JP2001500737A - 骨形態形成蛋白―16(bmp―16)組成物 - Google Patents
骨形態形成蛋白―16(bmp―16)組成物Info
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Abstract
(57)【要約】
BMP−16蛋白およびその製造方法を開示する。BMP−16蛋白をコードするDNA分子も開示する。骨、軟骨、腱、靭帯および半月板を含む他の結合組織の欠損および疾病の治療に、傷の治癒および関連組織の修復に、ならびに表皮、神経、心筋を含む筋肉を包含する組織、および他の組織、および肝臓、肺、心臓、膵臓および腎臓組織のごとき器官の疾病および欠損、ならびに傷の治療に本発明蛋白を使用してもよい。また本発明蛋白は未分化胚性細胞および幹細胞の増殖および/または分化の誘導にも有用でありうる。
Description
【発明の詳細な説明】
骨形態形成蛋白−16(BMP−16)組成物
本発明は、骨形態形成蛋白−16(BMP−16)およびBMP−16関連蛋
白と命名された新規ファミリーの精製蛋白、それらをコードしているDNA、な
らびにそれらの製造方法に関する。これらの蛋白を用いて骨および/または軟骨
または結合組織の形成を誘導してもよく、さらに傷の治療および組織の修復に用
いてもよい。また、これらの蛋白を他の蛋白骨形態形成蛋白活性を増大させるた
めに用いてもよい。
発明の背景
骨および他の組織抽出物中に存在する骨、軟骨および他の結合組織の誘導活性
に関与する分子の検索は、骨形態形成蛋白(BMP)と呼ばれる新規セットの分
子の発見につながった。BMP−1からBMP−15と命名されたいくつかの蛋
白の構造がすでに詳細に調べられている。これらの蛋白のユニークな誘導活性は
、それらが骨に存在することとあいまって、それらは骨修復プロセスにおいて重
要なレギュレーターであり、骨組織の正常な維持に関与しているかもしれないと
いうことを示唆する。これらのプロセスにおいて役割を果たすさらなる蛋白が存
在するかどうかを確認することが必要である。本発明は、かかる蛋白の同定に関
するものであり、本発明者らはこれをヒトBMP−16と命名した。
ヒトBMP−16はノダル(Nodal)と呼ばれるネズミ蛋白のヒト相同体であ
るノダルのヌクレオチドおよびアミノ酸配列はZhou et al.,Nature,361:543-5
47(1993)に記載されている。ネズミのノダル遺伝子は原腸形成期間中のマウス結
節において発現されると記載されている。ネズミのノダル遺伝子に対するレトロ
ウイルスにより誘導される挿入的変異は、通常は原始線条に関連した中胚葉細胞
タイプの不存在を引き起こし、胚にとり致命的である。Conlon et al.,Developm
ent 120:1919-1928(1994);Conlon et al.,Development 111:969-981(1991)。発明の概要
本明細書の用語「BMP−16蛋白」は、配列番号:2において特定されるア
ミノ酸配列を有するヒトBMP−16蛋白をいい、さらに配列番号:1に示す生
の(native)ヒト配列のごとき、BMP−16蛋白をコードするDNA配列もい
う。配列番号:1および2の天然に存在する対立遺伝子配列、ならびに上記配列
の等価な縮重コドン配列も包含される。
BMP−16DNA配列(配列番号:1)およびアミノ酸配列(配列番号:2
)をを配列表に示す。BMP−16蛋白は、軟骨、骨、または他の結合組織、ま
たはそれらの組み合わせの形成を誘導する能力がある。ラット・骨形成アッセイ
における軟骨および/または骨および/または他の結合組織の形成活性について
は後述する。さらにBMP−16蛋白は、胚性細胞および/または幹細胞の増殖
および/または分化に対する影響を示すことによっても特徴づけられる。よって
、本発明蛋白および組成物は、胚性細胞または幹細胞の集団のごとき細胞集団を
処理して細胞の増殖および/または分化を促進または豊富化させることができる
。
配列番号:1に示すヌクレオチド511からヌクレオチド840までを含むD
NAで形質転換された細胞を培養し、次いで、配列番号:2に示すアミノ酸1か
らアミノ酸110までを含むアミノ酸配列により特徴づけられ、同時生成される
他の蛋白性物質を実質的に含まない蛋白を培地から回収し精製することにより、
ヒトBMP−16を製造してもよい。哺乳動物細胞における製造のためには、D
NA配列は、成熟BMP−16ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列
にイン・フレーム(in frame)で結合している適当な5’側のプロペプチドをコー
ドしているDNA配列をさらに含む。プロペプチドは生のBMP−16関連プロ
ペプチドであってもよく、あるいはTGF−βスーパーファミリーの別の蛋白由
来のプロペプチドであってもよい。生のBMP−16プロペプチドを用いる場合
、配列番号:1に示すヌクレオチド1から840までを含む、全BMP−16ポ
リペプチドをコードするDNA配列を含むDNA配列を用いて形質転換された細
胞を培養し、配列番号:2に示すアミノ酸−170から110までを含むアミ
ノ酸配列(アミノ酸配列−170から−1まではヒトBMP−16の生のプロペ
プチドを含む)により特徴づけられる蛋白を得て、ついで、配列番号:2に示す
アミノ酸1から110までを含むアミノ酸配列により特徴づけられ、同時生成さ
れる他の蛋白性物質を実質的に含まない蛋白を培地から回収し精製することによ
り、ヒトBMP−16を製造してもよい。
他の種、特にヒト種はヒトBMP−16蛋白に対して相同的なDNA配列を有
すると期待される。それゆえ、本発明は、ヒトBMP−16蛋白をコードしてい
るDNA配列、それらの方法により得られるDNA配列、およびそれらのDNA
配列によりコードされるヒト蛋白の取得方法を包含する。この方法は、ヒト遺伝
子またはコーディグ配列またはそのフラグメントを求めて標準的方法を用いてラ
イブラリーをスクリーニングするためのプローブを設計するための、ヒトBMP
−16蛋白のヌクレオチド配列またはその一部分の使用を伴う。よって、本発明
は、ヒトBMP−16に対して相同的でありヒトBMP−16配列を用いて得る
ことのできる他の種由来のDNA配列を包含する。また本発明は、ヒトBMP−
16蛋白の機能的フラグメント、およびかかる機能的フラグメントをコードする
DNA配列、ならびに他の関連蛋白の機能的フラグメントを包含する。かかるフ
ラグメントを機能させる能力は、BMP−16蛋白のアッセイに関して説明され
る生物学的アッセイにおける蛋白のアッセイにより調べることができる。完全な
成熟ヒトBMP−16蛋白をコードしているDNA配列(配列番号:1)および
対応アミノ酸配列(配列番号:2)を本明細書に示す。ヒトBMP−16 DN
A配列のごとき関係のあるDNA配列で形質転換された細胞を培養し、ついで、
BMP−16のごとき蛋白を培地から回収することにより、ヒトBMP−16の
ごとき本発明BMP−16蛋白を製造してもよい。精製された発現蛋白は、同時
生成される他の蛋白性物質ならびに他の混入物質を実質的に含まない。回収され
た精製蛋白は、軟骨および/または骨および/または結合組織形成活性を示すと
考えられる。よって、後に説明するラット・骨形成アッセイにおいて軟骨および
/または骨および/または他の結合組織の形成活性を示す能力により、本発明蛋
白をさらに特徴づけてもよい。さらに、胚性細胞および/または幹細胞の増殖お
よび/または分化に対する影響を示す能力によりBMP−16蛋白を特徴づけて
もよい。よって、本発明蛋白または組成物を、細胞の増殖および/または分化を
促進または豊富化する能力により特徴づけてもよい。
本発明のもう1つの態様は、医薬上許容される賦形剤または担体中の治療上有
効量のヒトBMP−16蛋白を含有する医薬組成物を提供する。これらの本発明
組成物を骨の形成に使用してもよい。さらに、軟骨、または腱、靭帯、半月のご
とき他の結合組織、ならびに上記のものの組み合わせ、例えば、骨に対する腱の
結合部分の再生のためにこれらの組成物を用いてもよい。ヒトBMP−16の組
成物ごとき本発明組成物を傷の治療および組織の修復に用いてもよい。本発明組
成物はさらに、少なくとも1種の他の治療上有用な作用剤、例えば、米国特許第
5,108,922、5,013,649、5,116,738、5,106,748、
5,187,076ならびに5,141,905号に開示のBMP−1、BMP−2
、BMP−3、BMP−4、BMP−5、BMP−6およびBMP−7;PCT
出願公開WO93/18098に開示のBMP−8;およびPCT出願公開WO
93/00432に開示のBMP−9;PCT出願公開WO94/26893に
開示のBMP−10;PCT出願公開WO94/26892に開示のBMP−1
1、1994年12月22日出願の同時係属出願第08/362670号に開示
のBMP−12またはBMP−13、または1995年5月18日出願の同時継
続出願第08/446,924号に開示されたBMP−15を含んでいてもよい
。有用でありうる他の組成物は、Vgr−2およびGDF(PCT出願公開WO
94/003140;WO94/15949;WO95/01801;WO95
/01802;WO94/21681;WO94/15966および他のものに
記載されているものを含む)を含んでいてもよい。WO94/01557に開示
のBIP;およびPCT出願公開WO93/16099に開示のMP52も本発
明において有用でありうる。上記の全出願の開示を、参照により本明細書に記載
されているものとみなす。
本発明組成物は、BMP−16関連蛋白のほかに、上皮増殖因子(EGF)、
線維芽細胞増殖因子(FGF)、形質転換増殖因子(TGF−αおよびTGF−
β)、アクチビン、インヒビン、およびインスリン様増殖因子(IGF)を包含
する他の治療上有用な作用剤を含んでなっていてもよい。また、組成物は、適当
なマトリックス、例えば、組成物を保持し、骨および/または軟骨の成長のため
の表面を提供するようなマトリックスを含有していてもよい。マトリックスは、
骨誘導性蛋白のゆっくりとした放出および/またはその存在のための適切な環境
を提供しうるものであってもよい。
本発明BMP−16含有組成物を、多くの骨および/または軟骨の欠損、歯周
病ならびに種々の形態の組織および傷の治療に使用してもよい。治療されうる組
織および傷は、上皮、神経、筋肉(心筋を包含)、および他の組織および傷、な
らびに肝臓、肺、心臓、膵臓および腎臓組織のごとき他の器官を包含する。本発
明によれば、これらの方法は、かかる骨および/または軟骨および/または結合
組織の形成、傷の治癒あるいは組織の修復を必要とする患者に有効量のBMP−
16蛋白を投与することを含む。BMP−16含有組成物を用いて、骨関節炎、
骨粗鬆症のごとき症状、および骨、軟骨、筋肉、腱、靭帯または他の結合組織、
肝臓、肺、心臓、膵臓および腎臓組織のごとき器官、ならびに他の組織の他の異
常を治療または予防してもよい。またこれらの方法は、上記の少なくとも1種の
他のBMP蛋白と組み合わせて本発明蛋白を投与することを伴う。さらに、これ
らの方法は、EGF、FGF、TGF−α、TGF−β、アクチビン、インヒビ
ンおよびIGFを包含する他の増殖因子とともにBMP−16蛋白を投与するこ
とも含む。
本発明のさらなる態様は、BMP−16蛋白の発現をコードするDNA配列で
ある。かかる配列は、配列番号:1に示された3’から5’方向へのヌクレオチ
ド配列、遺伝コードの縮重を除いては配列番号:1のDNA配列と同じDNA配
列であって配列番号:2の蛋白をコードしているDNA配列を包含する。さらに
、厳密な条件下で配列番号:1のDNA配列とハイブリダイズし、軟骨および/
または骨の形成を誘導する能力を有する蛋白をコードしているDNA配列も本発
明に包含される。好ましいDNA配列は、厳密な条件下[T Maniatis et al,Mol
ecular Cloning(A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor Laboratory 1982,3
87〜389参照]
でハイブリダイズするDNA配列である。かかるDNA配列が、配列番号:2に
示す成熟ヒトBMP−16アミノ酸配列に対して少なくとも約80%、より好ま
しくは少なくとも約90%の相同性を有するポリペプチドをコードしていること
が一般的に好ましい。結局、配列番号:1の配列の対立遺伝子変種または他の変
種も、ヌクレオチド変化がペプチド配列の変化をもたらすか否かにかかわらず、
その配列がBMP−16活性を有する場合には本発明に包含される。また本発明
は、BMP−16蛋白の活性を保持しているポリペプチドをコードする、配列番
号:1に示すBMP−16のDNA配列のフラグメントも包含する。
本発明DNA配列は、例えば、細胞集団中のBMP−16をコードするmRN
Aの検出用プローブとして有用である。よって、本発明は、BMP−16遺伝子
に関連した遺伝病、あるいはBMP−16が不規則に転写または発現される細胞
、器官または組織の疾病を包含する疾病の検出または診断方法を包含する。本発
明DNA配列は、下記の遺伝子治療に適用されるベクターの調製にも有用である
。
本発明のさらなる態様は、作動するように発現調節配列に連結された上記DN
A配列を含むベクターを包含する。作動するように発現調節配列に連結されたB
MP−16蛋白をコードしているDNA配列で形質転換された細胞系を適当な培
地で培養し、そこからBMP−16蛋白を回収し精製する、本発明の新規BMP
−16蛋白製造方法において、これらのベクターを使用することができる。この
方法には、多くの知られた真核細胞および原核細胞双方を該ポリペプチド発現の
ための宿主として使用することができる。ベクターを遺伝子治療に適用してもよ
い。かかる使用において、インビトロでベクターを患者の細胞中にトランスフェ
クションし、次いで、細胞を患者に再導入することができる。別法として、標的
トランスフェクションにより、インビボでベクターを患者に導入してもよい。
本発明のさらなる態様はBMP−16蛋白またはポリペプチドである。かかる
ポリペプチドは、配列番号:2に示す配列を含むアミノ酸配列、配列番号:2の
アミノ酸配列の変種(天然に存在する対立遺伝子変種を包含)、ならびに他の変
種(軟骨および/または骨および/または他の結合組織、あるいは肝臓、肺、心
臓、膵臓および腎臓組織のごとき他の器官の形成を誘導する能力、あるいはBM
P−16に特徴的な他の活性を保持している)のアミノ酸配列を有することによ
って特徴づけられる。好ましいポリペプチドは、配列番号:2に示す成熟ヒトB
MP−16アミノ酸配列に対して少なくとも約80%、より好ましくは少なくと
も約90%の相同性を有するポリペプチドを包含する。結局のところ、かかるア
ミノ酸の変化が突然変異、化学的変化またはDNA配列の変化により誘発された
かどうかにかかわらず、配列番号:2の配列の対立遺伝子変種または他の変種も
本発明に包含される。また本発明は、BMP−16蛋白の活性を保持している、
配列番号:2に示すBMP−16のアミノ酸配列のフラグメントを包含する。
抗体製造の分野において知られている方法を用い、本発明精製蛋白を用いてヒ
トBMP−16および/または他のBMP−16関連蛋白に対する抗体(モノク
ローナルまたはポリクローナル)を得てもよい。抗体はBMP−16および/ま
たは他のBMP−16関連蛋白の精製、あるいはBMP−16関連蛋白の効果の
抑制または防止に有用でありうる。本発明蛋白または組成物は、胚性細胞または
幹細胞のごとき比較的分化していない細胞集団を処理して細胞の増殖および/ま
たは分化を促進することにも有用でありうる。処理された細胞集団は遺伝子治療
への適用に有用でありうる。配列の説明
配列番号:1は、成熟ヒトBMP−16ポリペプチドをコードしているヌクレ
オチド配列を含むヌクレオチド配列である。
配列番号:2は、成熟ヒトBMP−16ポリペプチド配列を含むアミノ酸配列
である。
配列番号:3は、ヒトBMP−16ポリペプチドに対するゲノムDNAの第2
エキソンのヌクレオチド配列である。
配列番号:4は、ヒトBMP−16ポリペプチドに対するゲノムDNAの第3
エキソンのヌクレオチド配列である。発明の詳細な説明
ネズミBMP−16関連DNA配列の全体またはフラグメント、または部分ヒ
トBMP−16配列をプローブとして用いて本発明ヒトBMP−16配列を得る
。したがって、ヒトBMP−16DNA配列は、配列番号:1のヌクレオチド1
から840までのDNA配列を含む。このヒトBMP−16 DNA配列は、Ge
nbank受託番号X70514において説明されたネズミのノダルDNA配列のヌ
クレオチド526から1393までとよく対応する。ヒトBMP−16蛋白は、
配列番号:2のアミノ酸−170から110までの配列を含む。成熟ヒトBMP
−16蛋白は配列番号:1のヌクレオチド511から840までによりコードさ
れ、配列番号:2のアミノ酸1から110までの配列を含む。
ヒトBMP−16蛋白は、CHO細胞のごとき哺動物細胞により発現された場
合、種々のN末端を有するBMP−16蛋白の不均一な集団として存在すると考
えられる。活性種は、配列番号:2のアミノ酸10のシステイン残基から開始す
るアミノ酸配列を含むか、あるいはN末端方向のさらなるアミノ酸配列を含むで
あろうと考えられる。かくして、活性BMP−16蛋白をコードしているDNA
配列は、配列番号:1のヌクレオチド1、511もしくは538から837もし
くは840までを含むであろう。したがって、ヒトBMP−16の活性種は、配
列番号:2のアミノ酸−170、1もしくは10から109もしくは110まで
を含むと考えられる。
宿主細胞による蛋白の分泌に適するプロペプチドをコードしているコーディグ
配列であって成熟成熟BMP−16蛋白に対するコーディング配列の正しい読み
枠において連結されているコーディング配列で宿主細胞を形質転換してもよい。
例えば、米国特許第5,168,050号には、BMP−2以外の哺乳動物蛋白の
前駆体部分をコードしているDNAが成熟BMP−2部分をコードしているDN
Aに融合されていることが開示されており、参照によりその開示を本明細書に記
載されているものとみなす。かくして、本発明は、BMP−16以外の蛋白のT
GF−βスーパーファミリーのメンバー由来のプロペプチドをコードしているD
NA配列であって、ヒトBMP−16蛋白または関連蛋白をコードしている
DNA配列の正しい読み枠に連結しているDNA配列を含むキメラDNA分子を
包含する。「キメラ」なる用語は、プロペプチドがBMP−16蛋白とは異なる
ポリペプチド由来であることを意味するために用いられる。
イー・コリ(E.coli)で発現させることによりヒトBMP−16の1の活性種
のN末端は実験的に次のように決定されると考えられる:[M]HHLPDRS
QLC。よって、このBMP−16種のN末端は配列番号:1のアミノ酸1におけ
るものであり、該BMP−16種をコードしているDNA配列は配列番号:1の
ヌクレオチド511から840までを含むであろう。ヒトBMP−16モノマー
の見かけの分子量はNovex 16%トリシンゲルによるSDS−PAGEにより実
験的に13kdと決定される。ヒトBMP−16蛋白は、無色透明の0.1%ト
リフルオロ酢酸溶液として存在すると考えられる。
また、CHO細胞のごとき哺乳動物細胞により発現される他のBMP−16蛋
白は、種々のN末端を有するBMP−16蛋白の活性種の不均一集団として存在
する。例えば、ヒトBMP−16蛋白は、配列番号:2のアミノ酸10における
システイン残基から開始するアミノ酸配列を含むか、あるいはN末端方向のさら
なるアミノ酸配列を含むであろう。よって、活性BMP−16蛋白をコードして
いるDNA配列は、配列番号:1のヌクレオチド511もしくは538から83
7もしくは840までを含むヌクレオチド配列を含むと考えられる。したがって
、活性ヒトBMP−16蛋白は、配列番号:2のアミノ酸1もしくは10から1
09もしくは110までを含むアミノ酸配列を含む。
本発明BMP−16蛋白は、モノマー形態で約13kdの分子量を有するポリ
ペプチドを包含し、該ポリペプチドは配列番号:2のアミノ酸配列を含み、実施
例において説明するローゼン改変サムパス−レディ異所性インプラントアッセイ
(Rosen-Modified Sampath-Reddi ectopic implant assay)において、軟骨およ
び/または骨および/または他の結合組織の形成を誘導する能力を有する。
培地から回収されたBMP−16蛋白を、同時産生される他の蛋白性物質およ
び存在する他の汚染物質から単離することにより精製する。例えば、下記ラット
骨形成分析における軟骨および/または骨および/または結合組織の形成を誘導
する能力により、BMP−16蛋白を特徴づけてもよい。さらに、胚性細胞およ
び/または幹細胞の増殖および/または分化に対する影響によりBMP−16蛋
白を特徴づけてもよい。よって、本発明蛋白または組成物を下記の胚性幹細胞ア
ッセイにより特徴づけてもよい。
本発明により提供されるBMP−16蛋白は、配列番号:1と類似の配列によ
りコードされているが天然に修飾がなされている(例えば、ポリペプチドにおけ
るアミノ酸変化を引き起こしうるヌクレオチド配列中の対立遺伝子変種)かまた
は人工的に誘導体化されている因子も包含する。例えば、合成ポリペプチドが、
配列番号:2のアミノ酸残基の連続した配列のすべてまたは一部分を複製したも
のであってもよい。これらの配列は、一次、二次または三次構造およびコンホー
メーションの特徴を配列番号:2の骨増殖因子ポリペプチドと共有することによ
り、それらに共通した骨増殖因子の生物学的特性を有することができる。例えば
、蛋白の構造およびコンホーメーションを有意に変化させず、生物学的特性を維
持させつつ多くの保存的アミノ酸置換が可能であることが知られている。例えば
、リジン(LysまたはK)、アルギニン(ArgまたはR)およびヒスチジン
(HisまたはH)のごとき塩基性側鎖を有するアミノ酸間;アスパラギン酸(
AspまたはD)およびグルタミン酸(GluまたはE)のごとき酸性側鎖を有
するアミノ酸間;アスパラギン(AsnまたはN)、グルタミン(Glnまたは
Q)、セリン(SerまたはS)、スレオニン(ThrまたはT)およびチロシ
ン(TyrまたはY)のごとき荷電していない極性側鎖を有するアミノ酸間;な
らびにアラニン(AlaまたはA)、グリシン(GlyまたはG)、バリン(V
alまたはV)、ロイシン(LeuまたはL)、イソロイシン(IleまたはI
)、プロリン(ProまたはP)、フェニルアラニン(PheまたはF)、メチ
オニン(MetまたはM)、トリプトファン(TrpまたはW)およびシステイ
ン(CysまたはC)のごとき無極性側鎖を有するアミノ酸間において保存的ア
ミノ酸置換が可能であることが認識されている。よって、生のBMP−16に対
するこれらの修飾物および欠失物を天然に存在するBMP−16および他のポリ
ペプチドの生物学的活性置換物として治療プロセスに用いてもよい。BMP
−16およびBMP−16変種の両方を実施例記載のアッセイに供することによ
り、BMP−16変種がBMP−16の生物学的活性を有しているかどうかを容
易に決定することができる。
本明細書記載のBMP−16連蛋白の配列に対する他の特別な変異は、グリコ
シレーション部位の修飾を包含する。これらの修飾は、O−結合型またはN−結
合型グリコシレーション部位を包含する。例えば、グリコシレーションの不存在
または部分的にのみ行われたグリコシレーションは、アスパラギン結合型グリコ
シレーション認識部位におけるアミノ酸の置換もしくは欠失から生じる。アスパ
ラギン結合型グリコシレーション認識部位は、細胞の適当なグリコシレーション
酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド
配列は、アスパラギン−X−スレオニンまたはアスパラギン−X−セリンのいず
れかである(通常、Xはいかなるアミノ酸であってもよい)。グリコシレーショ
ン認識部位における第1または第3のアミノ酸の位置の一方または両方における
種々のアミノ酸置換もしくは欠失(および/または第2の位置におけるアミノ酸
の欠失)は、修飾されたトリペプチド配列におけるグリコシレーションを生じさ
せない。さらに、細菌細胞におけるBMP−16関連蛋白の発現は、グリコシレ
ーション認識部位を変化させずにグリコシレーションされていない蛋白を生じる
。
さらに本発明は、他の蛋白性物質をコードしているDNA配列と結合していな
い、BMP−16蛋白の発現をコードしている新規DNA配列を包含する。これ
らのDNA配列は、配列番号:1に示された5’から3’方向への配列、および
厳密(stringent)な条件下、例えば、65℃における0.1XSSC、0.1%
SDS[Maniatis,etal.,Molecular Cloning(A Laboratory Manual),Cold Sprin
g Harbor Laboratory(1982)pages387〜389]においてそれらの配列にハイブリダ
イズし、軟骨および/または骨および/または他の結合組織を誘導する活性を有
する蛋白をコードしている配列を包含する。さらにこれらのDNA配列は、配列
番号:1のDNA配列を含む配列、および厳密な条件下においてそれらにハイブ
リダイズし、BMP−16に関して開示された他の活性を維持している蛋白をコ
ードしている配列を包含する。
同様に、配列番号:1の配列によりコードされるBMP−16蛋白あるいは配
列番号:2のアミノ酸配列を含むBMP−16蛋白をコードするDNA配列であ
るが、遺伝暗号の縮重または対立遺伝子変異(種の集団において天然に存在する
塩基の変化であってアミノ酸の変化を生じることも生じないこともある)により
コドン配列が異なるDNA配列も、本明細書記載の新規因子をコードする。活性
、半減期もしくはコードされているポリペプチドの産生を増大するための、点突
然変異または誘発された修飾(挿入、欠失および置換を包含)により引き起こさ
れる配列番号:1のDNA配列における変化も本発明に包含される。
本発明の別の態様は、BMP−16蛋白の新規製造方法を提供する。本発明方
法は、既知調節配列の調節下に置かれた本発明BMP−16蛋白をコードしてい
るDNA配列で形質転換された適当な細胞系を培養することを包含する。形質転
換された宿主細胞を培養し、BMP−16蛋白を培地から回収し精製する。精製
蛋白は、同時産生される他の蛋白ならびに他の混入物質を実質的に含まない。
適当な細胞または細胞系は、チャイニーズハムスター・卵巣細胞(CHO)の
ごとき哺乳動物細胞であってもよい。適当な哺乳動物宿主細胞の選択および形質
転換、培養、増幅、スクリーニング、生成物の生産ならびに精製方法は当該分野
において知られている。例えば、Gething and Sambrook,Nature,293:620〜625(1
981)、あるいは、Kaufinan et al.,Mol.Cell.Biol.,5(7):1750〜1759(1985)もし
くはHowleyらの米国特許第4,419,446号参照。付記した実施例に記載した
別の適当な哺乳動物細胞系は、サル・COS−1細胞系である。哺乳動物細胞C
V−1も適当でありうる。
細菌細胞も適当な宿主である。例えば、種々のイー・コリ(E.coli)株(例え
ば、HB101、MC1061)は、バイオテクノロジーの分野において宿主細
胞としてよく知られている。ビー・ズブチリス(B.subtilis)、シュードモナス
(Pseudomonas)、他の枯草菌類等の種々の株も、この方法に使用することがで
きる。一般的には、細菌細胞における蛋白の発現のためにはBMP−16プロペ
プチドをコードしているDNAは必要ない。
当業者に知られた多くの酵母細胞も、本発明ポリペプチドの発現用宿主細胞と
して利用できる。さらに、所望ならば、昆虫細胞を本発明方法における宿主細胞
として使用することもできる。例えば、Miller et al.,Genetic Engineering,8:
277〜298(Plenum Press 1986)およびその中で引用されている文献参照。
本発明の別の態様は、これらの新規BMP−16ポリペプチドの発現方法に用
いるベクターを提供する。好ましくは、ベクターは、本発明の新規因子コードし
ている上記の新規DNA配列の全体を含むものである。さらに、ベクターは、B
MP−16蛋白配列の発現を可能にする適当な発現調節配列を含む。また、上記
修飾配列を含むベクターも、本発明の具体例である。さらに、配列番号:1の配
列またはBMP−16蛋白をコードしている他の配列を加工して、BMP−16
蛋白をコードしているプロペプチド配列を欠失させ、それらを他のBMP蛋白も
しくはTGF−βスーパーファミリーの他のメンバーの完全なプロペプチドをコ
ードしている配列と置換することにより成熟BMP−16蛋白を発現するように
することもできよう。かくして、本発明は、BMP−16ポリペプチドをコード
しているDNA配列の正しい読み枠に連結されたTGF−βスーパーファミリー
のメンバー由来のプロペプチドをコードしているキメラDNA分子を包含する。
ベクターを細胞系の形質転換方法に使用することができ、ベクターは選択され
た宿主細胞において本発明DNA配列の複製および発現を指令しうる、作動する
ように本発明配列に連結されている選択された調節配列を有している。かかるベ
クターのための調節配列は当業者に知られており、宿主細胞に応じて選択するこ
とができる。かかる選択は通常行われることであり、本発明の一部分を形成する
ことはない。
骨が正常に形成されない環境における軟骨および/または骨の形成を誘導する
本発明蛋白は、ヒトおよび他の哺乳動物における骨折および軟骨の損傷の治癒に
適用される。BMP−16蛋白を用いたかかる標品は、閉鎖性ならびに解放性の
骨折の減少および人工関節の定着の改善にも予防的に使用することができる。骨
形成性薬剤により誘導されるデノボ骨形成は、先天性の脳顔面頭蓋の欠損、外傷
または腫瘍学的切除術により誘発される脳顔面頭蓋の欠損に対して貢献し、さら
に美容整形手術にも有用である。BMP−16関連蛋白を歯周病の治療、および
その他の歯の治療工程に使用してもよい。かかる薬剤は、骨形成細胞を引き寄せ
るための環境を提供し、骨形成細胞の増殖を刺激し、あるいは骨形成細胞の前駆
細胞の分化を誘導することができる。本発明BMP−16ポリペプチドは骨粗鬆
症に治療においても有用でありうる。種々の骨原性、軟骨誘導性および骨誘導性
因子が記載されている。その議論については、例えば、欧州特許出願第148,
155号および第169,016号参照。
本発明蛋白を傷の治癒および関連組織の修復にも使用することができる。傷の
タイプは、熱傷、切り傷、潰瘍を包含するが、これらに限定しない(傷の治癒お
よび関連組織の治療の議論については、例えば、PCT公開WO84/0110
6参照)。さらに本発明蛋白は神経細胞、星状細胞およびグリア細胞の生存率を
高めるうるとも考えられ、それゆえ、移植および神経生存率および修復の低下を
示す症状の治療において有用でありうると考えられる。さらに本発明蛋白は、神
経、表皮および筋肉のごとき他のタイプの組織、ならびに肝臓、心臓、膵臓およ
び腎臓組織のごとき他の器官に関連した症状の治療にも有用でありうる。さらに
本発明蛋白は、胚性細胞または幹細胞のごとき比較的未分化の細胞集団を治療し
て細胞の増殖および/または分化を促進することにも有用でありうる。また本発
明蛋白は食事療法の添加物、または細胞培地の成分としても価値を有する可能性
がある。この用途には、蛋白は無処理の形態であってもよく、あるいはより吸収
されやすい添加物となるように前消化されていてもよい。
さらに本発明蛋白は、TGF−βスーパーファミリーの蛋白に特徴的な他の有
用な特性を有する可能性がある。かかる特性は、血管形成、化学走性および/ま
たは化学誘引性、ならびにコラーゲン合成、線維増多、分化応答、細胞増殖応答
および細胞付着、移動および細胞外マトリックスの応答の誘導をはじめとする細
胞に対する影響を包含する。これらの特性は、本発明蛋白を傷の治癒、線維増多
の抑制および瘢痕組織形成の抑制のための潜在的な作用剤としている。
他のBMP、他のTGF−βスーパーファミリーの蛋白、またはインヒビン−
α蛋白もしくはインヒビン−β蛋白とともにホモダイマーまたはヘテロダイマー
としてダイマー化する場合、本明細書においてさらに説明するように、BMP−
16ヘテロダイマーは卵胞刺激ホルモン(FSH)の産生に対する影響を示すと
考えられる。FSHは哺乳動物卵巣中の卵の発達を刺激し(Ross et al.,in Text
book of Endocrinology,ed.Williams.p.355(1981))、卵巣に対するFSHでの過
剰な刺激は多発性の排卵を誘発するであろうと認識されている。FSHは精巣機
能においても重要である。よって、メスの哺乳動物における受精能を抑制し、オ
スの哺乳動物における精子形成を抑制するインヒビンの能力に基づいた避妊薬と
して、BMP−16は有用でありうる。充分量の他のインヒビン類の投与により
哺乳動物における不妊を誘導することができる。またBMP−16は、下垂体前
葉の細胞からのFSH放出刺激におけるアクチビン分子の能力に基づいた受精能
誘導治療薬としても有用でありうる。例えば、米国特許第4798885号参照
。
BMP−16は、性的に未成熟な哺乳動物における受精を促進して、ウシ、ヒツ
ジおよびブタのごとき家畜の一生の間の繁殖能を改善することも可能である。さ
らに、BMP−16は、赤血球細胞の分化を誘導することにより、造血の転調に
おいて(例えば、Broxmeyer et al,Ptoc.Natl.Acad.Sci.USA,85:9052-9056(1998
)またはEtoetal,Biochem.Biophys.Res.Comm.,142:1095-1103(1987)参照)、ある
いは生殖腺腫瘍の発達を抑制することにおいて(例えば、Matzuk et al.,Nature
,360:313-319(1992)参照)、あるいは骨形態形成蛋白の活性を増大させること(
例えば、Ogawa et al.,J.Biol.Chem.,267:14233-14237(1992)参照)において有
用でありうると考えられる。
BMP−16蛋白は、記載されているように(例えば、Vale et al,Endocrino
logy,91:562-572(1972);Ling et al.,Nature,321:779-782(1986)またはVale et
al.,Nature,321:776-779(1986)参照)、ラット下垂体前葉細胞を用いる確立され
たインビトロバイオアッセイにおける卵胞刺激ホルモン(FSH)の放出を転調
させる能力によってさらに特徴づけられる。本発明BMP−16蛋白は、インヒ
ビンαまたはインヒビン−β鎖とヘテロダイマーを構成する場合、記載されてい
るように(Ling et al.,Nature,321:779-782(1986);Vale et al.,Nature,321:776
-779(1986)またはVale et al,Endocrinology,91:562-572(1972))、下垂体前葉細
胞からの卵胞刺激ホルモン
(FSH)の放出に対して刺激的または抑制的な調節効果を示すであろう。それ
ゆえ、個々の構成によっては、本発明BMP−16蛋白が下垂体前葉細胞からの
卵胞刺激ホルモン(FSH)の放出に対して対比的および逆の効果を有する可能
性がある。
アクチビンA(インヒビンβAのホモダイマー構成物)は赤血球刺激活性を有
することが示されている(例えば、Eto et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1
42:1095-1103(1987)およびMurata et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,85:2
434-2438(1988)およびYu et al.,Nature,330:765-767(1987)参照)。本発明BM
P−16蛋白は類似の赤血球刺激活性を有する可能性があると考えられる。BM
P−16蛋白のこの活性は、Lozzio et al.,Blood,45:321-334(1975)および米国
特許第5071834号により記載されたようなヒトK−562細胞系を用いて
行われる生物学的アッセイにおいてエリスロポイエチン活性を示す能力によって
も特徴づけることができる。
本発明のさらなる態様は、骨折の治療ならびに軟骨の修復および/または骨の
欠損もしくは歯周病に関連した他の症状の治療のための方法および組成物である
。さらに本発明は、傷の治癒および組織修復のための方法および組成物を含む。
かかる組成物は、医薬上許容される賦形剤、担体もしくはマトリックスと混合さ
れた治療上有効量の少なくとも1種の本発明BMP−16関連蛋白を含む。さら
に本発明組成物は神経生存率を高めうると考えられ、それゆえ、移植および神経
生存率の低下を示す症状の治療において有用でありうると考えられる。本発明組
成物は、さらに少なくとも1種の他の治療上有用な薬剤(例えば、TGF−βス
ーパーファミリーの蛋白)を含有していてもよく、その有用な薬剤には、BMP
蛋白、例えば、米国特許第5,108,922、5,013,649、5,116,7
38、5,106,748、5,187,076ならびに5,141,905号に開示
のBMP−1、BMP−2、BMP−3、BMP−4、BMP−5、BMP−6
およびBMP−7;PCT出願公開WO93/18098に開示のBMP−8;
およびPCT出願公開WO93/00432に開示のBMP−9;PCT出願公
開WO94/26893に開示のBMP−10;PCT出願公開WO94/26
892
に開示のBMP−11、1994年12月22日出願の同時係属出願第08/3
62670号に開示のBMP−12またはBMP−13)、または1995年5
月18日出願の同時係属特許出願第08/446924号に開示のBMP−15
が包含される。有用でありうる他の組成物は、Vgr−2およびGDFs(PC
T出願公開WO94/003140;WO94/15949;WO95/018
01;WO95/01802;WO94/21681;WO94/15966;W
O95/10539;WO96/01845;WO96/02559および他の
ものに記載されているものを含む)を含んでいてもよい。WO94/01557
に開示のBIP;日本国の公開番号第7−250688号に開示のHP0026
9;ならびにPCT出願公開WO93/16099に開示のMP52も本発明に
おいて有用でありうる。上記出願の開示を参照により本明細書に記載されている
ものとみなす。
ヒトBMP−16蛋白は、その性質上、ホモダイマーまたはヘテロダイマーと
して存在しうると考えられる。安定性の向上したBMP−16および有用蛋白の
ダイマーの形成を促進するためには、一般的には、配列番号:1のDNA配列を
加工して1個またはそれ以上のさらなるシステイン残基を有するようにし、ダイ
マー形成の可能性を高めることができる。得られるDNA配列は、BMP−16
の「システイン付加変種」を生じうるであろう。好ましい具体例において、配列
番号:1のDNA配列を加工して、1個またはそれ以上のコドンを、TGTまた
はTGCのごときシステイン残基をコードするヌクレオチドトリプレットに変化
させる。別法として、配列番号:2の1個またはそれ以上のアミノ酸残基をCy
sに変化させることにより、アミノ酸レベルで蛋白配列を変化させるこよにより
BMP−16蛋白の「システイン付加変種」を得ることもできる。蛋白の「シス
テイン付加変種」の製造につては米国特許第5166322号に記載されており
、参照によりその開示を本明細書に記載されているものとみなす。
本発明蛋白は、他の関連蛋白および増殖因子と協同して、あるいはおそらく相
乗的に作用しうると期待される。それゆえ、本発明のさらなる治療方法および組
成物は、上記出願に開示されたBMP蛋白のごときTGF−βスーパーファミリ
ー蛋白の少なくとも1つのメンバーと混合された治療量の少なくとも1種の本発
明BMP−16蛋白を含んでなる。かかる混合物は、個々のBMP蛋白分子また
は異なるBMP部分よりなる異種分子を含みうる。例えば、本発明方法および組
成物が、BMP−16蛋白サブユニットおよび上記「BMP」蛋白のうちの1種
に由来するサブユニットよりなるジスルフィド結合したダイマーからなっていて
もよい。かくして、本発明は精製BMP−16関連ポリペプチドを包含し、該精
製BMP−16関連ポリペプチドは、一方のサブユニットが配列番号:2のアミ
ノ酸1から110までのアミノ酸配列を含み、もう一方のサブユニットがBMP
−1、BMP−2、BMP−3、BMP−4、BMP−5、BMP−6、BMP
−7、BMP−8、BMP−9、BMP−10、BMP−11またはBMP−1
2またはBMP−13(PCT出願WO95/16035に開示)、またはBM
P−15(1995年5月18日出願の同時係属特許出願第08/446924
号に開示)からなる群より選択される骨形態形成蛋白に関するアミノ酸配列を含
むヘテロダイマーである。さらなる具体例は、BMP−16関連部分、例えばヒ
トBMP−16およびネズミのノダル蛋白(ヒトBMP−16の相同体)を含む
ヘテロダイマーを包含しうる。さらに、BMP−16蛋白を、骨および/または
軟骨の欠損、傷、もしくは問題となっている組織の治療に有益な他の薬剤と混合
してもよい。これらの薬剤は、上皮増殖因子(EGF)、線維芽細胞増殖因子(
FGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、形質転換増殖因子(TGF−αお
よびTGF−β)、ならびにk−線維芽細胞増殖因子、副甲状腺ホルモン(PT
H)、白血病阻害因子(LIF/HILDA/DIA)、インスリン様増殖因子
(IGF−IおよびIGF−II)を包含する。これらの薬剤の部分も、本発明組
成物に使用することができる。
pH、等張性、安定性等に関するかかる生理学的に許容される蛋白組成物の調
製および処方は当該分野の範囲内である。さらに、本発明治療組成物は、BMP
蛋白が種特異性を欠くことから、獣医学にも適用価値がある。特に、人以外には
家畜およびサラブレッドのウマが、本発明BMP−16蛋白での治療に関する望
ましい対象である。
本発明治療方法は、組成物を、局所的に、全身的に、または移植もしくはデバ
イスのように部分的に投与することを包含する。もちろん、本発明に使用する治
療組成物は、投与する場合にはパイロジェンがなく、生理学的に許容される形態
である。さらに、望ましくは、組成物を、骨、軟骨または組織の損傷部位に送達
するためにカプセル封入するか、あるいは粘度のある形態として注射する。傷の
治癒および組織の修復には局所投与が適当であろう。上記組成物中に含有されて
いてもよいBMP−16関連蛋白以外の治療上有用な薬剤を、本発明方法におい
て、本発明BMP組成物と同時または逐次的に、BMP組成物に代えて、あるい
はこれに追加して投与してもよい。
好ましくは、骨、軟骨または他の結合組織の形成のためには、組成物は、損傷
を受けて修復を必要とする組織の部位にBMP−16関連蛋白または他のBMP
蛋白を送達し、骨および軟骨の発達のための構造を提供し、最適には体内に吸収
されうるマトリックスを含有する。該マトリックスが、BMP−16蛋白および
/または他の骨誘導蛋白の遅延した放出、ならびに細胞の浸潤のための正しい構
造および適切な環境を提供するものであってもよい。かかるマトリックスは、他
の移植される医療用具に使用する材料から作られる。
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容上の外
観および界面の特性に基づく。BMP−16組成物のそれぞれの適用により適切
な処方が決定されるであろう。組成物に有用なマトリックスは生分解性であり、
化学的に知られている硫酸カルシウム、リン酸三石灰、ヒドロキシアパタイト、
ポリ乳酸およびポリ無水物であってもよい。他の有用な材料は生分解性であり、
骨、腱または皮膚コラーゲンのごとき生物学的に十分に知られているものである
。さらなるマトリックスは純粋蛋白または細胞外マトリックス成分を含む。他の
有用なマトリックスは非生分解性で、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス
、アルミン酸、または他のセラミックスのごとき化学的に知られているものであ
る。マトリックスが、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、またはコラーゲン
およびリン酸三石灰のごとき、上記タイプの材料のいずれかの混合物からなって
いてもよい。例えば、カルシウム−アルミン酸−リン酸のような組成物中におい
てバ
イオセラミックスを変更してもよく、さらにその孔サイズ、粒子形態および生分
解性を変化させてもよい。
BMP−16蛋白の作用を変化させる種々の因子、例えば、形成が望まれる骨
の重量、骨損傷部位、損傷した骨の状態、傷のサイズ、損傷を受けた組織のタイ
プ、患者の年齢、性別ならびに食事、感染があればその程度、投与期間、および
他の臨床的因子を医師が考慮することにより、投与規則が決定されよう。再構成
に用いるマトリックスのタイプおよび組成物中のBMP蛋白のタイプに応じて用
量を変更してもよい。IGF−I(インスリン様増殖因子I)のごとき他の知ら
れた因子を最終組成物に添加することも、投薬を有効にする可能性がある。
骨の成長および/または修復を定期的に評価することにより、進行をモニター
することができる。例えば、X線、組織形態学的測定、およびテトラサイクリン
標識により、進行をモニターすることができる。
以下の実施例は、ヒトBMP−16および他のBMP−16関連蛋白の回収な
らびに特徴付け、組み換え法によるヒト蛋白の取得および蛋白の発現に関して、
本発明の実施につき説明する。
実施例
実施例1
DNAの単離
ヒトBMP−16およびヒトBMP−16関連蛋白をコードするDNA配列を
、当業者に知られた種々の方法により単離することができる。
以下に記載のごとく、BMP蛋白およびTGF−βスーパーファミリーの他の
蛋白に関する知識に基づけば、これらの分子(成熟ペプチド)のカルボキシル末
端部分がアミノ末端部分(プロペプチド領域)よりも高い配列保存性を示すこと
が予想される。BMP蛋白およびTGF−βファミリーの他の蛋白の間のこと配
列関連性により、当業者は、これらの分子のカルボキシル末端をコードする部分
からDNAプローブを設計し、これを用いて関連BMP蛋白およびTGF−βフ
ァミリーの他の蛋白を同定することができる。下記のごとく、ネズミのノダル遺
伝子の成熟ペプチドをコードする領域を用いてBMP−16およびBMP−16
関連蛋白を同定することができる。
ネズミのノダル遺伝子(Genbank受託番号X70514)のヌクレオチド10
60から1390までに対応するDNAプローブを32Pで放射性標識し、厳密な
ハイブリダイゼーション/洗浄条件下でのヒトゲノムライブラリーをスクリーニ
ングしてヒトBMP−16遺伝子配列または他のBMP−16関連遺伝子配列を
含む組み換えクローンを同定することができる。
ヒトBMP−16
ベクターλDASH II(Stratageneカタログ番号945203)中に構築
されたヒトゲノムライブラリーの100万個の組み換え体を、50枚のプレート
に約20000個/プレートとなるように撒く。標準ハイブリダイゼーションバ
ッファー(5XSSC,0.1% SDS,5Xデンハーツ,100μg/mlサ
ケ精子DNA)中で、厳密さを減じて(60℃でほぼ2日間)、組み換えバクテ
ロイファージプラークの複製ニトロセルロースレプリカを32P標識したネズミの
ノダルDNAプローブ(上記)とハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイ
ゼーション2日目に、放射性標識されたネズミのノダルDNAフラグメントを含
有するハイブリダイゼーション溶液を除去し、厳密さを減じた条件下(2XSS
C,0.1%SDS,60℃)でフィルイターを洗浄する。フィルターをサランラ
ップで包み、−80℃において増強スクリーンを用いてX線フィルムに一晩ない
し3日間さらす。オートラジオグラフを現像し、種々のシグナル強度の複数のハ
イブリダイゼーション陽性組み換え体を同定する。これらの低い厳密さでのハイ
ブリダイゼーション陽性クローンをプラーク精製する。プラーク精製した組み換
え体のバクテリオファージプラークのストックを作成し、バクテリオファージD
NAを単離する。
個々のハイブリダイゼーション陽性組み換え体バクテリオファージクローンを
、すでに開示されているBMP配列またはTGF−βファミリーの他のメンバー
に対応するDNA配列の存在について試験する。すでにBMP配列およびTGF
−
βファミリーの他のメンバーのDNA配列を明らかにするために使用されるオリ
ゴヌクレオチドをガラスチップ表面に固定化した。固定化オリゴヌクレオチドの
列に対するハイブリダイゼーション分析に使用する鋳型を以下のようにして得る
:
ネズミのノダルプローブを用いて同定(上記実験)されたハイブリダイゼーシ
ョン陽性ヒトゲノムクローン由来の組み換えバクテリオファージDNAを特異的
DNA増幅に供する。バクテリオファージクローニングベクターλDASHII
のDNA配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ハイブリダイ
ゼーション陽性組み換えクローンのヒトゲノムDNAインサートを特異的に増幅
する。ラムダDASH IIRゲノムクローニングベクター(Stratagene Cloning
systems,Inc.;La Jolla,CA)の配列に基づいて下記ヌクレオチドプライマーを設
計し、自動DNA合成装置で合成する。
オリゴヌクレオチド1および2をプライマーとして用いて、低い厳密さのハイ
ブリダイゼーションにより同定された組み換え体のヒトゲノムDNAインサート
またはバクテリオファージクローニングベクターλ DASH II中に含まれる
組み換えDNAインサートの特異的増幅を可能にする。増幅反応を以下のように
して行う:約500ngの精製組み換えバクテリオファージDNAまたは精製バ
クテリオファージプラークの水性溶離液から直接得られた不特定量の組み換えバ
クテリオファージDNAを、250μMの各デオキシヌクレオチド三リン酸(d
ATP、dGTPおよびdTTP)、90μMのDCTP、30μMのフルオレ
セイン−dCTP、1.3mMのMg(OAc)2、40ユニット/mlのPerkin
-Elmer Cetus rTthDNAポリメラーゼ(カタログ番号N808−0180)、
400mMのオリゴヌクレオチドプライマー1および400nMのオリゴヌクレ
オチドプライマー2の入った1X PerkiElmer Cetus GeneAmpR XLバッファー(カ
タログ番号N808−0180−トリシン、酢酸カリウム、グリセロールおよび
DMSOを含む)に添加する。反応混合物を下記サーマルサイクリングに供する
:
93℃で1分を1サイクル、93℃で40秒、ついで68℃で12分を30サイ
クル、その後65℃で10分を1サイクル。この反応により特異的に増幅される
約1μgのDNAを、50mM Tris−HCl pH7.5,10mM MgS
O4,50mgウシ血清アルブミン(BSA)/ml、および0.1mM DTT
中、37℃で90分間、18ミリユニットのRQ1 RNase不含DNase
(Promega Corp.,Madison,WI/カタログ番号M6101)で消化した。0.1体積
の0.5M Na2EDTAを添加して反応を停止させた。上記条件で特異的に増
幅されたDNAのフラグメント化により、約1500ないし50塩基対の範囲の
DNAフラグメントを得る。1500ないし50塩基対の特異的に増幅されたD
NAフラグメントを95℃で10分間熱変性させる。フラグメント化され、変性
したDNAの溶液を6X SSPE,0.05% Triton X-100の最終濃度とし、
ついで、ガラス表面に固定化されたBMP/TGF−βファミリーの標本オリゴ
ヌクレオチドの列に37℃で4時間ないし一晩ハイブリダイゼーションさせる。
ハイブリダイゼーションしたBMP/TGF−βファミリーの標本オリゴヌクレ
オチドの列(ガラス表面に固定化されている)を0.5X SSPE,0.005
% Triton X-100で洗浄し、GeneChip 50 Scarmer(Affymetrix)により分析した
。
329塩基対のネズミのノダルプローブにハイブリダイゼーションする組み換
えバクテリオファージクローンの1つをλHG−NR35−1と命名した。BM
P/TGF−βファミリーのオリゴヌクレオチドの列を用いるこのクローンの分
析により、ガラスチップ上のオリゴヌクレオチドの列の小さな部分集合に対する
陽性ハイブリダイゼーションパターンが得られた。陽性のハイブリダイゼーショ
ンシグナルにより確認されたオリゴヌクレオチドの1つを用いて、ネズミのプロ
ーブに対する元々のハイブリダイゼーションシグナルの原因であったヒトゲノム
インサートの領域のDNA配列を決定した。このオリゴヌクレオチドの配列を下
に示す:
ネズミのノダル配列(Genbank受託番号X70514)のヌクレオチド
1173から1190までに対応するこのオリゴヌクレオチドを用いてλHG−
NR35−1ゲノムクローンのDNA配列分析を行い、本願開示のヒトBMP−
16配列の一部分を同定した。バクテリオファージλHG−NR35−1は、1
996年6月25日に、American Type Culture Collection,12301 Parklawn Dr
ive,Rockville,MD(ATCC)に受託番号97623として寄託された。この寄
託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定
を満たしたものである。この組み換え体λHG−NR35−1のハイブリダイゼ
ーション領域は長さ約2.1キロベース(kb)および4.3kbの3kbの2つ
のBamHIフラグメントに局在している。これらの各フラグメントをプラスミ
ドベクターpGEM−3中にサブクローン化する。2.1kbおよび4.3kbの
BamHIフラグメントを含むプラスミドサブクローンをそれぞれDH5α/p
GEM#−NR35−1#B2およびDH5α/pGEM#−NR35−1#B
18と命名する。2.1kbのBamHIハイブリダイゼーションフラグメント
を含むプラスミド(DH5α/pGEM#−NR35−1#B2)は1996年
6月25日に受託番号98085としてATCCに寄託された。4.3kbのB
amHIハイブリダイゼーションフラグメントを含むプラスミド(DH5α/p
GEM#−NR35−1#B18)は1996年6月25日に受託番号9808
4としてATCCに寄託された。これらの寄託物は、特許手続上の微生物の寄託
の国際的承認に関するブダペスト条約の規定を満たしたものである。プラスミド
サブクローンDH5α/pGEM#−NR35−1#B2の2.1kbのインサ
ートの一部分のDNA配列を配列番号:3に示す。ネズミのノダル遺伝子のエキ
ソン2(Genbank受託番号X70514のヌクレオチド524から1240まで
)との比較により明らかなように、この配列の一部分(ヌクレオチド383から
1080まで)はヒトBMP−16遺伝子のエキソン2である。プラスミドサブ
クローンDH5α/pGEM#−NR35−1#B18の4.3kbのインサー
トの一部分のDNA配列を配列番号:4に示す。ネズミのノダル遺伝子のエキソ
ン3(Genbank受託番号X70514のヌクレオチド1241から1390まで
)との比較により明らかなように、この配列の一部分(ヌクレオ
チド434から583まで)はヒトBMP−16遺伝子のエキソン3である。ネ
ズミのノダル遺伝子構造その中に含まれる特定の蛋白コーディングヌクレオチド
配列、上記ヒトBMP−16遺伝子のエキソン2(配列番号:3)およびエキソ
ン3(配列番号:4)中に含まれる配列とそれらの配列との比較に関する知識に
基づけば、本発明ヒトBMP−16蛋白の部分コーディング配列を編集すること
ができる。この部分ヒトBMP−16コーディング配列(そこから配列番号:3
および配列番号:4の介在配列/イントロンおよび他の非BMP−16蛋白コー
ディング配列が除かれている)を配列番号:1に示す。ヒトBMP−16遺伝子
のエキソン2およびエキソン3からの配列を融合させることにより推定される編
集配列は、本発明ヒトBMP−16蛋白の280個のアミノ酸をコードする84
0個のヌクレオチド(配列番号:1のヌクレオチド1から840まで)からなる
読み枠を画定する。配列番号:2に示される、コードされる280個のアミノ酸
からなるBMP16蛋白前駆体ポリペプチドは、全成熟ヒトBMP−16ペプチ
ド(配列番号:2のアミノ酸1から110まで)ならびにBMP−16プロペプ
チドのC末端部分(配列番号:2のアミノ酸−170から−1まで)を含む。
他のBMP蛋白およびTGF−βファミリーの他の蛋白に関する知識に基づけ
ば、ヒトBMP−16前駆体ポリペプチドは、コンセンサス蛋白分解プロセッシ
ング配列Arg−X−X−Argに当てはまる多塩基配列Arg−His−Ar
g−Argにおいて開裂されるであろう。ヒトBMP−16前駆体ポリペプチド
の開裂は、配列番号:2の位置1のアミノ酸Hisから始まる110個のアミノ
酸の成熟ペプチドを生じると考えられる。ヒトBMP−16の成熟形態へのプロ
セッシングは、関連蛋白TGF−βのプロセッシング[Gentry et al.,Molec&Ce
ll.Biol.8:4162(1988);Derynck et al.Nature,316:701(1985)]と類似の様式での
ダイマー化およびN末端の除去を含むと考えられる。
それゆえ、ヒトBMP−16の成熟活性種は2つのポリペプチドのホモダイマ
ーを含むと考えられ、各サブユニットは配列番号:2のアミノ酸1から110ま
でを含み、推定分子量は約13000ダルトンである。さらなる活性種は、少な
くとも配列番号:2のアミノ酸24から125までを含み、それゆえ、最初の保
存されたシステイン残基を含むと考えられる。TGF−β/BMPファミリーの
蛋白の他のメンバーについては、ヒトBMP−16蛋白のカルボキシ末端部分は
アミノ末端部分よりも大きな配列保存性を示す。システイン豊富C末端ドメイン
(配列番号:2のアミノ酸10から110まで)におけるヒトBMP−16蛋白
の、ヒトBMP蛋白およびTGF−βファミリーの他の蛋白の対応領域に対する
アミノ酸同一性パーセンテージは次のとおり:BMP−2,42%;BMP−3,
41%;BMP−4,40%;BMP−5,42%;BMP−6,45%;BMP
−7,43%;BMP−8,45%;BMP−9,44%;BMP−10,43%;
BMP−11,35%;BMP−12,45%;BMP−13,46%;BMP
−15,36%;Vgl,44%;GDF−1,38%;TGF−β1,29%;
TGF−β2,32%;TGF−β3,29%;インヒビンβB,38%;インヒビ
ンβA,43%。
ヒトBMP−16DNA配列(配列番号:1)、またはその一部分をプローブ
として用いて、ヒトBMP−16またはヒトBMP−16関連mRNAを合成す
るヒト細胞系または組織を同定することができる。簡単に説明すると、RNAを
選択細胞または組織源から抽出し、ホルムアミドアガロースゲル電気泳動してニ
トロセルロースに移すか、あるいはホルムアルデヒドと反応させてニトロセルロ
ースに直接スポットする。次いで、ニトロセルロースを、ヒトBMP−16のコ
ーディング配列由来のプローブとハイブリダイゼーションさせる。
別法として、ヒトBMP−16配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマーを
設計する。ヒトBMP−16由来のプライマーは、特異的増幅反応を行うために
使用される該プライマー間の領域に存在する配列をコードしているヒトBMP−
16コーディング配列またはヒトBMP−16関連コーディング配列の一部分を
特異的に増幅するであろう。これらのヒトBMP−16由来のプライマーは、m
RNA、cDNAまたはゲノムDNA鋳型から、対応ヒトBMP−16またはB
MP−16関連部分のコーディング配列を特異的に増幅することを可能にするで
あろうと考えられる。上記方法のいずれかにより、可能性のある源が同定された
ならば、オリゴ(dT)セルロースクロマトグラフィーによりmRNAを選択
し、cDNAを合成し、確立されている方法(Tooleらの上記文献)によりλg
t10または当業者に知られた他のλバクテリオファージベクター(例えば、λ
ZAP)に組み込む。λバクテリオファージベクター中に組み込まれている、す
でに確立されているヒトcDNAまたはゲノムライブラリーに対して、上記オリ
ゴヌクレオチドプライマーによる増幅反応を行うこともできる。かかる場合、増
幅されたヒトBMP−16またはBMP−16関連蛋白をコードしているDNA
のフラグメントをプローブとして用いて、ヒトBMP−16またはBMP−16
関連蛋白の一部分をコードしている特異的増幅DNA生成物を生じるライブラリ
ーを直接スクリーニングすることができる。
当業者に知られたさらなる配列を用いてヒトBMP−16関連蛋白をコードし
ている他の全長cDNA、または本発明BMP−16関連蛋白をコードしている
全長cDNAクローンを、ヒト以外の種、特に他の哺乳動物種から単離すること
ができる。
実施例2W−20バイオアッセイ
A.W-20細胞の説明
インジケーター細胞系としてのW−20骨髄基質細胞の使用は、BMP蛋白で
の処理後のこれらの細胞の骨芽細胞への変換に基づく[Thies et al.,Journal o
f Bone and Minaral Research,5:305(1990);およびThieset al.,Endocrinology
,130:1318(1992)]。詳細には、W−20細胞は、マサチューセッツ州ボストン
のチルドレンズ・ホスピタル(Children'sHospital)のD.Nathan博士の研究室の
研究者により成体マウスから取られたクローン化された骨髄基質細胞系である。
ある種のBMP蛋白でのW−20細胞の処理は、(1)アルカリ性ホスファター
ゼ産生増加、(2)PTHにより刺激されるcAMPの誘導、および(3)細胞
によるオステオカルシン(osteocalcin)合成の誘導を引き起こす。(1)およ
び(2)は骨芽細胞の表現形に関連した特徴を示すが、オステオカルシン合成能
は成熟骨芽細胞によってのみ示される特性である。さらにそのうえ、現在まで、
我々は、
BMPで処理した場合のみ起こるW−20基質細胞の骨芽細胞様への変換を観察
してきた。この様式において、BMP処理されたW−20細胞により示されるイ
ンビトロ活性は、BMPについて知られているインビボでの骨形成活性と相関が
ある。
新規骨誘導分子のBMP活性を比較することにおいて有用な2種のインビトロ
での分析を以下に説明する。
B.W−20アルカリ性ホスファターゼ分析のプロトコール
W−20細胞を、96ウェルの組織培養プレートにウェルあたり200μlの
培地(10%熱不活性化ウシ胎児血清、2mMグルタミンおよび100ユニット
/mlペニシリン+100μg/mlストレプトマイシンを含有するDME)中
10000個の割合で撒く。95%空気、5%CO2のインキュベーター中37
℃において細胞を一晩付着させる。マルチチャンネルピペッターで各ウェルから
200μlの培地を除去し、10%熱不活性化ウシ胎児血清、2mMグルタミン
および1%ペニシリン−シトレプトマイシンを含有するDME中の同体積の試験
試料で置換した。試験物質を3系で分析する。試験試料および標準をW−20イ
ンジケーター細胞とともに24時間インキュベーションする。24時間後、37
℃のインキュベーターからプレートを取り出し、試験培地細胞をから除去する。
W−20細胞層をウェルあたり200μlのカルシウム/マグネシウム不含リン
酸緩衝化セイラインで3回洗浄し、これらの洗液を捨てる。ガラス製装置で蒸留
された50μlの水を各ウェルに添加し、次いで、分析プレートを急速に冷凍す
るためにドライアイス/エタノール浴に置く。凍結したら、分析プレートをドラ
イアイス/エタノール浴から取り出し、37℃で融解させる。この工程を2回以
上繰り返して全部で3回の凍結融解工程を行う。工程終了後、膜結合アルカリ性
ホスファターゼを測定に供する。50μlの分析混合物(50mMグリシン、0
.05% Triton X-100、4mM MgCl2、5mMリン酸p−ニトロフェノール
、pH=10.3)を各分析ウェルに添加し、次いで、分析プレートを、1分間
に60回振盪しながら37℃で30分インキュベーションする。30分間のイン
キュベーションの終わりに、100μlの0.2N NaOHを各ウェルに添加し
、
分析プレートを氷上に置くことにより反応を停止する。各ウェルの分光学的吸光
度を405ナノメーターの波長において読む。次いで、これらの値を既知標準と
比較して各試料のアルカリ性ホスファターゼ活性の評価を行う。例えば、既知量
のリン酸p−ニトロフェノールを用いると、吸光度値が得られる。これを表Iに
示す。
既知量のBMPに関する吸光度値を決定し、表IIに示すような単位時間あた
り開裂されたリン酸p−ニトロフェノールのμモル数に変換することができる。
次いで、これらの値を用いて既知量のBMP−16の活性をBMP−2活性と
比較する。
C.オステオカルシンRIAプロトコール
W−20細胞を、24ウェルのマルチウェル組織培養ディッシュの各ウェルに
、2mlのDME(10%熱不活性化ウシ胎児血清、2mMグルタミンを含有)
中106個となるように撒く。95%空気、5%CO2中37℃において細胞を一
晩付着させる。翌日、培地を、2mlの全体積中10%ウシ胎児血清、2mMグ
ルタミンおよび試験物質を含有するDMEに交換する。各試験物質を3系のウェ
ルに入れる。試験物質をW−20細胞とともに合計96時間(48時間目に同じ
培地で培地交換)インキュベーションする。96時間のインキュベーションの終
わりに、各ウェルから50μlの試験培地を取り、マウスオステオカルシンにつ
いてのラジオイムノ分析を用いてオステオカルシン産生について分析を行う。分
析の詳細は、マサチューセッツ州02072、スタウトン、ペイジ・ストリート
378のバイオメディカル・テクノロジーズ・インコーポレイテッド(Biomedic
al Techologies Inc.)により製造されたキットに説明がある。分析のための試
薬は、製品番号BT−431(マウスオステオカルシン標準)、BT−432(
ヤギ抗−マウスオステオカルシン)、BT−431R(ヨウ素化されたマウスオ
ステオカルシン)、BT−415(正常ヤギ血清)およびBT−414(ロバ抗
−ヤギIgG)として見いだされる。BMP処理に応答したW−20胞により合
成されたオステオカルシンについてのRIAを、製造者により提供されるプロト
コールに記載されたようにして行う。
試験試料に関して得られた値をマウスオステオカルシンの既知標準に関する値
と比較し、既知量のBMP−2での処理に応答してW−20細胞により産生され
たオステオカルシン量と比較する。BMP−2により誘導されたW−20による
オステオカルシン合成量を表IIIに示す。実施例3ローゼン改変サムパス−レディアッセイ
Sampath and Reddi,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:6591-6595(1983)に記載され
たラット骨形成アッセイの改変バージョンを用いて骨および/または軟骨および
/または他の結合組織におけるBMP蛋白の活性を評価する。サムパス−レディ
法のエタノール沈殿工程を、アッセイすべきフラクションを水に対して透析(組
成物が溶液の場合)または限界濾過(組成物が懸濁液の場合)することに置き換
える。次いで、溶液または懸濁液を0.1%TFAに対して平衡化させる。得ら
れた溶液を20mgのラットのマトリックスに添加する。蛋白処理していない疑
似ラット・マトリックス試料は対照として役立つ。この材料を凍結し、凍結乾燥
して得られた粉末を5番のゼラチンカプセルに封入する。21〜49日齢のロン
グ・エバンズ・ラット(Long Evans rat)の腹胸部の皮下にカプセルを移植する
。インプラントを7〜14日後に取る。各インプラントの半分をアルカリ性ホス
ファターゼアッセイ[Proc.Natl.Acad.Sci.,69:1601(1972)]に用いる。
各インプラントのもう半分を固定し、組織学的分析用に処理する。1ミクロン
のグリコメタクリレート切片をフォン・コッサおよび酸フクシンで染色して各イ
ンプラントにおいて誘導された骨および軟骨の形成の評点をつける。+1ないし
+5は、新たな骨および/または軟骨細胞ならびにマトリックスにより占められ
たインプラントの各組織学的切片の面積を表す。+5の評点は、インプラントの
50%よりも多くの部分が、インプラントにおける蛋白の直接の結果として生成
された新たな骨および/または軟骨であることを示す。評点+4、+3、+2お
よび+1は、それぞれ、インプラントの40%、30%、20%および10%よ
りも多くの部分が新たな軟骨および/または骨を含んでいることを示す。
別法として、同じ方向に集密になった線維芽細胞の高密度の束の存在により容
易に認識される胚性の腱に似た組織の出現についてインプラントを検査する[腱
/靭帯様組織は、例えば、Ham and Cormack,Histology(JB Lippincott Co.),197
9,pp.367-369に記載されており、その開示を参照により本明細書に記載されてい
るものとみなす]。BMP−16関連蛋白含有インプラントにおいて腱/靭帯様
組織を観察する、さらなるアッセイにおいてこれらの知見は再現されうる。本発
明BMP−16関連蛋白をこの活性に関して評価してもよい。
実施例4BMP−16の発現
ネズミ、ヒトまたは他の哺乳動物のBMP−16関連蛋白を製造するために、
該蛋白をコードしているDNAを適当な発現ベクター中に移し、慣用的な遺伝子
工学的方法により哺乳動物細胞または他の好ましい真核細胞宿主もしくは原核細
胞宿主中に導入する。生物学的に活性のある組み換え型ヒトBMP−16の好ま
しい発現系は、安定に形質転換された哺乳動物細胞であると考えられる。
当業者は、配列番号:1または配列番号:3の配列、もしくはBMP−16関
連蛋白をコードしている他のDNA配列、あるいは他の修飾された配列およびp
CD[Okayama et al,Mol.Cell Biol,2:161〜170(1982)]、pJL3、pJL4
[Gough et al.,EMBO J.,4:645〜653(1985)]ならびにpMT2 CXMのごとき
知られたベクターを用いることにより、哺乳動物発現ベクターを構築することが
できる。
哺乳動物発現ベクターpMT2 CXMは、p91023(b)(Wong et al,S
cience,228:810〜815,1985)の誘導体であるが、テトラサイクリン耐性遺伝子の
代わりにアンピシリン耐性遺伝子を有し、さらにcDNAクローン挿入のための
XhoI部位を有することにおいてp91023(b)とは異なる。pMT2C
XMの機能的エレメントは記載されており(Kaufman,R.J.et al.,1985,Proc.Nat1
.Acad.Sci.USA,82.689〜693)、アデノウイルス・VA遺伝子、72塩基対のエン
ハンサーを含むSV40・複製開始点、5’スプライス部位ならびにアデノウイ
ルス・後期mRNA上に存在するアデノウイルス・三分節リーダー配列の大部分
を含むアデノウイルス・大後期プロモーター、3’スプライス受容部位、DHF
R挿入断片、SV40・初期ポリアデニル化部位(SV40)、およびイー・コ
リ中での増殖に必要なpBR322配列を含んでいる。
pMT2−VWFのEcoRI消化によりプラスミドpMT2 CXMを得る
。pMT2−VWFは、受託番号ATCC67122の下で、American Type Cu
lture Collection(ATCC),Rockville,MD(USA)に寄託されている。EcoRI
消化により、pMT2−VWF中に存在するcDNA挿入断片を切り出し、連結
してイー・コリHB101またはDH−5をアンピシリン耐性へと形質転換する
のに用いる直鎖状のpMT2を得る。プラスミドpMT2 DNAを慣用的方法
により調製することができる。次いで、ループアウト/イン変異誘発(loopout/
in mutagenesis)[Morinaga et al.,Bio-technology,84:636(1984)]を用いて
pMT2 CXMを構築する。これにより、pMT2のSV40・複製開始点な
らびにエンハンサー配列近傍のHindIII部位に対応する塩基1075〜1
145が除去される。さらに、そのヌクレオチド1145の位置に下記配列:
を挿入する。この配列は制限エンドヌクレアーゼXhoIの認識部位を有する。
pMT23と命名されたpMT2 CXMの誘導体は、制限エンドヌクレアーゼ
PstI、EcoR、SalIおよびXhoIの認識部位を有する。プラスミド
pMT2 CXMおよびpMT 23DNAを慣用的方法により調製することがで
きる。
pMT21由来のpEMC2β1も本発明の実施に適する。pMT21は、p
MT2−VWF由来のpMT2に由来する。上記のごとく、EcoRI消化によ
り、pMT−VWF中に存在するcDNA挿入断片を切り出し、連結してイー・
コリHB101またはDH−5をアンピシリン耐性へと形質転換するのに用いる
ことのできる直鎖状のpMT2を得る。プラスミドpMT2DNAを慣用的方法
により調製することができる。
pMT21は、以下の2つの修飾を経てpMT2から誘導される。最初に、c
DNAクローニングのためのG/Cテイリングから伸長した19個のG残基を含
む、DHFRcDNAの76塩基対の5’非翻訳領域を欠失させる。この工程に
おいて、XhoI部位を挿入してDHFRのすぐ上流に下記配列:
を得る。
次いで、EcoRVおよびXbaIでの消化、DNAポリメラーゼIのクレノ
ウフラグメントでの処理、そしてClaIリンカー(CATCGATG)への連
結により、単一のClaI部位を導入する。これにより、250塩基対の断片が
アデノウイルス関連RNA(VAI)領域から欠失されるが、VAI RNA遺
伝子の発現または機能は阻害されない。pMT21をEcoRIおよびXhoI
で消化し、ベクターpEMC2B1を得るために用いる。
EcoRIおよびPstIでの消化により、EMCVリーダーの一部がpMT
2−ECATI[S.K.Jung et al.,J.Virol,63:1651〜1660(1989)]から得られ
、これは2752塩基対のフラグメントである。このフラグメントをTaqIで
消化し、508塩基対のEcoRI−TaqIフラグメントを得、これを低融点
アガロースゲル上の電気泳動により精製する。下記配列を有する5’TaqI突
出末端および3’XhoI突出末端:
を用いて68塩基対のアダプターおよびその相補鎖を合成する。
この配列は、ヌクレオチド763ないし827由来のEMCウイルスリーダー
配列に合致する。さらにこの配列は、EMCウイルスリーダー内の位置10にお
けるATGがATTに変化しており、XhoI部位が後に続いている。pMT2
1のEcoRI−XhoIフラグメント、EMCウイルスのEcoRI−Taq
Iフラグメント、および68塩基対のオリゴヌクレオチドアダプターの3つを連
結してベクターpEMCβ1を得る。
このベクターは、SV40・複製開始点ならびにエンハンサー、アデノウイル
ス・大後期プロモーター、アデノウイルス・三分節リーダー配列の大部分のcD
NAコピー、小型のハイブリッド介在配列、SV40・ポリアデニル化シグナル
ならびにアデノウイルス・VAI遺伝子、DHFRならびにβ−ラクタマーゼマ
ーカーおよびEMC配列を含み、哺乳動物細胞における高レベルの所望cDNA
の発現の指令に適当に関連している。
ベクターの構築はBMP−16関連DNA配列の修飾を包含する。例えば、コ
ーディング領域の5’および3’末端上の非コーディングヌクレオチドを除去す
ることにより、BMP−16のcDNAを修飾してもよい。欠失された非コーデ
ィングヌクレオチドを、発現に有益であることが知られている他の配列で置換し
てもよく、置換しなくてもよい。これらのベクターを、BMP−16関連蛋白の
発現にとり適当な宿主細胞中に形質転換する。さらに、BMP−16をコードし
ているプロペプチド配列を欠失させ、他のBMP蛋白の完全なプロペプチドをコ
ードしている配列に置き換えることにより成熟BMP−16関連蛋白を発現する
ように、配列番号:1の配列またはBMP−16関連蛋白をコードしている他の
配列を加工してもよい。
当業者は、コーディング配列に隣接している哺乳動物の調節配列を除去するか
または細菌の配列に置き換えて、細菌細胞による細胞内または細胞外発現用の細
菌ベクターを作成することにより、配列番号:1の配列を処理することができる
。
例えば、コーディング配列をさらに処理することができる(例えば、他の既知リ
ンカーに連結する、あるいはその非コーディング配列を欠失させるかまたは他の
既知方法によりそのヌクレオチドを変化させる)。次いで、T.Taniguchi et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5230〜5233(1980)に記載されたような方法を用いて
修飾されたBMP−16関連コーディング配列を既知細菌ベクター中に挿入する
ことができよう。次いで、この典型的な細菌ベクターを細菌宿主細胞中に形質転
換し、それによりBMP−16関連蛋白を発現させる。細菌細胞においてBMP
−16関連蛋白を細胞外発現させるための方法については、欧州特許公開EPA
177,343参照。
昆虫細胞における発現のために、昆虫ベクターの構築を行うための操作を行う
ことができる[例えば、公開された欧州特許出願第155,476号記載の方法
参照]。酵母細胞による本発明因子の細胞内または細胞外発現のための酵母の調
節配列を用いて、酵母ベクターを構築することもできる[例えば、公開されたP
CT出願WO86/00639および欧州特許出願公開EPA123,289号
記載の方法参照]。
高レベルの本発明BMP−16関連蛋白を哺乳動物細胞において製造する方法
は、異種BMP−16関連遺伝子の多数のコピーを有する細胞の構築を包含する
。異種遺伝子を増幅可能なマーカー、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DH
FR)遺伝子に連結し、Kaufman and Sharp,J.Mol.Biol.,159:601〜629(1982)の
方法により、メトトレキセート(MXT)濃度を上昇させていって増加した遺伝
子コピーを有する細胞を該マーカー関して選択できる。このアプローチを種々の
異なる細胞タイプに使用することができる。
例えば、リン酸カルシウム共沈ならびにトランスフェクション、エレクトロポ
ーレーションまたはプロトプラスト融合をはじめとする種々の方法により、BM
P−16関連蛋白の発現を可能にする他のプラスミドの配列と作動するように結
合された本発明BMP−16関連蛋白に対するDNA配列を含むプラスミドと、
DHFR発現プラスミドpAdA26SV(A)3[Kaufman and Sharp,Mol.Ce
ll.Biol.,2:1304(1982)]とを、DHFR欠損細胞DUKX−BII中に同時に
導入することができる。DHFRを発現する形質転換体を、透析されたウシ胎児
血清を含むアルファ培地における増殖に関して選択し、次いで、Kaufman et al.
,Mol.Cell.Biol:5.1750(1983)記載のごとく、MTX濃度を増加させていった場
合(例えば順次、0.02、0.2、1.0ついで5μMのMTX)の増殖による
増幅について選択を行う。形質転換体を増殖させ、生物学的に活性のあるBMP
−16の発現を、上記実施例3記載のローゼンにより改変されたサムパス−レデ
ィのラット・骨形成分析によりモニターする。BMP−16蛋白の発現はMTX
耐性レベルの増加に伴って増加するはずである。[35S]メチオニンまたはシス
テインでのパルスラベリングおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動のごとき当
該分野で知られた標準的方法を用いて、BMP−16ポリペプチドを特徴づける
。同様の方法により他の関連BMP−16関連蛋白を製造することができる。
実施例5発現されたBMP−16の生物学的活性
上記実施例4において得られた、発現されたBMP−16関連蛋白の生物学的
活性を測定するために、蛋白を細胞培養物から回収し、同時に産生された他の蛋
白性物質ならびに他の混入物質からBMP−16関連蛋白を単離することにより
精製する。実施例3記載のラット・骨形成分析により、精製蛋白を分析してもよ
い。
当業者に知られた標準的方法を用いて精製を行う。
銀染色[Oaldey et al.,Anal.Biochem.,105:361(1980)]で染色されるSDS
−PAGEアクリルアミド[Laemmli,Nature,227:680(1970)]およびイムノブロ
ット[Towbin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:4350(1979)]のごとき標準的
方法を用いて蛋白の分析を行う。
実施例6
ノーザン分析を用いて、BMP−16およびBMP−16関連蛋白を、種々の
細胞系に対する影響について試験することができる。適当な細胞系は、E13マ
ウス肢芽由来の細胞系を包含する。BMP−16またはBMP−16関連蛋白で
の処理から10日後、組織分化の状態について表現型を組織学的に調べる。さら
に、BMP−16またはBMP−16関連蛋白で処理した細胞由来のmRNAの
ノーザン分析を、表IVに記載する骨、軟骨および/または腱/靭帯に関する下
記マーカーの1つまたはそれ以上を包含する種々のマーカーについて行うことも
できる。
1−初期にマーカーが観察され、成熟骨組織が形成されるにつれマーカーが見
られなくなる。
2−マーカーは腱の部位に依存し、骨界面において最強。
3−低レベルのマーカーが見られる。
実施例7胚性幹細胞アッセイ
本発明BMP−16蛋白の効果をアッセイするために、多くの利用可能な幹細
胞系に対するインビボにおける増殖および分化の効果をアッセイすることが可能
である。1のかかる細胞系はES−E14TG2であり、Rockville,MDのAmeric
an Type Culture Collectionから利用可能である。
アッセイを行うために、100ユニットのLIF存在下で細胞を増殖させて未
分化状態に維持する。まず、LIFを除去し、細胞を凝集させて懸濁させる(胚
様体として知られる状態)ことによりアッセイをセットアップする。3日後、胚
様体をゼラチン被覆プレートに撒き(PCR分析のためには12ウェルプレート
、免疫細胞化学的分析のためには24ウェルプレートを用いる)、アッセイすべ
き蛋白で処理する。細胞に栄養分を与え、2〜3日毎に蛋白性因子で処理する。
15%ウシ胎児血清(FBS)補足培地またはずっと少量のFBSを含有するC
DM限定培地においてアッセイを行えるように細胞を適応させる。
処理期間(7〜21日の範囲)の終了時に細胞からRNAを集め、以下のマー
カーに関して定量的マルチプレックスPCRにより分析する:中胚葉マーカーBr
achyury、外胚葉マーカーAP−2、および内胚葉マーカーHNF−3α。免疫
細胞化学的分析により、神経細胞(グリア細胞およびニューロン細胞)、筋肉細
胞(心筋細胞、骨格筋細胞および平滑筋細胞)分化を検出することができ、さら
にプロテオグリカンコア蛋白(軟骨)およびサイトケラチン(表皮)のごとき種
々の他の表現型マーカーの検出が可能である。これらの細胞はLIFが除去され
た場合に自律的に分化する傾向があるので、常に無処理対照に対する比較により
結果を定量する。
以上の記載は、本発明の目下好ましい具体例を詳述するものである。その実施
において、当業者がこれらの記載を考慮して多くの改変ならびに変法を行うこと
が想定される。それらの改変ならびに変法は、添付した請求の範囲に包含される
と確信する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
C12N 1/21 C12N 1/21
5/10 C12P 21/02 C
C12P 21/02 A61P 1/02
// A61K 38/00 19/00
A61P 1/02 19/02
19/00 19/10
19/02 43/00 107
19/10 C12N 5/00 B
43/00 107 A61K 37/02
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AU,CA,FI,JP,KR,
NO
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.(a)配列番号:1のヌクレオチド1、511もしくは538から837 もしくは840までのヌクレオチド; (b)配列番号:2のアミノ酸−170、1もしくは10から109もしくは 110までをコードするヌクレオチド;および (c)(a)または(b)の天然に存在するヒト対立遺伝子配列または等価な 縮重コドン配列 からなる群より選択されるDNA配列を含む、単離DNA分子。 2.請求項1のDNA配列で形質転換された宿主細胞。 3.作動するように発現制御配列に結合された請求項1のDNA分子を含むベ クター。 4.請求項3のベクターで形質転換された宿主細胞。 5.配列番号:1のヌクレオチド511から840までからなるDNA配列を 含む単離DNA分子。 6.作動するように発現制御配列に結合された請求項5のDNA分子を含むベ クター。 7.請求項6のベクターで形質転換された宿主細胞。 8.下記工程: (a)請求項1記載のDNA分子で形質転換された宿主細胞を培養すること; ついで (b)培地からヒト骨形態形成蛋白−16(BMP−16)蛋白を回収し精製 すること を含む、精製されたヒトBMP−16蛋白の製造方法。 9.該宿主細胞が、配列番号:1のヌクレオチド511から840までからな るDNAコーディング配列を含むDNA分子で形質転換されているものである請 求項8の方法。 10.該宿主細胞が哺乳動物細胞であり、DNA分子がさらにTGF−βスー パーファミリーの蛋白のメンバー由来のプロペプチドをコードするDNA配列を 含み、該プロペプチドをコードするDNA配列が正しい読み枠においてDNAコ ーディング配列に連結されているものである、請求項9の方法。 11.配列番号:2に示すアミノ酸1から110までのアミノ酸配列を含む精 製された骨形態形成蛋白−16(BMP−16)ポリペプチド。 12.該ポリペプチドがダイマーであり、少なくとも1つのサブユニットが配 列番号:2のアミノ酸1から110までのアミノ酸配列を含むものである請求項 11の精製されたBMP−16ポリペプチド。 13.下記工程: (a)請求項5記載のDNA分子で形質転換された宿主細胞を培養すること; ついで (b)配列番号:2のアミノ酸1から110までのアミノ酸配列を含むポリペ プチドを培地から回収し精製すること により製造される、精製された骨形態形成蛋白−16(BMP−16)ポリペプ チド。 14.該ポリペプチドが2個のサブユニットを含むダイマーであり、1のサブ ユニットが配列番号:2のアミノ酸1から110までのアミノ酸配列を含み、1 のサブユニットがBMP−1、BMP−2、BMP−3、BMP−4、BMP− 5、BMP−6、BMP−7、BMP−8、BMP−9、BMP−10、BMP −11、BMP−12、BMP−13、およびBMP−15からなる群より選択 される骨形態形成蛋白に関するアミノ酸配列を含むものである、請求項12記載 の精製された骨形態形成蛋白−16(BMP−16)ポリペプチド。 15.骨形態形成蛋白−16(BMP−16)ポリペプチドをコードするDN A配列にインフレーム(in frame)で連結されたTGF−βスーパーファミリーの 蛋白のメンバー由来のプロペプチドをコードするDNA配列を含むキメラDNA 分子であって、該BMP−16ポリペプチドが配列番号:2のアミノ酸1から1 10までを含むものであるキメラDNA分子。 16.請求項12記載の精製されたBMP−16蛋白に対する抗体。
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