KR20000036012A - 골 형태발생 단백질-16 (bmp-16) 조성물 - Google Patents

골 형태발생 단백질-16 (bmp-16) 조성물 Download PDF

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셀레스테안쏘니제이.
머레이베쓰엘.
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브루스 엠. 에이센, 토마스 제이 데스로저
제네틱스 인스티튜트, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 정제 BMP-16 단백질 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 단백질은 골, 연골, 힘줄, 인대 및 반월판을 포함하는 기타 결합조직 상해 및 장애의 치료, 상처 치료 및 관련 조직 상해회복, 및 표피, 신경, 심근을 포함하는 근육, 기타 조직 및 상처, 및 간, 폐, 심장, 췌장 및 신장 조직과 같은 기관을 포함하는 조직에 대한 장애 및 상해의 치료용으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 단백질은 미분화 배아 및 스템 세포의 성장 및/또는 분화의 유도에 사용될 수 있다.

Description

골 형태발생 단백질-16 (BMP-16) 조성물 {BONE MORPHOGENETIC PROTEIN-16 (BMP-16) COMPOSITIONS}
골 및 기타 조직 추출물내에 존재하는 골-, 연골-, 및 기타 결합조직-유도 활성이 있는 분자(들)에 대한 탐색을 통하여 골 형태발생 단백질(BMP)이라 불리는 신규 분자군이 발견되었다. BMP-1 에서 BMP-15 로 칭해지는 몇몇 단백질의 구조가 이미 밝혀져 있다. 골 내에 존재한다는 것과 함께, 상기 단백질의 독특한 유도활성은, 이들이 골 상해회복 과정의 중요한 조절자라는 것과, 골 조직의 정상적인 유지에 관여할 수 있다는 것을 시사하고 있다. 이 과정에 작용하는 추가적인 단백질, 특히 인간 단백질이 존재하는가를 확인할 필요가 있다. 본 발명은, 본 발명자들이 인간 BMP-16 라 명명한, 상기 인간 인간 단백질의 동정에 관한 것이다.
인간 BMP-16 은 Nodal 이라 불리는 쥐 단백질의 인간 호몰로그이다. Nodal 의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 문헌 [Zhou et al., Nature, 361:543-547 (1993)] 에 개시되어 있다. 쥐 Nodal 유전자는 장배(腸胚) 형성동안 마우스 결절에서 발현되는 것으로 개시되어 있다. 쥐 Nodal 유전자의 레트로바이러스 유도성 삽입 변이는 일반적으로 원시 선조(線條)와 관련되어 있는 중배엽성 세포 유형의 부재를 야기하며, 배아를 치사시킨다 [Conlon et al., Development 120:1919-1928 (1994); Conlon et al., Development 111:969-981 (1991)].
발명의 개요
여기에서 사용된 용어 BMP-16 단백질은 서열번호: 2 에 특정된 아미노산 서열을 갖는 인간 BMP-16 단백질, 및 서열번호: 1 에 나타낸 천연 인간 서열과 같이 상기 BMP-16 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 칭한다. 또한, 서열번호: 1 및 2 의 자연발생적인 대립유전자, 및 이와 동등한 변성 코돈 서열도 포함된다.
BMP-16 의 DNA 서열 (서열번호: 1) 및 아미노산 서열 (서열번호: 2) 이 서열목록에 개시되어 있다. BMP-16 단백질은 연골, 골, 또는 기타 결합조직, 또는 이들 조합의 형성을 유도할 수 있다. 래트 골 형성 검정법에서의 연골 및/또는 골 및/또는 기타 결합조직 형성활성이 하기에 기재되어 있다. BMP-16 단백질은 추가로 배아 세포 및/또는 스템 세포의 성장 및/또는 분화상에 영향을 미치는 능력으로 특징지워질 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질 또는 조성물은 또한 배아성 세포 또는 스템 세포 집단과 같은 세포 집단을 처리하여 상기 세포의 성장 및/또는 분화를 증진시키거나 또는 증대시키는데 유용할 수 있다.
인간 BMP-16 단백질은 성숙 BMP-16 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 즉 서열번호: 1 에 나타나 있는 뉴클레오티드 #511 내지 뉴클레오티드 #840 를 함유하는 DNA 서열로 형질전환된 세포를 배양하고, 실질적으로 함께 제조되는 단백질성 물질이 없이, 배양배지로부터 서열번호: 2 에 나타낸 아미노산 #1 내지 #110 을 함유하는 아미노산 서열을 특징으로 하는 단백질을 회수 및 정제하여 제조될 수 있다. 포유동물 세포내에서의 제조를 위하여, 상기 DNA 서열은 추가로 성숙 BMP-16-관련 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 쪽에 프레임으로 염결되어 있는 적당한 프로펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 함유한다. 상기 프로펩티드는 천연 BMP-16-관련 프로펩티드이거나, 또는 TGF-β 수퍼패밀리에 속하는 다른 단백질 기원의 프로펩티드일 수 있다. 천연 BMP-16 프로펩티드가 사용되는 경우, 인간 BMP-16 은 전체 BMP-16 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열, 즉 서열번호: 1 에 나타낸 뉴클레오티드 #1 내지 #840 을 함유하는 DNA 서열로 형질전환된 세포를 배양하고, 서열번호: 2 에 나타낸 아미노산 #-170 내지 #110 (이중, 아미노산 -170 내지 -1 은 인간 BMP-16 의 천연 프로펩티드를 함유함) 을 함유하는 아미노산 서열을 특징으로 하는 단백질을 제조하고, 실질적으로 함꼐 제조되는 기타 단백질성 물질이 없이, 배양배지로부터 서열번호: 2 에 나타낸 아미노산 #1 내지 #110 을 함유하는 아미노산 서열을 특징으로 하는 단백질을 회수 및 정제하여 제조될 수 있다.
다른 종, 특히 인간은 인간 BMP-16 단백질과 유사한 DNA 서열을 가질 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명은 인간 BMP-16 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 수득방법, 상기 방법에 의해 수득되는 DNA 서열, 및 상기 DNA 서열에 의해 코딩되는 인간 단백질을 포함한다. 본 방법은 표준 기술을 사용함으로써 다른 종으로부터 이에 상응하는 유전자 또는 코딩 서열 또는 그의 단편용 라이브러리를 스크리닝하는 프로브를 고안하기 위하여 인간 BMP-16 단백질 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부를 사용하는 것을 수반한다. 따라서, 본 발명은 인간 BMP-16 단백질과 상동이고, 인간 BMP-16 서열을 이용하여 수득할 수 있는 다른 종들의 DNA 서열을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 인간 BMP-16 단백질의 기능적 단편, 상기 기능적 단편을 코딩하는 DNA 서열, 및 기타 관련 단백질의 기능적 단편을 포함할 수 있다. 상기 단편의 작용능력은 BMP-16 단백질의 감정용으로 기재되어 있는 생물학적 검정법에서 상기 단백질을 검정함으로써 측정가능하다. 완전한 성숙 인간 BMP-16 단백질을 코딩하는 DNA 서열 (서열번호: 1) 및 이에 상응하는 아미노산 서열 (서열번호: 2) 이 여기에 개시되어 있다. 인간 BMP-16 와 같은 본 발명의 BMP-16 단백질은 인간 BMP-16 DNA 서열과 같은 관련 DNA 서열로 형질전환된 세포를 배양하고, 배양배지로부터 단백질, 예를 들어 BMP-16 을 회수 및 정제하여 제조될 수 있다. 정제된 발현 단백질은 실질적으로 함께 생성되는 다른 단백질성 물질과 기타 오염물을 갖고 있지 않다. 회수된 정제 단백질은 연골 및/또는 골 및/또는 결합조직 형성 활성을 나타낼 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 단백질은 추가로 하기에 기재된 래트 골 형성 검정법에서 연골 및/또는 골 및/또는 기타 결합조직 형성 활성을 나타내는 능력을 특징으로 할 수 있다. 상기 BMP-16 단백질은 추가로 배아 세포 및/또는 스템 세포의 성장 및/또는 분화에 영향을 미치는 능력을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질 또는 조성물은 또한 상기 세포의 성장 및/또는 분화를 증진 또는 증대시키는 능력을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 약제학적으로 하용가능한 운반체 또는 담체내에 치료학적으로 유효한 양의 인간 BMP-16 단백질을 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 조성물은 골 형성에 사용될 수 있다. 상기 조성물은 추가로 연골, 또는 힘줄, 인대, 반월판 및 다른 결합조직을 포함하는 기타 결합조직의 형성과 이들의 조합, 예를 들어 regeneration of the 힘줄-대-뼈 부착장치의 재생용으로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물, 예를 들어 인간 BMP-16 조성물은 또한 상처 치료 및 조직 상해회복용으로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 추가로, 예를 들어, 미국특허 5,108,922; 5,013,649; 5,116,738; 5,106,748; 5,187,076; 및 5,141,905 에 개시되어 있는 BMP 단백질 BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 및 BMP-7; PCT 공고공보 W091/18098 에 개시되어 있는 BMP-8; 및 PCT 공고공보 W093/00432 에 개시되어 있는 BMP-9, PCT 출원 W094/26893 에 개시되어 있는 BMP-10; PCT 출원 W094/26892 에 개시되어 있는 BMP-11, 혹은 PCT 출원 WO95/16035 에 개시되어 있는 BMP-12 또는 BMP-13, 혹은 1995년 5월 18일 출원된 동시계류 특허출원 일련번호 08/446,924 에 개시되어 있는 BMP-15 와 같은 1종 이상의 기타 치료학적으로 유용한 제제를 함유할 수 있다. 추가로 사용될 수 있는 기타 조성물로는 Vcr-2 및, PCT 출원 W094/15965; W094/15949; W095/01801; W095/01802; W094/21681; W094/15966; W095/10539; W096/01845; W096/02559 및 기타에 개시되어 있는 것들을 포함하는 임의의 성장 및 분화 인자 [GDF]가 있다. 또한, W094/01557 에 개시되어 있는 BIP; 일본공고공보 7-250688 에 개시되어 있는 HP00269; PCT 출원 W093/16099 에 개시되어 있는 MP52 가 본 발명에 유용할 수 있다. 상기 모든 출원문헌들이 여기에 인용문헌으로 포함되어 있다.
본 발명의 조성물은 BMP-16-관련 단백질에 추가로, 표피 성장 인자 (EGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 형질전환 성장 인자 (TGF-α 및 TGF-β), 액티빈(activin), 인히빈(inhibin), 및 인슐린-유사 성장 인자 (IGF)와 같은 성장인자를 포함하는 기타 치료학적으로 유용한 제제를 함유할 수 있다. 상기 조성물은 또한스, 예를 들어, 상기 조성물을 지지하고 골 및/또는 연골 및/또는 기타 결합조직 성장용 표면을 제공하기 위한 적당한 매트릭스를 포함할 수 있다. 상기 매트릭스는 골유도성 단백질의 느린 방출 및/또는 이의 제시를 위한 적절한 환경을 제공한다.
BMP-16 함유 조성물은 다수의 골 및/또는 연골 및/또는 기타 결합조직 상해, 치주질환, 각종 조직 및 상처의 치료방법에 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 조직 및 상처로는 표피, 신경, 심근을 포함하는 근육, 및 기타 조직 및 상처, 및 간, 폐, 심장, 췌장 및 신장 조직과 같은 기타 기관이 있다. 본 발명의 방법은 골 및/또는 연골 및/또는 기타 결합조직 형성, 상처 치료 또는 조직 상해회복을 필요로 하는 환자에게 유효량의 BMP-16 단백질을 투여하는 것을 수반한다. BMP-16-함유 조성물은 또한 골관절염, 골다공증, 및 골, 연골, 근육, 힘줄, 인대 또는 기타 결합조직, 간, 폐, 심장, 췌장 및 신장 조직과 같은 기관, 및 기타 조직의 기타 장애와 같은 조건의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 본 방법은 또한 상기 기재된 바와 같은 1종 이상의 기타 BMP 단백질과 함께 본 발명 단백질의 투여를 수반할 수 있다. 추가로, 본 방법은 또한 EGF, FGF, TGF-α, TGF-β, 액티빈, 인히빈 및 IGF 를 포함하는 기타 성장 인자와 함께 BMP-16 단백질의 투여를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 BMP-16 단백질의 발현을 코딩하는 DNA 서열이다. 상기 서열은 서열번호: 1 에 나타나 있는 5' 에서 3' 방향의 뉴클레오티드 서열, 유전코드의 축중을 제외하고는 DNA 서열인 서열번호: 1 과 동일하고, 서열번호: 2 의 단밸질을 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 또한, 본 발명은 엄격한 조건하에서 서열번호: 1 의 DNA 서열과 혼성화되고 연골 및/또는 골 및/또는 기타 결합조직, 또는 간, 폐, 심장, 췌장 및 신장 조직과 같은 기타 기관의 형성을 유도할 수 있는 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 바람직한 DNA 서열은 엄격한 조건하에서 혼성화되는 것들이다 [참조: T. Maniatis et al, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982). pages 387 to 389]. 일반적으로, 상기 DNA 서열은 서열번호: 2 에 나타나 있는 성숙 인간 BMP-16 아미노산 서열과 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상 상동성이 있는 폴리펩티드를 코딩하는 것이 바람직하다. 마지막으로, 서열번호: 1 서열의 대립유전자 또는 기타 변이로, 이러한 뉴클레오티드 변화가 펩티드 서열의 변화를 초래할 수는 있으나, 상기 펩티드 서열이 여전히 BMP-16 활성을 갖고 있는 것들 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 또한 BMP-16 단백질 활성을 갖고 있는 폴리펩티드를 코딩하는 서열번호: 1 에 나타나 있는 BMP-16 DNA 서열의 단편을 포함한다.
본 발명의 DNA 서열은, 예를 들어, 주어진 세포 집단내에서 BMP-16 를 코딩하는 mRNA 탐지용 프로브로서 유용하다. 따라서, 본 발명은 BMP-16 유전자를 포함하는 유전학적 이상, 또는 BMP-16 이 비정상적으로 전사되거나 발현되는 세포, 기관 또는 조직 장애를 포함하는 장애의 탐지 또는 진단방법을 포함한다. 상기 DNA 서열은 또한 하기에 기재된 바와 같이 유전자치료에 사용하기 위한 벡터의 제조에 유용하다.
본 발명의 또 다른 측면은 이를 위한 발현 조절 서열과 작동성 결합되어 있는 상기 기재된 DNA 서열을 함유하는 벡터를 포함한다. 상기 벡터는 그의 발현 조절 서열과 작동성 결합되어 있는 BMP-16 단백질을 코딩하는 DNA 서열로 형질전환된 세포주를 적당한 배양배지내에서 배양하고, 이로부터 BMP-16-관련 단백질을 회수 및 정제하는 본 발명 BMP-16 단백질의 신규 제조방법에 사용될 수 있다. 본 방법은 다수의 공지된 원핵 및 진핵세포 모두를 폴리펩티드 발현용 숙주세포로 사용할 수 있다. 상기 벡터는 유전자치료 용도로 사용될 수 있다. 이 경우, 상기 벡터는 체외에서 환자의 세포에 트랜스펙션될 수 있고, 상기 세포는 환자에게 재도입될 수 있다. 선택적으로, 상기 벡터는 표적화된 트랜스펙션을 통해 체내에서 환자에게 도입될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 BMP-16 단백질 또는 폴리펩티드이다. 상기 폴리펩티드는 서열번호: 2 에 나타나 있는 서열을 포함하는 아미노산 서열, 자연발생적인 대립유전자성 변이를 포함하는 서열번호: 2 의 아미노산 서열, 및 단백질이 연골 및/또는 골 및/또는 기타 결합조직, 또는 간, 폐, 심장, 췌장 및 신장 조직과 같은 기타 기관의 형성을 유도하는 능력 또는 BMP-16 의 특징적인 기타 활성을 갖는 기타 변이체를 갖는 것을 특징으로 한다. 바람직한 폴리펩티드로는 서열번호: 2 에 나타나 있는 성숙 인간 BMP-16 아미노산 서열과 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 상동성이 있는 폴리펩티드가 있다. 마지막으로, 서열번호: 2 서열의 대립유전자성 또는 기타 변이로, 상기 아미노산 변화가 변이도입. 화학적 변이, 또는 상기 폴리펩티드의 제조에 사용되는 DNA 서열의 변이에 의해 유도될 수 있고, 상기 펩티드가 여전히 BMP-16 활성을 갖는 것들 또한 본 발명에 포합된다. 본 발명은 또한 BMP-16 단백질을 갖고 있으며 서열번호: 2 에 나타나 있는 BMP-16 아미노산 서열의 단편을 포함한다.
본 발명의 정제 단백질은 항체 생성 분야에 공지되어 있는 방법을 사용하여 인간 BMP-16 및/또는 기타 BMP-16-관련 단백질에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 발생에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 인간 BMP-16 및/또는 기타 관련 단백질에 대한 항체를 포함한다. 상기 항체는 BMP-16 및/또는 기타 BMP-16 관련 단백질의 정제용으로, 또는 BMP-16 관련 단백질의 효과를 저해하거나 방지하는데 유용할 수 있다. 상기 BMP-16 단백질 및 관련 단백질은 배아 세포 및/또는 스템 세포의 성장 및/또는 분화를 유도하는데 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질 또는 조성물은 또한 상대적으로 미분화된 세포 집단, 예를 들어 배아 세포 또는 스템 세포 집단에 처리하여, 상기 세포의 성장 및/또는 분화를 증진시키거나 증대시키느데 유용할 수 있다. 상기 처리된 세포 집단은 체내 이식 및 유전자치료용으로 유용할 수 있다.
서열의 기재
서열번호: 1 은 전체 성숙 인간 BMP-16 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호:2 는 성숙 인간 BMP-16 폴리펩티드 서열을 함유하는 아미노산 서열이다.
서열번호: 3 은 인간 BMP-16 폴리펩티드에 대한 게놈 DNA 중 두번째 엑손의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호: 4 는 인간 BMP-16 폴리펩티드에 대한 게놈 DNA 중 세번째 엑손의 뉴클레오티드 서열이다.
본 발명은 골 형태발생 단백질-16 (BMP-16) 및 BMP-16-관련 단백질로 칭해지는 신규 정제 단백질군, 이를 코딩하는 DNA, 및 이의 수득방법에 관한 것이다. 상기 단백질은 골 및/또는 연골 또는 기타 결합조직 형성의 유도와 상처치료 및 조직 상해회복에 사용될 수 있다. 또한, 상기 단백질은 기타 골 형태발생 단백질의 활성을 증대시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 인간 BMP-16 서열은 쥐 BMP-16-관련 DNA 서열의 전체 또는 단편, 혹은 부분적인 인간 BMP-16 서열을 프로브로 사용하여 수득된다. 따라서, 본 인간 BMP-16 DNA 서열은 서열번호: 1 중 뉴클레오티드 #1 내지 #840 의 DNA 서열을 함유한다. 인간 BMP-16 DNA 서열중 상기 서열은 GenBank accession # X70514 에 개시되어 있는 쥐 Nodal DNA 서열중 뉴클레오티드 #526 내지 #1393 과 잘 일치한다. 상기 인간 BMP-16 단백질은 서열번호: 2 중 아미노산 #-170 내지 #110 의 서열을 함유한다. 상기 성숙 인간 BNW-16 단백질은 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 #511 내지 #840 에 의해 코딩되고, 서열번호: 2 중 아미노산 #1 내지 #110 의 서열을 함유한다.
CHO 세포와 같은 포유동물 세포에 의해 발현된 인간 BMP-16 단백질은 N-말단이 다양한 BMP-16 단백질 활성종들의 혼성집단 형태로 존재할 것으로 예상된다. 상기 활성종들은 서열번호: 2 중 아미노산 #10 에서 시스테인 잔기로 시작되는 아미노산 서열을 함유하거나, 또는 N-말단 방향에 추가적인 아미노산 서열을 더 함유할 것으로 예상된다. 따라서, 활성 BMP-16 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 서열번호: 1 중 뉴클레오티드 #1, #511 또는 #538 내지 #837 또는 #840 을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 함유할 것으로 예상된다. 따라서, 인간 BMP-16 의 활성종은 서열번호: 2 중 아미노산 #-170, #1 또는 #10 내지 #109 또는 #110 을 함유하는 것들을 포함할 것으로 예상된다.
숙주세포는 성숙 BMP-16 단백질용 코딩서열에 올바른 리딩 프레임으로 연결되고, 숙주세포에 의한 단백질의 분비용으로 적합한 프로펩티드를 코딩하는 코딩서열로 형질전환될 수 있다. 예를 들어, BMP-2 를 제외한 포유동물 단백질의 전구체 부분을 코딩하는 DNA 가 성숙 BMP-2 단백질을 코딩하는 DNA 에 융합되는 미국특허 5.168,050 을 참고할 수 있다. 또한, BMP-2 의 프로펩티드가 성숙 BMP-12 단백질을 코딩하는 DNA 에 융합되는 W095/16035 명세서를 참고할 수 있다. 상기 인용문헌의 명세서 모두가 참고문헌으로 여기에 포함되어 있다. 따라서, 본 발명은 인간 BMP-16 단백질 또는 관련 단백질을 코딩하는 DNA 서열에 정확한 리딩 프레임으로 연결되고, BMP-16 을 제외한 단백질중 TGF-β 수퍼패밀리의 구성원으로부터 선택된 하나의 프로펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 키메라 DNA 분자를 포함한다. 용어 "키메라" 는 BMP-16 단백질과는 상이한 폴리펩티드로부터 기원한 프로펩티드를 나타내기 위하여 사용된다.
인간 BMP-16 중 한 활성종의 N-말단은 E. coli 내에서의 발현에 의해 [M]HHLPDRSQLC 가 되는 것이 실험적으로 확인될 것으로 예상된다. 따라서, 상기 BMP-16 종의 N-말단은 서열번호: 1 의 아미노산 #1 에 존재하고, 상기 BMP-16 종을 코딩하는 DNA 서열은 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 #511 내지 #840 을 함유할 것으로 생각된다. 인간 BMP-16 단량체의 정확한 분자량은 SDS-PAGE 에 의해 Novex 16% 트리신 겔상에서 약 13 kd 이 되는 것이 실험적으로 확인될 것으로 예상된다. 상기 인간 BMP-16 단백질은 0.1% 트리플루오로아세트산내에서 투명한, 무색의 용액 형태로 존재할 것으로 예상된다.
CHO 세포와 같은 포유동물 세포에 의해 발현된 기타 BMP-16 단백질 또한 N-말단이 다양한 BMP-16 단백질 활성종들의 혼성집단 형태로 존재할 것으로 예상된다. 예를 들어, 인간 BMP-16 단백질의 활성종은 서열번호: 2 의 아미노산 #10 에서 시스테인 잔기로 시작하는 아미노산 서열을 함유하거나, 또는 N-말단 방향에 추가적인 아미노산 서열을 더 함유하게 될 것으로 예상된다. 따라서, 활성 BMP-16 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 #511 또는 #538 내지 #837 또는 #840 을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 것들을 포함하는 것으로 예상된다. 따라서, 활성 인간 BMP-16 단백질은 서열번호: 2 의 아미노산 #1 또는 #10 내지 #109 또는 #110 을 함유하는 것들을 포함한다.
본 발명의 BMP-16 단백질은 단량체 형태의 분자량이 약 13 kd 인 폴리펩티드를 포함하며, 상기 폴리펩티드는 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 함유하며, 실시예에 기재되어 있는 로젠-개질 샘패쓰-레디 전위 이식편 검정법 (Rosen-Modified Sampath-Reddi ectopic implant assay) 에서 연골 및/또는 골 및/또는 기타 결합조직의 형성을 유도할 수 있다.
배양배지로부터 회수된 BMP-16 단백질은 함께 생성되는 기타 단백질성 물질과 존재하는 기타 오염물로부터 이들을 단리함으로써 정제된다. BMP-16 단백질은, 예를 들어, 하기에 기재되어 있는 래트 골 형성 검정법에서 연골 및/또는 골 및/또는 기타 결합조직의 형성 및 기타 조직 상해회복 및 분화를 유도하는 능력으로 특징지워질 수 있다. 추가로, BMP-16 단백질은 또한 배아 세포 및/또는 스템 세포의 성장 및/또는 분화에 미치는 그들의 영향으로 특징지워질 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질 또는 조성물은 하기에 기재되어 있는 배아 스템 세포 검정법에 의해 특성이 규명될 수 있다.
여기에서 제공되는 BMP-16 단백질은 또한 서열번호: 1 의 서열과 유사하나, but into which 수정 또는 결실이 자연적으로 일어나거나 (예를 들어 폴리펩티드내 아미노산의 변화를 야기할 수 있는 뉴클레오티드 서열내의 대립유전자성 변이) 또는 신중하게 조작된 서열에 의해 코딩되는 인자를 포함한다. 예를 들어, 합성 폴리펩티드는 서열번호: 2 아미노산 잔기의 염속적인 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 복제할 수 있다. 상기 서열은 서열번호: 2 의 골 성장 인자 폴리펩티드와 1차, 2차, 또는 3차 구조 및 형태적 특징을 공유하기 때문에, 그 안에 공통의 생물학적 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 단백질의 구조 및 형태를 크게 변화시키지 않고, 따라서 생물학적 특성을 그대로 유지하는, 많은 보존성 아미노산 치환이 가능하다고 알려져 있다. 예를 들어, 보존성 아미노산 치환은 염기성 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어 리신 (Lys 또는 K), 알기닌 (Arg 또는 R) 및 히스티딘 (His 또는 H); 산성 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어 아스파르트산 (Asp 또는 D) 및 글루탐산 (Glu 또는 E); 비하전 극성 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어 아스파라긴 (Asn 또는 N), 글루타민 (Gln 또는 Q), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 및 티로신 (Tyr 또는 Y); 및 비극성 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어 알라닌 (Ala 또는 A), 글리신 (Gly 또는 G), 발린 (Val 또는 V), 루이신 (Leu 또는 L), 이소루이신 (Ile 또는 I), 프롤린 (Pro 또는 P), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 메티오닌 (Met 또는 M), 트립토판 (Trp 또는 W) 및 시스테인 (Cys 또는 C)중에서 만들어질 수 있다. 따라서, 천연 BMP-16 의 이러한 수정 및 결실은 치료과정에서 자연발생적 BMP-16 및 기타 폴리펩티드에 대한 생물학적으로 활성인 치환체로 사용될 수 있다. 주어진 BMP-16 변이체가 BMP-16 의 생물학적 활성을 갖고 있는지의 여부는 BMP-16 와 BMP-16 의 변이체 모두에 실시예에 기재되어 있는 검정법을 수행함으로써 용이하게 확인될 수 있다.
여기에 기재되어 있는 BMP-16 단백질 서열의 기타 특이적 변이로는 글리코실화 부위의 개질이 있다. 상기 개질은 0-연결 또는 N-연결 글리코실화 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 글리코실화의 부재 또는 단지 부분적인 글리코실화는 아스파라긴-연결 글리코실화 인식부위에서의 아미노산 치환 또는 결실에 의해 야기된다. 상기 아스파라긴산-연결 글리코실화 인식부위는 적당한 세포성 글리코실화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 트리펩티드 서열을 함유한다. 상기 트리펩티드 서열은 아스파라긴-X-트레오닌 또는 아스파라긴-X-세린중 하나이다 (여기에서, X 는 통상 임의의 아미노산임). 글리코실화 인식부위의 첫번째 또는 세번째 아미노산중 하나 또는 둘 모두에서의 다양한 아미노산 치환 또는 결실 (및/또는 두번째 위치에서의 아미노산 결실)은 수정된 트리펩티드 서열에서 비글리코실화를 초래한다. 추가적으로, BMP-16-관련 단백질의 박테리아내에서의 발현 또한, 글리코실화 부위가 수정되지 않는다 할지라도, 비글리코실화 단백질의 생성을 초래하게 된다.
본 발명은 또한 기타 단백질성 물질을 코딩하는 DNA 서열과 연결되어 있지 않고, BMP-16 단백질의 발현을 코딩하는 신규 DNA 서열을 포함한다. 상기 DNA 서열은 5' 에서 3' 방향으로 서열번호: 1 에 나타낸 것과, 엄격한 혼성화 세정 조건 [예를 들어, 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 65℃; 참조, T. Maniatis et al, Molecular Cloning (A Laboratorv Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), pages 387 to 389]하에서 여기에 혼성화되고 연골 및/또는 골 및/또는 기타 결합조직 유도활성을 갖는 단백질을 코딩하는 서열들을 포함한다. 상기 DNA 서열은 또한 include 서열번호: 1 의 DNA 서열을 함유하는 것들과 엄격한 혼성화 조건하에서 여기에 혼성화되고 BMP-16 에 대해 개시되어 있는 기타 활성을 유지하는 단백질을 코딩하는 것들을 포함한다.
유사하게, 서열번호: 1 의 서열에 의해 코딩되는 BMP-16 단백질 또는 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 함유하나, 상기 서열이 유전코드의 축중 또는 대립유전자성 변이 (아미노산 변화를 야기할 수도 있는 종 집단내에서의 자연발생적 염기 변화) 에 기인하여 코돈 서열이 다른 BMP-16 단백질을 코딩하는 DNA 서열 또한 여기에 기재되어 있는 신규 인자를 코딩한다. 점 돌연변이 또는 유도성 수정 (삽입, 결실, 및 치환 포함)에 의해 야기되어 활성, 반감기 또는 코딩되는 폴리펩티드의 생성을 증진시키는 서열번호: 1 의 DNA 서열내의 변이 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 또 다른 측면은 BMP-16 단백질의 신규 제조방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 공지된 조절서열의 조절하에 본 발명의 BMP-16 단백질을 코딩하는 DNA 서열로 미리 형질전환된 적당한 세포주를 배양하는 것을 포함한다. 형질전환된 세포를 배양하고, 배양배지로부터 BMP-16 단백질을 회수 및 정제한다. 정제된 단백질에는 실질적으로 함께 생성되는 기타 단백질 및 기타 오염물이 존재하지 않는다.
적당한 세포 또는 세포주는 포유동물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 자궁 세포 (Chinese hamster ovary cell: CHO) 일 수 있다. 적당한 포유동물 숙주세포의 선택과 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝, 생성물 제조 및 정제방법은 당 분야에 공지되어 있다. 문헌 [Gething 및 Sambrook, Nature, 293-.620-625 (1981), 또는 선택적으로, Kaufman et al, Mol. Cell. Biol., 5(7):1750-1759 (1985) 또는 Howley et al, 미국특허 4,419,446] 를 참조하라. 첨부된 실시예에 기재되어 있는 기타 적당한 포유동물 세포주로는 원숭이 COS-1 세포주가 있다. 포유동물 세포 CV-1 도 적당할 수 있다.
박테리아 세포 또한 적당한 숙주일수 있다. 예를 들어, 다양한 E. coli 균주 (예를 들어, HBIOI, MC1061) 가 생물공학분야에서 숙주세포로 이미 알려져 있다. 바실러스 섭틸리스(B. subtilis), 슈도모나스(Pseudomonas), 기타 바실러스 등의 다양한 균주가 또한 본 방법에서 서용될 수 있다. 본 단백질을 박테리아 세포내에서 발현시키기 위해서는, BMP-16 의 프로펩티드를 코딩하는 DNA 서열이 일반적으로 필요하지는 않다.
당업자에게 공지되어 있는 다양한 효모세포 균주 또한 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키기 위한 숙주세포로 사용될 수 있다. 추가적으로, 필요한 경우, 본 발명의 방법에서 숙주세포로 곤충세포를 사용할 수도 있다. 예를 들어, 문헌 [Miller et al, Genetic Eneineering, 8:277-298 (Plenum Press 1986)] 및 참고문헌들이 여기에 인용되어 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 신규 BMP-16 폴리펩티드를 발현시키는 방법에서 사용하기 위한 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 벡터는 본 발명의 신규 인자를 코딩하는 상기 기재된 전체 신규 DNA 서열을 포함한다. 추가적으로, 상기 벡터는 BMP-16 단백질 서열의 발현을 가능하게 하는 적당한 발현 조절 서열을 함유한다. 선택적으로, 상기 기재된 수정된 서열이 혼입된 벡터 또한 본 발며으이 구현예이다. 추가적으로, 서열번호: 1 의 서열 또는 BMP-16 단백질을 코딩하는 기타 서열에서 BMP-16 프로펩티드 서열을 제거하고, 이를 기타 BMP 단백질 또는 TGF-β 수퍼패밀리의 구성원의 프로펩티드를 코딩하는 서열로 대체시켜 성숙 BMP-16 단백질을 발현하도록 조작할 수 있다. 따라서, 본 발명은 BMP-16 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열에 정확한 리딩 프레임으로 연결된 TGF-β 수퍼패밀리 구성원의 프로펩티드를 코딩하는 키메라 DNA 분자를 포함한다.
상기 벡터는 세포주를 형질전환시키는 방법에 사용될 수 있고, 선별된 숙주세포내에서 그의 복제 및 발현을 지시할 수 있고, 본 발명의 서열을 코딩하는 DNA 에 작동성 결합되어 있는 선별된 조절서열을 포함하고 있다. 상기 벡터용 조절 서열은 당업자에게 공지되어 있으며, 숙주세포에 따라 선택될 수 있다. 이러한 선별은 일상적인 것으로, 본 발명의 일부를 구성하지는 않는다.
연골 및/또는 골 및/또는 기타 결합조직이 정상적으로 형성되지 않는 여건에서 상기 조직의 형성을 유도하는 본 발명의 단백질은 인간 및 기타 동물에 있어서 골절 및 연골 또는 기타 결합조직 상해의 치료에 용도를 갖고 있다. BMP-16 단백질을 사용하는 제제는 폐쇄 및 개방골절 감소 및 또한 인공관절의 고정을 향상시키는 면에서 예방용도를 가질 수 있다. 골형성 제제에 의해 유도되는 새로운 골 형성은 선천성, 상처에 의해 유도되거나 또는 두개안면의 상해에 의해 유도된 종양성 절제의 상해회복에 기여하며, 또한 미용학적 성형수술에 유용하다. BMP-16-관련 단백질은 치주질환의 치료 및 기타 치아 상해회복 과정에 사용될 수 있다. 이러한 제제는 골-형성 세포를 유인하거나, 골-형성 세포의 성장을 촉진시키커나, 또는 골-형성 세포의 모세포의 분화를 유도하는 환경을 제공할 수 있고, 또한 뼈와 치아를 연결하는 치주 인대 및 부착장치의 재생을 지원할 수 있다. 본 발명의 BMP-16 폴리펩티드는 또한 골다공증의 치료에 유용할 수 있다. 다양한 골형성, 연골-유도, 및 골 유도인자가 개시되어 있다. 예를 들어, 이러한 논의를 위해서는 유럽특허출원 148,155 및 169,016 을 참조하라.
본 발명의 단백질은 또한 상처 치료 및 관련 조직 상해회복에 사용될 수 있다. 상처의 유형으로는 화상. 자상 및 궤양이 있다 (참조: 예를 들어 상처 치료 및 관련 조직 상해회복의 논의를 위해서는 PCT 공고공보 W084/01106). It is further contemplated that 본 발명의 단백질은 may increase 신경세초, 성상세포 및 글리아 세포의 생존을 증진시킬 수 있으며, 따라서 이식과 신경 생존 및 상해회복에서의 감소를 나타내는 상태의 치료에 유용할 수 있다. 본 발명의 단백질은 추가로 기타 유형의 조직, 예를 들어 신경, 표피, 근육 및, 간, 폐, 심장, 췌장 및 신장 조직과 같은 기타 기관과 관련된 상태의 치료에 유용할 수 있다. 본 발명의 단백질은 추가로 상대적으로 미분화된 세포 집단, 예를 들어 배아 세포, 또는 스템 세포에 처리하여 상기 세포의 성장 및/또는 분화를 증진시키는데 유용할 수 있다. 본 발명의 단백질은 또한 식이요법 보완제 또는 세포 배양배지 성분으로 가치가 있다. 이를 이하여, 본 단백질은 그대로 사용되거나, 또는 미리 예비소화시켜 보다 흡수가 용이한 보완제로 제공될 수 있다.
본 발명의 단백질은 또한 TGF-β 수퍼패밀리 단백질의 특징인 기타 유용한 특성을 가질 수 있다. 이러한 특성으로는 맥관형성성, 화학주성 및/또는 화학주성인자 성질 및, 콜라겐 합성, 섬유조직증식, 분화 반응, 세포 증식성 반응 및 세포 접합, 이동 및 세포외 매트릭스를 포함하는 반응의 유도를 포함하는 세포에 미치는 효과가 있다. 이러한 특성들은 본 발명의 단백질이 상처 치료, 섬유조직증식의 감소 및 흉터 조직 형성의 감소를 위한 잠재적인 시약이게 한다.
동종중합체 형태로 이량체화 되거나 또는 as a heterodimer with 기타 BMP, 기타 TGF-β 수퍼패밀리 단백질 구성원, 혹은 인히빈-α 단백질 또는 인히빈-β 단백질과의 이형이량체 형태인 경우, BMP-16 이형이량체는 여기에 추가로 기재된 바와 같이 황체자극호르몬 (FSH)의 생성에 효과를 나타낼 것으로 예상된다. FSH 는 포유동물 난소내에서 난자의 발생을 촉진하고 (Ross et al., in Textbook of Endocrinology, ed. Williams, p. 355 (1981)), FSH 에 의한 난소의 과다 촉진은 다량의 배란을 야기하는 것으로 알려져 있다. FSH 는 또한 정소 기능에 중요하다. 따라서, BMP-16 은 암컷 포유동물에서 번식력을 감소시키고 수컷 포유동물에서 정자형성을 감소시키는 인히빈의 능력을 기초로 하여 피임약으로 유용할 수 있다. 기타 인히빈을 충분한 양으로 투여할 경우 포유동물에서 불임을 유도할 수 있다. BMP-16 은 또한 뇌하수체 전엽 세포로부터 FSH 분비를 촉진시키는 액티빈 분자의 능력을 기초로 하여 수정 유도 치료제로서 유용할 수 있다. 예를 들어, 미국특허 4,798,885 를 참조하라. BMP-16 는 또한 소, 양 및 돼지와 같은 가축류의 생식활동 기간을 증진시키기 위하여 성적으로 미석숙한 포유동물의 수정 개시를 앞당기는 것에 유용할 수 있다. 추가로, BMP-16 은 적렬구계 세포의 분화를 유도함으로써 혈액생성을 조절하거나 [참조: 예를 들어, Broxmeyer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:9052-9056 (1988) 또는 Eto et al. Biochem. Biophys. Res. Comm., 142:1095-1103 (1987)], 생식선 종양의 발달을 억제하는데 [참조: 예를 들어, Matzuk et al., Nature, 360:313-319 (1992)] 또는 형태발생 단백질의 활성을 증대시키는데 [참조: 예를 들어, Ogawa et al., J. BioL Chem., 267:14233-14237 (1992)] 유용할 수 있다고 생각된다.
BMP-16 단백질은 추가로 문헌 [참조: 예를 들어, Vale et al, Endocrinology, 91:562-572 (1972); Ling et al., Nature, 321:779-782 (1986) 또는 Vale et al., Nature, 321:776-779 (1986)] 에 기재된 바와 같이 래트의 뇌하수체 전염 세포를 사용하는 확립된 체외 생물학 검정법에서 황체자극호르몬 (FSH) 의 방출을 조절하는 그들의 능력을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 BMP-16 단백질은, 인히빈 α 또는 인히빈 β 사슬과의 이종이량체 형태로 만들어지는 경우, 문헌 [Ling et al., Nature, 321:779-782 (1986) 또는 Vale et al., Nature, 321:776-779 (1986); Vale et al, Endocrinology, 91:562-572 (1972)] 에 기재된 바와 같이 뇌하수체 전엽 세포로부터의 황체 자극 호르몬 (FSH) 의 방출에 촉진성 또는 저해성 조절 효과를 나타낼 것으로 생각된다. 따라서, 특정한 조성에 따라, it is expected that the 본 발명의 BMP-16 단백질은 뇌하수체 전엽으로부터의 황체자극호르몬 (FSH)의 방출에 대조적이고 및 상반되는 효과를 가질 수 있는 것으로 예상된다.
액티빈 A (인히빈 βA의 동종이량체 조성) 는 적혈구생성-촉진 활성을 갖는 것으로 보고되어 있다 [참조: 예를 들어 Eto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 142:1095-1103 (1987) 및 Murata et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2434-2438 (1988) 및 Yu et al., Nature, 330:765-767 (1987)]. 본 발명의 BMP-16 단백질은 유사한 적혈구생성-촉진 활성을 가질 수 있는 것으로 예상된다. 상기 BMP-16 단백질의 활성은 추가로 BMP-16 단백질이 문헌 [Lozzio et al., Blood, 45:321-334 (1975) 및 미국특허 5,071,834] 에 기재된 바와 같이 인간 K-562 세포주를 이용하여 수행되는 생물학적 검정법에서 에리트로포이에틴 활성을 나타낼 수 있다는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 골절 및 연골 및/또는 골 및/또는 기타 결합조직 상해 또는 치주질환과 관련된 기타 상태의 치료방법 및 상해회복용 조성물이다. 본 발명은 또한 상처 치료 및 조직 상해회복을 위한 치료방법 및 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 약제학적으로 허용가능한 운반체, 담체 또는 매트릭스에 부가하여 본 발명의 BMP-16-관련 단백질 1종 이상을 치료학적으로 유효한 양으로 함유한다. 또한, 본 발명의 조성물은 신경세포 생존율을 증진시킬 수 있고, 따라서 이식 및 신경세포 생존율의 감소를 나타내는 상태의 치료에 유효할 수 있다고 생각된다. 본 발명의 조성물은 추가로, 예를 들어, 미국특허 5,108,922; 5,013,649; 5,116,738; 5,106,748; 5,187,076; 및 5,141,905 에 개시되어 있는 BMP 단백질 BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 및 BMP-7; PCT 공고공보 W091/18098 에 개시되어 있는 BMP-8; 및 PCT 공고공보 W093/00432 에 개시되어 있는 BMP-9, PCT 출원 W094/26893 에 개시되어 있는 BMP-10; PCT 출원 W094/26892 에 개시되어 있는 BMP-11, 혹은 PCT 출원 WO95/16035 에 개시되어 있는 BMP-12 또는 BMP-13, 혹은 1995년 5월 18일 출원된 동시계류 특허출원 일련번호 08/446,924 에 개시되어 있는 BMP-15 를 포함하는 TGF-β 수퍼패밀리 단백질의 구성원과 같은 1종 이상의 기타 치료학적으로 유용한 제제를 함유할 수 있다. 또한, 유용할 수 있는 기타 조성물로는 Vgr-2 및 PCT 출원 W094/15965; W094/15949; W095/01801; W095/01802; W094/21681; W094/15966; W095/10539; W096/01845; W096/02559 등에 개시되어 있는 것들을 포함하는 임의의 성장 및 분화 인자 [GDF]가 있다. 또한, W094/01557 에 개시되어 있는 BIP; 일본공고공보 7-250688 에 개시되어 있는 HP00269; 및 PCT 출원 W093/16099 에 개시되어 있는 MP52 가 본 발명에 유용할 수 있다. 상기 출원들의 명세서가 여기에 참고문헌으로 포함되어 있다.
인간 BMP-16 단백질은 동종이량체 또는 이종이량체의 형태로 존재할 수 있는 것으로 생각된다. 향상된 안정성을 갖는 BMP-16 및 유용한 단백질의 이량체 형성을 촉진하기 위하여, 서열번호: 1 의 DNA 서열을 유전학적으로 조작하여 하나 이상의 추가적인 시스테인 잔기를 제공함으로써 잠재적인 이량체 형성을 증진시킬 수 있다. 생성된 DNA 서열은 BMP-16 의 "시스테인이 첨가된 변이체"를 생성할 수 있게 된다. 바람직한 구현예에서는, 하나 이상의 코돈이 시스테인 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드 트리플렛. 예를 들어 TGT 또는 TGC 로 변경되도록 서열번호: 1 의 DNA 서열을 조작하게 된다. 선택적으로, 서열번호: 2 의 하나 이상의 아미노산 잔기를 Cys 변경함으로써 아미노산 수준에서 단백질의 서열을 변경하여 BMP-16 단백질의 "시스테인이 첨가된 변이체"를 생성할 수 있다. 본 단백질의 "시스테인이 첨가된 변이체"의 제조는 여기에 참고문헌으로 포함되어 있는 미국특허 5,166,322 에 개시되어 있다.
본 발명의 단백질은 기타 관련 단백질 및 성장 인자와 협력하여 또는 상승적으로 작용할 수 있다고 예상된다. 따라서, 본 발명의 치료방법 및 조성물 또한 치료학적 양의 TGF-β 수퍼패밀리 단백질의 기타 구성원, 예를 들어 상기의 출원들에 개시되어 있는 BMP 단백질 1종 이상과 함께 치료학적 양의 본 발명 BMP-16 단백질 1종 이상을 함유한다. 이러한 조합물은 본 BMP 단백질의 분리된 분자 또는 상이한 BMP 부로 이루어진 이종분자를 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 조성물은 BMP-16 단백질 서브유니트 및 상기 기재된 "BMP" 단백질중 하나의 서브유니트로 이루어지고 디술피드로 연결된 이량체를 함유할 수 있다. 따라서. 본 발명은 하나의 서브유니트가 서열번호: 2 중 아미노산 #1 내지 아미노산 #110 의 아미노산 서열을 함유하고, 다른 서브유니트는 PCT 출원 WO 95/16035 에 개시되어 있는 BMP-1, BMP-2, BNtp-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12 또는 BMP-13, 혹은 1995년 5월 18일에 출원된 공계류중인 특허출원, 일련번호 08/446,924 에 개시되어 있는 BMP-15 로 구성된 군으로부터 선택된 골 형태발생 단백질용 아미노산 서열을 함유하는 이종이량체인 정제된 BMP-16-관련 폴리펩티드를 포함한다. 다른 구현예는 BMP-16-관련부, 예를 들어 of 인간 BMP-16 과 인간 BMP-16 의 호몰로그인 쥐 Nodal 단백질의 이종이량체를 함유할 수 있다. 또한, BMP-16 단백질은 골 및/또는 연골 및/또는 기타 결합조직 상해, 상처, 또는 문제가 있는 조직의 치료에 유리한 기타 제제와 조합될 수 있다. 상기 제제로는 다양한 성장 인자, 예를 들어 표피 성장 인자 (EGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 혈소판 성장 인자 (PDGF), 형질전환 성장 인자 (TGF-α 및 TGF-β), 액티빈, 인히빈, 및 k-섬유아세포 성장 인자 (kFGF), 부갑상선 호르몬 (PTH), 부갑상선 호르몬 관련 펩티드 (PTHrP), 백혈병 억제 인자 (LIB/HILA/DA), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF-I 및 IGF-II) 가 있다. 상기 제제중 일부 또한 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 해당 pH, 등장성, 안정도 등을 갖는 이러한 생리학적으로 허용가능한 단백질 조성물의 제조 및 제형화는 당 분야의 기술범위 내에 있다. 또한, 상기 치료학적 조성물은 BMP 단백질의 종 특이성의 결여에 기인하여 수의학적 용도에 즉시 사용가능하다. 특히, 인간에 추가하여 가축류 및 순혈종 말이 본 발명의 BMP-16 단백질을 이용한 상기 치료의 바람직한 대상이다.
상기 치료방법은 상기 조성물을 이시편으로 또는 장치의 형태로 국소적으로, 전체적으로, 또는 지역적으로 투여하는 것을 포함한다. 투여될 경우, 본 발명에서 사용하기 위한 상기 치료조성물은, 물론, 발열원이 없고. 생리적으로 허용가능한 형태이다. 또한. 상기 조성물은 바람직하게는 골, 연골 또는 기타 결합조직의 위치에 또는 기타 조직 손상에 전달하기 위하여 캡슐화되거나 또는 점액형태로 주사될 수 있다. 국소투여는 상처 치료, 및 조직 상해회복에 적합할 수 있다. 본 발며의 방법에서 BMP 조성물과 함께 상기 기재된 본 조성물에 임의로 포함될 수 있는 BMP-16 단백질 이외의 치료학적으로 유용한 제제가 선택적으로 또는 추가적으로 동시에 또는 순서적으로 투여될 수 있다.
골 및/또는 연골 및/또는 기타 결합조직 형성용으로 바람직하게는, 본 조성물은 골 및/또는 연골 및/또는 기타 결합조직 손상 위치에 BMP-16-관련 또는 기타 BMP 단백질을 운반할 수 있는 매트릭스를 포함하며, 상기 매트릭스는 골 및 연골 및 기타 결합조직의 발달을 위한 구조를 제공하며, 가장 바람직하게는 체내에 흡수될 수 있다. 상기 매트릭스는 BMP-16 단백질 및/또는 기타 골 유도성 단백질에 서방성, 세포침윤에 적절한 제시 및 적합한 환경을 제공할 수 있. 상기 매트릭스는 기타 이식 의학적 용도에 현재 사용중인 물질로 만들어질 수 있다.
매트릭스 물질의 선택은 생물학적 상화성, 생분해성, 물리적 특성, 미용학적 외관 및 접촉면 특성을 기준으로 한다. 상기 BMP-16 조성물의 특정 용도는 적절한 제형화를 한정하게 된다. 본 조성물용의 잠재적인 매트릭스는 생분해성이고 화학적으로 정의된 황산칼슘, 인산칼슘, 히드록시아파타이트, 폴리락트산 및 폴리안하이드리드일 수 있다. 기타 잠재적인 재료는 생분해성이고 생물학적으로 이미 정의된 것으로, 예를 들어 골 또는 피부 콜라겐이다. 또 다른 매트릭스로는 순수 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분으로 구성된 것들이 있다. 기타 잠재적인 매트릭스는 비생분해성이고 화학적으로 정의된 것, 예를 들어 소성된 하드록시아파타이트, 바이오글라스, 알루미네이트, 또는 기타 세라믹이 있다. 매트릭스는 상기 언급된 유형중 임의의 물질의 조합물, 예를 들어 폴리락트산과 히드록시아파타이트 또는 콜라겐과 인산칼슘으로 이루어질 수 있다. 바이오세라믹은 조성물내에서, 예를 들어 칼슘-알루미네이트-포스페이트내에서 공극, 입경, 입자형태, 및 생분해성이 변화되도록 프로세싱될 수 있다.
투여량 섭생법은 BMP-16 단백질의 작용을 수정하는 다양한 인자, 예를 들어 골의 양 또는 형성되기를 바라는 기타 조직 중량, 골 또는 조직 손상 위치, 손상된 골 조직의 상태, 상처의 크기, 손상 조직의 유형, 환자의 연령, 성별, 및 음식물, 검염의 심각성, 투여시간 및 기타 임상적 인자를 고려하는 외과의가 참여함으로써 결정되어진다. 투여량은 재구성에 사용된 매트릭스의 유형 및 조성물내 BMP 단백질의 유형에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 조직 또는 주사투여는 최소효과를 나타내는 투여량에서 시작되어지고, 긍정적인 효과가 관찰될 때까지 투여량을 예정된 시간간격으로 증가시키게 된다. 이후, 투여량의 증량성 증가는 효과에 있어서 해당 증가가 일어나는 수준으로 상기 증량성 증가를 제한하면서, 동시에 일어날 수 있는 역효과를 고려하여 이루어진다. 최종 조성물에 기타 공지의 성장 인자, 예를 들어 IGF I (인슐린 유사 성장 인자 I) 또한 투여량에 영향을 줄 수 있다.
골 또는 조직 성장 및/또는 상해회복의 주기적 평가에 의해 경과를 모니터할 수 있다. 예를 들어, X-선, 조직형태계측법 및 테트라싸이클린 표지법에 의해 경과를 모니터할 수 있다.
하기의 실시예는 인간 BMP-16 및 기타 BMP-16-관련 단백질의 회수 및 특성규명, 상기 인간 단백질의 획득 및 재조합 기법을 통한 상기 단백질의 발현에 있어서 본 발명의 실시를 나타낸다.
실시예 1
DNA 의 단리
인간 BMP-16 및 인간 BMP-16-관련 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 당업자에게 공지된 다양한 기술에 의해 단리될 수 있다.
TGF-β 군에 속하는 BMP 단백질 및 기타 단백질에 대한 지식을 기초로 하여, 상기 분자 (성숙 펩티드)의 카르복실-말단부가 아미노-말단쪽의 부분 (프로펩티드 영역)보다 높은 서열 보존성을 나타낼 것으로 예상하였다. 당업자는 TGF-β 군에 속하는 BMP 단백질 및 기타 단백질간의 서열 관련성을 통해 TGF-β 군에 속하는 관련 BMP 단백질 및 기타 단백질의 동정에 사용될 수 있는 상기 분자의 일부 (성숙 펩티드 코딩 영역)을 코딩하는 카르복실-말단으로부터 DNA 프로브를 고안할 수 있다. 하기 기재된 바와 같이, 쥐 nodal 유전자의 성숙 펩티드 코딩 영역은 BMP-16 및 BMP-16-관련 단백질의 동정에 사용될 수 있다.
쥐 nodal 유전자 (GenBank accession # X70514)의 뉴클레오티드 #1060 내지 #1390 에 해당하는 DNA 프로브를32P 로 방사선 표지하여 엄격성을 감소시킨 혼성화/세정 조건하에서 인간 게놈 라이브러리의 스크리닝하여, 인간 BMP-16 유전자의 서열 또는 기타 BMP-16 관련 유전자의 서열을 함유하는 재조합 클론의 동정에 사용될 수 있다.
인간 BMP-16
벡터 λ DASH II (Stratagene catalog #945203) 에 구축된 인간 게놈 라이브러리의 재조합체 100만개를 50 개의 플레이트에 플레이트당 약 20,000 개의 재조합체의 밀도로 플레이팅하였다. 상기 재조합 박테리오파아지 플라끄의 2장의 니트로셀룰로스 레플리카를 표준 혼성화 완충액 (5X SSC, 0.1% SDS, 5X 덴하르트, 100㎍/ml 연어정자 DNA)내에서 엄격성이 감소된 조건 (60℃ 에서 2 일간)하에서 (상기 기재된)32P 표지된 331 bp 쥐 nodal DNA 프로브에 혼성화시킨다. 혼성화 2일째에, 방사능 표지된 쥐 nodal DNA 단편을 함유하는 혼성화 용액을 제거하고, 필터를 엄격성이 감소된 조건 (2X SSC, 0.1 % SDS, 60℃)하에서 세정한다. 필터를 사란 랩으로 싸고 -80℃ 에서 X-선 필름에 증폭필름을 사용하여 하룻밤 내지 3일간 노출시킨다. 상기 X-선 필름을 현상하여, 다양한 신호강도를 갖는 다수의 포지티브 혼성화 재조합체를 동정한다. 상기 낮은 엄격성 혼성화 포지티브 클론의 플라끄를 정제한다. 플라끄 정제 재조합체의 박테리오파아지 플레이트 스톡을 만들어 박테리오파아지 DNA 를 단리한다.
기존에 공개된 BMP 서열 또는 TGF-β 군의 기타 구성원에 해당하는 DNA 서열의 존재를 확인하기 위하여, 기존에 공개된 DNA 서열중 대표적인 올리고뉴클레오티드의 배열과 혼성화시켜 각각의 포지티브 혼성화되는 재조합 박테리오파아지 클론을 검사한다. 기존에 공개된 BMP 서열 또는 TGF-β 군의 기타 구성원의 서열을 확인하기 위하여 사용된 상기 올리고뉴클레오티드를 글라스 칩의 표면에 고정시켰다. 상기 고정된 올리고 뉴클레오티드 배열에 대한 혼성화 분석법에 사용되는 주형을 하기의 방식으로 제조한다:
쥐 nodal 프로브를 이용하여 동정된 포지티브 혼성화된 인간 게놈 클론 유래의 재조합 박테리오파아지 DNA (상기 기재된 실험) 에 특이적 DNA 증폭을 실시한다. 박테리오파아지 클로닝 벡터 λ DASH II 의 DNA 서열에 해당하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 포지티브 혼성화되는 재조합 클론의 인간 게놈 DNA 삽입편을 특이적으로 증폭시킨다. 람다 DASH II(R) 게놈 클로닝 벡터 (Stratagene Cloning Systems, Inc.; La Jolla, CA)의 서열을 기초로 하여 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 고안하여, 자동 DNA 합성기상에서 합성한다:
올리고뉴클레오티드 #1: ACTGCGCAACTCGTGAAAGGTAGGC
올리고뉴클레오티드 #2: GAACACTCGTCCGAGAATAACGAGTGG
올리고뉴클레오티드 #1 및 #2 를 프라이머로 사용하여 to 쥐 nodal 프로브에 대한 낮은 엄격성 혼성화에 의해 동정된 상기 재조합체의 인간 게놈 DNA 삽입편 또는 박테리오파아지 클로닝 벡터 λ DASH II 에 포함되어 있는 임의의 재조합 DNA 삽입편을 특이적으로 증폭시킨다. 상기 증폭반응은 하기에 따라 수행된다: 약 500 ng 의 정제 재조합 박테리오파아지 DNA 또는 정제 박테리오파아지 플라끄의 투명 수용액으로 직접 유래된 미지량의 재조합 박테리오파아지 DNA 를 1X 퍼킨-엘머 Cetus GeneAmp(R) XL 완충액 (catalog, #N808-0180 - 트리신, 포타슘 아세테이트, 글리세롤 및 DMSO 함유)에 각각 250 pM 씩의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (dATP, dGTP 및 dTTP), 90 pM dCTP, 30 pM 플루오레신-dCTP, 1.3 mM Mg(OAc)2, 40 유니트/ml 퍼킨-엘머 Cetus rTth DNA 폴리머라제 (catalog #N808-0180), 400 nM 올리고뉴클레오티드 프라이머 #1 및 400 nM 올리고뉴클레오티드 프라이머 #2 를 첨가한 반응혼합물에 첨가한다. 상기 반응혼합물에 하기 방식으로 열 싸이클링을 수행한다: 93℃ 에서 1 분 1 싸이클, 93℃ 에서 40 초 및 68℃ 에서 12 분 30 싸이클, 이후 65℃ 에서 10 분 1 싸이클. 상기 반응에 의해 특이적으로 증폭되는 DNA 약 1 ㎍ 을 18 밀리유니트의 RQ1 RNase-Free DNase 로 절단하였다 (Promega Corp., Madison, WI/Catalog #M6101, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgSO4, ml 당 50mg 소 혈청 알부민 (BSA), 및 0.1 mM DTT, 37℃, 90 분). 0.1 부피의 0.5 M NA2EDTA 를 첨가하여 반응을 정지시킨다. 상기 기재된 조건하에서 특이적으로 증폭된 DNA 의 단편화는 약 1500 내지 50 염기쌍 범위의 DNA 단편을 만든다. 상기 1500 내지 50 bp 의 특이적으로 증폭된 DNA 단편을 95℃ 에서 10분간 열변성시킨다. 상기 단편화되고 변성된 DNA 용액을 6X SSPE, 0.05% 트리톤 X-100 의 최종농도로 조정한 후, 미리 글라스 표면에 37℃ 에서 4 시간 내지 밤새 고정시킨 BMP/TGF-β 군 대표적 올리고뉴클레오티드 배열에 혼성화시킨다. 글라스 표면상에 고정된 혼성화 BMP/TGF-β 군 대표적 올리고뉴클레오티드 배열을 0.5X SSPE, 0.005% 트리톤 X-100 으로 세정하고, GeneChip 50 스캐너 (Affymetrix)로 분석하였다.
329 bp 쥐 nodal 프로브에 혼성화되는 재조합 박테리오파아지 클론중 하나를 λHG-NR35-1 로 명명하였다. BMP/TGF-β 군 올리고뉴클레오티드 배열을 이용하여 상기 클론을 분석한 결과 글라스 칩 배열상의 올리고뉴클레오티드의 작은 서브세트에 포지티브 혼성화 패탄이 나타났다. 포지티브 혼성화 신호에 의해 확인된 올리고뉴클레오티드중 하나를 사용하여 쥐 nodal 프로브에 대한 최초의 혼성화 신호를 나타내는 인간 게놈 삽입편 영역의 DNA 서열을 확인하였다. 상기 올리고뉴클레오티드의 서열을 하기에 개시한다:
올리고뉴클레오티드 #3: CTGTGAGGGCGAGTGTCC
쥐 nodal 서열 (Genbank Accession #X70514)의 뉴클레오티드 #1173-#l190 에 해당하는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 λHG-NR35-1 게놈 클론의 DNA 서열 분석을 수행하여, 본 명세서에 개시되어 있는 인간 BNIP-16 서열의 일부를 확인하였다. 상기 박테리오파아지 λHG-NR35-1 를 1996년 6월 25일에 American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, MD ATCC) 에 접근번호 #97623 로 기탁하였다. 상기 기탁은 특허과정 및 이의 조절을 위한 미생물의 기탁에 관한 국제조약dls 부타페스트 조약의 조건을 만족한다. 상기 재조합체, λHG-NR35-1 의 혼성화 영역은 약 2.1 kb 및 4.3 kb 길이인 두개의 BamHI 단편에 위치한다. 상기 단편 각각을 플라스미드 벡터 pGEM-3 에 서브클로닝한다. 2.1 kb 및 4.3kb BamHI 단편을 함유하는 상기 플라스미드 서브클론을 각각 DH5α/pGEM#-NR35-1#B2 및 DH5α/pGEM#-NR35-1#B18 이라 명명한다. 2.1 kb BamHI 혼성화 단편을 함유하는 플라스미드 서브클론 (DH5α/pGEM#-NR35-1#B2)을 1996년 6월 25일 ATCC 에 접근번호 #98085 으로 기탁하였다. 4.3 kb BamHI 혼성화 단편을 함유하는 플라스미드 서브클론 (DH5α/pGEM#-NR35-1#B18)을 1996년 6월 25일 ATCC 에 접근번호 #98084 로 기탁하였다. 상기 기탁은 특허과정 및 이의 조절을 위한 미생물의 기탁에 관한 국제조약dls 부타페스트 조약의 조건을 만족한다. 플라스미드 서브클론, DH5α/pGEM#-NR35-1#B2 의 2.1 kb 삽입편중 일부의 DNA 서열을 서열번호: 3 에 개시하였다. 상기 서열의 일부 (뉴클레오티드 #383 내지 #1080)를 쥐 nodal 유전자 (GenBank Accession No. X70514 의 뉴클레오티드 #524 내지 #1240)의 엑손 2 와 비교하여 인간 BMP-16 유전자의 엑손 2 라 표시한다. 플라스미드 서브클론, DH5α/pGEM#-NR35-1#B18 의 4.3 kb 삽입편중 일부의 DNA 서열을 서열번호: 4 에 개시하였다. 상기 서열의 일부 (뉴클레오티드 #434 내지 #583)를 쥐 nodal 유전자 (GenBank Accession No. X70514 의 뉴클레오티드 #1241 내지 #1390)의 엑손 3 서열을 코딩하는 단백질과 비교하여 인간 BMP-16 유전자의 엑손 3 의 코딩영역이라 표시한다. 쥐 nodal 유전자 구조에 대한 지식, 여기에 포함된 특정 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 상기에 상세히 개시된 인간 BMP-16 유전자의 엑손 2 (서열번호: 3) 및 엑손 3 (서열번호: 4) 내에 포함되어 있는 서열의 비교를 기초로 하여, 본 발명의 인간 BMP-16 단백질용의 부분적인 코딩서열을 편집할 수 있다. 상기 부분적인 인간 BMP-16 코딩서열 (서열번호: 3 및 4 의 중간서열/인트론 및 기타 비-BMP-16 단백질을 코딩하는 서열은 제거됨)을 서열번호: 1 에 개시한다. 인간 BMP-16 유전자중 엑손 2 및 3 의 코딩서열의 융합으로부터 예상된 상기 편집된 서열은 본 발명의 인간 BMP-16 단백질중 280 아미노산을 코딩하는 840 뉴클레오티드 (서열번호: 1 의 뉴클레오티드 #1 내지 #840)의 오픈 리딩 프레임을 정의한다. 서열번호: 2 에 개시되어 있는 코딩된 280 아미노산 BMP-16 단백질은 전체 성숙 인간 BMP-16 펩티드 (서열번호: 2 의 아미노산 #1 내지 #110) 및 BMP-16 프로펩티드의 C-말단부 (서열번호: 2 의 아미노산 #-170 내지 #-1)를 포함한다.
기타 BMP 단백질 및 TGF-β 군에 속하는 기타 단백질의 직식을 기초로 하여, 인간 BMP-16 전구체 폴리펩티드가 예상된 콘센서스 단백질분해성 프로세싱 서열 인 Arg-X-X-Arg 와 부합하는 다중염기성 서열 Arg-His-Argo-Arg 에서 잘린 것으로 예상된. 인간 BMP-16 전구체 폴리펩티드의 절개는 서열번호: 2 의 #1 에서 아미노산 His 로 시작되는 110 아미노산 성숙 펩티드를 생성할 것으로 예상된다. 인간 BMP-16 의 성숙 형태로의 프로세싱은 관련 단백질 TGF-β 의 프로세싱과 유사한 방식으로 이량체화 및 N-말단 영역의 제거를 포함할 것으로 예상된다 [Gentry et al., Molec & Cell. Biol., 8:4162 (1988); Derynck et al. Nature, 316:701 (1985)].
따라서, 인간 BMP-16 의 성숙 활성종은 각 서브유니트가 예상 분자량 약 13,000 달톤인 서열번호: 2 의 아미노산 #1 내지 #110 를 함유하는 두개의 폴리펩티드 서브유니트의 동종이량체를 함유할 것으로 예상된다. 또 다른 활성종은 적어도 서열번호: 2 의 아미노산 #10 내지 #110 를 함유함으로써, 첫번째 보존된 시스테인 잔기를 함유하도록 고안된다. TGF-β/BMP 군 단백질의 기타 구성원에 대해서는, 인간 BMP-16 단백질의 카르복실-말단부가 아미노-말단부쪽보다 높은 서열 보존성을 나타낸다. 시스테인-풍부 C-말단 도메인 (서열번호: 2 의 아미노산 #10 내지 #110)에서 인간 BMP 단백질 및 TGF-β 군에 속하는 기타 단백질의 상응하는 영역에 대한 인간 BMP-16 단백질의 아미노산 상동성 백분율은 다음과 같다: BMP-2, 42%; BMP-3, 41%; BMP-4, 40%; BMP-5, 42%; BMP-6, 45%; BMP-7, 43%; BMP-8, 45%; BMP-9, 44%; BMP-10, 43%; BMP-11, 35%; BMP-12, 45%; BMP-13, 46%; BMP-15, 36%; Vgl, 44%; GDF-1, 38%; TGF-β1, 29%; TGF-β2, 32%; TGF-β3, 29%; 인히빈 βB, 38%; 인히빈 βA, 43%.
인간 BMP-16 DNA 서열 (서열번호: 1) 또는 그의 일부를 인간 BMP-16 또는 인간 BMP-16-관련 mRNA 를 합성하는 인간 세포주 또는 조직을 동정하기 위한 프로브로 사용할 수 있다. 요약하면, 선별된 세포 또는 조직원으로부터 RNA 를 추출하여, 이를 포름알테히드 아가로스 겔상에서 전기영동시키고 니트로셀룰로스에 옮기거나, 또는 포름알테히드와 반응시키고 니트로셀룰로수에 직접 스포팅한다. 이후, 상기 니트로셀룰로스를 인간 BMP-16 의 코딩서열에서 유래된 프로브에 혼성화시킨다.
선택적으로, 인간 BMP-16 서열은 인간 BMP-16 의 일부 또는 인간 BMP-16-관련 코딩서열을 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 고안하는데 사용된다. 상기 인간 BMP-16 유래 프라이머는 mRNA, cDNA 또는 게놈 DNA 주형으로부터 이에 상응하는 인간 BMP-16 또는 BMP-16-관련 코딩서열을 특이적으로 증폭시키는 것을 가능하게 한다. 일단 상기 기재된 방법중의 하나에 의해 포지티브 원이 동정되면, 올리고 (dT) 셀룰로스 크로마토그래피에 의해 mRNAN 를 선별하고, cDNA 를 합성하고, 확립된 기술에 의해 당업자에게는 공지되어 있는 λgt1O 또는 기타 λ 박테리오파아지 벡터, 예를 들어 λZAP 에 클로닝한다 (Toole et al., supra). 또한, λ 박테리오파아지 벡터에 클로닝되어 있는 미리 확립된 인간 CDNA 또는 게놈 라이브러리상에 상기 기재된 직접 올리고뉴클레오티드 프라이머의 의한 증폭반응을 수행할 수 있다. 이 경우, 증폭된 인간 BMP-16 또는 BMP-16-관련 코딩 DNA 의 단편을 프로브로 사용하여 인간 BMP-16 또는 BMP-16-관련 단백질의 일부를 코딩하는 특이적으로 증폭된 DNA 산물을 생성하는 라이브러리를 직접 스크리닝할 수 있다.
인간 BMP-16-관련 단백질을 코딩하는 기타 전체길이의 cDNA, 또는 인간을 제외한 종, 특히 기타 포유동물종으로부터 얻은 본 발명의 BMP-16-관련 단백질을 코딩하는 전체길이의 cDNA 클론을 분리하기 위하여 당업자에게는 공지된 추가적인 방법을 사용할 수 있다.
실시예 2
W-20 바이오검정법
A. W-20 세포의 탐지
W-20 골수 스트로마 세포의 지시자 세포주로서의 사용은 상기 세포가 BMP 단백질로 처리한 후 오스테오블라스트-유사 세포로 전환되다는 것을 근거로 한다 [Thies et al, Journal of Bone and Mineral Research, 5:305 (1990); 및 Thies et al, Endocrinology, 130:1318 (1992)]. 구체적으로, W-20 세포는 D. Nathan 박사 (Children's Hospital, Boston, MA) 의 연구실에서 연구자들에 의해 성체 마우스로부터 유래된 클로성 골수 스트로마 세포주이다. W-20 세포를 특정 BMP 단백질로 처리할 경우 상기 세포에 의해 (1) 알칼리 포스파타제 생성이 증가되고, (2) PTH 으로 촉진되는 cAMP 가 유도되고, (3) 오스테오칼신 합성이 유도된다. (1) 및 (2) 는 오스테오블라스트 표현형과 관련된 특징을 나타내는 반면, 오스테오칼신을 합성하는 능력은 성숙 오스테오블라스트에서만 나타나는 표현형적 특성이다. 또한, 이제까지 우리는 BMP 로 처리했을 때만 W-20 스트로마 세포가 오스테오블라스트-유사 세포로 전환되는 것을 관찰하였다. 여기에서, BMP 처리된 W-20 세포에 의해 나타나는 체내 활성은 BMP 에 대해 알려져 있는 체내 골 형성 활성과 관련되어 있다.
하기에 신규 골유도성 분자의 BMP 활성과의 비교에 유용한 2 가지 체내 검정법을 개시한다.
B. W-20 알칼리 포스파타제 검정법 프로토콜
96 웰 조직배양 플레이트에 웰당 배양액 (10% 열불활성화시킨 소 태아 혈청, 2 mM 글루타민 및 100 유니트/ml 페니실린 + 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 보강한 DME) 200 ㎕ 에 10,000 세포의 밀도로 W-20 세포를 플레이팅한다. 상기 세포를 95% 공기, 5% CO237℃ 인큐베이터내에서 밤새 부착되도록 한다. 멀티채널 피펫터를 이용하여 각 웰로부터 200 ㎕ 의 배양액을 제거하고, 10% 열불활성화시킨 소 태아 혈청, 2 mM 글루타민 및 1% 페니실린을 보강한 DME 내에 운반되는 동부피의 시험시료로 대체한다. 시험물질을 삼중으로 검정한다. 시험시료 및 표준을 W-20 지시자 세포를 이용하여 24 시간 인큐베이션시킨다. 24 시간후, 37℃ 인큐베이터로부터 플레이트를 꺼내어, 세포로부터 시험배양액을 제거한다. W-20 세포층을 웰당 200 ㎕ 의 칼슘-마그네슘이 없는 포스페이트 완충화된 식염수로 3회 세정하고, 세정액을 제거한다. 각 웰에 50 ㎕ 의 증류수를 첨가한 후, 검정 플레이트를 드라이아이스/에탄올 욕조에 위치시켜 급속하게 냉각시킨다. 냉각된 후, 드라이아이스/에탄올 욕조에서 상기 검정 플레이트를 꺼내어 37℃ 에서 녹인다. 상기 단계를 2회 더 반복하여, 총 3회 냉각-해동시킨다. 완료후, 멤브레인에 결합된 알칼리 포스파타제를 측정에 이용할 수 있다. 각 웰에 50 ㎕ 의 검정 혼합물 (50 mM 글리신, 0.05% 트리톤 X-100, 4 mM MgCl2, 5 mM p-니트로페놀 포스페이트, pH = 10.3)을 첨가하고, 이후 검정 플레이트를 분당 60회전의 37℃ 진탕용조에서 30 분간 인큐베이션시킨다. 30 분 인큐베이션이 끝난 후, 각 웰에 100 ㎕ 의 0.2 N NaOH 를 첨가하여 반응을 정지시키고, 상기 검정 플레이트를 얼음위에 위치시킨다. 405 나노미터의 파장에서 각 웰에 대한 흡광도를 읽는다. 이후, 상기 수치를 고이된 표준과 비교하여 각 시료내 알칼리 포스파타제 활성 추정치를 얻는다. 예를 들어, 공지된 양의 p-니트로페놀 포스페이트을 사용하여, 흡광도를 알아낸다. 이를 표 I 에 나타낸다.
공지된 표준인 p-니트로페놀 포스페이트의 흡광도 수치
P-니트로페놀 포스페이트 마이크로몰 평균 흡광도 (405nm)
0.0000.0060.0120.0180.0240.030 00.261 +/- .0240.521 +/- .0310.797 +/- .0631.074 +/- .0611.305 +/- .083
공지된 양의 BMP 에 대한 흡광도 수치를 표 II 에 나타낸 바와 같이 단위시간당 절개된 p-니트로페놀 포스페이트의 마이크로몰로 결정 및 변환시킬 수 있다.
BMP-2 로 처리한 W-20 세포에 대한 알칼리 포스파타제 수치
BMP-2 농도 (ng/ml) 405 나노미터에서의 흡광도 시간당 기질의 마이크로몰량
01.563.126.2512.5025.050.0100.0 0.6450.6960.7650.9231.1211.4571.6621.977 0.0240.0260.0290.0360.0440.0580.0670.080
이후, 상기 수치를 사용하여 BMP-2 에 대한 공지된 양의 BMP-16 의 활성을 비교한다.
C. 오스테오칼신 RIA 프로토콜
24 웰 조직배양 디쉬에 웰당 배양액 (10% 열불활성화시킨 소 태아 혈청, 2 mM 글루타민을 함유하는 DME) 2 ml 에 106세포의 밀도로 W-20 세포를 플레이팅한다. 상기 세포를 95% 공기, 5% CO237℃ 인큐베이터내에서 밤새 부착되도록 한다. 다음날, 배양액을 10% 소 태아 혈청, 2 mM 글루타민 및 시험물질을 함유하는 DME 총 2 ml로 바꾼다. 상중 웰에 각 시험물질을 투여한다. 시험물질을 W-20 세포와 함께 48 시간째에 동일한 시험 배양액으로 대체하여 총 96 시간동안 인큐베이션시킨다. 96 시간의 끝무렵에, 각 웰로부터 50 ㎕ 의 시험 배양액을 취하고, 마우스 오스테오칼신용 면역방사선검정법(radioimmunoassay)을 이용하여 오스테오칼신 생성을 검정하였다. 검정법의 세부사항은 Biomedical Technologies Inc. (378 Page Street, Stoughton, MA 02072) 에서 제조한 키트에 기재되어 있다. 검정용 시약은 제품번호 BT-431 (마우스 오스테오칼신 표준), BT-432 (염소 항-마우스 오스테오칼신), BT-431R (요오드화시킨 마우스 오스테오칼신), BT-415 (일반 염소 혈청) 및 BT-414 (당나귀 항-염소 IgG) 이다. BMP 처리에 대응하여 W-20 세포에 의해 합성된 오스테오칼신에 대한 RIA 는 제조업체에서 제공한 프로토콜에 기재되어 있다.
시험시료에 대해 얻어진 수치를 마우스 오스테오칼신의 공지된 표준에 대한 수치 및 공지된 양의 BMP-2 에 대응하여 W-20 세포에 의해 생성된 오스테오칼신의 양과 비교한다. BMP-2 에 의해 유도된 W-20 세포에 의한 오스테오칼신 합성의 수치를 표 3 에 나타낸다.
W-20 세포에 의한 오스테오칼신 합성
BMP-2 농도 ng/ml 오스테오칼신 합성 ng/웰
02481631621252505001000 0.80.90.82.22.73.25.16.58.29.410.0
실시예 3
로젠 수정 샘패쓰-레디 검정법(ROSEN MODIFIED SAMPATH-REDDI ASSAY)
문헌 [Sampath 및 Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:6591-6595 (1983)]에 개시되어 있는 래트 골 형성 검정법의 수정판을 사용하여 BMP 단백질의 골 및/또는 연골 및/또는 기타 결합조직 활성을 측정한다. 이러한 수정된 검정법을 여기에서는 로젠 수정 샘패쓰-레디 검정법이라 부른다. 샘패쓰-레디 방법중 에탄올 침전법은 물에 대해 검정될 분획을 (조성물이 용액인 경우) 투석 또는 (조성물이 현탁액인 경우) 다이아필터링시키는 것으로 대체한다. 이후, 상기 용액 또는 현탁액을 0.1% TFA 까지 평형화시킨다. 생성된 용액을 20 mg 의 래트 매트릭스에 첨가한다. 단백질로 처리하지 않은 모조 래트 매트릭스 시료를 대조군으로 사용한다. 상기 물질을 냉각 및 동결건조시키고, 생성된 분말을 #5 젤라틴 캡슐내에 포장한다. 상기 캡슐을 21-49 일된 수컷 Long Evans 래트의 흉복부에 피하 이식한다. 7-14 일후에 이식물을 제거한다. 각 이식물의 반을 알칼리 포스파타제 분석에 사용한다 [참조, Reddi et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 69:1601 (1972)].
각 이식물의 나머지 반은조직학적 분석용으로 고정 및 프로세싱한다. 1 ㎛ 글리콜메타크릴레이트 구역을 Von Kossa 및 산 fuschin 으로 염색하여 각 이식물에 존재하는 유도된 골 및 연골 및 기타 결합조직 형성량의 등급을 매겼다. 용어 +1 내지 +5 는 새로운 골 및/또는 연골 세포 및 매트릭스어 점해져 있는 이식물의 각 조직학적 구역의 면적을 나타낸다. 점수 +5 는 이식물내 단백질의 직접적인 결과로 이식물의 50% 이상이 새로운 골 및/또는 연골임을 의미한다. 점수 +4, +3, +2, 및 +1 은 각각 40%, 30%, 20% 및 10% 이상이 새로운 연골 및/또는 골을 함유함을 나타낸다.
선택적으로, 상기 이식물들에서 배아 힘줄과 유사한 조직의 출현을 조사하였으며, 이는 동일한 평면에 배향되어 있고 서로 타이트하게 포개져 있는 섬유아세포의 밀집된 다발의 존재로 확인된다 [힘줄/인대-유사 조직은 예를 들어 문헌 (Ham 및 Cormack, Histology (JB Lippincott Co. (1979), pp. 367-369, 여기에 참고문헌으로 포함되어 있음]. 이러한 발견은 BMP-16-관련 단백질을 함유하는 이식물에서 힘줄/인대-유사 조직을 관찰하는 추가적인 검정법에서 재현될 수 있다. 본 발명의 BMP-16-관련 단백질은 상기 검정법에서 활성이 평가될 수 있다.
실시예 4
BMP-16 의 발현
쥐, 인간 또는 기타 포유동물 BMP-16-관련 단백질을 제조하기 위하여, 이를 코딩하는 DNA 를 적당한 발현 벡터에 옮겨, 통상의 유전공학적 기법을 이용하여 포유동물 세포 또는 기타 바람직한 진핵 또는 원핵성 숙주에 도입하였다. 생물학적으로 활성이 있는 재조합 인간 BMP-16 을 위한 바람직한 발현 시스템은 안정적으로 형질전환되는 포유동물 세포이다.
당다업자는 서열번호: 1 또는 서열번호: 3 의 서열, 또는 BMP-16-관련 단백질을 코딩하는 다른 DNA 서열 또는 기타 수정된 서열 및 공지된 벡터, 예를 들어 pCD [Okayama et a]., Mol. Cell Biol., 2:161-170 (1982)], pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4:645-653 (1985)] 및 pMT2 CXM를 사용하여 포유동물 발현 벡터를 구축할 수 있다.
포유동물 발현 벡터 pMT2 CXM 은 p9lO23(b) (Wong et al.. Science 228:8 10-815, 1985) 의 유도체로, p91023(b) 와는 테트라싸이클린 내성 유전자 대신에 앰피실린 내성 유전자를 함유하고 cDNA 클론의 삽입을 위한 XhoI 부위를 함유한다는 것이 다르다. pMT2 CXM 의 기능성 인자는 문헌 (Kaufman, R.J., 1985, Proc. Nati. Acad. Scl. USA 82:689-693) 에 기재되어 있으며, 아데노바이러스 VA 유전자, 72 bp 인핸서를 포함하는 SV40 복제기원, 아데노바이러스 후기 mRNA 상에 존재하는 5' 스플라이싱 부위와 아데노바이러스 트리파타이트 리더 서열을 포함하는 아데노바이러스 주요 후기 프로모, 3' 스플라이싱 수용체 부위, DHFR 삽입편, SV40 초기 폴리아데닐화 부위 (SV40), 및 E. coil 내에서 생존하기 위하여 필요한 pBR322 서열을 포함한다.
플라스미드 pMT2 CXM 은 pMT2-VWF 의 EcoRI 절단에 의해 얻어지며, American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD (USA)소재)에 접근번호 ATCC 67122 로 기탁되어 있다. EcoRl 절단은 pMT2-VWF 내에 존재하는 cDNA 를 절단해 내어, 앰피실린 내성에 결찰되어 E. coli HB 101 또는 DH-5 를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있는 선형 pNT2 를 생성한다. 플라스미드 pMT2 DNA 는 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이후, 루프아웃/인 변이도입법을 이용하여 pMT2 CXM 를 구축한다 [Morinaga, et al., Biotechnology 84: 636 (1984)]. 이는 SV40 복제기원 및 pMT2 의 인핸서 서열 근처의 Hind III 부위와 관련한 염기 1075 내지 1145 를 제거한다. 추가로, 이는 뉴클레오티드 1145 위치에 하기의 서열을 첨가한다:
5'PO-CATGGGCAGCTCGAG-3'
상기 서열은 제한효소 Xho I 의 인식부위를 포함한다. pMT2CXM 이라 명명된 상기 pMT2CXM 의 유도체는 제한효소 PstI, Eco RI, SalI 및 XhoI 의 인식부위를 포함한다. 플라스미드 pMT2 CXM 및 pMT23 DNA 는 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다.
pMT21 로부터 유래된 pEMC2β1 또한 본 발명의 실시에 적합할 수 있다. pMT21 은 pMT2-VWF 로부터 유래된 pMT2 로부터 유래된다. 상기 기재된 바와 같이, EcoRI 절단은 pMT-VWF 내에 존재하는 cDNA 를 잘라내어, 앰피실린 내성 유전자 위치에 E. coli HB 101 또는 DH-5 를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있는 선형 pNT2 를 생성한다. 플라스미드 pMT2 DNA 는 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다.
pMT21 은 하기의 두 수정을 통해 pMT2 로부터 유래된다. 먼저, G/C 말미의 19 G 잔기의 스트레치를 포함하는 DHFR cDNA 의 5'-미번역 영역 76 bp 를 결실시킨다. 이 과정에서, Xhol 부위가 삽입되어 DHFR 의 바로 상류는 하기의 서열을 갖게 된다:
5'-CTGCAGGCGAGCCTGAATTCCTCGAGCCATCATG-3'
Pstl Eco RI XhoI
둘째로, EcoRV 및 XbaI 으로 처리하고, DNA 폴리머라제 I 의 클레나우 단편으로 처리하고, ClaI 링커 (CATCGATG) 에 결찰시켜 유일한 ClaI 부위를 도입한다. 이는 아데노바이러스 관련 RNA (VAI) 영역으로부터 250 bp 단편을 결실시키나, VAI RNA 유전자 발현 또는 기능을 저해하지 않는다. pMT21 은 EcoRI 및 XhoI 으로 절단되어, 벡터 pEMC2B1 을 유도하기 위하여 사용된다.
EMCV 리더의 일부는 Eco RI 및 PstI 으로 절단에 의해 pMT2-ECAT1 으로부터 수득되며 [S.K. Jung, et al. J. Virol 63:1651-1660 (1989)], 2752 bp 단편을 형성한다. 상기 단편을 TaqI 으로 절단하여, 저온용융 아가로스 겔상에서 전기영동에 의해 정제되는 508 bp 의 Eco RI-TaqI 단편을 생성한다. 68 bp 아답터 및 그의 상보 가닥은 하기 서열을 갖는 5' TaqI 돌출말단 및 a 3' XhoI 돌출말단과 함께 합성된다:
5'-CGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATTGC-3'
TaqI Xhol
상기 서열은 뉴클레오티드 763 부터 827 까지 EMC 바이러스 리더 서열과 일치한다. 이는 또한 EMC 바이러스 리더내의 10 위치에 있는 ATG 를 ATT 로 변화시키며, 뒤에 XhoI 부위가 존재한다. pMT21 Eco RI-XhoI 단편, EMC 바이러스 EcoRI-TaqI 단편, 및 68 bp 올리고뉴클레오티드 아답터 TaqI-XhoI 아답터의 3가지 결찰방식에 의해 벡터 pEMC2β1 이 생성된다.
상기 벡터는 포유동물 세포내에서 원하는 cDNA 의 높은 수준의 발현을 인도하기에 적합한 관계로 SV40 복제기원 및 인핸서, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 주로 아데노바이러스 트리파타이트 리더 서열인 cDNA 카피, 작은 하이브리드 인터비닝 서열, SV40 폴리아데닐화 신호 및 아데노바이러스 VAI 유전자, DHFR 및 β-락타메이즈 마커 및 EMC 서열을 포함한다.
벡터의 구축은 BMP-16-관련 DNA 서열의 수정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 코딩영역의 5' 및 3' 말단상의 논-코딩 뉴클레오티드를 제거하여 BMP-16 CDNA 를 수정할 수 있다. 삭제된 논-코딩 뉴클레오티드는 발현에 유리한 것으로 알려져 있는 기타 서열로 대체될 수도 있다. 상기 벡터를 BMP-16-관련 단백질의 발현용으로 적합한 숙주세포에 형질전환시킨다. 추가로, BMP-16 을 코딩하는 프로펩티드 서열을 삭제하고 이를 기타 BMP 단백질의 완전한 프로펩티드를 코딩하는 서열로 대체시킴으로써 서열번호: 1 의 서열 또는 BMP-16-관련 단백질을 코딩하는 다른 서열이 성숙 BMP-16-관련 단백질을 발현하도록 조작할 수 있다.
당업자는 코딩 서열의 양측면에 위치한 포유동물 조절 서열을 삭제하고 이를 박테리아 서열과 대체시켜 박테리아 세포에 의한 세포내 또는 세포외 발현용 박테리아 벡터를 만듦으로써 서열번호: 1 의 서열을 조작할 수 있다. 예를 들어, 상기 코딩 서열은 추가로 조작될 수 있다 (예를 들어, 다른 공지된 링커에 결찰시키거나, 여기에서 노-코딩 서열을 삭제 또는 다른 공지된 방법으로 내부의 뉴클레오티드를 변경하여 수정할 수 있다). 이후, 수정된 BMP-16-관련 코딩서열은 문헌 [T. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5230-5233 (1980)]에 기재된 방법을 이용하여 공지된 박테리아 벡터에 삽입될 수 있다. 이후, 상기 전형적인 박테리아 벡터를 박테리아 숙주세포에 형질전환시킴으로써 BMP-16-관련 단백질을 발현시킬 수 있다. 박테리아 세포내에서 BMP-16-관련 단백질의 세포외 발현시키기 위한 스트라티지로는, 예를 들어 유럽특허출원 EPA 177,343 을 참조하라.
곤충세포내에서의 발혈을 위한 곤충벡터의 구축을 위하여 유사한 조작을 수행할 수 있다 [참조: 예를 들어 유럽특허출원 공고공보 155,476 에 개시되어 있는 방법]. 효모 벡터 또한 효모 세포에 의한 본 발명 인자의 세포내 또는 세포외 발현용 효모 조절 서열을 이용하여 구축될 수 있다 [참조: 예를 들어 PCT 공개공보 W086/00639 및 유럽특허출원 EPA 123,289 에 개시되어 있는 방법].
포유동물 세포내에서 본 발명의 BMP-16-관련 단백질을 높은 수준으로 발현시키는 방법은 이형유전자성 BMP-16-관련 유전자를 다수로 함유하는 세포의 구축을 포함할 수 있다. 이형유전자성 유전자는 증폭가능한 마커, 예를 들어 문헌 [Kaufman 및 Sharp, J. Mol. Biol., 159:601-629 (1982)] 의 방법에 따라 증가된 유전자 카피를 함유하는 세포를 메토트렉세이트 (MTX)의 농도를 증가시키면서 증식용으로 선별할 수 있는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자에 연결된다. 이러한 접근법은 다수의 상이한 세포 유형에 대해 사용될 수 있다.
예를 들어, 그의 발현을 가능하게 하는 다른 플라스미드 서열 및 DHFR 발현 플라스미드 pAdA26SV(A)3 [Kaufman 및 Sharp, Mol. Cell. Biol., 2:1304 (1982)]와 작동성 연결되어 있는 본 발명의 BMP-16-관련 단백질의 DNA 서열을 함유하는 플라스미드를 칼슘 포스페이트 공침전법 및 트랜스펙션, 전기천공법 또는 프로토플라스트 융합을 포함하는 다양한 방법에 의해서 DHFR-결핍 CHO 세포, DUKX-BII 내에 공도입시킬 수 있다. DHFR 을 발현하는 형질전환체는 투석된 소 태아 혈텅으로 보강된 알파 배지내에서의 성장에 의한 증폭용으로 선택되고, 이후에 문헌 [Kaufman et al., Mol. Cell Biol., 5:1750 (1983)] 에 기재되어 있는 바와 같이 MTX 의 농도를 증가시킴에 따른 성장에 의해 (예를 들어 0.02, 0.2, 1.0 및 5μM MTX 의 수ㅈ차적 단계) 증폭용으로 선별된다. 형질전환체를 클로닝하고, 실시예 3 에서 상기 기재된 바와 같이 로젠-수정 샘패쓰-레디 래트 골 형성 검정법에 의해 생물학적으로 활성이 있는 BMP-16 발현을 모니터한다. BMP-16 단백질 발현은 MTX 내성의 수준을 증가시킴에 따라 증가된다. [35S] 메티오닌 또는 시스테인을 이용한 펄스 레이블링 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 당분야에 공지되어 있는 표준 기술을 사용하여 BMP-16 폴리펩티드의 특성을 규명한다. 기타 관련 BMP-16-관련 단백질을 제조하기 위하여 유사한 방법을 사용할 수 있다.
실시예 5
발현된 BMP-16 의 생물학적 활성
상기 실시예 4 에서 수득된 발현 BMP-16 의 생물학적 활성을 측정하기 위하여, 세포 배양액으로부터 함께 생성되는 기타 단백질성 물질 및 기타 오염물로부터 BMP-16-관련 단백질을 단리함으로써 단백질을 회수하고 정제한다. 실시예 3 에 개시된 래트 골 형성 검정법에 따라 상기 정제된 단백질을 검정할 수 있다.
당업자에게는 공지된 표준 기술을 사용하여 정제를 수행한다.
은으로 염색된 [Oakley, et al. Anal.Biochem. 105:361 (1980)] SDS-PAGE 아크릴아미드 [Laemmll, Nature 227:680 (1970)] 및 이뮤노블로팅 [Towbin, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350 (1979)] 과 같은 표분기술을 사용하여 단백질 분석을 수행한다.
실시예 6
노던 분석법을 이용하여, 다양한 세포주에 미치는 그들의 영향에 대해 BMP-16 및 BMP-16-관련 단백질을 시험할 수 있다. 적합한 세포주로는 E13 마우스 사지 버드로부터 유래된 세포주가 있다. BMP-16 또는 BMP-16-관련 단백질로 처리한 지 10 일후, 세포 표현형을 조직 분화의 징후에 대해 조직학적으로 조사한다. 또한, 표 IV 에 기재된 바와 같은 골, 연골 및/또는 힘줄/인대를 위한 하나 이상의 하기 마커를 포함하는 다양한 마커에 대한 BMP-16 또는 BMP-16-관련 단백질을 처리한 세포의 mRNA 의 노던 분석법을 수행할 수 있다:
마커 연골 힘줄/인대
오스테오칼신 + - -
알칼리 포스파타제 + - -
프로테오글리칸 코어 단백질 +/-1 + +2
콜라겐 유형 I + + +
콜라겐 유형 II +/-1 + +2
데코린 + + +
엘라스틴 +/-3 ? +
1-초기에 나타나는 마커, 성숙 골 조직 형태에서는 나타나지 않는 마커
2-힘줄의 위치에 따른 마커; 골 간격에서 가장 강함
3-낮은 수준으로 나타나는 마커
실시예 7
배아 스템 세포 검정
본 발명의 BMP-16 단백질을 검정하기 위하여, 다수의 수득가능한 배아 스템 세포주에 대한 체외에서의 성장 및 분화 효과를 검정할 수 있다. 이러한 세포주중 하나가 ES-E14TG2 로, American Type Culture Collection (Rockville, Md) 에서 구할 수 있다.
검정을 수행하기 위하여, 100 유니트의 LIF 존재하에 세포를 증식시켜 이들을 미분화 상태로 유지시킬 수 있다. 먼저, LIF 를 제거하고, 엠브리오이드체라고 알려진 현탁액 상태의 세포를 응집시켜 검정을 세팅한다. 3일후, 엠브리오이드체를 젤라틴이 코팅된 플레이트 (PCR 분석용 12 웰 플레이트, 면역세포화학법용 24 웰 플레이트)상에 플레이팅하고, 검정될 단백질로 처리하였다. 세포에 영양분을 공급을 공급하고 2-3일마다 단백질 인자로 처리하였다. 세포를 조정하여 검정이 15% 소 태아 혈청 (FBS) 으로 보강된 배지내에서 또는 보다 적은 양의 FBS 를 함유하는 CDM 제한 배지를 이용하여 수행될 수 있도록 적응시킬 수 있다.
처리기간이 끝날 무렵 (7-21 일 범위), 세포로부터 RNA 를 수집하고 하기 마커용 정량적 멀티플렉스 PCR 에 의해 분석한다: 브라키우리(Brachyury), 중배엽성 마커, AP-2, 외배엽성 마커, 및 외배엽성 마커인 HNF-3α. 면역세포화학법을 통해, 신경성 세포(글리아 및 신경), 근육 세포 (신근원세포, 골격근 및 평활근), 및 프로테오글리칸 코어 단백질 (연골)과 같은 다양한 기타 표현형 마커, 및 싸이토케라틴 (표피)의 분화를 탐지하는 것도 가능하다. 상기 세포들은 LIF 가 제거되는 경우 자동적으로 분화하려는 경향을 갖고 있으므로, 결과를 미처리 대조군과의 비교에 의해 항상 정량화한다.
이제까지의 상기 기재를 통해는 본 발명의 바람직한 구현예를 상세히 설명하였다. 이의 실시에는 상기 기재를 고려하여 당업자는 다양한 수정 및 변이를 만들 것으로 예상된다. 이러한 수정 및 변이는 여기에 첨부된 청구범위에 속하는 것으로 생각되어진다.
[서열목록]
(1) 일반정보
(i) 출원인: 셀레스떼, 안토니 제이.
머레이, 엘리자베쓰 엘.
(ii) 발명의명칭: BMP-16 조성물
(iii) 서열의 수: 4
(iv) 해당 주소
(A) 주소: 제네틱스 인스티튜트, 인코포레이티드
(B) 거리: 캠브리지파크 드라이브 87
(C) 시명: 캠브리지
(D) 주명: 매사츄세츠
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호 (ZIP): 02140
(v) 컴퓨터 인식가능 형태
(A) 매체유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 작동시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 특허판 #1.0, 판본 #1.25
(vi) 현행 출원 데이터
(A) 출원번호:
(B) 출원일:
(C) 분류:
(viii) 변리사/대리인 정보:
(A) 이름: 라자, 스티븐 알
(B) 등록번호: 32,618
(C) 참조/저장번호: GI 5275
(ix) 통신정보:
(A) 전화: (617) 498-8260
(B) 팩스: (617) 876-5851
(2) 서열번호: 1 에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이: 843 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 스트랜드니스: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: cDNA
(ix) 특징
(A) 명칭/키 : sig_펩티드
(B) 위치: 1..510
(ix) 특징
(A) 명칭/키 : mat_펩티드
(B) 위치: 511..840
(ix) 특징
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 위치: 1..840
(xi) 서열기재: 서열번호: 1:
[서열번호 1]
(2) 서열번호: 2 에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이: 280 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: 단백질
(xi) 서열기재: 서열번호: 2:
[서열 2]
(2) 서열번호: 3 에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이: 2003 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 스트랜드니스: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: DNA (게놈)
(xi) 서열기재: 서열번호: 3:
[서열 3]
(2) 서열번호: 4 에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이: 1184 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 스트랜드니스: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형: DNA (게놈)
(xi) 서열기재: 서열번호: 4:
[서열 4]

Claims (16)

  1. 하기로 구성된 군으로부터 선택된 DNA 서열을 함유하는 단리된 DNA 분자:
    (a) 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 #1, 511 또는 538 내지 #837 또는 840;
    (b) 서열번호: 2 의 아미노산 #-170, 1 또는 10 내지 # 109 또는 110 을 코딩하는 뉴클레오티드; 및
    (c) (a) 또는 (b) 의자연발생적 인간 대립유전자성 서열 및 동등한 축중 코돈 서열.
  2. 제 1 항의 DNA 서열로 형질전환된 숙주세포.
  3. 그의 발현 조절 서열과 작동성으로 연결되어 있는 제 1 항의 DNA 분자를 함유하는 벡터.
  4. 제 3 항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  5. 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 # 511 내지 #840 으로 구성된 DNA 서열을 함유하는 단리된 DNA 분자.
  6. 그의 발현 조절 서열과 작동성으로 연결되어 있는 제 5 항의 DNA 분자를 함유하는 벡터.
  7. 제 6 항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  8. 하기의 단계를 포함하는 정제 인간 골 형태발생 단백질-16 (BMP-16) 단백질의 제조방법:
    (a) 제 1 항의 DNA 분자로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 배양배지로부터 상기 인간 BMP-16 단백질을 회수 및 정제하는 단계.
  9. 제 8 항에 있어서, 숙주세포를 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 # 511 내지 #840 으로 구성된 DNA 코딩서열을 함유하는 DNA 분자로 형질전환시키는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 숙주세포가 포유동물 세포이고, DNA 분자가 추가로 TGF-β 수퍼패밀리 단백질의 구성원으로부터 선택된 프로펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 함유하고, 이때 상기 프로펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 DNA 코딩서열에 대해 적합한 리딩 프레임으로 연결되어 있는 방법.
  11. 서열번호: 2 에 개시되어 있는 아미노산 #1 부터 #11O 까지의 아미노산 서열을 함유하는 정제 골 형태발생 단백질-16 (BMP-16) 폴리펩티드.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 이량체이고, 하나 이상의 서브유니트가 서열번호: 2 의 아미노산 #1 부터 #11O 까지의 아미노산 서열을 함유하는 정제 BMP-16 폴리펩티드.
  13. 하기 (a) 및 (b) 단계에 의해 제조되는 정제 골 형태발생 단백질-16 (BMP-16) 폴리펩티드:
    (a) 제 5 항의 DNA 분자로 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 배양배지로부터 서열번호: 2 의 아미노산 #1 부터 #11O 까지의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 회수 및 정제하는 단계.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 두개의 서브유니트로 구성된 이량체이고, 이중 하나의 서브유니트는 서열번호: 2 의 아미노산 #1 부터 #11O 까지의 아미노산 서열을 함유하며, 나머지 하나의 서브유니트는 BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9 BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, 및 BMP-15 로 구성된 군으로부터 선택된 골 형태발생 단백질용 아미노산 서열을 함유하는 정제 골 형태발생 단백질-16 (BMP-16) 폴리펩티드.
  15. TGF-β 수퍼패밀리 단백질의 구성으로부터 선택된 프로펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 함유하고, 상기 DNA 서열은 골 형태발생 단백질-16 (BMP-16) 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열에 프레임 방향으로 연결되고, 상기 BMP-16 폴리펩티드는 서열번호: 2 의 아미노산 #1 내지 #110 을 함유하는 것을 특징으로 하는 키메라 DNA 분자.
  16. 제 12 항의 정제 BMP-16 단백질에 대한 항체.
KR1019997001978A 1996-09-18 1997-07-09 골 형태발생 단백질-16 (bmp-16) 조성물 KR20000036012A (ko)

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