DE69726884T2 - Menschliches sdf-5 protein und diesbezügliche zusammensetzungen - Google Patents

Menschliches sdf-5 protein und diesbezügliche zusammensetzungen Download PDF

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Description

  • Verwandte Anmeldungen
  • Die vorliegende Erfindung ist eine „Continuation-in-part" der Anmeldung mit der Seriennummer 08/848439, eingereicht am 8. Mai 1997, welche eine „Continuation-in-part" der Anmeldung mit der Seriennummer 08/796153, eingereicht am 6. Februar 1997 ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Mitglieder der Frazzled-Proteinfamilie, DNA, welche für sie kodiert und Verfahren, um sie zu erhalten. Diese Proteine können verwendet werden, um Expression von Faktoren in, und/oder Differentiation von Gewebe und Organen herbeizuführen, und insbesondere um Bildung, Wachstum, Differentiation, Proliferation und/oder Erhaltung von Chondrozyten und/oder Knorpelgewebe herbeizuführen. Somit können diese Proteine bei der Behandlung von Knorpelstörungen wie Osteoarthritis, Rheumatoidarthritis und artikularen Knorpeldefekten und bei der Verstärkung und/oder Hemmung von zellulärer Bildung, Wachstum, Differentiation, Proliferation und/oder Erhaltung von anderem Gewebe und Organen, zum Beispiel Bauchspeicheldrüse, Leber, Milz, Lunge, Niere und/oder anderem Gewebe brauchbar sein. Diese Proteine können auch zum Vergrößern der Aktivität von anderen Gewebe-regenerierenden und differenzierenden Faktoren verwendet werden. Das Protein wurde durch die Erfinder humanes SDF-5 genannt.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Suche nach dem Molekül oder den Molekülen, welche für die Bildung, Proliferation, Differentiation und Erhaltung von Gewebe und Organen, wie Knorpel und Bindegeweben verantwortlich sind, hat sich weit erstreckt, da es einen enormen Bedarf an Faktoren gibt, welche zum Behandeln von Zuständen brauchbar sind, welche Abbau oder Schädigung dieser Gewebe einbeziehen, wie Osteoarthritis.
  • Die Strukturen von mehreren Proteinen in der als Frizzled bezeichneten Familie sind vorhergehend erforscht worden. Die vorliegende Erfindung betrifft eine als Frazzled bezeichnete Proteinfamilie, welche Familie Homologie an die Ligand-Bindungsdomäne der Frizzled-Proteine teilt. von Mitgliedern der Frizzled-Proteinfamilie ist gezeigt worden, dass sie an das Wingless (Wg) Protein in Drosophila binden, Bhanot et al., Nature, 382: 225–230 (1996). In Säugern und anderen Arten sind die Frizzled- Proteinfamilie Membran-gebundene Rezeptormoleküle, von welchen gezeigt wurde, dass sie an Proteine binden, welche durch die Familie der Wnt-Gene erzeugt wurden, Wang et al., J. Biol. Chem., 271: 4468–4476 (1996). Von Wnt-Genen wurde bestimmt, dass sie in Gewebe und Organen, einschließlich Bauchspeicheldrüse, Lunge, Leber, Nieren und Gehirn exprimiert werden.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfinder hierein haben überraschend entdeckt, dass Mitglieder der Frazzled-Proteinfamilie in der Lage sind, die Bildung von Chondrozyten und/oder Knorpelgewebe herbeizuführen. Die vorliegende Erfindung ist brauchbar zum Herbeiführen der Bildung von Chondrozyten und/oder Knorpelgewebe durch Verabreichen einer Zusammensetzung, welche mindestens ein Protein umfasst, welches ein Mitglied der Frazzled-Proteinfamilie ist, an Progenitorzellen. In bevorzugten Ausführungsformen kann die Zusammensetzung ein Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQUENZ ID Nr. 2 von Aminosäure 1, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 bis 295 umfassen; in einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQUENZ ID Nr. 2 von Aminosäure 21 bis 295 oder SEQUENZ ID Nr. 3 von Aminosäure 1 bis 275. Die Herbeiführung von Chondrozyten und/oder Knorpelgewebebildung kann Verabreichen der Zusammensetzung an Zellen in vitro und Gewinnen von Chondrozyten und/oder Knorpelgewebe umfassen, welches nachfolgend an den Patienten verabreicht werden kann. Die Zusammensetzung kann ferner einen geeigneten Träger zur Verabreichung umfassen.
  • Die vorliegende Erfindung sieht ebenfalls neuartige DNA-Sequenzen vor, welche für neuartige Mitglieder der Frazzled- und Frizzled-Proteinfamilien codieren. In besonderen Ausführungsformen sieht die vorliegende Erfindung neuartige DNA-Sequenzen vor, welche für das als humane SDF-5 bekannte Frazzled-Protein codieren. Die Nucleotidsequenzen und die entsprechenden Aminosäuresequenzen, welche durch diese DNA-Sequenzen codiert werden, werden in den Sequenzprotokollen vorgesehen. Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung isolierte DNA-Sequenzen, welche für ein humanes SDF-5 Protein codieren, welche eine DNA-Sequenz umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nucleotiden #256, 307, 310, 313, 316, 319, 322, 325 oder 328 bis #1140 oder 1143 von SEQ ID Nr. 1, oder Nucleotiden, welche für Aminosäuren #1, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 bis #295 von SEQ ID Nr. 2 codieren; oder Nucleotiden, welche für Aminosäuren #1 bis #275 von SEQ ID Nr. 3 codieren.
  • In weiteren Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung Vektoren, welche die obigen DNA-Moleküle in operativer Assoziation mit einer Expressions-Kontrollsequenz dafür umfassen, als auch mit diesen Vektoren transformierte Wirtszellen. In noch weiteren Ausführungsformen umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren zum Herstellen von gereinigten humanen SDF-5 Proteinen, neuartigen humanen SDF-5 Proteinen und Zusammensetzungen, welche die humanen SDF-5 Proteine enthalten. Diese Verfahren können die Schritte umfassen: Kultivieren einer Wirtszelle, transformiert mit einer DNA-Sequenz, welche für ein humanes SDF-5 Protein codiert, wie oben beschrieben und Gewinnen und Reinigen des besagten humanen SDF-5 Proteins aus dem Kulturmedium. Die vorliegende Erfindung umfasst ferner das gereinigte, humane SDF-5 Polypeptid, welches durch die obigen Verfahren hergestellt wird, als auch die gereinigten humanen SDF-5 Polypeptide, welche eine durch die obigen DNA-Sequenzen codierte Aminosäuresequenz umfassen. Die Proteine der vorliegenden Erfindung können die Aminosäuresequenz von Aminosäure #1, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 bis #295 von SEQ ID Nr. 2; die Aminosäuresequenz von Aminosäure #1 bis #275 von SEQ ID Nr. 3; oder ein humanes SDF-5 Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 30 bis etwa 35 kd umfassen, wobei besagtes Protein die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder 3 umfasst und mit der Fähigkeit, die Transkription von einem oder mehreren Genen zu regulieren.
  • Die vorliegende Erfindung ist brauchbar in verfahren zum Herbeiführen der Bildung oder Erhaltung von knorpelartigem Gewebe in einem Patienten, welche Verabreichen einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, welche ein SDF-5 Protein umfasst, an den Patienten umfasst. Besagte Zusammensetzung kann ferner ein oder mehrere Knochen-morphogenetische(s) Protein e) (BMP) umfassen, vorzugsweise ein BMP, ausgewählt aus BMP-2, BMP-4, BMP-7, MP52, BMP-12 und BMP-13, insbesondere bevorzugt BMP-2. Die Verfahren können verwendet werden, um Patienten zu behandeln, welche an Osteoarthritis oder einem artikularen Knorpeldefekt oder Schaden leiden.
  • Beschreibung von Sequenzen
    • SEQ ID Nr. 1: humane SDF-5 DNA
    • SEQ ID Nr. 2: humanes SDF-5 Protein
    • SEQ ID Nr. 3: humanes SDF-5 reifes Protein
  • Beschreibung von Hinterlegungen
  • Ein cDNA-Insert pSDF-5, welches die humane SDF-5 DNA Codierungssequenz enthält, wurde in einen Ampicillin E. coli Stamm insertiert und wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville. MD 20852 am 4. Februar 1997 hinterlegt. Dieser Hinterlegung ist die Eingangsnummer ATCC 98314 gewährt worden. Diese Hinterlegung erfüllt die Bedingungen des Budapester Vertrags.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Wie hierin verwendet betrifft der Begriff „Frazzled-Protein" humane Frazzled-Protein Mitglieder, welche Sequenz-Homologie zu den extrazellulären Bindungsdomänen der Frizzled-Proteinfamilie teilen, einschließlich Hfz3, Hfz5 und Hfz7, als auch andere humane Frazzled-Proteine und Frazzled-Protein Mitglieder, welche in anderen Arten gefunden werden und Sequenz-Homologie zu Frizzled-Proteinen von anderen Arten teilen, wie jene, welche in Wang et al., Wang et al., J. Biol. Chem., 271: 4468–4476 (1996) beschrieben werden. Ein spezifisches Mitglied der Frazzled-Proteinfamilie ist das humane SDF-5 Protein mit der in SEQUENZ ID Nr. 2 spezifizierten Aminosäuresequenz, als auch Homologe dieses Proteins, welche in anderen Arten gefunden werden; und weitere Proteine, welche strukturell und/oder funktionell mit SDF-5 eng verwandt sind. Es ist ebenfalls bekannt, dass Frazzled-verwandte Proteine auch in anderen Arten vorkommen, einschließlich Familienmitgliedern in Drosophila, Xenopus, C. elegans, Zebrafisch, als auch in Ratten, Mäusen und Menschen. „Frazzled-Proteine" schließen auch Varianten der Frazzled-Proteine ein, wie Allele-Varianten oder Varianten, welche durch Mutagenese oder Deletion herbeigeführt werden, und Fragmente von Frazzled- oder Frizzled-Proteinen, welche Varianten und Fragmente Frazzled-Aktivität behalten haben, vorzugsweise die Fähigkeit, an Proteine zu binden, wie die Wnt-Proteine, welche ansonsten an Membran-gebundene Rezeptoren binden würden, wie die Frizzled-Proteine.
  • Wie hierin verwendet betrifft der Begriff „Frazzled-Aktivität" eine oder mehrere Aktivitäten, welche durch die Frazzled-Proteine der vorliegenden Erfindung gezeigt werden. Insbesondere schließt „Frazzled-Aktivität" die Fähigkeit ein, an Wnt-Proteine zu binden, und kann somit die Fähigkeit einschließen, die Bindung von Wnt-Proteinen an Proteinrezeptoren wie die Frizzled-Proteinrezeptoren zu regulieren. „Frazzled-Aktivität" kann ferner die Fähigkeit einschließen, die Bildung Differentiation, Proliferation und/oder Erhaltung von Zellen und/oder Gewebe, zum Beispiel Bindegewebe, Organe und Wundheilung zu regulieren. Insbesondere kann „Frazzled-Aktivität" die Fähigkeit einschließen, die Bildung, Wachstum, Proliferation, Differentiation und/oder Erhaltung von Chondrozyten und/oder Knorpelgewebe zu verstärken und/oder zu hemmen. „Frazzled-Aktivität" schließt ebenfalls die Aktivitäten von Frazzled-Protein in den hierin beschriebenen Tests ein.
  • Die vorliegende Erfindung schließt auch Antikörper zu einem gereinigten humanen SDF-5 Protein ein, wie dem obigen. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen eine therapeutische Menge von mindestens einem der obigen humanen SDF-5 Proteine.
  • Es wird erwartet, dass humanes SDF-5 Protein, wie durch Säugetierzellen wie CHO-Zellen exprimiert, als heterogene Population von wirksamen Arten von humanem SDF-5 Protein mit variierenden N-Termini vorkommen. Basierend teilweise auf dem Von Heginje Signalpeptid-Vorhersage-Algorithmus scheinen die ersten 17 bis 24 Aminosäuren beim Signalisieren für die Sekretion des reifen Peptids einbezogen zu sein. Es wird erwartet, dass wirksame Arten gegebenenfalls das Signalpeptid einschließen können und Aminosäuresequenzen einschließen werden, welche mit Aminosäureresten #1, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 von SEQ ID Nr. 2 beginnen. Somit wird erwartet, dass DNA-Sequenzen, welche für wirksame humane SDF-5 Proteine codieren, jene einschließen, welche Nucleotide #256, 307, 310, 313, 316, 319, 322, 325 oder 328 bis #1140 oder 1143 von SEQ ID Nr. 1 umfassen. Entsprechend wird von wirksamen Arten von SDF-5 erwartet, dass sie jene einschließen, welche Aminosäuren #1, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 bis #295 von SEQ ID Nr. 2 umfassen.
  • Die vorliegende Erfindung ist brauchbar in einem Verfahren zum Ändern der Regulierung von Genen in einem Patienten, der dessen bedarf, und umfasst: Verabreichen einer wirksamen Menge der obigen Zusammensetzungen an besagten Patienten. Die Änderung der Regulierung von pankreatischen Genen kann durch Stimulieren oder Hemmen der Bindung durch Wnt-Proteine von Rezeptorproteinen, zum Beispiel Bindung zwischen dem humanen SDF-5 Protein der vorliegenden Erfindung und dem Wnt-Protein erreicht werden. Somit kann die humane SDF-5 Proteinfamilie in der Lage sein, die Bindungsinteraktion von Wnt-Genen an Rezeptorproteine, wie Frizzled-Rezeptorproteine zu regulieren.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Hybrid- oder Fusionsvektoren, welche die Codierungs-DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung und weitere für Frazzled codierende Sequenzen umfassen, gebunden an eine Gewebe-spezifische oder induzierbare regulatorische Sequenz, wie einen Promotor oder Operator. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Codierungssequenz für humanes SDF-5 Protein an einen oder mehrere Promotor, Verstärker und/oder weitere regulatorische Elemente von Genen funktionell gebunden, welche in Chondrozytenzellen und/oder Knorpelgewebe selektiv exprimiert werden. Zum Beispiel ist der Collagen Typ II Verstärker-Promotor, von welchem bekannt ist, dass er in Knorpel während mesenchymaler Kondensation und Knorpel exprimiert wird, Metsaranta et al., Dev. Dynamics, 204: 202–210 (1996): Li et al., Genes Develop., 9: 2821–2830 (1996). Ein weiteres regulatorisches Element, welches in der vorliegenden Erfindung brauchbar ist, ist der Tenascin-C-Promotor. Tenascin-C wird in artikularem Knorpel exprimiert, Pacifici et al., Matrix Biol., 14: 689–698. Zusätzlich kann die DNA-Sequenz, welche für humanes SDF-5 codiert, an eine oder mehrere regulatorische Sequenzen von Proteoglycan-Kernproteinen operativ gebunden werden, welche in Chondrozyten und/oder Knorpelgewebe selektiv erzeugt werden. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird die Codierungssequenz für humanes SDF-5 Protein an den aus dem IDX-Gen isolierten Promotor funktionell gebunden. Dieser Promotor wird selektiv in pankreatischen Zellen und Gewebe exprimiert. Somit ist ein Hybrid-DNA-Vektor, in welchem der IDX-Promotor funktionell an eine DNA-Sequenz gebunden ist, welche für ein humanes SDF-5 Protein codiert, brauchbar zur selektiven Expression des Proteins in pankreatischem Gewebe, zum Bei spiel für die Behandlung einer pankreatischen Störung oder zum Ändern der Regulierung von pankreatischen Genen in einem Patienten, zum Beispiel durch Stimulieren oder Hemmen von Bindung durch Wnt-Proteine von seinem Rezeptorprotein, zum Beispiel durch Binden zwischen dem exprimierten humanen SDF-5 Protein und dem Wnt-Protein. Vektoren, welche weitere Gewebe-selektiven regulatorischen Elemente und induzierbare regulatorische Elemente verwenden, können ebenfalls für die selektive oder induzierbare Expression der humanen SDF-5 Proteine der vorliegenden Erfindung brauchbar sein.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung sieht pharmazeutische Zusammensetzungen vor, welche eine therapeutisch wirksame Menge an humanem SDF-5 Protein enthalten, in einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel oder Träger. Diese Zusammensetzungen der Erfindung können bei der Bildung von Chondrozyten und/oder Knorpelgewebe Phenotyp verwendet werden. Diese Zusammensetzungen können ferner genutzt werden, um die Bildung, Wachstum, Proliferation, Differentiation und/oder Erhaltung von Beta-Zellen und weiteren Zelltypen zu verstärken und/oder zu hemmen, welche typischerweise in den Langerhans-Inseln oder anderen pankreatischen Zellen, als auch anderen Organgeweben wie Leber, Milz, Gehirn, Lunge, Herz und Nierengewebe gefunden werden. Die Zusammensetzungen, welche humanes SDF-5 Protein umfassen, können verwendet werden, um Vorläufer oder Stammzellen zu behandeln, wie pankreatische Zellen, welche in der Lage sind, in Zellen zu differenzieren, welche differenziertes Gewebe oder Organe umfassen, wie pankreatische Zellen, um die Bildung, Differentiation, Proliferation und/oder Erhaltung solcher Zellen, Gewebe oder Organe zu verstärken. Verfahren zum Bilden und Erhalten solcher Zellen werden zum Beispiel in WO-93/00441 beschrieben, dessen Offenbarung hierein durch Verweis hiermit eingeschlossen wird.
  • Die Zusammensetzungen der Erfindung können zusätzlich zu humanem SDF-5 Protein weitere therapeutisch brauchbare Wirkstoffe umfassen, einschließlich Wachstumsfaktoren wie epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), transformierendem Wachstumsfaktor (TGF-α und TGF-β), Aktivinen, Inhibinen, Knochen-morphogenen Proteinen (BMP) und insulinähnlichem Wachstumsfaktor (IGF). Die Zusammensetzungen können auch eine passende Matrix enthalten, zum Beispiel zur Unterstützung der Zusammensetzung und zum Vorsehen einer Oberfläche für Chondrozyten Zell- und/oder knorpelartigem Gewebewachstum. Die Matrix kann langsame Abgabe des humanen SDF-5 Proteins und/oder die passende Umgebung zur Präsentation davon vorsehen.
  • Das humane SDF-5 Protein, welches Zusammensetzungen enthält, kann in Verfahren zum Behandeln einer Anzahl an Gewebedefekten und Heilung und Erhaltung von verschiedenen Arten von Geweben und Wunden eingesetzt werden. Die Gewebe und Wunden, welche behandelt werden können, schließen Knorpel ein, aber können auch Epidermis, Nerven, Muskel, einschließlich Herzmuskel, weitere Bindegewebe wie Knochen, Sehne und Ligament und weitere Gewebe und Wunden einschließen und weitere Organe wie Bauchspeicheldrüse, Leber, Milz, Lunge, Gehirn, Herz und Nierengewebe. Diese Verfahren gemäß der Erfindung bringen Verabreichen einer wirksamen Menge an humanem SDF-5 Protein an einen Patienten mit sich, der solcher Gewebebildung, Wundheilung oder Gewebereparatur bedarf. Die humanes SDF-5 enthaltenden Zusammensetzungen können ebenfalls verwendet werden, um solche Zustände wie Rheumatoidarthritis, Osteoarthritis und weiter Abnormitäten von knorpelartigen oder anderen Organen oder Geweben wie Bauchspeicheldrüse, Leber, Milz, Lunge, Herz, Gehirn und Nierengewebe und anderen Geweben und Organen zu behandeln oder zu verhindern. Diese Verfahren können auch die Verabreichung eines Proteins der Erfindung in Verbindung mit Verabreichung von mindestens einem weiteren Protein mit sich bringen, zum Beispiel Wachstumsfaktoren einschließlich EGF, FGF, TGF-α, TGF-β, BMP, Aktivin, Inhibin und IGF.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung sind DNA-Sequenzen, welche für Expression von humanem SDF-5 Protein codieren. Solche Sequenzen schließen die Sequenz von Nucleotiden in einer 5' bis 3'-Richtung ein, veranschaulicht in SEQ ID Nr. 1, DNA-Sequenzen, welche mit Ausnahme der Degeneration des genetischen Codes identisch sind mit den DNA-Sequenzen ID Nr. 1 und für das Protein von SEQ ID Nr. 2 oder 3 codieren.
  • Die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind zum Beispiel als Sonden für den Nachweis von mRNA brauchbar, welche für weiteres Frazzled-Protein codiert, in einer gegebenen Zellpopulation. Die DNA-Sequenzen können auch zum Herstellen von Vektoren für Gentherapieanwendungen brauchbar sein, wie unten be schrieben.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung schließt Vektoren ein, welche eine DNA-Sequenz, wie oben beschrieben, in operativer Assoziation mit einer Expressionskontrollsequenz dafür umfassen. Diese Vektoren können in einem neuartigen Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten humanen SDF-5 Proteins der Erfindung eingesetzt werden, bei welchem eine Zelllinie, transformiert mit einer DNA-Sequenz, welche für ein humanes SDF-5 Protein codiert, in operativer Assoziation mit einer Expressionskontrollsequenz dafür in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert wird und humanes SDF-5 Protein daraus gewonnen und gereinigt wird. Dieses Verfahren kann eine Anzahl an bekannten Zellen, sowohl prokaryontische, als auch eukaryontische, als Wirtszellen für Expression des Polypeptids einsetzen. Die Vektoren können auch in Gentherapieanwendungen verwendet werden. Bei solch einer Verwendung können die Vektoren in die Zellen eines Patienten ex vivo transfiziert werden und die Zellen können wieder in einen Patienten eingeführt werden. Alternativ können die Vektoren in vivo durch gezielte Transfektion in einen Patienten eingeführt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Vektoren hergestellt, welche ein oder mehrere nicht-native regulatorische Elemente verwenden, wie Promotoren und/oder Verstärker, welche mit der Codierungssequenz für humanes SDF-5 operativ assoziiert sind, um Expression von humanem SDF-5 in gewünschtem Zellgewebe und/oder zu einer gewünschten Zeit in der Entwicklung zu erreichen. Zum Beispiel kann ein Vektor konstruiert werden, welcher das Promotor-Element aus dem gut gekennzeichneten IDX-Gen verwendet, von welchem bekannt ist, dass es konstitutiv in pankreatische Zellen, einschließlich Beta-Zellen während der Entwicklung exprimiert wird. Durch operatives Assoziieren des Promotors aus dem IDX-Gen mit der Codierungssequenz für Frazzled und Transformieren geeigneter Zellen wie pankreatische Stammzellen, wie in WO-93/00441 beschrieben, kann man humanes SDF-5 in diesen Zellen exprimieren und somit die gewünschten Wirkungen von Bildung Wachstum, Proliferation, Differentiation und/oder Erhaltung von Zellen wie pankreatischen Beta-Zellen fördern, welche in der Lage sind, Insulin abzuscheiden, entweder in in vitro Kultur oder in vivo.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung sind humane SDF-5 Proteine oder Polypeptide. Solche Polypeptide sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Aminosäuresequenz haben, welche die in SEQ ID Nr. 2 oder 3 veranschaulichte Sequenz einschließt.
  • Die gereinigten Proteine der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Antikörper, entweder monoklonal oder polyklonal, zu humanen SDF-5 Proteinen und/oder weiteren verwandten Proteinen zu erzeugen, und zwar unter Verwendung von Verfahren, die nach Stand der Technik der Antikörperherstellung bekannt sind. Somit schließt die vorliegende Erfindung auch Antikörper zu humanen SDF-5 und/oder anderen Frazzled-Proteinen ein. Die Antikörper können zur Reinigung von humanen SDF-5 Proteinen brauchbar sein, oder zum Hemmen oder Verhindern der Wirkungen von Frazzled-Proteinen, entweder in vitro oder in vivo. Die humanen SDF-5 Proteine können zum Herbeiführen des Wachstums und/-oder der Differentiation von embryonalen Zellen und/oder Stammzellen brauchbar sein. Somit können die Proteine oder Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch zum Behandeln von Zellpopulationen wie embryonalen Zellen oder Stammzellenpopulationen brauchbar sein, um das Wachstum und/oder die Differentiation der Zellen zu verstärken, anzureichern oder zu hemmen. Zum Beispiel können die humanen SDF-5 Proteine zum Behandeln von Zellpopulationen brauchbar sein, um Bildung, Differentiation, Proliferation und/oder Erhaltung von Chondrozyten, knorpelartigem Gewebe und/oder anderen Zellen wie Zellen von Bauchspeicheldrüse- oder anderem Gewebe oder Organ Phenotyp zu verstärken und/oder zu hemmen. Die behandelten Zellpopulationen können unter anderem für Gentherapieanwendungen brauchbar sein, wie unten beschrieben.
  • Es ist von besonderem Interesse, dass das humane SDF-5 Gen scheinbar für einen sekretierten Faktor codiert und somit lösliche Rezeptoren vorsieht, welche in der Lage sein können, mit den Wnt-Proteinen zu binden und somit Signaltransduktion durch die Wnt-Proteine initiieren und/oder blockieren. Somit kann die humane SDF-5 Genfamilie in der Lage sein, die Bindungsinteraktion von Wnt-Genen an Rezeptorproteine wie die Frizzled-Rezeptorproteine zu regulieren. Die potentiellen Signaltransduktions-RegulationsAktivitäten dieser Proteine deuten zusammen mit der Gegenwart und/oder Expression von Wnt-Genen in Bauchspeicheldrüsen und anderen Organen an, dass humanes SDF-5 Protein ein wichtiger Regulator von Differentiation von Gewebe und Organen ist und bei der Herbeiführung, Bildung, dem Wachstum, der Differentiation, Proliferation und/oder der Erhaltung von Geweben und Organen einbezogen sein kann. Somit können die Proteine der vorliegenden Erfindung bei Wundheilung, Gewebe- und Organreparatur und Regenerationsprozessen, als auch bei Differentiation von Gewebe, z. B. in der embryonalen Entwicklung brauchbar sein. Insbesondere ist durch die Erfinder beobachtet worden, dass das humane SDF-5 Protein zur Herbeiführung, Bildung, Wachstum, Differentiation, Proliferation und/oder Erhaltung und der Reparatur von Chondrozyten und/oder Knorpelgewebe brauchbar sein kann. Somit können diese Proteine und Zusammensetzungen, welche sie enthalten, bei der Behandlung von Knorpelstörungen wie Osteoarthritis, Rheumatoidarthritis und artikularen Knorpeldefekten und bei der Verstärkung und/oder Hemmung von zellulärer Bildung, Wachstum, Differentiation, Proliferation und/oder Erhaltung, zum Beispiel Bildung von Chondrozyten und/oder Knorpelgewebe brauchbar sein.
  • Die hierin vorgesehenen humanen SDF-5 Proteine schließen Faktoren ein, welche durch die Sequenzen ähnlich jenen von SEQ ID Nr. 1 codiert werden, aber in welchen Modifikationen oder Deletionen natürlich vorgesehen (z. B. Allele-Variationen in der Nucleotidsequenz, welche Aminosäureveränderungen im Polypeptid ergeben können) oder absichtlich konstruiert werden. Zum Beispiel können synthetische Polypeptide ganz oder teilweise kontinuierliche Sequenzen der Aminosäurereste von SEQ ID Nr. 2 oder 3 duplizieren. Diese Sequenzen können durch Teilen von primären, sekundären oder tertiären Struktur- und Konformationsmerkmalen mit humanen SDF-5 Polypeptiden von SEQ ID Nr. 2 oder 3 damit gemeinsame biologische Eigenschaften besitzen. Somit können diese Modifikationen und Deletionen des ursprünglichen humanen SDF-5 als biologisch wirksame Substitute für natürlich vorkommende humane SDF-5 Polypeptide in therapeutischen Prozessen eingesetzt werden. Es kann leicht bestimmt werden, ob eine gegebene Variante oder Fragment von humanem SDF-5 die biologische Aktivität von Frazzled beibehält, indem sowohl humanes SDF-5, als auch die variante oder Fragmente von humanem SDF-5 den hierin beschriebenen Tests unterworfen werden; zusätzlich kann die Variante oder das Fragment in einem kompetitiven Bindungstest verwendet werden, um bezüglich Bindung an das Wnt-Gen zu testen.
  • Andere spezifische Mutationen der Sequenzen der hierin beschriebenen SDF-5-Proteine beziehen Modifikationen einer Glykosylierungsstelle ein. Diese Modifikationen können O-gebundene oder N-gebundene Glykosylierungsstellen einbeziehen. Zum Beispiel ergibt sich die Abwesenheit von Glykosylierung oder nur teilweise Glykosylierung aus Aminosäuresubstitution oder Deletion an Asparagin-gebundenen Glykosylierungs-Erkennungsstellen. Die Asparagin-gebundenen Glykosylierungs-Erkennungsstellen umfassen Tripeptid-Sequenzen, welche durch passende zelluläre Glykosylierungsenzyme spezifisch erkannt werden. Diese Tripeptid-Sequenzen sind entweder Asparagin-X-threonin oder Asparagin-X-serin, wobei X üblicherweise eine Aminosäure ist. Eine Vielfalt an Aminosäuresubstitutionen oder Deletionen an einer oder beiden der ersten oder dritten Aminosäurepositionen einer Glykosylierungs-Erkennungsstelle (und/oder Aminosäuredeletion an der zweiten Position) ergibt Nicht-Glykosylierung an der modifizierten Tripeptid-Sequenz. Solche Varianten von humanem SDF-5 sind innerhalb der vorliegenden Erfindung. Zusätzlich wird bakterielle Expression von humanen SDF-5 Proteinen Produktion eines nichtglykosylierten Proteins ergeben, selbst wenn die Glykosylierungsstellen unmodifiziert bleiben. Solche bakteriell hergestellten Versionen von humanem SDF-5 sind innerhalb der vorliegenden Erfindung.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die neuartigen DNA-Sequenzen, welche frei von Assoziation mit DNA-Sequenzen sind, welche für anderes proteinartiges Material codieren, und für Expression von humanen SDF-5 Proteinen codieren. Diese DNA-Sequenzen schließen jene ein, welche in SEQ ID NR. 1 in einer 5' zu 3' Richtung skizziert sind. Diese DNA-Sequenzen schließen auch jene ein, welche die DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 umfassen.
  • Ähnlich codieren DNA-Sequenzen, welche für humane SDF-5 Proteine codieren, für welche durch die Sequenzen von SEQ ID NR. 1 codiert wird, oder humane SDF-5 Proteine, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder 3 umfassen, aber welche sich in der Codonsequenz aufgrund von Degenerationen des genetischen Codes oder Allelen-Variationen (natürlich auftretende Base-Veränderungen in der Artenpopulation, welche Aminosäureveränderungen ergeben können oder auch nicht) unterscheiden, ebenfalls für die hierin beschriebenen neuartigen Faktoren. Variationen in den DNA-Sequenzen von SEQ ID Nr. 1, welche durch Punktmutationen verursacht werden oder durch Mutationen (einschließlich Insertion, Deletion und Substitution) herbeigeführt werden, um die Aktivität, Halbwertszeit oder Herstellung der Polypeptide, für die codiert wird, zu verstärken, werden ebenfalls in der Erfindung umfasst.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht ein neuartiges Verfahren zum Herstellen von humanen SDF-5 Proteinen vor. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung bezieht Kultivieren einer geeigneten Zelllinie ein, welche mit einer DNA-Sequenz transformiert worden ist, welche für ein humanes SDF-5 Protein der Erfindung codiert, unter der Kontrolle von bekannten regulatorischen Sequenzen. Die transformierten Wirtszellen werden kultiviert und die humanen SDF-5 Proteine werden gewonnen und aus dem Kulturmedium herausgereinigt. Die gereinigten Proteine sind im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, mit welchen sie zusammen hergestellt werden, als auch von anderen Verunreinigungen.
  • Geeignete Zellen oder Zelllinien können Säugetierzellen, wie Eierstockzellen von Chinesischen Hamstern (CHO) sein. Die Wahl von geeigneten Säugetier-Wirtszellen und Verfahren zur Transformation, Kultur, Amplifikation, Screening, Produktherstellung und Reinigung sind nach Stand der Technik bekannt. Siehe z. B.
  • Gething und Sambrook, Nature, 293: 620–625 (1981) oder alternativ Kaufman et al, Mol. Cell. Biol., 5(7): 1750–1759 (1985) oder Howley et al, US-Patent 4419446. Eine andere geeignete Säugetier-Zelllinie, welche in den begleitenden Beispielen beschrieben wird, ist die Affen COS-1 Zelllinie. Die Säugetierzelle CV-1 kann ebenfalls geeignet sein.
  • Bakterielle Zellen können ebenfalls geeignete Wirte sein. Zu Beispiel sind die verschiedenen Stämme von E. coli (z. B. HB101, MC1061) als Wirtszellen im Bereich der Biotechnologie gut bekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas, anderen Bazillen und Ähnlichem können ebenfalls in diesem Verfahren eingesetzt werden. Zur Expression des Proteins in bakteriellen Zellen ist DNA, welche für das Signal-Peptid von Frazzled codiert, im Allgemeinen nicht notwendig.
  • Viele Stämme von Hefezellen, welche den Fachleuten bekannt sind, können ebenfalls als Wirtszellen zur Expression der Poly peptide der vorliegenden Erfindung verfügbar sein. Zusätzlich können, wo gewünscht, Insektenzellen als Wirtszellen in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung genutzt werden. Siehe z. B. Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277–298 (Plenum Press 1986) und darin zitierte Verweise.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht Vektoren zur Verwendung in dem Expressionsverfahren dieser neuartigen humanen SDF-5 Polypeptide vor. Vorzugsweise enthalten die Vektoren die vollen, oben beschriebenen, neuartigen DNA-Sequenzen, welche für die neuartigen Faktoren der Erfindung codieren. Zusätzlich enthalten die Vektoren passene Expressionskontrollsequenzen, welche Expression der Frazzled-Proteinsequenzen erlauben. Alternativ sind Vektoren, welche modifizierte Sequenzen wie oben beschrieben einschließen, ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Zusätzlich könnte die Sequenz von SEQ ID Nr. 1 oder andere Sequenzen, welche für humane SDF-5 Proteine codieren, manipuliert werden, um ein reifes humanes SDF-5 Protein zu exprimieren, und zwar durch Deletieren von humanen SDF-5 Signalpeptid-Sequenzen und ihr Ersetzen durch Sequenzen, welche für die vollständigen Signalpeptide von anderen Frazzled-Proteinen oder anderen geeigneten Propeptiden codieren. So schließt die vorliegende Erfindung chimärische DNA-Moleküle ein, welche für ein Signalpeptid von einem Mitglied der Frazzled-Familie codieren, gebunden im korrekten Leserahmen an eine DNA-Sequenz, welche für ein humanes SDF-5 Polypeptid codiert.
  • Die Vektoren können in dem Verfahren zum Transformieren von Zelllinien eingesetzt werden und enthalten ausgewählte regulatorische Sequenzen in operativer Assoziation mit den DNA-Codierungssequenzen der Erfindung, welche in der Lage sind, die Replikation und Expression davon in ausgewählten Wirtszellen zu steuern. Regulatorische Sequenzen für solche Vektoren sind den Fachleuten bekannt und können je nach Wirtszelle ausgewählt werden. Solche Selektion ist Routine und bildet keinen Teil der vorliegenden Erfindung.
  • Um SDF-5 Proteine von Ratten, Menschen oder anderen Säugetieren herzustellen, wird die DNA, welche für diese codiert, in einen passenden Expressionsvektor übertragen und in Säugetierzellen oder andere bevorzugte eukaryontische oder prokaryontische Wirte durch herkömmliche Verfahren der Gentechnologie ein geführt. Das bevorzugte Expressionssystem für biologisch wirksame, rekombinante, humane SDF-5 wird erwogen, um stabil in Säugetierzellen transformiert zu werden.
  • Ein Fachmann kann Säugetier-Expressionsvektoren durch Einsetzen der Sequenz von SEQ ID Nr. 1 oder anderen DNA-Sequenzen, welche für SDF-5 Proteine codieren, oder andere modifizierte Sequenzen und bekannte Vektoren, wie pCD [Okayama et al., Mol. Cell Biol., 2: 161–170 (1982)], pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4: 645–653 (1985)] und pMT2 CXM konstruieren.
  • Der Säugetier-Expressionsvektor pMT2 CXM ist ein Derivat von p91023(b) (Wong et al., Science 228: 810–815, 1985), welches sich vom letzteren dadurch unterscheidet, dass es das Ampicillin-Resistenzgen anstelle des Tetracyclin-Resistenzgens enthält und ferner eine XhoI-Stelle zur Insertion von cDNA-Klonen enthält. Die funktionalen Elemente von pMT2 CXM sind beschrieben worden (Kaufman, R. J., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 689–693) und schließen die Adenovirus VA-Gene, den SV40 Replikationsursprung, einschließlich dem 72 by Verstärker, den Adenovirus Major-Late-Promotor, einschließlich einer 5' Spleiß-Stelle und das Meiste der Adenovirus-Tripartite-Leitsequenz, welche an Adenovirus-Late-mRNAs vorhanden ist, eine 3' Spleiß-Akzeptor-Stelle, ein DH-FR-Insert, die SV40 Early-Polyadenylierungsstelle (SV40) und pBR322 Sequenzen ein, welche für Propagation in E. coli benötigt werden.
  • Plasmid pMT2 CXM wird durch EcoRI Verdau von pMT2-VWF erhalten, welches bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville MD (USA) unter der Eingangsnummer ATCC 67122 hinterlegt worden ist. EcoRI-Verdau schneidet das cDNA-Insert heraus, das in pMT2-VWF vorhanden ist, was pMT2 in linearer Form ergibt, welches ligiert werden kann und verwendet werden kann, um E. coli HB 101 oder DH-5 zu Ampicillin-Resistenz umzuwandeln. Plasmid pMT2 DNA kann durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden. pMT2 CXM wird dann unter Verwendung von Loopout/-in Mutagenese konstruiert [Morinaga et al., Biotechnology 84: 636 (1984). Dies entfernt Basen 1075 bis 1145 bezogen auf die Hind-III Stelle nahe der SV40 Replikationsursprung- und Verstärkersequenzen von pMT2. Zusätzlich insertiert es die folgende Sequenz:
    Figure 00150001
    an Nucleotid 1145. Diese Sequenz enthält die Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease XhoI. Ein Derivat von pMT2CXM mit der Bezeichnung pMT23 enthält Erkennungsstellen für die Restriktionsendonucleasen PstI, EcoRI, SalI und Xho3. Plasmid pMT2 CXM und pMT23 DNA kann durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden.
  • pEMC2β1, welches von pMT21 abgeleitet wird, kann ebenfalls in der Praxis der Erfindung geeignet sein. pMT21 wird von pMT2 abgeleitet, welches von pMT2-VWF abgeleitet wird. Wie oben beschrieben, schneidet EcoRI-Verdau das cDNA-Insert heraus, welches in pMT-VWF vorhanden ist, was pMT2 in linearer Form ergibt, welches ligiert werden kann und verwendet werden kann, um E. coli HB 101 oder DH-5 zu Ampicillin-Resistenz umzuwandeln. Plasmid pMT2 DNA kann durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden.
  • pMT21 wird durch die folgenden zwei Modifikationen von pMT2 abgeleitet. Zuerst wird 76 by der 5' nicht-translatierten Region der DHFR cDNA einschließlich einem Bereich von 19 G Resten von G/C Tailing für cDNA Klonieren deletiert. In diesem Verfahren wird eine XhoI-Stelle insertiert, um die folgende Sequenz gleich oberhalb von DHFR zu erhalten:
  • Figure 00160001
  • Zweitens wird eine einzigartige ClaI-Stelle durch Verdau mit EcoRV und XbaI, Behandlung mit Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I und Ligation an einen ClaI-Linker (CATCGATG) eingeführt.
  • Dies deletiert ein 250 by Segment aus der Adenovirus-assoziierten RNA (VAI)-Region, aber stört nicht VAI RNA Genexpression oder Funktion. pMT21 wird mit EcoRI und Xhol verdaut und verwendet, um den Vektor pEMC2B1 abzuleiten.
  • Ein Teil des EMCV-Leiters wird aus pMT2-ECAT1 [S. K. Jung et al., J. Virol. 63: 1651–1660 (1989)] durch Verdau mit EcoRI und PstI erhalten, was ein 2752 by Fragment ergibt. Dieses Fragment wird mit TagI verdaut, was ein EcoRI-TagI Fragment von 508 by ergibt, welches durch Elektrophorese in einem niedrig schmelzenden Agarosegel gereinigt wird. Ein 68 by Adapter und sein komplementärer Strang werden mit einem 5' TagI Vorsprungsende und einem 3' XhoI Vorsprungsende synthetisiert, welches die folgende Sequenz hat:
  • Figure 00170001
  • Diese Sequenz passt zur EMC-Virus-Leitsequenz von Nucleotid 763 bis 827. Sie verändert ebenfalls das ATG an Position 10 innerhalb des EMC-Virus-Leiters zu einem ATT und wird von einer Xhol Stelle gefolgt. Eine Drei-Weg Ligation des pMT21 EcoRI-XhoI Fragments, des EMC-Virus EcoRI-TagI-Fragments und des 68 by Oligonucleotid-Adapters TagI-XhoI-Adapters ergibt den Vektor pEM-C2β1.
  • Dieser Vektor enthält den SV40 Replikationsursprung und Verstärker, den Adenovirus-Major-Late-Promotor, eine cDNA-Kopie des Meisten der Adenovirus-Tripartite-Leitsequenz, eine kleine Hybrid-intervenierende Sequenz, ein SV40 Polyadenylierungssignal und das Adenovirus VA 1 Gen, DHFR und β-Lactamase-Marker und eine EMC-Sequenz in passenden Verhältnissen, um die hochgradige Expression der gewünschten cDNA in Säugetierzellen zu steuern.
  • Die Konstruktion von Vektoren kann Modifikation der humanen SDF-5 DNA-Sequenzen einbeziehen. Zum Beispiel kann humane SDF-5 cDNA durch Entfernen der nicht-codierenden Nucleotide an den 5' und 3' Enden der Codierungsregion modifiziert werden. Die deletierten nicht-codierenden Nucleotide können durch andere Sequenzen, von welchen bekannt ist, dass sie für die Expression zuträglich sind, ersetzt werden oder nicht. Diese Vektoren werden in passende Wirtszellen zur Expression von humanen SDF-5 Proteinen transformiert. Zusätzlich kann die Sequenz von SEQ ID Nr. 1, andere Sequenzen, welche für humane SDF-5 Proteine codieren, manipuliert werden, um ein reifes humanes SDF-5 Protein zu exprimieren, durch Deletieren von humanen SDF-5 codierenden Signalpeptidsequenzen und ihr Ersetzen durch Sequenzen, welche für die vollständigen Signalpeptide von anderen Proteinen codieren.
  • Ein Fachmann kann die Sequenzen von SEQ ID Nr. 1 durch Eliminieren oder Ersetzen der Säugetier regulatorischen Sequenzen, welche die Codierungssequenz flankieren, mit bakteriellen Sequenzen manipulieren, um bakterielle Vektoren zur intrazellulären oder extrazellulären Expression durch bakterielle Zellen zu erzeugen. Zum Beispiel könnte die Codierungssequenz weiter mani puliert werden (z. B. ligiert an andere bekannte Linker oder modifiziert durch Deletieren von nicht-codierenden Sequenzen daraus oder Verändern von Nucleotiden darin durch andere bekannte Techniken). Die modifizierte humane SDF-5 Codierungssequenz könnte dann in einen bekannten bakteriellen Vektor unter Verwendung von Verfahren wie in T. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 5230–5233 (1980) beschrieben insertiert werden.
  • Dieser exemplarische bakterielle Vektor könnte dann in bakterielle Wirtszellen transformiert und ein Protein dadurch exprimiert werden. Für eine Strategie zum Herstellen extrazellulärer Expression von humanen SDF-5 Proteinen in bakteriellen Zellen siehe z. B. Europäische Patentanmeldung EPA 177343.
  • Ähnliche Manipulationen können für die Konstruktion eines Insektenvektors [siehe z. B. in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung 155476 beschriebene Verfahren] zur Expression in Insektenzellen durchgeführt werden. Ein Hefevektor könnte ebenfalls konstruiert werden, welcher Hefe regulatorische Sequenzen für intrazelluläre oder extrazelluläre Expression der Faktoren der vorliegenden Erfindung durch Hefezellen einsetzt, [siehe z. B. in veröffentlichter PCT-Anmeldung WO-86/00639 und Europäischer Patentanmeldung EPA-123289 beschriebene Verfahren].
  • Ein Verfahren zum Herstellen großer Mengen von humanem SDF-5 Protein der Erfindung in Säugetierzellen kann die Konstruktion von Zellen einbeziehen, welche multiple Kopien des heterologen humanen SDF-5 Gens enthalten. Das heterologe Gen wird an einen amplifizierbaren Marker gebunden, z. B. das Dihydrofolat-Reduktase (DHFR)-Gen, für welches Zellen, welche erhöhte Genkopien enthalten, zur Propagierung in steigenden Konzentrationen von Methotrexat (MTX) selektiert werden können, entsprechend den Verfahren von Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601–629 (1982). Diese Herangehensweise kann mit einer Anzahl an unterschiedlichen Zelltypen eingesetzt werden.
  • Zum Beispiel kann ein Plasmid, welches eine DNA-Sequenz für ein humanes SDF-5 Protein der Erfindung in operativer Assoziation mit anderen Plasmidsequenzen, welche Expression davon ermöglichen, und das DHFR Expressionsplasmid pAdA26SV(A)3 enthält [Kaufman und Sharp, Mol. Cell. Biol. 2: 1304 (1982)], in DHFR-defiziente CHO-Zellen, DUKX-BII durch verschiedene Verfahren coeingeführt werden, einschließlich Calciumphosphat-Co-Präzipita tion und Transfektion, Elektroporation oder Protoplasten-Fusion. DHFR exprimierende Transformanten werden bezüglich Wachstum in Alpha-Medium mit dialysiertem fötalem Kälberserum selektiert und nachfolgend bezüglich Amplifikation durch Wachstum in steigenden Konzentrationen von MTX selektiert (z. B. aufeinanderfolgende Schritte in 0,02, 0,2, 1,0 und 5 μM MTX), wie in Kaufman et al., Mol Cell Biol., 5: 1750 (1983) beschrieben. Transformanten werden kloniert und biologisch wirksame humane SDF-5 Expression wird durch Test in einem der hierin beschriebenen Tests überwacht. Humane SDF-5 Proteinexpression sollte mit steigenden Graden von MTX-Resistenz steigen. Humane SDF-5 Polypeptide werden unter Verwendung von Standardtechniken gekennzeichnet, welche nach Stand der Technik bekannt sind, wie Puls-Markierung mit [35S] Methionin oder Cystein und Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese. Ähnlichen Verfahren kann gefolgt werden, um andere verwandte SDF-5 Proteine herzustellen.
  • Ein SDF-5 Protein der vorliegenden Erfindung, welches Frazzled-Aktivität zeigt, findet Anwendung bei der Herbeiführung, Bildung, dem Wachstum, der Differentiation, Proliferation und/oder Erhaltung und Heilung von Zellen und Geweben wie Chondrozyten und/oder knorpelartigem Gewebe, als auch pankreatischem Gewebe und anderen Organgeweben in Menschen und anderen Tieren. Solch ein Präparat, welches humanes SDF-5 Protein beinhaltet, kann prophylaktische Verwendung bei der Behandlung von Rheumatoidarthritis und Osteoarthritis und traumatischer Verletzung an Knorpel finden, als auch beim Verhindern von pankreatischen Tumoren, Diabetes und anderen pankreatischen Gewebestörungen. De novo Bildung von Beta-Zellen, Langerhans-Insel-Zellen und anderen Zellen des pankreatischen Phenotyps, welche durch ein Frazzled-Protein herbeigeführt wird, trägt zur Reparatur von kongenitalen, durch Trauma herbeigeführten oder onkologischen Gewebedefekten oder Zuständen bei. Humanes SDF-5 Protein kann auch bei der Behandlung von pankreatischer Erkrankung und bei anderen Gewebe- und Organreparaturverfahren verwendet werden. Solche Wirkstoffe können eine Umgebung vorsehen, um geeignete Stammzellen anzuziehen, Wachstum und Proliferation von Bauchspeicheldrüsebildenden Zellen zu stimulieren oder Differentiation von Progenitoren von Bauchspeicheldrüse-bildenden Zellen herbeizuführen, und können auch die Regeneration von anderen Geweben und Organen unterstützen. Humane SDF-5 Polypeptide der Erfindung können auch bei der Behandlung von Organstörungen wie Pankreatitis oder Diabetes brauchbar sein.
  • Die Proteine der Erfindung können auch bei Wundheilung und bei verwandter Gewebereparatur verwendet werden. Die Art der Wunden schließt ein, aber ist nicht begrenzt auf Verbrennungen, Einschnitte und Geschwüre, (siehe z. B. PCT Veröffentlichung WO-84/01106 zur Diskussion von Wundheilung und verwandter Gewebereparatur). Es wird ferner erwogen, dass Proteine der Erfindung neuronales, astrozytisches und/oder gliales Zellüberleben erhöhen können und daher bei Transplantation und Behandlung von Zuständen brauchbar sein können, welche eine Verringerung des neuronalen Überlebens aufweisen, und Reparatur. Die Proteine der Erfindung können ferner für die Behandlung von Zuständen bezüglich weiteren Arten von Gewebe brauchbar sein, wie Nerven, Epidermis, Muskel, Bindegewebe wie Knochen, Knorpel, Sehne und Ligament und weiteren Organen wie Bauchspeicheldrüse, Leber, Milz, Lunge, Herz, Gehirn und Nierengewebe. Die Proteine der vorliegenden Erfindung können auch Wert als Diätergänzung haben oder als Zusatzstoffe für Zellkulturmedien. Zu diesem Zweck können die Proteine in intakter Form verwendet werden, oder können vorverdaut werden, um eine schneller absorbierte Ergänzung vorzusehen.
  • Die Proteine der Erfindung können auch andere brauchbare Eigenschaftsmerkmale der Frazzled-Proteinfamilie haben. Solche Eigenschaften schließen angiogene, chemotaktische und/oder chemoattraktive Eigenschaften und Wirkungen auf Zellen, einschließlich Differentiationsresponses, Zellproliferationsresponses und Responses ein, welche Zelladhäsion, Migration und extrazelluläre Matrizes einbeziehen. Diese Eigenschaften machen die Proteine der Erfindung zu potentiellen Wirkstoffen zur Wundheilung, Reduktion von Fibrose und Reduktion von Narbengewebebildung. Die Proteine der Erfindung können auch für die Herbeiführung der Bildung von Zellen brauchbar sein, welche in der Lage sind, wertvolle Hormone zu abzuscheiden, wie Insulin, Glucagon oder andere endokrine oder exokrine Hormone.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein therapeutisches Verfahren und Zusammensetzung zum Behandeln von Störungen von Knorpel und Bindegewebe, als auch Störungen der Bauchspeichel drüse, Diabetes oder anderen Zuständen, bezogen auf Störungen oder Erkrankungen des pankreatischen Gewebes. Die Erfindung umfasst ferner therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen zur Wundheilung und Gewebereparatur. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einem humanen SDF-5 Protein der vorliegenden Erfindung in Vermischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel, Träger oder Matrix. Es wird ferner erwogen, dass Zusammensetzungen der Erfindung neuronales und gliales Zellüberleben erhöhen und daher bei Transplantation und Behandlung von Zuständen brauchbar sind, welche eine Verringerung im neuronalen Überleben aufweisen.
  • Es wird erwartet, dass die Proteine der Erfindung gemeinsam mit oder vielleicht synergistisch mit anderen verwandten Proteinen und Wachstumsfaktoren wirken können. Weitere therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung umfassen daher eine therapeutische Menge von mindestens einem humanen SDF-5 Protein der Erfindung mit einer therapeutischen Menge von mindestens einem anderen Protein, wie einem Mitglied der TGF-β Superfamilie von Proteinen, was die Knochen-morphogenen Proteine (BMPs), Wachstums- und Differentiationsfaktoren (GDFs) und andere Proteine, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 und BMP-7, offenbart beispielsweise in US-Patenten 5108922, 5013649, 5116738, 5106748, 5187076 und 5141905; BMP-8, offenbart in PCT-Veröffentlichung WO-91/18098 und BMP-9, offenbart in PCT-Veröffentlichung WO-93/00432; BMP-10, offenbart in PCT-Anmeldung WO-94/26893; BMP-11, offenbart in PCT-Anmeldung WO-94/26892 oder BMP-12 oder BMP-13, offenbart in PCT-Anmeldung WO-95/16035 oder BMP-15, offenbart in PCT-Anmeldung WO-96/36710 oder BMP-16, offenbart in gleichzeitig anhängiger Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/715/202, eingereicht am 18. September 1996, einschließt.
  • Weitere Zusammensetzungen, welche ebenfalls brauchbar sein können, schließen Vgr-2 und jeden der Wachstums- und Differentiationsfaktoren [GDFs] ein, einschließlich den in PCT-Anmeldungen WO-94/15965, WO-94/15949, WO-95/01801, WO-95/01802, WO-94/21681, WO-94/15966 beschriebenen und weitere. Ebenfalls kann in der vorliegenden Erfindung BIP brauchbar sein, offenbart in WO-94/01557; und MP52, offenbart in PCT-Anmeldung WO-93/16099. Die Offenbarungen all dieser obigen Anmeldungen werden hiermit durch Verweis auf die darin enthaltenen Offenbarungen eingeschlossen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das SDF-5 mit einem Protein BMP-2, BMP-7, MP52, BMP-12 oder BMP-13 kombiniert.
  • Die Zusammensetzung kann weitere Wirkstoffe und Wachstumsfaktoren einschließen, wie epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), Plättchen-hergeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF), transformierende Wachstumsfaktoren (TGF-α und TGF-β), Aktivine, Inhibine und k-Fibroblastenwachstumsfaktor (kFRF), Parathormon (PTH), Leukämie-hemmenden Faktor (LIF/HILDA/DIA), insulinähnliche Wachstumsfaktoren (IGF-I und IGF-II). Anteile dieser Wirkstoffe können auch in Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Die Herstellung und Formulierung solcher physiologisch annehmbarer Proteinzusammensetzungen mit gebührender Berücksichtigung von pH, Isotonie, Stabilität und ähnlichem ist innerhalb der Fähigkeiten nach Stand der Technik. Die therapeutischen Zusammensetzungen sind gegenwärtig aufgrund des Mangels an Artenspezifität in Frazzled-Proteinen auch für veterinäre Anwendungen wertvoll. Insbesondere Haustiere und Vollblutpferde sind zusätzlich zu Menschen gewünschte Patienten für solche Behandlung mit den SDF-5 Proteinen der vorliegenden Erfindung.
  • Das therapeutische Verfahren schließt Verabreichen der Zusammensetzung topisch, systemisch oder örtlich wie durch Injektion oder Implantation ein. Bei der Verabreichung hat die therapeutische Zusammensetzung zur Verwendung in dieser Erfindung selbstverständlich eine Pyrogen-freie, physiologisch annehmbare Form. Ferner kann die Zusammensetzung wünschenswerterweise eingekapselt sein oder in einer viskosen Form zur Abgabe an die Stelle des pankreatischen oder anderen Gewebeschadens injiziert werden. Topische Verabreichung kann für Wundheilung und Gewebereparatur geeignet sein. Andere therapeutisch brauchbare Wirkstoffe als die SDF-5 Proteine, welche ebenfalls gegebenenfalls in die Zusammensetzung wie oben beschrieben eingeschlossen werden können, können alternativ oder zusätzlich, gleichzeitig oder in Folge mit der SDF-5 Zusammensetzungen in den Verfahren der Erfindung verabreicht werden.
  • Zur Implantation schließt die Zusammensetzung vorzugsweise eine Matrix ein, welche in der Lage ist, humane SDF-5 Proteine an die Stelle des pankreatischen oder anderen Gewebeschadens ab zugeben, eine Struktur für das sich entwickelnde Gewebe vorsieht und optimalerweise in der Lage ist, in den Körper resorbiert zu werden. Die Matrix kann langsame Abgabe von humanem SDF-5 und/-oder anderem Protein vorsehen, als auch geeignete Präsentation und passende Umgebung für zelluläre Infiltration. Solche Matrizes können aus Materialien gebildet werden, welche gegenwärtig für andere implantierte medizinische Anwendungen in Gebrauch sind. Die Wahl des Matrixmaterials basiert auf biologischer Kompatibilität, biologischer Abbaubarkeit, mechanischen Eigenschaften, kosmetischer Erscheinung und Interface-Eigenschaften. Die besondere Anwendung der humanen SDF-5 Zusammensetzungen wird die passende Formulierung definieren.
  • Der Dosierungsplan wird durch den behandelnden Arzt in Erwägung verschiedener Faktoren bestimmt, welche die Wirkung des humanen SDF-5 Proteins modifizieren, z. B. Menge an gewünschtem, zu bildenden Gewebe, Stelle der Gewebeschädigung, Zustand des geschädigten Gewebes, Größe einer Wunde, Art des geschädigten Gewebes, Alter, Geschlecht und Diät des Patienten, Schwere einer Infektion, Zeit der Verabreichung und weiteren klinischen Faktoren. Die Dosierung kann mit der Art der verwendeten Matrix, welche bei der Rekonstitution verwendet wird, und den Arten von humanen SDF-5 Proteinen in der Zusammensetzung variieren. Die Zugabe weiterer bekannter Wachstumsfaktoren wie IGF I (insulinähnlicher Wachstumsfaktor I) zur Endzusammensetzung kann die Dosierung ebenfalls beeinflussen.
  • Der Fortschritt kann durch periodische Bewertung von Gewebewachstum und/oder Reparatur überwacht werden. Der Fortschritt kann zum Beispiel durch Röntgenstrahlen, histomorphometrische Bestimmungen und Tetracyclin-Markierung überwacht werden.
  • Verwendungen und biologische Aktivität
  • Von den Proteinen der vorliegenden Erfindung wird erwartet, dass sie eine oder mehrere der unten identifizierten Verwendungen oder biologische Aktivitäten aufweisen (einschließlich jenen, welche mit hierin angeführten Tests assoziiert werden). Die für Proteine der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verwendungen oder Aktivitäten können durch Verabreichung oder Verwendung solcher Proteine oder durch Verabreichung oder Verwendung von Polynucleotiden vorgesehen werden, welche für solche Proteine codieren (wie zum Beispiel in Gentherapien oder Vektoren, welche zur Einführung von DNA geeignet sind).
  • Forschungsverwendungen und Brauchbarkeit
  • Die durch die vorliegende Erfindung vorgesehenen Proteine können ähnlich in Tests verwendet werden, um biologische Aktivität zu bestimmen, einschließlich einem Panel von multiplen Proteinen für Hochdurchsatz-Screening; um Antikörper zu erwecken oder um eine andere Immunantworte auszulösen; als Reagens (einschließlich dem markierten Reagens) in Tests, welche ausgelegt sind, um Gehalte des Proteins (oder seines Rezeptors) in biologischen Flüssigkeiten quantitativ zu bestimmen; als Marker für Gewebe, in welchen das entsprechende Protein bevorzugt exprimiert wird (entweder konstitutiv oder bei einer besonderen Stufe der Gewebedifferentiation oder Entwicklung oder bei einem Krankheitszustand); und natürlich um korrelative Rezeptoren oder Liganden zu isolieren. Wo die Proteine an andere Proteine binden oder potentiell binden (wie zum Beispiel in einer Rezeptor-Ligand Interaktion), kann das Protein verwendet werden, um das andere Protein zu identifizieren, mit welchem Bindung stattfindet, oder um Hemmer der Bindungsinteraktion zu identifizieren. Proteine, welche in diesen Bindungsinteraktionen einbezogen sind, können ebenfalls verwendet werden, um nach Peptid oder kleine Molekülinhibitoren oder -Agonisten der Bindungsinteraktion zu screenen.
  • Jedes oder alle dieser Forschungsergebnisse sind in der Lage, in analysereines oder Kit Format zur Kommerzialisierung als Forschungsprodukte entwickelt zu werden.
  • Verfahren zum Durchführen der oben aufgelisteten Verwendungen sind den Fachleuten gut bekannt. Verweise, welche solche Verfahren offenbaren, schließen ohne Eingrenzung ein: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis, Hrsg., 1989 und „Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Berger, S. L. Und A. R. Kimmel, Hrsg., 1987.
  • Ernährungsverwendungen
  • Proteine der vorliegenden Erfindung können auch als Nah rungsquellen oder Ergänzungen verwendet werden. Solche Verwendungen schließen ohne Einschränkung Verwendung als Protein- oder Aminosäure-Ergänzung, Verwendung als Kohlenstoffquelle, Verwendung als Stickstoffquelle und Verwendung als Quelle von Kohlenhydrat ein. In solchen Fällen kann das Protein der Erfindung zur Speise eines bestimmten Organismus zugegeben werden oder kann als separates festes oder flüssiges Präparat verabreicht werden, wie in Form von Pulver, Pillen, Lösungen, Suspensionen oder Kapseln. Im Fall von Mikroorganismen kann das Protein der Erfindung zu dem Medium zugegeben werden, in oder an welchem der Mikroorganismus kultiviert wird.
  • Zytokin- und Zellproliferations/-differentiationsaktivität
  • Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann Zytokin, Zellproliferations- (entweder herbeiführend oder hemmend) oder Zelldifferentiations- (entweder herbeiführend oder hemmend) Aktivität aufweisen, oder kann Produktion von anderen Zytokinen in bestimmten Zellpopulationen herbeiführen. Viele bis jetzt entdeckte Proteinfaktoren, einschließlich alle bekannten Zytokine, haben Aktivität in einem oder mehreren Faktor-abhängigen Zellproliferationstests aufgewiesen und somit dienen die Tests als bequeme Bestätigung von Zytokin-Aktivität. Die Aktivität eines Proteins der vorliegenden Erfindung wird durch jeden einer Anzahl an Faktor-abhängigen, Zellproliferations-Routinetests für Zelllinien bewiesen, einschließlich ohne Einschränkung 32D, DA2, DA1G, T10, B9, B9/11, BaF3, MC9/G, M+ (preB M+), 2E8, RB5, DA1, 123, T1165, HT2, CTLL2, TF-1, Mo7e und CMK.
  • Die Aktivität eines Proteins der Erfindung kann neben anderen Mitteln durch die folgenden Verfahren gemessen werden:
  • Tests zur T-Zellen oder Thymozyten-Proliferation schließen ohne Einschränkung jene ein, welche beschrieben werden in: Current Protocols in Immunology, Hrsg. durch J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3,1–3,19; Kapitel 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137: 3494–3500, 1986; Bertagnolli et al., J. Immunol. 145: 1706–1712, 1990; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133: 327–341, 1991; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149: 3778–3783, 1992; Bowman et al., J. Immunol. 152: 1756–1761, 1994.
  • Tests für Zytokin-Herstellung und/oder Proliferation von Milzzellen, Lymphknotenzellen oder Thymozyten schließen ohne Einschränkung jene ein, welche beschrieben werden in: Polyclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A. M. und Shevach, E. M. in Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan Hrsg. Vol 1 pp. 3.12.1–2.12.14. John Wiley and Sons, Toronto, 1994; und Measurement of mouse and human Interferon γ, Schreiber R. D., in Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan Hrsg , Vol. 1, pp. 6.8.1–6.8.8 John Wiley and Sons, Toronto, 1994.
  • Test für Proliferation und Differentiation von hämatopoietischen und lymphopoietischen Zellen schließen ohne Einschränkung jene ein, welche beschrieben werden in: Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K., Davis, L. S. und Lipsky, P. E. in Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan Hrsg. Vol 1 pp. 6.3.1–6.3.12. John Wiley and Sons, Toronto 1991; deVries et al., J. Exp. Med. 173: 1205–1211, 1991; Moreau et al., Nature 336: 690–692, 1988; Greenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2931–2938, 1983; Measurement of mouse and human Interleukin 6 – Nordan, R. in Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan Hrsg. Vol 1, pp. 6.6.1-6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto, 1991; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 1857–1861, 1986; Measurement of human Interleukin 11, Bennett, F., Giannotti, J., Clark, S. C. und Turner, K. J. in Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan Hrsg., vol 1, pp. 6.15.1, John Wiley and Sons, Toronto, 1991; Measurement of mouse and human Interleukin 9, Ciarletta, A., Giannotti, J., Clark, S. C. und Turner, K. J. in Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan Hrsg , Vol 1, pp. 6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto, 1991.
  • Tests für T-Zellen Klon-Responses zu Antigenen (welche unter anderem Proteine identifizieren werden, die APC-T-Zellen Interaktionen beeinflussen, als auch direkte T-Zellen Wirkungen durch Messen von Proliferation und Zytokin-Herstellung) schließen ohne Einschränkung jene ein, welche beschrieben werden in: Current Protocols in Immunology, Hrsg. durch J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates und Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function; Kapitel 6, Cytokines and their cellular receptors; Kapitel 7, Immunologic studies in Humans); Weinberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6091-6095, 1980; Weinberger et al., Eur. J. Immun. 11: 405–411, 1981; Takai et al., J. Immunol. 137: 3494–3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508–512, 1988.
  • Immun-Stimulierungs- oder Suppressionsaktivität
  • Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann Immun-Stimulierungs- oder Immun-Suppressionsaktivität aufweisen, einschließlich ohne Einschränkung die Aktivitäten, für welche Tests hierin beschrieben werden. Ein Protein kann bei der Behandlung von verschiedenen Immunschwächen und Störungen (einschließlich schwerer kombinierter Immunschwäche (SCID)) brauchbar sein, zum Beispiel bei Regulierung (hoch oder herab) von Wachstum und Proliferation von T- und/oder B-Lymphozyten, als auch beim Beeinflussen der zytolytischen Aktivität von NK-Zellen und anderen Zellpopulationen. Diese Immunschwächen können genetisch bedingt sein oder können durch Viren- (z. B. HIV), als auch Bakterien- oder Pilzinfektionen verursacht sein, oder können Folge von Autoimmunstörungen sein. Spezieller können Infektionskrankheiten, welche durch Virus-, Bakterien-, Pilz- oder andere Infektion verursacht werden, unter Verwendung eines Proteins der vorliegenden Erfindung, einschließlich Infektionen durch HIV, Hepatitisviren, Herpesviren, Mykobakterien, Leishmania spp., Malaria spp. und verschiedene Pilzinfektionen wie Candidiasis behandelbar sein. Natürlich kann diesbezüglich ein Protein der vorliegenden Erfindung auch brauchbar sein, wo ein Ankurbeln des Immunsystems allgemein wünschenswert sein kann, also bei der Behandlung von Krebs.
  • Autoimmunstörungen, welche unter Verwendung eines Proteins der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, schließen zum Beispiel Bindegewebserkrankungen, Multiple Sklerose, systemischen Lupus erythematodes, Rheumatoidarthritis, autoimmune Lungenentzündung, Guillain-Barre-Syndrom, autoimmune Thyroiditis, insulinabhängigen Diabetes mellitus, Myasthenia gravis, Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung und autoimmun-entzündliche Augenerkrankung ein. Solch ein Protein der vorliegenden Erfindung kann auch bei der Behandlung von allergischen Reaktionen und Zuständen brauchbar sein, wie Asthma (insbesondere allergi schem Asthma) oder anderen Atemproblemen. Weitere Zustände, bei welchen Immunsuppression erwünscht ist (einschließlich zum Beispiel Organtransplantation) können ebenfalls unter Verwendung eines Proteins der vorliegenden Erfindung behandelbar sein.
  • Unter Verwendung der Proteine der Erfindung kann es ebenfalls möglich sein, Immunantworten auf mehreren Wegen zu beeinflussen. Herabregulierung kann die Form von Hemmen oder Blockieren einer Immunantwort haben, welche bereits fortschreitet, oder kann Verhindern des Herbeiführens einer Immunantwort einbeziehen. Die Funktionen von aktivierten T-Zellen können durch Suppression von T-Zell-Antworten oder durch Herbeiführen von spezifischer Toleranz in T-Zellen oder beides gehemmt werden. Immunsuppression von T-Zell-Antworten ist im Allgemeinen ein wirksames, nicht Antigen-spezifisches Verfahren, welches kontinuierliche Aussetzung der T-Zellen unter das Suppressionsmittel erfordert. Toleranz, welche Herbeiführen von Nicht-Responsivität oder Anergie in T-Zellen einbezieht, ist dadurch von Immunsuppression unterscheidbar, dass es im Allgemeinen Antigen-spezifisch ist und fortbesteht, nachdem Aussetzung unter das Tolerierungsmittel aufgehört hat. In der Praxis kann die Toleranz durch den Mangel an T-Zell-Antwort bei Wiederaussetzung durch ein spezifisches Antigen in Abwesenheit des Tolerierungsmittels demonstriert werden.
  • Herabregulieren oder Verhindern von einer oder mehreren Antigenfunktionen (einschließlich ohne Einschränkung von B-Lymphozyten Antigenfunktionen (wie zum Beispiel B7)), z. B. Verhindern von hochgradiger Lymphokinsynthese durch aktivierte T-Zellen, wird brauchbar sein in Situationen von Gewebe-, Haut- und Organtransplantation und bei Transplantat-gegen-Wirt Erkrankung (GVHD). Zum Beispiel sollte Blockierung von T-Zellen Funktion verringerte Gewebedestruktion bei Gewebetransplantation ergeben. Typischerweise wird bei Gewebetransplantaten Abstoßung des Transplantats durch sein Erkennen als fremd durch T-Zellen initiiert, gefolgt von einer Immunreaktion, die das Transplantat zerstört. Die Verabreichung eines Moleküls, welches Interaktion eines B7-Lymphozyten-Antigens mit seinem/-en natürlichen Ligand(en) an Immunzellen hemmt oder blockiert, (wie lösliche oder monomere Form eines Peptids mit B7-2 Aktivität allein oder in Verbindung mit einer monomeren Form eines Peptids mit einer Ak tivität von einem anderen B-Lymphozyten-Antigen (z. B. B7-1, B7-3) oder blockierenden Antikörper), vor Transplantation, kann zum Binden des Moleküls an den/die natürlichen Ligand(en) an den Immunzellen führen, ohne das entsprechende co-stimulative Signal zu übersenden. Blockieren von B-Lymphozyten-Antigen Funktion in dieser Sache verhindert Zytokinsynthese durch Immunzellen wie T-Zellen und wirkt so als Immunsuppressant. Darüber hinaus kann der Mangel an Co-Stimulation auch ausreichend sein, um die T-Zellen zu anergieren und dadurch Toleranz in einer Person herbeizuführen. Herbeiführung von Langzeittoleranz durch B-Lymphozyten Antigen-Blockierungsreagenzien kann die Notwendigkeit von wiederholter Verabreichung dieser Blockierungsreagenzien vermeiden. Um ausreichende Immunsuppression oder Toleranz in einer Person zu erreichen kann es ebenfalls notwendig sein, die Funktion einer Kombination aus B-Lymphozyten-Antigenen zu blockieren.
  • Die Aktivität von bestimmten Blockierungsreagenzien beim Verhindern von Organtransplantatabstoßung oder GVHD kann unter Verwendung von Tiermodellen bewertet werden, die für Aktivität in Menschen vorhersehend sind. Beispiele für passende Systeme, welche verwendet werden können, schließen allogene Herztransplantate in Ratten und xenogene pankreatische Inselzellen-Transplantate in Mäusen ein, welche beide verwendet worden sind, um die immunsuppressiven Wirkungen von CTLA4Ig Fusionsproteinen in vivo wie in Lenschow et al., Science 257: 789–792 (1992) und Turka et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 11102–11105 (1992) beschrieben zu untersuchen. Zusätzlich können Mausmodelle von GVHD (siehe Paul Hrsg. Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp. 846–847) verwendet werden, um die Wirkung von blockierender B-Lymphozyten-Antigen-Funktion in vivo auf die Entwicklung dieser Krankheit zu bestimmen.
  • Blockierende Antigen-Funktion kann auch zum Behandeln von Autoimmunerkrankung therapeutisch brauchbar sein. Viele Autoimmunstörungen sind das Ergebnis von unangemessener Aktivierung von T-Zellen, die reaktiv gegenüber Eigengewebe sind und welche die Herstellung von Zytokinen und Autoantikörper fördern, welche in der Pathologie der Krankheiten einbezogen sind. Das Verhindern der Aktivierung von autoreaktiven T-Zellen kann Krankheitssymptome reduzieren oder eliminieren. Verabreichung von Reagen zien, welche Co-Stimulation von T-Zellen durch Unterbrechen von Rezeptor:Ligand-Interaktionen von B-Lymphozyten-Antigenen blockieren, kann verwendet werden, um T-Zellen Aktivierung zu hemmen und Produktion von Autoantikörpern oder von T-Zellen hergeleiteten Zytokinen zu verhindern, welche in dem Krankheitsprozess einbezogen sein können. Zusätzlich können Blockierungsreagenzien Antigen-spezifische Toleranz von autoreaktiven T-Zellen herbeiführen, welche zu Langzeitbefreiung von der Krankheit führen könnte. Die Aktivität von Blockierungsreagenzien beim Verhindern oder Mildern von Autoimmunstörungen kann unter Verwendung einer Anzahl an gut gekennzeichneten Tiermodellen für menschliche Autoimmunerkrankungen bestimmt werden. Beispiele schließen murine experimentelle Autoimmun-Enzephalitis, systemischen Lupus erythematodes in MRL/lpr/lpr Mäusen oder NZB Hybridmäusen, murine autoimmune Collagen-Arthritis, Diabetes mellitus in NOD Mäusen und BB Ratten und murine experimentelle Myasthenia gravis ein (siehe Paul Hrsg., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp 840–856).
  • Hochregulierung einer Antigenfunktion (vorzugsweise einer B-Lymphozyten Antigenfunktion) als Mittel zum Hochregulieren von Immunantworten kann ebenfalls in der Therapie brauchbar sein. Hochregulierung von Immunantworten kann die Form von Verstärken einer bestehenden Immunantwort oder Auslösen einer Anfangs-Immunantwort haben. Zum Beispiel kann Verstärken einer Immunantwort durch Stimulieren von B-Lymphozyten Antigenfunktion in Fällen von Virusinfektion brauchbar sein. Zusätzlich können systemische Viruserkrankungen wie Influenza, die gewöhnliche Erkältung und Enzephalitis durch die Verabreichung von stimulatorischen Formen von B-Lymphozyten-Antigenen systemisch gemildert werden.
  • Alternativ können Anti-Virus Immunantwort in einem infizierten Patienten durch Entfernen von T-Zellen aus dem Patienten, Co-Stimulieren der T-Zellen in vitro mit Virus-Antigen-pulsierten APCs, welche entweder ein Peptid der vorliegenden Erfindung exprimieren, oder zusammen mit einer stimulatorischen Form eines löslichen Peptids der vorliegenden Erfindung und Wiedereinführung der in vitro aktivierten T-Zellen in den Patienten verstärkt werden. Ein weiteres Verfahren zum Verstärken von Antivirus Immunantwort wäre es, infizierte Zellen aus einem Patien ten zu isolieren, sie mit einer Nucleinsäure zu transfizieren, welche für ein Protein der vorliegenden Erfindung wie hierin beschrieben codiert, so dass die Zellen das Ganze oder einen Teil des Proteins an ihrer Oberfläche exprimieren, und die transfizierten Zellen wieder in den Patienten einzuführen. Die infizierten Zellen wären nun in der Lage, ein co-stimulatives Signal in vivo an T-Zellen zu senden und sie dadurch zu aktivieren.
  • In einer weiteren Anwendung kann Hochregulierung oder Verstärkung von Antigenfunktion (vorzugsweise B-Lymphozyten-Antigenfunktion) beim Herbeiführen von Tumorimmunität brauchbar sein. Tumorzellen (z. B. Sarkom, Melanom, Lymphom, Leukämie, Neuroblastom, Karzinom), welche mit einer Nucleinsäure transfiziert sind, welche für mindestens ein Peptid der vorliegenden Erfindung codiert, können an eine Person verabreicht werden, um Tumor-spezifische Toleranz in der Person zu überwinden. Falls gewünscht, kann die Tumorzelle transfiziert werden, um eine Kombination von Peptiden zu exprimieren. Zum Beispiel können von einem Patienten erhaltene Tumorzellen ex vivo mit einem Expressionsvektor transfiziert werden, welcher die Expression eines Peptids mit B7-2-ähnlicher Aktivität allein oder in Verbindung mit einem Peptid mit B7-1-ähnlicher Aktivität und/oder B7-3-ähnlicher Aktivität steuert. Die transfizierten Tumorzellen werden dem Patienten zurückgegeben, um Expression der Peptide an der Oberfläche der transfizierten Zelle zu ergeben. Alternativ können Gentherapietechniken verwendet werden, um auf eine Tumorzelle zur Transfektion in vivo zu zielen.
  • Die Gegenwart des Peptids der vorliegenden Erfindung mit der Aktivität eines B-Lymphozyten-Antigens an der Oberfläche der Tumorzelle sieht das notwendige Co-Stimulationssignal an T-Zellen vor, um eine T-Zellen vermittelte Immunantwort gegen die transfizierten Tumorzellen herbeizuführen. Zusätzlich können Tumorzellen, welchen MHC Klasse I oder MHC Klasse II Moleküle fehlen, oder welche dabei versagen, ausreichende Mengen an MHC Klasse I oder MHC Klasse II Moleküle zu reexprimieren, mit Nucleinsäure transfiziert werden, welche für das Ganze oder einen Teil (z. B. einen zytoplasmatische Domäne verkürzten Teil) eines MHC Klasse I α Kettenproteins und β2 Mikroglobulinproteins oder eines MHC Klasse II α Kettenproteins und eines MHC Klasse II β Kettenproteins codieren, um dadurch MHC Klasse I oder MHC Klasse II Protei ne an der zelloberfläche zu exprimieren. Expression des passenden Klasse I oder Klasse II MHC in Verbindung mit einem Peptid mit der Aktivität eines B-Lymphozyten-Antigens (z. B. B7-1, B7-2, B7-3) führt eine T-Zellen vermittelte Immunantwort gegen die transfizierte Tumorzelle herbei. Gegebenenfalls kann ein Gen, welches für ein Antisense-Konstrukt codiert, welches Expression eines MHC Klasse II assoziierten Proteins blockiert, wie die Invariant-Kette, auch mit einer DNA co-transfiziert werden, welche für ein Peptid mit der Aktivität eines B-Lymphozyten-Antigens codiert, um Präsentation von Tumor assoziierten Antigenen zu fördern und Tumor-spezifische Immunität herbeizuführen. So kann das Herbeiführen einer T-Zellen vermittelten Immunantwort in einer menschlichen Person ausreichend sein, um Tumor-spezifische Toleranz in der Person zu überwinden.
  • Die Aktivität eines Proteins der Erfindung kann neben anderen Mitteln durch die folgenden Verfahren gemessen werden: Geeignete Tests für Thymozyten- oder Splenozyten-Zytotoxizität schließen ohne Einschränkung jene ein, welche beschrieben werden in: Current Protocols in Immunology, Hrsg. durch J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function, 3.1–3,19; Kapitel 7 Immunologic studies in Humans); Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488–2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128: 1968–1974, 1982: Handa et al., J. Immunol. 135: 1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137: 3494–3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508–512, 1988; Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488–2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128: 1968–1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135: 1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137: 3494–3500, 1986; Bowman et al., J. Virology 61: 1992–1998: Takai et al., J. Immunol. 140: 508–512, 1988; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133: 327–341, 1991; Brown et al., J. Immunol. 153: 3079–3092, 1994.
  • Tests für T-Zellen abhängige Immunoglobulin-Responses und Isotyp-Switching (welche unter anderem Proteine identifizieren, die T-Zellen abhängige Antikörper-Responses modulieren und die Th1/Th2-Profile beeinflussen) schließen ohne Einschränkung jene ein, welche beschrieben werden in: Maliszewski, J. Immunol. 144: 3028–3033, 1990; und Tests für B-Zellen Funktion: In vitro anti body production, Mond, J. J. und Brunswick, M. in Current Protocols in Immunology J. E. e. a. Coligan Hrsg. Vol 1, pp. 3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto, 1994.
  • Gemischte Lymphozyten Reaktions (MLR)-Tests (welche unter anderem Proteine identifizieren, die hauptsächlich Th1 und CTL-Responses erzeugen) schließen ohne Einschränkung jene ein, welche beschrieben werden in: Current Protocols in Immunology, Hrsg. durch J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1–3.19; Kapitel 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137: 3494–3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508–512, 1988; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149: 3778–3783, 1992.
  • Dendritische Zell-abhängige Tests (welche unter anderem Proteine identifizieren, welche durch dendritische Zellen exprimiert werden, die naive T-Zellen aktivieren) schließen ohne Einschränkung jene ein, welche beschrieben werden in: Guery et al., J. Immunol. 134: 536–544, 1995; Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 173: 549–559, 1991; Macatonia et al., Journal of Immunology 154: 5071–5079, 1995; Porgador et al., Journal of Experimental Medicine 182: 255–260, 1995; Nair et al., Journal of Virology 67: 4062–4069, 1993; Huang et al., Science 264: 961–965, 1994; Macatonia et al., Journal of Experimental Medicine 169: 1255–1264, 1989; Bhardwaj et al., Journal of Clinical Investigation 94: 797–807, 1994; und Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 172: 631–640, 1990.
  • Tests für Lymphozyten-Überleben/Apoptose (welche unter anderem Proteine identifizieren, die Apoptose nach Superantigen-Induktion verhindern und Proteine, die Lymphozyten-Homeostase regulieren) schließen ohne Einschränkung jene ein, welche beschrieben werden in: Darzynkiewicz et al., Cytometry 13: 795–808, 1992; Gorczyca et al., Leukemia 7: 659–670, 1993; Gorczyca et al., Cancer Research 53: 1945–1951, 1993; Itoh et al., Cell 66: 233–243, 1991; Zacharchuk, Journal of Immunology, 145: 4037–4045, 1990; Zamai et al.; Cytometry 14: 891–897, 1993; Gorczyca et al., International Journal of Oncology 1: 639–648, 1992.
  • Tests für Proteine, die frühe Schritte von T-Zellen Festlegung und Entwicklung beeinflussen, schließen ohne Einschränkung jene ein, welche beschrieben werden in: Antica et al., Blood 84: 111–117, 1994; Fine et al., Cellular Immunology 155: 111–122, 1994; Galy et al., Blood 85: 2770–2778, 1995; Toki et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 7548–7551, 1991.
  • Hämatopoiese-regulierende Aktivität
  • Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann bei der Regulierung von Hämatopoiese brauchbar sein und demzufolge bei der Behandlung von Myeloid- oder Lymphoidzellmangel. Selbst marginale biologische Aktivität zur Unterstützung von Kolonie-bildenden Zellen oder von Faktor-abhängigen Zelllinien zeigt Einbeziehung beim Regulieren von Hämatopoiese an, z. B. beim Unterstützen des Wachstums und der Proliferation von Erythroid-Progenitorzellen allein oder in Kombination mit anderen Zytokinen, wodurch Nutzen angezeigt wird, zum Beispiel beim Behandeln von verschiedenen Anämien oder zur Verwendung in Verbindung mit Bestrahlung/Chemotherapie, um die Produktion von Erythroid-Vorläufern und/oder Erythroidzellen zu stimulieren; beim Unterstützen des Wachstums und der Proliferation von Myeloidzellen wie Granulozyten und Monozyten/Makrophagen (also traditionelle CFS-Aktivität), was zum Beispiel in Verbindung mit Chemotherapie brauchbar ist, um Myelo-Suppression als Folge zu verhindern oder behandeln; beim Unterstützen des Wachstums und der Proliferation von Megakaryozyten und demzufolge von Plättchen und dadurch Erlauben der Verhinderung oder Behandlung von verschiedenen Plättchenstörungen wie Thrombozytopenie, und allgemein zur Verwendung anstelle von oder ergänzend zu Plättchen-transfusionen; und/oder beim Unterstützen des Wachstums und der Proliferation von hämatopoietischen Stammzellen, welche in der Lage sind, zu jeder und all den oben erwähnten hämatopoietischen Zellen zu reifen und daher therapeutischen Nutzen in verschiedenen Stammzellenstörungen finden (wie jenen, welche üblicherweise mit Transplantation behandelt werden, einschließlich, ohne Einschränkung, aplastischer Anämie und paroxysmaler nocturnaler Hämoglobinurie), als auch beim Wiederbevölkern der Stammzellenabteilung nach Bestrahlung/Chemotherapie entweder in vivo oder ex vivo (z. B. in Verbindung mit Knochenmarktransplantation oder mit peripherer Progenitorzellentransplantation (homolog oder heterolog)), als normale Zellen oder genetisch manipuliert für Gentherapie.
  • Die Aktivität eines Proteins der Erfindung kann neben anderen Mitteln durch die folgenden Verfahren gemessen werden:
  • Geeignete Tests für Proliferation und Differentiation von verschiedenen hämatopoietischen Linien werden oben angeführt.
  • Tests für embryonische Stammzellendifferentiation (welche unter anderem Proteine identifizieren, die embryonische Differentiation Hämatopoiese beeinflussen), schließen ohne Einschränkung jene ein, welche beschrieben werden in: Johansson et al., Cellular Biology 15: 141–151, 1995; Keller et al., Molecular and Cellular Biology 13: 473–486, 1993; McClanahan et al., Blood 81: 2903–2915, 1993.
  • Tests für Stammzellen-Überleben und Differentiation (welche unter anderem Proteine identifizieren, die Lympho-Hämatopoiese regulieren), schließen ohne Einschränkung jene ein, welche beschrieben werden in: Methylcellulose-Colony forming assays, Freshney, M. G. in Culture of Hematopoietic Cells, R. I. Freshney, et al., Hrsg. Vol. pp. 265–268, Wiley-Liss Inc., New York, NY, 1994; Hirayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5907–5911, 1992; Primitive hematopoietic colony forming cells with high proliferative potential, McNiece, I. K. und Briddell, R. A. in Culture of Hematopoietic Cells, R. I. Freshney, et al., Hrsg., Vol. pp. 23–39, Wiley-Liss, Inc., New York, NY, 1994; Neben et al., Experimental Hematology 22: 353–359, 1994; Cobblestone area forming cell assay, Ploemacher, R. E. in Culture of Hematopoietic Cells, R. I. Freshney et al., Hrsg. Vol pp. 1–21, Wiley-Liss. Inc., New York, NY, 1994; Long term bone marrow cultures in the presence of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M. und Allen, T. in Culture of Hematopoietic Cells, R. I. Freshney et al., Hrsg. vol pp. 163–179, Wiley-Liss. Inc., New York, NY, 1994; Long term culture initiating cell assay, Sutherland, H. J. in Culture of Hematopoietic Cells, R. I. Freshney et al., Hrsg. Vol pp. 139–162, Wiley-Liss. Inc., New York, NY, 1994;
  • Gewebewachstum-Aktivität
  • Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls Nutzen in Zusammensetzungen haben, welche für Knochen, Knorpel, Sehnen, Ligament und/oder Nervengewebewachstum oder Regeneration verwendet werden, als auch zur Wundheilung und Gewebereparatur und Ersatz und bei der Behandlung von Verbrennungen, Einschnitten und Geschwüren.
  • Ein Protein der vorliegenden Erfindung, welches Knorpel- und/oder Knochenwachstum in Umständen herbeiführt, in denen Knochen normalerweise nicht gebildet wird, findet Anwendung beim Heilen von Knochenfrakturen und Knorpelschäden oder Defekten in Menschen und anderen Tieren. Solch ein Präparat, welches ein Protein der Erfindung einsetzt, kann prophylaktische Verwendung in geschlossener, als auch offener Frakturreduktion finden und auch bei der verbesserten Fixation von künstlichen Gelenken. De novo Knochenbildung, herbeigeführt durch einen osteogenen Wirkstoff, trägt zur Reparatur von kongenitalen, Trauma-induzierten oder durch onkologische Resektion induzierten cranio-facialen Defekten bei und ist auch in der kosmetisch-plastischen Chirurgie brauchbar.
  • Ein Protein dieser Erfindung kann bei der Behandlung von Periodontalerkrankung und bei anderen Zahn-Reparaturverfahren verwendet werden. Solche Wirkstoffe können eine Umgebung vorsehen, um Knochen-bildende Zellen anzuziehen, Wachstum von Knochenbildenden Zellen zu stimulieren oder Differentiation von Progenitoren von Knochen-bildenden Zellen herbeizuführen. Ein Protein der Erfindung kann auch bei der Behandlung von Osteoporose oder Osteoarthritis brauchbar sein, wie durch Stimulation von Knochen- und/oder Knorpelreparatur oder durch Blockieren von Entzündung oder Prozessen der Gewebezerstörung (Collagenase-Aktivität, Osteoclast-Aktivität usw.), welche durch entzündliche Prozesse vermittelt werden.
  • Eine weitere Kategorie von Gewebegenerationsaktivität, die dem Protein der vorliegenden Erfindung zuschreibbar sein kann, ist Sehnen/Ligament-Bildung. Ein Protein der vorliegenden Erfindung, welches Sehnen/Ligament-ähnliches Gewebe oder andere Gewebebildung in Umständen herbeiführen kann, wo solches Gewebe normalerweise nicht gebildet wird, findet Anwendung beim Heilen von Sehnen- oder Ligamentrissen, Missbildungen und anderen Sehnen- oder Ligamentdefekten in Menschen und anderen Tieren. Solch ein Präparat, welches ein Sehnen/Ligament-ähnliches Gewebe herbeiführendes Protein einsetzt, kann prophylaktische Verwendung beim Verhindern von Schaden an Sehnen- oder Ligamentgewebe finden, als auch Verwendung bei der verbesserten Fixation von Sehne oder Ligament an Knochen oder anderen Geweben und beim Reparieren von Defekten an Sehnen- oder Ligamentgewebe. De novo Sehnen/Ligament-ähnliche Gewebebildung, herbeigeführt durch eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, trägt zur Reparatur von kongenitalen, Trauma-induzierten oder anderen Sehnen- oder Ligamentdefekten anderen Ursprungs bei und ist ebenfalls in kosmetisch-plastischer Chirurgie zur Befestigung oder Reparatur von Sehnen oder Ligamenten brauchbar. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können eine Umgebung vorsehen, um Sehnen- oder Ligament-bildende Zellen anzuziehen, Wachstum von Sehnen- oder Ligament-bildenden Zellen zu stimulieren, Differentiation von Progenitoren von Sehnen- oder Ligament-bildenden Zellen herbeizuführen oder Wachstum von Sehnen/Ligamentzellen oder Progenitoren ex vivo zur Rückgabe in vivo herbeizuführen, um Gewebereparatur zu bewirken. Die Zusammensetzungen der Erfindung können auch brauchbar sein bei der Behandlung von Tendinitis, Karpaltunnelsyndrom und anderen Sehnen- oder Ligamentdefekten. Die Zusammensetzungen können auch eine passende Matrix und/oder Maskierungsmittel als Träger einschließen, wie nach Stand der Technik gut bekannt.
  • Das Protein der vorliegenden Erfindung kann auch zur Proliferation von Nervenzellen und zur Regeneration von Nerven- und Gehirngewebe brauchbar sein, also zur Behandlung von Erkrankungen und Neuropathien des zentralen und peripheren Nervensystems, als auch von mechanischen und traumatischen Störungen, welche Degeneration, Absterben oder Trauma von Nervenzellen oder Nervengewebe einbeziehen. Insbesondere kann ein Protein bei der Behandlung von Erkrankungen des peripheren Nervensystems wie peripheren Nervenverletzungen, peripherer Neuropathie und lokalisierten Neuropathien und Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie Alzheimer, Parkinson-Erkrankung, Huntington-Erkrankung, amyotropher lateraler Sklerose und Shy-Drager-Syndrom verwendet werden. Weitere Zustände, welche gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, schließen mechanische und traumatische Störungen ein, wie Rückenmarkstörungen, Kopftrauma und cerebro-vaskuläre Störungen wie Schlaganfall. Periphere Neuropathien, welche sich aus Chemotherapie oder anderen medizinischen Therapien ergeben, können unter Verwendung eines Proteins der Erfindung ebenfalls behandelbar sein.
  • Proteine der Erfindung können auch brauchbar sein, um besse re oder schnellere Schließung von nicht-heilenden Wunden zu fördern, welche Druckgeschwüre, Geschwüre in Verbindung mit vaskulärer Insuffizienz, chirurgische oder traumatische Wunden und Ähnliches ohne Einschränkung einschließen.
  • Es wird erwartet, dass ein Protein der vorliegenden Erfindung auch Aktivität zur Erzeugung oder Regeneration von anderen Geweben aufweisen kann, wie Organen (einschließlich zum Beispiel Bauchspeicheldrüse, Leber, Gedärm, Niere, Haut, Endothelium), Muskel (glatt, Skelett oder Herz) und vaskulärem (einschließlich vaskulärem Endothelium) Gewebe, oder zum Fördern des Wachstums von Zellen, welche solche Gewebe umfassen. Ein Teil der gewünschten Wirkungen kann durch Hemmung oder Modulation von fibrotischer Narbenbildung stattfinden, um es normalem Gewebe zu erlauben, sich zu regenerieren. Ein Protein der Erfindung kann auch angiogene Aktivität aufweisen.
  • Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann auch für Darm-Schutz oder Regeneration und Behandlung von Lunge oder Leberfibrose, Reperfusionsverletzungen in verschiedenen Geweben und Zuständen brauchbar sein, welche sich aus systemischem zytokinen Schaden ergeben.
  • Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann auch zum Fördern oder Hemmen von Differentiation von oben beschriebenen Geweben von Vorläufer-Geweben oder Zellen brauchbar sein; oder zum Hemmen des Wachstums von oben beschriebenen Geweben.
  • Die Aktivität eines Proteins der Erfindung kann neben anderen Mitteln durch die folgenden Verfahren gemessen werden: Tests für Gewebeerzeugungsaktivität schließen ohne Einschränkung jene ein, welche beschrieben werden in: Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO-95/16035 (Knochen, Knorpel, Sehne); Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO-95/05846 (Nerven, neuronal); Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO-91/07491 (Haut, Endothelium).
  • Tests für Wundheilung schließen ohne Einschränkung jene ein, welche beschrieben werden in: Winter, Epidermal Wound Healing, pps. 71–112 (Maibach, H. I. Und Rovee, D. T., Hrsg.), Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago, wie durch Eaglstein und Mertz, J. Invest. Dermatol. 71: 382–84 (1978) modifiziert.
  • Aktivin/Inhibin-Aktivität
  • Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann auch Aktivin- oder Inhibin-bezogene Aktivitäten aufweisen. Inhibine sind durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, die Abgabe von Follikel-stimulierendem Hormon (FSH) zu hemmen, während Aktivine durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet sind, die Abgabe von Follikel-stimulierendem Hormon (FSH) zu stimulieren. Somit kann ein Protein der vorliegenden Erfindung allein oder in Heterodimeren mit einem Mitglied der Inhibin-α-Familie als Verhütungsmittel brauchbar sein, basierend auf der Fähigkeit des Inhibins, die Fruchtbarkeit in weiblichen Säugern zu verringern und Spermatogenese in männlichen Säugern zu verringern. Verabreichung von ausreichenden Mengen von weiteren Inhibinen können Unfruchtbarkeit in diesen Säugern herbeiführen. Alternativ kann das Protein der Erfindung als Homodimer oder als Heterodimer mit anderen Protein-Untereinheiten der Inhibin-β-Gruppe als Fruchtbarkeit herbeiführendes Therapeutikum brauchbar sein, basierend auf der Fähigkeit von Aktivin-Molekülen beim Stimulieren von FSH-Abgabe von Zellen des Hypophysenvorderlappens. Siehe zum Beispiel United States Patent 4798885. Ein Protein der Erfindung kann auch zum Vorrücken des Beginns von Fruchtbarkeit bei sexuell unreifen Säugern brauchbar sein, um so die reproduktive Leistung der Lebenszeit von Haustieren wie Kühen, Schafen und Schweinen zu erhöhen.
  • Die Aktivität eines Proteins der Erfindung kann neben anderen Mitteln durch die folgenden Verfahren gemessen werden: Tests für Aktivin/Inhibin-Aktivität schließen ohne Einschränkung jene ein, welche beschrieben werden in: Vale et al., Endocrinology 91: 562–572, 1972; Ling et al., Nature 321: 779–782, 1986; Vale et al., Nature 321: 776–779, 1986; Mason et al., Nature 318: 659–663, 1985; Forage et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 3091–3095, 1986.
  • Chemotaktische/chemokinetische Aktivität
  • Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann Chemotaktische oder chemokinetische Aktivität (z. B. als Chemokin wirken) für Säugetierzellen haben, einschließlich zum Beispiel Monozyten, Fibroblasten, Neutrophile, T-Zellen, Mastzellen, Eosinophile, epitheliale und/oder endotheliale Zellen. Chemotaktische und chemokinetische Proteine können verwendet werden, um eine gewünschte Zellpopulation zu einer gewünschten Wirkungsstelle zu mobilisieren oder anzuziehen. Chemotaktische oder chemokinetische Proteine sehen besondere Vorteile bei der Behandlung von Wunden und anderen Traumata an Geweben vor, als auch bei Behandlung von lokalisierten Infektionen. Zum Beispiel kann Anziehen von Lymphozyten, Monozyten oder Neutrophilen zu Tumoren oder Infektionsstellen verbesserte Immunantwort gegen den Tumor oder den infizierenden Wirkstoff ergeben.
  • Ein Protein oder Peptid hat für eine besondere Zellpopulation Chemotaktische Aktivität, wenn es direkt oder indirekt die gesteuerte Orientierung oder Bewegung solch einer Zellpopulation stimulieren kann. Vorzugsweise hat das Protein oder Peptid die Fähigkeit, gesteuerte Bewegung von Zellen direkt zu stimulieren. Ob ein bestimmtes Protein für eine Zellpopulation Chemotaktische Aktivität hat, kann leicht durch Einsetzen eines solchen Proteins oder Peptids in jeden bekannten Test für Zellchemotaxis bestimmt werden.
  • Die Aktivität eines Proteins der Erfindung kann neben anderen Mitteln durch die folgenden Verfahren gemessen werden:
  • Tests für Chemotaktische Aktivität (welche Proteine identifizieren, die Chemotaxis herbeiführen oder verhindern), bestehen aus Tests, welche die Fähigkeit eines Proteins messen, die Migration von Zellen über eine Membran herbeizuführen, als auch die Fähigkeit eines Proteins, die Adhäsion einer Zellpopulation an eine andere Zellpopulation herbeizuführen. Geeignete Tests für Bewegung und Adhäsion schließen ohne Einschränkung jene ein, welche beschrieben werden in: Current Protocols in Immunology, Hrsg. durch J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Kapitel 6.12, Measurement of alpha and Beta Chemokines 6.12.1–6.12.28; Taub et al., J. Clin. Invest. 95: 1370–1376, 1995; Lind et al. APMIS 103: 140–146, 1995; Muller et al., Eur. J. Immunol. 25: 1744–1748; Gruber et al., J. of Immunol. 152: 5860–5867, 1994; Johnston et al., J. of Immunol. 153: 1762–1768, 1994.
  • Hämostatische und thrombolytische Aktivität
  • Ein Protein der Erfindung kann auch hämostatische oder thrombolytische Aktivität aufweisen. Als Folge wird von solch einem Protein erwartet, dass es bei der Behandlung von verschie denen Koagulationsstörungen (einschließlich erblicher Störungen wie Hämophilie) brauchbar ist, oder zum Verstärken von Koagulation und anderen hämostatischen Vorkommnissen bei Behandeln von Wunden als Folge von Trauma, Chirurgie oder anderen Ursachen. Ein Protein der Erfindung kann auch zum Auflösen oder Hemmen von Bildung von Thrombosen brauchbar sein und zur Behandlung und Verhinderung von Zuständen, welche sich daraus ergeben (wie zum Beispiel Infarkt der Gefäße des Herzens und zentralen Nervensystems (z. B. Schlaganfall)).
  • Die Aktivität eines Proteins der Erfindung kann neben anderen Mitteln durch die folgenden Verfahren gemessen werden:
  • Test für hämostatische und thrombolytische Aktivität schließt ohne Einschränkung jene ein, welche beschrieben werden in: Linet et al., J. Clin. Pharmacol. 26: 131–140, 1986; Burdick et al., Thrombosis Res. 45: 413–419, 1987; Humphrey et al., Fibrinolysis 5: 71–79 (1991); Schaub, Prostaglandins 35: 467–474, 1988.
  • Rezeptor/Ligand-Aktivität
  • Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann auch Aktivität als Rezeptoren, Rezeptorliganden oder Hemmer oder Agonisten von Rezeptor/Ligand-Interaktionen zeigen. Beispiele für solche Rezeptoren und Liganden schließen ohne Einschränkung ein: Zytokinrezeptoren und ihre Liganden, Rezeptorkinasen und ihre Liganden, Rezeptorphosphatasen und ihre Liganden, Rezeptoren, welche in Zelle-Zelle-Interaktionen involviert sind, und ihre Liganden (einschließlich ohne Einschränkung zelluläre Adhäsionsmoleküle (wie Selektive, Integrine und ihre Liganden) und Rezeptor/Ligand Paare, welche in Antigen-Präsentation, Antigen-Erkennung und Entwicklung von zellulären und humoralen Immunantworten einbezogen sind). Rezeptoren und Liganden sind ebenfalls zum Screenen von potentiellen Peptid oder kleinmoleküligen Hemmern der relevanten Rezeptor/Ligand-Interaktion brauchbar. Ein Protein der vorliegenden Erfindung (einschließlich ohne Einschränkung Fragmente von Rezeptoren und Liganden) kann selbst als Hemmer von Rezeptor/Ligand-Interaktionen brauchbar sein.
  • Die Aktivität von einem Protein der Erfindung kann neben anderen Mitteln durch die folgenden Verfahren gemessen werden:
  • Geeignete Tests für Rezeptor-Ligand-Aktivität schließen ohne Einschränkung jene ein, welche beschrieben werden in: Current Protocols in Immunology, Hrsg. durch J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Kapitel 7.28, Measurement of Cellular Adhesion under static conditions 7.28.1-7.28.22), Takai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6864–6868, 1987; Bierer et al., J. Exp. Med. 168: 1145–1156, 1988; Rosenstein et al., J. Exp. Med. 169: 149–160, 1989; Stoltenborg et al., J. Immunol. Methods 175: 59–68, 1994; Stitt et al., Cell 80: 661–670, 1995.
  • Anti-Entzündungsaktivität
  • Proteine der vorliegenden Erfindung können auch Anti-Entzündungsaktivität aufweisen. Die Anti-Entzündungsaktivität kann durch Vorsehen eines Stimulus für Zellen erreicht werden, welche in der entzündlichen Response einbezogen sind, und zwar durch Hemmen oder Fördern von Zelle-Zelle Interaktionen (wie zum Beispiel Zelladhäsion), durch Hemmen oder Fördern von Chemotaxis von Zellen, welche im entzündlichen Prozess einbezogen sind, Hemmen oder Fördern von Zell-Extravasation oder durch Stimulieren oder Unterdrücken der Herstellung von anderen Faktoren, welche direkter eine entzündliche Response hemmen oder fördern. Proteine, welche solche Aktivitäten aufweisen, können verwendet werden, um entzündliche Zustände zu behandeln, einschließlich chronische oder akute Zustände, einschließlich ohne Einschränkung Entzündungen in Verbindung mit Infektion (wie septischem Schock, Sepsis oder systemischem Entzündungsreaktions-Syndrom (SIRS)), Ischämie-Reperfusionsverletzung, Endotoxin-Letalität, Arthritis, Komplement-vermittelte hyperakute Abstoßung, Nephritis, Zytokin- oder Chemokin-induzierte Lungenverletzung, entzündlicher Darmerkrankung, Crohn-Erkrankung oder als Folge von Überproduktion von Zytokinen wie TNF oder IL-1. Proteine der Erfindung können auch brauchbar sein, um Anaphylaxe und Hypersensibilität gegenüber antigenen Substanzen oder Materialien zu behandeln.
  • Tumorhemmungsaktivität
  • Zusätzlich zu den oben beschriebenen Aktivitäten für immunologische Behandlung oder Verhinderung von Tumoren kann ein Pro tein der Erfindung weitere Antitumoraktivitäten aufweisen. Ein Protein kann direkt oder indirekt (wie zum Beispiel durch ADCC) Tumorwachstum hemmen. Ein Protein kann seine Tumor-hemmende Aktivität durch Wirken auf Tumorgewebe oder Tumorvorläufergewebe aufweisen, durch Hemmen der Bildung von Geweben, welche notwendig sind, um Tumorwachstum zu unterstützen (wie zum Beispiel durch Hemmen von Angiogenese), durch Verursachen der Produktion von anderen Faktoren, Wirkstoffen oder Zelltypen, welche Tumorwachstum hemmen, oder durch Unterdrücken, Eliminieren oder Hemmen von Faktoren, Wirkstoffen oder Zelltypen, welche Tumorwachstum fördern.
  • Weitere Aktivitäten
  • Ein Protein der Erfindung kann auch eine oder mehrere der folgenden zusätzlichen Aktivitäten oder Wirkungen aufweisen: Hemmen von Wachstum, Infektion oder Funktion von oder Töten von infektiösen Wirkstoffen, einschließlich ohne Einschränkung Bakterien, Viren, Pilzen und anderen Parasiten; Bewirken (Unterdrücken oder Verstärken) von körperlichen Merkmalen, einschließlich ohne Einschränkung Größe, Gewicht, Haarfarbe, Augenfarbe, Haut, fett-zu-mager Verhältnis oder weitere Gewebepigmentierung, oder Organ- oder Körperteilgröße oder Form (wie zum Beispiel Brustvergrößerung oder Verringerung, Veränderungen in Knochenform oder Gestalt); Beeinflussen von Biorhythmen oder Herzzyklen oder Rhythmen; Beeinflussen der Fruchtbarkeit von männlichen oder weiblichen Personen; Beeinflussen von Metabolismus, Katabolismus, Anabolismus, Verarbeiten, Nutzung, Lagerung oder Eliminierung von diätetischem Fett, Lipid, Protein, Kohlenhydrat, Vitaminen, Mineralien, Co-Faktoren oder weiteren Ernährungsfaktoren oder Bestandteil(en); Beeinflussen von Verhaltensmerkmalen, einschließlich ohne Einschränkung Appetit, Libido, Stress, Kognition (einschließlich kognitiven Störungen), Depression (einschließlich depressiven Störungen) und gewalttätigen Verhaltens; Vorsehen von analgetischen Wirkungen oder anderen Schmerzverringernden Wirkungen; Fördern von Differentiation und Wachstum von embryonalen Stammzellen in anderen Linien als hämatopoietischen Linien; hormonale oder endokrine Aktivität; im Fall von Enzymen Korrigieren von Schwächen des Enzyms und Behandeln von Schwäche-bezogenen Krankheiten; Behandlung von hyperproliferati ven Störungen (wie zum Beispiel Psoriasis); Immunoglobulin-ähnliche Aktivität (wie zum Beispiel die Fähigkeit, Antigene oder Komplement zu binden); und die Fähigkeit, als Antigen in einer Impfstoffzusammensetzung zu wirken, um eine Immunantwort gegenüber solch einem Protein oder anderem Material oder Einheit hervorzurufen, welche mit solchem Protein kreuz-reaktiv ist.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Praxis der vorliegenden Erfindung beim Gewinnen und Kennzeichnen von humanem SDF-5 Protein und Einsetzen der DNA, um andere SDF-5 Proteine zu gewinnen, Erhalten der humanen Proteine und Exprimieren der Proteine durch Rekombinant-Techniken.
  • Beispiel 1: Klonieren eines humanen Homoloas zu muriner SDF-5
  • Die Nucleotidsequenz von murinem SDF-5 (persönliche Kommunikation, Professor Honjo) wurde verwendet, um GenBank zu befragen. Mehrere ESTs, deren DNA-Sequenz an entweder dem 5' oder 3'-Ende der cDNA identifiziert worden war, zeigten einen hohen Identitätsgrad mit der murinen SDF-5. Einige der ESTs waren von humanen Quellen. Die verschiedenen humanen ESTs wurden zur murinen SDF-5 Nucleotidsequenz in voller Länge ausgerichtet und es wurde bestimmt, dass keiner der Klone, von welchen die EST-Sequenzen hergeleitet worden waren, die gesamte Codierungssequenz von SDF-5 enthielt. Das EST, welches das meiste 5' an der murinen SDF-5 Nucleotidsequenz ausgerichtet hatte, war H14917. Dieses EST repräsentierte eine 5'-Ende DNA-Sequenz einer humanen cDNA von Brustgewebe. Die Ausrichtung mit murinem SDF-5 legt nahe, dass der durch EST #H14917 repräsentierten humanen Brust-cD-NA etwa 147 Nucleotide an Codierungssequenz am 5'-Ende fehlten.
  • Um ein Isolat eines Derivats in voller Länge von murinem SDF-5 zu versuchen, wurde eine biotinyliere Oligonucleotid-Sonde (5'-Biotin-ATCGATGCCGTGGCACAGCTGCAGGTTG-3') synthetisiert, welche das Umkehr-Komplement von Nucleotiden 18 bis 44 der H14917 Sequenz repräsentierte. Diese Sonde wurde in einem Lösungsanreicherungsprotokoll mit 5 separaten, humanen cDNA-Bibliotheken in voller Länge verwendet, welche aus den folgenden Geweben bereitet wurden: Erwachsenenlunge, Erwachsenenherz, Erwachsenennieren, fötales Gehirn und Brustdrüse. Nach der Anreicherung wurden etwa 60000 Kolonien von jeder angereicherten Bibliothek auf jeweils 10 Platten plattiert und Standard-Kolonie-Hybridisierungs techniken unter Verwendung des gleichen Oligonucleotids als Sonde nach seiner Markierung mit Polynucleotidkinase und [g-32P]ATP unterworfen. Aufgrund technischer Probleme wurden nur 4 Platten (24000) Kolonien für die Brustdrüsen-Bibliothek plattiert. Nur die Brustdrüsen-Bibliothek schien cDNA-Klone zu enthalten, die zur Sonde hybridisierten. Zwölf positive Klone wurden aufgenommen, aufgezogen und wieder plattiert. Diese wieder plattierten Positiven wurden dann nochmal zur gleichen Sonde hybridisiert, um sie zu verifizieren und ihre Reinheit sicherzustellen. Alle 12 der anfänglich Positiven gaben Hybridisierungssignale bei sekundärer Hybridisierung. Vier der Kandidaten wurden DNA-Sequenzierung unterworfen. Ein Signalklon wurde ausgewählt (Isolat #4), welcher die richtige Ausrichtung hatte, die gesamte Codierungssequenz für humanes SDF-5 enthielt und dessen Sequenz durch Vergleich mit anderen Isolaten verifiziert wurde.
  • Beispiel 2
  • W-20 Biotests
  • A. Beschreibung von W-20 Zellen
  • Verwendung der W-20 Knochenmark-Stromazellen als Indikator-Zelllinie basiert auf der Umwandlung dieser Zellen zu Osteoblast-ähnlichen Zellen nach Behandlung mit einem osteogenen Protein wie einem BMP-Protein [Thies et al., Journal of Bone and Mineral Research, 5: 305 (1990); und Thies et al., Endocrinology, 130: 1318 (1992)]. Speziell sind W-20 Zellen eine klonale Knochenmark-Stromazelllinie, hergeleitet von erwachsenen Mäusen durch Forscher im Labor von Dr. D. Nathan, Children's Hospital, Boston, MA. Behandlung von W-20 Zellen mit bestimmten BMP-Proteinen ergibt (1) erhöhte alkalische Phosphataseproduktion, (2) Herbeiführung von PTH-stimuliertem cAMP und (3) Herbeiführung von Osteocalcinsynthese durch die Zellen. Während (1) und (2) Merkmale in Verbindung mit dem Osteoblast-Phenotyp darstellen, ist die Fähigkeit, Osteocalcin zu synthetisieren, eine phenotypische Eigenschaft, welche nur durch reife Osteoblasen gezeigt wird. Ferner haben wir bis jetzt Umwandlung von W-20 Stromazellen in Osteoblast-ähnliche Zellen nur bei Behandlung mit BMPs beobachtet. Auf diese Weise korrelieren die in vitro Aktivitäten, welche durch BMP behandelte W-20 Zellen gezeigt werden, mit der für BMPs bekannten in vivo Knochenbildungsaktivität.
  • Unten werden zwei in vitro Tests beschrieben, welche beim Vergleich von BMP-Aktivitäten von neuartigen osteoinduktiven Molekülen brauchbar sind.
  • B. W-20 alkalische Phosphatase-Testprotokoll
  • W-20 Zellen werden in Gewebekulturschalen mit 96 Mulden bei einer Dichte von 10000 Zellen pro Mulde in 200 μl Medium (DME mit 10 Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und 100 Einheiten/ml Penicillin + 100 μg/ml Streptomycin plattiert. Die Zellen dürfen über Nacht in einem 95% Luft, 5% CO2 Inkubator bei 37°C anhaften. Die 200 μl Medium werden mit einem Multikanal-Pipettor aus jeder Mulde entfernt und mit einem gleichen Volumen an Testprobe, geliefert in DME mit 10 Hitze-inaktiviertem Kälberserum, 2 mM Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin ersetzt. Die Testsubstanzen werden dreifach getestet. Den Testproben und Standards wird ein 24 Stunden Inkubationszeitraum mit den W-20 Indikatorzellen erlaubt. Nach den 24 Stunden werden die Schalen aus dem 37°C Inkubator entfernt und die Testmedien wird von den Zellen entfernt. Die W-20 Zellschichten werden 3 Mal mit 200 μl pro Mulde an Calcium/Magnesium-freier, Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und diese Wäschen werden verworfen. 50 μl Glas-destilliertes Wasser werden zu jeder Mulde zugegeben und die Testschalen werden dann in einem Trockeneis/Ethanolbad zum Blitzgefrieren platziert. Sobald gefroren, werden die Schalen vom Trockeneis/Ethanolbad entfernt und bei 37°C aufgetaut. Dieser Schritt wird 2 weitere Male für insgesamt 3 Frost-Tau-Verfahren wiederholt. Sobald vollständig, ist die Membran-gebundene alkalische Phosphatase für Messung verfügbar. 50 μl Testgemisch (50 mM Glycin, 0,05 Triton X-100, 4 mM MgCl2, 5 mM p-Nitrophenol-Phosphat, pH = 10,3) werden zu jeder Testmulde zugegeben und die Testschalen werden dann für 30 Minuten bei 37°C in einem schüttelnden Wasserbad bei 60 Oszillationen pro Minute inkubiert. Am Ende der 30 Minuten Inkubation wird die Umsetzung durch Zugeben von 100 μl von 0,2N NaOH zu jeder Mulde und Platzieren der Testschalen auf Eis gestoppt. Die spektrophotometrische Extinktion für jede Mulde wir bei einer Wellenlänge von 405 Nanometern abgelesen. Diese Werte werden dann mit bekannten Standards verglichen, um eine Schätzung der alkalischen Phosphataseaktivität in jeder Probe zu ergeben. Zum Beispiel werden un ter Verwendung von bekannten Mengen an p-Nitrophenolphosphat Extinktionswerte erzeugt. Dies wird in Tabelle I gezeigt.
  • Tabelle 1
    Figure 00470001
  • Extinktionswerte für bekannte Mengen an BMPs können bestimmt werden und können zu μmol an p-Nitrophenolphosphat, gespalten pro Einheitszeit umgewandelt werden, wie in Tabelle II gezeigt.
  • Tabelle II
    Figure 00470002
  • Diese Werte werden dann verwendet, um die Aktivitäten von bekannten Mengen an SDF-5 mit BMP-2 zu vergleichen.
  • C. Osteocalcin RIA Protokoll
  • W-20 Zellen werden bei 106 Zellen pro Mulde in Multiwell Gewebekulturschalen mit 24 Mulden in 2 ml DME plattiert, welches 10 Hitze-inaktiviertes fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin enthält. Die Zellen dürfen über Nacht in einer Atmosphäre von 95% Luft, 5% CO2 bei 37°C anhaften. Am nächsten Tag wird das Medium zu DME gewechselt, welches 10% fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin und die Testsubstanz in einem Gesamtvolumen von 2 ml enthält. Jede Testsubstanz wird an dreifache Mulden verabreicht. Die Testsubstanzen werden mit den W-20 Zellen für insgesamt 96 Stunden inkubiert, mit Ersetzen bei 48 Stunden durch die gleichen Testmedien. Am Ende von 96 Stunden werden 50 μl Testmedium aus jeder Mulde entfernt und bezüglich Osteocalcin-Produktion unter Verwendung eines Radioimmuntests für Maus-Osteocalcin getestet. Die Details des Tests werden in dem Kit beschrieben, welches durch Biomedical Technologies Inc., 378 Page Street, Stoughton, MA 02072 hergestellt wird. Reagenzien für den Test werden als Produktnummern BT-431 (Maus-Osteocalcin-Standard), BT-432 (Ziege-anti-Maus Osetocalcin), BT-431R (iodiertes Maus-Osteocalcin), BT-415 (normales Ziegenserum) und BT-414 (Esel-anti-Ziege IgG) gefunden. Der RIA für Osteocalcin, synthetisiert durch W-20 Zellen in Antwort auf BMP-Behandlung wird wie in dem durch den Hersteller vorgesehenen Protokoll beschrieben durchgeführt.
  • Die erhaltenen Werte für die Testproben werden mit Werten für bekannte Standards von Maus-Osteocalcin verglichen und mit der Menge an Osteocalcin, welche durch W-20 Zellen in Antwort auf Challenge mit bekannten Mengen von BMP-2 produziert werden. Die Werte für BMP-2 induzierte Osteocalcin-Synthese durch W-20 Zellen wird in Tabelle III gezeigt.
  • Tabelle III
    Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Beispiel 3
  • Rosen-modifizierter Sampath-Reddi-Test
  • Eine modifizierte Version des Rattenknochenbildungstests, beschrieben in Sampath und Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 6591–6595 (1983) wird verwendet, um Knochen und/oder Knorpel und/oder andere Bindegewebeaktivität von neuartigen osteoinduktiven oder chondroinduktiven Proteinen zu bewerten. Dieser modifizierte Test wird hierin der Rosen-modifizierte Sampath-Reddi-Test genannt. Der Ethanol-Ausfällungsschritt des Sampath-Reddi-Verfahrens wird durch Dialysieren (falls die Zusammensetzung eine Lösung ist) oder Diafiltrieren (falls die Zusammensetzung eine Suspension ist) der zu testenden Fraktion gegen Wasser ersetzt. Die Lösung oder Suspension wird dann zu 0,1 TFA äquilibriert. Die sich ergebende Lösung wird zu 20 mg Rattenmatrix zugegeben. Eine Rattenmatrix-Scheinprobe, welche nicht mit dem Protein behandelt wird, dient als Kontrolle. Dieses Material wird gefroren und gefriergetrocknet und das sich ergebende Pulver wird in #5 Gelatinekapseln eingeschlossen. Die Kapseln werden subkutan in den abdominalen Thoraxbereich von 21–49 Tage alten männlichen Long Evans Ratten implantiert. Die Implantate werden nach 7–14 Tagen entfernt. Die Hälfte eines jeden Implantats wird zur alkalischen Phosphatase-Analyse verwendet [siehe Reddi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 69: 1601 (1972)].
  • Die andere Hälfte von jedem Implantat wird fixiert und zur histologischen Analyse verarbeitet. 1 um Glycolmethacrylat-Abschnitte werden mit Von Kossa und Säure Fuschin eingefärbt, um die Menge an herbeigeführter Knochen- und Knorpel und andere Bindegewebebildung, welche in jedem Implantat vorhanden ist, zu bewerten. Die Begriffe +1 bis +5 repräsentieren den Bereich jedes histologischen Abschnitts eines Implantats, der durch neue Knochen- und/oder Knorpelzellen besetzt ist und Matrix. Eine Bewertung von +5 zeigt an, dass mehr als 50% des Implantats neuer Knochen und/oder Knorpel ist, welcher als direkte Folge von Protein im Implantat hergestellt wurde. Eine Bewertung von +4, +3, +2 und +1 würde anzeigen, dass mehr als 40%, 30%, 20% bzw. 10% des Implantats neuen Knorpel und/oder Knochen enthalten.
  • Alternativ werden die Implantate auf das Erscheinen von Gewebe untersucht, welches embryonischen Sehnen ähnelt, welches leicht durch die Gegenwart von dichten Bündeln an Fibroblasten erkannt wird, welche in der gleichen Ebene ausgerichtet und eng zusammengepackt sind. [Sehnen/Ligament-ähnliches Gewebe wird zum Beispiel in Ham und Cormack, Histology (JB Lippincott Co. (1979), pp. 367–369 beschrieben, dessen Offenbarung hiermit durch Verweis eingeschlossen wird]. Diese Befunde können in zusätzlichen Tests reproduziert werden, in welchen Sehnen/Ligament-ähnliche Gewebe in dem SDF-5 Protein beobachtet werden, welches Implantate enthält. Die SDF-5 Proteine dieser Erfindung können bezüglich Aktivität an diesem Test bewertet werden.
  • Beispiel 4
  • Expression von SDF-5
  • Um murine, humane oder andere Säugetier-SDF-5 Proteine herzustellen, wird die DNA, welche es codiert, in einen passenden Expressionsvektor übertragen und in Säugetierzellen oder andere bevorzugte eukaryontische oder prokaryontische Wirte durch herkömmliche gentechnische Verfahren eingeführt. Es wird erwogen, dass das bevorzugte Expressionssystem für biologisch wirksames, rekombiniertes, humanes SDF-5, stabil transformierte Säugetierzellen sein können.
  • Ein Fachmann kann Säugetier-Expressionsvektoren durch Einsetzen der Sequenz von SEQ ID Nr. 1 konstruieren, oder anderen DNA-Sequenzen, welche für SDF-5 Protein codieren, oder anderen modifizierten Sequenzen und bekannten Vektoren, wie pCD [Okayama et al., Mol. Cell Biol., 2: 161–170 (1982)], pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4: 645–653 (1985)] und pMT2 CXM.
  • Der Säugetier-Expressionsvektor pMT2 CXM ist ein Derivat von p91023(b) (Wong et al., Science 228: 810–815, 1985), welcher sich vom letzteren dadurch unterscheidet, dass er das Ampicillin-Resistenzgen anstelle des Tetracyclin-Resistenzgens enthält und ferner eine XhoI-Stelle zur Insertion von cDNA-Klons enthält. Die funktionellen Elemente von pMT2 CXM sind beschrieben worden (Kaufman, R. J., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 689–693) und schließen die Adenovirus VA-Gene, den SV40 Replikationsursprung einschließlich den 72 by Verstärker, den Adenovirus Major-Late-Promotor, einschließlich einer 5'-Spleiß-Stelle und das Meiste der Adeonovirus Tripartite Leitsequenz, welche an Adenovirus Late mRNAs vorhanden ist, eine 3'-Spleiß-Akzeptorstelle, ein DHFR-Insert, die SV40 Early Polyadenylierungsstelle (SV40) und pBR322 Sequenzen ein, welche zur Propagierung in E. coli notwendig sind.
  • Plasmid pMT2 CXM wird durch EcoRI-Verdau von pMT2-VWF erhalten, welcher bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD (USA) unter Eingangsnummer ATCC 67122 hinterlegt worden ist. EcoRI-Verdau schneidet das cDNA-Insert aus, welches in pMT2-VWF vorhanden ist, was pMT2 in linearer Form ergibt, welches ligiert und verwendet werden kann, um E. coli HB 101 oder DH-5 zu Ampicillinresistenz umzuwandeln. Plasmid pMT2 DNA kann durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden. pMT2 CXM wird dann unter Verwendung Loopout/in Mutagenese [Morinaga et al., Biotechnology 84: 636 (1984)) konstruiert. Dies entfernt Basen 1075 bis 1145 bezüglich der HindIII Stelle nahe dem SV40-Replikationsursprung und Verstärkersequenzen von pMT2. Zusätzlich insertiert es die folgende Sequenz:
    Figure 00510001
    an Nucleotid 1145. Diese Sequenz enthält die Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease XhoI. Ein Derivat von pMT2CXM mit der Bezeichnung pMT23 enthält Erkennungsstellen für die Restriktionsendonucleasen PstI, EcoRI, SalI und XhoI. Plasmid pMT2 CXM und pMT23 DNA kann durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden.
  • pEMC2β1, abgeleitet von pMT21, kann auch in der Praxis der Erfindung brauchbar sein. pMT21 wird von pMT2 abgeleitet, welches von pMT2-VWF abgeleitet wird. Wie oben beschrieben schneidet EcoRI-Verdau das cDNA-Insert aus, welches in pMT-VWF vorhanden ist, was pMT2 in linearer Form ergibt, welches ligiert und verwendet werden kann, um E, coli HB 101 oder DH-5 zu Ampicillin-Resistenz zu transformieren. Plasmid pMT2 DNA kann durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden.
  • pMT21 wird durch die folgenden zwei Modifikationen von pMT2 abgeleitet. Zuerst wird 76 by der 5' nicht-translatierten Region der DHFR cDNA einschließlich einer Strecke von 19 G Resten von G/C Tailing für cDNA Klonierung deletiert. In diesem Prozess wird eine XhoI-Stelle insertiert, um die folgende Sequenz direkt oberhalb von DHFR zu erhalten:
  • Figure 00520001
  • Zweitens wird eine einzigartige ClaI-Stelle durch Verdau mit EcoRV und XbaI Behandlung mit Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I und Ligation an einen ClaI-Linker (CATCGATG) eingeführt. Dies deletiert ein 250 by Segment aus der Adenovirus-assoziierten RNA (VAI) Region aber stört nicht VAI RNA Genexpression oder Funktion. pMT21 wird mit EcoRI und Xhol verdaut und verwendet, um den Vektor pEMC2B1 abzuleiten.
  • Ein Teil des EMCV-Leiters wird aus pMT2-ECATI [S. K. Jung et al., J. Virol 63: 1651–1660 (1989)] durch Verdau mit EcoRI und PstI erhalten, was ein 2752 by Fragment ergibt. Dieses Fragment wird mit TagI verdaut, was ein Eco RI-TagI Fragment von 508 by ergibt, welches durch Elektrophorese an niedrig schmelzendem Agarosegel gereinigt wird. Ein 68 by Adapter und sein komplementärer Strang werden mit einem 5' TagI hervortretenden Ende und einem 3' XhoI hervortretenden Ende synthetisiert, was die folgende Sequenz hat:
  • Figure 00520002
  • Diese Sequenz passt zur EMC-Virus Leitsequenz von Nucleotid 763 bis 827. Sie verändert auch das ATG an Position 10 innerhalb des EMC Virusleiters zu einem ATT und ihr folgt eine Xhol-Stelle. Eine Drei-Wege Ligation des pMT21 EcoRI-16hoI Fragments, des EMC Virus EcoRI-TagI Fragments und des 68 by Oligonucleotid-Adapters TagI-16hoI Adapters ergibt den Vektor pEMC2β1.
  • Dieser Vektor enthält den SV40 Replikationsursprung und Ver stärker, den Adenovirus Major-Late-Promotor, eine cDNA Kopie des Meisten der Adenovirus-Tripartite-Leitsequenz, eine kleine Hybrid-intervenierende Sequenz, ein SV40 Polyadenylierungssignal und das Adenovirus VA I Gen, DHFR und β-Lactamasemarker und eine EMC-Sequenz in passenden Verhältnissen, um die hochgradige Expression der gewünschten cDNA in Säugetierzellen zu steuern.
  • Die Konstruktion von Vektoren kann Modifikation der SDF-5 DNA-Sequenzen einbeziehen. Zum Beispiel kann SDF-5 cDNA durch Entfernen der nicht-codierenden Nucleotide an den 5' und 3' Enden der Codierungsregion modifiziert werden. Die deletierten nicht-codierenden Nucleotide können durch andere Sequenzen ersetzt werden oder nicht, von welchen bekannt ist, dass sie der Expression zuträglich sind. Diese Vektoren werden zur Expression von SDF-5 Proteinen in passende Wirtszellen transformiert. Zusätzlich kann die Sequenz von SEQ ID Nr. 1 oder andere Sequenzen, welche für SDF-5 Proteine codieren, manipuliert werden, um ein reifes SDF-5 Protein zu exprimieren, durch Deletieren von SDF-5 Propeptidsequenzen und ihr Ersetzen durch Sequenzen, welche für die vollständigen Propeptide von anderen sekretierten Proteinen codieren.
  • Ein Fachmann kann die Sequenzen von SEQ ID Nr. 1 durch Eliminieren oder Ersetzen der Säugetier-regulatorischen Sequenzen, welche die Codierungssequenz flankieren, mit bakteriellen Sequenzen manipulieren, um bakterielle Vektoren zur intrazellulären oder extrazellulären Expression durch bakterielle Zellen zu erzeugen. Zum Beispiel könnte die Codierungssequenz weiter manipuliert werden (z. B. ligiert an andere bekannte Linker oder modifiziert durch Deletieren von nicht-codierenden Sequenzen daraus oder Verändern von Nucleotiden darin durch andere bekannte Techniken). Die modifizierte für SDF-5 codierende Sequenz könnte dann in einen bekannten bakteriellen Vektor unter Verwendung von Verfahren insertiert werden, wie in T. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5230–5233 (1980) beschrieben. Dieser exemplarische bakterielle Vektor könnte dann in bakterielle Wirtszellen transformiert werden und dadurch ein SDF-5 Protein exprimieren. Für eine Strategie zum Herstellen extrazellulärer Expression von SDF-5 Proteinen in bakteriellen Zellen siehe z. B. Europäische Patentanmeldung EPA-177343.
  • Ähnliche Manipulationen können für die Konstruktion eines Insektenvektors [siehe z. B. Verfahren, welche in veröffentlichter Europäischer Patentanmeldung 155476 beschrieben werden] zur Expression in Insektenzellen durchgeführt werden. Ein Hefevektor könnte ebenfalls konstruiert werden, der Regulatorsequenzen von Hefe für intrazelluläre oder extrazelluläre Expression der Faktoren der vorliegenden Erfindung durch Hefezellen einsetzt [siehe z. B. in veröffentlichter PCT-Anmeldung WO-86/00639 und Europäischer Patentanmeldung EPA-123289 beschriebene Verfahren].
  • Ein Verfahren zum Herstellen von großen Mengen eines SDF-5 Proteins der Erfindung in Säugetierzellen kann die Konstruktion von Zellen einbeziehen, welche multiple Kopien des heterologen SDF-5 Gens enthalten. Das heterologe Gen ist an einen amplifizierbaren Marker gebunden, z. B. das Dihydrofolat-Reduktase (DHFR)-Gen, für welches Zellen, welche erhöhte Genkopien enthalten, zur Propagierung in steigenden Konzentrationen von Methotrexat (MTX) gemäß den Verfahren von Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601–692 (1982) selektiert werden können. Diese Herangehensweise kann bei einer Anzahl an unterschiedlichen Zelltypen eingesetzt werden.
  • Zum Beispiel können ein Plasmid, welches eine DNA-Sequenz für ein SDF-5 Protein der Erfindung in operativer Assoziation mit anderen Plasmidsequenzen enthält, welche Expression davon ermöglichen und das DHFR-Expressionsplasmid pAdA26SV(A)3 [Kaufman und Sharp, Mol. Cell. Biol., 2: 1304 (1982)] in DHFR-defiziente CHO-Zellen, DUKX-BII durch verschiedene Verfahren, einschließlich Calciumphosphat-Co-Ausfällung und Transfektion, Elektroporation oder Protoplastenfusion co-eingeführt werden. DHFR exprimierende Transformanten werden bezüglich Wachstum in Alpha-Medien mit dialysiertem fötalen Rinderserum selektiert und nachfolgend bezüglich Amplifikation durch Wachstum in steigenden Konzentrationen von MTX (z. B. aufeinanderfolgenden Schritten in 0,02, 0,2, 1,0 und 5 μM MTX) wie in Kaufman et al., Mol. Cell Biol., 5: 1750 (1983) beschrieben selektiert. Die Transformanten werden kloniert und biologisch wirksame SDF-5 Expression wird durch den oben in Beispiel 3 beschriebenen, Rosen-modifizierten Sampath-Reddi Rattenknochenbildungstest überwacht. SDF-5 Proteinexpression sollte mit steigenden Graden von MTX-Resistenz steigen. SDF-5 Polypeptide werden unter Verwendung von nach Stand der Technik bekannten Standardtechniken wie Pulsmarkierung mit [35S] Methionin oder Cystein und Polyacrylamidgel-Elektrophorese gekennzeichnet. Ähnlichen Verfahren kann gefolgt werden, um andere verwandte Proteine herzustellen.
  • Beispiel 5
  • Biologische Aktivität von exprimiertem SDF-5
  • Um die biologische Aktivität der in Beispiel 4 oben erhaltenen exprimierten SDF-5-Proteine zu messen, werden die Proteine aus den Kulturmedien gewonnen und gereinigt, indem man SDF-5 Proteine von anderen proteinartigen Materialien isoliert, mit welchen sie gemeinsam hergestellt werden, als auch von anderen Verunreinigungen. Die gereinigten Proteine können gemäß dem in Beispiel 3 beschriebenen Rattenknochenbildungstest und anderen hierin beschriebenen Tests getestet werden.
  • Die Reinigung wird unter Verwendung von den Fachleuten bekannten Standardtechniken durchgeführt.
  • Die Proteinanalyse wird unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, wie SDS-PAGE Acrylamid [Laemmli, Nature 227: 680 (1970)], mit Silber gefärbt [Oakley et al., Anal. Biochem. 105: 361 (1980)] und durch Immunoblot [Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350 (1979)].
  • Beispiel 6
  • Unter Verwendung von Northern-Analyse können SDF-5 Proteine bezüglich ihrer Wirkungen auf verschiedene Zelllinien getestet werden. Geeignete Zelllinien schließen jene ein, welche von E13 Mausgliedknospen abgeleitet werden. Nach 10 Tagen Behandlung mit SDF-5 Protein wird der Zell-Phenotyp histologisch bezüglich Anzeichen für Gewebedifferentiation untersucht. Zusätzlich kann Northern-Analyse von mRNA aus mit SDF-5 Protein behandelten Zellen für verschiedene Marker durchgeführt werden, einschließlich einem oder mehreren der folgenden Marker für Knochen, Knorpel und/oder Sehnen/Ligament, wie in Tabelle IV beschrieben:
  • Tabelle IV
    Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Beispiel 7
  • Expressionsanalyse
  • In situ Hybridisierung wurde verwendet, um SDF-5 mRNA in Sektionen 10,5–15,5 dpc Mausembryonen zu lokalisieren. SDF-5 wurde in den sich entwickelnden Gelenken des appendikularen Skeletts und in einigen Sehnen und Ligamenten exprimiert. Es wurde keine Expression in den Knochen des axialen oder appendikularen Skeletts oder in Muskel nachgewiesen. Diese offensichtlichen Beobachtungen weisen stark auf SDF-5 in Bindegewebebildung hin. Von diesen Ergebnissen erschien es sehr wahrscheinlich, dass Knorpelbildung durch SDF-5 reguliert würde und diese Information war die Basis zur Bewertung dieses Proteins unter Verwendung von in vitro Tests.
  • In vitro Aktivität
  • Murine SDF-5 wurde in CHO-Zellen exprimiert. MLB13MYC-Klon 14 Zellen wurden zu Konfluenz wachsen gelassen und mit entweder SDF-5, BMP-2, einer Kombination aus SDF-5 und BMP-2 oder gar nicht behandelt. SDF-5 enthaltendes CHO-konditioniertes Medium wurde bei einer 1 : 20 Verdünnung (~10 ng/ml Endkonzentration) verwendet und Schein-konditioniertes Medium von CHO-Zellen wurde zu BMP-2 und nicht behandelten Zellkulturen zugegeben. BMP-2 wurde bei 100 ng/ml verwendet. Nach vier Tagen wurde die RNA geerntet und Genexpression durch einen GeneChip 50 Scanner (Affymetrix) analysiert. In unbehandelten oder mit SDF-5 behandelten Zellen gab es keine nachweisbare Expression von Genmerkmalen eines Knochen- oder Knorpel-Phenotyps. BMP-2 induzierte die Expression von hypertrophen Knorpel- und Knochenmarkergenen, zusammen mit niedrigen knorpelartigen Markern. In Zellen, welche mit einer Kombination von sowohl SDF-5, als auch BMP-2 behandelt wurden, waren Knochen (Osteocalcin: alkalische Phosphatase; PTH/PTHrP Rezeptor) und hypertrophe Knorpelmarker (Typ X Collagen) deutlich verringert oder abwesend und Marker für Knorpel (Collagen Typen II und IX; Decorin; Aggrecan) waren im Vergleich zu BMP-2 allein erhöht. Diese Wirkung ist ähnlich jener, welche vorhergehend für die Kombination von PTHrP und BMP-2 beobachtet wurde, außer, dass es größere Verstärkung von Knorpel-Phenotyp mit der SDF-5 Kombination zu geben scheint.
  • Beispiel 8
  • Embryonaler Stammzellentest
  • Um die Wirkungen der SDF-5 Proteine der vorliegenden Erfindung zu testen, ist es möglich, die Wachstums- und Differentiationswirkungen in vitro in einer Anzahl an verfügbaren embryonalen Stammzelllinen zu testen. Eine solche Zelllinie ist ES-E14T-G2, welche von der American Type Culture Collection in Rockville, Md erhältlich ist.
  • Um den Test durchzuführen, können die Zellen in Gegenwart von 100 Einheiten LIF propagiert werden, um sie in einem undifferenzierten Zustand zu halten. Die Tests werden durch zuerst Entfernen der LIF und Aggregieren der Zellen in Suspension, in etwas, das als Embryoid-Körper bekannt ist, angesetzt. Nach 3 Tagen werden die Embryoid-Körper auf mit Gelatine überzogene Schalen (12 Mulden Schalen zur PCR-Analyse, 24 Mulden Schalen für Immuncytochemie) plattiert und mit den zu testenden Proteinen behandelt. Die Zellen werden mit Nahrung versorgt und alle 2–3 Tage mit dem Proteinfaktor behandelt. Die Zellen können adaptiert werden, so dass Tests in Medien durchgeführt werden können, die mit 15 fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wurden, oder mit CDM-definierten Medien, die viel geringere Mengen an FBS enthalten.
  • Am Ende des Behandlungszeitraums (im Bereich von 7–21 Tagen) wird die RNA aus den Zellen geerntet und durch quantitative Multiplex PCR für die folgenden Marker analysiert: Brachyury, ein mesodermaler Marker, AP-2, ein ektodermaler Marker und HNF-3α, ein endodermaler Marker. Durch Immuncytochemie ist es ebenfalls möglich, die Differentiation von neuronalen Zellen (Glia und Neuronen), Muskelzellen (Cardiomyozyten, Skelett und Glattmuskel) und verschiedene andere Phenotyp-Marker wie Proteoglycan-Kernprotein (Knorpel) und Zytokeratine (Epidermis) nachzuweisen.
  • Da alle diese Zellen dazu neigen, autonom zu differenzieren, wenn LIF entfernt wird, werden die Ergebnisse immer durch Vergleich mit einer unbehandelten Kontrolle quantifiziert.
  • Die vorhergehenden Beschreibungen führen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung detailliert aus. Es wird erwartet, dass zahlreiche Modifikationen und Variationen in der Praxis davon bei den Fachleuten bei Erwägung dieser Beschreibungen auftreten werden. Es wird angenommen, dass jene Modifikationen und Variationen innerhalb der hieran angehängten Ansprüche umfasst werden.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001

Claims (13)

  1. DNA-Molekül, welches eine DNA-Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Nukleotiden #256, 307, 310, 313, 316, 319, 322, 325 oder 328 bis #1140 oder 1143 von SEQ ID Nr. 1; (b) Nucleotiden, codierend für Aminosäuren #1, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 bis #295 von SEQ ID Nr. 2; (c) Nucleotiden, codierend für Aminosäuren #1 bis #275 von SEQ ID Nr. 3; und (d) äquivalenten degenerativen Codonsequenzen von einem von (a) bis (c);
  2. DNA-Molekül gemäß Anspruch 1, umfassend ferner eine Nucleotidsequenz, codierend für ein geeignetes Signalpeptid 5' zu und gebunden im Rahmen an die DNA-Codierungssequenz.
  3. Vektor, welcher das DNA-Molekül von Anspruch 1 oder 2 in operativer Assoziation mit einer Expressionskontrollsequenz dafür umfasst.
  4. Wirtszelle, welche mit dem Vektor von Anspruch 3 transformiert ist.
  5. Verfahren zum Herstellen von humanem SDF-5 Polypeptid, wobei besagtes Verfahren die Schritte umfasst: (a) Kultivieren einer Wirtszelle, welche mit dem DNA-Molekül von Anspruch 1 oder 2 oder dem Vektor von Anspruch 3 transformiert ist; und (b) Gewinnen und Reinigen des besagtem humanen SDF-5 Proteins aus dem Kulturmedium.
  6. Humanes SD-5 Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR. 2 oder SEQ ID Nr. 3 umfasst oder durch ein DNA-Molekül von Anspruch 1 oder 2 codiert wird oder durch die Schritte des Verfahrens von Anspruch 5 hergestellt wird.
  7. Humanes SDF-5 Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 30 bis etwa 35 kD, wobei besagtes Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 3 umfasst und welches die Fähigkeit hat, die Transkription von einem oder mehreren Genen zu regulieren.
  8. Zusammensetzung, welche mindestens ein humanes SDF-5 Polypeptid gemäß Anspruch 6 oder 7 umfasst.
  9. Verwendung des SDF-5 Polypeptids nach Anspruch 6 oder 7 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die prophylaktische Behandlung von Rheumatoidarthritis, Osteoarthritis, Knorpelverletzung, Wundheilung oder verwandter Gewebereparatur, oder für die Behandlung von Störungen von Knorpel oder Bindegewebe.
  10. Antikörper zum humanen SDF-5 Polypeptid von Anspruch 6 oder 7.
  11. Verfahren in vitro zum Steigern der Differentiation von Zellen in Chondrozyten, wobei besagtes Verfahren Anwenden einer Zusammensetzung umfasst, welche BMP-2 und das Polypeptid von Anspruch 6 oder 7 umfasst.
  12. Verwendung von BMP-2 und dem Polypeptid von Anspruch 6 oder 7 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Steigern der Differentiation von Zellen in Chondrozyten, wobei besagte Zusammensetzung gegebenenfalls einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und/oder Verdünnungsmittel umfasst.
  13. Zusammensetzung nach Anspruch 8, welche eine pharmazeutische Zusammensetzung ist, welche gegebenenfalls einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und/oder Verdünnungsmittel umfasst.
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