【発明の詳細な説明】
ヒトSDF−5蛋白および組成物
関連出願
本発明は、1997年2月6日出願の第08/796153号の一部継続出願
である1997年5月8日出願の第08/848439号の一部継続出願である
。
本発明は、フラズルド(frazzled)蛋白ファミリーの新規メンバー、それらをコ
ードするDNA、ならびにそれらを得る方法に関する。これらの蛋白を用いて組
織および器官における因子の発現および/または組織および器官の分化を誘導し
てもよく、特に、軟骨細胞および/または軟骨組織の形成、成長、分化、増殖お
よび/または維持を誘導してもよい。よって、これらの蛋白は、骨関節炎、リュ
ーマチ性関節炎および関節軟骨欠損のごとき軟骨の疾病の治療において、および
/または他の組織および器官、例えば膵臓、肝臓、肺、腎臓および/または他の
組織の細胞の形成、成長、分化、増殖および/または維持の促進および/または
抑制において有用でありうる。これらの蛋白は、他の組織再生および分化因子の
活性増強に使用してもよい。当該蛋白は、発明者によりトSDF−5と称される
。
発明の背景
軟骨および結合組織のごとき組織および器官の形成、増殖、分化および維持に
関与する分子の検索は、骨関節炎のごときこれらの組織に対する変性またはダメ
ージを含む症状の治療に有用な因子に対する非常に大きな必要性が存在するため
、広範囲にわたっている。
フリズルド(frizzled)と命名されたファミリーのいくつかの蛋白の構造は、
すでに詳細に調べられている。本発明は、フリズルド蛋白のリガンド結合ドメイ
ンに対する相同性を有するファミリーであるフラズルドと命名された蛋白のファ
ミリーに関する。フリズルド蛋白ファミリーのメンバーは、ショウジョウバエに
おいてウィ
ングレス(Wg)蛋白に結合することが示されている。Bhanot et al.,Nature,
382:225-230(1996)。哺乳動物および他の種において、フリズルドファミリーの
蛋白は、Wnt遺伝子のファミリーにより生じる蛋白に結合することが示されて
いる膜結合受容体分子である。Wang et al.,J.Biol.Chem.,271:4468-4476(1
996)。Wnt遺伝子は、膵臓、肺、肝臓、腎臓および脳を包含する組織および器
官において発現されることがわかっている。
発明の概要
驚くべきことに、発明者らは、フラズルド蛋白ファミリーのメンバーは軟骨細
胞および/または軟骨組織の形成を誘導できることを見出した。したがって、本
発明は、軟骨細胞および/または軟骨組織の形成を誘導する方法であって、フラ
ズルド蛋白ファミリーのメンバーである少なくとも1種の蛋白を含む組成物を前
駆細胞に投与することを含む方法を提供する。好ましい具体例において、組成物
は、配列番号:2のアミノ酸1、18、19、20、21、22、23、24ま
たは25から295までのアミノ酸配列を有する蛋白を含む。好ましい具体例に
おいて、本発明は、配列番号:1のアミノ酸21から295まで、あるいは配列
番号:3のアミノ酸1から275までのアミノ酸配列を有する蛋白を包含する。
1の具体例において、当該方法は、インビボにおいて組成物を患者に投与するこ
とを含む。あるいはまた、当該方法は、インビトロにおいて組成物を細胞に投与
し、ついで、軟骨細胞および/または軟骨組織を回復させることを含むものであ
り、その後、それらの軟骨細胞および/または軟骨組織をを患者に投与してもよ
い。さらに、組成物は、適当な投与用担体を含んでいてもよい。
また本発明は、フラズルドおよびフリズルド蛋白ファミリーの新規メンバーを
コードする新規DNA配列を提供する。特定の具体例において、本発明は、ヒト
SDF−5として知られるフラズルド蛋白をコードする新規DNA配列を提供す
る。ヌクレオチド配列およびこれらのDNA配列によりコードされる対応アミノ
酸配列を配列表に示す。詳細には、本発明は、ヒトSDF−5蛋白をコードして
いる単離DNA配列であって、配列番号:1のヌクレオチド256、307、
310、313、316、319、322、325または328から1140ま
で、または配列番号:2のアミノ酸1、18、19、20、21、22、23、
24または25から295までのアミノ酸をコードするヌクレオチド、または配
列番号:3のアミノ酸1から275までをコードするヌクレオチド、ならびに上
記のものから容易に得ることができ、フラズルド活性を維持している上記配列の
フラクションおよび変種からなる群より選択されるDNA配列を含む単離DNA
配列を包含する。さらに本発明は、厳密な条件下でこれらの配列にハイブリダイ
ゼーションし、フラズルド活性を示す蛋白をコードしている配列を包含する。
他の具体例において、本発明は、発現制御配列に作動するように結合された上
記DNA分子を含むベクター、ならびにこれらのベクターで形質転換された宿主
細胞を包含する。さらなる他の具体例において、本発明は、精製ヒトSDF−5
蛋白、新規ヒトSDF−5蛋白、およびヒトSDF−5蛋白を含有する組成物の
製造方法を包含する。これらの方法は、上記のごときヒトSDF−5蛋白をコー
ドするDNA配列で形質転換された宿主細胞を培養し、ついで、培地から該ヒト
SDF−5蛋白を回収し、精製する工程を含む。さらに本発明は、上記方法によ
り製造される精製ヒトSDF−5ポリペプチド、ならびに上記DNA配列により
コードされるアミノ酸配列を含む精製ヒトSDF−5ポリペプチドを包含する。
本発明蛋白は、配列番号:2のアミノ酸1、18、19、20、21、22、2
3、24または25から295までのアミノ酸配列、あるいは配列番号:3のア
ミノ酸1から275までのアミノ酸配列を含んでいてもよく、また、分子量約3
0ないし約35kdのヒトSDF−5蛋白を含んいてもよく、該SDF−5蛋白
は配列番号:2または3のアミノ酸配列を含み、1またはそれ以上の遺伝子の転
写を調節する能力を有する。
また本発明は、患者における軟骨組織の形成または維持を誘導する方法を包含
し、該方法は、SDF−5蛋白を含有する有効量の組成物を患者に投与すること
を含む。該組成物はさらに1またはそれ以上の骨形態形成蛋白(BMP)、好ま
しくはBMP−2、BMP−4、BMP−7、MP52、BMP−12およびB
MP−15から選択されるBMP、最も好ましくはBMP−2を含んでいてもよ
い。該方法を用いて、骨関節炎または関節軟骨欠損もしくはダメージに苦しむ患
者を治療してもよい。配列の説明
配列番号:1 ヒトSDF−5DNA
配列番号:2 ヒトSDF−5蛋白
配列番号:3 ヒトSDF−5成熟蛋白寄託物の説明
ヒトSDF−5 DNAコーディング配列を含むcDNAインサートpSDF
−5をアンピシリン・イー・コリ(E.coli)株に挿入して、1997年2月4
日にthe American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockvill
e,MD 20852に寄託した。この寄託物は受託番号ATCC98314を付与され
た。この寄託はブダペスト条約の規定を満たすものである。発明の詳細な説明
本明細書の用語「フラズルド蛋白」とは、フリズルド蛋白ファミリーの細胞外
結合ドメインに対する配列相同性を有するヒトのフラズルド蛋白のメンバーをい
い、Hfz3、Hfz5およびHfz7ならびに他のヒトのフラズルド蛋白、さ
らに他の種に見出され、Wang et al.,J.Biol.Chem.,271:4468-4476(1996)に
記載されたような他の種由来のフリズルド蛋白に対する相同性を有するフラズル
ド蛋白を包含する。フラズルド蛋白ファミリーの1の特定のメンバーは、配列番
号:2に示すアミノ酸配列を有するヒトSDF−5蛋白であり、あるいはまた他
の種に見出されるこの蛋白のホモログ(homologues)、そしてSDF−5に構造
的および/または機能的に密接に関連している他の蛋白である。フラズルド関連
蛋白は、ショウジョウバエ、アフリカツメガエル、シー・エレガンス(C.elega
ns)、ゼブラダニオおよびラット、マウス、ヒトを包含する他の種にも存在する
。「フラズルド蛋白」は、対立遺伝子変種または突然変異もしくは欠失により誘
発された変種のごときフラズ
ルド蛋白の変種、ならびにフラズルドまたはフリズルド蛋白のフラグメントも包
含し、該変種およびフラグメントはフラズルド活性、好ましくはWnt蛋白のご
とき蛋白に対する結合能、あるいはフリズルド蛋白のごとき膜結合受容体への結
合能を保持している。
本明細書の用語「フラズルド活性」とは、本発明フラズルド蛋白により示され
る1またはそれ以上の活性をいう。詳細には、「フラズルド活性」は、Wnt蛋
白への結合能を包含し、よって、フリズルド蛋白受容体のごとき蛋白受容体への
Wnt蛋白の結合を調節する能力を包含しうる。さらに「フラズルド活性」は、
細胞および/または組織、例えば結合組織、器官の形成、分化、増殖および/ま
たは維持ならびに傷の治癒を調節する能力を包含しうる。「フラズルド活性」は
、本明細書記載のアッセイにおけるフラズルド蛋白の活性も包含する。
よって、本発明は、フラズルド活性を保持している、配列番号:2または3に
示すヒトSDF−5蛋白のアミノ酸配列の蛋白変種および機能的フラグメントを
包含する。また本発明は、上記のごとき精製ヒトSDF−5蛋白に対する抗体も
包含する。本発明組成物は、治療量の少なくとも1種の上記ヒトSDF−5蛋白
を含む。
CHO細胞のごとき哺乳動物細胞により発現されるヒトSDF−5蛋白は、種
々のN末端を有するヒトSDF−5蛋白の活性種の混成集団として存在すると考
えられる。一部には、Von Heginjeシグナルペプチド推定アルゴリズムによれば
、最初の17ないし24個のアミノ酸は成熟ペプチド分泌のためのシグナリング
に関与しているようである。活性種はシグナルペプチドを含んでいてもよく、配
列番号:2のアミノ酸残基1、18、19、20、21、22、23、24また
は25から開始するアミノ酸配列を含むであろう。よって、活性ヒトSDF−5
蛋白をコードするDNA配列は、配列番号:1のヌクレオチド256、307、
310、313、316、319、322、325または328から1140ま
でを含むDNA配列を包含する。したがって、SDF−5の活性種は、配列番号
:2のアミノ酸1、18、19、20、21、22、23、24または25から
295までのアミノ酸を含むものを包含すると考えられる。
さらにもう1つの具体例において、本発明は、遺伝子調節を変化させる必要の
あ
る患者における遺伝子調節を変化させる方法であって、有効量の上記組成物を該
患者に投与することを含む方法を包含する。膵臓の遺伝子に対する調節の変化を
、Wnt蛋白による受容体蛋白への結合、例えば本発明ヒトSDF−5蛋白とW
nt蛋白との間の結合を刺激または抑制することにより行ってもよい。よって、
ヒトSDF−5蛋白ファミリーは、フリズルド受容体蛋白のごとき受容体蛋白に
対するWnt遺伝子の結合相互作用を調節することができる。
また本発明は、プロモーターまたオペレーターのごとき組織特異的または誘導
可能な調節配列に連結された、本発明コーディングDNA配列および他のフラズ
ルドコーディング配列を含むハイブリッドまたは融合ベクターも包含する。本発
明の好ましい具体例において、ヒトSDF−5蛋白のコーディング配列が、軟骨
細胞および/または軟骨組織において選択的に発現される遺伝子由来の1または
それ以上のプロモーター、エンハンサーおよび/または調節エレメントに、作動
可能に連結される。例えば、II型コラーゲンエンハンサー、プロモーターは、
間葉組織凝結および軟骨形成中に軟骨において発現されることが知られている。
Metsaranta et al.,Dev.Dynamics,204:202-210(1996);Li et al.,Genes Dec
elop.,9:2821-2830(1986)。本発明において有用なもう1つの調節エレメントは
テナスシン(tenascin)Cプロモーターである。テナスシンCは関節軟骨において
発現される。Pacifici et al.,Matrix Biol.,14:689-698。さらに、ヒトSD
F−5をコードするDNA配列を、軟骨細胞および/または軟骨組織において選
択的に産生されるプロテオグリカンコア蛋白由来の1またはそれ以上の調節配列
に、作動可能に連結してもよい。本発明の他の好ましい具体例において、ヒトS
DF−5蛋白のコーディング配列が、IDX遺伝子から単離されたプロモーター
に、作動可能に連結される。このプロモーターは膵臓細胞および組織において選
択的に発現される。よって、IDXプロモーターがヒトSDF−5蛋白をコード
するDNA配列に作動可能に結合されているハイブリッドDNAベクターは、膵
臓組織における蛋白の選択的発現に有用であり、例えば、Wnt蛋白とその受容
体蛋白との間の結合、例えば発現されたヒトSDF−5蛋白とWnt蛋白との間
の結合を刺激または抑制することによる、患者における膵臓病の治療または膵臓
の遺伝子調節の変化に有用である。他の組織選択的調節
エレメントおよび誘導可能エレメントを用いたベクターも、本発明ヒトSDF−
5蛋白の選択的または誘導可能な発現に有用である。
本発明のもう1つの態様は、医薬上許容される賦形剤または担体中の治療上有
効量のヒトSDF−5蛋白を含有する医薬組成物を提供する。本発明のこれらの
組成物を軟骨細胞および/または軟骨組織表現型の形成に使用してもよい。さら
にこれらの組成物を用いて、ベータ細胞およびランゲルハンス島に典型的に見出
される他の細胞タイプ、または他の膵臓細胞、ならびに肝臓、脾臓、脳、心臓お
よび腎臓組織のごとき他の器官の組織の形成、成長、増殖、分化および/または
維持を促進および/または抑制してもよい。ヒトSDF−5蛋白を含む組成物を
用いて、分化した組織または器官を構成する細胞(例えば膵臓細胞)へと分化し
うる前駆細胞または膵臓幹細胞のごとき幹細胞を処理して、かかる細胞、組織ま
たは器官の形成、分化、増殖および/または維持を促進してもよい。かかる細胞
の形成および維持方法は、例えば、WO93/00441に記載されており、参
照によりその開示を本明細書に記載されているものとみなす。
本発明組成物は、ヒトSDF−5蛋白のほかに、表皮成長因子(EGF)、繊
維芽細胞成長因子(FGF)、形質転換成長因子(TGF−αおよびTGF−β
)、アクチビン、インヒビン、骨形態形成蛋白(BMP)およびインスリン様成
長因子(IGF)のごとき成長因子を包含する治療上有用な作用剤を含んでいても
よい。組成物は適当なマトリックス、例えば、組成物を支持し、軟骨細胞および
/または軟骨組織の成長のための表面を提供するためのマトリックスを含んでい
てもよい。マトリックスは、ヒトSDF−5蛋白を除々に放出させるものであっ
てもよく、さらに/あるいはヒトSDF−5蛋白提供のための適当な環境を提供
するものであってもよい。
ヒトSDF−5蛋白含有組成物を、多くの組織欠損の治療方法、ならびに種々
のタイプの組織および傷の治癒および維持方法に使用してもよい。治療可能な組
織および傷としては、軟骨のみならず表皮、神経、筋肉(心筋を包含)、骨、腱
および靭帯のごとき他の結合組織、および他の組織および傷、ならびに膵臓、肝
臓、脾臓、肺、脳、心臓および腎臓組織のごとき他の器官等がある。本発明のこ
れらの方法は、
かかる組織の形成、傷の治癒または組織の修復を要する患者に有効量のヒトSD
F−5蛋白を投与することを含む。ヒトSDF−5含有組成物を用いて、リュー
マチ性関節炎、骨関節炎、および軟骨または他の器官または組織(膵臓、肝臓、
脾臓、肺、心臓および腎臓の組織および他の組織および器官のごとき)の他の異
常を治療または予防することができる。これらの方法は、本発明蛋白を少なくと
も1種の他の蛋白、例えばEGF、FGF、TGF−α、TGF−β、BMP、
アクチビン、インヒビンおよびIGFのごとき成長因子と組み合わせて投与する
ことを含んでもよい。
本発明のさらなる態様は、ヒトSDF−5蛋白の発現をコードするDNA配列
である。かかる配列は、配列番号:1において5’から3’方向へと示されるヌ
クレオチド配列を包含するが、遺伝コードの縮重を除いては配列番号:1のDN
A配列と同一であり、配列番号:2または3の蛋白をコードするDNA配列も包
含される。厳密な条件下で配列番号:1のDNA配列にハイブリダイゼーション
し、かつ1またはそれ以上のWnt蛋白に対する結合能を有する蛋白、および/
またはインスリン産生ベータ細胞のごとき膵臓細胞、または肝臓、脾臓、肺、心
臓、脳および腎臓のごとき他の器官の組織の形成、成長、増殖、分化、維持を促
進および/または抑制する能力のある蛋白をコードしているDNA配列も本発明
に包含される。好ましいDNA配列は、厳密な条件下[T.Maniatis et al,Molec ular Cloning(A Laboratory Manual
),Cold Spring Harbor Laboratory(1982),
387〜389ページ参照]でハイブリダイゼーションするDNA配列を包含する。か
かるDNA配列が、配列番号:2または3に示す成熟ヒトSDF−5アミノ酸配
列に対して少なくとも約80%の相同性、より好ましくは少なくとも約90%の
相同性を有するポリペプチドをコードしていることが一般的に好ましい。結局、
配列番号:1の配列の対立遺伝子または他の変種は、かかるヌクレオチド変化が
ペプチド配列の変化を引き起こすか否かにかかわらず、そのペプチド配列がやは
りフラズルド活性を有している場合には、本発明に包含される。また本発明は、
フラズルド蛋白の活性を保持しているポリペプチドをコードする、配列番号:1
に示すヒトSDF−5蛋白のDNA配列の機能的フラグメントを包含する。配列
番号:2または3に示される本発
明ヒトSDF−5蛋白の特定の変種またはフラグメントがフラズルド活性を維持
しているかどうかを調べることは、本明細書記載のアッセイを用いて通常的に行
われる。
本発明DNA配列は、例えば、細胞集団中の他のフラズルド蛋白をコードする
mRNAの検出のためのプローブとして有用である。本発明DNA配列は、後で
説明する遺伝子治療用ベクターの調製にも有用である。
本発明のさらなる態様は、発現制御配列に作動可能に結合した上記DNA配列
を含むベクターを包含する。本発明の組み換えヒトSDF−5蛋白の新規製造方
法にこれらのベクターを使用してもよく、該方法において、発現制御配列に作動
可能に結合されたヒトSDF−5蛋白をコードするDNA配列で形質転換された
細胞系が適当な培地で培養され、ヒトSDF−5蛋白が培地から回収され、精製
される。この方法は、ポリペプチド発現用宿主細胞として、よく知られた多くの
原核細胞および真核細胞の両方を使用することができる。ベクターを遺伝子治療
用途に使用してもよい。かかる使用において、ベクターをエクスビボにおいて患
者の細胞中にトランスフェクションし、細胞を患者に再導入する。別法として、
ベクターをインビボにおいて標的化トランスフェクションにより患者に導入して
もよい。
本発明の好ましい具体例において、ヒトSDF−5のコーディング配列に作動
可能に結合したプロモーターおよび/またはエンハンサーのごとき1またはそれ
以上の本来的なものでない調節エレメントを用いてベクターを調製して、所望細
胞組織において、および/または発達中の所望時期において、ヒトSDF−5を
発現させる。例えば、発達中にベータ細胞を包含する膵臓細胞において構成的に
発現されることが知られており、十分に特徴が知られているIDX遺伝子由来の
プロモーターエレメントを用いてベクターを構築してもよい。IDX遺伝子由来
のプロモーターをフラズルドのコーディング配列に作動可能に結合させ、WO9
3/00441に記載のように膵臓幹細胞のごとき適当な細胞を形質転換するこ
とにより、これらの細胞においてヒトSDF−5を発現させることができ、かく
して、インスリンを分泌しうる膵臓ベータ細胞のごとき細胞の形成、成長、増殖
、分化および/または維持についての所望の効果をインビトロまたはインビボの
いずれ
かにおいて促進することができる。
本発明のさらなる態様はヒトSDF−5蛋白またはポリペプチドである。かか
るポリペプチドは、配列番号:2または3に示す配列を含むアミノ酸配列、ある
いは天然に存在する対立遺伝子変種ならびにフラズルドの能力(軟骨細胞および
/または軟骨組織および/または膵臓または肝臓、肺、心臓、脳および腎臓組織
のごとき他の器官組織の形成、成長、増殖、分化および/または維持を促進およ
び/または抑制する能力であって、フラズルド蛋白に特徴的なもの)を保持して
いる他の蛋白変種を包含する配列番号:2または3のアミノ酸配列の変種を有す
ることにより特徴づけられる。好ましいポリペプチドは、配列番号:2および3
に示す成熟ヒトSDF−5アミノ酸配列に対して少なくとも約80%、より好ま
しくは少なくとも約90%の相同性を有するポリペプチドを包含する。結局、配
列番号:2または3の配列の対立遺伝子変種または他の変種は、かかるアミノ酸
変化が突然変異、化学的変換、あるいはポリペプチド作成のためのDNA配列の
変更によってなされたものであるかどうかにかかわらず、ペプチド配列がやはり
フラズルド活性を有しているかぎり、本発明に包含される。また本発明は、フラ
ズルド蛋白の活性を保持している、配列番号:2または3に示すヒトSDF−5
のアミノ酸配列のフラグメントも包含する。当業者は、当該分野で知られた方法
を用いてヒトSDF−5蛋白のかかる変種およびフラグメントを容易に得ること
ができ、本明細書実施例に記載のごとくそれらの活性を容易にアッセイすること
ができる。
本発明の精製蛋白を用い、当該分野で知られている抗体生成法を用いて、ヒト
SDF−5蛋白および/または他の関連蛋白に対するモノクローナルまたはポリ
クローナルな抗体を得てもよい。よって、本発明は、ヒトSDF−5および/ま
たは他のフラズルド蛋白に対する抗体も包含する。抗体は、ヒトSDF−5蛋白
の精製、あるいはインビトロまたはインビボでフラズルド蛋白の効果を抑制また
は防止することに有用でありうる。ヒトSDF−5蛋白は、胚性細胞および/ま
たは幹細胞の成長および/または分化の誘導に有用でありうる。よって、本発明
蛋白または組成物は、胚性細胞または幹細胞のごとき細胞集団を処理して細胞の
成長および/または分化を促進、豊富化または抑制することに有用でありうる。
例えば、ヒトSDF−
5蛋白は、細胞集団を処理して、軟骨細胞、軟骨組織および/または膵臓細胞の
ごとき他の細胞または他の組織もしくは器官の表現型を形成、分化、増殖および
/または維持を促進および/または抑制することに有用でありうる。処理された
細胞集団は、とりわけ、後で説明する遺伝子治療用途に有用でありうる。
ヒトSDF−5遺伝子が分泌因子をコードしており、それゆえ、Wnt蛋白と
結合可能な可溶性受容体を提供し、かくして、Wnt蛋白によるシグナルトラン
スダクションを開始および/またはブロックするということは、特に興味深い。
よって、ヒトSDF−5遺伝子ファミリーは、フリズルド受容体蛋白のごとき受
容体蛋白に対するWnt遺伝子の結合相互作用を調節する可能性がある。膵臓お
よび他の器官におけるWnt遺伝子の存在および/または発現に伴うこれらの蛋
白のシグナルトランスダクション調節活性は、ヒトSDF−5蛋白が、組織およ
び器官の分化に対する重要なレギュレーターであり、組織および器官の誘導、形
成、成長、分化、増殖および/または維持に関与している可能性があることを示
唆する。よって、本発明蛋白は、傷の治癒ならびに器官の修復および再生プロセ
ス、あるいはまた組織の分化、例えば胚の発達において有用でありうる。特に、
ヒトSDF−5蛋白が軟骨細胞および/または軟骨組織の誘導、形成、成長、分
化、増殖および/または維持ならびに修復に有用でありうることが、本発明者に
より観察された。よって、これらの蛋白およびそれらを含む組成物は、骨関節炎
、リューマチ性関節炎および関節軟骨欠損のごとき軟骨の疾病の治療、ならびに
細胞の形成、成長、分化、増殖および/または維持の促進および/または抑制、
例えば軟骨細胞および/または軟骨組織の形成において有用でありうる。
本発明ヒトSDF−5蛋白は、配列番号:1の配列に類似した配列によりコー
ドされる因子を包含するが、該因子中には自然発生的(例えば、ポリペプチド中
のアミノ酸変化を引き起こしうるヌクレオチド配列中の対立遺伝子変異)あるい
は人工的に作成されたした修飾または欠失が存在している。例えば、合成ポリペ
プチドが、配列番号:2または3のアミノ酸残基の一連の配列を全体的または部
分的に複製したものであってもよい。これらの配列は、1次、2次、または3次
構造およびコンホーメーション的特質を配列番号:2または3のヒトSDF−5
ポリペプチドと共
有することによって、それらに共通した生物学的特性を有する可能性がある。よ
って、本来のヒトSDF−5のこれらの修飾および欠失体を、治療プロセスにお
いて天然のヒトSDF−5ポリペプチドの生物学的活性置換体として用いてもよ
い。ヒトSDF−5およびヒトSDF−5の変種またはフラグメントを本明細書
記載のアッセイに供することにより、ヒトSDF−5の変種またはフラグメント
がフラズルドの生物学的活性を有しているかどうかを容易に決定することができ
る。さらに、変種またはフラグメントを競合アッセイに用いてWnt遺伝子への
結合を試験してもよい。
本明細書記載のヒトSDF−5蛋白配列の他の特別な変異は糖鎖付加部位の修
飾を包含する。これらの修飾はO−結合またはN−結合糖鎖付加部位を含むもの
であってもよい。例えば、糖鎖付加の不存在またはごく部分的な糖鎖付加は、ア
スパラギン結合糖鎖付加認識部位の置換または欠失により生じる。アスパラギン
結合糖鎖付加認識部位は、適当な細胞の糖鎖付加酵素により特異的に認識される
トリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−X−ス
レオニンまたはアスパラギン−X−セリンであり、通常にはXはいずれかのアミ
ノ酸である。糖鎖付加認識部位の1番目または3番目のアミノ酸位置の一方また
は両方における種々のアミノ酸置換または欠失(および/または2番目の位置に
おけるアミノ酸欠失)は、修飾トリペプチド配列において糖鎖付加を生じさせな
い。かかるヒトSDF−5変種は本発明の範囲内である。さらに、ヒトSDF−
5蛋白の細菌による発現は、糖鎖付加部位が未修飾であっても、糖鎖付加されて
いない蛋白を生じるであろう。ヒトSDF−5のかかる細菌により産生されたバ
ージョンは本発明の範囲内である。
また本発明は、他の蛋白性物質をコードするDNA配列が結合しておらず、ヒ
トSDF−5蛋白の発現をコードしている新規DNA配列をも包含する。これら
のDNA配列は、配列番号:1に5’から3’方向に示したDNA配列ならびに
厳密な条件下(例えば、0.1X SSC,0.1%SDS,65℃;T.Maniatis et al,Molecular Cloning(A Laboratory Manual
),Cold Spring Harbor Laboratory(1982),387-
389ページ参照)でそれらにハイブリダイゼーションする配列であってフラズル
ド活性を有する蛋白をコードしている配列を包含する。これらのDNA配列もま
た、配列番号:
1のDNA配列を含むDNA配列、ならびに厳密な条件下でそれらにハイブリダ
イゼーションし、フラズルド活性を有する蛋白をコードしているDNA配列を包
含する。
同様に、配列番号:1の配列によりコードされたヒトSDF−5蛋白をコード
するDNA配列、あるいは配列番号:2または3のアミノ酸配列を含むヒトSD
F−5蛋白をコードするDNA配列は、遺伝学的コードの縮重または対立遺伝子
変異(種の集団中における天然に存在する塩基変化であり、アミノ酸変化を生じ
させる者であっても、生じさせないものであってもよい)によりコドン配列が異
なっていても、本明細書記載の新規因子をコードする。コードされるポリペプチ
ドの活性、半減期または産生を増大させるための点突然変異または誘発された修
飾(挿入、欠失および置換を包含)により引き起こされる配列番号:1のDNA
配列における変異も本発明に包含される。
本発明のもう1つの態様は、ヒトSDF−5蛋白の新規製造方法を提供する。
本発明方法は、本発明ヒトSDF−5蛋白をコードするDNA配列で形質転換さ
れた適当な細胞系を、調節配列の制御下において培養することを含む。形質転換
宿主細胞を培養して、ヒトSDF−5蛋白を培地から回収し精製する。精製蛋白
は、同時産生される他の蛋白ならびに他の混入物質を実質的に含まない。
適当な細胞または細胞系はチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)のごと
き哺乳動物細胞であってもよい。適当な哺乳動物宿主細胞ならびに形質転換、培
養、増幅、スクリーニング、生成物の製造および精製方法の選択は当該分野にお
いて知られている。例えば、Gething and Sambrook,Nature,293:620-625(1981
)あるいはKaufman et al,Mol .Cell.Biol.,5(7):1750-1759(1985)またはHowl
eyらの米国特許第4,419,446号参照。もう1つの適当な哺乳動物細胞系は本明細
書の実施例に記載されているサルCOS−1細胞系である。哺乳動物細胞CV−
1も適当であるかもしれない。
細菌細胞も適当な宿主であるかもしれない。例えば、種々のイー・コリ株(例
えばHB101、MC1061)はバイオテクノロジーの分野において宿主細胞
としてよく知られている。ビー・ズブチリス(B.subtilis)、シュードモナス(Pse
udomonas)、
他のバチルス等をこの方法に使用してもよい。細菌細胞における蛋白の発現には
、一般的には、フラズルドのシグナルペプチドをコードするDNAは必要ない。
当業者に知られた多くの酵母細胞株も、本発明ポリペプチド発現のための宿主
細胞として利用できる。さらに、所望ならば、本発明方法において昆虫細胞を宿
主として用いてもよい。例えば、Miller et al,Genetic Engineering,8:277-2
98(Plenum Press 1986)およびその中で引用された文献参照。
本発明のもう1つの態様は、これらの新規SDF−5ポリペプチドの発現方法
に使用するベクターを提供する。好ましくは、ベクターは、本発明新規因子をコ
ードする上記の新規DNA配列の全長を含む。さらに、ベクターは、フラズルド
蛋白配列の発現を可能にする適当な発現制御配列を含む。あるいはまた、上記修
飾配列を含むベクターも本発明の具体例である。さらに、ヒトSDF−5シグナ
ルペプチド配列を欠失させ、他のフラズルド蛋白または他の適当なプロペプチド
の完全シグナルペプチドをコードする配列に置き換えることにより、配列番号:
1の配列またはヒトSDF−5蛋白をコードする他の配列を加工して、成熟ヒト
SDF−5蛋白を発現させることもできる。よって、本発明は、ヒトSDF−5
ポリペプチドをコードするDNA配列に正しい読み枠において結合している、フ
ラズルドファミリーのメンバー由来のシグナルペプチドをコードするキメラDN
A分子を包含する。
ベクターを細胞系の形質転換法に使用してもよく、ベクターは、選択された宿
主における複製および発現を指令しうる、本発明コーディング配列に作動可能に
結合された調節配列を含む。かかるベクターの調節配列は当業者に知られており
、宿主細胞に応じて選択できる。かかる選択は通常のことであり、本発明の一部
を形成しない。
ラット、ヒトまたは他の哺乳動物のSDF−5蛋白を製造するために、それを
コードするDNAを適当な発現ベクター中に移行させ、慣用的な遺伝子工学的手
法により哺乳動物細胞または他の好ましい真核細胞または原核細胞宿主中に導入
する。生物学的に活性のある組み換えヒトSDF−5を得るための好ましい発現
系は安定に
形質転換された哺乳動物細胞であると考えられる。
当業者は、配列番号:1の配列、またはSDF−5蛋白をコードする他のDN
A配列または他の修飾配列ならびにpCD(Okayama et al.,Mol.Cell Biol.,2:1
61-170(1982))、pJL3、pJL4(Gough et al.,EMBO J.,4:645-653(1985))
およびpMT2 CXMのごとき既知ベクターを用いることにより、哺乳動物発
現ベクターを構築することができる。
哺乳動物発現ベクターpMT2 CXMはp91023(b)(Wong et al.,Scie
nce 228:810-815,1985)の誘導体であり、テトラサイクリン耐性遺伝子のかわり
にアンピシリン耐性遺伝子を含み、さらにcDNAクローン挿入のためのXho
I部位を含むことにおいて異なっている。pMT2 CXMの機能的エレメント
は記載されており(Kaufman,R.J.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:689
-693)、アデノウイルスVA遺伝子、72bpのエンハンサーを含むSV40複
製開始点、5’スプライス部位およびアデノウイルス後期mRNA上に存在する
アデノウイルス三分節リーダー配列の大部分を含むアデノウイルス大後期プロモ
ーター、3’スプライスアクセプター部位、DHFRインサート、SV40初期
ポリアデニル化部位(SV40)、ならびにイー・コリ中での増殖に必要なpB
R322配列を含んでいる。
受託番号ATCC 67122としてthe American Type Culture Collection(
ATCC),Rockville,MD(USA)に寄託されたpMT−VWFのEcoRI消化によ
りプラスミドpMT2 CXMを得る。EcoRI消化によりpMT2−VWF
に存在するcDNAインサートを切り出し、pMT2を直鎖状とし、それをライ
ゲーション(ligation)し、これを用いてイー・コリHB101またはDH−5
を形質転換してアンピシリン耐性とすることができる。慣用的方法によりプラス
ミドpMT2 DNAを調製することができる。ついで、ループアウト/イン突
然変異(Morinaga,et al.,Biotechnology 84:636(1984))を用いてpMT2 C
XMを構築する。
これにより、SV40複製開始点およびpMT2エンハンサー配列の近傍のHi
ndIII部位に対応した塩基1075〜1145が除去される。さらに、下記
配列:
をヌクレオチド1145に挿入する。この配列は制限エンドヌクレアーゼXho
I認識部位を含む。pMT23と命名されたpMT2 CXMの誘導体は制限エ
ンドヌクレアーゼPstI、Eco1 RI、SalIおよびXhoIの認識部
位を含む。慣用的方法によりプラスミドpMT2 CXMおよびpMT23 D
NAを調製してもよい。
pMT21に由来するpEMC2β1は本発明の実施に適するかもしれない。
pMT21はpMT2に由来し、pMT2はpMT2−VWFに由来する。上記
のごとく、EcoRI消化によりpMT−VWF中に存在するcDNAインサー
トを切り出し、pMT2を直鎖状とし、これをライゲーションし、これを用いて
イー・コリHB101またはDH5を形質転換させてアンピシリン耐性とするこ
とができる。慣用的方法によりプラスミドpMT2 DNAを調製することがで
きる。
pMT21は下記の2つの修飾によりpMT2に由来するものである。第1は
、cDNAクローニング用のG/Cテイリング由来の19個のG残基の伸長部分
を含む、76bpのDHFR cDNA5’非翻訳領域が欠失されている。この
プロセスにおいて、XhoI部位が挿入されてDHFRのすぐ上流に下記配列:
が得られる。第2は、EcoRVおよびXbaI消化、DNAポリメラーゼIの
クレノウフラグメントでの処理、およびClaIリンカー(CATCGATG)へのライ
ゲーションにより単一のClaI部位が導入されている。これにより、250b
pのセグメントがアデノウイルス関連RNA(VAI)領域から欠失されるが、
VAI RNA遺伝子発現または機能は妨げられない。pMT21をEcoRI
およびXhoIで消化して、ベクターpEMC2B1を得るために使用する。
EcoRIおよびPstIでの消化により、EMCVリーダーの一部をpMT
2−ECAT1(S.K.Jung,et al,J.Virol 63:1651-1660(1989))から得て、2
752bpのフラグメントを生じさせる。このフラグメントをTaqIで消化し
て、508bpのEcoRI−TaqIフラグメントを得て、これを低融点アガ
ロースゲル電気泳動により精製する。下記の配列:
を有する68bpのアダプターおよびその相補鎖を合成する。これは5’Taq
I突出末端および3’XhoI突出末端を有する。
この配列はEMCウイルスリーダー配列のヌクレオチド763から827まで
に合致する。また、EMCウイルスリーダー中の位置10のATGがATTに変
化しており、その後にXhoI部位がある。pMT21 EcoRI−XhoI
フラグメント、EMCウイルスEcoRI−TaqIフラグメント、および68
bpのオリゴヌクレオチドアダプターTaqI−XhoIアダプターのスリーウ
ェイライゲーション(three way ligation)によりベクターpEMC2β1が得
られる。
このベクターは、哺乳動物細胞において所望cDNAを高レベルで発現させる
ように適切に関連づけられたSV40複製開始点およびエンハンサー、アデノウ
イルス大後期プロモーター、アデノウイルス三分節リーダー配列の大部分のcD
NAコピー、小さなハイブリッド介在配列、SV40ポリアデニル化シグナルお
よびアデノウイルスVAI遺伝子、DHFRおよびβ−ラクタマーゼマーカーな
らびにEMC配列を含む。
ベクター構築物はヒトSDF−5DNA配列の修飾を含んでいてもよい。例え
ば、コーディング領域の5’および3’末端にある非コーディングヌクレオチド
を除去することによりヒトSDF−5 cDNAを修飾することができる。欠失
された非コーディングヌクレオチドを、発現に有利であることが知られている他
の配列に置き換えてもよく、置き換えなくてもよい。これらのベクターを、ヒト
SDF−5蛋白の発現のために適当な宿主細胞中に形質転換する。さらに、ヒト
SDF−5コーディングシグナルペプチド配列を欠失させ、他の蛋白の完全なシ
グナルペプチドをコードする配列に置き換えることにより、配列番号:1の配列
、ヒトSDF−5蛋白をコードする他の配列を加工して成熟ヒトSDF−5蛋白
を発現させることができる。
当業者は、コーディング配列に隣接する哺乳動物調節配列を細菌配列に置換す
ることにより、配列番号:1の配列を加工して、細菌細胞により細胞内または細
胞外発現される細菌ベクターを作成することができる。例えば、コーディング配
列をさらに加工することができる(例えば、他の既知リンカーを連結、あるいは
非コーディング配列を欠失させることにより修飾、あるいは既知方法によりヌク
レオチドを変化させる)。ついで、修飾ヒトSDF−5コーディング配列を、T.
Taniguchi et al.,Proc .Natl Acad.Sci.USA,77:5230-5233(1980)に記載さ
れたような方法を用いて既知細菌ベクター中に挿入することができる。ついで、
この典型的な細菌ベクターを細菌宿主中に形質転換し、それにより蛋白を発現さ
せる。ヒトSDF−5蛋白を細菌細胞の細胞外で発現させるための方法としては
、例えば、欧州特許出願EPA第177343号参照。
昆虫細胞での発現のために、同様の操作を行って昆虫ベクターを構築すること
ができる(例えば、出願公開された欧州特許出願第155476号記載の方法参
照)。本発明因子を酵母により細胞内または細胞外発現させるために、酵母の調
節配列を用いて酵母ベクターを構築してもよい(例えば、公開されたPCT出願
WO86/00639および欧州特許出願EPA第123289号参照)。
本発明ヒトSDF−5蛋白を哺乳動物細胞において高レベルで産生させる方法
は、異型のヒトSDF−5遺伝子の多数のコピーを含む細胞の構築を包含しても
よい。異型遺伝子を増幅可能マーカー、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DH
FR)遺伝子に連結し、Kaufman and Sharp,J .Mol.Biol.,159:601-629(1982
)の方法に従ってメトトレキセート(MTX)濃度を上昇させつつ増殖させて、
増大した遺伝子コピーを含む細胞を選択することができる。
例えば、発現を可能にする他のプラスミドの配列に作動可能に結合された本発
明ヒトSDF−5蛋白のDNA配列を含むプラスミドならびにDHFR発現プラ
スミドpAdA26SV(A)3[Kaufman and Sharp,Mol .Cell.Biol.,2:1304(1
982)]を、リン酸カルシウム共沈およびトランスフェクション、エレクトロポレ
ーションまたはプロトプラスト融合を包含する種々の方法により同時に
DHFR欠損CHO細胞中に導入することができる。透析されたウシ胎児血清を
含有するアルファ培地中での選択に関してDHFR発現形質転換体を選択し、つ
いで、Kaufman et al.,Mol Cell Biol.,5:1750(1983)に記載のごとくMTX濃
度を上昇させつつ(例えば、逐次的に0.02、0.2、1.0、ついで5μM
のMTX)増殖させることにより、増殖に関して選択する。形質転換体をクロー
ン化し、本明細書記載のアッセイの1つにより、生物学的に活性のあるヒトSD
F−5の発現をモニターする。ヒトSDF−5蛋白発現はMTXレベルの上昇に
伴って増大するはずである。[35S]メチオニンまたはシステインを用いるパ
ルスラベリングおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動のごとき当該分野で知ら
れた標準的方法を用いてヒトSDF−5ポリペプチドを特徴づける。同様の方法
により他の関連SDF−5蛋白を得ることができる。
フラズルド活性を示す本発明SDF−5蛋白は、ヒトおよび他の動物における
軟骨細胞および/または軟骨組織ならびに膵臓組織、および他の器官の組織のご
とき細胞および組織の誘導、形成、成長、分化、増殖および/または維持ならび
に治癒に適用される。ヒトSDF−5蛋白を用いるかかる調合物は、リューマチ
性関節炎および骨関節炎および軟骨に対する外傷の治療、ならびに膵臓腫瘍、糖
尿病および他の膵臓組織の疾病の予防において予防的使用をしてもよい。フラズ
ルド蛋白により誘導される、ベータ細胞、ランゲルハンス島、および膵臓表現型
の他の細胞のデノボ形成は、先天性の、外傷により誘導される、あるいは腫瘍学
的な組織欠損または症状の修復に貢献する。ヒトSDF−5蛋白を膵臓病、およ
び他の組織および器官の修復プロセスに使用してもよい。かかる作用剤は、適当
な幹細胞を誘引する環境を提供し、膵臓形成細胞の成長および増殖を刺激し、あ
るいは膵臓形成細胞の前駆細胞の分化を誘導する可能性があり、さらに他の組織
および器官の再生を助ける可能性がある。本発明ヒトSDF−5ポリペプチドは
膵臓炎または糖尿病にごとき器官の疾病の治療にも有用でありうる。
本発明蛋白を傷の治癒および関連組織の修復に使用してもよい。傷のタイプは
、熱傷、切り傷および潰瘍を包含するが、これらに限らない(傷の治癒および関
連組織の修復については例えば、PCT公開WO84/01106参照)。さら
に本発
明蛋白はニューロン、星状細胞および/またはグリア細胞の生存率を高め、それ
ゆえ、移植ならびにニューロンの生存立および修復の低下を示す症状の治療にお
いて有用であると考えられる。さらに本発明蛋白は、神経、表皮、筋肉、骨、軟
骨、腱および靭帯のごとき結合組織のごとき他のタイプの組織、ならびに膵臓、
肝臓、脾臓、肺、心臓、脳および腎臓組織に関連した症状の治療に有用でありう
る。本発明蛋白は食物の添加物として、あるいは細胞培養培地の添加物としても
価値を有する。この用途には、蛋白を無傷の状態で使用してもよく、あるいは前
消化して、より容易に吸収される添加物としてもよい。
本発明蛋白は、フラズルドファミリーの蛋白に特徴的な他の有用な特性も有し
うる。かかる特性は、血管形成、化学走性および/または化学誘引特性、および
分化応答、細胞増殖応答、および細胞の付着、移動を包含する応答、および細胞
外マトリックスに対する影響を包含する。これらの特性は、本発明蛋白を傷の治
癒、繊維症の軽減および瘢痕組織形成の抑制のための有効な作用剤としている。
本発明蛋白は、インスリン、グルカゴンまたは他の内分泌もしくは外分泌ホルモ
ンのごとき貴重なホルモンを分泌しうる細胞の形成の誘導にも有用でありうる。
本発明のさらなる態様は、軟骨および結合組織の疾病、ならびに膵臓病、糖尿
病、および膵臓組織の疾病または疾患に関連した他の症状の治療方法ならびに治
療用組成物である。さらに本発明は、傷の治癒および組織の修復のための治療方
法ならびに組成物を包含する。かかる組成物は、医薬上許容される賦形剤、担体
またはマトリックスと混合された治療上有効量の少なくとも1種の本発明ヒトS
DF−5蛋白を含む。さらに本発明組成物はニューロンおよびグリア細胞の生存
率を高め、それゆえ、移植ならびにニューロンの生存率低下を示す症状の治療に
有用であると考えられる。
本発明蛋白は、他の関連蛋白および成長因子と協奏的に、あるいはおそらく相
乗的に作用うしうると考えられる。それゆえ、本発明のさらなる治療方法および
組成物は、骨形態形成蛋白(BMP)を包含するTGF−βスーパーファミリー
の蛋白のメンバー、成長および分化因子(GDF)および他の蛋白、例えば米国
特許第5108922、5013649、5116738、5106748、
5187076および5141905号に開示されたBMP−1、BMP−2、
BMP−3、BMP−4、BMP−5、BMP−6およびBMP−7;PCT出
願公開WO91/18098に開示されたBMP−8;およびPCT出願公開W
O93/00432に開示されたBMP−9;PCT出願公開WO94/268
93に開示されたBMP−10;PCT出願公開WO94/26892に開示さ
れたBMP−11、あるいはPCT出願公開WO95/16035に開示された
BMP−12またはBMP−13、あるいはPCT出願公開WO96/3671
0に開示されたBMP−15あるいは1996年9月18日出願の同時係属特許
出願第08/715202号に開示されたBMP−16のごとき治療上有効量の
少なくとも1種の他の蛋白と一緒になった治療上有効量の少なくとも1種の本発
明ヒトSDF−5蛋白を含む。
有用でありうる他の組成物は、Vgr−2ならびにPCT出願公開WO94/
15965;WO94/15949;WO95/01801;WO95/018
02;WO94/21681;WO94/15966等に記載されたものを包含
する成長および分化因子(GDF)を含有していてもよい。WO94/0155
7に開示されたBIP;およびPCT出願公開WO93/16099に開示され
たMP52を包含してもよい。上記すべての開示を、参照により本明細書に開示
されているものとみなす。好ましい具体例において、SDF−5が蛋白BMP−
2、BMP−7、MP52、BMP−12またはBMP−13と組み合わされる
。
組成物は、表皮成長因子(EGF)、繊維芽細胞成長因子(FGF)、血小板
由来成長因子(PDGF)、形質転換成長因子(TGF−αおよびTGF−β)
、アクチビン、インヒビン、およびk−繊維芽細胞成長因子(kFGF)、副甲
状腺ホルモン(PHT)、白血病抑制因子(LIF/HILDA/DIA)、イ
ンスリン様成長因子(IGF−IおよびIGF−II)のごとき他の作用剤およ
び成長因子を含んでいてもよい。これらの作用剤の一部を本発明に使用してもよ
い。
pH、等張性、安定性等において生理学的に許容されるかかる蛋白組成物の処
方は当業者に明らかである。またフラズルド蛋白における種特異性が欠乏してい
る場合の獣医学的用途にも、本発明治療組成物は目下のところ価値を有する。詳
細には、
本発明SDF−5蛋白でのかかる治療に適した対象は、ヒトのほかには家畜およ
びサラブレッドのウマである。
治療方法は、組成物を局所的、全身的、または局部的に、注射または移植のご
とき方法で投与することを包含する。投与する場合、本発明に使用する治療組成
物は、もちろん、パイロジェン不含で、生理学的に許容される形態である。さら
に、望ましくは、組成物をカプセル封入してもよく、あるいは膵臓または他の組
織のダメージ部位へのデリバリーのために粘性のある形態として注射してもよい
。局所的投与は傷の治癒および組織の修復に適しているかもしれない。本発明方
法において、上記組成物に含有されていてもよいSDF−5蛋白以外の治療上有
用な作用剤を、SDF−5組成物のかわりに、あるいはそれに加えて、同時また
は逐次投与してもよい。
移植には、好ましくは、組成物は、ヒトSDF−5蛋白を膵臓または他の組織
のダメージ部位にデリバリーすることのできるマトリックスを含む。マトリック
スは、ヒトSDF−5および/または他の蛋白を除々に放出するほか、細胞を浸
潤させるために正しくヒトSDF−5を提供し、適切な環境を提供する。かかる
マトリックスは、現在他の移植医療に使用されている材料から作られてもよい。
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容上の外観
および界面特性に基づいて行われる。ヒトSDF−5組成物の個々の適用により
、適切な処方が決定される。
例えば形成が望まれる組織量、組織ダメージ部位、ダメージを受けた組織の状
態、傷のサイズ、ダメージを受けた組織のタイプ、患者の年齢、性別、食事、感
染症の重さ、投与期間ならびに他の臨床的要因のごときヒトSDF−5蛋白の作
用を変化させる種々の要因を担当医が考慮することにより、投与規則が決定され
るであろう。復元に用いるマトリックスおよび組成物中のヒトSDF−5蛋白の
タイプに応じて用量は変更されうる。IGF I(インスリン様増殖因子I)の
ごとき他の既知成長因子の添加もまた、用量に影響しうる。
組織の成長および/または修復を定期的に評価することにより、進展をモニタ
ーすることができる。例えば、X線、組織形態学的試験およびテトラサイクリン
標識により進展をモニターすることができる。用途および生物学的活性
本発明蛋白は、下記の1またはそれ以上の用途または生物学的活性(本明細書
に引用されたアッセイに関連するものも含む)を示すと考えられる。本発明蛋白
に関して説明された用途または活性は、かかる蛋白の投与または使用により、あ
るいはかかる蛋白をコードしているポリヌクレオチドの投与または使用(例えば
、遺伝子治療またはDNA導入に適したベクターのごとき)により提供されうる
。研究用途および有用性
本発明により提供される蛋白は、高処理量スクリーニングのための一群の多数
の蛋白を含む、生物学的活性を決定するためのアッセイに;抗体の生成または他
の免疫応答を誘導するために;生物学的液体中の蛋白(またはその受容体)のレ
ベルを定量的に決定するために設計されたアッセイにおける試薬(標識試薬を包
含)として;対応蛋白が優先的に発現される(構成的に、または組織分化もしく
は発達の特定段階において、または疾病状態において発現される)組織のマーカ
ーとして;ならびに、もちろん関連受容体またはリガンドを単離するために用い
てもよい。蛋白がもう1つの蛋白に結合または潜在的に結合する場合、結合する
他の蛋白を同定し、あるいは、または結合相互作用の阻害剤を同定するために蛋
白を使用することができる。これらの結合相互作用に関与する蛋白を用いて、結
合相互作用に関するペプチドまたは小型分子状阻害剤またはアゴニストのスクリ
ーニングを行うこともできる。
これらの研究用途のいずれかまたはすべては、研究用製品として商品化するた
めに試薬グレードまたはキットのフォーマットへと発展させることができる。
上記使用を実行するための方法は当業者によく知られている。かかる方法を開
示する文献は、"Molecular Cloning:A Laboratory Manual",2nd ed.,Cold Spr
ing
Harbor Laboratory Press,Sambrook,J.,E.F.Fritsch and T.Maniatis eds.
,1989,および"Methods in Enzymology:Guide to Molecular Cloning Techniqu
es",Academic Press,Berger,S.L.and A.R.Kimmel eds.,1987を包含するが
、これらに限らない。
栄養としての用途
本発明蛋白を栄養源または添加物として使用することができる。かかる用途は
、蛋白またはアミノ酸添加物としての用途、炭素源としての用途、窒素源として
の用途および炭水化物源としての用途を包含するが、これらに限らない。かかる
場合、本発明蛋白を特定の生物のエサとして添加してもよく、あるいは粉末、ピ
ル、溶液、懸濁液またはカプセルの形態のごとき別個の固体または液体調合物と
して投与することもできる。微生物の場合、微生物が培養される培地に本発明蛋
白またはポリヌクレオチドを添加することができる。
サイトカインおよび細胞増殖/分化活性
本発明蛋白はサイトカイン活性、細胞増殖活性(誘導もしくは阻害)または細
胞分化活性(誘導もしくは阻害)を示しうるか、またはある種の細胞集団におい
て他のサイトカインの産生を誘導しうる。今日まで見いだされてきた多くの蛋白
性因子(すべての既知サイトカインを包含)は、1またはそれ以上の因子依存的
細胞増殖アッセイにおいて活性を示しており、よって、アッセイはサイトカイン
活性の便利な確認法として役立つ。本発明蛋白の活性は、細胞系(32D、DA
2、DA1G、T10、B9、B9/11、BaF3、MC9/G、M+(pr
eBM+)、2E8、RB5、DA1、123、T1165、HT2、CTLL
2、TF−1、Mo7eおよびCMKを包含するが、これらに限らない)のため
の多くの常套的な因子依存的細胞増殖アッセイのいずれかにより確認される。
本発明蛋白の活性を、とりわけ、下記方法により測定してもよい:
T細胞または胸腺細胞の増殖についてのアッセイは、Current Protocols in I
mmunology,Ed by J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.
Margulies,E.M.Shevach,W Strober,Pub.Greene Publishing Associates an
d Wiley-Interscience(Chapter 3,In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Fun
ction 3.1-3.19;Chapter 7,Immunologic studies in Humans);Takai et al.,J
.Immunol.137:3494-3500,1986;Bertagnolli et al.,J.Immunol.145:1706-
1712,1990;Bertagnolli et al.,Cellular Immunology 133:327-341,1991;Ber
tagnolli,et al.,J.Immunol.149:3778-3783,1992;Bowman et al.,J.Immu
nol.152:1756-1761,1994に記載されたものを包含するが、これらに限らない。
脾臓細胞、リンパ節細胞または胸腺細胞のサイトカイン生成および/または増
殖に関するアッセイは、Polyclonal Tcell stimulation,kruisbeek,A.M.and Sh
evach,E-M.In Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan eds.Vol
1pp.3.12.1-3.12.14,John Wiley and Sons,Toronto.1994;and Measurement
of mouse and human Interferonγ,Schreiber,R.D.In Current Protocols in
Immunology.J.E.e.a.Coligan eds.Vol 1pp.6.8.1-6.8.8,John Wiley and
Sons,Toronto.1994に記載されたものを包含するが、これらに限らない。
造血およびリンパ生成細胞の増殖および分化についてのアッセイは、Measurem
ent of Human and MurineInterleukin 2 and Interleukin 4,Bottomly,K.,Da
vis,L.S.and Lipsky,P.E.In CurrentProtocols in Immunology.J.E.e.a.C
oligan eds.Vol 1pp.6.3.1-6.3.12,John Wiley and Sons,Toronto.1991;de
vries et al.,J.Exp.Med.173:1205-1211,1991;Moreau et al.,Nature 336
:690-692,1988;Greenberger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:2931
-2938,1983;Measurement of mouse and human interleukin6-Nordan,R.In Cu
rrent Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan eds.Vol 1pp.6.6.1-6.6.
5,John Wiley and Sons,Toronto.1991;Smith et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.83:1857-1861,1986;Measurement of human Interleukin 11-Bennett
,F.,Giannotti,J.,Clark,S.C.and Turner,K.J.In Current Protocols
in Immunology.J.E.e.a.Coligan eds.Vol 1pp.6.15.1 John Wiley
and Sons,Toronto.1991;Measurement of mouse and humanInterleukin9-Ciarl
etta,A.,Giannotti,J.,Clark,S.C.and Turner,K.J.In Current Protoco
ls in Immunology.J.E.e.a.Coligan eds.Vol 1pp.6.13.1,John Wiley and
Sons,Toronto.1991に記載されたものを包含するが、これらに限らない。
抗原に対するT細胞クローンの応答についてのアッセイ(特に、増殖およびサ
イトカイン産生を測定することによりAPC−T細胞相互作用ならびに直接的な
T細胞の効果を同定する)は、Current Protocols in Immunology,Ed byJ.E.
Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach,W Strober,Pub.G
reene Publishing Associates and Wiley-Interscience(Chapter 3,In Vitro a
ssays for Mouse Lymphocyte Function;Chapter 6,Cytokines and their cellu
lar receptors;Chapter 7,Immunologic studies in Humans);Weinberger et al
.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:6091-6095,1980;Weinberger et al.,Eur
.J.Immun.11:405-411,1981;Takai etal.,J.Immunol.137:3494-3500,1986
;Takai et al.,J.Immunol.140:508-512,1988に記載されたものを包含するが
、これらに限らない。
免疫刺激または抑制活性
また本発明蛋白は、本明細書記載のアッセイにおける活性(これらに限らない
)を包含する免疫刺激または免疫抑制活性を示すものであってもよい。蛋白は、
種々の欠乏症および障害(重症の免疫欠乏合併症(SCID)を包含)において
有用である可能性があり、例えば、Tおよび/またはBリンパ球の増殖をアップ
レギュレーションまたはダウンレギュレーションすることにおいて、ならびにN
K細胞および他の細胞集団の細胞溶解活性を有効ならしめることにおいて有用で
ありうる。これらの免疫欠乏症は遺伝的なものであってもよく、またウイルス(
例えば、HIV)ならびに細菌または真菌感染により引き起こされるものであっ
てもよく、あるいは自己免疫疾患により引き起こされるものであってもよい。よ
り詳細には、ウイルス、
細菌、真菌または他の感染物質により引き起こされる感染性疾患、例えば、HI
V、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ミコバクテリア、レシュマニア、マラリ
アおよびカンジダ種のごとき種々の真菌感染症を、本発明蛋白を用いて治療可能
である。もちろん、この点において、免疫系に対するブーストが指示される場合
、すなわち、癌の治療において、本発明蛋白を用いてよい。
本発明蛋白を用いて治療してもよい自己免疫疾患は、例えば、多発性硬化症、
全身性の深在性エリトマーデス、リューマチ性関節炎、自己免疫性肺炎、Guilla
in-Barre症候群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症
、対宿主移植片疾患および自己免疫性の炎症性の目の疾患を包含する。本発明の
かかる蛋白を、喘息または他の呼吸器系の疾患のごときアレルギー性反応および
症状の治療に用いてもよい。免疫抑制が望まれる他の症状(例えば、喘息(特に
アレルギー性喘息)および関連呼吸器系の問題を包含)を本発明蛋白を用いて治
療してもよい。免疫抑制が望まれる他の状態(例えば、器官移植を包含)を、本
発明蛋白を用いて治療してもよい。
本発明蛋白を用いて、多くのやり方で免疫応答を可能にすることもできる。ダ
ウンレギュレーションは、すでに進行中の免疫応答を阻害またはブロックする形
態のものであってもよく、あるいは免疫応答の誘導を妨害することを含むもので
あってもよい。T細胞応答を抑制することにより、あるいはT細胞中に特異的な
耐性を誘導することにより、あるいはその両方により活性化T細胞の機能を阻害
してもよい。一般的には、T細胞応答の免疫抑制は活性のある、非抗原特異的な
プロセスであり、T細胞を抑制剤に連続的に曝露することを必要とする。耐性と
は、T細胞における非応答性またはアネルギーを意味し、一般的には抗原特異的
であり耐性化剤への曝露を止めた後も持続するという点で免疫抑制とは異なる。
操作上は、耐性化剤の不存在下で特異的抗原に曝露した際のT細胞応答の欠如に
より耐性が示されうる。
1またはそれ以上の抗原機能(Bリンパ球抗原機能(例えばB7のごとき)を
包含するが、これに限らない)をダウンレギュレーションすることまたは妨害す
ること、例えば、活性化T細胞による高レベルのリンホカイン合成の妨害は、組
織、皮膚および器官の移植および対宿主移植片疾患(GVHD)において有用で
あろう。
例えば、T細胞機能のブロックは組織移植における組織破壊を減少させるはずで
ある。典型的には、組織移植において、移植片の拒絶反応は、組織片がT細胞に
より外来のものと認識されることにより開始され、次いで、移植片を破壊する免
疫反応が起こる。免疫細胞上でのB7リンパ球抗原とその本来的なリガンドとの
相互作用を阻害またはブロックする分子(別のBリンパ球抗原(例えば、B7−
1、B7−3)の活性を有するモノマー形態のペプチドと混合された、あるいは
単独の、B7−2活性を有する可溶性でモノマー形態のペプチド)の移植前の投
与は、応答的な同時刺激シグナルを伝達することなく免疫細胞上の本来のリガン
ドへの分子の結合を誘導する可能性がある。この点においてBリンパ球抗原機能
をブロックすることは、T細胞のごとき免疫細胞によるサイトカイン合成を妨害
し、かくして、免疫抑制剤として作用する。そのうえ、同時刺激の欠如はT細胞
の反応を失わせるのに十分でありうる。Bリンパ球抗原ブロッキング試薬による
長期の耐性の誘導により、これらのブロッキング試薬の繰り返し投与の必要性が
回避されうる。対象において十分な免疫抑制または耐性を達成するためには、B
リンパ球抗原の組み合わせの機能をブロックすることも必要かもしれない。
器官移植拒絶反応またはGVHDを妨害することにおける個々のブロッキング
試薬の有効性を、ヒトにおける有効性を推定しうる動物モデルを用いて評価する
ことができる。使用可能な適当な系の例は、ラットにおける同種心臓移植片およ
びマウスにおける異種膵臓島細胞移植片を包含し、それらは両方ともインビボで
のCTLA4Ig融合蛋白の免疫抑制効果を試験するために使用された(Lenscho
w et al.,Science 257:789-792(1992)およびTurka et al.,Proc Natl.Acad.
Sci.USA,89:11102-11105(1992)に記載されている)。さらに、GVHDのネズ
ミモデル(Paul ed.,Fundamental Immunology,Ravan Press,New York,1989,
pp.846-847参照)を用いて、インビボでの当該疾患の進行に対するBリンパ球抗
原機能のブロッキング効果を決定することができる。
また、抗原機能をブロックすることは自己免疫疾患の治療にとり治療的に有用
でありうる。多くの自己免疫疾患は、自己組織に対して反応性があり、疾病の病
理に関与するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進するT細胞の不適当な活
性化の
結果である。自己反応性T細胞の活性化を妨害することは疾病の徴候を減少また
は除去しうる。Bリンパ球抗原の受容体:リガンド相互作用を破壊することによ
りT細胞の同時刺激をブロックする試薬の投与を用いてT細胞活性化を阻害し、
疾病プロセスに関与しうる自己抗体またはT細胞由来のサイトカインの産生を妨
害することができる。さらに、ブロッキング試薬は、疾病の長期の寛解を導く可
能性のある自己反応性T細胞の抗原特異的耐性を誘導しうる。自己免疫疾患の予
防または改善におけるブロッキング試薬の有効性を、ヒトの自己免疫疾患につい
ての十分に特徴づけられた多くの動物モデルを用いて決定することができる。例
は、ネズミの実験的自己免疫脳炎、MRLlpr/lprマウスまたはNZBハ
イブリッドマウスにおける全身性深在性エリトマトーデス、ネズミ自己免疫コラ
ーゲン関節炎、NODマウスおよびBBラットにおける糖尿病、およびネズミの
実験的重症筋無力症(Paul ed.,Fundamental Immunology,Raven Press,New Y
ork,1989,pp.840-856)を包含する。
免疫応答をアップレギュレーションするための手段としての抗原機能(好まし
くは、Bリンパ球抗原機能)のアップレギュレーションは治療に有用でもある。
免疫応答のアップレギュレーションは存在している免疫応答を促進する形態また
は最初の免疫応答を除去する形態であってよい。例えば、Bリンパ球抗原機能を
刺激することによる免疫応答の促進は、ウイルス感染の場合に有用でありうる。
さらに、インフルエンザ、通常のかぜ、および脳炎のごとき全身的なウイルス性
疾患を、刺激性形態のBリンパ球抗原を全身投与することにより改善してもよい
。
別法として、T細胞を患者から取り、本発明ペプチドを発現するACPsを付
加したウイルス抗原とともにインビトロにおいてT細胞を同時刺激するか、また
は刺激性形態の本発明可溶性ペプチドと一緒にし、次いで、インビトロで活性化
されたT細胞を患者体内に再導入することにより、感染患者における抗ウイルス
免疫応答を促進してもよい。抗ウイルス免疫応答を促進するもう1つの方法は、
感染細胞を患者から取り、本明細書記載の本発明蛋白をコードする核酸をそれら
にトランスフェクションして細胞がその表面に蛋白全体または一部を発現するよ
うにし、次いで、トランスフェクション細胞を患者体内に再導入することであろ
う。すると、感染細
胞はインビボにおいて同時刺激シグナルをT細胞に伝えることができ、そのこと
によりT細胞を活性化することができよう。
もう1つの適用例において、抗原機能(好ましくは、Bリンパ球抗原機能)のア
ップレギュレーションまたは促進は腫瘍免疫性の誘導において有用でありうる。
本発明の少なくとも1種のペプチドをコードする核酸でトランスフェクションさ
れた腫瘍細胞(例えば、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、神経芽細胞腫、癌腫
)を対象に投与して対象中の腫瘍特異的耐性を克服することができる。所望なら
ば、腫瘍細胞をトランスフェクションしてペプチドの組み合わせを発現させるこ
とができる。例えば、患者から得た腫瘍細胞を、B7−2様活性を有するペプチ
ドのみ、またはB7−1様活性および/またはB7−3様活性を有するペプチド
と組み合わせて発現することを指令する発現ベクターで、エクスビボにおいてト
ランスフェクションすることができる。トランスフェクションされた腫瘍細胞を
患者に戻して、トランスフェクションされた細胞の表面上にペプチドを発現させ
る。別法として、遺伝子治療法を用いてインビボでのトランスフェクションのた
めに腫瘍細胞を標的化することができる。
腫瘍細胞表面上におけるBリンパ球抗原の活性を有する本発明ペプチドの存在
は、T細胞に必要な同時刺激シグナルを提供して、T細胞により媒介されるトラ
ンスフェクションされた腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導する。さらに、MHC
クラスIまたはMHCクラスII分子を欠く腫瘍細胞、あるいは十分量のMHC
クラスIまたはMHCクラスII分子を再発現できない腫瘍細胞を、MHCクラ
スIα鎖蛋白およびβ2マイクログロブリン蛋白またはMHCクラスIIα鎖お
よびMHCクラスIIβ鎖蛋白の全体または一部(例えば、末端切断蛋白の細胞
質ドメイン)をコードしている核酸でトランスフェクションして、そのことによ
りクラスIまたはクラスIIMHC蛋白を細胞表面上に発現させることができる
。Bリンパ球抗原(例えば、B7−1、B7−2、B7−3)の活性を有するペ
プチドと組み合わせた適当なクラスIまたはクラスII HMCの発現は、T細
胞により媒介されるトランスフェクションされた腫瘍細胞に対する免疫応答を誘
導する。所望により、不変鎖のごとき、MHCクラスII結合蛋白の発現をブロ
ックするアンチセンス構築物をコー
ドしている遺伝子を、Bリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードしている
DNAとともに同時トランスフェクションして腫瘍関連抗原の提示を促進し、腫
瘍特異的免疫性を誘導こともできる。よって、ヒト対象におけるT細胞により媒
介される免疫応答の誘導は、対象における腫瘍特異的耐性を克服するに十分であ
りうる。
本発明蛋白の活性を、特に、下記方法により測定してもよい:
胸腺細胞または脾臓細胞の細胞毒性に適したアッセイは、Current Protocols
in Immunology,Ed by J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M
.Shevach,W Strober,Pub.Greene Publishing Associates and Wiley-Inters
cience(Chapter 3,In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19
;Chapter 7,Immunologics tudies in Humans);Herrmann et al.,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 78:2488-2492,1981;Herrmann et al.,J.Immunol.128:1968-
1974,1982;Handa et al.,J.Immunol.135:1564-1572,1985;Takai et al.,J
.Immunol.137:3494-3500,1986;Takai et al.,J.Immunol.140:508-512,19
88;Herrmann et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2488-2492,1981;Herrma
nn et al.,J.Immunol.128:1968-1974,1982;Handa et al.,J.Immunol.135
:1564-1572,1985;Takai et al.,J.Immunol.137:3494-3500,1986;Bowmanet
al.,J.Virology 61:1992-1998;Takai et al.,J.Immunol.140:508-512,198
8;Bertagnolli et al.,Cellular Immunology 133:327-341,1991;Brown et al.
,J.Immunol.153:3079-3092,1994に記載されたアッセイを包含するが、これ
らに限らない。
T細胞依存性免疫グロブリン応答およびイソタイプスイッチングのためのアッ
セイ(特に、T細胞依存性抗体応答を転調させ、Th1/Th2プロフィールに
影響する蛋白を同定する)は、Maliazewski,J.Immunol.144:3028-3033,1990に記
載されているアッセイを包含するが、これに限らず、さらにB細胞の機能のアッ
セイは、In vitro antibody production,Mond,J.J.and Brunswick,M.In Current
Protocols in Immunology J.E.Coligan eds.Val 1pp.3.8.1-3.8.16,John Wiley
and Sons,Tronto 1994に記載のアッセイを包含する。
混合リンパ球反応(MLR)アッセイ(特に、主としてTh1およひCTL応
答
を発生させる蛋白を同定する)は、Current Protocols in Immunology,Ed by J
.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach,W Strober,P
ub.Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(Chapter 3,In Vi
tro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19;Chapter 7,Immunologic
studies in Humans);Takai et al.,J.Immunol.137:3494-3500,1986;Takai
et al.,J.Immunol.140:508-512,1988;Bertagnolli et al.,J.Immunol.14
9:3778-3783,1992に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない。
樹枝状細胞依存的アッセイ(特に、無処理のT細胞を活性化する樹枝状細胞に
より発現される蛋白を同定する)は、Guery et al.,J.Immunol.134:536-544
,1995;Inaba et al.,Journal of Experimental Medicine 173:549-559,1991;
Macatonia et al.,Journal of Immunology 154:5071-5079,1995;Porgador et
al.,Journal of Experimental Medicine 182:255-260,1995;Nair et al.,Jou
rnal of Virology 67:4062-4069,1993;Huang et al.,Science 264:961-965,1
994;Macatonia et al.,Journal of Experimental Medicine 169:1255-1264,19
89;Bhardwaj et al.,Journal of Clinical Investigation 94:797-807,1994;a
nd Inabaetal.,Journal of Experimental Medicine 172:631-640,1990に記載
されたアッセイを包含するが、これらに限らない。
リンパ球生存/アポトーシスのアッセイ(特に、超抗体誘導後のアポトーシス
を防止する蛋白、ならびにリンパ球のホメオスタシスを調節する蛋白を同定する
)は、Darzynkiewicz et al.,Cytometry 13:795-808,1992;Gorczyca et al.,
Leukemia 7:659-670,1993;Gorczyca et al.,Cancer Research 53:1945-1951,
1993;Itoh et al.,Cell 66:233-243,1991;Zacharchuk,Journal of Immunolog
y 145:4037-4045,1990;Zamai et al.,Cytometry 14:891-897,1993;Gorczyca
et al.,International Journal of Oncology 1:639-648,1992に記載のアッセ
イを包含するが、これらに限らない。
初期段階のT細胞のコミットメント(commitment)および発達のアッセイは、An
tica
et al.,Blood 84:111-117,1994;Fine et al.,Cellular Immunology 155:111-122
,1994;Galy et al.,Blood 85:2770-2778,1995;Toki et al.,Proc.Natl.Acad
.Sci.USA 88:7548-7551,1991に記載のアッセイを包含するが、これらに限ら
ない。
造血調節活性
本発明蛋白は、造血の調節において有用であり、それゆえ、骨髄およびリンパ
球欠乏症の治療において有用である。コロニー形成細胞または因子依存性細胞系
を支持する最低限の生物学的活性でさえも、造血の調節への関与を示している。
例えば、赤血球系前駆細胞のみの増殖を支持すること、あるいは他のサイトカイ
ンと組み合わされて、例えば種々の貧血の治療に有用性を示すこと、あるいは放
射線療法/化学療法と組み合わされて赤芽前駆細胞および/または赤芽細胞の産
生を刺激すること;顆粒球のごとき骨髄細胞および単球/マクロファージの増殖
を支持すること(すなわち、伝統的なCSF活性)、例えば、化学療法と組み合わ
されて、引き続き起こる骨髄抑制を防止することに有用であり;巨核細胞の増殖
、次いで、血小板の増殖を支持すること、またそれにより血小板減少症のごとき
種々の血小板疾患を予防または治療することに有用であり、また一般的には血小
板輸液の代わりにあるいはそれと相補的に使用され;さらに/あるいは造血幹細
胞(成熟して上記のすべての造血細胞となり、それゆえ、種々の幹細胞疾患(通
常には、移植により治療される疾患であり、例えば、再生不良性貧血および発作
性ヘモグロビン尿症)において有用性がわかる)の増殖を支持することに有用で
あり、さらにはインビボまたはエクスビボでの放射線/化学療法後(すなわち、
骨髄移植と組み合わされる)、あるいは遺伝子治療のために遺伝子操作された後
の幹細胞コンパートメントの正常細胞としての再増殖においても有用である。
本発明蛋白の活性を、特に、下記方法測定してもよい。
種々の造血細胞系の増殖および分化に適したアッセイはすでに引用されている
。
胚の幹細胞の分化のアッセイ(特に、胚の分化造血に影響する蛋白を同定する
)は、Johansson et al.Cellular Biology 15:141-151,1995;Keller et al.,
Molecular and Cellular Biology 13:473-486,1993;McClanahan et al.,Blood
81:2903-2915,1993に記載のアッセイを包含するが、これらに限らない。
幹細胞生存および分化のアッセイ(特に、リンパー造血を調節する蛋白を同定
する)は、Methylcellulose colony forming assays,Freshney,M.G.In Cultu
re of Hematopoietic Cells.R.I.Freshney,et al.eds.Vol pp.265-268,W
iley-Liss,Inc.,New York,NY.1994;Hirayama et al.,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 89:5907-5911,1992;Primitive hematopoietic colony forming cells
with high proliferative potential,McNiece,I.K.and Briddell,R.A.In C
ulture of Hematopoietic Cells.R.I.Freshney,et al.eds.Vol pp.23-39
,Wiley-Liss,Inc.,New York,NY.1994;Neben et al.,Experimental Hemato
logy 22:353-359,1994;Cobblestone area forming cell assay,Ploemacher,R
.E.In Culture of Hematopoietic Cells.R.I.Freshney,et al.eds.Vol pp
.1-21,Wiley-Liss,Inc..,New York,NY.1994;Long term bone marrow cult
ures in the presence of stromal cells,Spooncer,E.,Dexter,M.and Alle
n,T.In Culture of Hematopoietic Cells.R.I.Freshney,et al.eds.Vol
pp.163-179,Wiley-Liss,Inc.,New York,NY.1994;Long term culture init
iating cell assay,Sutherland,H.J.In Culture of Hematopoietic Cells.R
.I.Freshney,et al.eds.Vol pp.139-162,Wiley-Liss,Inc.,New York,N
Y.1994に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない。
組織増殖活性
本発明蛋白は、骨、軟骨、鍵、靭帯および/または神経組織の成長または再生
、ならびに傷の治癒および組織修復に用いる組成物において、さらに熱傷、裂傷
および潰瘍の治療において有用性を有する。
骨が正常に形成されない環境において軟骨および/または骨の成長誘導する本
発明蛋白は、ヒトおよび他の動物における骨折および軟骨損傷または欠損の治癒
における用途がある。本発明蛋白を用いるかかる調合物は、閉鎖性骨折ならびに
解放性骨折の軽減に有用であり、また人工関節の固定の改善にも有用である。骨
形成剤に
より誘導されるデノボ骨形成は、先天性の、外傷による、あるいは腫瘍学的切除
により誘発される脳顔面頭蓋の欠損の修復に貢献し、さらに美容整形外科手術に
おいても有用である。
本発明蛋白を歯周病の治療および他の歯の修復プロセスに用いてもよい。かか
る作用剤は、骨形成細胞を誘引する環境を提供し、骨形成細胞の増殖を刺激し、
あるいは骨形成細胞前駆体の分化を誘導しうる。本発明蛋白は、例えば、骨およ
び/または軟骨修復の刺激により、あるいは炎症または炎症プロセスにより媒介
される組織破壊のプロセス(コラゲナーゼ活性、破骨細胞活性等)をブロックす
ることにより、骨粗鬆症または骨関節炎の治療においても有用でありうる。
本発明蛋白によるものとしてもよい組織発生活性のもう1つのカテゴリーは鍵
/靭帯の形成である。鍵/靭帯様組織または他の組織が正常に形成されない環境
におけるかかる組織の形成を誘導する本発明蛋白は、ヒトおよび他の動物におけ
る鍵または靭帯の裂傷、変形および他の鍵または靭帯の欠損の治癒、に適用され
る。鍵/靭帯様組織誘導蛋白を用いるかかる調合物は、鍵または靭帯組織に対す
るダメージの予防ならびに鍵または靭帯の骨または他の組織への固定の改善に用
いてもよい。本発明組成物により誘導されるデノボ鍵/靭帯様組織形成は、先天
性の、外傷による、あるいは腫瘍学的切除により誘発される脳顔面頭蓋の欠損の
修復に貢献し、さらに鍵または靭帯の付着または修復のための美容整形外科手術
においても有用である。本発明組成物は、鍵−または靭帯−形成細胞を誘引する
ための環境を提供し、鍵−または靭帯−形成細胞の増殖を刺激し、鍵−または靭
帯−形成細胞の前駆体の分化を誘導し、あるいはインビボに戻した場合に組織修
復を行うようにエクスビボでの鍵/靭帯細胞または前駆体の増殖を誘導しうる。
本発明組成物は、鍵炎、手根骨トンネル症候群および他の鍵または靭帯の欠損に
も有用である。本発明組成物は、適当なマトリックスおよび/または当該分野で
よく知られた担体のごとき隔離剤を含んでいてもよい。
本発明蛋白は、神経細胞の増殖ならびに神経および脳組織の再生に、すなわち
、中枢および末梢神経系疾患およびニューロパシーならびに機械的疾患および外
傷性疾患(神経細胞または神経組織に対する変性、死もしくは外傷を包含)の治
療にも
有用でありうる。より詳細には、末梢神経傷害、末梢ニューロパシーおよび局在
化ニューロパシーのごとき末梢神経系の疾病、ならびにアルツハイマー病、パー
キンソン病、ハンチントン病、筋委縮性外側脊髄硬化症およびShy-Drager症候群
のごとき中枢神経系の疾病の治療に蛋白を使用してもよい。本発明により治療し
てもよいさらなる症状は、脊髄疾患のごとき機械的疾患および外傷性疾患、頭部
外傷ならびに卒中のごとき脳血管系の疾患を包含する。化学療法または他の医学
的療法により引き起こされる末梢ニューロパシーは、本発明蛋白を用いて治療可
能である。
また本発明蛋白は、圧迫性潰瘍、血管機能不全に関連した潰瘍、外科的および
外傷による創傷等(これらに限らない)を包含する非治癒性創傷のより好ましく
迅速な閉口の促進にも有用でありうる。
また本発明蛋白は、器官(例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮を包含
)、筋肉(平滑筋、骨格筋または心筋)、および血管(血管内皮を包含)組織の
ごとき他の組織の発生、あるいはかかる組織を構成している細胞の増殖促進のた
めの活性を示しうる。望ましい効果の一部は、線維症性瘢痕を抑制することによ
る正常組織の再生であってもよい。本発明蛋白は脈管形成活性も示しうる。
本発明蛋白は、腸の保護または再生、および肺または肝臓の線維症、種々の組
織の再灌流傷害、および全身的なサイトカインのダメージにより生じる症状の治
療にも有用でありうる。
本発明蛋白は、前駆体組織または細胞からの上記組織の分化促進または抑制;
あるいは上記組織の増殖抑制にも有用でありうる。
本発明蛋白の活性は、とりわけ、以下の方法により測定してもよい:
組織再生活性のアッセイは、国際公開WO95/16035(骨、軟骨、鍵)
;国際公開WO95/05846(神経、ニューロン);国際公開WO91/0
7491(皮膚、内皮)に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない
。
創傷治癒活性のアッセイは、Maibach,HI and Rovee,DT,eds.,Year Book M
edical Publishers,Inc.,Chicago(Eaglstein and Mertz,J.Invest.Dermat
ol 71:382-384(1978)により修飾されている)に記載されたものを包含するが、
これらに限らない。アクチビン/インヒビン活性
また、本発明蛋白はアクチビン−またはインヒビン−関連活性を示しうる。イ
ンヒビン類は、卵胞刺激ホルモン(FSH)の放出抑制能により特徴づけられ、
アクチビン類は、卵胞刺激ホルモン(FSH)の放出刺激能により特徴づけられ
る。よって、本発明蛋白は、単独であるいはインヒビンαファミリーのメンバー
とのヘテロダイマーの形態で、メスの哺乳動物の繁殖力を減少させ、オスの哺乳
動物の精子形成減少させるインヒビンの能力に基づく不妊薬として有用でありう
る。十分な量の他のインヒビンの投与により、これらの哺乳動物において不妊を
誘導することができる。別法として、本発明蛋白は、ホモダイマーとしてあるい
はインヒビン−βグループの他の蛋白のサブユニットとのヘテロダイマーとして
、下垂体前葉細胞からのFSH放出の刺激におけるアクチビン分子の能力に基づ
いて、繁殖力を誘導する治療薬として有用でありうる。例えば、米国特許第47
98885号参照。また本発明蛋白は、性的に未成熟な哺乳動物における繁殖の
向上に有用である可能性があり、その結果、ウシ、ヒツジおよびブタのごとき家
畜の生存期間中の繁殖力が増大する。
本発明蛋白の活性は、とりわけ、下記方法により測定してもよい:
アクチビン/インヒビン活性のアッセイは、Vale et al.,Endocrinology 91:
562-572,1972;Ling et al.,Nature 321:779-782,1986;Vale et al.,Nature 3
21:776-779,1986;Mason et al.,Nature318:659-663,1985;Forage et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 83:3091-3095,1986に記載のアッセイを包含するが、
これらに限らない。
化学走性/ケモキネシス活性
本発明蛋白は、哺乳動物細胞、例えば単球、好中球、T細胞、肥満細胞、好酸
球および/または内皮細胞の化学走性またはケモキネシス活性(例えば、ケモカ
インとして作用)を有する可能性がある。化学走性およびケモキネシス蛋白を用
いて所望細胞集団を所望作用部位に動員または誘引することができる。化学走性
またはケ
モキネシス蛋白は、組織に対する傷害および他の外傷の治療ならびに局所的な感
染の治療に特に有利である。例えば、リンパ球、単球または好中球の腫瘍または
感染部位への誘引は、腫瘍または感染因子に対する免疫応答を改善しうる。
特定の蛋白またはペプチドは特定の細胞集団に対して化学走性活性を有してお
り、刺激可能な場合には、直接的または間接的にかかる細胞集団の方向または運
動を指令する。好ましくは、蛋白またはペプチドは、細胞の方向づけられた運動
を直接的に刺激する能力を有する。特定の蛋白が細胞集団に対する化学走性活性
を有するかどうかを、かかる蛋白またはペプチドを細胞化学走性の既知アッセイ
に用いることにより容易に決定することができる。
本発明蛋白の活性は、とりわけ、下記方法により測定してもよい:
化学走性活性のアッセイ(化学走性を誘導または妨害する蛋白を同定するアッ
セイ)は、細胞の膜を越えた移動を誘導する蛋白の能力ならびに1の細胞集団の
他の細胞集団への付着を誘導する蛋白の能力を測定するアッセイを含む。移動お
よび付着に適したアッセイは、Current Protocols in Immunology,Ed by J.E.
Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach,W.Strober,Pub.G
reene Publishing Associates and Wiley-Interscience(Chapter 6.12,Measur
ement of alpha and beta Chemokines 6.12.1-6.12.28;Taub et al.J.Clin.I
nvest.95:1370-1376,1995;Lind et al.APMIS 103:140-146,1995;Muller et
al Eur.J.Immunol.25:1744-1748;Gruber et al.J.of Immunol.152:5860-5
867,1994;Johnston et al.J.of Immunol.153:1762-1768,1994に記載のアッ
セイを包含するが、これらに限らない。
止血および血栓溶解活性
また、本発明蛋白は、止血または血栓溶解活性を示す可能性がある。結果とし
て、かかる蛋白は、種々の凝血疾患(血友病のごとき遺伝性疾患を包含)の治療
に有用であり、あるいは外傷、手術または他の原因により生じた傷害の治療にお
ける凝血および他の止血を促進しうる。本発明蛋白は、血栓の溶解または血栓形
成阻害なら
びにそれらにより生じる症状(例えば、心筋梗塞および中枢神経系血管の梗塞(
例えば、卒中)のごとき)の治療および予防に有用でありうる。
本発明蛋白の活性を、とりわけ、下記方法により測定してもよい:
止血および血栓溶解活性のアッセイは、Linet et al.,J.Clin.Pharmacol.
26:131-140,1986;Burdick et al.,Thrombosis Res.45:413-419,1987;Humphre
y et al.,Fibrinolysis 5:71-79(1991);Schaub,Prostaglandins 35:467-474,
1988に記載のアッセイを包含するが、これらに限らない。
受容体/リガンド活性
また、本発明蛋白は、受容体、受容体リガンドまたは受容体/リガンド相互作
用の阻害剤もしくはアゴニストとしての活性を示しうる。かかる受容体およびリ
ガンドの例は、サイトカイン受容体およびそれらのリガンド、受容体キナーゼお
よびそれらのリガンド、受容体ホスファターゼおよびそれらのリガンド、細胞−
細胞相互作用に関与する受容体およびそれらのリガンド(細胞付着分子(セレク
チン、インテグリンおよびそれらのリガンドのごとき)ならびに抗原提示、抗原
認識、細胞性および体液性免疫応答の発生に関与する受容体/リガンド対などを
包含)を包含するがこれらに限らない。受容体およびリガンドは、関連する受容
体/リガンド相互作用に対する潜在的なペプチドまたは小型分子阻害剤のスクリ
ーニングにも有用である。本発明蛋白(受容体およびリガンドのフラグメントを
包含するが、これらに限らない)は、それ自体、受容体/リガンド相互作用の阻
害剤として有用でありうる。
本発明蛋白の活性を、とりわけ、下記方法により測定してもよい:
受容体−リガンド活性の適当なアッセイは、Current Protocols in Immunolog
y,Ed by J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach
,W.Strober,Pub.Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(C
hapter 7.28,Measurement of Cellular Adhesion under static conditions 7.
28.1-7.28.22),Takai et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
84:6864-6868,1987;Bierer et al.,J.Exp.Med.168:1145-1156,1988;Rosen
stein et al.,J.Exp.Med.169:149-160 1989;Stoltenborg et al.,J.Immun
ol.Methods 175:59-68,1994;Stitt et al.,Cell 80:661-670,1995に記載の
アッセイを包含するが、これらに限らない。
抗炎症活性
本発明蛋白は抗炎症活性を示しうる。抗炎症活性は、刺激応答に関与している
細胞に刺激を与えることにより、細胞−細胞相互作用(例えば、付着のごとき)
を阻害または促進することにより、炎症プロセスに関与している細胞の化学走性
を阻害または促進することにより、細胞溢出を阻害または促進することにより、
あるいは炎症応答をより直接的に阻害または促進する他の因子の産生を刺激また
は抑制することにより発揮される。かかる活性を示す蛋白を用いて炎症の症状(
慢性もしくは急性症状を包含、感染に関連した炎症(敗血性ショック、敗血症も
しくは全身性炎症応答症候群(SIRS)のごとき)、虚血−再潅流傷害、エン
ドトキシンによる致命的傷害、関節炎、補体により媒介される超急性拒否反応、
腎炎、サイトカインもしくはケモカインにより誘導される肺の傷害、炎症性腸疾
患、クローン病またはTNFもしくはIL−1のごときサイトカインの過剰産生
から生じる疾病を包含するがこれらに限らない)を治療することができる。本発
明蛋白は、アナフィラキシーおよび抗原性物質もしくは材料に対する過敏症の治
療にも有用でありうる。
腫瘍阻害活性
腫瘍の免疫学的治療または予防に関する上記活性のほかに、本発明蛋白は他の
抗腫瘍活性を示しうる。ある蛋白は腫瘍増殖を直接的または間接的に(例えば、
ADCCを介して)阻害しうる。ある蛋白は、腫瘍組織または腫瘍前駆体組織に
作用して、腫瘍増殖を支持するに必要な組織の形成を阻害し(例えば、脈管形成
を阻害することにより)、腫瘍増殖を阻害する他の因子、作用剤または細胞タイ
プの産生を引き起こすことにより、あるいは腫瘍増殖を促進する因子、作用剤ま
たは細胞タイプを除去または阻害することにより腫瘍阻害活性を示しうる。他の活性
本発明蛋白は、下記のさらなる活性または効果の1つまたはそれ以上を示しう
る:細菌、ウイルス、真菌および他の寄生虫(これらに限らず)を包含する感染
性因子の殺傷;身長、体重、体毛の色、目の色、皮膚または他の組織の色素沈着
、または器官または身体部分のサイズまたは形態(例えば、豊胸またはその逆)
を包含する身体特性への影響(抑制または促進);摂食した脂肪、蛋白または炭
水化物の消化への影響;食欲、性欲、ストレス、認識(認識の疾患を包含)、鬱
(鬱病性疾患を包含)および暴力的行為(これらに限らず)を包含する行動特性
への影響;鎮痛効果または他の痛み軽減効果の提供;造血系以外の系統における
胚の幹細胞の分化および増殖の促進;ホルモンまたは内分泌活性;酵素の場合、
酵素欠乏の修正および関連疾患の治療;過剰増殖性疾患(例えば、乾癬のごとき
)の治療;免疫グロブリン様活性(例えば、抗体または補体に結合する能力);
ならびにワクチン組成物において抗原として作用してかかる蛋白またはかかる蛋
白と交差反応する他の物質もしくは存在に対する免疫応答を生じさせる能力。
下記実施例は、ヒトSDF−5蛋白の回収および特徴づけ、他のSDF−5蛋
白を回収するためのDNAの使用、ヒト蛋白の取得ならびに組み換え法による蛋
白発現を説明する。実施例1:ネズミSDF−5に対するヒト相同体のクローニング
ネズミSDF−5のヌクレオチド配列(Honjo教授から個人的に得た)を用い
てGenBankを調査した。DNA配列がcDNAの5’または3’末端のいずれか
において同定されている数個のESTはネズミSDF−5に対して高度の同一性
を示した。いくつかのESTはヒト起源のものであった。種々のヒトESTを全
長のネズミSDF−5ヌクレオチド配列と並置比較したところ、EST配列が由
来したクローンのうちSDF−5の全コーディング配列を含むものはなかった。
ネズミSDF−5ヌクレオチドの5’において最も類似していたのは
H14917であった。このESTは、胸部組織由来のヒトcDNAのDNA配
列の5’末端であった。ネズミSDF−5との並置比較によれば、EST H1
4917により示されるヒト胸部cDNAは5’末端における約147ヌクレオ
チドのコーディング配列を欠くものであった。
ネズミSDF−5の全長誘導体の単離を試みるために、H14917配列のヌ
クレオチド18から44までの逆相補物であるビオチン化オリゴヌクレオチドプ
ローブ(5-ビオチン-ATCGATGCCGTGGCACAGCTGC AGGTTG-3')を合成した。以下に
述べる組織に由来する5個の別個のヒト全長cDNAライブラリーを用いる溶液
豊富化プロトコールに、このプローブを使用した。該組織とは、成人肺、成人心
臓、成人腎臓、胎児脳、および乳腺である。豊富化後、豊富化した各ライブラリ
ーからの約60000個のコロニーをそれぞれ10枚のプレートに撒き、ついで
、同じオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドキナーゼおよび[g−35P]ATP
を用いて標識した後プローブとして使用する、標準的ハイブリダイゼーション法
に供した。技術的問題のため、乳腺ライブラリーに関してはわずか4枚のプレー
ト(24000個のコロニー)にしか撒かなかった。乳腺ライブラリーだけが、
プローブにハイブリダイゼーションするcDNAクローンを含んでいるようであ
った。20個の陽性コロニーを拾い、増殖させ、再度プレートに撒いた。ついで
、これらの再プレーティングされた陽性クローンを再度同じプローブにハイブリ
ダイゼーションさせて、それらを確認し、それらの純度を確かめた。最初の12
個の陽性コロニーをすべてDNAc配列決定に供した。正しい方向の1のクロー
ン(単離体#4)が選択され、それはヒトSDF−5の全コーディング配列を含
んでおり、その配列は他の単離体との比較により確認された。
実施例2W−20バイオアッセイ A.W−20細胞の説明
インジケーター細胞系としてのW−20骨髄基質細胞の使用は、BMP蛋白で
の処理後のこれらの細胞の骨芽細胞への変換に基づく[Thies et al.,Journal
of Bone and Minaral Research,5:305(1990);およびThieset et al.,Endocrino
logy,130:1318(1992)]。詳細には、W−20細胞は、マサチューセッツ州ボス
トンのチルドレンズ・ホスピタル(Children's Hospital)のD.Nathan博士の研
究室の研究者により成体マウスから取られたクローン化された骨髄基質細胞系で
ある。ある種のBMP蛋白でのW−20細胞の処理は、(1)アルカリ性ホスフ
ァターゼ産生増加、(2)PTHにより刺激されるcAMPの誘導、および(3)
細胞によるオステオカルシン(osteocalcin)合成の誘導を引き起こす。(1)
および(2)は骨芽細胞の表現形に関連した特徴を示すが、オステオカルシン合
成能は成熟骨芽細胞によってのみ示される特性である。さらにそのうえ、現在ま
で、我々は、BMPで処理した場合のみ起こるW−20基質細胞の骨芽細胞様へ
の変換を観察してきた。この様式において、BMP処理されたW−20細胞によ
り示されるインビトロ活性は、BMPについて知られているインビボでの骨形成
活性と相関がある。
新規骨誘導分子のBMP活性を比較することにおいて有用な2種のインビトロ
での分析を以下に説明する。
B.W−20アルカリ性ホスファターゼ分析のプロトコール
W−20細胞を、96ウェルの組織培養プレートにウェルあたり200μlの
培地(10%熱不活性化ウシ胎児血清、2mMグルタミンおよび100ユニット
/mlペニシリン+100μg/mlストレプトマイシンを含有するDME)中
10000個の割合で撒く。95%空気、5%CO2のインキュベーター中37
℃において細胞を一晩付着させる。マルチチャンネルピペッターで各ウェルから
200μlの培地を除去し、10%熱不活性化ウシ胎児血清、2mMグルタミン
および1%ペニシリン−シトレプトマイシンを含有するDME中の同体積の試験
試料で置換した。試験物質を3系で分析する。試験試料および標準をW−20イ
ンジケーター細胞とともに24時間インキュベーションする。24時間後、37
℃のインキュベーターからプレートを取り出し、試験培地細胞をから除去する。
W−20細胞層をウェルあたり200μlのカルシウム/マグネシウム不含リン
酸緩衝化セイラインで3回洗浄し、これらの洗液を捨てる。ガラス製装置で蒸留
された50μlの水を各ウェルに添加し、次いで、分析プレートを急速に冷凍す
るため
にドライアイス/エタノール浴に置く。凍結したら、分析プレートをドライアイ
ス/エタノール浴から取り出し、37℃で融解させる。この工程を2回以上繰り
返して全部で3回の凍結融解工程を行う。工程終了後、膜結合アルカリ性ホスフ
ァターゼを測定に供する。50μlの分析混合物(50mMグリシン、0.05
%トリトンX−100、4mM MgCl2、5mMリン酸p−ニトロフェノール
、pH=10.3)を各分析ウェルに添加し、次いで、分析プレートを、1分間
に60回振盪しながら37℃で30分インキュベーションする。30分間のイン
キュベーションの終わりに、100μlの0.2N NaOHを各ウェルに添加
し、分析プレートを氷上に置くことにより反応を停止する。各ウェルの分光学的
吸光度を405ナノメーターの波長において読む。次いで、これらの値を既知標
準と比較して各試料のアルカリ性ホスファターゼ活性の評価を行う。例えば、既
知量のリン酸p−ニトロフェノールを用いると、吸光度値が得られる。これを表
Iに示す。
表I
リン酸p−ニトロフェノールの既知標準に関する吸光度値
リン酸p−ニトロフェノール(μモル) 平均吸光度(405nm)
0.000 0
0.006 0.261±0.024
0.012 0.521±0.031
0.018 0.797±0.063
0.024 1.074±0.061
0.030 1.305±0.083
既知量のBMPに関する吸光度値を決定し、表IIに示すような単位時間あたり
開裂されたリン酸p−ニトロフェノールのμモル数に変換することができる。
表II
BMP−2で処理されているW−20細胞に関する
アルカリ性ホスファターゼ値
BMP−2濃度 吸光度の読み 1時間あたりの開裂基質 (ng/ml) 405ナノメーター μモル
0 0.645 0.024
1.56 0.696 0.026
3.12 0.765 0.029
6.25 0.923 0.036
12.50 1.121 0.044
25.0 1.457 0.058
50.0 1.622 0.067
100.0 1.977 0.080
次いで、これらの値を用いて既知量のSDF−5の活性をBMP−2活性と比
較する。
C.オステオカルシンRIAプロトコール
W−20細胞を、24ウェルのマルチウェル組織培養ディッシュの各ウェルに
、2mlのDME(10%熱不活性化ウシ胎児血清、2mMグルタミンを含有)
中106個となるように撒く。95%空気、5%CO2中37℃において細胞を一
晩付着させる。翌日、培地を、2mlの全体積中10%ウシ胎児血清、2mMグ
ルタミンおよび試験物質を含有するDMEに交換する。各試験物質を3系のウェ
ルに入れる。試験物質をW−20細胞とともに合計96時間(48時間目に同じ
培地で培地交換)インキュベーションする。96時間のインキュベーションの終
わりに、各ウェルから50μlの試験培地を取り、マウスオステオカルシンにつ
いてのラジオイムノ分析を用いてオステオカルシン産生について分析を行う。分
析の詳細は、マサチューセッツ州02072、スタウトン、ペイジ・ストリート
378のバイオメディカル・テクノロジーズ・インコーポレイテッド(Biomedic
al Techologies Inc.)により製造されたキットに説明がある。分析のための試
薬は、製品番号BT−431(マウスオステオカルシン標準)、BT−432(
ヤギ抗−
マウス・オステオカルシン)、BT−431R(ヨウ素化されたマウス・オステ
オカルシン)、BT−415(正常ヤギ・血清)およびBT−414(ロバ抗−
ヤギIgG)として見いだされる。BMP処理に応答したW−20細胞により合
成されたオステオカルシンについてのRIAを、製造者により提供されるプロト
コールに記載されたようにして行う。
試験試料に関して得られた値をマウスオステオカルシンの既知標準に関する値
と比較し、既知量のBMP−2での処理に応答してW−20細胞により産生され
たオステオカルシン量と比較する。BMP−2により誘導されたW−20による
オステオカルシン合成量を表IIIに示す。
表III
W−20細胞によるオステオカルシン合成
BMP−2濃度(ng/ml) オステオカルシン合成(ng/ウェル)
0 0.8
2 0.9
4 0.8
8 2.2
16 2.7
31 3.2
62 5.1
125 6.5
250 8.2
500 9.4
1000 10.0
実施例3ローゼン−改変サムパス−レディアッセイ
Sampath and Reddi,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:6591-6595(1983)に記載され
たラット骨形成アッセイの改変バージョンを用いて骨および/または軟骨および
/または他の結合組織におけるBMP蛋白の活性を評価する。サムパス−レディ
法のエタノール沈殿工程を、アッセイすべきフラクションを水に対して透析(組
成物が溶液の場合)または限界濾過(組成物が懸濁液の場合)することに置き換
える。次いで、溶液または懸濁液を0.1%TFAに対して平衡化させる。得ら
れた溶液を20mgのラットマトリックスに添加する。蛋白処理していない疑似
ラットマトリックス試料は対照として役立つ。この材料を凍結し、凍結乾燥して
得られた粉末を5番のゼラチンカプセルに封入する。21〜49日齢のロング・
エバンズ・ラット(Long Evans rat)の腹胸部の皮下にカプセルを移植する。イン
プラントを7〜14日後に取る。各インプラントの半分をアルカリ性ホスファタ
ーゼアッセイ[Proc.Natl.Acad.Sci.,69:1601(1972)]に用いる。
各インプラントのもう半分を固定し、組織学的分析用に処理する。1ミクロン
のグリコメタクリレート切片をフォン・コッサおよび酸フクシンで染色して各イ
ンプラントにおいて誘導された骨および軟骨の形成の評点をつける。+1ないし
+5は、新たな骨および/または軟骨細胞ならびにマトリックスにより占められ
たインプラントの各組織学的切片の面積を表す。+5の評点は、インプラントの
50%よりも多くの部分が、インプラントにおける蛋白の直接の結果として生成
された新たな骨および/または軟骨であることを示す。評点+4、+3、+2お
よび+1は、それぞれ、インプラントの40%、30%、20%および10%よ
りも多くの部分が新たな軟骨および/または骨を含んでいることを示す。
別法として、同じ方向に集密になった線維芽細胞の高密度の束の存在により容
易に認識される胚性の鍵に似た組織の出現についてインプラントを検査する[腱
/靭帯様組織は、例えば、Ham and Cormack,Histology(JB Lippincott Co.),197
9,pp.367-369に記載されており、その開示を参照により本明細書に記載されてい
るものとみなす]。SDF−5蛋白含有インプラントにおいて腱/靭帯様組織を
観察する、さらなるアッセイにおいてこれらの知見は再現されうる。本発明SD
F−5蛋白をこの活性に関して評価してもよい。
実施例4SDF−5の発現
ネズミ、ヒトまたは他の哺乳動物のSDF−5蛋白を製造するために、該蛋白
をコードしているDNAを適当な発現ベクター中に移し、慣用的な遺伝子工学的
方法により哺乳動物細胞または他の好ましい真核細胞宿主もしくは原核細胞宿主
中に導入する。生物学的に活性のある組み換えヒトSDF−5の好ましい発現系
は、安定に形質転換された哺乳動物細胞であると考えられる。
当業者は、配列番号:1の配列またはSDF−5蛋白をコードしている他のD
NA配列、あるいは他の修飾された配列およびpCD[Okayama et al.,Mol.Ce
ll Biol.,2:161〜170(1982)]、pJL3、pJL4[Gough et al.,EMBO J.,
4:645〜653(1985)]ならびにpMT2 CXMのごとき知られたベクターを用い
ることにより、哺乳動物発現ベクターを構築することができる。
哺乳動物発現ベクターpMT2 CXMは、p91023(b)(Wong et al.,S
cience,228:810〜815,1985)の誘導体であるが、テトラサイクリン耐性遺伝子
の代わりにアンピシリン耐性遺伝子を有し、さらにcDNAクローン挿入のため
のXhoI部位を有することにおいてp91023(b)とは異なる。
pMT2CXMの機能的エレメントは記載されており(Kaufman,R.J.et al.,19
85,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:689〜693)、アデノウイルスVA遺伝子、72
bpのエンハンサーを含むSV40複製開始点、5’スプライス部位ならびにア
デノウイルス後期mRNA上に存在するアデノウイルス三分節リーダー配列の大
部分を含むアデノウイルス大後期プロモーター、3’スプライス受容部位、DH
FR挿入断片、SV40初期ポリアデニル化部位(SV40、ならびにイー・コ
リ中での増殖に必要なpBR322配列を含んでいる。
pMT2−VWFのEcoRI消化によりプラスミドpMT2 CXMを得る
。pMT2−VWFは、受託番号ATCC67122の下で、American Type Cu
lture Collection(ATCC),Rockville,MD(USA)に寄託されている。EcoRI消化
により、pMT2−VWF中に存在するcDNA挿入断片を切り出し、ライゲー
ションして、イー・コリHB101またはDH−5をアンピシリン耐性へと形質
転換するのに用いる直鎖状のpMT2を得る。プラスミドpMT2 NAを慣用
的方法により調製することができる。次いで、ループアウト/イン変異誘発(loo
pout/in mutagenesis)[Morinaga et al.,Bio-technology,84:636(1984)]を用
いてpMT2 CXMを構築する。これにより、pMT2のSV40・複製開始
点ならびにエンハンサー配列近傍のHindIII部位に対応する塩基1075〜
1145が除去される。さらに、そのヌクレオチド1145の位置に以下の配列
:
を挿入する。この配列は制限エンドヌクレアーゼXhoIの認識部位を有する。
pMT23と命名されたpMT2 CXMの誘導体は、制限エンドヌクレアーゼ
PstI、EcoRI、SalIおよびXhoIの認識部位を有する。プラスミ
ドpMT2 CXMおよびpMT23 DNAを慣用的方法により調製することが
できる。
pMT21由来のpEMC2β1も本発明の実施に適する。pMT21は、p
MT2−VWF由来のpMT2に由来する。上記のごとく、EcoRI消化によ
り、pMT−VWF中に存在するcDNA挿入断片を切り出し、ライゲーション
して、イー・コリHB101またはDH−5をアンピシリン耐性へと形質転換す
るのに用いる直鎖状のpMT2を得る。プラスミドpMT2 DNAを慣用的方
法により調製することができる。
pMT21は、以下の2つの修飾を経てpMT2から誘導される。最初に、c
DNAクローニングのためのG/Cテイリングから伸長した19個のG残基を含
む、DHFRcDNAの76bpの5’非翻訳領域を欠失させる。この工程にお
いて、XhoI部位を挿入してDHFRのすぐ上流に以下の配列:
を得る。
次いで、EcoRVおよびXbaIでの消化、DNAポリメラーゼIのクレノ
ウフラグメントでの処理、そしてClaIリンカー(CATCGATG)への連
結により、単一のClaI部位を導入する。これにより、250bpの断片がア
デノウイルス関連RNA(VAI)領域から欠失されるが、VAI RNA遺伝
子の発現または機能は阻害されない。pMT21をEcoRIおよびXhoIで
消化し、ベクターpEMC2B1を得るために用いる。
EcoRIおよびPstIでの消化により、EMCVリーダーの一部がpMT
2−ECATI[S.K.Jung et al.,J.Virol,63:1651〜1660(1989)]から得られ
、これは2752bpのフラグメントである。このフラグメントをTaqIで消
化し、508bpのEcoRI−TaqIフラグメントを得、これを低融点アガ
ロースゲル上の電気泳動により精製する。以下の配列:
を有する68bpのアダプターおよびその相補鎖を合成する。これは5’Taq
I突出末端および3’XhoI突出末を有する。
この配列は、ヌクレオチド763ないし827由来のEMCウイルスリーダー
配列に合致する。さらにこの配列は、EMCウイルスリーダー内の位置10にお
けるATGがATTに変化しており、XhoI部位が後に続いている。
pMT21のEcoRI−XhoIフラグメント、EMCウイルスのEcoRI
−TaqIフラグメント、および68bpのオリゴヌクレオチドアダプターをス
リーウェイライゲーションしてベクターpEMC2β1を得る。
このベクターは、哺乳動物細胞における高レベルの所望cDNAの発現の指令
のために適当に関連づけられたSV40複製開始点ならびにエンハンサー、アデ
ノウイルス大後期プロモーター、アデノウイルス三分節リーダー配列の大部分の
cDNAコピー、小型のハイブリッド介在配列、SV40ポリアデニル化シグナ
ルおよび
アデノウイルスVA I遺伝子、DHFRおよびβ−ラクタマーゼマーカーおよ
びEMC配列を含む。
ベクターの構築はSDF−5関連DNA配列の修飾を包含する。例えば、コー
ディング領域の5’および3’末端上の非コーディングヌクレオチドを除去する
ことにより、SDF−5のcDNAを修飾してもよい。欠失された非コーディン
グヌクレオチドを、発現に有益であることが知られている他の配列で置換しても
よく、置換しなくてもよい。これらのベクターを、SDF−5蛋白の発現にとり
適当な宿主細胞中に形質転換する。別法として、SDF−5プロペプチド配列を
欠失させ、他のBMP蛋白の完全なプロペプチドをコードしている配列に置き換
えることにより成熟SDF−5蛋白を発現するように、配列番号:1の配列また
はSDF−5蛋白をコードしている他の配列を加工してもよい。
当業者は、コーディング配列に隣接している哺乳動物の調節配列を除去するか
または細菌の配列に置き換えて、細菌細胞による細胞内または細胞外発現用の細
菌ベクターを作成することにより、配列番号:1の配列を加工することができる
。例えば、コーディング配列をさらに加工することができる(例えば、他の既知
リンカーに連結する、あるいはその非コーディング配列を欠失させるかまたは他
の既知方法によりそのヌクレオチドを変化させる)。次いで、T.Taniguchi et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5230〜5233(1980)に記載されたような方法を用
いて修飾されたSDF−5関連コーディング配列を既知細菌ベクター中に挿入す
ることができる。次いで、この典型的な細菌ベクターを細菌宿主細胞中に形質転
換し、それによりSDF−5蛋白を発現させる。細菌細胞においてSDF−5蛋
白を細胞外発現させるための方法については、欧州特許公開EPA177343
参照。
昆虫細胞における発現のために、昆虫ベクターの構築を行うために同様の操作
を行うことができる[例えば、公開された欧州特許出願第155,476号記載
の方法参照]。酵母細胞による本発明因子の細胞内または細胞外発現のための酵
母の調節配列を用いて、酵母ベクターを構築することもできる[例えば、公開さ
れたPCT出願WO86/00639および欧州特許出願公開EPA12328
9号記載の方法参照]。
高レベルの本発明SDF−5蛋白を哺乳動物細胞において製造する方法は、異
型SDF−5遺伝子の多数のコピーを有する細胞の構築を包含する。異型遺伝子
を増幅可能なマーカー、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子
に連結し、Kaufman and Sharp,J.Mol.Biol.,159:601〜629(1982)の方法により、
メトトレキセート(MXT)濃度を上昇させていって増加した遺伝子コピーを有
する細胞を該マーカー関して選択できる。このアプローチを種々の異なる細胞タ
イプに使用することができる。
例えば、リン酸カルシウム共沈ならびにトランスフェクション、エレクトロポ
ーレーションまたはプロトプラスト融合をはじめとする種々の方法により、SD
F−5蛋白の発現を可能にする他のプラスミドの配列と作動的に連結された本発
明SDF−5蛋白に対するDNA配列を含むプラスミドと、DHFR発現プラス
ミドpAdA26SV(A)3[Kaufman and Sharp,Mol.Cell.Biol.,2:1304(
1982)]とを、DHFR欠損細胞DUKX−BII中に同時に導入することができ
る。DHFRを発現する形質転換体を、透析されたウシ胎児血清を含むアルファ
培地における増殖に関して選択し、次いで、Kaufman et al.,Mol.Cell.Biol.
,5:1750(1983)記載のごとく、MTX濃度を増加させていった場合の増殖による
増幅について選択を行う。形質転換体を増殖させ、生物学的に活性のあるSDF
−5の発現を、上記実施例3記載のローゼンにより改変されたサムパス−レディ
のラット・骨形成分析によりモニターする。SDF−5蛋白の発現はMTX耐性
レベルの増加に伴って増加するはずである。[35S]メチオニンまたはシステ
インでのパルスラベリングおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動のごとき当該
分野で知られた標準的方法を用いて、SDF−5ポリペプチドを特徴づける。同
様の方法により他の関連SDF−5蛋白を製造することができる。
実施例5発現されたSDF−5の生物学的活性
上記実施例4において得られた、発現されたSDF−5蛋白の生物学的活性を
測定するために、蛋白を細胞培養物から回収し、同時に産生された他の蛋白性物
質な
らびに他の混入物質からSDF−5蛋白を単離することにより精製する。実施例
3記載のラット・骨形成分析により、精製蛋白を分析してもよい。
当業者に知られた標準的方法を用いて精製を行う。
銀染色[Oakley et al.,Anal.Biochem.,105:361(1980)]で染色されるSD
S−PAGEアクリルアミド[Laemmli,Nature,227:680(1970)]およびイムノ
ブロット[Towbin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:4350(1979)]のご
とき標準的方法を用いて蛋白の分析を行う。
実施例6
ノーザン分析を用いて、SDF−5を種々の細胞系に対する影響について試験
することができる。適当な細胞系は、E13マウス・肢芽由来の細胞系を包含す
る。SDF−5での処理から10日後、組織分化の状態について表現型を組織学
的に調べる。さらに、SDF−5で処理した細胞由来のmRNAのノーザン分析
を、表IVに記載する骨、軟骨および/または腱/靭帯に関する下記マーカーの
1つまたはそれ以上を包含する種々のマーカーについて行うこともできる。
表IV
マーカー 骨 軟骨 腱/靭帯
オステオカルシン + − −
アルカリ性ホスファターゼ + − −
プロテオグリカンコア蛋白 +/−1 + +2
I型コラーゲン + + +
II型コラーゲン +/−1 + +2
デコリン + + +
エラスチン +/−3 ? +
1−初期にマーカーが観察され、成熟骨組織が形成されるにつれマーカーが見
られなくなる。
2−マーカーは腱の部位に依存し、骨界面において最強。
3−低レベルのマーカーが見られる。
実施例7 発現の分析
インシトゥ(in situ)ハイブリダイゼーションを用いてSDF−5 mRNA
をマウス胚のセクション10.5−15.5dpcに局在化させた。発生中の体肢
骨格の関節およびいくつかの腱および靭帯においてSDF−5が発現された。体
軸骨格または体肢骨格の骨あるいは筋肉においては発現は検出されなかった。こ
れらの明白な観察結果は、結合組織形成におけるSDF−5の関与を強く示すも
のであった。これらの結果から、軟骨形成がSDF−5により調節されている可
能性が最も高く、この情報は、インビトロアッセイを用いたこの蛋白の評価の基
礎となった。インビトロ活性
ネズミのSDF−5をCHO細胞において発現させた。MLB13YMC−ク
ローン14細胞を増殖させて集密とし、SDF−5、BMP−2、SDF−5お
よびBMP−5の混合物のいずれかで処理するか、あるいは処理を行わなかった
。SDF−5含有CHOならし培地を1:20希釈して使用し(最終濃度10n
g/ml未満)、CHO細胞により得られた模擬ならし培地をBMP−2および
無処理細胞培養に添加した。BMP−2を100ng/mlの濃度として使用し
た。4日後、RNAを集め、GeneChip 50スキャナー(Affymetrix)により遺伝
子発現を分析した。無処理またはSDF−5処理細胞においては、骨または軟骨
の表現型の特徴を有する遺伝子の発現は検出できなかった。BMP−2は、低軟
骨質マーカーとともに厚肥性の軟骨および骨のマーカー遺伝子発現を誘導した。
BMP−2のみで処理した細胞と比較すると、SDF−5およびBMP−2の両
方の混合物で処理した細胞において、骨(オステオカルシン;アルカリ性ホスファ
ターゼ;PTH/PTHrP受容体)および厚肥性軟骨マーカー(タイプXコラー
ゲン)が有意に減少し、あるいは存在せず、さらに、軟骨に関するマーカー(コ
ラーゲンタイプIIおよびIX;デコリン;アグレカン)が増加していた。
SDF−5との混合物を用いた場合には軟骨表現型が大きく促進されるように思
われることを除き、この効果はPTHrPおよびBMP−2の混合物に関してす
でに観察されている結果と同様である。
実施例8 胚性幹細胞アッセイ
本発明SDF−5蛋白の効果をアッセイするために、多くの利用可能な胚性幹
細胞系に対するインビトロでの成長および分化効果をアッセイすることができる
。1のかかる細胞系はES−E14TG2であり、メリーランド州RockvilleのA
merican Type Culture Collectionから入手できる。
アッセイを行うために、100ユニットのLIF存在下で細胞を増殖させて、
それらを未分化状態に保つことができる。まず、LIFを除去し、懸濁液中で細
胞をいわゆる胚様体として凝集させることによりアッセイをセットアップする。
3日後、胚様体をゼラチン被覆プレート(PCR分析用12ウェルプレート、免
疫細胞化学用24ウェルプレート)上に置き、アッセイすべき蛋白で処理する。
細胞に栄養分を供給し、2〜3日ごとに蛋白因子で処理する。15%ウシ胎児血
清(FBS)補足培地またはより少量のFBSを含むCDM限定培地においてア
ッセイを行えるように、細胞を適合させてもよい。
処置期間(7〜21日の範囲)の終わりに、細胞からRNAを集め、以下のマ
ーカーに従って定量的マルチプレックスPCRにより分析する。該マーカーは、
Brachyury(中胚葉マーカー)、AP−2(外胚葉マーカー)、およびNHF−
3α(内胚葉マーカー)である。免疫細胞化学により、ニューロン細胞(グリア
およびニューロン)、筋肉細胞(心筋細胞、骨格筋および平滑筋)の分化、なら
びにプロテオグリカンコア蛋白(軟骨)およびサイトケラチン(真皮)のごとき他の
種々の表現型マーカーを検出することも可能である。LIFが除去された場合に
これらの細胞は自律的に分化する傾向があるので、つねに未処理対照との比較に
より結果を定量する。
以上の記載は、本発明の目下好ましい具体例を詳述するものである。その実施
において、当業者がこれらの記載を考慮して多くの改変ならびに変法を行うこと
が想
定される。それらの改変ならびに変法は、添付した請求の範囲に包含されると確
信する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61P 43/00 111 C07K 16/24
C07K 14/52 C12N 1/15
16/24 1/19
C12N 1/15 1/21
1/19 C12P 21/02 C
1/21 C12N 15/00 ZNAA
5/10 5/00 A
C12P 21/02 A61K 37/02
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(GH,KE,LS,MW,S
D,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG
,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL,AM,AT
,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,
CH,CN,CU,CZ,DE,DK,EE,ES,F
I,GB,GE,GH,HU,IL,IS,JP,KE
,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,
LT,LU,LV,MD,MG,MK,MN,MW,M
X,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE
,SG,SI,SK,SL,TJ,TM,TR,TT,
UA,UG,UZ,VN,YU,ZW