に対して刺激的または抑制的な調節効果を示すであろう。それゆえ、個々の構成によっては、本発明ＢＭＰ−１６蛋白が下垂体前葉細胞からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出に対して対比的および逆の効果を有する可能性がある。アクチビンＡ（インヒビンβＡのホモダイマー構成物）は赤血球刺激活性を有することが示されている（例えば、Eto et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1 42:1095-1103(1987)およびMurata et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA.，85:2 434-2438(1988)およびYu et al.,Nature,330:765-767(1987)参照）。本発明ＢＭＰ−１６蛋白は類似の赤血球刺激活性を有する可能性があると考えられる。ＢＭＰ−１６蛋白のこの活性は、Lozzio et al.,Blood,45:321-334(1975)および米国特許第５０７１８３４号により記載されたようなヒトＫ−５６２細胞系を用いて行われる生物学的アッセイにおいてエリスロポイエチン活性を示す能力によっても特徴づけることができる。本発明のさらなる態様は、骨折の治療ならびに軟骨の修復および／または骨の欠損もしくは歯周病に関連した他の症状の治療のための方法および組成物である。さらに本発明は、傷の治癒および組織修復のための方法および組成物を含む。かかる組成物は、医薬上許容される賦形剤、担体もしくはマトリックスと混合された治療上有効量の少なくとも１種の本発明ＢＭＰ−１６関連蛋白を含む。さらに本発明組成物は神経生存率を高めうると考えられ、それゆえ、移植および神経生存率の低下を示す症状の治療において有用でありうると考えられる。本発明組成物は、さらに少なくとも１種の他の治療上有用な薬剤（例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの蛋白）を含有していてもよく、その有用な薬剤には、ＢＭＰ蛋白、例えば、米国特許第５,１０８,９２２、５,０１３,６４９、５,１１６,７３８、５,１０６,７４８、５,１８７,０７６ならびに５,１４１,９０５号に開示のＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７；ＰＣＴ出願公開ＷＯ９３／１８０９８に開示のＢＭＰ−８；およびＰＣＴ出願公開ＷＯ９３／００４３２に開示のＢＭＰ−９;ＰＣＴ出願公開ＷＯ９４／２６８９３に開示のＢＭＰ−１０;ＰＣＴ出願公開ＷＯ９４／２６８９２に開示のＢＭＰ−１１、１９９４年１２月２２日出願の同時係属出願第０８／３６２６７０号に開示のＢＭＰ−１２またはＢＭＰ−１３）、または１９９５年５月１８日出願の同時係属特許出願第０８／４４６９２４号に開示のＢＭＰ−１５が包含される。有用でありうる他の組成物は、Ｖｇｒ−２およびＧＤＦｓ（ＰＣＴ出願公開ＷＯ９４／００３１４０；ＷＯ９４／１５９４９；ＷＯ９５／０１８０１；ＷＯ９５／０１８０２;ＷＯ９４／２１６８１;ＷＯ９４／１５９６６；ＷＯ９５／１０５３９；ＷＯ９６／０１８４５；ＷＯ９６／０２５５９および他のものに記載されているものを含む）を含んでいてもよい。ＷＯ９４／０１５５７に開示のＢＩＰ；日本国の公開番号第７−２５０６８８号に開示のＨＰ００２６９；ならびにＰＣＴ出願公開ＷＯ９３／１６０９９に開示のＭＰ５２も本発明において有用でありうる。上記出願の開示を参照により本明細書に記載されているものとみなす。ヒトＢＭＰ−１６蛋白は、その性質上、ホモダイマーまたはヘテロダイマーとして存在しうると考えられる。安定性の向上したＢＭＰ−１６および有用蛋白のダイマーの形成を促進するためには、一般的には、配列番号：１のＤＮＡ配列を加工して１個またはそれ以上のさらなるシステイン残基を有するようにし、ダイマー形成の可能性を高めることができる。得られるＤＮＡ配列は、ＢＭＰ−１６の「システイン付加変種」を生じうるであろう。好ましい具体例において、配列番号：１のＤＮＡ配列を加工して、１個またはそれ以上のコドンを、ＴＧＴまたはＴＧＣのごときシステイン残基をコードするヌクレオチドトリプレットに変化させる。別法として、配列番号：２の１個またはそれ以上のアミノ酸残基をＣｙｓに変化させることにより、アミノ酸レベルで蛋白配列を変化させるこよによりＢＭＰ−１６蛋白の「システイン付加変種」を得ることもできる。蛋白の「システイン付加変種」の製造につては米国特許第５１６６３２２号に記載されており、参照によりその開示を本明細書に記載されているものとみなす。本発明蛋白は、他の関連蛋白および増殖因子と協同して、あるいはおそらく相乗的に作用しうると期待される。それゆえ、本発明のさらなる治療方法および組成物は、上記出願に開示されたＢＭＰ蛋白のごときＴＧＦ−βスーパーファミリー蛋白の少なくとも１つのメンバーと混合された治療量の少なくとも１種の本発明ＢＭＰ−１６蛋白を含んでなる。かかる混合物は、個々のＢＭＰ蛋白分子または異なるＢＭＰ部分よりなる異種分子を含みうる。例えば、本発明方法および組成物が、ＢＭＰ−１６蛋白サブユニットおよび上記「ＢＭＰ」蛋白のうちの１種に由来するサブユニットよりなるジスルフィド結合したダイマーからなっていてもよい。かくして、本発明は精製ＢＭＰ−１６関連ポリペプチドを包含し、該精製ＢＭＰ−１６関連ポリペプチドは、一方のサブユニットが配列番号：２のアミノ酸１から１１０までのアミノ酸配列を含み、もう一方のサブユニットがＢＭＰ −１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ −７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１またはＢＭＰ−１２またはＢＭＰ−１３（ＰＣＴ出願ＷＯ９５／１６０３５に開示）、またはＢＭＰ−１５（１９９５年５月１８日出願の同時係属特許出願第０８／４４６９２４号に開示）からなる群より選択される骨形態形成蛋白に関するアミノ酸配列を含むヘテロダイマーである。さらなる具体例は、ＢＭＰ−１６関連部分、例えばヒトＢＭＰ−１６およびネズミのノダル蛋白（ヒトＢＭＰ−１６の相同体）を含むヘテロダイマーを包含しうる。さらに、ＢＭＰ−１６蛋白を、骨および／または軟骨の欠損、傷、もしくは問題となっている組織の治療に有益な他の薬剤と混合してもよい。これらの薬剤は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、ならびにｋ−線維芽細胞増殖因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ／ＨＩＬＤＡ／ＤＩＡ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−II）を包含する。これらの薬剤の部分も、本発明組成物に使用することができる。ｐＨ、等張性、安定性等に関するかかる生理学的に許容される蛋白組成物の調製および処方は当該分野の範囲内である。さらに、本発明治療組成物は、ＢＭＰ蛋白が種特異性を欠くことから、獣医学にも適用価値がある。特に、人以外には家畜およびサラブレッドのウマが、本発明ＢＭＰ−１６蛋白での治療に関する望ましい対象である。本発明治療方法は、組成物を、局所的に、全身的に、または移植もしくはデバイスのように部分的に投与することを包含する。もちろん、本発明に使用する治療組成物は、投与する場合にはパイロジェンがなく、生理学的に許容される形態である。さらに、望ましくは、組成物を、骨、軟骨または組織の損傷部位に送達するためにカプセル封入するか、あるいは粘度のある形態として注射する。傷の治癒および組織の修復には局所投与が適当であろう。上記組成物中に含有されていてもよいＢＭＰ−１６関連蛋白以外の治療上有用な薬剤を、本発明方法において、本発明ＢＭＰ組成物と同時または逐次的に、ＢＭＰ組成物に代えて、あるいはこれに追加して投与してもよい。好ましくは、骨、軟骨または他の結合組織の形成のためには、組成物は、損傷を受けて修復を必要とする組織の部位にＢＭＰ−１６関連蛋白または他のＢＭＰ蛋白を送達し、骨および軟骨の発達のための構造を提供し、最適には体内に吸収されうるマトリックスを含有する。該マトリックスが、ＢＭＰ−１６蛋白および／または他の骨誘導蛋白の遅延した放出、ならびに細胞の浸潤のための正しい構造および適切な環境を提供するものであってもよい。かかるマトリックスは、他の移植される医療用具に使用する材料から作られる。マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容上の外観および界面の特性に基づく。ＢＭＰ−１６組成物のそれぞれの適用により適切な処方が決定されるであろう。組成物に有用なマトリックスは生分解性であり、化学的に知られている硫酸カルシウム、リン酸三石灰、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であってもよい。他の有用な材料は生分解性であり、骨、腱または皮膚コラーゲンのごとき生物学的に十分に知られているものである。さらなるマトリックスは純粋蛋白または細胞外マトリックス成分を含む。他の有用なマトリックスは非生分解性で、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸、または他のセラミックスのごとき化学的に知られているものである。マトリックスが、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンおよびリン酸三石灰のごとき、上記タイプの材料のいずれかの混合物からなっていてもよい。例えば、カルシウム−アルミン酸−リン酸のような組成物中においてバイオセラミックスを変更してもよく、さらにその孔サイズ、粒子形態および生分解性を変化させてもよい。ＢＭＰ−１６蛋白の作用を変化させる種々の因子、例えば、形成が望まれる骨の重量、骨損傷部位、損傷した骨の状態、傷のサイズ、損傷を受けた組織のタイプ、患者の年齢、性別ならびに食事、感染があればその程度、投与期間、および他の臨床的因子を医師が考慮することにより、投与規則が決定されよう。再構成に用いるマトリックスのタイプおよび組成物中のＢＭＰ蛋白のタイプに応じて用量を変更してもよい。ＩＧＦ−Ｉ（インスリン様増殖因子Ｉ）のごとき他の知られた因子を最終組成物に添加することも、投薬を有効にする可能性がある。骨の成長および／または修復を定期的に評価することにより、進行をモニターすることができる。例えば、Ｘ線、組織形態学的測定、およびテトラサイクリン標識により、進行をモニターすることができる。以下の実施例は、ヒトＢＭＰ−１６および他のＢＭＰ−１６関連蛋白の回収ならびに特徴付け、組み換え法によるヒト蛋白の取得および蛋白の発現に関して、本発明の実施につき説明する。実施例実施例１ＤＮＡの単離ヒトＢＭＰ−１６およびヒトＢＭＰ−１６関連蛋白をコードするＤＮＡ配列を、当業者に知られた種々の方法により単離することができる。以下に記載のごとく、ＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−βスーパーファミリーの他の蛋白に関する知識に基づけば、これらの分子（成熟ペプチド）のカルボキシル末端部分がアミノ末端部分（プロペプチド領域）よりも高い配列保存性を示すことが予想される。ＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−βファミリーの他の蛋白の間のこと配列関連性により、当業者は、これらの分子のカルボキシル末端をコードする部分からＤＮＡプローブを設計し、これを用いて関連ＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−βファミリーの他の蛋白を同定することができる。下記のごとく、ネズミのノダル遺伝子の成熟ペプチドをコードする領域を用いてＢＭＰ−１６およびＢＭＰ−１６関連蛋白を同定することができる。ネズミのノダル遺伝子（Genbank受託番号Ｘ７０５１４）のヌクレオチド１０６０から１３９０までに対応するＤＮＡプローブを³²Ｐで放射性標識し、厳密なハイブリダイゼーション／洗浄条件下でのヒトゲノムライブラリーをスクリーニングしてヒトＢＭＰ−１６遺伝子配列または他のＢＭＰ−１６関連遺伝子配列を含む組み換えクローンを同定することができる。ヒトＢＭＰ−１６ベクターλＤＡＳＨＩＩ（Stratageneカタログ番号９４５２０３）中に構築されたヒトゲノムライブラリーの１００万個の組み換え体を、５０枚のプレートに約２００００個／プレートとなるように撒く。標準ハイブリダイゼーションバッファー（５ＸＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ，５Ｘデンハーツ，１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）中で、厳密さを減じて（６０℃でほぼ２日間）、組み換えバクテロイファージプラークの複製ニトロセルロースレプリカを³²Ｐ標識したネズミのノダルＤＮＡプローブ（上記）とハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーション２日目に、放射性標識されたネズミのノダルＤＮＡフラグメントを含有するハイブリダイゼーション溶液を除去し、厳密さを減じた条件下（２ＸＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ,６０℃）でフィルイターを洗浄する。フィルターをサランラップで包み、−８０℃において増強スクリーンを用いてＸ線フィルムに一晩ないし３日間さらす。オートラジオグラフを現像し、種々のシグナル強度の複数のハイブリダイゼーション陽性組み換え体を同定する。これらの低い厳密さでのハイブリダイゼーション陽性クローンをプラーク精製する。プラーク精製した組み換え体のバクテリオファージプラークのストックを作成し、バクテリオファージＤＮＡを単離する。個々のハイブリダイゼーション陽性組み換え体バクテリオファージクローンを、すでに開示されているＢＭＰ配列またはＴＧＦ−βファミリーの他のメンバーに対応するＤＮＡ配列の存在について試験する。すでにＢＭＰ配列およびＴＧＦ − βファミリーの他のメンバーのＤＮＡ配列を明らかにするために使用されるオリゴヌクレオチドをガラスチップ表面に固定化した。固定化オリゴヌクレオチドの列に対するハイブリダイゼーション分析に使用する鋳型を以下のようにして得る：ネズミのノダルプローブを用いて同定（上記実験）されたハイブリダイゼーション陽性ヒトゲノムクローン由来の組み換えバクテリオファージＤＮＡを特異的ＤＮＡ増幅に供する。バクテリオファージクローニングベクターλＤＡＳＨＩＩのＤＮＡ配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ハイブリダイゼーション陽性組み換えクローンのヒトゲノムＤＮＡインサートを特異的に増幅する。ラムダＤＡＳＨＩＩ^Rゲノムクローニングベクター(Stratagene Cloning systems,Inc.;La Jolla,CA)の配列に基づいて下記ヌクレオチドプライマーを設計し、自動ＤＮＡ合成装置で合成する。オリゴヌクレオチド１および２をプライマーとして用いて、低い厳密さのハイブリダイゼーションにより同定された組み換え体のヒトゲノムＤＮＡインサートまたはバクテリオファージクローニングベクターλ ＤＡＳＨＩＩ中に含まれる組み換えＤＮＡインサートの特異的増幅を可能にする。増幅反応を以下のようにして行う：約５００ｎｇの精製組み換えバクテリオファージＤＮＡまたは精製バクテリオファージプラークの水性溶離液から直接得られた不特定量の組み換えバクテリオファージＤＮＡを、２５０μＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、９０μＭのＤＣＴＰ、３０μＭのフルオレセイン−ｄＣＴＰ、１.３ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）₂、４０ユニット／ｍｌのPerkin -Elmer Cetus rTthＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号Ｎ８０８−０１８０）、４００ｍＭのオリゴヌクレオチドプライマー１および４００ｎＭのオリゴヌクレオチドプライマー２の入った１Ｘ PerkiElmer Cetus GeneAmpR XLバッファー(カタログ番号Ｎ８０８−０１８０−トリシン、酢酸カリウム、グリセロールおよびＤＭＳＯを含む)に添加する。反応混合物を下記サーマルサイクリングに供する：９３℃で１分を１サイクル、９３℃で４０秒、ついで６８℃で１２分を３０サイクル、その後６５℃で１０分を１サイクル。この反応により特異的に増幅される約１μｇのＤＮＡを、５０mＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７.５，１０ｍＭＭｇＳＯ₄，５０ｍｇウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ｍｌ、および０.１ｍＭＤＴＴ中、３７℃で９０分間、１８ミリユニットのＲＱ１ＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅ（Promega Corp.,Madison,WI/カタログ番号Ｍ６１０１）で消化した。０.１体積の０.５ＭＮａ₂ＥＤＴＡを添加して反応を停止させた。上記条件で特異的に増幅されたＤＮＡのフラグメント化により、約１５００ないし５０塩基対の範囲のＤＮＡフラグメントを得る。１５００ないし５０塩基対の特異的に増幅されたＤＮＡフラグメントを９５℃で１０分間熱変性させる。フラグメント化され、変性したＤＮＡの溶液を６ＸＳＳＰＥ，０.０５％ Triton X-100の最終濃度とし、ついで、ガラス表面に固定化されたＢＭＰ／ＴＧＦ−βファミリーの標本オリゴヌクレオチドの列に３７℃で４時間ないし一晩ハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーションしたＢＭＰ／ＴＧＦ−βファミリーの標本オリゴヌクレオチドの列（ガラス表面に固定化されている）を０.５ＸＳＳＰＥ，０.００５％ Triton X-100で洗浄し、GeneChip 50 Scarmer（Affymetrix）により分析した。３２９塩基対のネズミのノダルプローブにハイブリダイゼーションする組み換えバクテリオファージクローンの１つをλＨＧ−ＮＲ３５−１と命名した。ＢＭＰ／ＴＧＦ−βファミリーのオリゴヌクレオチドの列を用いるこのクローンの分析により、ガラスチップ上のオリゴヌクレオチドの列の小さな部分集合に対する陽性ハイブリダイゼーションパターンが得られた。陽性のハイブリダイゼーションシグナルにより確認されたオリゴヌクレオチドの１つを用いて、ネズミのプローブに対する元々のハイブリダイゼーションシグナルの原因であったヒトゲノムインサートの領域のＤＮＡ配列を決定した。このオリゴヌクレオチドの配列を下に示す：ネズミのノダル配列（Genbank受託番号Ｘ７０５１４）のヌクレオチド１１７３から１１９０までに対応するこのオリゴヌクレオチドを用いてλＨＧ− ＮＲ３５−１ゲノムクローンのＤＮＡ配列分析を行い、本願開示のヒトＢＭＰ− １６配列の一部分を同定した。バクテリオファージλＨＧ−ＮＲ３５−１は、１９９６年６月２５日に、American Type Culture Collection,12301 Parklawn Dr ive,Rockville,MD（ＡＴＣＣ）に受託番号９７６２３として寄託された。この寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定を満たしたものである。この組み換え体λＨＧ−ＮＲ３５−１のハイブリダイゼーション領域は長さ約２.１キロベース（ｋｂ）および４.３ｋｂの３ｋｂの２つのＢａｍＨＩフラグメントに局在している。これらの各フラグメントをプラスミドベクターpＧＥＭ−３中にサブクローン化する。２.１ｋｂおよび４.３ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントを含むプラスミドサブクローンをそれぞれＤＨ５α／ｐＧＥＭ＃−ＮＲ３５−１＃Ｂ２およびＤＨ５α／ｐＧＥＭ＃−ＮＲ３５−１＃Ｂ１８と命名する。２.１ｋｂのＢａｍＨＩハイブリダイゼーションフラグメントを含むプラスミド（ＤＨ５α／ｐＧＥＭ＃−ＮＲ３５−１＃Ｂ２）は１９９６年６月２５日に受託番号９８０８５としてＡＴＣＣに寄託された。４.３ｋｂのＢａｍＨＩハイブリダイゼーションフラグメントを含むプラスミド（ＤＨ５α／ｐＧＥＭ＃−ＮＲ３５−１＃Ｂ１８）は１９９６年６月２５日に受託番号９８０８４としてＡＴＣＣに寄託された。これらの寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定を満たしたものである。プラスミドサブクローンＤＨ５α／ｐＧＥＭ＃−ＮＲ３５−１＃Ｂ２の２.１ｋｂのインサートの一部分のＤＮＡ配列を配列番号：３に示す。ネズミのノダル遺伝子のエキソン２（Genbank受託番号Ｘ７０５１４のヌクレオチド５２４から１２４０まで）との比較により明らかなように、この配列の一部分（ヌクレオチド３８３から１０８０まで）はヒトＢＭＰ−１６遺伝子のエキソン２である。プラスミドサブクローンＤＨ５α／ｐＧＥＭ＃−ＮＲ３５−１＃Ｂ１８の４.３ｋｂのインサートの一部分のＤＮＡ配列を配列番号：４に示す。ネズミのノダル遺伝子のエキソン３（Genbank受託番号Ｘ７０５１４のヌクレオチド１２４１から１３９０まで）との比較により明らかなように、この配列の一部分（ヌクレオチド４３４から５８３まで）はヒトＢＭＰ−１６遺伝子のエキソン３である。ネズミのノダル遺伝子構造その中に含まれる特定の蛋白コーディングヌクレオチド配列、上記ヒトＢＭＰ−１６遺伝子のエキソン２（配列番号：３）およびエキソン３（配列番号：４）中に含まれる配列とそれらの配列との比較に関する知識に基づけば、本発明ヒトＢＭＰ−１６蛋白の部分コーディング配列を編集することができる。この部分ヒトＢＭＰ−１６コーディング配列（そこから配列番号：３および配列番号：４の介在配列／イントロンおよび他の非ＢＭＰ−１６蛋白コーディング配列が除かれている）を配列番号：１に示す。ヒトＢＭＰ−１６遺伝子のエキソン２およびエキソン３からの配列を融合させることにより推定される編集配列は、本発明ヒトＢＭＰ−１６蛋白の２８０個のアミノ酸をコードする８４０個のヌクレオチド（配列番号：１のヌクレオチド１から８４０まで）からなる読み枠を画定する。配列番号:２に示される、コードされる２８０個のアミノ酸からなるＢＭＰ１６蛋白前駆体ポリペプチドは、全成熟ヒトＢＭＰ−１６ペプチド（配列番号：２のアミノ酸１から１１０まで）ならびにＢＭＰ−１６プロペプチドのＣ末端部分（配列番号：２のアミノ酸−１７０から−１まで）を含む。他のＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−βファミリーの他の蛋白に関する知識に基づけば、ヒトＢＭＰ−１６前駆体ポリペプチドは、コンセンサス蛋白分解プロセッシング配列Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇに当てはまる多塩基配列Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇにおいて開裂されるであろう。ヒトＢＭＰ−１６前駆体ポリペプチドの開裂は、配列番号：２の位置１のアミノ酸Ｈｉｓから始まる１１０個のアミノ酸の成熟ペプチドを生じると考えられる。ヒトＢＭＰ−１６の成熟形態へのプロセッシングは、関連蛋白ＴＧＦ−βのプロセッシング[Gentry et al.,Molec＆Ce ll.Biol.8:4162(1988);Derynck et al.Nature,316:701(1985)]と類似の様式でのダイマー化およびＮ末端の除去を含むと考えられる。それゆえ、ヒトＢＭＰ−１６の成熟活性種は２つのポリペプチドのホモダイマーを含むと考えられ、各サブユニットは配列番号：２のアミノ酸１から１１０までを含み、推定分子量は約１３０００ダルトンである。さらなる活性種は、少なくとも配列番号：２のアミノ酸２４から１２５までを含み、それゆえ、最初の保存されたシステイン残基を含むと考えられる。ＴＧＦ−β／ＢＭＰファミリーの蛋白の他のメンバーについては、ヒトＢＭＰ−１６蛋白のカルボキシ末端部分はアミノ末端部分よりも大きな配列保存性を示す。システイン豊富Ｃ末端ドメイン（配列番号：２のアミノ酸１０から１１０まで）におけるヒトＢＭＰ−１６蛋白の、ヒトＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−βファミリーの他の蛋白の対応領域に対するアミノ酸同一性パーセンテージは次のとおり：ＢＭＰ−２,４２％；ＢＭＰ−３, ４１％；ＢＭＰ−４,４０％；ＢＭＰ−５,４２％；ＢＭＰ−６,４５％；ＢＭＰ −７,４３％；ＢＭＰ−８,４５％；ＢＭＰ−９,４４％；ＢＭＰ−１０,４３％；ＢＭＰ−１１,３５％；ＢＭＰ−１２，４５％；ＢＭＰ−１３，４６％；ＢＭＰ −１５，３６％；Ｖｇｌ,４４％；ＧＤＦ−１,３８％；ＴＧＦ−β１,２９％；ＴＧＦ−β２,３２％；ＴＧＦ−β３,２９％；インヒビンβ_B,３８％；インヒビンβ_A,４３％。ヒトＢＭＰ−１６ＤＮＡ配列（配列番号：１）、またはその一部分をプローブとして用いて、ヒトＢＭＰ−１６またはヒトＢＭＰ−１６関連ｍＲＮＡを合成するヒト細胞系または組織を同定することができる。簡単に説明すると、ＲＮＡを選択細胞または組織源から抽出し、ホルムアミドアガロースゲル電気泳動してニトロセルロースに移すか、あるいはホルムアルデヒドと反応させてニトロセルロースに直接スポットする。次いで、ニトロセルロースを、ヒトＢＭＰ−１６のコーディング配列由来のプローブとハイブリダイゼーションさせる。別法として、ヒトＢＭＰ−１６配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ヒトＢＭＰ−１６由来のプライマーは、特異的増幅反応を行うために使用される該プライマー間の領域に存在する配列をコードしているヒトＢＭＰ− １６コーディング配列またはヒトＢＭＰ−１６関連コーディング配列の一部分を特異的に増幅するであろう。これらのヒトＢＭＰ−１６由来のプライマーは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ鋳型から、対応ヒトＢＭＰ−１６またはＢＭＰ−１６関連部分のコーディング配列を特異的に増幅することを可能にするであろうと考えられる。上記方法のいずれかにより、可能性のある源が同定されたならば、オリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーによりｍＲＮＡを選択し、ｃＤＮＡを合成し、確立されている方法（Tooleらの上記文献）によりλｇｔ１０または当業者に知られた他のλバクテリオファージベクター(例えば、λ ＺＡＰ)に組み込む。λバクテリオファージベクター中に組み込まれている、すでに確立されているヒトｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーに対して、上記オリゴヌクレオチドプライマーによる増幅反応を行うこともできる。かかる場合、増幅されたヒトＢＭＰ−１６またはＢＭＰ−１６関連蛋白をコードしているＤＮＡのフラグメントをプローブとして用いて、ヒトＢＭＰ−１６またはＢＭＰ−１６関連蛋白の一部分をコードしている特異的増幅ＤＮＡ生成物を生じるライブラリーを直接スクリーニングすることができる。当業者に知られたさらなる配列を用いてヒトＢＭＰ−１６関連蛋白をコードしている他の全長ｃＤＮＡ、または本発明ＢＭＰ−１６関連蛋白をコードしている全長ｃＤＮＡクローンを、ヒト以外の種、特に他の哺乳動物種から単離することができる。実施例２Ｗ−２０バイオアッセイＡ.Ｗ-２０細胞の説明インジケーター細胞系としてのＷ−２０骨髄基質細胞の使用は、ＢＭＰ蛋白での処理後のこれらの細胞の骨芽細胞への変換に基づく［Thies et al.,Journal o f Bone and Minaral Research,5:305(1990)；およびThieset al.,Endocrinology ,130:1318(1992)］。詳細には、Ｗ−２０細胞は、マサチューセッツ州ボストンのチルドレンズ・ホスピタル（Children'sHospital）のD.Nathan博士の研究室の研究者により成体マウスから取られたクローン化された骨髄基質細胞系である。ある種のＢＭＰ蛋白でのＷ−２０細胞の処理は、（１）アルカリ性ホスファターゼ産生増加、（２）ＰＴＨにより刺激されるｃＡＭＰの誘導、および（３）細胞によるオステオカルシン（osteocalcin）合成の誘導を引き起こす。（１）および（２）は骨芽細胞の表現形に関連した特徴を示すが、オステオカルシン合成能は成熟骨芽細胞によってのみ示される特性である。さらにそのうえ、現在まで、我々は、ＢＭＰで処理した場合のみ起こるＷ−２０基質細胞の骨芽細胞様への変換を観察してきた。この様式において、ＢＭＰ処理されたＷ−２０細胞により示されるインビトロ活性は、ＢＭＰについて知られているインビボでの骨形成活性と相関がある。新規骨誘導分子のＢＭＰ活性を比較することにおいて有用な２種のインビトロでの分析を以下に説明する。Ｂ.Ｗ−２０アルカリ性ホスファターゼ分析のプロトコールＷ−２０細胞を、９６ウェルの組織培養プレートにウェルあたり２００μｌの培地（１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび１００ユニット／ｍｌペニシリン＋１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥ）中１００００個の割合で撒く。９５％空気、５％ＣＯ₂のインキュベーター中３７ ℃において細胞を一晩付着させる。マルチチャンネルピペッターで各ウェルから２００μｌの培地を除去し、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび１％ペニシリン−シトレプトマイシンを含有するＤＭＥ中の同体積の試験試料で置換した。試験物質を３系で分析する。試験試料および標準をＷ−２０インジケーター細胞とともに２４時間インキュベーションする。２４時間後、３７ ℃のインキュベーターからプレートを取り出し、試験培地細胞をから除去する。Ｗ−２０細胞層をウェルあたり２００μｌのカルシウム／マグネシウム不含リン酸緩衝化セイラインで３回洗浄し、これらの洗液を捨てる。ガラス製装置で蒸留された５０μｌの水を各ウェルに添加し、次いで、分析プレートを急速に冷凍するためにドライアイス／エタノール浴に置く。凍結したら、分析プレートをドライアイス／エタノール浴から取り出し、３７℃で融解させる。この工程を２回以上繰り返して全部で３回の凍結融解工程を行う。工程終了後、膜結合アルカリ性ホスファターゼを測定に供する。５０μｌの分析混合物（５０ｍＭグリシン、０ .０５％ Triton X-100、４ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭリン酸ｐ−ニトロフェノール、ｐＨ＝１０.３）を各分析ウェルに添加し、次いで、分析プレートを、１分間に６０回振盪しながら３７℃で３０分インキュベーションする。３０分間のインキュベーションの終わりに、１００μｌの０.２ＮＮａＯＨを各ウェルに添加し、分析プレートを氷上に置くことにより反応を停止する。各ウェルの分光学的吸光度を４０５ナノメーターの波長において読む。次いで、これらの値を既知標準と比較して各試料のアルカリ性ホスファターゼ活性の評価を行う。例えば、既知量のリン酸ｐ−ニトロフェノールを用いると、吸光度値が得られる。これを表Ｉに示す。既知量のＢＭＰに関する吸光度値を決定し、表ＩＩに示すような単位時間あたり開裂されたリン酸ｐ−ニトロフェノールのμモル数に変換することができる。次いで、これらの値を用いて既知量のＢＭＰ−１６の活性をＢＭＰ−２活性と比較する。Ｃ.オステオカルシンＲＩＡプロトコールＷ−２０細胞を、２４ウェルのマルチウェル組織培養ディッシュの各ウェルに、２ｍｌのＤＭＥ（１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンを含有）中１０⁶個となるように撒く。９５％空気、５％ＣＯ₂中３７℃において細胞を一晩付着させる。翌日、培地を、２ｍｌの全体積中１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび試験物質を含有するＤＭＥに交換する。各試験物質を３系のウェルに入れる。試験物質をＷ−２０細胞とともに合計９６時間（４８時間目に同じ培地で培地交換）インキュベーションする。９６時間のインキュベーションの終わりに、各ウェルから５０μｌの試験培地を取り、マウスオステオカルシンについてのラジオイムノ分析を用いてオステオカルシン産生について分析を行う。分析の詳細は、マサチューセッツ州０２０７２、スタウトン、ペイジ・ストリート３７８のバイオメディカル・テクノロジーズ・インコーポレイテッド（Biomedic al Techologies Inc.）により製造されたキットに説明がある。分析のための試薬は、製品番号ＢＴ−４３１（マウスオステオカルシン標準）、ＢＴ−４３２（ヤギ抗−マウスオステオカルシン）、ＢＴ−４３１Ｒ(ヨウ素化されたマウスオステオカルシン)、ＢＴ−４１５（正常ヤギ血清）およびＢＴ−４１４（ロバ抗 −ヤギＩｇＧ）として見いだされる。ＢＭＰ処理に応答したＷ−２０胞により合成されたオステオカルシンについてのＲＩＡを、製造者により提供されるプロトコールに記載されたようにして行う。試験試料に関して得られた値をマウスオステオカルシンの既知標準に関する値と比較し、既知量のＢＭＰ−２での処理に応答してＷ−２０細胞により産生されたオステオカルシン量と比較する。ＢＭＰ−２により誘導されたＷ−２０によるオステオカルシン合成量を表ＩＩＩに示す。実施例３ローゼン改変サムパス−レディアッセイ Sampath and Reddi,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:6591-6595(1983)に記載されたラット骨形成アッセイの改変バージョンを用いて骨および／または軟骨および／または他の結合組織におけるＢＭＰ蛋白の活性を評価する。サムパス−レディ法のエタノール沈殿工程を、アッセイすべきフラクションを水に対して透析（組成物が溶液の場合）または限界濾過（組成物が懸濁液の場合）することに置き換える。次いで、溶液または懸濁液を０.１％ＴＦＡに対して平衡化させる。得られた溶液を２０ｍｇのラットのマトリックスに添加する。蛋白処理していない疑似ラット・マトリックス試料は対照として役立つ。この材料を凍結し、凍結乾燥して得られた粉末を５番のゼラチンカプセルに封入する。２１〜４９日齢のロング・エバンズ・ラット（Long Evans rat）の腹胸部の皮下にカプセルを移植する。インプラントを７〜１４日後に取る。各インプラントの半分をアルカリ性ホスファターゼアッセイ［Proc.Natl.Acad.Sci.,69:1601(1972)］に用いる。各インプラントのもう半分を固定し、組織学的分析用に処理する。１ミクロンのグリコメタクリレート切片をフォン・コッサおよび酸フクシンで染色して各インプラントにおいて誘導された骨および軟骨の形成の評点をつける。＋１ないし＋５は、新たな骨および／または軟骨細胞ならびにマトリックスにより占められたインプラントの各組織学的切片の面積を表す。＋５の評点は、インプラントの５０％よりも多くの部分が、インプラントにおける蛋白の直接の結果として生成された新たな骨および／または軟骨であることを示す。評点＋４、＋３、＋２および＋１は、それぞれ、インプラントの４０％、３０％、２０％および１０％よりも多くの部分が新たな軟骨および／または骨を含んでいることを示す。別法として、同じ方向に集密になった線維芽細胞の高密度の束の存在により容易に認識される胚性の腱に似た組織の出現についてインプラントを検査する［腱／靭帯様組織は、例えば、Ham and Cormack,Histology(JB Lippincott Co.),197 9,pp.367-369に記載されており、その開示を参照により本明細書に記載されているものとみなす］。ＢＭＰ−１６関連蛋白含有インプラントにおいて腱／靭帯様組織を観察する、さらなるアッセイにおいてこれらの知見は再現されうる。本発明ＢＭＰ−１６関連蛋白をこの活性に関して評価してもよい。実施例４ＢＭＰ−１６の発現ネズミ、ヒトまたは他の哺乳動物のＢＭＰ−１６関連蛋白を製造するために、該蛋白をコードしているＤＮＡを適当な発現ベクター中に移し、慣用的な遺伝子工学的方法により哺乳動物細胞または他の好ましい真核細胞宿主もしくは原核細胞宿主中に導入する。生物学的に活性のある組み換え型ヒトＢＭＰ−１６の好ましい発現系は、安定に形質転換された哺乳動物細胞であると考えられる。当業者は、配列番号：１または配列番号：３の配列、もしくはＢＭＰ−１６関連蛋白をコードしている他のＤＮＡ配列、あるいは他の修飾された配列およびｐＣＤ［Okayama et al,Mol.Cell Biol,2:161〜170(1982)］、ｐＪＬ３、ｐＪＬ４［Gough et al.,EMBO J.,4:645〜653(1985)］ならびにｐＭＴ２ＣＸＭのごとき知られたベクターを用いることにより、哺乳動物発現ベクターを構築することができる。哺乳動物発現ベクターｐＭＴ２ＣＸＭは、ｐ９１０２３（ｂ）(Wong et al,S cience,228:810〜815,1985)の誘導体であるが、テトラサイクリン耐性遺伝子の代わりにアンピシリン耐性遺伝子を有し、さらにｃＤＮＡクローン挿入のためのＸｈｏＩ部位を有することにおいてｐ９１０２３（ｂ）とは異なる。ｐＭＴ２ＣＸＭの機能的エレメントは記載されており(Kaufman,R.J.et al.,1985,Proc.Nat1 .Acad.Sci.USA,82.689〜693)、アデノウイルス・ＶＡ遺伝子、７２塩基対のエンハンサーを含むＳＶ４０・複製開始点、５’スプライス部位ならびにアデノウイルス・後期ｍＲＮＡ上に存在するアデノウイルス・三分節リーダー配列の大部分を含むアデノウイルス・大後期プロモーター、３’スプライス受容部位、ＤＨＦＲ挿入断片、ＳＶ４０・初期ポリアデニル化部位（ＳＶ４０）、およびイー・コリ中での増殖に必要なｐＢＲ３２２配列を含んでいる。ｐＭＴ２−ＶＷＦのＥｃｏＲＩ消化によりプラスミドｐＭＴ２ＣＸＭを得る。ｐＭＴ２−ＶＷＦは、受託番号ＡＴＣＣ６７１２２の下で、American Type Cu lture Collection(ＡＴＣＣ),Rockville,MD(USA)に寄託されている。ＥｃｏＲＩ消化により、ｐＭＴ２−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡ挿入断片を切り出し、連結してイー・コリＨＢ１０１またはＤＨ−５をアンピシリン耐性へと形質転換するのに用いる直鎖状のｐＭＴ２を得る。プラスミドｐＭＴ２ＤＮＡを慣用的方法により調製することができる。次いで、ループアウト／イン変異誘発（loopout/ in mutagenesis）［Morinaga et al.,Bio-technology,84:636(1984)］を用いてｐＭＴ２ＣＸＭを構築する。これにより、ｐＭＴ２のＳＶ４０・複製開始点ならびにエンハンサー配列近傍のＨｉｎｄＩＩＩ部位に対応する塩基１０７５〜１１４５が除去される。さらに、そのヌクレオチド１１４５の位置に下記配列: を挿入する。この配列は制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩの認識部位を有する。ｐＭＴ２３と命名されたｐＭＴ２ＣＸＭの誘導体は、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ、ＥｃｏＲ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩの認識部位を有する。プラスミドｐＭＴ２ＣＸＭおよびｐＭＴ２３ＤＮＡを慣用的方法により調製することができる。ｐＭＴ２１由来のｐＥＭＣ２β１も本発明の実施に適する。ｐＭＴ２１は、ｐＭＴ２−ＶＷＦ由来のｐＭＴ２に由来する。上記のごとく、ＥｃｏＲＩ消化により、ｐＭＴ−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡ挿入断片を切り出し、連結してイー・コリＨＢ１０１またはＤＨ−５をアンピシリン耐性へと形質転換するのに用いることのできる直鎖状のｐＭＴ２を得る。プラスミドｐＭＴ２ＤＮＡを慣用的方法により調製することができる。ｐＭＴ２１は、以下の２つの修飾を経てｐＭＴ２から誘導される。最初に、ｃＤＮＡクローニングのためのＧ／Ｃテイリングから伸長した１９個のＧ残基を含む、ＤＨＦＲｃＤＮＡの７６塩基対の５’非翻訳領域を欠失させる。この工程において、ＸｈｏＩ部位を挿入してＤＨＦＲのすぐ上流に下記配列：を得る。次いで、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩでの消化、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでの処理、そしてＣｌａＩリンカー（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）への連結により、単一のＣｌａＩ部位を導入する。これにより、２５０塩基対の断片がアデノウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡＩ）領域から欠失されるが、ＶＡＩＲＮＡ遺伝子の発現または機能は阻害されない。ｐＭＴ２１をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ベクターｐＥＭＣ２Ｂ１を得るために用いる。ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩでの消化により、ＥＭＣＶリーダーの一部がｐＭＴ２−ＥＣＡＴＩ［S.K.Jung et al.,J.Virol,63:1651〜1660(1989)］から得られ、これは２７５２塩基対のフラグメントである。このフラグメントをＴａｑＩで消化し、５０８塩基対のＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩフラグメントを得、これを低融点アガロースゲル上の電気泳動により精製する。下記配列を有する５’ＴａｑＩ突出末端および３’ＸｈｏＩ突出末端：を用いて６８塩基対のアダプターおよびその相補鎖を合成する。この配列は、ヌクレオチド７６３ないし８２７由来のＥＭＣウイルスリーダー配列に合致する。さらにこの配列は、ＥＭＣウイルスリーダー内の位置１０におけるＡＴＧがＡＴＴに変化しており、ＸｈｏＩ部位が後に続いている。ｐＭＴ２１のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメント、ＥＭＣウイルスのＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩフラグメント、および６８塩基対のオリゴヌクレオチドアダプターの３つを連結してベクターｐＥＭＣβ１を得る。このベクターは、ＳＶ４０・複製開始点ならびにエンハンサー、アデノウイルス・大後期プロモーター、アデノウイルス・三分節リーダー配列の大部分のｃＤＮＡコピー、小型のハイブリッド介在配列、ＳＶ４０・ポリアデニル化シグナルならびにアデノウイルス・ＶＡＩ遺伝子、ＤＨＦＲならびにβ−ラクタマーゼマーカーおよびＥＭＣ配列を含み、哺乳動物細胞における高レベルの所望ｃＤＮＡの発現の指令に適当に関連している。ベクターの構築はＢＭＰ−１６関連ＤＮＡ配列の修飾を包含する。例えば、コーディング領域の５’および３’末端上の非コーディングヌクレオチドを除去することにより、ＢＭＰ−１６のｃＤＮＡを修飾してもよい。欠失された非コーディングヌクレオチドを、発現に有益であることが知られている他の配列で置換してもよく、置換しなくてもよい。これらのベクターを、ＢＭＰ−１６関連蛋白の発現にとり適当な宿主細胞中に形質転換する。さらに、ＢＭＰ−１６をコードしているプロペプチド配列を欠失させ、他のＢＭＰ蛋白の完全なプロペプチドをコードしている配列に置き換えることにより成熟ＢＭＰ−１６関連蛋白を発現するように、配列番号：１の配列またはＢＭＰ−１６関連蛋白をコードしている他の配列を加工してもよい。当業者は、コーディング配列に隣接している哺乳動物の調節配列を除去するかまたは細菌の配列に置き換えて、細菌細胞による細胞内または細胞外発現用の細菌ベクターを作成することにより、配列番号：１の配列を処理することができる。例えば、コーディング配列をさらに処理することができる(例えば、他の既知リンカーに連結する、あるいはその非コーディング配列を欠失させるかまたは他の既知方法によりそのヌクレオチドを変化させる)。次いで、T.Taniguchi et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5230〜5233(1980)に記載されたような方法を用いて修飾されたＢＭＰ−１６関連コーディング配列を既知細菌ベクター中に挿入することができよう。次いで、この典型的な細菌ベクターを細菌宿主細胞中に形質転換し、それによりＢＭＰ−１６関連蛋白を発現させる。細菌細胞においてＢＭＰ −１６関連蛋白を細胞外発現させるための方法については、欧州特許公開ＥＰＡ１７７,３４３参照。昆虫細胞における発現のために、昆虫ベクターの構築を行うための操作を行うことができる［例えば、公開された欧州特許出願第１５５,４７６号記載の方法参照］。酵母細胞による本発明因子の細胞内または細胞外発現のための酵母の調節配列を用いて、酵母ベクターを構築することもできる［例えば、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８６／００６３９および欧州特許出願公開ＥＰＡ１２３,２８９号記載の方法参照］。高レベルの本発明ＢＭＰ−１６関連蛋白を哺乳動物細胞において製造する方法は、異種ＢＭＰ−１６関連遺伝子の多数のコピーを有する細胞の構築を包含する。異種遺伝子を増幅可能なマーカー、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)遺伝子に連結し、Kaufman and Sharp,J.Mol.Biol.,159:601〜629(1982)の方法により、メトトレキセート（ＭＸＴ）濃度を上昇させていって増加した遺伝子コピーを有する細胞を該マーカー関して選択できる。このアプローチを種々の異なる細胞タイプに使用することができる。例えば、リン酸カルシウム共沈ならびにトランスフェクション、エレクトロポーレーションまたはプロトプラスト融合をはじめとする種々の方法により、ＢＭＰ−１６関連蛋白の発現を可能にする他のプラスミドの配列と作動するように結合された本発明ＢＭＰ−１６関連蛋白に対するＤＮＡ配列を含むプラスミドと、ＤＨＦＲ発現プラスミドｐＡｄＡ２６ＳＶ（Ａ）３［Kaufman and Sharp,Mol.Ce ll.Biol.,2:1304(1982)］とを、ＤＨＦＲ欠損細胞ＤＵＫＸ−ＢＩＩ中に同時に導入することができる。ＤＨＦＲを発現する形質転換体を、透析されたウシ胎児血清を含むアルファ培地における増殖に関して選択し、次いで、Kaufman et al. ,Mol.Cell.Biol:5.1750(1983)記載のごとく、ＭＴＸ濃度を増加させていった場合（例えば順次、０.０２、０.２、１.０ついで５μＭのＭＴＸ）の増殖による増幅について選択を行う。形質転換体を増殖させ、生物学的に活性のあるＢＭＰ −１６の発現を、上記実施例３記載のローゼンにより改変されたサムパス−レディのラット・骨形成分析によりモニターする。ＢＭＰ−１６蛋白の発現はＭＴＸ耐性レベルの増加に伴って増加するはずである。［³⁵Ｓ］メチオニンまたはシステインでのパルスラベリングおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動のごとき当該分野で知られた標準的方法を用いて、ＢＭＰ−１６ポリペプチドを特徴づける。同様の方法により他の関連ＢＭＰ−１６関連蛋白を製造することができる。実施例５発現されたＢＭＰ−１６の生物学的活性上記実施例４において得られた、発現されたＢＭＰ−１６関連蛋白の生物学的活性を測定するために、蛋白を細胞培養物から回収し、同時に産生された他の蛋白性物質ならびに他の混入物質からＢＭＰ−１６関連蛋白を単離することにより精製する。実施例３記載のラット・骨形成分析により、精製蛋白を分析してもよい。当業者に知られた標準的方法を用いて精製を行う。銀染色［Oaldey et al.,Anal.Biochem.,105:361(1980)］で染色されるＳＤＳ −ＰＡＧＥアクリルアミド［Laemmli,Nature,227:680(1970)］およびイムノブロット［Towbin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:4350(1979)］のごとき標準的方法を用いて蛋白の分析を行う。実施例６ノーザン分析を用いて、ＢＭＰ−１６およびＢＭＰ−１６関連蛋白を、種々の細胞系に対する影響について試験することができる。適当な細胞系は、Ｅ１３マウス肢芽由来の細胞系を包含する。ＢＭＰ−１６またはＢＭＰ−１６関連蛋白での処理から１０日後、組織分化の状態について表現型を組織学的に調べる。さらに、ＢＭＰ−１６またはＢＭＰ−１６関連蛋白で処理した細胞由来のｍＲＮＡのノーザン分析を、表ＩＶに記載する骨、軟骨および／または腱／靭帯に関する下記マーカーの１つまたはそれ以上を包含する種々のマーカーについて行うこともできる。１−初期にマーカーが観察され、成熟骨組織が形成されるにつれマーカーが見られなくなる。２−マーカーは腱の部位に依存し、骨界面において最強。３−低レベルのマーカーが見られる。実施例７胚性幹細胞アッセイ本発明ＢＭＰ−１６蛋白の効果をアッセイするために、多くの利用可能な幹細胞系に対するインビボにおける増殖および分化の効果をアッセイすることが可能である。１のかかる細胞系はＥＳ−Ｅ１４ＴＧ２であり、Rockville,MDのAmeric an Type Culture Collectionから利用可能である。アッセイを行うために、１００ユニットのＬＩＦ存在下で細胞を増殖させて未分化状態に維持する。まず、ＬＩＦを除去し、細胞を凝集させて懸濁させる（胚様体として知られる状態）ことによりアッセイをセットアップする。３日後、胚様体をゼラチン被覆プレートに撒き(ＰＣＲ分析のためには１２ウェルプレート、免疫細胞化学的分析のためには２４ウェルプレートを用いる)、アッセイすべき蛋白で処理する。細胞に栄養分を与え、２〜３日毎に蛋白性因子で処理する。１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）補足培地またはずっと少量のＦＢＳを含有するＣＤＭ限定培地においてアッセイを行えるように細胞を適応させる。処理期間（７〜２１日の範囲）の終了時に細胞からＲＮＡを集め、以下のマーカーに関して定量的マルチプレックスＰＣＲにより分析する：中胚葉マーカーBr achyury、外胚葉マーカーＡＰ−２、および内胚葉マーカーＨＮＦ−３α。免疫細胞化学的分析により、神経細胞（グリア細胞およびニューロン細胞）、筋肉細胞（心筋細胞、骨格筋細胞および平滑筋細胞）分化を検出することができ、さらにプロテオグリカンコア蛋白（軟骨）およびサイトケラチン（表皮）のごとき種々の他の表現型マーカーの検出が可能である。これらの細胞はＬＩＦが除去された場合に自律的に分化する傾向があるので、常に無処理対照に対する比較により結果を定量する。以上の記載は、本発明の目下好ましい具体例を詳述するものである。その実施において、当業者がこれらの記載を考慮して多くの改変ならびに変法を行うことが想定される。それらの改変ならびに変法は、添付した請求の範囲に包含されると確信する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｐ 1/02 // Ａ６１Ｋ 38/00 19/00 Ａ６１Ｐ 1/02 19/02 19/00 19/10 19/02 43/00 １０７ 19/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 43/00 １０７Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＣＡ，ＦＩ，ＪＰ，ＫＲ，ＮＯ

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）配列番号：１のヌクレオチド１、５１１もしくは５３８から８３７もしくは８４０までのヌクレオチド；（ｂ）配列番号：２のアミノ酸−１７０、１もしくは１０から１０９もしくは１１０までをコードするヌクレオチド；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）の天然に存在するヒト対立遺伝子配列または等価な縮重コドン配列からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む、単離ＤＮＡ分子。２．請求項１のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞。３．作動するように発現制御配列に結合された請求項１のＤＮＡ分子を含むベクター。４．請求項３のベクターで形質転換された宿主細胞。５．配列番号：１のヌクレオチド５１１から８４０までからなるＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子。６．作動するように発現制御配列に結合された請求項５のＤＮＡ分子を含むベクター。７．請求項６のベクターで形質転換された宿主細胞。８．下記工程：（ａ）請求項１記載のＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞を培養すること；ついで（ｂ）培地からヒト骨形態形成蛋白−１６（ＢＭＰ−１６）蛋白を回収し精製することを含む、精製されたヒトＢＭＰ−１６蛋白の製造方法。９．該宿主細胞が、配列番号：１のヌクレオチド５１１から８４０までからなるＤＮＡコーディング配列を含むＤＮＡ分子で形質転換されているものである請求項８の方法。１０．該宿主細胞が哺乳動物細胞であり、ＤＮＡ分子がさらにＴＧＦ−βスーパーファミリーの蛋白のメンバー由来のプロペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、該プロペプチドをコードするＤＮＡ配列が正しい読み枠においてＤＮＡコーディング配列に連結されているものである、請求項９の方法。１１．配列番号：２に示すアミノ酸１から１１０までのアミノ酸配列を含む精製された骨形態形成蛋白−１６（ＢＭＰ−１６）ポリペプチド。１２．該ポリペプチドがダイマーであり、少なくとも１つのサブユニットが配列番号：２のアミノ酸１から１１０までのアミノ酸配列を含むものである請求項１１の精製されたＢＭＰ−１６ポリペプチド。１３．下記工程：（ａ）請求項５記載のＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞を培養すること；ついで（ｂ）配列番号：２のアミノ酸１から１１０までのアミノ酸配列を含むポリペプチドを培地から回収し精製することにより製造される、精製された骨形態形成蛋白−１６（ＢＭＰ−１６）ポリペプチド。１４．該ポリペプチドが２個のサブユニットを含むダイマーであり、１のサブユニットが配列番号：２のアミノ酸１から１１０までのアミノ酸配列を含み、１のサブユニットがＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ− ５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ −１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、およびＢＭＰ−１５からなる群より選択される骨形態形成蛋白に関するアミノ酸配列を含むものである、請求項１２記載の精製された骨形態形成蛋白−１６（ＢＭＰ−１６）ポリペプチド。１５．骨形態形成蛋白−１６（ＢＭＰ−１６）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列にインフレーム(in frame)で連結されたＴＧＦ−βスーパーファミリーの蛋白のメンバー由来のプロペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むキメラＤＮＡ分子であって、該ＢＭＰ−１６ポリペプチドが配列番号：２のアミノ酸１から１１０までを含むものであるキメラＤＮＡ分子。１６．請求項１２記載の精製されたＢＭＰ−１６蛋白に対する抗体。