KR20000070879A - 인간 에스디에프-5 단백질 및 조성물 - Google Patents

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protein
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human sdf
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sdf
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라발리에드워드알.
레이시리사에이.
Original Assignee
브루스 엠. 에이센, 토마스 제이 데스로저
제네틱스 인스티튜트, 인코포레이티드
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Abstract

정제된 인간 SDF-5 단백질 및 이의 제조방법이 개시된다. 또한 인간 SDF-5 단백질을 코딩하는 DNA 분자가 개시된다. 단백질은 Wnt 유전자의 이들의 수용체에 결합하는 것을 조절하는데 사용된다. 바람직한 구현예로서, 단백질은 연골세포 및/또는 연골 조직의 형성, 성장, 분화, 증식 및/또는 유지를 유도하고, 다른 조직 치유, 예컨대 췌장조직 치유에 사용할 수 있다.

Description

인간 에스디에프-5 단백질 및 조성물 {HUMAN SDF-5 PROTEIN AND COMPOSITIONS}
연골 및 연결조직과 같은 조직 및 기관의 형성, 증식, 분화 및 유지에 관여하는 분자 또는 분자들에 대한 연구가, 골관절염과 같은 조직의 분해 또는 손상을 수반하는 상태의 치료에 유용한 인자가 상당히 필요하였기 때문에 광범위하게 실행되어 왔다.
프리질드(Frizzled)로 명명된 패밀리에서의 여러 단백질의 구조는 이미 설명되어져 있다. 본 발명은 프리즐드 단백질의 리간드 결합 도메인과 상동성을 공유하는, 프라즐드로 명명된 단백질 패밀리에 관한 것이다. 프리즐드 단백질 패밀리 멤버는 초파리 윙리스(Wg) 단백질에 결합하는 것으로 알려졌다. Bhanot et al., Nature, 382:225-230 (1996). 포유류 및 기타 종에서, 단백질의 프리즐드 패밀리는 Wnt 유전자의 패밀리에 의해 생성되는 단백질에 결합하는 것으로 알려진 막결합수용체 분자이다. Wang et al., J.Biol.Chem., 271:4468-4476(1996). Wnt 유전자는 췌장, 폐, 간,신장 및 뇌를 포함한 조직 및 기관에서 발현되는 것으로 결정되었다.
본발명의 요약
본 발명자는 놀랍게도 프라즐드 단백질 패밀리의 멤버는 연골세포 및/또는 연골 조직의 형성을 유도할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 본발명은 프라즐드 단백질 패밀리의 하나인 1 종이상의 단백질을 함유하는 조성물을 근원세포에 투여하는 것을 특징으로 하는, 연골세포 및/또는 연골 조직의 형성을 유도하는 방법을 제공한다. 바람직한 구현예로, 조성물은 아미노산 1, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 내지 295 의 SEQ ID NO : 2 의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 함유할 수 있고; 바람직한 구현예로, 본 발명은 아미노산 21 내지 295 의 SEQ ID NO : 1 또는 아미노산 1 내지 275 의 SEQ ID NO : 3 의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 함유한다. 하나의 구현예로, 본 방법은 생체내에서 환자에게 상기 조성물을 투여하는 것을 특징으로 한다. 이와는 달리, 본 방법은 시험관에서 세포에 상기 조성물을 투여하고, 연골세포 및/또는 연골 조직을 회수한후 환자에게 투여하는 것으로 구성될 수 있다. 조성물은 추가로 투여에 적합한 담체를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 프라즐드 및 프리즐드 단백질 패밀리의 새로운 멤버를 코딩하는 신규의 DNA 서열을 제공한다, 구체적인 구현예로, 본 발명은 인간 SDF-5 로 알려진 프라질드 단백질을 코딩하는 신규의 DNA 서열을 제공한다. 이러한 DNA 서열에 의해 코딩되는 뉴클레오티드 서열 및 대응하는 아미노산 서열은 서열목록에 제공되어 있다. 특히, 본 발명은 SEQ ID NO : 1 의 뉴클레오티드 #256, 307, 310, 313, 316, 319, 322, 325 또는 328 내지 #1140; 또는 SEQ ID NO : 2 의 아미노산 #1, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 내지 #295 를 코딩하는 뉴클레오티드; 또는 SEQ ID NO : 3 의 아미노산 #1 내지 #275 을 코딩하는 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택한 DNA 서열을 함유하는 인간 SDF-5 단백질을 코딩하는 단리된 DNA 서열 및 상기에서 용이하게 입수할 수 있고 프라즐드 활성을 갖는 상기 서열의 단편 및 변종을 함유한다. 본 발명은 추가로 엄격한 하이브리드화 조건하 상기 서열과 하이브리다이즈하고 프라즐드 활성을 보이는 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다.
다른 구현예로, 본 발명은 발현 조절 서열과 기능적으로 연계된 상기 DNA 분자를 함유하는 벡터 및 이러한 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 포함한다. 또 다른 구현예로, 본 발명은 정제된 인간 SDF-5 단백질의 제조방법, 신규의 인간 SDF-5 단백질 및 인간 SDF-5 단백질을 함유하는 조성물을 포함한다. 이러한 방법은 이하의 단계로 이루어질 수 있다 : 상기에서 기술한 바와 같은 인간 SDF-5 단백질을 코딩하는 DNA 서열로 형질전환된 숙주세포의 배양; 및 배양 배지로부터 상기 인간 SDF-5 단백질을 정제 및 회수하는 단계. 본 발명은 상기 방법으로 생성되는 정제된 인간 SDF-5 폴리펩티드, 및 상기 DNA 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 함유하는 정제된 인간 SDF-5 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본 발명의 단백질은 SEQ ID NO : 2 의 아미노산 #1, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 내지 #295 의 아미노산 서열; SEQ ID NO : 3 의 아미노산 #1 내지 #275 의 아미노산 서열; 또는 약 30 내지 약 35kd 의 분자량을 갖는 인간 SDF-5 단백질 (이 단백질은 SEQ ID NO : 2 또는 3 의 아미노산 서열을 함유하고, 하나이상의 유전자의 전사의 조절능을 갖는다)을 함유할 수 있다.
본 발명은 또한 SDF-5 단백질을 함유하는 유효량의 조성물을 환자에게 투여하는 것을 특징으로하는, 환자에게서 연골성 조직의 유지 또는 형성을 유도하는 방법을 포함한다. 상기 조성물은 하나이상의 골형성 단백질 (BMP), 바람직하게는 BMP-2, BMP-4, BMP-7, MP52, BMP-12 및 BMP-13 로부터 선택된 BMP, 가장 바람직하게는 BMP-2 를 추가로 함유할 수 있다. 이 방법은 골관절염 또는 관절 연골 결함 또는 손상을 입은 환자의 치료에 사용될 수 있다
서열의 설명
SEQ ID NO : 1 인간 SDF-5 DNA
SEQ ID NO : 2 인간 SDF-5 단백질
SEQ ID NO : 3 인간 SDF-5 성숙 단백질
기탁의 설명
인간 SDF-5 DNA 코딩 서열을 함유하는 cDNA 삽입(insert)pSDF-5 를 암피실린 대장균에 삽입시켜, ATCC 에 기탁하였다 (미국 메릴랜드 로크빌 파크론 드라이브 12301; 1997년 2월 4일). 이 기탁은 기탁번호 ATCC 98314 로 등록되었다. 이 기탁은 부다페스트 조약의 요건을 충족시킨다.
본 출원은 1997.2.6 일자로 출원된 출원 시리얼 번호 08/796,153 의 연속일부출원인, 1997.5.8 일자로 출원된 출원시리얼 번호 08/848,439 의 연속일부 출원이다.
본 발명은 프라질드(Frazzled) 단백질 패밀리의 새로운 멤버, 이를 코딩하는 DNA, 및 이의 수득방법에 관한 것이다. 이러한 단백질은 조직 및 기관에서의 인자의 발현 및/또는 조직 및 기관의 분화의 유도, 특히 연골세포 및/또는 연골 조직의 형성, 성장, 분화, 증식 및/또는 유지를 유도하는 데 사용할 수 있다. 따라서, 이러한 단백질은 연골 장애, 예컨대 골관절염, 류마티스 관절염, 관절 연골 결함의 치료, 및 기타 조직 및 기관, 예컨대 췌장, 간, 비장, 폐, 신장 및/또는 기타 조직의 세포형성, 성장, 분화, 증식 및/또는 유지의 강화 및/또는 억제에 유용할 수 있다. 이러한 단백질은 또한 기타 조직 재생 및 분화 인자의 활성을 증가시키는데 유용할 것이다. 이 단백질은 발명자에 의해 인간 SDF-5 로 명명되었다.
여기 사용하는 용어 "프라즐드 단백질(Frazzled protein)" 는 Hfz3, Hfz5, 및 Hfz7 를 포함한 프리즐드 단백질 패밀리의 세포외결합 도메인과 서열상동성을 갖는 인간 프라즐드 단백질 멤버 및 기타 인간 프라즐드 단백질 및 다른 종에서 발견되는 프라즐드 단백질 멤버를 의미하고, Wang et al., Wang et al., J.Biol.Chem., 271:4468-4476 (1996) 에 기재되어 있는 것과 같은 다른 종에서 유래한 프리즐드 단백질에 대한 서열 상동성을 공유한다. 프라즐드 단백질 패밀리중 하나의 특이적 멤버는 SEQ ID NO : 2 에 상술되어 있는 아미노산 서열, 및 다른 종들에서 발견되는 상기 단백질의 상동체를 갖는 인간SDF-5 단백질; 및 구조적으로/또는 기능적으로 SDF-5 와 밀접하게 연관된 다른 단백질들이다. 프라즐드 관련 단백질은 또한 초파리, 제노퍼스(Xenopus), 씨. 엘라간스(C.elegans), 제브라피쉬 및 쥐, 마우스 및 인간내 페밀리 멤버를 포함한 다른 종들에 존재함이 알려져 있다. "프라즐드 단백질" 은 또한 대립 유전자 (allelic) 변종 또는 돌연변이 또는 결실로 유도된 변종과 같은 프라즐드 단백질의 변종, 및 변종 및 단편이 프라즐드 활성, 바람직하게는 프리즐드 단백질과 같은 막결합수용체에 결합하는,Wnt 단백질과 같은 단백질에 결합하는 능력을 보유한 프라즐드 또는 프리즐드 단백질의 단편을 포함한다.
여기에서 사용하는 , 용어 "프라즐드 활성" 은 본 발명의 프라즐드 단백질에 의해 발휘되는 하나이상의 활성을 의미한다. 특히, "프라즐드 활성" 에는 Wnt 단백질에 결합하는 능력이 포함되고, 따라서 프리즐드 단백질 수용체와 같은 단백질 수용체에 대한 Wnt 단백질의 결합을 조절하는 능력이 포함될 수 있다. "프라즐드 활성" 은 추가로 세포 및/또는 조직, 예컨대 연결 조직, 기관 및 아무는 상처의 형성, 분화, 증식 및/또는 유지를 조절하는 능력을 포함한다. 특히, "프라즐드 활성"은 연골세포 및/또는 연골 조직의 형성, 성장, 증식, 분화 및/또는 유지를 강화 및/또는 억제하는 능력을 포함할 수 있다. "프라즐드 활성" 은 또한 여기에 기재되어 있는 분석에서의 프라즐드 단백질의 활성들을 포함한다.
따라서, 본 발명은 프라즐드 활성을 보유하는 SEQ ID NO : 2 또는 3 에 나타낸 인간 SDF-5 단백질의 아미노산 서열의 단백질 변종 및 기능성 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 상기와 같은 정제된 인간 SDF-5 단백질에 대한 항체를 포함한다. 본 발명의 조성물은 치료량의 상기 인간 SDF-5 단백질의 하나이상을 함유한다.
CHO 세포와 같은 포유류 세포에 의해 발현되는 인간 SDF-5 단백질은 다양한 N-말단을 갖는 인간 SDF-5 단백질의 활성종의 이질군으로서 존재하리라 기대된다. 부분적으로 Von Heginje 시그널 펩티드 예상 알고리즘에 기초하여, 처음 17 내지 24 아미노산은 성숙 펩티드의 분비를 위한 시그널링에 관여하는 것으로 보인다. 활성종은 시그널 펩티드를 임의적으로 포함할 수 있으며, SEQ ID NO : 2 의 아미노산 잔기 #1,18,19,20,21,22,23,24 또는 25 로 시작하는 아미노산 서열을 포함할 것이 기대된다. 따라서, 활성 인간 SDF-5 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 SEQ ID NO 1:의 뉴클레오티드 #256, 307, 310, 313, 316, 319, 322, 325 또는 328 내지 #1140 을 함유하는 DNA 서열을 포함함이 기대된다. 따라서, SDF-5 의 활성종은 SEQ ID NO 2:의 아미노산 #1,18,19,20,21,22,23,24 또는 25 내지 295 를 함유하는 활성종을 포함하리라 기대된다.
다른 구현예로, 본 발명은 유전자의 조절을 필요로 하는 환자에게 유효량의 상기 조성물을 투여하는 것을 특징으로하는 상기 환자에서의 유전자 조절을 변경하는 방법을 포함한다. 췌장 유전자의 조절 변경은 수용체 단백질의 Wnt 단백질에 의한 결합, 예컨대, 본 발명의 인간 SDF-5 단백질과 Wnt 단백질 사이의 결합을 자극하거나 억제하여 수행할 수 있다. 따라서, 인간 SDF-5 단백질 패밀리는 Wnt 유전자의 수용체 단백질, 예컨대 프리즐드 수용체 단백질에 대한 결합 상호작용을 조절할 수 있다.
본 발명은 또한 프로모터 또는 오퍼레터와 같은 조직 특이적 또는 유도성 조절 서열과 연계된 본발명의 코딩 DNA 서열 및 다른 프라즐드 코딩서열을 함유하는 하이브리드 또는 융합 벡터를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예로, 인간 SDF-5 단백질의 코딩 서열은 연골세포 및/또는 연골조직에서 선택적으로 발현되는 유전자 유래의 하나이상의 프로모터, 인핸서 및/또는 기타 조절 요소에 기능적으로 연결되어 있다. 예컨대, 간엽 응축동안의 연골 및 연골에서 발현되는 것으로 공지된 콜라겐 형 II 인핸서 프로모터. Metsaranta et al., Dev.Dynamics, 204:202-210 (1996); Li et al., Genes Develop., 9:2821-2830 (1996). 본 발명에서 유용한 또 하나의 조절 요소는 테나신 (tenascin) C 프로모터이다. 테나신 C 는 관절 연골에서 발현된다. Pacifici et al., Matrix Biol., 14:689-698. 추가로, 인간 SDF-5 를 코딩하는 DNA 서열은 연골세포 및/또는 연골 조직에서 선택적으로 생산되는 프로테오글리칸 코어 단백질유래의 하나이상의 조절 서열에 기능적으로 연계될 수 있다. 본발명의 다른 바람직한 구현예로, 인간 SDF-5 단백질에 대한 코딩서열은 IDX 유전자로부터 단리된 프로모터에 기능적으로 연계된다. 이 프로모터는 췌장 세포 및 조직에서 선택적으로 발현된다. 따라서 인간 SDF-5 단백질을 코딩하는 DNA 서열에 IDX 프로모터가 기능적으로 연계된 하이브리드 DNA 벡터가 췌장 조직에서 단백질의 선택적 발현, 예컨대 환자에 있어서 췌장 장애의 치료 또는 췌장 유전자의 조절 변경, 예컨대 이의 수용체 단백질의 Wnt 단백질에 의한 결합, 예컨대 발현된 인간 SDF-5 단백질 및 Wnt 단백질 사이의 결합에 의한 결합을 자극하거나 억제하는데 유용하다. 또한 기타 조직-선택성 조절 요소 및 유도성 조절 요소를 이용한 벡터가 본 발명의 인간 SDF-5 단백질의 선택적 또는 유도성 발현을 위해 유용할 수 있다.
본 발명의 또 하나의 태양은 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체에 치료학적으로 유효한 양의 인간 SDF-5 단백질을 함유하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 이러한 조성물은 연골세포 및/또는 연골 조직 표현형의 형성에서 사용할 수 있다. 이러한 조성물은 추가로 베타 세포, 및 랑게한스 또는 기타 췌장 세포의 섬에서 전형적으로 발견되는 다른 세포유형, 및 간, 비장, 뇌, 허파, 심장 및 신장 조직과 같은 기타 기관 조직의 형성, 성장, 증식, 분화 및/또는 유지를 강화 및/또는 억제하는데 사용할 수 있다. 인간 SDF-5 단백질을 함유하는 조성물은, 예컨대 췌장 세포와 같은 분화된 조직 또는 기관을 함유하는 세포로 분화될 수 있는 췌장 기간 세포와 같은 기간세포 또는 전구체를 처리하여 상기와 같은 세포, 조직 또는 기관의 형성, 분화, 증식 및/또는 유지를 강화시키는데 사용할 수 있다. 이러한 세포의 형성 및 유지 방법은 예컨대, WO93/00441 에 기재되어 있으며, 이의 개시는 여기에 참고로 포함되어 있다.
본 발명의 조성물은 인간 SDF-5 단백질외에 표피성장인자 (EGF), 섬유아세포성장인자 (FGF), 전환성장인자 (TGF-α및 TGF-β), 액티빈, 인히빈, 골형성단백질 (BMP) 및 인슐린유사 성장인자 (IGF) 와 같은 성장인자를 포함한 기타 치료학적으로 유용한 제제를 함유할 수 있다. 조성물은 또한 예컨대, 조성물을 지지하고 연골세포 및/또는 연골 조직 성장을 위한 표면을 제공하기 위하여 적당한 매트릭스를 포함할 수 있다. 이 매트릭스는 인간 SDF-5 단백질의 서방 및/또는 이의 제공을 위한 적당한 환경을 프리젠테이션(presentation)할 수 있다.
인간 SDF-5 단백질을 함유하는 조성물은 수많은 조직 결함의 치료, 및 다양한 유형의 조직 및 상처의 치료 및 유지하는 방법에 사용할 수 있다. 치료될 수 있는 조직 및 상처에는 연골이 포함되나, 또한 표피, 신경, 심장 근육을 포함한 근육, 기타 연결 조직, 예컨대 골, 건 및 인대 및 기타 조직 및 상처, 및 기타 기관, 예컨대, 췌장, 간, 비장, 허파, 뇌, 심장 및 신장 조직이 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 이런 방법은 조직 형성, 상처 치료 또는 조직 치유가 필요한 환자에게 유효량의 인간 SDF-5 단백질을 투여하는 것을 수반한다. 인간 SDF-5 을 함유하는 조성물은 또한 류마티스관절염, 골관절염 및 연골, 또는 췌장, 간, 비장, 허파, 심장, 뇌 및 신장 조직과 같은 기타 기관 또는 조직의 비정상과 같은 상태 및 기타 조직 및 기관의 치료 또는 예방에 사용할 수 있다. 이러한 방법에는 또한 하나이상의 기타 단백질, 예컨대 EGF, FGF, TGF-α, TGF-β, BMP, 액티빈, 인히빈 및 IGF 를 포함한 성장인자의 투여를 병행하여 본 발명의 단백질을 투여하는 것이 수반될 수 있다.
본 발명의 또 하나의 태양은 인간 SDF-5 단백질의 발현을 코딩하는 DNA 서열이다. 이러한 서열에는 SEQ ID NO : 1 에 설명되어 있는 5' →3' 배향의 뉴클레오티드를 포함하며, 이 DNA 서열은 유전 코드의 축중을 제외하며, DNA 서열 SEQ ID NO : 1 과 일치하고 SEQ ID NO : 2 또는 3 의 단백질을 코딩한다. 본 발명에는 엄격한 조건하 SEQ ID NO : 1 의 DNA 서열과 하이브리다이즈하고 하나이상의 Wnt 단백질에 결합하는 능력을 갖는 단백질을 코딩하고/거나 인슐린생산 베타 세포와같은 췌장 세포, 또는 간,비장, 허파, 심장, 뇌 및 신장 조직과 같은 기타 기관 조직의 형성, 성장, 증식, 분화, 유지를 강화시키고/거나 억제하는 능력을 갖은 DNA 서열이 추가로 포함된다. 바람직한 DNA 서열에는 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA 서열이 포함된다 [참조, T.Maniatis et al, Molecular Cloning (A laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), pages 387 -389]. 이러한 DNA 서열은 SEQ ID NO : 2 또는 3 에 나타낸 성숙 인간 SDF-5 아미노 산 서열에 대해 적어도 약 80% 의 상동성, 좀더 바람직하게는 적어도 약 90% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것이 일반적으로 바람직하다., 최종적으로, SEQ ID NO : 1 의 서열의 대립 유전자 또는 기타 변종은, 이러한 뉴클레오티드 변화가 펩티드 서열에서의 변화를 초래하는 것에 무관하게, 그러나 펩티드 서열이 여전히 프라즐드 활성을 갖는 경우, 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 또한 프라즐드 단백질의 활성을 보유하는 폴리펩티드를 코딩하는 SEQ ID NO : 1 에 나타낸 인간 SDF-5 단백질의 DNA 서열의 기능적 단편을 포함한다. 본 발명의 인간 SDF-5 단백질의 특정 변종 또는 단편, 예컨대 SEQ ID NO : 2 또는 3 에 나타낸 것들이 프라즐드 활성을 유지하는지의 결정은 여기에 기재된 분석을 이용하여 정례적으로 실행한다.
본 발명의 DNA 서열은, 예컨대, 주어진 세포 군내 기타 프라즐드 단백질을 코딩하는 mRNA 의 검출을 위한 프로브로서 유용하다. DNA 서열은 또한 후술되는 바와 같이 유전자 치료용 벡터의 제조에 유용할 수 있다.
본 발명의 추가의 태양에는 발현조절서열과 기능적으로 연계된 전술한 바와 같은 DNA 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 이러한 벡터는 발현조절서열과 기능적으로 연계된 인간 SDF-5 단백질을 코딩하는 DNA 서열로 형질전환된 세포주를 적당한 배양배지에 배양하고 이로부터 인간 SDF-5 단백질을 회수 및 정제하는 본 발명의 재조합 인간 SDF-5 단백질을 제조하는 새로운 방법에서 사용할 수 있다. 이러한 방법은 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주세포로서 수많은 공지된 진핵 또는 원핵세포를 사용할 수 있다. 벡터는 또한 유전자 치료 용도에서 사용할 수 있다. 이러한 용도에서, 벡터는 생체외에서 환자의 세포에 트랜스펙션시키고, 세포를 환자에게 재도입시킬 수 있다. 이와는 달리, 벡터는 목표 트랜스펙션을 통해 생체내에서 환자에게 도입시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 벡터는 발육시 목적하는 세포 조직 및/또는 원하는 시간에 인간 SDF-5 의 발현을 달성하기 위하여, 인간 SDF-5 에 대한 코딩 서열과 기능적으로 연계된 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 하나이상의 비천연성 조절요소를 이용하여 제조한다. 예컨대, 벡터는 발육동안 베타 세포를 포함한 췌장 세포에서 췌장에서 본질적으로 발현되는 것으로 공지된 잘 특징화된 IDX 유전자로부터 프로모터 요소를 이용하여 구축할 수 있다. IDX 유전자 유래의 프로모터와 프라즐드의 코딩 서열을 기능적으로 연계하며, WO93/00441 에 기술된 바와 같은 췌장 기간 세포와 같은 적당한 세포를 형질전환시킴으로써, 상기의 세포에서 인간 SDF-5 를 발현시켜, 실험관 배양 또는 생체에서 인슐린을 분비할 수 있는 췌장 베타세포와같은 세포의 형성, 성장, 증식, 분화 및/또는 유지의 목적하는 효과를 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 추가의 태양은 인간 SDF-5 단백질 또는 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 또는 3 에 설명되어 있는 서열을 포함하는 아미노산 서열, 천연 발생 대립유전자 변종을 포함한 SEQ ID NO : 2 또는 3 의 아미노산 서열의 변종, 및 단백질이 프라즐드 능력, 예컨대, 연골세포 및/또는 연골 조직 및/또는 췌장 또는 기타 기관 조직, 예컨대 간, 비장, 허파, 심장, 뇌 및 신장 조직의 형성, 성장, 증식, 분화 및/또는 유지를 강화 및/또는 억제하는 능력을 갖는 프라즐드 단백질 특성의 기타 변종을 갖는 것을 특징으로 한다. 바람직한 폴리펩티드에는 SEQ ID NO : 2 또는 3 에 나타낸 성숙 인간 SDF-5 아미노산 서열에 적어도 약 80%, 좀더 바람직하게는 적어도 약 90% 상동한 폴리펩티드가 포함된다. 최종적으로, SEQ ID NO : 2 또는 3 의 서열의 대립 유전자 또는 기타 변종은, 이러한 아미노산 변화가 돌연변이, 화학적 변경, 또는 폴리펩티드의 생산을 위해 사용되는 DNA 서열의 변경에 의해 유도되었는지 (펩티드 서열은 여전히 프라즐드 활성을 갖는다) 따라 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 또한 프라즐드 단백질의 활성을 보유한 SEQ ID NO : 2 또는 3 에 나타낸 인간 SDF-5 의 아미노산 서열의 단편을 포함한다. 당업자는 당분야에 공지된 기술을 이용하여 인간 SDF-5 단백질의 변종 및 단편을 용이하게 제조할 수 있고, 여기의 실시예에 기재된 바와 같이 이들에 대한 활성을 용이하게 분석할 수 있다.
본 발명의 정제된 단백질은 항체 제조의 당분야에서 공지된 방법을 이용하여 인간 SDF-5 단백질 및/또는 기타 관련 단백질에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 발생시키는데 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 인간 SDF-5 및/또는 기타 프라즐드 단백질에 대한 항체를 포함한다. 항체는 인간 SDF-5 단백질의 정제 또는 실험관 또는 생체에서 프라즐드 단백질의 효과를 억제하거나 방해하는데 유용할 수 있다. 인간 SDF-5 단백질은 배 세포 및/또는 기간 세포의 성장 및/또는 분화를 유도하는데 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질 또는 조성물은 또한 배세포 또는 기간 세포군과 같은 세포군을 처리하여 세포의 성장 및/또는 분화를 강화시키거나, 풍부하게하거나 또는 억제하는데 유용할 수 있다. 예컨대, 인간 SDF-5 단백질은 세포군을 처리하여 연골세포, 연골조직 및/또는 기타 세포 예컨대 췌장 또는 기타 조직 또는 기관 표현형의 세포의 형성, 분화, 증식 및/또는 유지를 강화 및/또는 억제하는데 유용할 수 있다. 처리된 세포군은 기타의 것들중 후술되는 바와같은 유전자 치료 용도에 유용할 수 있다.
인간 SDF-5 유전자는 분비된 인자를 코딩하여 Wnt 단백질과 결합할 수 있는 가용성 수용체를 제공하고, Wnt 단백질로 시그널 트랜스덕션을 개시 및/또는 차단하는 것으로 보이는 것이 특히 중요하다. 따라서, 인간 SDF-5 유전자 패밀리는 프라즐드 수용체 단백질과 같은 수용체 단백질에 대한 Wnt 유전자의 결합 상호작용을 조절할 수 있다. 이러한 단백질의 잠재적 시그널 트랜스덕션 조절 활성과 더불어 췌장 및 기타기관에서의 Wnt 유전자의 존재 및/또는 발현은 인간 SDF-5 단백질이 조직 및 기관의 분화의 중요한 조절자임을 시사하고, 조직 및 기관의 유도, 형성, 성장, 분화, 증식 및/또는 유지에 관여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질은 아무는 상처, 조직 및 기관 치유 및 재생 과정, 및 예컨대 배발달에서 조직의 분화에서 유용할 수 있다. 특히, 인간 SDF-5 단백질은 연골세포 및/또는 연골조직의 유도, 형성, 성장, 분화 ,증식 및/또는 유지 및 치료에 유용할 수 있음이 본 발명자에 의해 관찰되었다. 따라서, 이러한 단백질, 이를 함유한 조성물은 골관절염, 류마티스관절염 및 관절연골 결함과 같은 연골장애의 치료, 및 예컨대 세포 형성, 성장, 분화, 증식 및/또는 유지, 예컨대 연골세포 및/또는 연골조직의 형성의 강화 및/또는 억제에서 유용할 수 있다.
여기에 제공된 인간 SDF-5 단백질은 SEQ ID NO : 1 의 서열과 유사한 서열, 그러나 수정 또는 결실이 자연적으로 제공된 ( 예컨대, 폴리펩티드에서 아미노산 변화를 초래할 수 있는 뉴클레오티드 서열에서의 대립유전자 변형) 또는 조작된 서열에 의해 코딩된 인자를 포함한다. 예컨대, 합성 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2 또는 3 의 아미노산 잔기의 연속 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 복제할 수 있다. SEQ ID NO : 2 또는 3 의 인간 SDF-5 폴리펩티드와 일차, 이차, 또는 삼차 구조 및 배치 특성을 공유함으로써 공통으로 생물학적 특성을 보유할 수 있다. 따라서, 천연 인간 SDF-5 의 이러한 수정 및 결실은 치료 과정에서 천연발생 인간 SDF-5 폴리펩티드에 대한 생물학적 활성 대체물로서 사용할 수 있다. 인간 SDF-5 의 주어진 변종 또는 단편이 프라즐드의 생물학적 활성을 보유한지는 인간 SDF-5 및 인간 SDF-5 의 변종 또는 단편을 여기에 기재된 분석을 실행함으로써 용이하게 측정할 수 있고; 또한 변종 또는 단편은 Wnt 유전자에 대한 결합을 시험하는 경쟁결합분석에서 사용할 수 있다.
여기에 기술된 인간 SDF-5 단백질의 서열의 기타 특징적 돌연변이는 글리코실화 부위의 수정을 수반한다. 이러한 수정은 O-결합 또는 N-결합 글리코실화 부위를 수반할 수 있다. 예컨대, 글리코실화의 부재 또는 단지 부분적 글리코실화는 아스파라긴-결합 글리코실화 인식부위에서 아미노산 치환 또는 결실로부터 발생할 수 있다. 아스파라긴-결합 글리코실화 인신 부위는 적당한 세포 글리코실화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 트리펩티드 서열을 함유한다. 이러한 트리펩티드 서열은 아스파라긴-X-트레오닌 또는 아스파라긴-X-세린이며, 여기에서 X 는 통상적으로 임의의 아미노산이다. 글리코실화 인식 부위의 첫번째 또는 세번째 아미노산 위치의 하나 또는 양쪽에서 다양한 아미노산 치환 또는 결실 (및/또는 두번째 위치에서의 아미노산 결실) 은 수정된 트리펩티드 서열에서 비글리코실화를 초래한다. 이러한 인간 SDF-5 의 변종은 본 발명의 범위내이다. 추가적으로, 인간 SDF-5 의 박테리아 발현은 글리코실화 부위가 비수정된 채로 남는 다 하더라도 비글리코실화 단백질의 생산을 초래할 것이다. 이러한 인간 SDF-5 의 박테리아 생산 버전은 본 발명 내이다.
본 발명은 또한 다른 단백질성 물질을 코딩하는 DNA 서열과 연계가 없고, 인간 SDF-5 단백질의 발현을 코딩하는 신규의 DNA 서열을 포함한다. 이러한 DNA 서열은 5'→3' 배향에서 SEQ ID NO : 1 에 설명된 DNA 서열 및 엄격한 하이브리드화 조건하 [예, 0.1X SSC, 0.1% SDS, 65℃;참조, T. Maniatis et al, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), pages 387-389]에서 상기에 하이브리다이즈하고 ,프라즐드 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 이러한 DNA 서열에는 또한 SEQ ID NO : 1 의 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열 및 여기에 엄격한 하이브리드화 조건하 하이브리다이즈하고 프라즐드 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 서열이 포함된다.
마찬가지로, SEQ ID NO : 1 의 서열에 의해 코딩되는 인간 SDF-5 단백질, 또는 SEQ ID NO : 2 또는 3 의 아미노산 서열을 함유하나, 유전 코드 또는 대립유전자 변종(아미노산 변화를 초래할 수도 안할 수 도 있는 종의 군에서의 천연발생 염기 변화)의 축중으로 인한 코돈서열에서 상이한 인간 SDF-5 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 또한 여기에 기술된 새로운 인자를 코딩한다. 코딩된 폴리펩티드의 활성, 반감기 또는 생산을 향상시키기 위한 점 돌연변이 또는 유도수정 (삽입, 결실, 및 치환포함) 으로 발생하는 SEQ ID NO : 1 의 DNA 서열에서의 변이는 본 발명에 포함된다.
본 발명의 또하나의 태양은 인간 SDF-5 단백질을 제조하는 새로운 방법이다. 본 발명의 방법은 공지된 조절 서열의 조절하, 본 발명의 인간 SDF-5 단백질을 코딩하는 DNA 서열로 형질전환된 적당한 세포주를 배양하는 것이 포함된다. 형질전환된 세포주는 배양하고 인간 SDF-5 단백질을 배양 배지로부터 회수 및 정제한다. 정제된 단백질은 다른 오염원 유래 및 공동으로 생산되는 다른 단백질이 실질적으로 없다.
적당한 세포 또는 세포주는 포유류 세포, 예컨대 챠이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 일 수 있다. 적당한 포유류 숙주 세포의 선별 및 형질전환, 배양, 증식, 스크리닝, 생성물 생산 및 정제방법은 종래기술에 공지되어 있다. 참조 예컨대 Gething and Sambrook,Nature, 293:620-625 (1981), 또는 이와는 달리, Kaufman et al, Mol. Cell. Biol., 5(7):1750-1759 (1985) 또는 Howley et al, U.S. Patent 4,419,466. 실시예에 기술된 또하나의 적합한 포유류 세포주는 원숭이 COS-1 세포주이다. 포유류 세포 CV-1 가 또한 적합할 수 있다.
박테리아 세포가 또한 적합한 숙주일 수 있다. 예컨대, 대장균의 다양한 균주 (예, HB101, MC1061) 은 생명공학분야에서 숙주로 공지되어 있다. 비.서브틸리스, 슈도모나스, 기타 바실리 등의 다양한 균주가 또한 본 방법에서 사용될 수 있다. 박테리아 세포에서 단백질의 발현을 위해서는 프라즐드의 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA 는 통상적으로 필요하지 않다.
당업자에게 공지된 많은 이스트 세포균주가 또한 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주세포로서 이용가능하다. 추가로, 원한다면, 곤충세포를 본 발명의 방법에서 숙주세포로서 이용가능하다. 참조, 예컨대 Miller et al, Genetic Engineering, 8:277-298 (Plenum Press 1986) 및 여기에 인용된 참조문헌.
본 발명의 또하나의 태양은 상기 신규 인간 SDF-5 폴리펩티드의 발현방법에서 유용한 벡터를 제공한다. 바람직하게는 벡터는 본 발명의 신규의 인자를 코딩하는 전술한 완전히 새로운 DNA 서열을 포함한다. 또한, 벡터는 프라즐드 단백질 서열의 발현을 허용하는 적당한 발현 조절 서열을 포함한다. 이와는 달리, 전술한 바와 같은 수정 서열이 혼입된 벡터 또한 본 발명의 구현예이다. 또한, SEQ ID NO : 1 의 서열 또는 인간 SDF-5 단백질을 코딩하는 기타 서열은 인간 SDF-5 시그널 펩티드 서열을 결실시키고 이를 다른 프라즐드 단백질의 완전한 시그널 펩티드 또는 다른 적당한 프로펩티드를 코딩하는 서열로 치환 조작하여 성숙 인간 SDF-5 단백질을 발현시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 정확한 판독 프레임에서 인간 SDF-5 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열에 연결된 프라즐드 패밀리의 멤버 유래의 시그널 펩티드를 코딩하는 키메릭 DNA 분자를 포함한다.
벡터는 세포주를 형질전환시키는 방법에서 사용가능하고, 선택된 숙주세포에서 복제 및 발현을 제어할 수 있는 본 발명의 DNA 코딩 서열과 기능적으로 연계된 선택된 조절 서열을 함유할 수 있다. 이러한 벡터를 위한 조절 서열은 당분야의 당업자에게 공지되어 있고, 숙주세포에 따라 선택할 수 있다. 이러한 선택은 일상적인 것이고 본 발명의 일부를 형성하지는 않는다.
쥐, 인간 또는 다른 포유류 SDF-5 단백질을 제조하기 위해서는, 이를 코딩하는 DNA는 적당한 발현 벡터로 옮기고 포유류 세포 또는 기타 바람직한 진핵세포 또는 원핵세포 숙주에 통상의 유전공학적 기술로 도입한다. 생물학적으로 활성인 재조합 인간 SDF-5 를 위한 바람직한 발현 시스템이 안정되게 형질전환된 포유류 세포로 생각된다.
당분야의 당업자는 SEQ ID NO : 1 의 서열, SDF-5 단백질을 코딩하는 다른 DNA 서열 또는 다른 수정된 서열 및 공지된 벡터, 예컨대, pCD [Okayama et al., Mol. Cell Biol., 2:161-170 (1982)], pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4:645-653 (1985)] 및 pMT2 CXM 를 이용하여 포유류 발현 벡터를 구축할 수 있다.
포유류 발현벡터 pMT2 CXM 은 테트라사이클린 내성 유전자 대신에 암피실린 내성 유전자를 함유하고, 추가로 cDNA 클론의 삽입을 위한 XhoI 부위를 포함하는 점에서 p91023(b)(Wong et al., Science 228:810-815, 1985) 와는 상이한 이의 유도체이다. pMT2 CXM의 기능요소는 기술되어 있고 (Kaufman,R.J., 1985, Proc, Natl.Acad.Sci.USA 82:289-693), 아데노바이러스 VA 유전자, 72bp 인핸서를 포함하는 복제의 SV 40 오리진, 5' 스플라이스 부위 및 아데노바이러스 레이트(late) mRNA 에 존재하는 대부분의 아데노바이러스 3 부 리더 서열을 포함하는 아데노바이러스 메이저 레이트 프로모터, 3' 스플라이스 수용체 부위, DHFR 삽입체, SV40 얼리 폴리아데닐화 부위 (SV40) 및 대장균에서 증식에 필요한 pBR322 서열을 포함한다.
플라스미드 pMT2 CXM 은 ATCC (미국 메릴렌드 로크빌) 에 기탁번호 ATCC 67122 로 기탁된 pMT2-VWF 의 EcoRI 소화로 수득된다. EcoRI 소화는 pMT2-VWF 에 존재하는 cDNA 삽입체를 절단하여, 접합될 수 있고 암피실린에 대해 내성을 갖도록 대장균 HB 101 또는 DH-5 를 형질전환시키는데 사용하는 선형형태의 pMT2 를 산출시킨다. 플라스미드 pMT2DNA 는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 이어서 pMT2 CXM 는 루트아웃/인 돌연변이를 이용하여 구축한다 [Morinaga, et al., Biotechnology 84: 636 (1984)]. 이것은 복제의 SV 40 오리진 및 pMT2 의 인핸서 서열 부근의 HindIII 부위와 관련된 염기 1075 내지 1145 을 제거시킨다. 또한 이는 하기 서열을 뉴클레오티드 1145 에 삽입시킨다 :
이 서열은 제한 엔도뉴클레아제 XhoI 에 대한 인식부위를 함유한다. pMT23 으로칭한 pMT2 CXM 의 유도체는 제한 엔도뉴클레아제 PstI, Eco RI, SalI 및 XhoI 에 대한 인식 부위를 함유한다. 플라스미드 pMT2 CXM 및 pMT23 DNA 는 통상의 방법으로 제조할 수 있다.
또한 pMT21 로부터 유래한 pEMC2β1 는 본발명의 실행에 있어 적합하다. pMT21 은 pMT2-VWF 유래의 pMT2 에서 유래한다. 전술한 바와 같이 EcoRI 소화는 pMT-VWF 에 존재하는 cDNA 삽입체를 절단하여, 접합될 수 있고, 암피실린에 대해 내성을 갖도록 대장균 HB 101 또는 DH-5 를 형질전환시키는데 사용하는 선형형태의 pMT2 를 산출시킨다. 플라스미드 pMT2 DNA 는 통상의 방법으로 제조할 수 있다.
pMT21 은 하기의 두 수정을 통하여 pMT2 로부터 유래한다. 첫번째, cDNA 클로닝을 위한 G/C 테일링유래의 연속 19G 잔기를 포함하는 DHFR cDNA 의 5' 비번역 영역의 76bp 를 결실시킨다. 이 과정에서, XhoI 부위를 삽입하여 DHFR 로부터 바로 상류의 하기 서열을 수득한다 :
둘째로, 단일 ClaI 부위를 EcoRV 및 XbaI 로 소화시켜 도입하고, DNA 폴리머라아제 I 의 클레나우 단편으로 처리하고 ClaI 링커(CATCGATG) 에 접합시킨다. 이것은 아데노바이러스 조합 RNA(VAI) 영역유래의 250bp 단편을 결실시키나 VAI RNA 유전자 발현 또는 기능을 방해하지 않는다. pMT21 은 EcoRI 및 XhoI 로 소화시키고, 벡터 pEMC2B1 를 유도하는데 사용한다.
EMCV 리더의 일부는 EcoRI 및 PstI 로 소화시켜 pMT2-ECAT1 [S.K. Jung, et al, J.Virol 63:1651-1660 (1989)] 로부터 2752bp 단편을 수득한다. 이 단편을 저용융 아가로오스 겔상에서 전기영동하여, 정제된 508 bp 의 EcoRI-TaqI 단편을 산출하는 TaqI 로 소화시킨다. 68bp 아답터 및 이의 보상가닥은 하기 서열을 갖는 5'TaqI 돌출 말단 및 3'XhoI 돌출말단과 합성한다 :
이서열은 뉴클레오티드 763 내지 827 의 EMC 바이러스 리더 서열과 합치된다. 이는 또한 EMC 바이러스 리더내의 위치 10 에서 ATG 를 ATT 로 변화시키고 뒤에 XhoI 부위가 뒷따른다. pMT21 Eco RI-XhoI 단편, EMC 바이러스 EcoRI-TaqI 단편 및 68bp 올리고뉴클레오티드 어답터 TaqI-XhoI 어답터의 세가지방법의 접합은 벡터 pEMC2β1 을 가져온다.
이 벡터는 SV40 복제오리진 및 인핸서, 아데노바이러스 메이저 레이트 프로모터, 다수의 아데노바이러스 3 부 리더 서열의 cDNA 카피, 소하이브리드 중재 서열, SV40 폴리아데닐화 시그널 및 아데노바이러스 VAI 유전자, DHFR 및 β-락타마아제 마커 및 EMC 서열을 원하는 cDNA 의 고수준의 발현을 포유류 세포에서 제어하는 적절한 상관관계에서 함유한다.
벡터의 구축은 인간 SDF-5 DNA 서열의 수정을 수반할 수 있다. 예컨대, 인간 SDF-5 cDNA 는 코딩영역의 5' 및 3' 말단에서 비코딩 뉴클레오티드를 제거하여 수정시킬 수 있다. 결실된 비코딩 뉴클레오티드는 발현에 유익한 것으로 공지된 다른 서열에 의해 치환되거나 되지 않을 수 있다. 이러한 벡터는 인간 SDF-5 단백질의 발현을 위한 적당한 숙주세포로 형질전환된다. 또한, SEQ ID NO :1 의 서열, 인간 SDF-5 단백질을 코딩하는 다른 서열은 SDF-5 를 코딩하는 시그널 펩티드 서열을 결실시키고 이를 다른 단백질의 완전한 시그널 펩티드를 코딩하는 서열로 치환하여 성숙한 인간 SDF-5 단백질을 발현시키도록 조작할 수 있다.
당분야의 당업자는 코딩서열의 옆에 끼인 포유류 조절 서열을 제거하거나 박테리아 서열로 치환하여 박테리아 세포에 의한 세포내 또는 세포외 발현을 위한 박테리아 벡터를 제조할 수 있다. 예컨대, 코딩서열은 추가로 조작할 수 있다 (예, 다른 공지된 링커에 접합하거나 이로부터 비코딩서열을 제거하여 수정하거나 공지된 기술로 뉴클레오티드를 변경한다). 이어서 수정된 인간 SDF-5 코딩 서열은 문헌 [T.Taniguchi et al., Proc.Natl Acad.Sci.USA, 77:5230-5233(1980)] 에 기술된 바와 같은 절차를 이용하여 공지의 박테리아 벡터에 삽입시킨다. 이어서 이 예시적 박테리아 벡터는 박테리아 숙주 세포로 형질전환시키고 이로 단백질을 발현시킨다. 박테리아 세포에서의 인간 SDF-5 세포외 발현을 위한 전략은 유럽특허출원 EPA 177,343 을 참조한다.
유사한 조작을 곤충세포에서의 발현을 위한 곤충벡터의 구축을 위해 실시할 수 있다 [참조, 예, 공고된 유럽특허출원 155,476 에 기술된 절차]. 또한 이스트 벡터는 이스트 세포로 본발명의 인자의 세포내 또는 세포외 발현을 위한 이스트 조절 서열을 이용하여 구축할수 있다. [참조, 예컨대 공고된 PCT 출원 WO86/00639 및 유럽 특허출원 EPA 123,289 에 기재된 절차].
포유류 세포에서 본 발명의 인간 SDF-5 단백질의 고수준 제조방법은 이질성 인간 SDF-5 유전자의 다중 카피를 함유하는 세포의 구축을 수반한다. 이질성 유전자는 증폭성 마커, 예컨대 증가된 유전자 카피를 함유하는 세포가 문헌[Kaufman and Sharp, J.Mol.Biol., 159:601-629(1982)] 의 절차에 따른 메토트렉세이트 (MTX) 의 농도의 증가에 있어서의 증식을 위하여 선택될 수 있는 디히드로플레이트 리덕타아제 (DHFR) 에 연결될 수 있다. 이러한 접근은 수많은 상이한 세포유형으로 이용할 수 있다.
예컨대, SDF-5 단백질을 발현시킬 수 있는 다른 플라스미드 서열과 기능적으로 연계되어 있는 본 발명의 인간 SDF-5 단백질의 DNA 서열을 함유하는 플라스미드 및 DHFR 발현 플라스미드 pAdA26SV(A)3 [Kaufman and Sharp, Mol.Cell.Biol., 2:1304 (1982)] 는 칼슘 포스페이트 공침전 및 트랜스펙션, 전기영동 또는 프로토플라스트 융합을 포함한 다양한 방법으로 DHFR-결핍 CHO 세포, DUKX-BII 에 공도입될 수 있다. DHFR 발현 형질전환체는 투석된 태아 송아지 혈청을 갖는 알파 배지에서 성장을 위하여 선별하고, 이어서 MTX 농도 증가시 (예, 0.02, 0.2 및 5uM MTX 연속단계) 성장에 의한 증폭을 위해 문헌 [Kaufman et al., Mol Cell Biol.,5:1750 (1983)] 에 기재된 바와 같이 선별한다. 형질전환체는 클론시키고, 생물학적으로 활성인 인간 SDF-5 발현은 여기에 기재된 분석중 하나로 모니터한다. 인간 SDF-5 단백질 발현은 MTX 내성의 수준의 증가에 따라 증가하여야 한다. 인간 SDF-5 폴리펩티드는 [35S] 메티오닌 또는 시스테인에 의한 펄스 라벨링 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 당분야에 공지된 표준기술을 이용하는 것을 특징으로한다. 유사한 절차가 다른 관련 SDF-5 단백질을 제조하는데 뒷따를 수 있다.
프라즐드 활성을 실증하는 본 발명의 SDF-5 단백질은 인간 및 기타 동물에서, 연골세포 및/또는 연골 조직과 같은 세포 및 조직, 및 췌장 조직, 및 기타 기관 조직의 치유 및 유도, 형성, 성장, 분화, 증식 및/또는 유지에서 용도를 갖는다. 인간 SDF-5 단백질을 사용하는 이러한 제제는 류마티스 관절염 및 골관절염 및 연골의 외상의 치료 및 췌장암, 당뇨병 및 기타 췌장 조직 장애의 예방에서 예방적 용도를 갖을 수 있다. 프라즐드 단백질에 의해 유도되는 베타 세포, 랑겐한 세포의 섬, 및 췌장 표현형의 기타세포의 신규 형성은 선천성, 종양유도, 또는 종양조직 결함 또는 상태의 치유에 기여한다. 또한 인간 SDF-5 단백질은 췌장질환의 치료, 기타 조직 및 기관 치유과정에서 사용할 수 있다. 이러한 제제는 적당한 기간세포를 끌어들이고, 판크레아스-형성 세포의 성장 및 증식을 자극하거나 판크레아스-형성 세포의 근원세포의 분화를 유도하는 환경을 제공하고, 또한 기타 조직 및 기관의 재생을 지지할 수 있다. 본발명의 인간 SDF-5 폴리펩티드는 또한 췌장염 또는 당뇨병과 같은 기관 장애의 치료에 유용할 수 있다.
또한 본 발명의 단백질은 아무는 상처 및 관련 조직 치유에 사용할 수 있다. 상처의 종류에는 화상, 절개, 궤양이 포함되나 이에만 국한되는 것은 아니다 (참조, 예, 아무는 상처 및 관련 조직치유의 거론에 대한 PCT 공보 WO84/01106). 본 발명의 단백질은 신경원, 성상 및/또는 신경교세포 생존을 증가시킬 수 있어, 신경원 생존 및 치유에서의 감소를 보이는 증상의 치료 및 이식에서 유용할 수 있음이 추가로 고려된다. 본 발명의 단백질은 추가로 신경, 표피, 근육, 연결조직, 골, 연골, 건 및 인대, 및 췌장, 간, 비장, 허파, 심장, 뇌 및 신장 조직과 같은 다른 유형의 조직과 관련된 상태의 치료에 유용할 수 있다. 본 발명의 단백질은 또한 식이보충물, 또는 세포배양배지의 첨가제로서 가치를 갖을 수 있다. 이러한 사용을 위해서는, 단백질은 온전한 형태로 사용하거나, 또는 예비소화시켜 좀더 용이한 흡수 보충물을 제공할 수 있다.
본 발명의 단백질은 또한 단백질의 프라즐드 패밀리에 특징적인 기타 유용한 특성을 갖을 수 있다. 이러한 특성에는 맥관유래, 화학주성 및/또는 주화특성, 및 분화반응, 세포증식반응 및 세포흡착, 이동 및 세포외 매트릭스를 포함한 반응을 포함한 세포에 대한 영향이 포함된다. 이러한 특성은 본 발명의 단백질을 아무는 상처, 섬유증 감소 및 상처 조직형성의 감소에 대한 강력한 제제로 만든다. 본 발명의 단백질은 또한 인슐린, 글리카곤 또는 기타 내분비 또는 외분비 호르몬과 같은 중요한 호르몬을 분비할 수 있는 세포의 형성을 유도하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 추가의 태양은 연골 및 연결조직의 장애 및 췌장염, 당뇨병 및 췌장 조직 장애 또는 질환과 관련된 기타 상태의 치료용 조성물 및 치료방법이다. 본 발명은 추가로 아무는 상처 및 조직 치유용 조성물 및 치료방법을 포함한다. 이러한 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 매트릭스와 혼합된 본 발명의 하나이상의 인간 SDF-5 단백질의 약학적으로 유효한 양을 함유한다. 본 발명의 조성물은 신경원 및 신경교 세포 생존을 증가시켜 신경원 생존에서 감소를 보이는 상태의 치료 및 이식에서 유용함이 추가로 고려된다.
본 발명의 단백질은 다른 관련 단백질 및 성장 인자와 협력하거나 아마 상승적으로 작용할 수 있음이 기대된다. 그러므로 추가로 본 발명의 치료방법 및 조성물은 본 발명의 하나이상의 인간 SDF-5 단백질의 치료량 및 골형성 단백질 (BMP), 성장 및 분화인자 (GDF) 및 기타 단백질을 포함한 단백질의 TGF-β슈퍼패밀리의 멤버와 같은 하나이상의 다른 단백질의 치료량을 함유한다. BMP-1, BMP- 2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 및 BMP-7 은 미국특허 5,108,922; 5,013,649; 5,116,738; 5,106,748; 5,187,076 및 5,141,905 에 개시되어 있고; BMP-8 은 PCT공보 WO91/18098 에 개시되어있고; BMP-9 는 PCT공보 WO93/00432 에 개시되어있고; BMP-10 은 PCT공보 WO94/26893 에 개시되어있고; BMP-11 은 PCT공보 WO94/26892 에 개시되어있고;또는 BMP-12 또는 BMP-13은 PCT공보 WO95/16035 에 개시되어있고 ; 또는 BMP-15 는 PCT공보 WO96/36710 에 개시되어있고; 또는 BMP-16 은 1996 년 9.18 일자 출원된 공동계류중인 특허출원시리얼번호 08/715/202 에 개시되어 있다.
또한 유용할 수 있는 다른 조성물에는 Vgr-2, 및 PCT 출원 WO94/15965; WO94/15949; WO95/01801; WO95/01802; WO94/21681; WO94/15966; 및 기타에 기재되어 있는 것을 포함한 임의의 성장 및 분화 인자 [GDF]를 포함할 수 있다. 또한 WO94/01557 에 개시되어 있는 BIP 및 ; PCT 출원 WO93/16099 에 개시되어 있는 MP52 가 본 발명에서 유용할 수 있다. 상기 출원의 모두의 개시는 여기에 참조로 포함되어 있다. 바람직한 구현예로, SDF-5 는 단백질 BMP-2, BMP-7, MP-52, BMP-12 또는 BMP-13 과 결합된다.
조성물은 표피성장인자 (EGF), 섬유아세포성장인자 (FGF), 혈소판 유래성장인자 (PDGF), 전환성장인자 (TGF-α및 TGF-β), 액티빈, 인히빈, 및 k-섬유아세포성장인자 (kFGF), 파라티로이드 호르몬 (PTH), 백혈병 억제 인자(LIF/HILDA/DIA), 인슐린유사 성장인자 (IGF-I 및 IGF-II) 와 같은 성장 인자 및 기타 제제를 포함할 수 있다. 이러한 제제의 일부는 또한 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다.
pH, 등장성, 안정성등에 대한 적당한 관계를 갖는 이러한 생리학적으로 허용가능한 단백질 조성물의 제제 및 제형은 당분야의 기술내이다. 또한 치료학적 조성물은 프라즐드 단백질에서 종특이성의 부족으로 인해 수의 용도에 현재 중요하다. 특히 인간외 가축 및 순종마가 본 발명의 SDF-5 단백질에 의한 치료의 대상이다.
치료방법에는 조성물을 국부적으로, 전신적으로, 또는 주사 또는 이식에 의한 것과 같은 국소적으로 투여하는 것이 포함된다. 투여시, 본 발명에서 사용하는 치료학적 조성물은 물론 피로겐이 없는 생리학적으로 허용가능한 형태이다. 추가로, 조성물은 바람직하게는 췌장 또는 기타 조직 손상의 부위에 전달하기 위한 점성 형태로 주사되거나 캡슐화될 수 있다. 국부 투여는 상처 치료 및 조직 치유에 적합할 수 있다. 또는 임의적으로 전술한 바와 같은 조성물에 포함될 수 있는 SDF-5 단백질이외의 치료학적으로 유용한 제제는 대안적으로 또는 추가적으로 본 발명의 방법에 따라 SDF-5 조성물과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
이식을 위해서는, 조성물은 바람직하게는 췌장 또는 기타 조직 손상부위에 인간 SDF-5 단백질을 전달하고, 조직을 발육시키기 위한 조직을 제공하며 인체에 최적으로 흡수될 수 있는 매트릭스를 포함한다. 매트릭스는 인간 SDF-5 및/또는 기타 단백질의 서방, 및 세포침투를 위한 적당한 프리젠테이션 및 적당한 환경을 제공할 수 있다. 이러한 매트릭스는 다른 이식 의약 용도에서 현재 사용중인 재료로 형성될 수 있다. 매트릭스 재료의 선택은 생상용성, 생분해성, 기계적특성, 화장적 외관 및 공유영역 특성에 기초한다. 인간 SDF-5 조성물의 특정 용도는 적당한 제형을 한정할 것이다.
투여 양생법은 인간 SDF-5 단백질의 작용을 수정하는 다양한 인자, 예컨대 형성시키고자 하는 조직의 양, 조직손상 부위, 손상 조직의 상태, 상처크기, 손상된 조직의 유형, 환자연령, 성별 및 식이법, 임의 감염의 심각성, 투여시간 및 기타 임상적 인자를 고려하여 담당 의사에 의해 결정될 것이다. 투여량은 재구성에서 사용하는 매트릭스의 유형 및 조성물내 인간 SDF-5 단백질의 유형에 따라 변할 것이다. 다른 공지된 성장 인자, 예컨대 IGF I(인슐린 유사 성장인자 I) 의 최종 조성물에의 투여는 또한 투여량에 영향을 미칠것이다.
과정은 조직 성장 및/또는 치유의 주기적 평가에 의해 모니터될 수 있다. 과정은 예컨대 x-레이, 조직형태학적 측정 및 테트라사이클린 라벨링으로 모니터할 수 있다.
용도 및 생물학적 활성
본 발명의 단백질은 하기에서 확인되는 하나이상의 용도 또는 생물학적 활성 (여기에서 언급된 분석과 관련된 것들도 포함) 을 보이리라 기대된다. 본 발명의 단백질에 대해서 기재된 용도 또는 활성은 이러한 단백질의 사용 또는 투여, 또는 이러한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 사용 또는 투여 (예컨대, 유전자 치료 또는 DNA 의 도입에 적합한 벡터) 에 의해 제공될 수 있다.
연구 용도 및 유틸리티
본 발명에 의해 제공되는 단백질은 고산출 스크리닝용 다중 단백질의 패널에 포함되는 생물학적 활성을 측정하기 위하여; 항체를 육성하거나 다른 면역 반응을 제거하는 분석에서; 생물학적 유체에서 단백질 (또는 이의 수용체) 의 수준을 양적으로 결정하도록 고안된 분석에서 시약 (표식된 시약포함) 으로서; 대응하는 단백질이 우선적으로 발현되는 (기본적으로 또는 조직 분화 또는 발달의 특정 단계에서 또는 질환상태에서) 조직용 마커로서; 및, 물론, 관련 수용체 또는 리간드를 단리시키기 위한 분석에서 유사하게 사용할 수 있다. 단백질이 다른 단백질에 결합하거나 잠재적으로 결합하는 경우 (예, 수용체-리간드 상호작용에서), 단백질은 결합이 발생하는 다른 단백질을 확인하거나 결합 상호작용의 억제제를 확인하기 위하여 사용할 수 있다. 이러한 결합 상호작용에 관여된 단백질은 또한 펩티드 또는 소분자억제제 또는 결합상호작용의 아고니스트를 스크리닝하기 위하여 사용할 수 있다.
이러한 연구 유틸리티의 임의 또는 모두는 시약 그레이드 또는 연구산물로써 상업용 키트 포맷으로 개발될 수 있다.
상기 열거된 용도를 실행하기 위한 방법은 당분야의 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 방법을 개시하고 있는 문헌에는 제한없이 다음과 같다 : "Molecular Cloning : A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press Sambrook, J., E.F.Fritsch and T. Maniatis eds., 1989, and "Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Berger, S.L. and A.R. Kimmel eds., 1987.
영양상 용도
본 발명의 단백질은 또한 영양원 또는 보충물로서 사용할 수 있다. 이러한 사용에는 제한없이 단백질 또는 아미노산 보충물로서의 사용, 탄소원으로서의 사용, 질소원으로서의 사용 및 탄수화물원으로서의 사용이 포함된다. 이러한 경우에서, 본 발명의 단백질은 특정 유기체의 사료에 첨가하거나 또는 분말, 환제, 용액, 현탁액 또는 캡슐의 형태와 같이, 분리된 고형 또는 액형 제제로서 투여할 수 있다. 미생물의 경우에서는, 본 발명의 단백질은 미생물이 배양되어 있는 내 또는 위의 배지에 첨가할 수 있다.
사이토킨 및 세포증식 /분화 활성
본 발명의 단백질은 사이토킨, 세포증식 (유도 또는 억제) 또는 세포분화 (유도 또는 억제) 활성을 보이거나 또는 특정 세포 군에서 다른 사이토킨의 생산을 유도할 수 있다. 모든 공지된 사이토킨을 포함하여, 현재까지 발견된 많은 단백질 인자는 하나이상의 인자에 의존하는 세포증식 분석에서 활성을 보여, 분석은 사이토킨 활성의 통상적 확인 역활을 한다. 본 발명의 단백질의 활성은 제한없이 32D, DA2, DA1G, T10, B9/11, BaF3, MC9/G, M+(preB M+), 2E8, RB5, DA1, 123, T1165, HT2, CTLL2, TF-1, Mo7E 및 CMK 를 포함하는 세포주에 대한 수많은 통상적 인자에 의존하는 세포증식 분석중 하나에 의해 밝혀졌다.
다른 수단들중, 본 발명의 단백질의 활성은 다음의 방법으로 측정할 수 있다 : T-세포 또는 흉선세포 증식에 대한 분석에는 제한없이 다음에 기재된 것들이 포함된다 : Current Protocols in Immunology, Ed by J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Bertagnolli et al., J. Immunol. 145:1706-1712, 1990; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133:327-341, 1991; Bertagnolli, et al., J. Immunol. 149:3778-3783, 1992; Bowman et al., J. Immunol. 152: 1756-1761, 1994.
사이토킨 생산 및/또는 비장 세포, 림프절세포 또는 흉선세포의 증식에 대한 분석에는 제한없이 다음에 기재된 것들이 포함된다 : Polyclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A.M. and Shevach, E.M. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 pp. 3.12.1-3.12.14, John Wiley and Sons, Toronto.1994; and Measurement of mouse and human Interferon, Schreiber, R,D. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 pp.6.8.1-6.8.8, John Wiley and Sons, Toronto. 1994
조혈 및 림프생성 세포의 증식 및 분화에 대한 분석에는 제한없이 다음에 기재된 것들이 포함된다 : Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K., Davis, L.S. and Lipsky, P.E. In Current Protocols in Immunology.J.E.e.a. Coligan eds.Vol 1 pp. 6.3.1-6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto.1991; deVries et al., J.Exp.Med. 173-1205-1211, 1991; Moreau et al., Nature 336:690-692, 1988;Greenberger et al., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 80:2931-2938, 1983; Measurement of mouse and human interleukin 6-Nordan, R.In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 pp.6.6.1-6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto.1991;Smith et al., Proc.Natl. Acad. Sci .U.S.A. 83:1857-1861, 1986;Measurement of human Interleukin 11 Bennett, F., Giannotto, J., Clark. S.C. and Turner, K.J. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 pp. 6.15.1 John Wiley and Sons, Toronto 1991; Measurement of mouse and human Interleukin 9-Ciarletta, A., Giannotti,J., Clark, S.C. and Turner,K.J. In Current Ptotocols in Immunology. J.E.e.a.Coligan eds. Vol 1 pp. 6.13.1 John Wiley and Sons, Toronto. 1991.
항원에 대한 T-세포 클론 반응에 분석 (다른 것들중 APC-T 세포 상호작용에 영향을 주고 T-세포 영향을 제어하는 단백질은 증식 및 사이토킨 생산을 측정하여 확인할) 에는 제한없이 다음에 기재된 것들이 포함된다 : Current Protocols in Immunology, Ed by J.E.Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H.Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function; Chapter 6, Cytokines and their cellular receptors; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Weinberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6091-6095, 1980; Weinberger et al., Eur.J. Immun. 11:405-411, 1981; Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988.
면역 자극 또는 억제활성
본 발명의 단백질은 또한 면역 자극 또는 면역 억제 활성을 보일 수 있으며, 이에는 제한없이 여기에 분석을 위해 기재된 활성이 포함된다. 단백질은 다양한 면역 결핍 및 장애 (예, 심각한 결합 면역결핍포함 (SCID))의 치료, 예컨대, T 및/또는 B 림프구의 성장 및 증식의 조절 (상향 또는 하향) 및 NK 세포 및 기타 세포군의 세포융해 활성을 일으키는데 유용할 수 있다. 이러한 면역결핍은 유전적이거나 또는 바이러스 (예, HIV) 및 박테리아 또는 곰팡이 감염에 의할 수 있거나, 또는 자가면역 장애로부터 발생할 수 있다. 좀더 구체적으로는, 바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 기타 감염에 의한 감염성 질병 원인은 HIV, 헤파티티스 바이러스, 헤르페스바이러스, 마이코박테리아, 라이스마니아 에스피피., 말라리아 에스피피. 및 칸디다증과 같은 다양한 곰팡이 감염을 포함하여 본 발명의 단백질을 이용하여 치료가능하다. 물론, 이와 관련하여서는, 본 발명의 단백질은 또한 면역 시스템에 대한 부스터가 통상적으로 바람직할 수 있는 경우, 즉 암의 치료에서 유용할 수 있다.
본 발명의 단백질을 이용하여 치료할 수 있는 자가면역 장애에는 예컨대 연결조직 질환, 다발경화증, 전신 루프스 홍반, 류마티스 관절염, 자가면역 폐염증, 글루라인-베인 증후군, 자가면역 갑상선염, 인슐린 의존 당뇨 멜리티스, 중증근무력증, 이식편대숙주 질환 및 자가면역 염증안질환이 포함된다. 본 발명의 이러한 단백질은 또한 알러지 반응 및 증상, 예컨대 천식 (특히 알러지 천식) 또는 기타 호흡기 문제의 치료에 유용할 수 있다. 면역 억제가 바람직한 기타 상태 (예컨대 기관 이식포함) 은 또한 본 발명의 단백질을 이용하여 치료가능하다.
본 발명의 단백질을 이용하여, 수많은 방법으로 면역반응시키는 것이 또한 가능하다. 하향 조절은 이미 진행중인 면역반응을 억제하거나 차단하는 형태일 수 있거나 면역반응의 유도를 방지하는 것을 수반할 수 있다. 활성화 T 세포의 기능은 T 세포 반응을 억제하거나 또는 T 세포에서 특이 내성을 유도하거나 또는 이둘다 실행하여 억제할 수 있다. T 세포 반응의 면역억제는 통상적으로 억제제에 T 세포를 연속적으로 노출시키는 것이 필요한 활성, 비-항원-특이적인 방법이다. T 세포에서 비반응성 또는 알러지를 유도하는 것을 수반하는 내성은 이것이 통상적으로 항원 특이적이고 내성제에 대한 노출이 종결된후 지속된다는 점에서 면역억제와 구별된다.
조작상으로, 내성은 내성제의 부재하에서 특이적 항원에 재노출시 T 세포 반응의 결핍으로 실증된다.
하나이상의 항원 기능의 하향 조절 또는 방지 (제한없이 B 림프구 항원기능 (예, B7) 포함), 예컨대 활성화 T 세포에 의한 고수준 림포카인 합성의 방지는 조직, 피부 및 기관 이식의 상황에서 및 이식편대숙주 질환 (GVHD) 에서 유용할 것이다. 예컨대, T 세포 기능의 차단은 조직 이식에서 감소된 조직 해체를 가져올 것이다. 전형적으로, 조직 이식에서, 이식체의 거부는 T 세포에 의해 외래물질로 인식됨으로 개시되고, 이식체를 파괴하는 면역반응이 뒷따른다. B7 림프구 항원의 이의 천연 리간드와의 상호작용을 면역세포상에서 억제하거나 차단하는 분자 (B7-2 활성만을 갖는 가용성의 모노머형태의 펩티드 또는 다른 B 림프구 항원 (예, B7-1, B7-3) 또는 블로킹 항체의 활성을 갖는 모노머 형태의 펩티드와 병행하여) 는 이식전 대응하는 공자극성 시그널의 전달없이 면역세포상에서 분자의 천연리간드에의 결합을 초래할 수 있다. 여기에서의 블로킹 B 림프구 항원기능은 T 세포와 같은 면역세포에 의해 사이토킨 합성을 방지하여 면역억제제로서 작용하는 것이다. 더욱이, 공자극은 또한 T 세포를 에너자이저시키는데 충분하여 환자에게서 내성을 유도한다. B 림프구 항원-차단 시약에 의한 장기간 내성의 유도는 이러한 차단시약의 반복투여의 필요성을 우회시킬 수 있다. 환자에게서 충분한 면역억제 또는 내성을 달성하기 위해서는, B 림프구 항원의 조합의 기능을 차단하는 것이 필요할 것이다.
기관이식거부 또는 GVHD 의 방지에서 특정 차단시약의 효능은 인간에서의 효능을 예측할 수 있는 동물 모델을 이용하여 평가할 수 있다. 사용할 수 있는 적당한 시스템의 예로는 쥐에서의 심장이식 및 마우스에서의 이형발생적 췌장섬 세포이식이 포함되며, 이둘다 문헌 [Lenschow et al., Science 257:789-792 (1992) and Turka et al., Proc. Natl.Acad.Sci USA, 89:11102-11105 (1992)] 에 기재되어 있는 바와 같이 생체내에서 CTLA4Ig 융합 단백질의 면역억제 효과를 시험하기 위해서 사용되어 왔다. 또한 GVHD 의 뮤린 모델 (참조, Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp. 846-847) 은 상기 질병의 발증시 생체내 블록킹 B 림프구 항원기능의 효과를 측정하는데 사용할 수 있다.
블록킹 항원 기능은 또한 자가면역 질환을 치료하는데 치료학적으로 유용할 수 있다. 많은 자가면역 장애는 자신의 조직에 대해 반응적이고, 사이토킨 및 질병의 변인을 수반하는 자가항체의 생산을 촉진하는 T 세포의 부적절한 활성의 결과이다. 자가반응 T 세포의 활성의 방지는 질병 증후군을 제거하거나 감소시킬 수 있다. B 림프구 항원의 수용체:리간드 상호작용을 방해하여 T 세포의 공자극을 차단하는 시약의 투여는 T 세포 활성을 억제하고, 자가항체 또는 질병과정중에서 수반될 수 있는 T 세포-유래 사이토킨의 생산을 방지하는데 사용할 수 있다. 또한, 차단시약은 질병으로부터 장기간의 경감을 가져올 수 있는 자가반응 T 세포의 항원-특이적 내성을 유도할 수 있다. 자가면역 장애를 방지 또는 제거에서의 차단시약의 효능은 인간 자가면역 질환의 잘 특징화된 많은 동물모델을 이용하여 측정할 수 있다. 예로는 뮤린 실험적 자가면역 뇌염, MRL/lpr/lpr 마우스 또는 NZB 하이브리드 마우스에서의 전신 루푸스 홍반, 뮤린 자가면역 콜라겐 관절염, NOD 마우스 및 BB 쥐에서 당뇨 멜리투스, 뮤린 실험 중증근무력증 (참조, Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp. 840-856) 이 포함된다.
면역반응의 상향 조절의 수단으로서, 항원 기능의 상향조절(upregulation) (바람직하게는 B 림프구 항원 기능) 은 또한 치료에 유용할 것이다. 면역반응의 상향조절은 존재하는 면역반응을 향상시키거나 또는 초기면역반응을 제거하는 형태일 것이다. 예컨대, B 림프구 항원 기능의 자극을 통해 면역반응을 향상시키는것이 바이러스 감염의 경우에서 유용할 것이다. 또한, 인플루엔자, 보통감기, 및 뇌염과 같은 전신 바이러스 질환은 자극형태의 B 림프구 항원을 전신투여하여 경감시킬 수 있다.
이와는 달리, 항-바이러스 면역 반응은 환자로부터 T 세포를 제거하고, 본 발명의 펩티드를 발현하거나 또는 본 발명의 자극형태의 펩티드와 함께 바이러스 항원-펄스드 APC 로 생체외에서 T 세포를 공자극하고, 생체외에서 활성된 T 세포를 환자에게 재도입하여 감염환자에서 강화될 수 있다. 항-바이러스 면역반응의 강화의 다른 방법은 환자로부터 감염된 세포를 단리시키고, 여기에 기술되어 있는 본 발명에 따른 단백질을 코딩하는 핵산으로, 세포가 세포 표면상의 단백질의 일부 또는 전부를 발현시키도록 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 세포를 환자에게 재도입시킨다. 감염된 세포는 공자극 시그널을 T 세포에 보내 생체내에서 T 세포를 활성화시킬 수 있다.
또하나의 용도는, 항원 기능 (바람직하게는 B 림프구 항원 기능) 상향 조절 또는 강화는 종양 면역원성의 유도에서 유용할 것이다. 본 발명의 하나이상의 펩티드를 코딩하는 핵산으로 트랜스펙션된 종양 세포 (예, 사코마, 멜라노마, 림포마, 백혈병, 신경모세포증, 암)는 환자에게 투여하여 환자에서 종양특이적 내성을 극복할 수 있다. 원한다면, 종양세포는 트랜스펙션시켜 펩티드의 조합을 발현시킬수 있다. 예컨대, 환자로부터 수득한 종양세포는 B7-2-유사 활성을 갖는 펩티드만을 또는 B7-1-유사 활성 및/또는 B7-3-유사 활성을 갖는 펩티드를 함께 발현을 제어하는 발현 벡터로 생체외에서 트랜스펙션시킬 수 있다. 트랜스펙션된 종양 세포는 환자로 되돌려 트랜스펙션된 세포의 표면에서 펩티드의 발현을 가져온다. 이와는 달리, 유전자 치료 기술은 생체내에서 트랜스펙션을 위한 종양세포을 목표로 하는데 사용할 수 있다.
종양세포의 표면상에서 B 림프구 항원(들) 의 활성을 갖는 본 발명의 펩티드의 존재는 T 세포에 필요한 공자극 시그널을 제공하여 트랜스펙션된 종양 세포에 대한 T 세포 중재 면역 반응을 유도한다. 또한, MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자가 결핍된 또는 충분량의 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 재발현시키는데 실패한 종양 세포는 MHC 클래스 I α사슬 단백질 및 β2마이크로글로블린 단백질 또는 MHC 클래스 II α사슬 단백질 및 MHC 클래스 IIβ 사슬 단백질의 전부 또는 일부 (예, 세포질-도메인 절두 부분) 을 코딩하는 핵산으로 트랜스펙션시켜 세포표면에서 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 를 발현시킬 수 있다.
B-림프구 항원 (예, B7-1, B7-2, B7-3) 의 활성을 갖는 펩티드와 함께 적합한 클래스 I 또는 클래스 II MHC 의 발현은 트랜스펙션된 종양 세포에 대한 T 세포 중재 면역 반응을 유도한다. 임의적으로, MHC 클래스 II 관련 단백질 (예, 불변사슬) 의 발현을 차단하는 안티센스 구축물을 코딩하는 유전자는 B 림프구 항원의 활성을 갖는 펩티드를 코딩하는 DNA 로 공트랜스펙션되어 종양관련 단백질의 제공을 촉진하고 종양특이적 면역원성을 유도한다. 따라서, 인간환자에서 있어서 T 중재 면역 반응의 유도는 환자에서 있어서 종양 특이적 내성을 극복하는데 충분하다.
본 발명의 단백질의 활성은 다른 수단들중 하기의 방법으로 측정된다 :
흉선세포 또는 비세포 세포독성에 대한 적합한 분석은 제한없이 다음에 기재된 것들이다 : Current Protocols in Immunology, Ed by J.E. Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M.Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associateds and Wiley-Interscience (Chapter3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19 ; Chapter 7, Immunologic studies in Humans);Hermann et al., Proc. Natl.Acad.Sci USA 78:2488-2492, 1981; Herrmann et al., J.Immunol. 128:1968-1974, 1982;Handa et al., J.Immunol.135:1564-1572, 1985; Takai et al., J.Immmunol.137:3494-3500, 1986; Bowmanet al.,J. Virology 61:1992-1998; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133:327-341, 1991; Brown et al., J. Immunol. 153:3079-3092, 1994.
세포의존 면역글로블린 반응 및 이소타입 스위칭 (다른 것들중 T-세포의존 항체 반응을 조절하고 Th1/Th2 프로필에 영향을 미치는 단백질을 확인할) 에 대한 분석에는 제한없이 다음에 기재된 것들이 포함된다: Maliszewski, J. Immunol. 144:3028-3033, 1990; and Assays for B cell function: In vitro antibody production, Mond, J.J. and Brunswick, M. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol I pp. 3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto. 1994.
혼합된 림프구 반응 분석 (다른 것들중 Thl 및 CTL 반응을 주로 발생시키는 단백질을 확인할) 에는 제한없이 다음에 기재된 것들이 포함된다 :
Current Protocols in Immunology, Ed by J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. L=unol. 140:508-512, 1988; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149:3778-3783, 1992.
덴드리틱(Dendritic)세포-의존 분석 (다른 것들중 순수한 T-세포를 활성화시키는 덴드리틱 세포에 의해 발현되는 단백질을 확인할) 에는 제한없이 다음에 기재된 것들이 포함된다; Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 173:549-559, 199 1; Macatonia et al., Journal of Immunology 154:5071-5079, 1995; Porgador et al., Journal of Experimental Medicine 182:255-260, 1995; Nair et al., Journal of Virology 67:4062-4069, 1993; Huang et al., Science 264:961-965, 1994; Macatonia et al., Journal of Experimental Medicine 169:1255-1264, 1989; Bhardwaj et al., Journal of Clinical Investigation 94:797-807, 1994; and Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 172:631-640, 1990.
림프구생존/세포소멸에 대한 분석(다른 것들중, 슈퍼항원 유도후 세포소멸을 방지하는 단백질 및 림프구 항상성을 조절하는 단백질을 확인할) 에는 제한없이 다음에 기재된 것들이 포함된다 : Darzynkiewicz et al., Cytometry 13:795-808, 1992; Gorczyca et al., Leukemia 7:659-670, 1993; Gorczyca et al., Cancer Research 53:1945-1951, 1993; Itoh et al., Cell 66:233-243, 1991; Zacharchuk, Journal of Immunology, 145:4037-4045, 1990; Zamai et al., Cytometry 14:891-897, 1993; Gorczyca et al., International Journal of Oncology 1:639-648, 1992.
T-세포 수용 및 발달의 초기 단계에 영향을 미치는 단백질에 대한 분석에는 다음에 기재된 서열이 포함된다 : Antica et al., Blood 84:111-117, 1994; Fine et al., Cellular Immunology 155:111-122, 1994; Galy et al., Blood 85:2770-2778, 1995; Toki et al., Proc. Nat. Acad Sci. USA 88:7548-755 1, 1991.
조혈 조절 활성
본 발명의 단백질은 조혈 조절에 유용하며, 따라서, 골수 또는 림포이드 세포 결핍의 치료에 유용하다. 칼러니 형성 세포 또는 인자-의존 세포주를 유지하는 미소 생활성만으로도 조혈 조절과 관련됨을 나타내고, 즉 단독으로 또는 기타 사이토카인과 조합되어 적혈구 전구세포의 증식 및 성장을 촉진하고, 일례로 적혈구 전구체 및/또는 적혈구 세포의 생성을 촉진시키는 방사선/화학치료와 함께 사용되거나 각종 빈혈을 치료함에 유용성을 가지며; 화학 치료와 함께, 수반되어 골수-서프레션을 예방하거나 치료하기 위한, 과립구 및 단구/대식세포와 같은 골수 세포의 성장과 증식을 촉진 (즉, 전통적인 CSF 활성)하는데 유용하고; 거핵구, 결국 혈소판의 성장과 증식을 촉진하여 혈소판감소증과 같은 다양한 혈소판 질병을 예방 또는 치료하게 하며, 일반적으로 혈소판 수혈 대신, 또는 보충으로 사용되고; 및/또는 상기 언급된 조혈 세포의 일부 및 전부로 성숙될 수 있는 조혈 간(幹)세포의 성장과 증식을 촉진하여 각종 간세포 질병 (이식을 통해 일반적으로 치료되는 것으로, 제한하는 것은 아니지만, 급성 빈혈 및 경련성 야간성 혈색소뇨증)의 치료용, 및 방사능/화학 치료 이후의 생체내 또는 체외 (in vivo 또는 ex vivo)에서 유전자 치료를 위해 유전자 조작된 또는 정상 세포의 간세포 부분 내에서의 재구성 (즉, 골수 이식 또는 말초 전구세포 이식 (동질성 또는 이질성)과 병행하여)에 유용성이 있다.
본 발명 단백질의 활성은, 다른 방법 중에서, 하기의 방법으로 측정될 수 있다.
각종 조혈 세포주의 증식과 분화에 대한 적합한 측정법은 상기에 기술되었다.
엠브리오 간세포 분화의 측정 (각종 단백질 중, 엠브리오 분화 조혈에 영향을 미치는 단백질을 측정할 것임)은, 제한 없이, 문헌에 기술된 것을 포함한다 (Johansson et al, Cellular Biology 15:141-151, 1995; Keller et al, Molecular and Cellular Biology 13:473-486, 1993; McClanahan et al, Blood 81:2903-2915, 1993).
간세포 생존과 분화 측정 (각종 단백질 중, 림포-조혈에 영향을 미치는 단백질을 측정할 것임)은, 제한 없이, 문헌에 기술된 것을 포함한다 (메틸셀룰로스 칼러니 형성 측정, Freshney,M.G., Culture of Hematopoietic Cells. R.I.Freshney et al eds. Vol pp.265-268, Wiley-Liss, INC., New York, NY 1994; Hirayama et al, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:5907-5911, 1922; 높은 증식 잠재성을 가지는 원시성 조혈 칼러니 형성 세포, McNiece, I.K. and Briddell, R.A. Culture of Hematopoietic Cells. R.I.Freshney et al eds, Vol pp.23-39, Wiley-Liss, Inc., New York, NY, 1994; Neben et al, Experimental Hematology 22:353-359, 1994; Cobblestone area forming cell assay, Ploemacher,R.E. Culture of Hematopoietic Cells. R.I.Freshney et al eds, Vol pp.1-21, Wiley-Liss, Inc., New York, NY, 1994; 스토말 세포 존재 하에서의 장기간 골수배양, Spooncer,E., Dexter,M., and Allen,T. Culture of Hematopoietic Cells. R.I.Freshney et al eds, Vol pp.163-179, Wiley-Liss, Inc., New York, NY, 1994; 장기간 배양 개시 세포 측정, Sutherland,H.J. Culture of Hematopoietic Cells. R.I.Freshney et al eds, Vol pp.139-162, Wiley-Liss, Inc., New York, NY, 1994)과 관련됨을 나타낸다.
조직 성장 활성
본 발명의 단백질은 상처 치유 및 조직 수선 및 대치, 그리고 화상, 절상 및 궤양 등의 치료 뿐만 아니라, 뼈, 연골, 건(腱), 인대 및/또는 신경 조직 성장 또는 재생을 위한 조성물 내에서 또한 유용성을 가진다.
뼈가 일반적으로 형성되지 않는 조건하에서 연골 및/또는 뼈 성장을 유도하는 본 발명의 단백질은, 인간 및 기타 동물에서의 골절 및 연골 손상 또는 결함의 치유에 적용된다. 본 발명 단백질을 함유하는 이러한 제제는, 닫힌 골절의 예방뿐 아니라 열린 골절의 감소 효과를 가지며, 또한 인공 관절의 고정성을 개선할 수 있다. 골형성제에 의해 유도된 새로운 뼈 형성은, 선천적이거나 외상에 의한, 또는 종양 절제에 따른, 두개안면 결함의 치유와, 미용상 성형 수술에도 유용하다.
본 발명의 단백질은 치근막 질환의 치료, 및 기타 치아 치료 과정에 또한 유용하다. 이러한 시약은 골-형성 세포를 이끄는 환경을 제공하거나, 골-형성 세포의 성장을 촉진, 또는 골-형성 세포의 전구체의 분화를 유도할 수 있다. 본 발명의 단백질은, 뼈 및/또는 연골 수선의 촉진, 염증 과정에 의해 매개되는 조직 붕괴 과정 (콜라게나제 활성, 파골세포 활성 등) 또는 염증을 방지함으로써 골다공증 또는 골 관절염의 치료에 유용할 수 있다.
본 발명 단백질에 기대할 수 있는 조직 재생 활성의 다른 분야로는, 건/인대 형성이 있다. 조직이 형성되지 않는 환경 하에서 건/인대-유사 조직 또는 기타 조직 형성을 유도하는 본 발명의 단백질은, 인간 및 동물에서 건 또는 인대의 파열, 기형 및 기타 건 또는 인대의 결함을 치유하는데 적용된다. 건/인대 유사 조직 유도성 단백질을 포함하는 이러한 제제는, 건 또는 인대가 뼈 또는 인대 조직에 개선된 고정성을 가지도록 하는 것, 건 또는 인대 조직의 손상을 수선하는 것 뿐 아니라, 건 또는 인대 조직의 손상을 방지하는 예방적 용도를 가진다. 본 발명 조성물에 의한 드 노보 건/인대-유사 조직 형성은 선천성, 외상성, 또는 기타 다른 기원의 건 또는 인대 결함의 치료, 및 건 또는 인대를 수선 또는 부착시키는 미용상의 성형 수술에 또한 유용하다. 본 발명의 조성물은, 건- 또는 인대-형성 세포를 끌어 당기는 환경을 제공하거나, 건- 또는 인대-형성 세포 전구체의 성장을 촉진하고, 또는 건/인대 세포 또는 전구체의 생체외 성장을 유도하여 결국 생체내에서의 조직 치유를 유도한다. 본 발명의 조성물은 건염 (腱炎), 카팔 터널 증후군 (carpal tunnel syndrome) 및 기타 건 또는 인대 결함의 치유에 또한 유용하다. 조성물은 또한 당업계 공지의 적절한 기질 및/또는 담체로서의 분리제를 함유할 수 있다.
본 발명의 단백질은 신경 세포 증식과 신경 및 뇌 조직의 재생, 즉, 중추 및 말초 신경계 질환 및 신경병, 또한 신경 세포 및 신경 조직의 퇴화, 사멸 또는 외상을 일으키는 기계적 및 외상성 결함의 치유에 유용하다. 보다 특정하게는, 본 단백질은 말초 신경의 상처, 말초 신경병 및 국소 신경병과 같은 말초 신경계의 질환과, 알쯔하이머, 파킨슨, 헌팅턴 병, 근위축성측색경화증, 및 샤이-드래거 증후군 (Shy-Drager Syndrome)과 같은 중추 신경계 질환의 치료에 이용될 수 있다. 본 발명과 연관되어 치료될 수 있는 기타로는 척추질환, 머리 외상과 같은 기계적이고 외상성인 질환과, 스트로크와 같은 뇌혈관 질환이 있다. 화학치료 또는 다른 의학 치료에서 기인하는 말초 신경병 역시 본 발명의 단백질을 이용하여 치유 가능하다.
본 발명의 단백질은 아물지 않는 상처의 신속하고도 개선된 치유로, 프레셔 궤양에 제한 없이, 혈관부전, 수술 및 외상성 상처 관련 궤양 등의 치유에 또한 유용하다.
본 발명의 단백질은 또한, 장기 (예로써, 췌장, 간, 장, 신장, 피부, 내피 등), 근육 (평활근, 골격근, 또는 심근) 및 혈관 조직 (혈관 내피 포함)과 같은 기타 조직의 생성 및 재생, 또는 이들 조직을 구성하는 세포의 성장 촉진에 활성을 가질 수 있다. 목적하는 효과의 일부분은, 정상 세포가 재생되는 것을 허용하기 위해 섬유성 상처화의 억제 또는 조절하는 것에 의할 수 있다. 본 발명의 단백질은 또한 맥관형성 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 단백질은 장의 보호 또는 폐 또는 간 섬유증의 치료와 재생, 다양한 조직의 리퍼퓨젼 상처 (reperfusion injury), 전신성 사이토카인 손상으로 비롯된 증상의 치료에 또한 유용하다.
본 발명의 단백질은 또한 상기한 조직이 전구 조직 또는 세포로부터 분화되는 것을 촉진 또는 억제하는 것; 또는 상기 조직의 성장 억제에 유용하다.
본 발명의 단백질의 활성은, 다른 방법 중에서도, 하기의 방법에 의해 측정될 수 있다:
조직 생성 활성 측정은, 제한 없이 문헌에 기술된 것을 포함한다 (국제 특허 출원 번호 WO95/16035 (뼈, 연골, 건); 국제 특허 출원 번호 WO95/05846 (신경, 신경성); 국제 특허 출원 번호 WO91/07491(피부, 내피)).
상처 치유 활성 측정은, 제한 없이, 문헌에 기술된 것을 포함한다 (Winter, Epidermal Wound Healing, pps. 71-112 (Maibach, HI and Rovee, DT eds), Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago, Eaglstein and Mertz에 의한 개편, J. Invest. Dermatol. 71:382-84 (1978)).
액티빈/인히빈 활성
본 발명의 단백질은 액티빈- 또는 인히빈-연관 활성을 나타낼 수 있다. 인히빈은 난포 형성 호르몬 (FSH)의 분비를 막는 특징이 있으며, 액티빈은 난포 형성 호르몬 (FSH)의 분비를 촉진하는 특성이 있다. 따라서, 본 발명의 단백질은 단독 또는 인히빈 알파계 일원과의 헤테로다이머로서, 인히빈이 여성 포유류에서는 임신성을 감소시키는 능력과, 남성 포유류에서는 정자 생성을 감소시키는 능력에 기초하여, 피임약으로 유용할 수 있다. 다른 인히빈 적당량의 투여는, 이러한 포유 동물의 불임을 유도할 수 있다. 이와 다르게는, 본 발명의 단백질은 호모다이머 또는 인히빈 베타군의 다른 소단위체와의 헤테로다이머로서, 액티빈 분자가 뇌하수체 전엽 세포로부터 FSH 분비를 촉진시키는 능력에 기초하여, 임신 유도 치료로 유용할 수 있다. 예로써, 미국 특허 4,798,885를 참고한다. 본 발명의 단백질은 성적으로 미성숙한 포유동물의 생식성의 개시로의 진전에 유용하여, 소, 양 및 돼지와 같은 가축의 일생 동안의 번식능력을 제고시킨다.
본 발명의 단백질의 활성은, 다른 방법 중에서, 하기의 방법으로 측정될 수 있다:
액티빈/인히빈의 활성 측정은, 제한 없이 문헌에 기술된 것을 포함한다 (Vale et al, Endocrinology 91:562-572, 1972; Ling et al, Nature 321:779-782, 1986; Vale et al, Nature 321:776-779, 1986; Mason et al, Nature, 318:659-663, 1985; Forage et al, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83:3091-3095, 1986).
키모택틱/키모키네틱 활성
본 발명의 단백질은 포유류 세포, 예로써, 단구, 파이브로블라스트, 뉴트로필, T-세포, 마스트 세포, 에오시노필, 상피성 및/또는 내피성 세포에 대한 키모택틱/키모키네틱 활성 (예로써, 키모카인으로 작용)을 가진다. 키모택틱 및 키모키네틱 단백질은 목적 작용 부위에, 목적하는 세포 집단을 이동시키거나 끌어당길 수 있도록 하기 위해 사용될 수 있다. 키모택틱 또는 키모키네틱 단백질은 국소 염증 치료 뿐 아니라, 조직의 상처 또는 다른 외상의 치료에 특히 유리한 장점을 가진다. 일례로, 림포사이트, 단구 또는 뉴트로필이 종양 또는 감염 지역에 이끌리게되면, 종양 또는 감염제에 대항하여 개선된 면역 반응을 도모할 수 있다.
단백질 또는 펩타이드는 세포 집단을 직간접으로 목적하는 방향으로 자극하거나 또는 이동시킬 수 있다면, 그러한 특정 세포 집단에 대해 키모택틱 활성을 가진다. 바람직하게는, 단백질 또는 펩타이드는 목적 방향으로 세포를 직접적으로 자극하는 능력을 가진다. 세포 집단에 대해 특정 단백질이 키모택틱 활성을 가지는가의 여부는, 세포 키모택시스를 위한 공지의 단백질 또는 펩타이드 측정법을 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명 단백질의 활성은, 다른 방법 중에서도, 하기의 방법으로 측정될 수 있다:
키모택틱 활성의 측정 (키모택시스를 유도 또는 저해하는 단백질의 검증)은 단백질이 하나의 세포 집단을 다른 세포 집단으로 부착되도록 유도하는 능력뿐 아니라, 세포가 막을 건너서 이동할 수 있도록 단백질이 유도하는 능력을 측정한다. 이동과 부착에 대한 적당한 측정법으로는, 제한 없이, 문헌에 기술된 것을 포함한다 (Current Protocols in Immunology, J.E.Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Margulies, E.M.Shevach, W.Strober eds, Pub. Greene Publlishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 6.12, Measurement of alpha and beta Chemokines 6.12.1-6.12.28; Taub et al, J.Clin.Invest. 95:1370-1376, 1995; Lind et al, APMIS 103:140-146, 1995; Muller et al, Eur.J.Immunol. 25:1744-1748; Gruber et al, J.of Immunol. 152:5860-5867, 1994; Johnston et al, J. of Immunol. 153:1762-1768, 1994).
지혈 및 혈전 붕괴 활성
본 발명의 단백질은 지혈 및 혈전 붕괴 활성을 또한 나타낼 수 있다. 따라서, 이러한 단백질은 각종 응집 이상의 치료 (혈우병과 같은 유전성 질환 포함) 또는 외상, 외과적 수술, 또는 기타 원인에 의한 상처 치료에서 응집 및 기타 지혈 현상을 증대시키기 위한 것에 유용할 것으로 기대된다. 본 발명의 단백질은 혈전형성의 용해 또는 억제 및, 그로 인해 발생하는 증상 (예로써, 스트로크와 같은, 심장 및 중추 신경계 혈관의 경색등)의 치료와 방지에 유용할 수 있다.
본 발명 단백질의 활성은, 다른 방법 중에서도, 하기의 방법으로 측정될 수 있다:
지혈 및 혈전 붕괴 활성의 측정법은, 제한 없이, 문헌에 공지된 것을 포함한다 (Linet et al, J.Clin.Pharmacol. 26:131-140, 1986; Burdick et al, Thrombosis Res. 45:413-419, 1987; Humphrey et al, Fibrinolysis 5:71-79 (1991); Schaub, Prostaglandins 35: 467-474, 1988).
수용체/리간드 활성
본 발명의 단백질은 수용체, 수용체 리간드 또는 수용체/리간드 상호작용의 억제제 또는 애고니스트 활성을 나타낼 수 있다. 이러한 수용체와 리간드의 예로는, 제한 없이, 사이토카인 수용체와 그들 리간드, 수용체 카이네이즈와 그들 리간드, 수용체 포스파타아제와 그들 리간드, 세포-세포상호 작용 관련 수용체와 그들 리간드 (제한 없이, 세포 부착 물질 (셀렉틴, 인테그린 및 그의 리간드 등) 및 항원 발현, 항원 인식 및 세포와 액성 면역 반응 관련 수용체/리간드 쌍))를 포함한다. 수용체와 리간드는 수용체/리간드 상호 작용과 연관된 잠재성 펩타이드 또는 소분자 억제제를 스크리닝하는데 유용하다. 본 발명의 단백질은 (제한 없이, 수용체와 그들 리간드의 단편 포함) 그 자체로 수용체/리간드 상호작용의 억제제로서 유용할 수 있다.
본 발명의 단백질 활성은, 다른 방법 중에서, 하기의 방법으로 측정될 수 있다:
적절한 수용체-리간드 활성 측정법은 제한 없이 문헌에 기술된 것을 포함한다 (Current Protocols in Immunology, J.E.Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Margulies, E.M.Shevach, W.Strober eds, Pub. Greene Publlishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 7.28, Measurement of Cellular Adhesion under static conditions 7.28.1-7.28.22), Takai et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6864-6868, 1987; Bierer et al, J.Exp.Med. 168:1145-1156, 1988; Rosenstein et al, J.Exp.Med. 169:149-160, 1989; Stoltenborg et al, J. of Immunol. Methods 175:59-68, 1994; Stitt et al, Cell 80:661-670, 1995).
항-염증 활성
본 발명의 단백질은 항-염증 활성을 또한 나타낼 수 있다. 항-염증 활성은 염증 반응에 관련된 세포에 자극을 제공하거나, 세포-세포 상호작용을 억제 또는 촉진하거나 (예로써, 세포 부착 등), 염증 과정에 관련된 세포의 키모택시스를 억제 또는 촉진하거나, 세포 일혈 (溢血)을 억제 또는 촉진하거나, 염증 반응을 보다 직접적으로 자극 또는 촉진하는 기타 인자의 생성을 촉진 또는 억제함으로써 이루어진다. 이러한 활성을 가지는 단백질은, 제한 없이, 감염에 수반된 염증 (부패성 쇼크, 패혈증 또는 전신성 염증 반응 증후군 (SIRS)), 이스케미아-리퍼퓨젼 상처, 엔도톡신 치사성, 관절염, 보체-매개성 과민성 거부, 신장염, 사이토카인 또는 키모카인-유도성 폐 상처, 염증성 장 질환, 크론씨 병 또는 TNF 또는 IL-1과 같은 사이토카인의 과생성에 의한 결과를 포함하는, 만성 또는 급성 증상을 포함한 염증 증상을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 단백질은 또한, 항원성 물체 및 물질에 대한 아나필락시스 및 과민성현상을 치료하는데 사용될 수 있다.
종양 억제 활성
면역 치료 또는 종양 억제의 상기 활성 외에도, 본 발명의 단백질은 기타 항-종양 활성을 나타낼 수 있다. 단백질은 종양 생성을 직접 또는 간접 (예로써, ADCC를 통하여)으로 억제할 수 있다. 단백질은, 종양 성장을 유지시키는데 필요한 조직의 형성을 억제하고 (예로써, 맥관형성 억제 등), 종양 성장을 억제하는 기타 인자, 물질, 또는 세포 타잎의 형성을 촉진하고, 또는 종양 성장을 촉진하는 기타 인자, 물질, 또는 세포 타잎을 방지, 억제 또는 제거하는 작용을 종양 조직 또는 종양 전구 조직에서 실시하여 종양 억제 활성을 나타낼 수 있다.
기타 활성
본 발명의 단백질은 하기의 부가 활성 또는 효능을 하나 이상 가질 수 있다: 제한 없이, 박테리아, 바이러스, 균류 및 기타 기생충을 포함하는, 감염성 물질을 사멸시키거나, 또는 그들의 성장, 감염, 또는 기능을 억제; 제한 없이, 신장, 체중, 모발 색, 안(眼)색, 피부, 비만 대 야윔 비율 또는 기타 조직 착색, 또는 장기 또는 신체의 크기 및 형태 (예로써, 가슴 확대 또는 축소, 뼈의 형태 또는 모양의 변화 등)를 포함하는 신체 특성에의 영향 (억제 또는 촉진);여성 또는 남성 대상의 생식성에의 영향; 식이성 지방, 기름, 단백질, 탄수화물, 비타민, 미네랄, 보조인자 또는 기타 영양 인자 또는 성분 (들)의 대사, 동화, 이화, 처리, 사용, 축적 또는 제거에 대한 영향; 제한 없이, 식욕, 나른함, 스트레스, 인지 (인지 이상 포함), 우울함 (우울 이상 포함) 및 난폭 행동을 포함하는 행동 특성에 대한 영향; 진통 효과 또는 기타 통증 감소 효과의 제공; 조혈성계 이외의 엠브리오성 간 (幹)세포의 분화와 성장 촉진; 호르몬 및 내분비 활성; 효소의 경우, 효소 결핍의 보정 및 결핍-관련 질환의 치료; 과다증식 질환 (예로써, 건선 등)의 치료; 임뮤노글로블린-유사 활성 (예로써, 항원 또는 보체에 결합하는 능력 등); 및 단백질에 교차 반응성을 가지는 실재물 또는 단백질, 기타 물질에 대항하여 면역 반응을 증진하기 위한 백신 조성물에서, 항원으로 작용하는 활성.
하기의 실시예는, 인간 SDF-5 단백질을 회수 및 확인하고, DNA를 사용하여 기타 SDF-5 단백질을 회수하고, 인간 단백질을 수득하며, 재조합 기술을 사용하여 단백질을 발현하는 본 발명의 실시를 개시한다.
실시예 1: 쥐 SDF-5에 대응하는 인간 유사체의 클로닝
쥐 SDF-5 의 염기 서열 (개인적인 교류, Honjo 교수)는 GenBank에 문의하기 위해 사용하였다. DNA서열이 밝혀진 EST들은, cDNA의 5' 또는 3' 말단이 쥐 SDF-5 의 염기 서열과 높은 정도의 동일성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 각종 인간 EST들을 완전한 길이의 쥐 SDF-5 의 염기 서열과 정렬시켜, EST 서열이 유도된 클론 중 어느 것도 SDF-5 의 전체 코딩 서열을 포함하지 않음을 밝혀내었다. 쥐 SDF-5 의 염기 서열의 5'과 가장 잘 합치되는 EST는 H14917 이었다. 이 EST는 인간 가슴 조직 cDNA의 5' 말단 DNA 서열을 나타낸다. 쥐 SDF-5 와의 합치는 EST#H14917로 나타나는 인간 가슴 cDNA가, 5' 말단에서 약 147 개의 코딩 서열 염기가 결여되어 있음을 나타낸다.
쥐 SDF-5의 전체 길이 유도체를 분리하기 위한 시도로, H14917 서열의 18 내지 44 염기에 역 상보성인 비오틴화 올리고뉴클레오타이드 프로브 (5'-비오틴-ATCGATGCCGTGGCACAGCTGCAGGTTG-3')를 합성하였다. 이 프로브는 하기 조직에서 제조된 완전 길이의 5 개의 독립된 인간 cDNA 라이브러리를 이용한 용액 인리치먼트 방법에 사용되었다: 성인의 폐, 성인의 심장, 성인의 신장, 태아의 뇌, 및 유선 (乳線). 인리치먼트 후에, 각 인리치화 라이브러리에서 약 60,000 개의 칼러니를 10 개의 배지에 각각 접종시켜, 폴리뉴클레오타이드 카이네이즈 및 [g-32P]ATP로 레이블링한 동일한 올리고뉴클레오타이드를 프로브로 이용하여, 표준 칼러니 하이브리다이제이션 방법을 실시하였다. 기술상의 문제로, 유선 라이브러리에 대해서는 단지 4 개의 배지 (24,000 칼러니)만이 접종되었다. 유선 라이브러리만이 프로브에 하이브리다이즈된 cDNA 클론을 포함하는 것으로 판명되었다. 12 개의 양성 클론을 취하여, 배양시켜 재 접종한다. 재 접종된 양성 클론은 동일한 프로브로 다시금 하이브리다이즈시켜, 확인과 함께 순도를 검증한다. 초기 12 개의 양성 클론 모두 2차 하이브리드화에서도 시그널을 나타내었다. 4 개의 후보를 골라 DNA 시퀀싱을 실시한다. 인간 SDF-5의 전체 코딩 서열을 함유하며, 올바른 방향을 가진 단일 클론 (단리물 #4)을 골라서 다른 단리물과 비교하여 서열을 확인한다.
실시예 2
W-20 생분석
A. W-20 세포의 설명
지시세포주로서의 W-20 기질세포의 사용은 골형성 단백질, 예컨대 BMP 단백질로 처리후 이러한 세포의 골아세포-유사 세포로 전환에 기초한다 [Thies et al,Journal of Bone and Mineral Research, 5:305 (1990); and Thies et al, Endocrinology, 130:1318 (1992)]. 구체적으로, W-20 세포는 Dr.D.Nathan,Children's Hospital (Boston, MA) 의 연구소의 연구자에 의해 성숙한 쥐로부터 유래한 클로날 골수 기질세포주이다. 특정 BMP 단백질에 의한 W-20 세포의 처리는 (1) 증가된 알칼리 포스파타아제 생산, (2) PTH 자극 cAMP 의 유도 및 (3) 세포에의한 오스테오칼신 합성의 유도를 가져온다. (1) 및 (2) 는 골아세포 표현형과 관련된 특징을 보여주는 반면, 오스테오칼신 합성능력은 성숙 골아세포에의해 단지 보여지는 표현형 특성이다. 더욱이, 지금까지 W-20 기질 세포의 골아세포-유사 세포로의 전환은 단지 BMP 로 처리시 발견하였다. 이러한 방식으로, BMP 처리 W-20 세포에 의해 보여지는 실험관내 활성은 BMP 로 인해 알려진 생체내 골형성 활성과 상관관계가 있다.
새로운 골유도성 분자의 BMP 활성과 비교하여 유용한 2 개의 실험관 분석이 후술되어 있다.
B. W-20 알칼리 포스파타아제 분석 프로토콜
W-20 세포를 200㎕ 의 배지의 웰당 10,000 세포의 밀도로 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이트 시킨다 (10% 열불활성 태아송아지 혈청, 2mM 글루타민 및 100 단위/ml 페니실린+100㎍ 스트렙토마이신을 갖는 DME). 세포는 95% 공기, 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 37℃로 밤새워 부착되도록 한다. 200㎕ 의 배지는 멀티채널 피펫으로 각각의 웰로부터 제거하고, 10% 열불활성 태아송아지 혈청, 2mM 글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 갖는 DME 으로 운반되는 동량의 시험 시료로 대체한다. 시험 시료 및 표준을 W-20 지시세포와 함께 24 시간동안 인큐베이션시킨다. 24 시간후, 37℃ 의 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 시험배지를 세포로부터 제거한다. W-20 세포층은 칼슘/마그네슘이 없는 포스페이트 완충 염수의 웰당 200㎕로 3 회 세정하고 이 세정물은 버린다. 50㎕ 의 유리 증류수를 각 웰에 첨가하고 이어서 분석 플레이트를 급속냉동을 위하여 드라이아이스/에탄올조에 위치시킨다. 일단 냉동된면, 분석 플레이트는 드라이아이스 및/또는 에탄올 조로부터 제거하고 37℃ 에서 해빙시킨다. 이 단계를 총 3 냉동-해빙 절차를 통해 2 회이상 실시한다. 일단 완결되면, 막결합 알칼리 포스파타아제를 측정에 이용할 수 있다. 50㎕ 의 분석 혼합물 (50mM 글리신, 0.05% Triton X-100, 4 mM 염화마그네슘, 5mM p-니트로페놀 포스페이트, pH=10.3) 을 각각의 분석웰에 첨가하고 이어서 분석 플레이트를 60 진동/분로 37℃ 의 진탕수조에서 30 분간 인큐베인션시킨다. 30 분간의 인큐베이션 말미에 각각의 웰에 100㎕ 의 0.2 N NaOH 를 첨가하여 반응 종결시키고 분석 플레이트를 빙상에 놓는다. 각각의 웰에 대한 분광계흡수도를 405nm 에서 읽는다. 이어서 이 값을 공지의 표준값과 비교하여 각각의 시료에서 알칼리 포스파타아제 활성을 평가한다. 예컨대, 공지량의 p-니트로페놀 포스페이트를 이용하여 흡광도 값을 발생시킨다. 이것은 표 I 에 나타내었다.
p-니트로페놀 포스페이트의 공지의 표준에 대한 흡광도값
p-니트로페놀 포스페이트 umoles 평균흡광도(405nm)
0.000 0
0.006 0.261+/-.024
0.012 0.521+/-.031
0.018 0.797+/-.063
0.024 1.074+/-.061
0.030 1.305+/-.083
공지량의 BMP 에 대한 흡광도 값은 측정하여 표 II 에 나타낸 바와 같이 단위시간당 절단된 p-니트로페놀 포스페이트 (μmol) 로 전환시킬 수 있다.
BMP-2 로처리된 W-20 세포에 대한 알칼리 포스페이트값
BMP-2 농도 ng/ml 405 nm 에서의 흡광도 시간당 μmol 기질
0 0.645 0.024
1.56 0.696 0.026
3.12 0.765 0.029
6.25 0.923 0.036
12.50 1.121 0.044
25.0 1.457 0.058
50.0 1.662 0.067
100.0 1.977 0.080
이어서 이값은 공지량의 SDF-5 내지 BMP-2 의 활성과 비교하는데 사용한다.
C.오스테오칼신 RIA 프로토콜
웰당 10% 열불활성된 태아송아지 혈청, 2mM 글루타민을 함유한 DME 가 2ml 씩 들어있는 24 웰 멀티웰 조직 배양 디쉬에서 웰당 106세포로 W-20 세포를 플레이트시킨다. 세포를95% 의 공기, 5% 이산화탄소의 대기에서 37℃ 로 밤새워 부착시킨다. 다음날 배지를 10% 태아송아지 혈청, 2mM 글루타민 및 시험물질을 2ml 의 총량으로 함유하는 DME 로 바꾼다. 각각의 시험물질을 삼중웰에 투여한다. 시험물질은 동일한 시험 물질 배지로 48 시간때 대체하여 총 96 시간동안 W-20 세포와 인큐베이션시킨다. 96 시간의 말미에, 50㎕ 의 시험 배지를 각각의 웰로부터 제거하고 마우스 오스테오칼신에 대한 방사선면역검정을 이용하여 오스테오칼신 생산에 대해 분석한다. 분석의 상세한 것은 Biomedical Technologies Inc., 378 Page Street, Stoughton, MA 02072 에 의해 제작된 키트에 기술되어 있다. 분석용 시약은 상품번호 BT-431 (마우스 오스테오칼신 표준), BT-432 (염소 항-마우스 오스테오칼신), BT-431R (요오드화 마우스 오스테오칼신),BT-415 (정상 염소 혈청) 및 BT-414 (당나귀 항 염소 IgG) 으로 알려져 있다. BMP 처리에 대한 반응에서 W-20 세포에 의해 합성된 오스테오칼신에 대한 RIA 는 제조자에 의해 제공되는 프로토콜에 기재된 바와 같이 실행한다.
시험 시료에서 수득한 값을 마우스 오스테오칼신의 공지된 표준 값 및 공지량의 BMP-2 에 의한 공격에 대한 반응에서 W-20 세포에 의해 생성되는 오스테오칼신의 양과 비교한다. W-20 세포에 의한 BMP-2 유도 오스테오칼신 합성에 대한 값은 표 III 에 나타내었다.
W-20 세포에의한 오스테오칼신 합성
BMP-2 농도 ng/ml 오스테오칼신 합성 ng/웰
0 0.8
2 0.9
4 0.8
8 2.2
16 2.7
31 3.2
62 5.1
125 6.5
250 8.2
500 9.4
1000 10.0
실시예 3
로젠 수정 샘퍼시-레디 분석
Sampath and Reddi, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 80:6591-6595(1983) 에 기재되어 있는 쥐골형성 분석의 수정버젼은 신규의 골유도 또는 연골유도 단백질의 골 및/또는 연골 및/또는 기타 연결 조직 활성을 평가하는데 사용된다. 이러한 수정 분석은 여기에서 로젠-수정 샘퍼시-레디 분석으로 부른다. 샘퍼시-레디 절차의 에탄올 침전단계는 분석하고자 하는 분획을 물에 대하여 투석 (만일 조성물이 용액이면) 또는 디아필터링 (만일 조성물이 현탁액이면) 하여 대체한다. 이어서 용액 또는 현탁액을 0.1% TFA 로 평형화시킨다. 생성된 용액은 쥐 매트릭스 20 mg 로 첨가한다. 단백질로 처리되지 않은 머크 쥐 매트릭스 시료는 대조군으로 쓰인다. 이 재료는 냉동 동결건조하고, 생성된 분말을 #5 젤라틴 캡슐에 봉입한다. 캡슐은 생후 21-49 일의 수컷 롱에반 쥐의 복부 흉곽부분에 피하이식한다. 7-14 일후 이식체를 제거한다. 각 이식체의 반은 알칼리 포스파타아제 분석에 사용한다 [참조, Reddi et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 69:1601 (1972)]
각 이식체의 다른 반은 고정 처리하여 조직학적 분석을 한다. 1㎛ 글리콜메타크릴레이트 섹션을 본코사 및 산 퓨신으로 염색하여 각각의 이식체에 존재하는 유도된 골 및 연골 및 기타 연결 조직 형성을 평가한다. +1 내지 +5 는 새로운 골 및/또는 연골 세포 및 매트릭스에 의해 차지된 이식체의 각각의 조직학적 섹션의 부분을 나타낸다. + 5 는 이식체의 50% 이상이 이식체내 단백질의 직접적 결과로서 생성된 새로운 골 및/또는 연골임을 나타낸다. +4, +3, +2 및 +1 은 이식체의 각각이 40%, 30%, 20% 및 10% 이상 새로운 연골 및/또는 골을 함유하고 있음을 나타낸다.
이와는 달리, 이식체는 동일 평판에서 배향되어 있고 빽빽히 밀집되어 있는 밀집다발의 섬유아세포의 존재로 쉽게 알 수 있는 배아성 건을 닮은 조직의 외관에 대해 검사한다 [건/인대유사조직은, 예컨대, [Ham and Cormack, Histology (JB Lippincott Co.(1979), pp. 367-369] 에 기재되어 있고, 이의 개시는 여기에 참조로 포함되어 있다]. 이러한 발견은 건/인대유사 조직이 이식체를 함유하는 SDF-5 단백질에서 관찰되는 추가의 분석에서 재생될 수 있다. 이러한 발견의 SDF-5 는 이러한 분석에 대한 활성에 대하여 평가할 수 있다.
실시예 4
SDF-5 의 발현
뮤린, 인간 또는 포유류 SDF-5 단백질을 제조하기 위하여, 이를 코딩하는 DNA 를 적당한 발현 벡터로 옮기고 포유류 세포 또는 기타 바람직한 진핵세포 또는 원핵세포에 통상의 유전공학적 기술로 도입시킨다. 생물학적으로 활성인 재조합 인간 SDF-5 에 대한 바람직한 발현 시스템은 안정적으로 형질전환된 포유류 세포인 것으로 사료된다.
당분야의 당업자는 SEQ ID NO : 1 의 서열, SDF-5 단백질을 코딩하는 다른 DNA 서열 또는 다른 수정된 서열 및 공지된 벡터, 예컨대, pCD [Okayama et al., Mol. Cell Biol., 2:161-170 (1982)], pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4:645-653 (1985)] 및 pMT2 CXM 를 이용하여 포유류 발현 벡터를 구축할 수 있다.
포유류 발현벡터 pMT2 CXM 은 테트라사이클린 내성 유전자 대신에 암피실린 내성 유전자를 함유하고, 추가로 cDNA 클론의 삽입을 위한 XhoI 부위를 포함하는 점에서 p91023(b)(Wong et al., Science 228:810-815, 1985) 와는 상이한 이의 유도체이다. pMT2 CXM의 기능요소는 기술되어 있고 (Kaufman,R.J., 1985, Proc, Natl.Acad.Sci.USA 82:289-693), 아데노바이러스 VA 유전자, 72bp 인핸서를 포함하는 복제의 SV 40 오리진, 5' 스플라이스 부위 및 아데노바이러스 레이트(late) mRNA 에 존재하는 대부분의 아데노바이러스 3 부 리더 서열을 포함하는 아데노바이러스 메이저 레이트 프로모터, 3' 스플라이스 수용체 부위, DHFR 삽입체, SV40 얼리 폴리아데닐화 부위 (SV40) 및 대장균에서 증식에 필요한 pBR322 서열을 포함한다.
플라스미드 pMT2 CXM 은 ATCC (미국 메릴렌드 로크빌) 에 기탁번호 ATCC 67122 로 기탁된 pMT2-VWF 의 EcoRI 소화로 수득된다. EcoRI 소화는 pMT2-VWF 에 존재하는 cDNA 삽입체를 절단하여, 접합될 수 있고 암피실린에 대해 내성을 갖도록 대장균 HB 101 또는 DH-5 를 형질전환시키는데 사용하는 선형형태의 pMT2 를 산출시킨다. 플라스미드 pMT2DNA 는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 이어서 pMT2 CXM 는 루트아웃/인 돌연변이를 이용하여 구축한다 [Morinaga, et al., Biotechnology 84: 636 (1984)]. 이것은 복제의 SV 40 오리진 및 pMT2 의 인핸서 서열 부근의 HindIII 부위와 관련된 염기 1075 내지 1145 을 제거시킨다. 또한 이는 하기 서열을 뉴클레오티드 1145 에 삽입시킨다 :
이 서열은 제한 엔도뉴클레아제 XhoI 에 대한 인식부위를 함유한다. pMT23 으로칭한 pMT2 CXM 의 유도체는 제한 엔도뉴클레아제 PstI, Eco RI, SalI 및 XhoI 에 대한 인식 부위를 함유한다. 플라스미드 pMT2 CXM 및 pMT23 DNA 는 통상의 방법으로 제조할 수 있다.
또한 pMT21 로부터 유래한 pEMC2β1 는 본발명의 실행에 있어 적합하다. pMT21 은 pMT2-VWF 유래의 pMT2 에서 유래한다. 전술한 바와 같이 EcoRI 소화는 pMT-VWF 에 존재하는 cDNA 삽입체를 절단하여, 접합될 수 있고, 암피실린에 대해 내성을 갖도록 대장균 HB 101 또는 DH-5 를 형질전환시키는데 사용하는 선형형태의 pMT2 를 산출시킨다. 플라스미드 pMT2 DNA 는 통상의 방법으로 제조할 수 있다.
pMT21 은 하기의 두 수정을 통하여 pMT2 로부터 유래한다. 첫번째, cDNA 클로닝을 위한 G/C 테일링유래의 연속 19G 잔기를 포함하는 DHFR cDNA 의 5' 비번역 영역의 76bp 를 결실시킨다. 이 과정에서, XhoI 부위를 삽입하여 DHFR 로부터 바로 상류의 하기 서열을 수득한다 :
둘째로, 단일 ClaI 부위를 EcoRV 및 XbaI 로 소화시켜 도입하고, DNA 폴리머라아제 I 의 클레나우 단편으로 처리하고 ClaI 링커(CATCGATG) 에 접합시킨다. 이것은 아데노바이러스 조합 RNA(VAI) 영역유래의 250bp 단편을 결실시키나 VAI RNA 유전자 발현 또는 기능을 방해하지 않는다. pMT21 은 EcoRI 및 XhoI 로 소화시키고, 벡터 pEMC2B1 를 유도하는데 사용한다.
EMCV 리더의 일부는 EcoRI 및 PstI 로 소화시켜 pMT2-ECAT1 [S.K. Jung, et al, J.Virol 63:1651-1660 (1989)] 로부터 2752bp 단편을 수득한다. 이 단편을 저용융 아가로오스 겔상에서 전기영동하여, 정제된 508 bp 의 EcoRI-TaqI 단편을 산출하는 TaqI 로 소화시킨다. 68bp 아답터 및 이의 보상가닥은 하기 서열을 갖는 5'TaqI 돌출 말단 및 3'XhoI 돌출말단과 합성한다 :
이서열은 뉴클레오티드 763 내지 827 의 EMC 바이러스 리더 서열과 합치된다. 이는 또한 EMC 바이러스 리더내의 위치 10 에서 ATG 를 ATT 로 변화시키고 뒤에 XhoI 부위가 뒷따른다. pMT21 Eco RI-XhoI 단편, EMC 바이러스 EcoRI-TaqI 단편 및 68bp 올리고뉴클레오티드 어답터 TaqI-XhoI 어답터의 세가지방법의 접합은 벡터 pEMC2β1 을 가져온다.
상기 벡터는, 포유동물 세포에서 목적하는 cDNA 의 고발현시키기 위해 적절한 관련성을 갖는, SV-40 의 복제 오리진 및 인헨서, 아데노비루스 메이저 레이트 프로모터, 아데노비루스 트리파티트 리더 서열의 대부분의 cDNA 카피, 작은 혼성 개재배열, SV40 폴리아데닐화 시그날 및 아데노비루스 VA I 유전자, DHFR 및 β-락타마제 마커 및 EMC 서열을 함유한다.
벡터의 구축은 SDF-5 DNA 서열의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, SDF-5 cDNA 는 코딩 영역의 5' 및 3' 말단에서 비-코딩 뉴클레오티드를 제거하므로써 변형될 수 있다. 결실된 비-코딩 뉴클레오티드는 발현에 유익한 것으로 공지된 다른 서열들로 대체될 수도 또는 되지 않을 수도 있다. 상기 벡터는 SDF-5 단백질의 발현을 위해 적절한 숙주세포로 형질전환된다. 또한, SEQ ID NO:1 의 서열 또는 SDF-5 단백질을 코딩하는 다른 서열은 SDF-5 프로펩티드 서열을 결실시키고 그들을 다른 분비 단백질의 완전한 프로펩티드를 코딩하는 서열로 대체시키므로써 성숙 SDF-5 단백질을 발현하도록 조작될 수 있다.
당 분야의 숙련자는 코딩 서열의 측면에 있는 포유류 조절 서열을 제거하거나 박테리아성 서열로 대체시킴으로써 SEQ ID NO:1 의 서열을 조작하여 박테리아 세포에 의한 세포내 또는 세포외 발현을 위한 박테리아성 벡터를 제조할 수 있다. 예를 들어, 코딩 서열은 더 조작될 수 있다 (예를 들어, 기타 공지된 링커에 결찰시키거나, 비-코딩 서열을 그로부터 결실시키거나 또는 다른 공지된 기술에 의해 그 안에서 뉴클레오티드를 변경시킴으로써 변형시킨다). 변형된 SDF-5 코딩 서열을 이어서 문헌 [T. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5230-5233 (1980)] 에 기재된 방법을 이용하여 공지된 박테리아성 벡터로 삽입시킬 수 있다. 이러한 예시적인 박테리아성 벡터를 이어서 박테리아 숙주 세포로 형질전환시키고, 그에 의해 SDF-5 단백질이 발현된다. 박테리아 세포내에서 SDF-5 단백질을 세포외 발현시켜 생성하는 방법은 유럽 특허 출원 EPA 177,343 호를 참고한다.
곤충 세포에서의 발현을 위한 곤충 벡터의 구축을 위해 유사한 조작법을 수행할 수 있다 [참고, 유럽 특허 출원 제 155,476 호에 기재된 방법]. 효모 세포에 의한 본 발명의 인자들의 세포내 또는 세포외 발현을 위해 효모 조절 서열을 이용하는 효모 벡터 또한 구축될 수 있다 [참고, PCT 출원 WO86/00639 호 및 유럽 특허 출원 EPA 123,289 호에 기재된 방법].
포유동물 세포내에서 본 발명의 SDF-5 단백질을 높은 수준으로 생성하는 방법은 이형 SDF-5 유전자를 여러 카피 함유하는 세포의 구축을 수반할 수 있다. 이형 유전자는, 증가된 유전자 카피를 함유하는 세포가 문헌 [Kaufman 및 Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-629 (1982)] 에 기재된 방법에 의해 메토트렉세이트 (MTX) 의 농도가 증가함에 따라 증식을 위해 선택될 수 있도록 증폭가능한 마커, 예를 들어, 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자에 연결된다. 이러한 시도는 수 많은 상이한 세포 유형에 이용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 SDF-5 단백질의 DNA 서열을 그의 발현을 가능케 하는 다른 플라스미드 서열과 작용적으로 연결하여 함유하는 플라스미드 및 DHFR 발현 플라스미드 pAdA26SV(A) [Kaufman 및 Sharp, Mol. Cell. Bio., 2:1304 (1982)] 를 DHFR-결핍 CHO 세포인, DUKX-BII 로 인산칼슘 공침전법 및 트랜스펙션, 전기천공법 또는 프로토플라스트 융합법을 포함하는 각종 방법들에 의해 함께 도입시킬 수 있다. DHFR 발현 형질전환체는 투석된 소 태아 혈청을 포함하는 알파 배지에서의 성장에 의해 선별되고, 이어서 문헌 [Kaufman et al., Mol Cell Biol., 5:1750 (1983)] 에 기재된 바와 같이 MTX 의 농도가 증가 (예를 들어, 0.02, 0.2, 1.0 및 5 μM MTX 로 순차적 단계) 함에 따른 성장에 의한 증폭에 대해 선별된다. 형질전환체를 클론시키고, 생물학적 활성 SDF-5 발현을 실시예 3 에 상기 기재된 로센-변형된 샘패트-레디 래트 본 형성 검정법 (Rosen-modified Sampath-Reddi rat bone formation assay) 에 의해 모니터한다. SDF-5 단백질 발현은 MTX 내성 수준이 증가함에 따라 증가되어야 한다. SDF-5 폴리펩티드는 [35S] 메티오닌 또는 시스테인으로의 펄스 표식법 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 당 분야의 공지된 표준 기술을 사용하여 특성화된다. 유사한 방법들을 잇따라 수행하여 다른 관련 단백질들을 생성할 수도 있다.
실시예 5
발현된 SDF-5 의 생물학적 활성
상기 실시예 4 에서 수득된 발현 SDF-5 단백질의 생물학적 활성을 측정하기 위해서, 단백질을 세포 배양액으로 부터 회수하고 정제하여 함께 생성된 단백질성 물질 뿐 아니라 다른 오염물질로 부터 SDF-5 단백질을 분리시킨다. 정제된 단백질을 실시예 3 에 기재된 래트 본 형성 검정법 및 본 명세서에 기재된 다른 검정법에 따라 검정할 수 있다.
정제법은 당 분야의 숙련자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 수행된다.
단백질 분석은 은 [Oakley, et al., Anal. Biochem. 105:361 (1980)] 으로 염색되는 SDS-PAGE 아크릴아미드 [Laemmli, Nature 227:680 (1970)] 및 면역블롯팅법 [Towbin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350 (1979)] 와 같은 표준 기술을 사용하여 수행된다.
실시예 6
노던 분석법을 사용하여, SDF-5 단백질을 각종 세포주에 대한 그의 효과에 대해 시험할 수 있다. 적합한 세포주로는 E13 마우스 림 버드 (E13 mouse limb buds) 로 부터 유래된 세포주가 포함된다. SDF-5 단백질로 처리한 지 10 일 후, 세포 표현형을 조직 분화의 표식에 대해 조직학적으로 조사한다. 또한, SDF-5 단백질 처리된 세포로 부터의 mRNA 의 노던 분석을, 표 IV 에 기재된 바와 같이, 뼈, 연골 및/또는 건/인대에 대한 하기의 마커를 하나 이상 포함하는 각종 마커에 대해 수행할 수 있다:
마커 뼈 연골 건/인대
오스테오칼신 + - -
알칼린 포스파타제 + - -
프로테오글리칸 코어 단백질 +/-1 + +2
콜라겐 타입 I + + +
콜라겐 타입 II +/-1 + +2
데코린 + + +
엘라스틴 +/-3 ? +
1-초기에는 보이나 성숙한 뼈 조직이 형성됨에 따라 보이지 않는 마커2-건의 위치에 따른 마커; 뼈 접점에서 가장 강함3-낮은 수준에서 보이는 마커
실시예 7 발현 분석
인 시튜(in situ) 혼성법은 마우스 태아의 10.5 - 15.5 dpc 부분에서 SDF-5 mRNA 를 위치확인하는데 사용된다. SDF-5 는 부속 골격의 발달하는 관절 및 일부 건 및 인대에서 발현된다. 축 또는 부속 골격의 뼈 또는 근육에서는 발현이 검출되지 않는다. 이러한 분명한 관찰은 SDF-5 가 결합조직 형성에 관여한다는 것을 강하게 함축하고 있다. 이러한 결과들로 부터, 연골 형성이 SDF-5 에 의해 조절될 것이라는 것이 가장 가망성있게 보이고, 이러한 정보는 시험관내 검정을 이용한 상기 단백질의 평가를 근거로 하고 있다.
시험관내 활성
쥐 SDF-5 를 CHO 세포에서 발현시킨다. MLB 13MYC-클론 14 세포를 군집 성장시켜, SDF-5, BMP-2, SDF-5, BMP-2 의 조합중 어느 하나로 처리하거나 또는 비처리한다. SDF-5 함유 CHO 조절된 배지를 1:20 희석율(∼10 ng/ml 최종농도)로 사용하고, CHO 세포로 부터의 모의 조절된 배지를 BMP-2 빛 비처리된 세포 배양액에 첨가하고, BMP-2 를 100 ng/ml 로 사용한다. 4 일 후, RNA 를 수합하여 진칩 50 스캐너 (GeneChip 50 Scanner, Affymetrix) 로 유전자 발현을 분석한다. 비처리 또는 SDF-5 처리된 세포에 있어서는, 뼈 또는 연골 표현형을 특징으로 하는 유전자 발현이 검출되지 않는다. BMP-2 는, 약간의 연골성 마커와 함께, 비대성 연골 및 뼈 마커 유전자의 발현을 유도한다. SDF-5 및 BMP-2 의 조합으로 처리된 세포에서는, BMP-2 만 처리한 경우와 비교하여, 뼈 (오스테오칼신; 알칼린 포스파타제; PTH/PTHrP 수용체) 및 비대성 연골 마커 (X 형 연골) 이 상당히 감소되거나 없고, 연골에 대한 마커 (콜라겐 타입 II 및 IX; 데코린; 아그레칸) 이 증가한다. 상기 효과는 SDF-5 조합에 대한 연골 표현형이 보다 더 향상된 것 처럼 보이는 것을 제외하고는, PTHrP 와 BMP2 의 조합에 대해 이전에 관찰된 것과 유사하다.
실시예 8 : 태아 간세포 검정
본 발명의 SDF-5 단백질의 효과를 검정하기 위해서, 수 많은 유용한 태아 간세포에 대해 시험관내에서 성장 및 분화 효과를 검정하는 것이 가능하다. 이러한 세포주로는 ES-E14TG2 로, 이는 아메리카 타입 컬쳐 콜렉션으로 부터 이용 가능하다 (Americal Type Culture Collection in Rockville, Md).
검정을 수행하기 위해서, 세포를 100 유니트의 LIF 의 존재에서 증식시켜 비분화된 상태로 유지한다. 검정은 처음에 LIF 를 제거하고 현탁액중 배상체로 알려져 있는 세포를 수합하는 것으로 구성된다. 3 일후, 배상체를 젤라틴 도포된 플레이트(PCR 분석용 12 웰 플레이트, 면역세포화학용 24 웰 플레이트)상에 플레이트시키고, 검정할 단백질로 처리한다. 세포에 영양분을 공급하고 2-3 일 마다 단백질 인자로 처리한다. 15 % 소 태아 혈청 (FBS) 또는 보다 적은 양의 FBS 를 함유하는 CDM 한정 배지가 추가공급된 배지에서 검정이 수행될 수 있도록 세포는 적응될 수 있다.
처리 기간(7 내지 21 일 간)의 마지막에 RNA 를 세포로 부터 수합하고 하기 마커에 대해 정량적 멀티플렉스 PCR 로 분석한다: 중배엽 마커인 프라치어리 (Brachyury), 외배엽 마커인 AP-2, 및 내배엽 마커인 HNF-3α. 면역세포화학을 통해, 신경세포 (교질세포 및 뉴런), 근육세포(심근세포, 골격근 및 평활근), 및 프로테오글리칸 코어 단백질 (연골)과 같은 각종 다른 표현형 마커 및 사이토케라틴 (상피)의 분화를 확인할 수 있다. 상기 세포들은 LIF 가 제거되는 경우 자동적으로 분화되는 경향이 있으므로, 결과는 항상 비처리된 대조군와의 비교에 의해서 정량된다.
상기 설명은 본 발명의 바람직한 구현예를 상세하게 나타내고 있다. 실제로 그의 많은 개량 및 변형이 상기 기재를 감안하여 당 업자에 의해 일어날 것으로 예상된다. 이러한 개량 및 변형은 본 명세서에서 첨부된 청구범위내 포함되는 것으로 간주된다.
서열 목록
(1) 일반 정보 :
(i) 출원인 : 라벨리, 에드워드, 라시, 리자
(ii) 발명의 명치 : 인간 SDF-5 단백질 및 조성물
(iii) 서열의 수 : 3
(iv) 통신주소:
(A)수취인 : 제네틱 인스티튜트 인코포레이티드
(B)거리 : 87 캠브릿지파크 드라이브
(C)시 : 캠브릿지
(D)주 : 메사츄세트
(E)국가 : 미국
(F)우편번호 : 02140
(v) 컴퓨터 판독형태 :
(A)매체형 : 플로피 디스크
(B)컴퓨터: IBM PC 호환성
(C)작동시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D)소프트웨어 :PatentIn Release #1.0, 버젼 #1.25
(vi) 현출원데이타 :
(A) 출원번호 :
(B) 출원일 :
(C) 분류:
(viii) 대리인 정보:
(A) 성명 : 라자 스티븐 알
(B) 등록번호 : 32,618
(ix) 텔레커뮤니케이션 정보 :
(A)전화 :(617) 498-8260
(B)팩스 :(617) 876-5851
(2) SEQ ID NO : 1 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 2027 bp
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토포로지 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (genomic)
(xi) 서열의 기재방법: SEQ ID NO : 1 :
(2) SEQ ID NO : 2 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 295 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토포로지 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
(xi) 서열의 기재방법: SEQ ID NO : 2 :
(2) SEQ ID NO : 3 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 275 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토포로지 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
(xi) 서열의 기재방법: SEQ ID NO : 3 :

Claims (27)

  1. 하기로 이루어진 군에서 선택한 DNA 서열을 포함하는 단리된 DNA 서열 :
    (a) SEQ ID NO : 1 의 뉴클레오티드 #256, 307, 310, 313, 316, 319, 322, 325 또는 328 내지 #1140 또는 1143 ; 및
    (b) 염격한 하이브리드화 조건하 (a) 에 하이브리다이즈하고 프라즐드 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 서열.
  2. 하기로 이루어진 군에서 선택한 DNA 서열을 포함하는 단리된 DNA 서열 :
    (a) SEQ ID NO : 2 의 아미노산 #1, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 내지 #295 을 코딩하는 뉴클레오티드;
    (b) SEQ ID NO : 3 의 아미노산 #1 내지 275 를 코딩하는 뉴클레오티드; 및
    (b) 염격한 하이브리드화 조건하 (a) 또는 (b) 에 하이브리다이즈하고 프라즐드 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 서열.
  3. 발현 조절 서열과 기능적으로 연계된 제 1 항의 DNA 분자를 함유하는 벡터.
  4. 발현 조절 서열과 기능적으로 연계된 제 2 항의 DNA 분자를 함유하는 벡터
  5. 제 3 항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  6. 제 4 항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  7. 하기로 이루어진 군에서 선택한 DNA 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자 :
    (a) SEQ ID NO : 1 의 뉴클레오티드 #316 내지 # 1143 ; 및
    (b) (a) 의 천연의 대립유전자 서열 및 등가의 중첩성 코돈 서열.
  8. 발현 조절 서열과 기능적으로 연계된 제 7 항의 DNA 분자를 함유하는 벡터
  9. 제 8 항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  10. SEQ ID NO : 1 의 뉴클레오티드 #316 내지 # 1143 를 포함하는, 인간 SDF-5 단백질을 코딩하는 단리된 DNA 분자.
  11. 제 10 항에 있어서, DNA 코딩 서열에 대해 적합한 시그널 펩티드 5' 를 코딩하고, 프레임에서 DNA 코딩 서열에 연결되어 있는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 단리된 DNA 분자.
  12. 발현 조절 서열과 기능적으로 연계된 제 11 항의 DNA 분자를 포함하는 벡터
  13. 제 12 항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  14. SEQ ID NO : 1 의 뉴클레오티드 #256 내지 # 1143 를 포함하는, 인간 SDF-5 단백질을 코딩하는 단리된 DNA 분자.
  15. 하기의 단계로 이루어진 정제된 인간 SDF-5 단백질의 제조방법 :
    (a) 인간 SDF-5 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 제 1 항에 따른 DNA 서열로 형질전환시킨 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 배양 배지로부터 상기 인간 SDF-5 단백질을 회수 및 정제하는 단계.
  16. 하기의 단계로 이루어진 정제된 인간 SDF-5 단백질의 제조방법 :
    (a) 인간 SDF-5 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 제 2 항에 따른 DNA 서열로 형질전환시킨 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 배양 배지로부터 상기 인간 SDF-5 단백질을 회수 및 정제하는 단계.
  17. 하기의 단계로 이루어진 정제된 인간 SDF-5 단백질의 제조방법 :
    (a) 인간 SDF-5 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 제 7 항에 따른 DNA 서열로 형질전환시킨 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 배양 배지로부터 상기 인간 SDF-5 단백질을 회수 및 정제하는 단계.
  18. SEQ ID NO : 2 또는 SEQ ID NO : 3 에 따른 아미노산 서열을 함유하는 정제된 인간 SDF-5 폴리펩티드.
  19. 하기의 단계들에 의해 생성된 정제된 인간 SDF-5 단백질 :
    (a) SEQ ID NO : 1 에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 #316 내지 #1143 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 로 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) SEQ ID NO : 2 에 나타낸 바와 같은 아미노산 #21 내지 #295 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 상기 배양 배지로부터 회수 및 정제하는 단계.
  20. 제 19 항에 따른 인간 SDF-5 폴리펩티드 1 종이상을 치료량으로 함유하는 조성물.
  21. 유효량의 제 20 항의 조성물을 췌장 유전자 조정을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 췌장 유전자 조정을 필요로 하는 환자에 있어서 췌장 유전자의 조정을 변경하는 방법.
  22. SEQ ID NO : 2 의 아미노산 #1 내지 #295 의 아미노산 서열을 포함하는 정제된 인간 SDF-5 단백질.
  23. SEQ ID NO : 3 의 아미노산 #1 내지 #275 의 아미노산 서열을 포함하는 정제된 인간 SDF-5 단백질.
  24. 제 22 항에 따른 정제된 인간 SDF-5 단백질에 대한 항체.
  25. SEQ ID NO : 3 의 아미노산의 서열을 포함하고 하나이상의 유전자의 전사를 조정하는 능력을 갖은, 약 30 내지 약 35 kd 의 분자량을 갖는 정제된 인간 SDF-5 단백질.
  26. 제 25 항에 따른 정제된 인간 SDF-5 단백질에 대한 항체.
  27. BMP-2 및 SDF-5 를 함유하는 조성물을 적용하는 것을 특징으로하는 세포의 연골세포로의 분화를 증가시키는 방법.
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