JP2729222B2 - 新規骨誘導組成物 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】この発明は、新規蛋白質およびそれらの製
造方法に関するものである。これらの蛋白質は軟骨およ
び硬骨の形成を誘導し得る。 【０００２】 【従来の技術】骨は、蛋白質コラーゲンの線維束、およ
びプロテオグリカン、非コラーゲン性蛋白質、脂質およ
び酸性蛋白質により形成された広範なマトリックス構造
を特徴とする高度に分化した組織である。一生を通じて
連続的に行なわれる骨形成および骨組織の再生／修復の
プロセスは、分化細胞により行なわれる。正常な胎長骨
の発達の前に、軟骨のひな形が形成される。骨の成長は
恐らく「骨芽細胞」(骨形成細胞)の介在によると思われる
が、骨の再建は明らかに骨吸収細胞、いわゆる「破骨細
胞」および骨芽細胞の結合活性により行なわれる。様々
な骨原性軟骨誘導および硬骨誘導因子が報告されてい
る。それらに関しては、例えばヨーロッパ特許出願第１
４８１５５号および同第１６９０１６号参照。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】この発明は、純粋形態
の新規蛋白質を提供する。具体的には、４種の新規蛋白
質は、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２・クラスＩ(またはＢＭ
Ｐ−２)、ＢＭＰ−３およびＢＭＰ−２・クラスII(また
はＢＭＰ−４)(ただし、ＢＭＰは骨形態形成蛋白質であ
る)と称する。これらの蛋白質は、後記第２〜８表に示
したアミノ酸配列と同一または実質的に相同性のペプチ
ド配列を特徴とする。それらは予め定められた部位での
骨形成を誘導し得る。さらにこれらの骨誘導因子は、後
記インビボラット骨形成検定における１０〜１０００n
ｇ／ｇ(骨)の濃度での活性を含む生化学的および生物学
的特性を特徴とする。この発明の蛋白質は、表に示した
ＤＮＡ配列、またはそれとハイブリダイゼーションし、
骨成長因子の生物学的特性を有するポリペプチドをコー
ドし得る配列またはそれらの特性を示す他の様々な修飾
配列によりコードされ得る。 【０００４】この発明の蛋白質の１つはＢＭＰ−１とい
う。ひとＢＭＰ−１またはhＢＭＰ−１の一部分は、ゲ
ノムhＢＭＰ−１フラグメントを表す後記第５表のアミ
ノ酸＃１〜アミノ酸＃３７またはhＢＭＰ−１ cＤＮＡ
を表す第６表のアミノ酸＃１〜アミノ酸＃７３０の配列
と同一または実質的に同じペプチド配列を有することを
特徴とする。さらに、hＢＭＰ−１または関連骨誘導因
子は、これらの配列の少なくとも一部分を有することを
特徴とし得る。これらのペプチド配列は、第５表のヌク
レオチド＃３４４０〜ヌクレオチド＃３５５０および第
６表のヌクレオチド＃３６〜ヌクレオチド＃２２２５に
それぞれ示された配列と同一または実質的に同じＤＮＡ
配列によりコードされる。さらに、これらのhＢＭＰ−
１ポリペプチドは骨形成誘導能を有することを特徴とす
る。hＢＭＰ−１は、骨１ｇ当たり１０〜１０００nｇの
濃度でインビボ ラット骨形成検定において活性を呈す
る。 【０００５】この発明の相同性うし成長因子(bＢＭＰ−
１と称す)は、ゲノムbＢＭＰ−１フラグメントを表す後
記第２表のアミノ酸＃１〜アミノ酸＃３７の配列と同一
または実質的に同じ配列を含むペプチド配列を有するこ
とを特徴とする。このペプチド配列は、後記第２表のヌ
クレオチド＃２９４〜ヌクレオチド＃４０４に示された
配列と同一または実質的に同じＤＮＡ配列によりコード
される。後記第２表で同定されたうしペプチド配列もま
た３７アミノ酸長である。さらに、bＢＭＰ−１は骨形
成誘導能を特徴とする。この発明の別の骨誘導蛋白質組
成物は、ＢＭＰ−２・クラスＩ(またはＢＭＰ−２)と称
する。それは、cＤＮＡ hＢＭＰ−２・クラスＩを表す
第７表のアミノ酸＃１〜アミノ酸＃３９６の配列と同一
または実質的に同じペプチド配列の少なくとも一部分を
有することを特徴とする。このペプチド配列は、第７表
のヌクレオチド＃３５６〜ヌクレオチド＃１５４３に示
された配列と同一または実質的に同じＤＮＡ配列により
コードされる。第７表で同定されたひとペプチド配列は
３９６アミノ酸長である。またhＢＭＰ−２または関連
骨誘導蛋白質もこのペプチド配列の少なくとも一部分を
有することを特徴とし得る。さらにhＢＭＰ−２・クラ
スＩは、骨形成誘導能を特徴とする。 【０００６】hＢＭＰ−２・クラスＩ(またはhＢＭＰ−
２)と称するこの発明の相同性うし骨誘導蛋白質は、ゲ
ノム配列を表す後記第３表で同定されたＤＮＡ配列を有
する。このうしＤＮＡ配列は、予想される１２９アミノ
酸コード配列、次いで約２０５個のヌクレオチド(３'非
コード配列)を有する。さらにhＢＭＰ−２・クラスＩは
骨形成誘導能を特徴とする。この発明の別の骨誘導蛋白
質組成物は、ＢＭＰ−２・クラスIIまたはＢＭＰ−４と
称する。ひと蛋白質hＢＭＰ−２・クラスII(またはhＢ
ＭＰ−４)は、hＢＭＰ−２・クラスIIのcＤＮＡを表す
第８表のアミノ酸＃１〜アミノ酸＃４０８間の配列と同
一または実質的に同じペプチド配列の少なくとも一部分
を有することを特徴とする。このペプチド配列は、第８
表のヌクレオチド＃４０３〜ヌクレオチド＃１６２６に
示された配列と同一または実質的に同じＤＮＡ配列の少
なくとも一部分によりコードされる。さらにこの因子
は、骨形成誘導能を特徴とする。 【０００７】この発明のさらに別の骨誘導因子、ＢＭＰ
−３は、うし相同体bＢＭＰ−３により示される。bＢＭ
Ｐ−３は、うしゲノム配列を表す第４ＡおよびＢ表のＤ
ＮＡ配列およびアミノ酸配列を有することを特徴とす
る。それは、第４ＡおよびＢ表のアミノ酸＃１〜アミノ
酸＃１７４と同一または実質的に同じペプチド配列の少
なくとも一部分を有することを特徴とする。さらにＢＭ
Ｐ−３は、骨形成誘導能を特徴とする。うし因子は、類
縁体ひとＢＭＰ−３蛋白質または他のほ乳類骨誘導蛋白
質を得るための道具として使用され得る。このうし骨誘
導因子の特性を正確に表すと、この配列を用いる方法に
おける本質的「出発点」が得られる。遺伝子工学技術分野
における熟練者に周知の技術を用いるこの方法は、プロ
ーブとしてうしＤＮＡ配列を使用してひとゲノムまたは
cＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、このプ
ローブとハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列を同定
することを含む。ハイブリダイゼーション可能な配列を
有するクローンは精製されたプラークであり、ＤＮＡは
そこから分離され、サブクローンされ、ＤＮＡ配列分析
が行なわれる。すなわち、この発明の別の態様は、この
方法により製造されたひと蛋白質hＢＭＰ−３である。 【０００８】この発明の別の態様は、医薬的に許容し得
る賦形剤中にこの発明によるうし成長因子ポリペプチド
の１種またはそれ以上の治療有効量を含有する医薬組成
物に関するものである。さらに、これらの組成物は他の
治療上有用な薬剤を含有し得る。またそれらは、骨欠損
部位への蛋白質送達および骨成長構造の提供に適したマ
トリックスを含み得る。これらの組成物は、幾つかの骨
欠損および歯周病の処置方法において使用され得る。こ
の発明によると、これらの方法は、骨形成を必要とする
患者に、本明細書に記載された新規蛋白質ＢＭＰ−１、
ＢＭＰ−２・クラスＩ、ＢＭＰ−２・クラスIIおよびＢ
ＭＰ−３の少なくとも１種の有効量を投与することを必
然的に伴う。 【０００９】さらにこの発明の別の態様は、骨形成誘導
能を有するひとまたはうしポリペプチドの発現をコード
するＤＮＡ配列に関するものである。それらの配列は、
第２〜８表に示された５'−３'方向のヌクレオチド配列
を含む。他方、ストリンジェント条件下で第２〜８表の
ＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列、
または非ストリンジェント条件下で示されたＤＮＡ配列
とハイブリダイゼーションし、少なくとも１種の骨成長
因子生物学的特性を有する蛋白質の発現をコードするＤ
ＮＡ配列もこの発明に包含される。最後に、第２〜８表
の配列の対立遺伝子または他の変形もまた、それらのヌ
クレオチド変形の結果としてのペプチド配列の変形の存
否に拘わらず、この発明に含まれる。 【００１０】さらにこの発明の別の態様は、前記ＤＮＡ
配列を発現制御配列と効果的に組み合わせて含むベクタ
ーに関するものである。このベクターは、発現制御配列
と効果的に共同して骨成長因子ポリペプチドの発現をコ
ードするＤＮＡ配列により形質転換されたセルラインが
培養される、骨成長因子ポリペプチドの新規製造方法に
おいて使用され得る。この発明の方法は、ポリペプチド
発現用の宿主細胞として幾つかの公知細胞を使用し得
る。現在好ましいセルラインはほ乳類セルラインおよび
細菌細胞である。以下、詳細な記載および好ましい実施
態様を熟考すれば、この発明の他の態様および利点は明
らかである。 【００１１】 【課題を解決するための手段】この発明の蛋白質は、後
記第２〜８表に示された配列と同一または実質的に相同
性のアミノ酸配列またはその一部分を有することを特徴
とする。これらの蛋白質もまた骨形成誘導能を特徴とす
る。また、この明細書に記載された骨成長因子は、第２
〜８表の配列に類似した配列によりコードされる因子を
含むが、その配列に対する修飾は、自然に行なわれるか
(例、ポリペプチドにおけるアミノ酸変更を誘導し得る
ヌクレオチド配列における対立遺伝子的改編)または慎
重な工学的処理により行なわれる。例えば、合成ポリペ
プチドは、第２〜８表のアミノ酸残基の連続配列を全体
的または部分的に複製し得る。これらの配列は、第２〜
８表の骨成長因子ポリペプチドと共有の一次、二次また
は三次構造および立体配座特性により、共通して骨成長
因子生物学的特性を有し得る。すなわち、それらは、治
療プロセスにおいて天然骨成長因子ポリペプチドの生物
学的活性代用物として使用され得る。 【００１２】この明細書に記載された骨成長因子の配列
の他の特異的突然変異体は、グリコシル化部位の一方ま
たは両方の修飾を伴う。グリコシル化の不在または一部
のみのグリコシル化は、第２〜８表に示された骨成長因
子の配列に存在するアスパラギン結合グリコシル化認識
部位の一方または両方におけるアミノ酸置換または欠失
に起因する。アスパラギン結合グリコシル化認識部位
は、適当な細胞のグリコシル化酵素により特異的に認識
されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド
配列は、アスパラギン−Ｘ−トレオニンまたはアスパラ
ギン−Ｘ−セリン(ただし、Ｘは通常アミノ酸である)で
ある。グリコシル化認識部位の第一または第三アミノ酸
位の一方または両方における様々なアミノ酸置換または
欠失(および／または第２位におけるアミノ酸欠失)は、
修飾トリペプチド配列における非グリコシル化をもたら
す。またこの発明は、他の蛋白質性材料をコードするＤ
ＮＡ配列との随伴がなく、骨成長因子の発現をコードす
る新規ＤＮＡ配列を(アレリック)包含する。これらのＤ
ＮＡ配列は、５'−３'方向の第２〜８表に示された配列
およびストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件
[マニアチス等、「モレキュラー・クローニング(ア・ラ
ボラトリー・マニュアル)」、コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー(１９８２)、３８７〜３８９頁参
照]下で第２〜８表のＤＮＡ配列とハイブリダイゼーシ
ョンする配列を含む。 【００１３】緩和ハイブリダイゼーション条件下で第２
〜８表の配列とハイブリダイゼーションし、骨成長因子
生物学的特性を有する骨成長因子の発現をコードするＤ
ＮＡ配列はまた、この発明の骨成長因子もコードする。
例えば、重要な相同性を有する領域、例えばグリコシル
化またはジスルフィド結合部位を第２〜８表の配列と共
有し、１種またはそれ以上の骨成長因子生物学的特性を
有する骨成長因子をコードするＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配
列が第２〜８表の配列とストリンジェント的にハイブリ
ダイゼーションしない場合でも、成長因子のこの新たな
科の一員を明らかにコードする。同様に、第２〜８表の
配列によりコードされる骨成長因子ポリペプチドをコー
ドするが、遺伝子コードの縮重またはアレリック変異
(アミノ酸変更を誘導する場合もしない場合もあり得る
種の集団における天然塩基の変形)故にコドン配列が異
なるＤＮＡ配列もまた、この明細書に記載された新規成
長因子をコードする。点突然変異または誘導修飾により
ポリペプチドの活性、半減期または生産の向上が誘発さ
れる第２〜８表のＤＮＡ配列における変形もまたこの発
明に包含される。 【００１４】この発明の別の態様は、新規骨誘導因子の
新規製造方法に関するものである。この発明の方法は、
既知調節配列の制御下、この発明の新規骨成長因子ポリ
ペプチドの発現をコードするＤＮＡ配列により形質転換
された適当な細胞またはセルラインの培養を含む。適当
な細胞またはセルラインは、ほ乳類細胞、例えばチャイ
ニーズ・ハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)であり得る。適当
なほ乳類宿主細胞の選択並びに形質転換、培養、増幅、
スクリーニング、および製品の製造および精製の方法は
当業界では周知である。例えば、ゲシングおよびサンブ
ルック、「ネイチャー」、２９３、６２０−６２５(１９
８１)または別法としてカウフマン等、「モル・セル・バ
イオル」、５(７)１７５０−１７５９(１９８５)または
ハウレイ等、アメリカ合衆国特許第４４１９４４６号参
照。後記実施例記載の別の適当なほ乳類セルラインは、
さるＣＯＳ−１セルラインである。同様に有用なほ乳類
セルラインはＣＶ−１セルラインである。 【００１５】細菌細胞は適当な宿主である。例えば、エ
シェリヒア・コリの様々な株(例、ＨＢ１０１、ＭＣ１
０６１)はバイオテクノロジー分野において宿主細胞と
してよく知られている。枯草菌(バシルス・サブチリ
ス)、プソイドモナス、他のかん菌などの様々な株もま
たこの方法において使用され得る。当業界の熟練者には
周知の多くの酵母細胞株もまた、この発明のポリペプチ
ドの発現用の宿主細胞として利用され得る。さらに、所
望により、昆虫細胞もこの発明の方法における宿主細胞
として利用され得る。例えば、ミラー等、「ジェネティ
ック・エンジニアリング」、８、２７７−２９８(プレナ
ム・プレス１９８６)およびその引用文献参照。この発
明の別の態様は、これらの新規骨誘導ポリペプチド類の
発現方法で使用されるベクターに関するものである。好
ましくは、これらのベクターは、この発明の新規因子を
コードする前述の完全な新規ＤＮＡ配列を含む。さらに
また、これらのベクターは、骨誘導蛋白質配列を発現さ
せる適当な発現制御配列を含む。他方、上記修飾配列が
組み込まれたベクターはまた、この発明の具体例であ
り、骨誘導蛋白質の製造に有用である。これらのベクタ
ーはセルラインの形質転換方法で使用され得、選択され
た宿主細胞におけるその複製および発現を指向し得るこ
の発明のＤＮＡコード配列と効果的に組み合わせて選択
された調節配列を含み得る。これらのベクターに有用な
調節配列は当業界の熟練者には周知であり、選択された
宿主細胞に応じて選択され得る。この選択は常套的であ
り、この発明の一部を形成するものではない。 【００１６】骨が正常には形成されない環境において骨
の成長を誘導するこの発明の蛋白質は、骨折の治癒に適
用性を有する。この発明の蛋白質の１種またはそれ以上
を用いる骨原性製剤は、閉鎖および複雑骨折の縮小並び
に人工関節の固定改善における予防的用途を有し得る。
骨原性薬剤により新たに誘導される骨形成は、先天的、
外傷性または腫よう切除による頭顔欠損の修復に貢献
し、美容形成外科においても有用である。この発明の骨
生成因子は、歯周病の処置および他の歯修復プロセスに
おいて貴重であり得る。これらの薬剤は、骨形成細胞を
誘引し、骨形成細胞の成長を刺激し、または骨形成細胞
の原種の分化を誘導する環境を提供する。勿論、この発
明の蛋白質は他の治療用途を有し得る。この発明の別の
態様は、骨折および骨欠損に関連した他の状態または歯
周病の修復を目的とする治療方法および組成物に関する
ものである。前記組成物は、この発明の骨誘導因子蛋白
質の少なくとも１種の治療有効量を含有する。この発明
による骨誘導因子は、医薬的に許容し得る賦形剤または
マトリックスと混合した状態で治療組成物中に存在し得
る。さらにこの発明の治療方法および組成物は、この発
明の骨誘導因子の治療有効量およびこの発明の他の骨誘
導因子の少なくとも１種の治療有効量を含む。さらに、
この発明による蛋白質またはこの発明の蛋白質の組合わ
せは、それが相互作用し得る１種またはそれ以上の骨誘
導因子と共に投与され得る。さらに、骨誘導蛋白質は、
問題の骨欠損の処置に有益な他の薬剤と組合わされ得
る。それらの薬剤には様々な成長因子が含まれるが、限
定される訳ではない。pＨ、等張性、安定性などに関し
て生理学的に許容し得る蛋白質組成物の製造は、当業界
の技術の範囲内である。 【００１７】特にＢＭＰ−１は、組成物において個々に
使用され得る。ＢＭＰ−１はまた、この発明の他の蛋白
質の１種またはそれ以上と組合わせて使用され得る。Ｂ
ＭＰ−１およびＢＭＰ−２・クラスＩは組合わせて使用
され得る。ＢＭＰ−１およびＢＭＰ−２・クラスIIもま
た組合わせて使用され得る。ＢＭＰ−１およびＢＭＰ−
３もまた組合わせて使用され得る。さらに、ＢＭＰ−１
は、この発明の他の蛋白質の２種または３種と組合わせ
て使用され得る。例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２・ク
ラスＩおよびＢＭＰ−２・クラスIIは組合わされ得る。
ＢＭＰ−１はまた、ＢＭＰ−２・クラスＩおよびＢＭＰ
−３と組合わされ得る。さらに、ＢＭＰ−１は、ＢＭＰ
−２・クラスIIおよびＢＭＰ−３と組合わされ得る。Ｂ
ＭＰ−１、ＢＭＰ−２・クラスＩ、ＢＭＰ−２・クラス
IIおよびＢＭＰ−３は組合わされ得る。ＢＭＰ−２・ク
ラスＩは、医薬組成物において個々に使用され得る。Ｂ
ＭＰ−２・クラスＩもまた、この発明の他の蛋白質の１
種またはそれ以上と組合わせて使用され得る。ＢＭＰ−
２・クラスＩは、ＢＭＰ−２・クラスIIと組合わされ得
る。それはまた、ＢＭＰ−３とも組合わされ得る。さら
にＢＭＰ−２・クラスＩは、ＢＭＰ−２・クラスIIおよ
びＢＭＰ−３と組合わされ得る。 【００１８】ＢＭＰ−２・クラスIIは、医薬組成物にお
いて個々に使用され得る。さらに、それは前述の他の蛋
白質と組合わせて使用され得る。さらに、それはＢＭＰ
−３と組合わせて使用され得る。ＢＭＰ−３は、組成物
において個々に使用され得る。さらにそれは、前述の様
々な組合わせで使用され得る。この治療方法は、インプ
ラントまたはデバイスとして組成物を局所投与すること
を含む。投与される場合、勿論この発明で使用される治
療組成物は、発熱物質を含まない、生理学的に許容し得
る形態を呈する。さらに、この組成物は、望ましくは骨
損傷部位への送達に適した粘稠性形態で封入または注射
され得る。好ましくは、骨成長誘導因子組成物は、骨誘
導因子を骨損傷部位に送達し、成長する硬骨および軟骨
構造を提供し得、最適状態で体内に再吸収され得るマト
リックスを含む。それらのマトリックスは、他の内植医
学適応例で現在使用されている他の材料により形成され
得る。 【００１９】材料の選択は、例えば、生物学的適合性、
生物分解性、機構特性、表面的外観および界面特性に基
づいて行なわれる。同様に、骨誘導因子の適用は適当な
製剤を限定する。骨誘導因子に適用され得るマトリック
スは、生物分解性で化学的に定義されるもの、例えば硫
酸カルシウム、燐酸トリカルシウム、ヒドロキシアパタ
イト、ポリ乳酸、ポリ無水物(ただし、これらに限定さ
れる訳ではない)、生物分解性で生物学的に明確に定義
されるもの、例えば骨もしくは皮膚コラーゲン、他の純
粋な蛋白質または細胞外マトリックス成分、非生物分解
性で化学的に定義されるもの、例えば焼結ヒドロキシア
パタイト、生体ガラス、アルミン酸塩または他のセラミ
ック、または前述のタイプの材料を幾つか組合わせたも
の、例えばポリ酪酸およびヒドロキシアパタイトまたは
コラーゲンおよび燐酸トリカルシウムであり得る。生体
セラミックもまた組成物、例えばカルシウム−アルミン
酸塩−燐酸塩において改変され得、例えば孔サイズ、粒
子サイズ、粒子形状および生物分解性の改変が行なわれ
得る。 【００２０】投与量については、この成長因子の作用を
修飾する様々な要因、例えば形成が望まれる骨の重量、
骨損傷の部位、損傷骨の状態、患者の年令、性別および
治療食、感染の重症度、投与時間および他の臨床要因を
考慮して担当医が決定する。用量は、再構成およびＢＭ
Ｐの組成物において使用されるマトリックスのタイプに
より変動し得る。最終組成物への他の既知成長因子、例
えばＩＧＦ１(インスリン様成長因子１)の追加もまた用
量に影響を与え得る。一般的に、投与量は、所望の骨重
量１ｇ当たり、蛋白質約１０〜１０6ナノグラムの範囲
内とすべきである。経過は骨成長および／または修復の
定期的評価(例、エックス線)によりモニターされ得る。
また、これらの治療組成物は、骨誘導因子における種特
異性の欠如故に現在獣医学適用においても貴重である。
ひとに加えて特定の家畜およびサラブレッドのうまは、
この発明の骨誘導因子による処置において望ましい患者
である。以下、実施例により、うし蛋白質の回収および
特性検定、それらの使用によるひと蛋白質の回収、ひと
蛋白質の獲得および組換え技術による蛋白質の発現にお
けるこの発明の実施態様を説明する。 【００２１】 【実施例】 実施例１ うし骨誘導因子の単離 ウリスト等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・
ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、７０:３５
１１(１９７３)の方法に従い、破砕したうしの骨粉(２
０−１２０メッシュ、ヘリトレックス)を製造する(ただ
し、下記の通り幾つかの抽出工程は省く)。１０ｋｇの
粉末を、４℃で４８時間激しい撹はん下、０.６ＮのＨ
Ｃｌを連続交換しながら脱塩する。生成した懸濁液を４
℃で１６時間２モルのＣaＣl2および１０ミリモルのエ
チレンジアミン-四酢酸[ＥＤＴＡ]５０ｌにより抽出
し、次いで５０ｌの０.５モルＥＤＴＡ中で４時間抽出
する。残留物を蒸留水で３回洗浄した後、「クリニカル
・オーソペディックス・アンド・リレーデット・リサー
チ」、１７１:２１３(１９８２)の記載に従い、４モルの
グアニジン塩酸塩[ＧuＣl]、２０ミリモルのトリス(pＨ
７.４)、１ミリモルのＮ−エチルマレイミド、１ミリモ
ルのヨードアセトアミド、１ミリモルのフェニルメチル
スルホニル・フッ素２０ｌに再懸濁する。１６〜２０時
間後、上清を除去し、別の１０ｌのＧuＣl緩衝液と置き
換える。残留物をさらに２４時間抽出する。 【００２２】粗ＧuＣl抽出物を合わせ、１００００分子
量遮断膜を備えたペリコン装置で約２０倍に濃縮し、次
いで５０ミリモルのトリス、０.１モルのＮaＣｌ、６モ
ルの尿素(pＨ７.２)、第一カラム用出発緩衝液に対して
透析する。充分透析後、蛋白質を４リットルＤＥＡＥセ
ルロースカラムに仕込み、未結合フラクションを集め
る。未結合フラクションを濃縮し、６モル尿素中５０ミ
リモルのＮaＡc、５０ミリモルのＮaＣl(pＨ４.６)に対
して透析する。未結合フラクションをカルボキシメチル
セルロースカラムに適用する。カラムに結合していない
蛋白質を出発緩衝液で充分洗浄することにより除去し、
骨誘導因子含有材料を５０ミリモルのＮaＡc、０.２５
ミリモルのＮaＣl、６モルの尿素(pＨ４.６)によりカラ
ムから脱着させる。この段階溶離から得られた蛋白質を
２０〜４０倍に濃縮し、次いで８０ミリモルＫＰＯ4、
６モル尿素(pＨ６.０)により５倍に希釈する。溶液のp
Ｈを５００ミリモルのＫ2ＨＰＯ4により６.０に調節す
る。８０ミリモルＫＰＯ4、６モル尿素(pＨ６.０)中で
平衡状態にしたヒドロキシルアパタイトカラム(ＬＫＢ)
に試料を適用し、同緩衝液でカラムを洗浄することによ
り、未結合蛋白質を全て除去する。骨誘導因子活性蛋白
質を１００ミリモルＫＰＯ4(pＨ７.４)および６モル尿
素により溶離させる。 【００２３】この蛋白質を約１０倍に濃縮し、固体Ｎa
Ｃlを加えて最終濃度０.１５モルとする。この材料を、
５０ミリモルＫＰＯ4、１５０ミリモルＮaＣl、６モル
尿素(pＨ７.４)中で平衡状態にしたヘパリン−セファロ
ースカラムに適用する。出発緩衝液でカラムを充分洗浄
後、骨誘導因子活性蛋白質を５０ミリモルＫＰＯ4、７
００ミリモルりＮaＣl、６モル尿素(pＨ７.４)により溶
離させる。このフラクションを最小体積に濃縮し、４モ
ルＧuＣl、２０ミリモルのトリス(pＨ７.２)により平衡
状態にしたスーパローズ６およびスーパローズ１２カラ
ム(一列に連結)に０.４ｍｌアリコートを適用し、カラ
ムを流速０.２５ｍｌ／分で展開する。骨誘導因子活性
を示す蛋白質は、約３００００ダルトンの蛋白質に対応
する相対移動を呈する。 【００２４】上記フラクションをプールし、５０ミリモ
ルＮaＡc、６モル尿素(pＨ４.６)に対して透析し、ファ
ルマシア・モノＳ ＨＲカラムに適用する。カラムを１.
０モルＮaＣl、５０ミリモルＮaＡc、６モル尿素(pＨ
４.６)への勾配により展開する。活性フラクションをプ
ールし、１０％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)によりpＨ３.
０とする。この材料を０.１％ＴＦＡ中０.４６×２５ｃ
ｍバイダックＣ４カラムに適用し、カラムを９０％アセ
トニトリル、０.１％ＴＦＡへの勾配により展開する(６
０分間で３１.５％アセトニトリル、０.１％ＴＦＡから
４９.５％アセトニトリル、０.１％ＴＦＡ、ただし１分
間１ｍｌの速度)。活性材料を約４０−４４％アセトニ
トリルで溶離する。マッコナヘイ等、「インターナショ
ナル・アーカイブス・オブ・アラージー」、２９:１８５
−１８９(１９６６)、ボルトン等、「バイオケミカル・
ジャーナル」、１３３:５２９(１９７３)およびボーウェ
ン-ポープ、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー」、２３７:５１６１(１９８２)の中の一法によ
り、適当なフラクションのアリコートをヨウ素化する。
これらのフラクション中に存在するヨウ素化蛋白質をＳ
ＤＳゲル電気泳動および尿素トリトンＸ１００等電点電
気泳動により分析する。この段階で、骨誘導因子を評価
すると、約１０−５０％純度である。 【００２５】実施例２ うし骨誘導因子の特性検定 Ａ．分子量 実施例１により得られた約２０μｇの蛋白質を凍結乾燥
し、１×ＳＤＳ試料緩衝液に再溶解する。３７℃で１５
分加熱後、試料を１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
に適用し、次いで冷却しながら電気泳動させる。予め染
色した分子量標準(ベゼスダ・リサーチ・ラブズ)と比べ
て分子量を測定する。完了直後、骨誘導因子含有ゲルレ
ーンを０.３ｃｍ片に切断する。各片をすり潰し、１.４
ｍｌの０.１％ＳＤＳを加える。試料を室温で一夜穏や
かに振り混ぜて蛋白質を溶離させる。各ゲル片を脱塩す
ることにより、生物学的検定における干渉を防ぐ。各試
料から得た上清を１０％ＴＦＡによりpＨ３.０に酸性化
し、０.４５ミクロン膜によりろ過し、０.４６ｃｍ×５
ｃｍＣ４バイダックカラムに入れ、０.１％ＴＦＡから
０.１％ＴＦＡ、９０％ＣＨ3ＣＮへの勾配により展開す
る。適当な骨誘導因子含有フラクションをプールし、２
０ｍｇのラット・マトリックスにより再構成する。この
ゲル・システムにおいて、骨誘導因子フラクションの大
部分は、約２８０００−３００００ダルトンの分子量を
有する蛋白質移動度を有する。 【００２６】Ｂ．等電点電気泳動 骨誘導因子活性の等電点を変性等電点電気泳動システム
において測定する。トリトンＸ１００尿素ゲルシステム
(ホーファー・サイエンティフィック)を次の要領で修正
する。１)使用される両性電解質の４０％はサーバライ
ト３／１０あり、６０％はサーバライト７−９である。
２)使用されるカソライト(catholyte)は４０ミリモルＮ
aＯＨである。実施例１で得られた約２０μｇの蛋白質
を凍結乾燥し、試料緩衝液に溶解し、等電点電気泳動ゲ
ルに適用する。ゲルを２０ワット、１０℃で約３時間移
動させる。完了時、骨誘導因子含有レーンを０.５ｃｍ
片に切断する。各片を１.０ｍｌの６モル尿素、５ミリ
モルのトリス(pＨ７.８)中ですり潰し、試料を室温で振
り混ぜる。試料を上記と同様に酸性化し、ろ過し、脱塩
し、検定する。実施例３記載の検定で測定された活性の
大部分は、８.８−９.２のpＩと一致する形で移動す
る。 【００２７】Ｃ．サブユニットの特性 骨誘導因子のサブユニット組成についても測定する。純
粋な骨誘導因子を上記と同様にプレパラティブ１５％Ｓ
ＤＳゲルから分離する。次いで試料の一部を試料緩衝液
中５ミリモルＤＴＴにより還元し、１５％ＳＤＳゲルに
おいて再電気泳動させる。約３０キロダルトン蛋白質
は、約２０キロダルトンおよび１８キロダルトンの箇所
で２本の大きなバンド並びに３０キロダルトンの箇所で
小さなバンドを生ずる。２本のバンドの広さは、恐らく
はグリコシル化、他の翻訳後修飾、蛋白質加水分解によ
る減成またはカルバミル化に起因すると思われる不均質
性を示す。 【００２８】実施例３ 骨誘導因子の生物学的活性 サンパスおよびレディ、「プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・
オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリ
カ」、８０:６５９１−６５９５(１９８３)の一般的方法
によるラット骨形成検定を用いることにより、実施例１
で得られたこの発明のうし骨誘導因子の骨生成活性を評
価する。またこの検定を用いて他の種類の骨誘導因子を
評価することも可能である。エタノール沈澱工程の代わ
りに検定フラクションの水に対する透析を行う。次い
で、溶液または懸濁液を揮発性溶媒、例えば０.１−０.
２％ＴＦＡに再溶解し、生成した溶液を２０ｍｇのラッ
ト・マトリックスに加える。この材料を冷凍し、凍結乾
燥し、生成した粉末を＃５ゼラチンカプセルに封入す
る。２１−４９日令の雄ロング・エバンス・ラットの腹
部胸領域にカプセルを皮下内植する。７−１４日後イン
プラントを除去する。各インプラントの半分を用いてア
ルカリ性ホスファターゼ分析[レディ等、「プロシーディ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オ
ブ・アメリカ」、６９:１６０１(１９７２)参照]を行
い、半分を固定し、組織分析を行う。常用手順で、１μ
ｍグリコメタクリレート部分をボン・コッサおよび酸性
フーシン(fuschin)で染色することにより、新規骨無機
質を検出する。アルカリ性ホスファターゼ、マトリック
ス形成プロセスにおいて軟骨芽細胞および骨芽細胞によ
り生産される酵素もまた測定される。新しい軟骨および
硬骨形成はしばしばアルカリ性ホスファターゼレベルと
相関する。下記第１表は、骨誘導因子により処理されな
かった対照を含むラット・マトリックス試料の用量応答
を示す。 【００２９】 【表１】 第１表内植蛋白質＊(μｇ) 軟骨 アルカリ性ホスファターゼ(μ/ｌ) ７.５ ２ 実施せず ２.５ ３ ４４５.７ ０.８３ ３ ７７.４ ０.２８ ０ ３２.５ ０.００ ０ ３１.０ ＊この段階で骨誘導因子は約１０−１５％の純度である。 【００３０】形成された硬骨または軟骨は、マトリック
スによりふさがれた空間に物理的に閉じ込められる。ま
た、前記と同様にＳＤＳゲル電気泳動および等電点電気
泳動により試料を分析し、次いでオートラジオグラフィ
ーを行う。分析は、pＩ９.０および２８−３０キロダル
トンでの蛋白質バンドと活性の相関関係を示す。１ＯＤ
／ｍｇ−ｃｍの消衰係数を蛋白質に関する推定値として
使用し、特定フラクション中の骨誘導因子の純度を近づ
ける。前記希釈物におけるインビボ ラット骨形成検定
において、蛋白質は、１０〜２００nｇ蛋白質／(骨)ｇ
〜恐らくは１μｇ蛋白質／(骨)ｇより大の比率でインビ
ボ活性を呈する。 【００３１】実施例４ うし骨誘導因子蛋白質組成物 ２８−３０キロダルトンの分子量を有する実施例２Ａの
蛋白質組成物を実施例２Ｃの記載に従い還元し、トリプ
シンで消化する。下記のアミノ酸配列を有する８種のト
リプシンフラグメントを標準的方法により単離する。 フラグメント１:ＡＡＦＬＧＤＩＡＬＤＥＥＤＬＧ フラグメント２:ＡＦＱＶＱＱＡＡＤＬ フラグメント３:ＮＹＱＤＭＶＶＥＧ フラグメント４:ＳＴＰＡＱＤＶＳＲ フラグメント５:ＮＱＥＡＬＲ フラグメント６:ＬＳＥＰＤＰＳＨＴＬＥＥ フラグメント７:ＦＤＡＹＹ フラグメント８:ＬＫＰＳＮ？ＡＴＩＱＳＩＶＥ 【００３２】実施例１記載の方法と類似した精製手順に
従い、うしの骨由来の蛋白質の低級精製製品を製造す
る。この精製手順は、ＤＥ−５２カラム、ＣＭセルロー
スカラムおよびモノＳカラムの省略並びにヒドロキシル
アパタイトおよびヘパリン・セファロースカラムの順で
の置き換えにより前記手順からは基本的に変化する。簡
単に述べると、濃縮粗４モル抽出物をエタノール(４度)
に加えて８５％最終濃度とする。次いで混合物を遠心分
離し、沈澱を５０ミリモルのトリス、０.１５モルＮaＣ
l、６.０モル尿素に再溶解する。次に、この材料を前記
と同様にヘパリン・セファロースにおいて分画化する。
ヘパリン結合材料を前記と同様にヒドロキシアパタイト
において分画化する。活性フラクションをプールし、濃
縮し、高度分離ゲルろ過において分画化する(６モルの
グアニジニウムクロリド、５０ミリモルのトリス(pＨ
７.２)中ＴＳＫ３００００)。活性フラクションをプー
ルし、０.１％ＴＦＡに対して透析し、次いで前記と同
様にＣ４バイダック逆相カラムにおいて分画化する。調
製物を還元し、アクリルアミドゲルで電気泳動する。１
８Ｋバンドに対応する蛋白質を溶離させ、トリプシンで
消化する。下記のアミノ酸配列を有するトリプシンフラ
グメントが分離される。 フラグメント９:ＳＬＫＰＳＮＨＡＴＩＱＳ？Ｖ フラグメント１０:ＳＦＤＡＹＹＣＳ？Ａ フラグメント１１:ＶＹＰＮＭＴＶＥＳＣＡ フラグメント１２:ＶＤＦＡＤＩ？Ｗ ただし、トリプシン・フラグメント７および８は、実質
的にそれぞれフラグメント１０および９であるものとす
る。 【００３３】Ａ．bＢＭＰ−１ レイズ、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー」、１８３(１):１−１２(１９８５)の方法に従い、
オリゴヌクレオチドのプール(または特有のオリゴヌク
レオチド)を成分とするプローブを設計し、自動ＤＮＡ
シンセサイザーで合成する。一プローブは、下記ヌクレ
オチド配列 TCCTCATCCAGGGCAATGTCGCCCAGGAAGGC を有する比較的長い(３２ヌクレオチド)「ゲスマー」[ツ
ール等、「ネイチャー」、３１２:３４２−３４７(１９８
４)]を成分としている。 遺伝子コードは同義性であるため(複数のコドンが同じ
アミノ酸をコードし得る)、プローブプールにおけるオ
リゴヌクレオチドの数は、真核生物におけるコドン使用
頻度、Ｇ:Ｔ塩基対の相対安定性および真核生物コード
配列におけるジヌクレオチドＣpＧの相対的希少性に基
づいて減らされる[ツール等(前出)参照]。第２セットの
プローブは、アミノ酸をコードし得る可能な配列を全て
含む短いオリゴヌクレオチド(長さ１７ヌクレオチド)に
より構成される。第２セットのプローブは下記配列を有
する。 (a)A [A/G] [A/G] TC [T/C] TC [T/C] TC [A/G] TC [T/
C] AA (b)A [A/G] [A/G] TC [T/C] TC [T/C] TC [A/G] TCNAG 括弧内のヌクレオチドは代替配列である。「Ｎ」はＡ、
Ｔ、ＣまたはＧを意味する。 【００３４】両場合において、プローブ設計に使用され
るアミノ酸配列の領域は、可能ならば高度変性コドンを
避けることにより選択される。オリゴヌクレオチドを自
動ＤＮＡシンセサイザーで合成する。次いで、ポリヌク
レオチドキナーゼおよび32Ｐ−ＡＴＰを用いてプローブ
に放射性標識を行う。これら２セットのプローブを用い
てうしゲノム組換え体ライブラリーをスクリーニングす
る。ライブラリーは次の要領で構築される。うし肝臓Ｄ
ＮＡを制限エンドヌクレアーゼ酵素Ｓau ３Ａにより部
分消化し、ショ糖勾配により沈降させる。次に、１５−
３０キロ塩基の範囲でのサイズ分画ＤＮＡをバクテリオ
ファージＢamＨＩベクターＥＭＢＬ３に結合する[フリ
シャウフ等、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー」、１７０:８２７−８４２(１９８３)]。ライ
ブラリーを１プレート当たり組換え体８０００個の割合
で培養する。プラークの重複ニトロセルロースレプリカ
を作成し、ウー等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナ
イテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、７５:３６８８−
９１(１９７８)の手順の修正法に従い増幅する。 【００３５】３２merプローブを32Ｐ−ガンマ−ＡＴＰ
によりキナーゼ化し、４５℃で５×ＳＳＣ、０.１％Ｓ
ＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌのサーモン精
液ＤＮＡ中１セットのフィルターとハイブリダイゼーシ
ョンし、４５℃で５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳにより洗
浄する。１７merプローブをキナーゼ化し、５０℃で３
モルのテトラメチルアンモニウムクロリド(ＴＭＡＣ)、
０.１モルの燐酸ナトリウム(pＨ６.５)、１ミリモルＥ
ＤＴＡ、５×デンハルツ、０.６％ＳＤＳ、１００μｇ
／ｍｌサーモン精液ＤＮＡ中他のセットのフィルターと
ハイブリダイゼーションし、５０℃で３モルＴＭＡＣ、
５０ミリモルのトリス(pＨ８.０)により洗浄する。これ
らの条件により、１７merプローブプールに対する不適
当な組合わせの検出は最小限となる[ウッド等、「プロシ
ーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステー
ツ・オブ・アメリカ」、８２:１５８５−１５８８(１９
８５)参照]。この方法により４０００００個の組換え体
をスクリーニングし、一デュプリケイト陽性をプラーク
精製する。ラムダbＰ−５０と称するこの組換え体バク
テリオファージのプレートリゼイトからＤＮＡを分離す
る。bＰ−５０は、１９８６年１２月１６日に受託番号
４０２９５としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション(アメリカ合衆国メリーランド、ロックビ
ル、パークローン・ドライブ１２３０１)(以後「ＡＴＣ
Ｃ」と称す)に寄託された。この寄託物およびこの明細書
に含まれる他の寄託物は、特許手続きを目的とする微生
物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約およびそ
の下での規則の必要条件を満たしている。このbＰ−５
０クローンは、bＢＭＰ−１と称するうし骨成長因子の
少なくとも一部をコードする。 【００３６】このbＢＭＰ−１クローンのオリゴヌクレ
オチド・ハイブリダイゼーション領域は、Ｍ１３中にサ
ブクローン化され、標準技術により配列された約８００
bpのＥcoＲＩフラグメントに対して局在している。ラム
ダbＰ−５０の部分的ＤＮＡ配列および誘導されたアミ
ノ酸配列を下記第２表に示す。牛骨２８〜３０kd材料か
ら分離されたトリプシンフラグメントに対応するアミノ
酸配列は、第２表の下線部である。この配列の最初の下
線部分は、オリゴヌクレオチドプローブが設計される上
記トリプシンフラグメント１に対応する。第二の下線部
分は、上記トリプシンフラグメント２に対応する。予測
されたアミノ酸配列は、トリプシンの特異性を考慮して
予想した通り、塩基性残基(Ｒ)がトリプシンフラグメン
ト２の前にあることを示す。第２表におけるヌクレオチ
ド位置＃２９２−２９３のカップレットＣＴに先行する
核酸配列は、コンセンサス受容配列(すなわち、ピリミ
ジン濃厚域、ＴＣＴＣＴＣＴＣＣ、次にＡＧ)の存在お
よび誘導されたアミノ酸配列の適当な位置における塩基
性残基の欠如に基づきイントロン(非コード配列)である
と思われる。このbＢＭＰ−１ゲノム配列は第２表にお
いて明白である。このゲノムクローンからの推定に基づ
くbＢＭＰ−１ペプチド配列は３７アミノ酸長であり、
第２表におけるヌクレオチド＃２９４〜＃４０４のＤＮ
Ａ配列によりコードされる。 【００３７】 【表２】【００３８】Ｂ．bＢＭＰ−２ フラグメント３のアミノ酸配列に基づき、オリゴヌクレ
オチドのプールを成分とする２種のプローブを設計し、
前記と同様に自動ＤＮＡシンセサイザーで合成する。 プローブ＃1:ＡＣＮＡＣＣＡＴ[Ａ/Ｇ]ＴＣ[Ｔ/Ｃ]ＴＧ
[Ａ/Ｇ]AＴプローブ＃２:ＣＡ[Ａ／Ｇ]ＧＡ[Ｔ／Ｃ]Ａ
ＴＧＧＴＮＧＴＮＧＡ これらのプローブを放射性標識し、これらを用いて、Ａ
項の記載に従い(ただし、ベクターはラムダＪ１ＢamＨ
１armsである)構築されたうしゲノムライブラリーをス
クリーニングする[ムリンズ等、「ネイチャー」、３０８:
８５６−８５８(１９８４)]。放射性標識１７−merプロ
ーブ＃１を、Ａ項記載の１７merプローブに関する方法
によるフィルターのセットとハイブリダイゼーションす
る。上記Ａ項記載の手順により４０００００個の組換え
体をスクリーニングする。一デュプリケイト陽性をプラ
ーク精製し、ＤＮＡを、ラムダbＰ−２１と称する組換
えバクテリオファージの培養リゼイトから分離する。バ
クテリオファージbＰ−２１は、１９８７年３月６日に
ＡＴＣＣ４０３１０の受託番号でＡＴＣＣに寄託され
た。bＰ−２１クローンは、bＢＭＰ−２と称するうし成
長因子をコードする。 【００３９】このbＢＭＰ−２クローンのオリゴヌクレ
オチド・ハイブリダイゼーション領域は、Ｍ１３中にサ
ブクローン化され、標準技術により配列決定された約
１.２キロ塩基のＳacＩ制限フラグメントに対して局在
する。このＳacＩフラグメントおよびbＰ−２１の隣接
ＨindIII−ＳacＩ制限フラグメントの部分的ＤＮＡ配列
および誘導されたアミノ酸配列を下記第３表に示す。こ
のクローンからのbＢＭＰ−２ペプチド配列は１２９ア
ミノ酸長であり、ヌクレオチド＃１〜ヌクレオチド＃３
８７のＤＮＡ配列によりコードされる。牛骨２８〜３０
kd材料から分離されたトリプシンフラグメントに対応す
るアミノ酸配列は、第３表の下線部である。この配列の
下線部分は、bＢＭＰ−２に関するオリゴヌクレオチド
プローブが設計される上記トリプシンフラグメント３に
対応する。予測されたアミノ酸配列は、トリプシンの特
異性を考慮して予想した通り、塩基性残基(Ｋ)がトリプ
シンフラグメント３の前にあることを示す。ＣＧＴトリ
プレットによりコードされるアルギニン残基は、それに
隣接する停止コドン(ＴＡＧ)の存在に基づき恐らく蛋白
質のカルボキシ末端であると思われる。 【００４０】 【表３】【００４１】Ｃ．bＢＭＰ−３ トリプシンフラグメント９(プローブ＃３)、１０(プロ
ーブ＃２)および１１(フ゜ロ-フ゛#1)のアミノ酸配列に基づい
て、オリゴヌクレオチドのプールを成分とするプローブ
を設計し、自動ＤＮＡシンセサイザーで合成する。 プローブ＃１:ＡＣＮＧＴＣＡＴ[Ａ／Ｇ]ＴＴＮＧＧ[Ａ
／Ｇ]ＴＡ プローブ＃２:ＣＡ[Ａ／Ｇ]ＴＡ[Ａ／Ｇ]ＴＡＮＧＣ[Ａ
／Ｇ]ＴＣ[Ａ／Ｇ]ＡＡ プローブ＃３:ＴＧ[Ａ／Ｇ／Ｔ]ＡＴＮＧＴＮＧＣ[Ａ／
Ｇ]ＴＧ[Ａ／Ｇ]ＴＴ 上記Ａ項で詳述したＴＭＡＣハイブリダイゼーション方
法により、ＥＭＢＬ３において構築された組換えうしゲ
ノムライブラリーをスクリーニングする。４０００００
個の組換え体を32Ｐで標識されたプローブ＃１により繰
り返しスクリーニングする。このプローブとハイブリダ
イゼーションした組換え体は全て二次培養として再培養
される。トリプリケイト・ニトロセルロース・レプリカ
は二次培養物から成り、前記と同様に増幅される。３セ
ットのフィルターを再びＴＭＡＣ条件下でプローブ＃
１、＃２および＃３とハイブリダイゼーションする。一
クローン、ラムダbＰ−８１９は３種のプローブ全てと
ハイブリダイゼーションする。これをプラーク精製し、
ＤＮＡをプレートリゼイトから分離する。バクテリオフ
ァージ ラムダbＰ−８１９は、１９８７年６月１６日に
ＡＴＣＣ４０３４４の受託番号下でＡＴＣＣに寄託され
た。このbＰ−８１９クローンは、bＢＭＰ−３と称する
うし骨成長因子をコードする。 【００４２】プローブ＃２とハイブリダイゼーションす
るbＰ−８１９の領域は局在して配列している。この領
域の部分的ＤＮＡおよび誘導されたアミノ酸配列を第４
Ａ表に示す。トリプシンフラグメント１０および１２に
対応するアミノ酸配列は下線部である。最初の下線部の
配列はフラグメント１２に対応し、第２の下線部の配列
はフラグメント１０に対応する。従って、プローブ＃２
とハイブリダイゼーションするbＰ−８１９のこの領域
は、少なくとも１１１個のアミノ酸をコードする。この
アミノ酸配列は、ヌクレオチド＃４１４〜＃７４６のＤ
ＮＡ配列によりコードされる。 【００４３】 【表４】 【００４４】プローブ＃１および＃３とハイブリダイゼ
ーションするbＰ−８１９の領域は局在して配列してい
る。この領域の部分的ＤＮＡおよび誘導されたアミノ酸
配列を第４Ｂ表に示す。トリプシンフラグメント９およ
び１１に対応するアミノ酸配列は下線部である。最初の
下線部の配列はフラグメント９に対応し、第２の下線部
の配列はフラグメント１１に対応する。プローブ＃１お
よび＃３とハイブリダイゼーションするbＰ−８１９の
この領域のペプチド配列は、第４Ｂ表のヌクレオチド＃
３０５〜＃４９３によりコードされる長さ６４個のアミ
ノ酸である。ＡＧＡトリプレットによりコードされるア
ルギニン残基は、それに隣接する停止コドン(ＴＡＡ)の
存在に基づき蛋白質のカルボキシ末端であると思われ
る。カップレットＴＣ(３０５−３０６位)に先行する核
酸配列は、コンセンサス受容配列(すなわち、ピリミジ
ン濃厚域、ＴＴＣＴＣＣＣＴＴＴＴＣＧＴＴＣＣＴ、次
にＡＧ)の存在および誘導されたアミノ酸配列の適当な
位置における塩基性残基以外の停止配列の存在に基づき
イントロン(非コード配列)であると思われる。 【００４５】従って、bＢＭＰ−３は、第４Ａ表および
第４Ｂ表のＤＮＡおよびアミノ酸配列を有することを特
徴とする。このクローンのペプチド配列は１７４アミノ
酸長であり、第４Ａ表のヌクレオチド＃４１４〜ヌクレ
オチド＃７４６および第４Ｂ表のヌクレオチド＃３０５
〜ヌクレオチド＃４９３のＤＮＡ配列によりコードされ
る。 【００４６】 【表５】【００４７】実施例５ ひと骨誘導因子 Ａ．hＢＭＰ−１ うしおよびひとの骨成長因子遺伝子は著しく相同性を示
すと思われるため、第２表のうしbＢＭＰ−１ ＤＮＡ配
列(またはその一部分)をプローブとして用いることによ
り、ひと遺伝子ライブラリーをスクリーニングする。う
しゲノムクローンの８００bp ＥcoＲＩフラグメントを
ニック翻訳により32Ｐで標識する。ひとゲノムライブラ
リー(ツール等、前出)を、１プレート当たり組換え体４
００００個の割合で２０プレートにおいて培養する。デ
ュプリケイト・ニトロセルロースフィルター・レプリカ
は、各プレートで構成されており、５０℃で約１４時間
５×ＳＳＣ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌ変性サ
ーモン精液ＤＮＡ、０.１％ＳＤＳ(標準ハイブリダイゼ
ーション溶液)中ニック翻訳プローブとハイブリダイゼ
ーションされる。次いで、フィルターを５０℃で１×Ｓ
ＳＣ、０.１％ＳＤＳにより洗浄し、オートラジオグラ
フィーに付す。５つのデュプリケイト陽性を分離し、プ
ラーク精製する。これらの組換えバクテリオファージの
うちの１種、ＬＰ−Ｈ１のプレート・リゼイトからＤＮ
Ａを得る。ＬＰ−Ｈ１は１９８７年３月６日にＡＴＣＣ
に寄託された(受託番号４０３１１)。このクローンは、
hＢＭＰ−１というひとゲノム骨成長因子の少なくとも
一部分をコードする。ＬＰ−Ｈ１のハイブリダイゼーシ
ョン領域は、２.５キロ塩基ＸbaＩ／ＨindIII制限フラ
グメントに対して局在している。 【００４８】ラムダＬＰ−Ｈ１の部分的ＤＮＡ配列およ
び誘導されたアミノ酸配列を下記第５表に示す。このク
ローンからのペプチド配列は３７アミノ酸長であり、ヌ
クレオチド＃３４４０〜ヌクレオチド＃３５５０のＤＮ
Ａ配列によりコードされる。第５表のコード配列の側面
には、約２８個のヌクレオチド(推定に基づく５'非コー
ド配列)および約１９個のヌクレオチド(推定に基づく
３'非コード配列)が存在する。第２表のbＢＭＰ−１配
列と第５表のhＢＭＰ−１ゲノム配列とを比較すると、
両配列間に顕著な相同性の存在することが示される。コ
ード領域のサイズおよび非コード領域の位置は、一般に
異なる種類の相同性遺伝子においても保持されているた
め、骨誘導因子遺伝子のコードおよび非コード領域の配
置は同定され得る。相同部位においてシグナルを生じる
ＲＮＡが側面に位置する、２種類の遺伝子間の相同性領
域は、コード領域を示す。 【００４９】 【表６】【００５０】第５表に示されたひとコード配列に特異的
なプローブを用いることにより、骨誘導因子を合成する
ひとセルラインまたは組織を同定する。このプローブは
次の方法に従い作成される。下記配列 (a)GGGAATTCTGCCTTTCTTGGGGACATTGCCCTGGACGAAGAGGACCT
GAG (b)CGGGATCCGTCTGAGATCCACAGCCTGCTGTACCTGGAAGGCCCTCA
GG を有する２種のオリゴヌクレオチドを自動シンセサイザ
ーで合成し、アニーリングし、エシェリヒア・コリＤＮ
ＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメントを用いて広
げ、制限酵素ＥcoＲＩおよびＢamＨＩにより消化し、Ｍ
１３ベクターに挿入する。次に、一本鎖32Ｐ標識プロー
ブは、標準技術によりこのサブクローンの鋳型調製物に
より作成される。ツール等の方法(前出)により、様々な
細胞および組織供給源由来のポリアデニル化ＲＮＡをホ
ルムアルデヒド-アガロースゲルにより電気泳動させ、
ニトロセルロースに移動させる。次いで、このプローブ
を、４２℃で一夜５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、
０.１％ＳＤＳ、４０ミリモルの燐酸ナトリウム(pＨ６.
５)、１００μｇ／ｍｌの変性サーモン精液ＤＮＡおよ
び５ミリモルのバナジルリボヌクレオシド中ニトロセル
ロース・ブロットとハイブリダイゼーションし、０.２
×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中６５℃で洗浄する。オート
ラジオグラフィーによると、ひと骨肉腫セルラインＵ−
２ ＯＳ由来のＲＮＡを含むレーンは、約４.３および
３.０キロ塩基のＲＮＡ種に対応するハイブリダイゼー
ション・バンドを含んでいる。 【００５１】cＤＮＡをＵ−２ ＯＳポリアデニル化ＲＮ
Ａから合成し、確立された技術により(ツール等、前出)
ラムダgt１０にクローン化する。このライブラリーから
の組換え体２００００個を５０プレートの各々において
培養する。デュプリケイト・ニトロセルロース・レプリ
カはこれらのプレートで構成される。前記オリゴヌクレ
オチドを32Ｐ−ガンマ−ＡＴＰによりキナーゼ化し、５
５℃で一夜標準ハイブリダイゼーション溶液中で２セッ
トのレプリカとハイブリダイゼーションする。次いで、
フィルターを５５℃で１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳによ
り洗浄し、オートラジオグラフィーに付す。ラムダＵ２
ＯＳ−１と称する一デュプリケイト陽性をプラーク精製
する。ラムダＵ２ＯＳ−１は１９８７年６月１６日にＡ
ＴＣＣに寄託された(受託番号４０３４３)。ラムダＵ２
ＯＳ−１の挿入体の全ヌクレオチド配列および誘導され
たアミノ酸配列を第６表に示す。このcＤＮＡクローン
は、分泌された蛋白質特有の疎水性リーダー配列が後に
続くメチオニンをコードし、ヌクレオチド位２２２６−
２２２８の停止コドンを含む。このクローンは、このア
ミノ酸配列に基づき分子量og８３キロダルトンを有する
７３０個のアミノ酸で構成される蛋白質をコードする、
２１９０bpのオープン・リーディング・フレームを含
む。このクローンは、第５表に示したコード領域と同じ
配列を含む。この蛋白質は、分泌後開裂してhＢＭＰ−
１蛋白質を生成する一次翻訳産物を示すと考えられる。
従って、このクローンは、ゲノムhＢＭＰ−１配列ラム
ダＬＰ−Ｈ１に含まれるひと遺伝子フラグメントに対応
するhＢＭＰ−１のcＤＮＡである。ただし、ＢＭＰ−１
のアミノ酸＃５５０〜＃５９０は、表皮成長因子並びに
プロテインＣ、第X因子および第IX因子の「成長因子」領
域と相同性である。 【００５２】 【表７】【表８】【表９】【表１０】【００５３】Ｂ．hＢＭＰ−２:クラスＩおよびII 実施例４Ｂ記載のＨindIII−ＳacＩうしゲノムbＢＭＰ
−２フラグメントをＭ１３ベクターにサブクローンす
る。32Ｐ−標識一本鎖ＤＮＡプローブは、このサブクロ
ーンの鋳型調製物から作成される。このプローブを用い
ることにより、Ａ項で前述された様々な細胞および組織
供給源由来のポリアデニル化ＲＮＡをスクリーニングす
る。約３.８キロ塩基のmＲＮＡ種に対応するハイブリダ
イゼーション・バンドは、ひとセルラインＵ−２ ＯＳ
由来のＲＮＡを含むレーンにおいて検出される。ＨindI
II−ＳacＩフラグメントをニック翻訳により32Ｐで標識
し、これを用いて、６５℃で一夜標準ハイブリダイゼー
ション緩衝液中でハイブリダイゼーションし、次いで６
５℃で１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳにより洗浄すること
により、前記Ｕ−２ ＯＳcＤＮＡライブラリーのニトロ
セルロース・フィルター・レプリカをスクリーニングす
る。１２個のデュプリケイト陽性クローンを取り上げ、
二次培養として再培養する。デュプリケイト・ニトロセ
ルロース・レプリカは二次培養物から成り、一次スクリ
ーニングを行なった場合と同様に両セット共うしゲノム
プローブとハイブリダイゼーションされる。次いで６５
°で一方のセットのフィルターを１×ＳＳＣ、０.１％
ＳＤＳで洗浄し、他方のセットを０.１×ＳＳＣ、０.１
％ＳＤＳで洗浄する。 【００５４】２クラスのhＢＭＰ−２ cＤＮＡクローン
は、高いストリンジェント洗浄条件下(０.１×ＳＳＣ、
０.１％ＳＤＳ)において、強い(４組換え体)または弱い
(７組換え体)ハイブリダイゼーション・シグナルに基づ
き明白である。１１組換えバクテリオファージ全部をプ
ラーク精製し、小規模ＤＮＡ調製物を各々の培養リゼイ
トから作成し、配列分析用に挿入体をpＳＰ６５および
Ｍ１３にサブクローン化する。hＢＭＰ−２・クラスＩ
と称する(ＢＭＰ−２としても知られている)強いハイブ
リダイゼーションクローンの配列分析は、それらが第３
表に示された配列と強い配列相同性を有することを示
す。従ってこれらのクローンは、bＢＭＰ−２遺伝子(こ
の部分配列は第３表に示されている)によりコードされ
る蛋白質のひと均等蛋白質をコードするcＤＮＡであ
る。hＢＭＰ−２・クラスIIと称する(ＢＭＰ−４として
も知られている)弱いハイブリダイゼーション組換え体
の配列分析は、それらもまた、それらのコード領域の
３'末端において第３表に示した配列と全く相同性であ
る(ただし、さらに大きい５'領域ではそれほどではな
い)ことを示す。すなわち、それらは、同一ではない
が、前記構造との類似構造を有するひと蛋白質をコード
する。 【００５５】完全長のhＢＭＰ−２・クラスＩcＤＮＡク
ローンも同様の方法で得られる。クラスIIサブクローン
の１つ(II−１０−１)の１.５キロ塩基挿入体を分離
し、ニック翻訳により放射性標識する。上記でスクリー
ニングされたＵ−２ ＯＳ cＤＮＡライブラリーのニト
ロセルロース・レプリカ(５０フィルター、１００００
００組換え体バクテリオファージに対応)の１セット
を、ストリンジェント条件下(標準ハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液中６５°でハイブリダイゼーション、６５°
で０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで洗浄)でこのプロー
ブとハイブリダイゼーションする。クラスIIプローブと
はハイブリダイゼーションしないうしゲノムプローブと
ハイブリダイゼーションする組換え体全部を選び取り、
プラーク精製する(１０組換え体)。プレートのストック
を作り、小規模バクテリオファージＤＮＡ調製物を作成
する。Ｍ１３へのサブクローニング後、配列分析は、こ
れらのうち４つが元のクラスＩクローンと部分的に一致
するクローンを表すことを示す。これらの中の１つ、ラ
ムダＵ２ＯＳ−３９は、約１.５キロ塩基の挿入体を含
んでおり、１９８７年６月１６日付けでＡＴＣＣに寄託
された(受託番号４０３４５)。部分的ＤＮＡ配列(ラム
ダＵ２ＯＳ−３９および幾つかの他のhＢＭＰ−２クラ
スＩcＤＮＡ組換え体から編集された)および誘導された
アミノ酸配列を下記第７表に示す。ラムダＵ２ＯＳ−３
９は、その部分配列が第３表に示されているうし遺伝子
セグメントによりコードされる蛋白質ＢＭＰ−２のひと
対応部全体をコードするのに必要なヌクレオチド配列を
全て含むものと予想される。このひとcＤＮＡ hＢＭＰ
−２クラスＩは、３９６個のアミノ酸から成る蛋白質を
コードする、１１８８bpのオープン・リーディング・フ
レームを含む。３９６個のアミノ酸から成るこの蛋白質
は、このアミノ酸配列に基づき４５キロダルトンの分子
量を有する。この配列は、一次翻訳産物を表すものと考
えられる。全フレームにおいて停止コドンを有する３４
２bpの５'未翻訳領域がこの蛋白質に先行する。この５'
未翻訳領域に先行する１３bp領域は、cＤＮＡクローニ
ング方法で使用されるリンカーを表す。 【００５６】 【表１１】 【表１２】【表１３】 【００５７】完全な長さのhＢＭＰ−２・クラスIIひとc
ＤＮＡクローンは、次の要領で得られる。クラスII組換
えII−１０−１の５'端部からの２００bp ＥcoＲＩ−Ｓ
acＩフラグメントをそのプラスミド・サブクローンから
分離し、ニック翻訳により標識し、Ｕ−２ ＯＳ cＤ
ＮＡライブラリー(２５フィルター／セット、５０００
００個の組換え体を示す)の１セットのデュプリケイト
・ニトロセルロース・レプリカとハイブリダイゼーショ
ンする。前記ストリンジェント条件下でハイブリダイゼ
ーションおよび洗浄を行う。１６デュプリケイト陽性を
選び取り、二次培養として再培養する。二次培養のニト
ロセルロース・フィルター・レプリカを作成し、II−１
０−１の配列と対応すべく合成された、下記配列 CGGGCGCTCAGGATACTCAAGACCAGTGCTG を有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション
する。５０℃で標準ハイブリダイゼーション緩衝液中で
ハイブリダイゼーションし、１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤ
Ｓにより５０°で洗浄する。このオリゴヌクレオチドと
ハイブリダイゼーションする１４組換えバクテリオファ
ージをプラーク精製する。プラーク・ストックを作り、
小規模バクテリオファージＤＮＡ調製物を作成する。こ
れらの中の３つをＭ１３にサブクローニング後、配列分
析は、それらが元のクラスIIクラスと部分的に一致する
クローンを表すことを示す。これらの中の１つ、ラムダ
Ｕ２ＯＳ−３は１９８７年６月１６日付けでＡＴＣＣに
寄託された(受託番号４０３４２)。Ｕ２ＯＳ−３は約
１.８キロ塩基の挿入体を含む。Ｕ２ＯＳ−３の部分的
ＤＮＡ配列および誘導されたアミノ酸配列を下記第８表
に示す。このクローンは、全ひとＢＭＰ−２・クラスII
蛋白質をコードするのに必要なヌクレオチド配列の全て
を含むものと予想される。このcＤＮＡは、全フレーム
において停止コドンを有する３９４bpの５'未翻訳領域
が先行し、４０８個のアミノ酸から成る蛋白質をコード
する、１２２４bpのオープン・リーディング・フレーム
を含み、イン-フレーム停止コドンの後に３０８bpの３'
未翻訳領域を含む。５'未翻訳領域に先行する８bp領域
は、cＤＮＡクローニング方法で使用されるリンカーを
表す。４０８個のアミノ酸から成る蛋白質は４７キロダ
ルトンの分子量を有し、一次翻訳産物を表すものと考え
られる。 【００５８】 【表１４】【表１５】【表１６】【００５９】第３、４、７および８表に示されたＢＭＰ
−２・クラスＩおよびII並びにＢＭＰ−３の配列は、イ
ンヒビンのベータ(Ｂ)(InhβB)およびベータ(Ａ)(Inhβ
A)サブユニットと顕著な相同性を有する。インヒビン
は、避妊における使用に関して現在研究されているホル
モンの一種である。メゾン等、「ネイチャー」、３１８:
６５９−６６３(１９８５)参照。さらに範囲を狭める
と、それらはまた、ムレリアン阻害物質(ＭＩＳ)、雄性
胚の成長中におけるムレリアン導管の退行を誘発する精
巣性糖蛋白質、および細胞の成長を阻害または刺激し
得、またはそれらを分化させ得る形質転換成長因子−ベ
ータ(ＴＧＦβ)とも相同性を呈する。さらに、hＢＭＰ
−２・クラスＩ、クラスIIをコードする第７表および第
８表の配列は、ドロソフィラ・デカペンタプレジック
(ＤＰＰ−Ｃ)遺伝子座転写体と顕著な相同性を有する。
マッサーグ、「セル」、４９:４３７−４３８(１９８
７)、パジェット等、「ネイチャー」、３２５:８１−８４
(１９８７)、ケート等、「セル」、４５:６８５−６９８
(１９８６)参照。従って、ＢＭＰ−２が、この発生的突
然変異遺伝子座からのこの転写体から作られた蛋白質の
ひと相同体であり得ることが考えられる。以下、これら
の相同性を第９表により示す。 【００６０】 【表１７】【００６１】Ｃ．ＢＭＰ−３ うしおよびひとの骨成長因子遺伝子が顕著な相同性を有
すると思われるため、第４Ａ表および第４Ｂ表のうしＤ
ＮＡ配列とハイブリダイゼーションすることが示された
オリゴヌクレオチド・プローブを用いてひとゲノム・ラ
イブラリーをスクリーニングする。これらのプローブを
用いてひとゲノムライブラリー(ツール等、前出)をスク
リーニングし、仮定的陽性を分離すると、前記と同様に
ＤＮＡ配列が得られる。この組換え体がひと骨誘導因子
分子の一部をコードするという証拠は、うし／ひと蛋白
質および遺伝子構造相同性に存する。一旦ひとＢＭＰ−
３分子の一部をコードするＤＮＡを含む組換えバクテリ
オファージが得られると、実施例５(Ａ)の記載と同様に
ひとコード配列をプローブとして用いることにより、Ｂ
ＭＰ−３を合成するひとセルラインまたは組織を同定す
る。mＲＮＡをオリゴ(dＴ)セルロース・クロマトグラフ
ィーにより選択し、cＤＮＡを確立された技術により(ツ
ール等、前出)合成し、ラムダgt１０においてクローン
化する。 【００６２】別法として、このひと骨誘導因子をコード
する全遺伝子は、必要ならば追加の組換えクローンにお
いて同定および生成され得る。このひと骨誘導因子遺伝
子のさらに別の３'または５'領域を含む追加の組換え体
は、元のクローンの端部(複数も可)における独特のＤＮ
Ａ配列を同定し、これらをプローブに用いてひとゲノム
ライブラリーを再スクリーニングすることにより生産さ
れ得る。次いで、この遺伝子は、標準的分子生物学技術
により単一プラスミドにおいて再会合され、細菌におい
て増幅され得る。次に、全ひとＢＭＰ−３因子遺伝子は
適当な発現ベクターに移入され得る。次いで、この遺伝
子を含む発現ベクターによりほ乳類細胞、例えばさるＣ
ＯＳ細胞をトランスフェクションし、その細胞において
ひと遺伝子が転写され、ＲＮＡは正確にスプライシング
される。トランスフェクションされた細胞の培地を、遺
伝子が完全であることの指標としてこの明細書に記載さ
れた骨誘導因子活性に関して検定する。これらの細胞か
らmＲＮＡを得、このmＲＮＡ供給源からcＤＮＡを合成
し、クローン化する。同様に上記方法を用い、プローブ
供給源としてうし骨誘導因子および／またはひと骨誘導
因子を利用することにより、興味の対象である他の種類
の骨誘導因子を分離することが可能である。これらの他
の種類の骨誘導因子は、特に骨折修復において似た有用
性を有し得る。 【００６３】実施例６ 骨誘導因子の発現 うし、ひとまたは他のほ乳類の骨誘導因子を製造するた
めに、常用的遺伝子工学技術により、それをコードする
ＤＮＡを適当な発現ベクターに移入し、ほ乳類細胞に導
入する。当業界の熟練者であれば、第２〜８表の配列ま
たは他の修飾配列並びに既知ベクター、例えばpＣＤ[岡
山等、「モル．セル・バイオル.」、２:１６１−１７０
(１９８２)]およびpＪＬ３、pＪＬ４[ゴフ等、「ＥＭＢ
Ｏ・ジャーナル」、４:６４５−６５３(１９８５)]を用
いることによるほ乳類発現ベクターの構築は可能であ
る。これらのベクターを用いた適当な宿主細胞の形質転
換により、骨誘導因子が発現され得る。当業界の熟練者
であれば、コード配列の側面に位置するほ乳類調節配列
を削除またはこれを細菌性配列と置き換えることにより
第２〜８表の配列を操作し、細菌細胞による細胞内また
は細胞外発現用細菌性ベクターを構築することが可能で
ある。例えば、コード配列はさらに操作(例、他の既知
リンカーと結合または他の公知技術によるそこからの非
コード配列の欠失もしくは存在するヌクレオチドの改編
による修飾)され得る。次いで、修飾骨誘導因子コード
配列は、例えば谷口等、「プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・
オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリ
カ」、７７:５２３０−５２３３(１９８０)に記載された
方法を用いて既知細菌性ベクターに挿入され得る。次い
で、この実例的細菌性ベクターにより細菌宿主細胞を形
質転換し、骨誘導因子を発現させ得る。細菌細胞におけ
る骨誘導因子の細胞外発現の実施戦略については、例え
ばヨーロッパ特許出願ＥＰＡ１７７３４３を参照。 【００６４】昆虫細胞で発現させる昆虫性ベクターの構
築についても同様の操作が実施され得る[例えば、公開
されたヨーロッパ特許出願１５５４７６記載の方法を参
照]。酵母ベクターもまた、酵母細胞によるこの発明の
因子の細胞内または細胞外発現を目的とする酵母調節配
列を用いて構築され得る。[例えば、公開ＰＣＴ出願Ｗ
Ｏ８６／００６３９およびヨーロッパ特許出願ＥＰＡ１
２３２８９参照]。ほ乳類細胞から高レベルの本発明骨
誘導因子を製造する方法は、異種骨誘導因子遺伝子の多
数のコピーを含む細胞の構築を含む。異種遺伝子は、増
幅可能なマーカー、例えばジヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨ
ＦＲ)遺伝子(この場合、カウフマンおよびシャープ、
「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」、１
５９:６０１−６２９(１９８２)の方法に従い、多量の
遺伝子コピーを含む細胞が、メトトレキセート(ＭＴＸ)
の高濃縮液における伸長に関して選択され得る)に結合
され得る。この方法は幾つかの異なる細胞タイプにより
使用され得る。例えば、この発明の骨誘導因子に関する
ＤＮＡ配列を含むプラスミドは、その発現を可能にする
他のプラスミド配列およびＤＨＦＲ発現プラスミドpＡd
Ａ２６ＳＶ(Ａ)３[カウフマンおよびシャープ、「モレキ
ュラー・アンド・セルラー・バイオロジー」、２:１３０
４(１９８２)]と効果的に組合わされて、燐酸カルシウ
ム共沈澱およびトランスフェクションによりＤＨＦＲ−
欠失ＣＨＯ細胞、ＤＵＫＸ−ＢＩＩ中に共に導入され得
る。ＤＨＦＲ発現形質転換体を、透析うし胎児血清を含
むアルファ培地での成長に関して選択し、続いてＭＴＸ
高濃縮液(０.０２、０.２、１.０および５マイクロモル
のＭＴＸにおける連続段階)での成長による増幅に関し
て選択する[カウフマン等、「モレキュラー・アンド・セ
ラー・バイオロジー」、５:１７５０(１９８３)の記載に
よる]。形質転換体をクローン化し、ラット骨形成検定
により生物学的活性骨誘導因子発現をモニターする。骨
誘導因子発現はＭＴＸ耐性のレベルが高くなると、増加
すべきである。同様の方法は、他の骨誘導因子の製造に
も使用され得る。 【００６５】別法として、ひと遺伝子は前記に従い直接
的に発現される。活性骨誘導因子は細菌または酵母細胞
において製造され得る。しかしながら、生物学的活性組
換えひと骨誘導因子に対して現在好ましい発現系は、安
定して形質転換されたＣＨＯ細胞である。一実施態様と
して、実施例５のひと骨誘導因子(hＢＭＰ−１)を製造
するためには、ＳalＩ消化によりＵ２ＯＳ−１の挿入体
をベクターarmsから放出させ、ＸhoＩにより消化された
ほ乳類発現ベクターpＭＴ２ＣＸにサブクローン化す
る。ＤＥＡＥ−デキストラン方法を用いて[ソンパイラ
ックおよびダンナ、「ＰＮＡＳ」、７８:７５７５−７５
７８(１９８１)、ルトマンおよびマグヌッソン、「ニュ
クレイック・アシッズ・リサーチ」、１１:１２９５−１
３０８(１９８３)]、このサブクローンからのプラスミ
ドＤＮＡによりＣＯＳ細胞をトランスフェクションす
る。血清不含有２４時間条件培地を細胞から集める(ト
ランスフェクションの４０−７０時間後開始)。ほ乳類
発現ベクターpＭＴ２ Ｃla−Ｘho(pＭＴ２ＣＸ)は、p９
１０２３(b)(ウォング等、「サイエンス」、２２８:８１
０−８１４、１９８５年)の誘導体であり、後者がテト
ラサイクリン耐性遺伝子ではなくアンピシリン耐性遺伝
子を含み、さらにcＤＮＡクローンの挿入に関するＸho
Ｉ部位を含む点で相異する。pＭＴ２Ｃla−Ｘhoの機能
的要素については既に記載されており(カウフマン、１
９８５年、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナ
イテッド・ステーツ・オブ・アメリカ、８２:６８９−
６９３)、アデノウイルスＶＡ遺伝子、７２bpエンハン
サーを含むＳＶ４０複製開始点、５'スプライス部位を
含むアデノウイルス主後期プロモーターおよびアデノウ
イルス三部分リーダー配列の大部分(アデノウイルス後
期mＲＮＡに存在)、３'スプライス受容部位、ＤＨＦＲ
挿入体、ＳＶ４０早期ポリアデニレーション部位(ＳＶ
４０)並びにエシェリヒア・コリにおける伸長に必要と
されるpＢＲ３２２配列が含まれる。 【００６６】プラスミドpＭＴ２ Ｃla−Ｘhoは、pＭＴ
２−ＶＷＦのＥcoＲＩ消化により得られる[アメリカ合
衆国、メリーランド、ロックビルのアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション(ＡＴＣＣ)に寄託された
(受託番号ＡＴＣＣ６７１２２)]。ＥcoＲＩ消化によりp
ＭＴ２−ＶＷＦに存在するcＤＮＡ挿入体が切除され、
線状形態のpＭＴ２が生成する。これを結合して用いる
ことにより、エシェリヒア・コリＨＢ１０１またはＤＨ
−５をアンピシリン耐性に形質転換することができる。
プラスミドpＭＴ２ ＤＮＡは常法により製造され得る。
次に、pＭＴ２をＥcoＲＶおよびＸbaＩで消化し、消化
されたＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラ
グメントで処理し、Ｃlaリンカー(ネバイオラブズ、Ｃ
ＡＴＣＧＡＴＧ)を結合することによりpＭＴ２ＣＸが構
築される。これは、ＳＶ４０複製開始点付近のＨindIII
部位から出発する塩基２２６６〜２４２１およびpＭＴ
２のエンハンサー配列を除く。次に、プラスミドＤＮＡ
をＥcoＲＩで消化し、前記と同様にブラント化し、Ｅco
ＲＩアダプターに結合し、 ５' ＰＯ4−ＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴ ３' ３' ＧＧＡＧＣＴＣＴＣＧＡ ５' ＸhoＩで消化し、結合することによりpＭＴ２ Ｃla−Ｘ
hoが得られ、次いでこれを用いてエシェリヒア・コリを
アンピシリン耐性に形質転換することができる。プラス
ミドpＭＴ２ Ｃla−Ｘho ＤＮＡは常法により製造され
得る。得られた骨誘導因子は、通常の蛋白質分離・精製
法によって分離及び精製される。これらの方法に特に限
定はなく、ゲル濾過法、アフィニティークロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマト
グラフィー、ＨＰＬＣ等を組み合わせて用いることがで
きる。分離・精製は、ラット骨形成検定による生物学的
活性および／または抽出ウシ骨誘導因子の特性検定結果
等を指標として効率的に用い得る。 【００６７】実施例７ 発現した骨誘導因子の生物学的活性 Ａ．ＢＭＰ−１ 上記実施例６で得られた発現した骨誘導因子(hＢＭＰ−
１)の生物学的活性を測定する。因子をヘパリン・セフ
ァロースカラムにおいて部分的に精製する。１枚の１０
０ｍｍ皿から得たトランスフェクション上清４ｍｌを、
ＹＭ１０膜を用いた限外ろ過により約１０倍に濃縮し、
次いで２０ミリモルのトリス、０.１５モルＮaＣｌ(pＨ
７.４)(出発緩衝液)に対して透析する。次に、この材料
を出発緩衝液中１.１ｍｌヘパリン・セファロースカラ
ムに適用する。出発緩衝液の８ｍｌ洗浄液により未結合
蛋白質を除去し、２０ミリモルのトリス、２.０モルＮa
Ｃｌ(pＨ７.４)の３−４ｍｌ洗浄液によりＢＭＰ−１を
含む結合蛋白質を脱着させる。ヘパリンカラムにより結
合した蛋白質をセントリコン１０において約１０倍に濃
縮し、０.１％トリフルオロ酢酸を用いてジアフィルト
レーションすることにより塩を還元する。この溶液の適
量を２０ｍｇのラットマトリックスと混合し、次いで前
記実施例３の記載に従いインビボ骨および軟骨形成に関
して検定する。ＭＯＣＫ(モック)トランスフェクション
上清分画を対照として使用する。特定量のひとＢＭＰ−
１が加えられたラットマトリックスを含むインプラント
を７日後にラットから除去し、組織評価を行う。各イン
プラントからの代表的部分を、新規骨無機質の存在に対
してボン・コッサおよび酸性フーシンにより染色し、軟
骨特異的マトリックス形成の存在に対してトルイジンブ
ルーにより染色する。その部分内に存在する細胞のタイ
プおよびこれらの細胞が表現型を示す程度を評価する。 【００６８】ひとＢＭＰ−１をマトリックス材料に加え
ると、内植の７日後に軟骨様小節が形成された。軟骨芽
(細胞)型細胞は、形状および異染性マトリックスの発現
により認識され得る。ひとＢＭＰ−１において観察され
る活性の量は、マトリックスに加えられたひとＢＭＰ−
１蛋白質の量により異なった。第９表は、観察された骨
誘導量に対するひとＢＭＰ−１蛋白質の用量応答関係を
示す。 【００６９】 第１０表インプラント番号 使用量(トランスフェク 組織学的スコア ション培地１ｍｌの当量) ８７６-１３４-１ １０ＢＭＰ−１ Ｃ＋２ ８７６-１３４-２ ３ＢＭＰ−１ Ｃ＋１ ８７６-１３４-３ １ＢＭＰ−１ Ｃ＋／− ８７６-１３４-４ １０ＭＯＣＫ Ｃ− ８７６-１３４-５ ３ＭＯＣＫ Ｃ− ８７６-１３４-６ １ＭＯＣＫ Ｃ− 【００７０】軟骨(c)活性を０(−)〜５の尺度に基づい
て評価した。類似レベルの活性は、ヘパリンセファロー
ス分画ＣＯＳ細胞抽出物においても観察される。６モル
尿素が全緩衝液に含まれること以外は前記方法と同様の
方法で部分精製を実施する。さらに、上記ラット骨形成
検定において、ＢＭＰ−２も同様に軟骨形成活性を示し
た。上記方法を用い、プローブ供給源としてうし骨誘導
因子および／またはひと骨誘導因子を利用することによ
り興味深い他の骨誘導因子を分離することができる。そ
れらの他の骨誘導因子は、特に骨折修復において似た有
用性を呈し得る。以上、この発明の好ましい実施態様に
ついて詳細に記載した。その実施に際し、これらの記載
事項を考慮して多くの修正および変更が行なわれること
は当業界の熟練者であれば容易に想到し得るはずであ
る。それらの修正および変更も後記請求の範囲内に包含
されるものと考えられる。 【００７１】 微 生 物 寄託機関の名称 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション 寄託機関の住所 １２３０１ パークローン・ドライブ ロックビル、メリーランド２０８５２、アメリカ合衆国寄託物の名称 ＡＴＣＣ番号 引用頁／行 寄託の日付 ＬＰ−Ｈ１ ４０３１１ ２９／２０ 1987年3月4日 bＰ５０ ４０２９５ ２０／３ 1986年12月15日 bＰ−２１ ４０３１０ ２２／１８ 1987年3月4日 Ｕ２ＯＳ−３ ４０３４２ ４４／２２ 1987年6月16日 ラムダU2-OS-1 ４０３４３ ３２／３３ 1987年6月16日 ラムダBP819 ４０３４４ ２５／２３ 1987年6月16日 Ｕ２ＯＳ-39 ４０３４５ ３９／２１ 1987年6月16日 【００７２】この発明によって下記の各事項が可能とな
る。 (１)医薬的に許容し得る賦形剤中に、(a)ＢＭＰ−１、
(b)ＢＭＰ−２・クラスＩ、(c)ＢＭＰ−２・クラスII、
(d)ＢＭＰ−３、およびそれらの混合物から成る群から
選ばれる蛋白質を含有して成る医薬組成物。 (２)蛋白質がＢＭＰ−１である、１記載の組成物。 (３)蛋白質がＢＭＰ−2・クラスＩである１記載の組成
物。 (４)蛋白質がＢＭＰ−2・クラスIIである１記載の組成
物。 (５)蛋白質がＢＭＰ−３である、１記載の組成物。 (６)さらに、骨または軟骨欠損部位に組成物を送達し、
骨形成誘導構造を提供し得るマトリックスを含む、１記
載の医薬組成物。 (７)マトリックスが、ヒドロキシアパタイト、コラーゲ
ン、ポリ乳酸および燐酸三カルシウムから成る群から選
択される材料を含む、６記載の組成物。 (８)骨または軟骨形成を必要とする患者における骨形成
誘導方法であって、１−７のいずれか１項記載の組成物
の有効量を患者に投与することを含む方法。 (９)ＢＭＰ−１をコードするＤＮＡ配列により形質転換
されたセルラインを適当な培養培地で培養し(ただし、
前記ＤＮＡ配列は適切な発現制御配列と組合わされてい
る)、培養培地からＢＭＰ−１を分離することを含むＢ
ＭＰ−１の製造方法。 (10)ＤＮＡ配列が実質的に下記ヌクレオチド配列を含ん
でいる、９記載の方法。 【表１８】【表１９】【表２０】【表２１】(11)ＢＭＰ−２・クラスＩをコードするＤＮＡ配列によ
り形質転換されたセルラインを適当な培養培地で培養し
(ただし、前記ＤＮＡ配列は適切な発現制御配列と組合
わされている)、培養培地からＢＭＰ−２・クラスＩを
分離することを含むＢＭＰ−２・クラスＩの製造方法。 (12)ＤＮＡ配列が実質的に下記ヌクレオチド配列を含ん
でいる、１１記載の方法。 【表２２】【表２３】【表２４】 【００７３】(13)ＢＭＰ−２・クラスIIをコードするＤ
ＮＡ配列により形質転換されたセルラインを適当な培養
培地で培養し(ただし、前記ＤＮＡ配列は適切な発現制
御配列と組合わされている)、培養培地からＢＭＰ−２
・クラスIIを分離することを含むＢＭＰ−２・クラスII
の製造方法。 (14)ＤＮＡ配列が実質的に下記ヌクレオチド配列を含ん
でいる、１３記載の方法。 【表２５】 【表２６】【表２７】(15)ＢＭＰ−３をコードするＤＮＡ配列により形質転換
されたセルラインを適当な培養培地で培養し(ただし、
前記ＤＮＡ配列は適切な発現制御配列と組合わされてい
る)、培養培地からＢＭＰ−３を分離することを含むＢ
ＭＰ−３の製造方法。 (16)ＤＮＡ配列が実質的に下記ヌクレオチド配列を含ん
でいる、１５記載の方法。 【表２８】および 【表２９】 (17)実質的に１０記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−１
の実質的特性を呈する蛋白質をコードする配列を含むＢ
ＭＰ−１をコードするcＤＮＡ配列。 (18)実質的に１２記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−２
・クラスＩの実質的特性を呈する蛋白質をコードする配
列を含むＢＭＰ−２・クラスＩをコードするcＤＮＡ配
列。 (19)実質的に１４記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−２
・クラスIIの実質的特性を呈する蛋白質をコードする配
列を含むＢＭＰ−２・クラスIIをコードするcＤＮＡ配
列。 (20)実質的に１６記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−３
の実質的特性を呈する蛋白質をコードする配列を含むＢ
ＭＰ−３をコードするcＤＮＡ配列。 (21)骨誘導蛋白質をコードするＤＮＡ配列および相同性
ＤＮＡを含むベクターであって、蛋白質をコードするＤ
ＮＡ配列が、 a．実質的に１０記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−１
の実質的特性を呈する蛋白質をコードする配列を含むＢ
ＭＰ−１をコードするＤＮＡ配列、 b．実質的に１２記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−２
・クラスＩの実質的特性を呈する蛋白質をコードする配
列を含むＢＭＰ−２・クラスＩをコードするＤＮＡ配
列、 c．実質的に１４記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−２
・クラスIIの実質的特性を呈する蛋白質をコードする配
列を含むＢＭＰ−２・クラスIIをコードするＤＮＡ配
列、および d．実質的に１６記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−３
の実質的特性を呈する蛋白質をコードする配列を含むＢ
ＭＰ−３をコードするＤＮＡ配列から成る群から選ばれ
たものである、ベクター。 (22)骨誘導蛋白質をコードするＤＮＡ配列を発現させ得
る２１記載のベクターにより形質転換された細胞および
前記細胞の子孫。 (23)ほ乳類細胞、細菌細胞、昆虫細胞および酵母細胞か
ら成る群から選ばれる、２２記載の形質転換細胞。 【００７４】(24) (a)(i)実質的に下記配列を有するcＤＮＡ 【表３０】 【表３１】【表３２】【表３３】および(１)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれ
とハイブリダイズし、(２)発現時に、実施例３のインビ
ボ・ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグ
ラム／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成
誘導能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配
列により形質転換された細胞を培養し、 (ii)実質的に上記(a)(i)記載のアミノ酸＃５１〜＃８７
の３７アミノ酸配列を含む蛋白質を前記細胞培地から回
収する工程により生産される蛋白質、 (b)(i)実質的に下記配列を有するcＤＮＡ 【表３４】【表３５】【表３６】 および(１)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれ
とハイブリダイズし、(２)発現時に、実施例３のインビ
ボ・ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグ
ラム／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成
誘導能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配
列により形質転換された細胞を培養し、 (ii)実質的に上記(b)(i)記載のアミノ酸＃２９９〜＃３
９６の９７アミノ酸配列を含む蛋白質を前記細胞培地か
ら回収する工程により生産される蛋白質、 (c)(i)実質的に下記配列を有するcＤＮＡ 【表３７】 【表３８】【表３９】および(１)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれ
とハイブリダイズし、(２)発現時に、実施例３のインビ
ボ・ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグ
ラム／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成
誘導能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配
列により形質転換された細胞を培養し、 (ii)実質的に上記(c)(i)記載のアミノ酸＃３１１〜＃４
０８の９７アミノ酸配列を含む蛋白質を前記細胞培地か
ら回収する工程により生産される蛋白質、 (d)(i)実質的に下記配列を有するcＤＮＡ 【表４０】および 【表４１】 および(１)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれ
とハイブリダイズし、(２)発現時に、実施例３のインビ
ボ・ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグ
ラム／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成
誘導能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配
列により形質転換された細胞を培養し、 (ii)実質的に上記(d)(i)記載のアミノ酸＃７９〜＃１７
５の９６アミノ酸配列を含む蛋白質を前記細胞培地から
回収する工程により生産される蛋白質、および (e)前記蛋白質の混合物 から成る群から選ばれる精製蛋白質の有効量を、医薬的
に許容し得る賦形剤と共に含んで成る医薬組成物であっ
て、実施例３のインビボ・ラット骨形成検定において約
１０−１０００ナノグラム／グラム(骨)の濃度で硬骨お
よび／または軟骨形成誘導能を呈する組成物。 【００７５】(25)さらに、骨または軟骨欠損部位に組成
物を送達し、骨形成誘導構造を提供し得るマトリックス
を含む、24記載の医薬組成物。 (26)マトリックスが、ヒドロキシアパタイト、コラーゲ
ン、ポリ酪酸および燐酸三カルシウムから成る群から選
択される材料を含む、25記載の組成物。 (27)骨または軟骨形成を必要とする患者における骨形成
誘導方法であって、24−26のいずれか１項記載の組成物
の有効量を患者に投与することを含む方法。 (28)24(a)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む
ベクターであって、前記配列が、 (a)実質的に24(a)に記載されたヌクレオチド配列、およ
び (b)(1)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハ
イブリダイズし、(2)発現時に実施例３のインビボ・ラ
ット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム／
グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導能
を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を含
む配列であるベクター。 (29)24(b)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む
ベクターであって、前記配列が、 (a)実質的に24(b)に記載されたヌクレオチド配列、およ
び (b)(1)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハ
イブリダイズし、(2)発現時に実施例３のインビボ・ラ
ット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム／
グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導能
を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を含
む配列であるベクター。 (30)24(c)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む
ベクターであって、前記配列が、 (a)実質的に24(c)に記載されたヌクレオチド配列、およ
び (b)(1)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハ
イブリダイズし、(2)発現時に実施例３のインビボ・ラ
ット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム／
グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導能
を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を含
む配列であるベクター。 (31)24(d)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む
ベクターであって、前記配列が、 (a)実質的に24(d)に記載されたヌクレオチド配列、およ
び (b)(1)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハ
イブリダイズし、(2)発現時に実施例３のインビボ・ラ
ット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム／
グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導能
を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を含
む配列であるベクター。 (32)前記ＤＮＡ配列を発現させ得る28、29、30および31
記載のベクターから成る群から選ばれたベクターにより
形質転換された細胞および前記細胞の子孫。 (33)ほ乳類細胞、細菌細胞、昆虫細胞および酵母細胞か
ら成る群から選ばれる、32記載の形質転換細胞。 (34)精製蛋白質の製造方法であって、(a)24(a)記載の蛋
白質をコードするＤＮＡ配列を含み、それを発現させ得
る細胞を生成し(ただし、この配列は、 (i)実質的に24(a)に記載されたヌクレオチド配列および (ii)(a)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれと
ハイブリダイズし、(b)発現時に実施例３のインビボ・
ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム
／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導
能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を
含む)、 (b)組換え体ＤＮＡを発現させ得る条件下、適当な培養
培地において前記の形質転換宿主細胞またはその子孫を
培養し、 (c)前記培養から前記蛋白質を分離および精製する工程
を含む方法。 【００７６】(35)精製蛋白質の製造方法であって、 (a)24(b)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含み、
それを発現させ得る細胞を生成し(ただし、この配列
は、 (i)実質的に24(b)に記載されたヌクレオチド配列および (ii)(a)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれと
ハイブリダイズし、(b)発現時に実施例３のインビボ・
ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム
／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導
能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を
含む)、 (b)組換え体ＤＮＡを発現させ得る条件下、適当な培養
培地において前記の形質転換宿主細胞またはその子孫を
培養し、 (c)前記培養から前記蛋白質を分離および精製する工程
を含む方法。 (36)精製蛋白質の製造方法であって、 (a)24(c)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含み、
それを発現させ得る細胞を生成し(ただし、この配列
は、 (i)実質的に24(c)に記載されたヌクレオチド配列および (ii)(a)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれと
ハイブリダイズし、(b)発現時に実施例３のインビボ・
ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム
／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導
能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を
含む)、 (b)組換え体ＤＮＡを発現させ得る条件下、適当な培養
培地において前記の形質転換宿主細胞またはその子孫を
培養し、 (c)前記培養から前記蛋白質を分離および精製する工程
を含む方法。 (37)精製蛋白質の製造方法であって、 (a)24(d)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含み、
それを発現させ得る細胞を生成し(ただし、この配列
は、 (i)実質的に24(d)に記載されたヌクレオチド配列および (ii)(a)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれと
ハイブリダイズし、(b)発現時に実施例３のインビボ・
ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム
／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導
能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を
含む)、 (b)組換え体ＤＮＡを発現させ得る条件下、適当な培養
培地において前記の形質転換宿主細胞またはその子孫を
培養し、 (c)前記培養から前記蛋白質を分離および精製する 工程を含む方法。
造方法に関するものである。これらの蛋白質は軟骨およ
び硬骨の形成を誘導し得る。 【０００２】 【従来の技術】骨は、蛋白質コラーゲンの線維束、およ
びプロテオグリカン、非コラーゲン性蛋白質、脂質およ
び酸性蛋白質により形成された広範なマトリックス構造
を特徴とする高度に分化した組織である。一生を通じて
連続的に行なわれる骨形成および骨組織の再生／修復の
プロセスは、分化細胞により行なわれる。正常な胎長骨
の発達の前に、軟骨のひな形が形成される。骨の成長は
恐らく「骨芽細胞」(骨形成細胞)の介在によると思われる
が、骨の再建は明らかに骨吸収細胞、いわゆる「破骨細
胞」および骨芽細胞の結合活性により行なわれる。様々
な骨原性軟骨誘導および硬骨誘導因子が報告されてい
る。それらに関しては、例えばヨーロッパ特許出願第１
４８１５５号および同第１６９０１６号参照。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】この発明は、純粋形態
の新規蛋白質を提供する。具体的には、４種の新規蛋白
質は、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２・クラスＩ(またはＢＭ
Ｐ−２)、ＢＭＰ−３およびＢＭＰ−２・クラスII(また
はＢＭＰ−４)(ただし、ＢＭＰは骨形態形成蛋白質であ
る)と称する。これらの蛋白質は、後記第２〜８表に示
したアミノ酸配列と同一または実質的に相同性のペプチ
ド配列を特徴とする。それらは予め定められた部位での
骨形成を誘導し得る。さらにこれらの骨誘導因子は、後
記インビボラット骨形成検定における１０〜１０００n
ｇ／ｇ(骨)の濃度での活性を含む生化学的および生物学
的特性を特徴とする。この発明の蛋白質は、表に示した
ＤＮＡ配列、またはそれとハイブリダイゼーションし、
骨成長因子の生物学的特性を有するポリペプチドをコー
ドし得る配列またはそれらの特性を示す他の様々な修飾
配列によりコードされ得る。 【０００４】この発明の蛋白質の１つはＢＭＰ−１とい
う。ひとＢＭＰ−１またはhＢＭＰ−１の一部分は、ゲ
ノムhＢＭＰ−１フラグメントを表す後記第５表のアミ
ノ酸＃１〜アミノ酸＃３７またはhＢＭＰ−１ cＤＮＡ
を表す第６表のアミノ酸＃１〜アミノ酸＃７３０の配列
と同一または実質的に同じペプチド配列を有することを
特徴とする。さらに、hＢＭＰ−１または関連骨誘導因
子は、これらの配列の少なくとも一部分を有することを
特徴とし得る。これらのペプチド配列は、第５表のヌク
レオチド＃３４４０〜ヌクレオチド＃３５５０および第
６表のヌクレオチド＃３６〜ヌクレオチド＃２２２５に
それぞれ示された配列と同一または実質的に同じＤＮＡ
配列によりコードされる。さらに、これらのhＢＭＰ−
１ポリペプチドは骨形成誘導能を有することを特徴とす
る。hＢＭＰ−１は、骨１ｇ当たり１０〜１０００nｇの
濃度でインビボ ラット骨形成検定において活性を呈す
る。 【０００５】この発明の相同性うし成長因子(bＢＭＰ−
１と称す)は、ゲノムbＢＭＰ−１フラグメントを表す後
記第２表のアミノ酸＃１〜アミノ酸＃３７の配列と同一
または実質的に同じ配列を含むペプチド配列を有するこ
とを特徴とする。このペプチド配列は、後記第２表のヌ
クレオチド＃２９４〜ヌクレオチド＃４０４に示された
配列と同一または実質的に同じＤＮＡ配列によりコード
される。後記第２表で同定されたうしペプチド配列もま
た３７アミノ酸長である。さらに、bＢＭＰ−１は骨形
成誘導能を特徴とする。この発明の別の骨誘導蛋白質組
成物は、ＢＭＰ−２・クラスＩ(またはＢＭＰ−２)と称
する。それは、cＤＮＡ hＢＭＰ−２・クラスＩを表す
第７表のアミノ酸＃１〜アミノ酸＃３９６の配列と同一
または実質的に同じペプチド配列の少なくとも一部分を
有することを特徴とする。このペプチド配列は、第７表
のヌクレオチド＃３５６〜ヌクレオチド＃１５４３に示
された配列と同一または実質的に同じＤＮＡ配列により
コードされる。第７表で同定されたひとペプチド配列は
３９６アミノ酸長である。またhＢＭＰ−２または関連
骨誘導蛋白質もこのペプチド配列の少なくとも一部分を
有することを特徴とし得る。さらにhＢＭＰ−２・クラ
スＩは、骨形成誘導能を特徴とする。 【０００６】hＢＭＰ−２・クラスＩ(またはhＢＭＰ−
２)と称するこの発明の相同性うし骨誘導蛋白質は、ゲ
ノム配列を表す後記第３表で同定されたＤＮＡ配列を有
する。このうしＤＮＡ配列は、予想される１２９アミノ
酸コード配列、次いで約２０５個のヌクレオチド(３'非
コード配列)を有する。さらにhＢＭＰ−２・クラスＩは
骨形成誘導能を特徴とする。この発明の別の骨誘導蛋白
質組成物は、ＢＭＰ−２・クラスIIまたはＢＭＰ−４と
称する。ひと蛋白質hＢＭＰ−２・クラスII(またはhＢ
ＭＰ−４)は、hＢＭＰ−２・クラスIIのcＤＮＡを表す
第８表のアミノ酸＃１〜アミノ酸＃４０８間の配列と同
一または実質的に同じペプチド配列の少なくとも一部分
を有することを特徴とする。このペプチド配列は、第８
表のヌクレオチド＃４０３〜ヌクレオチド＃１６２６に
示された配列と同一または実質的に同じＤＮＡ配列の少
なくとも一部分によりコードされる。さらにこの因子
は、骨形成誘導能を特徴とする。 【０００７】この発明のさらに別の骨誘導因子、ＢＭＰ
−３は、うし相同体bＢＭＰ−３により示される。bＢＭ
Ｐ−３は、うしゲノム配列を表す第４ＡおよびＢ表のＤ
ＮＡ配列およびアミノ酸配列を有することを特徴とす
る。それは、第４ＡおよびＢ表のアミノ酸＃１〜アミノ
酸＃１７４と同一または実質的に同じペプチド配列の少
なくとも一部分を有することを特徴とする。さらにＢＭ
Ｐ−３は、骨形成誘導能を特徴とする。うし因子は、類
縁体ひとＢＭＰ−３蛋白質または他のほ乳類骨誘導蛋白
質を得るための道具として使用され得る。このうし骨誘
導因子の特性を正確に表すと、この配列を用いる方法に
おける本質的「出発点」が得られる。遺伝子工学技術分野
における熟練者に周知の技術を用いるこの方法は、プロ
ーブとしてうしＤＮＡ配列を使用してひとゲノムまたは
cＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、このプ
ローブとハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列を同定
することを含む。ハイブリダイゼーション可能な配列を
有するクローンは精製されたプラークであり、ＤＮＡは
そこから分離され、サブクローンされ、ＤＮＡ配列分析
が行なわれる。すなわち、この発明の別の態様は、この
方法により製造されたひと蛋白質hＢＭＰ−３である。 【０００８】この発明の別の態様は、医薬的に許容し得
る賦形剤中にこの発明によるうし成長因子ポリペプチド
の１種またはそれ以上の治療有効量を含有する医薬組成
物に関するものである。さらに、これらの組成物は他の
治療上有用な薬剤を含有し得る。またそれらは、骨欠損
部位への蛋白質送達および骨成長構造の提供に適したマ
トリックスを含み得る。これらの組成物は、幾つかの骨
欠損および歯周病の処置方法において使用され得る。こ
の発明によると、これらの方法は、骨形成を必要とする
患者に、本明細書に記載された新規蛋白質ＢＭＰ−１、
ＢＭＰ−２・クラスＩ、ＢＭＰ−２・クラスIIおよびＢ
ＭＰ−３の少なくとも１種の有効量を投与することを必
然的に伴う。 【０００９】さらにこの発明の別の態様は、骨形成誘導
能を有するひとまたはうしポリペプチドの発現をコード
するＤＮＡ配列に関するものである。それらの配列は、
第２〜８表に示された５'−３'方向のヌクレオチド配列
を含む。他方、ストリンジェント条件下で第２〜８表の
ＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列、
または非ストリンジェント条件下で示されたＤＮＡ配列
とハイブリダイゼーションし、少なくとも１種の骨成長
因子生物学的特性を有する蛋白質の発現をコードするＤ
ＮＡ配列もこの発明に包含される。最後に、第２〜８表
の配列の対立遺伝子または他の変形もまた、それらのヌ
クレオチド変形の結果としてのペプチド配列の変形の存
否に拘わらず、この発明に含まれる。 【００１０】さらにこの発明の別の態様は、前記ＤＮＡ
配列を発現制御配列と効果的に組み合わせて含むベクタ
ーに関するものである。このベクターは、発現制御配列
と効果的に共同して骨成長因子ポリペプチドの発現をコ
ードするＤＮＡ配列により形質転換されたセルラインが
培養される、骨成長因子ポリペプチドの新規製造方法に
おいて使用され得る。この発明の方法は、ポリペプチド
発現用の宿主細胞として幾つかの公知細胞を使用し得
る。現在好ましいセルラインはほ乳類セルラインおよび
細菌細胞である。以下、詳細な記載および好ましい実施
態様を熟考すれば、この発明の他の態様および利点は明
らかである。 【００１１】 【課題を解決するための手段】この発明の蛋白質は、後
記第２〜８表に示された配列と同一または実質的に相同
性のアミノ酸配列またはその一部分を有することを特徴
とする。これらの蛋白質もまた骨形成誘導能を特徴とす
る。また、この明細書に記載された骨成長因子は、第２
〜８表の配列に類似した配列によりコードされる因子を
含むが、その配列に対する修飾は、自然に行なわれるか
(例、ポリペプチドにおけるアミノ酸変更を誘導し得る
ヌクレオチド配列における対立遺伝子的改編)または慎
重な工学的処理により行なわれる。例えば、合成ポリペ
プチドは、第２〜８表のアミノ酸残基の連続配列を全体
的または部分的に複製し得る。これらの配列は、第２〜
８表の骨成長因子ポリペプチドと共有の一次、二次また
は三次構造および立体配座特性により、共通して骨成長
因子生物学的特性を有し得る。すなわち、それらは、治
療プロセスにおいて天然骨成長因子ポリペプチドの生物
学的活性代用物として使用され得る。 【００１２】この明細書に記載された骨成長因子の配列
の他の特異的突然変異体は、グリコシル化部位の一方ま
たは両方の修飾を伴う。グリコシル化の不在または一部
のみのグリコシル化は、第２〜８表に示された骨成長因
子の配列に存在するアスパラギン結合グリコシル化認識
部位の一方または両方におけるアミノ酸置換または欠失
に起因する。アスパラギン結合グリコシル化認識部位
は、適当な細胞のグリコシル化酵素により特異的に認識
されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド
配列は、アスパラギン−Ｘ−トレオニンまたはアスパラ
ギン−Ｘ−セリン(ただし、Ｘは通常アミノ酸である)で
ある。グリコシル化認識部位の第一または第三アミノ酸
位の一方または両方における様々なアミノ酸置換または
欠失(および／または第２位におけるアミノ酸欠失)は、
修飾トリペプチド配列における非グリコシル化をもたら
す。またこの発明は、他の蛋白質性材料をコードするＤ
ＮＡ配列との随伴がなく、骨成長因子の発現をコードす
る新規ＤＮＡ配列を(アレリック)包含する。これらのＤ
ＮＡ配列は、５'−３'方向の第２〜８表に示された配列
およびストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件
[マニアチス等、「モレキュラー・クローニング(ア・ラ
ボラトリー・マニュアル)」、コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー(１９８２)、３８７〜３８９頁参
照]下で第２〜８表のＤＮＡ配列とハイブリダイゼーシ
ョンする配列を含む。 【００１３】緩和ハイブリダイゼーション条件下で第２
〜８表の配列とハイブリダイゼーションし、骨成長因子
生物学的特性を有する骨成長因子の発現をコードするＤ
ＮＡ配列はまた、この発明の骨成長因子もコードする。
例えば、重要な相同性を有する領域、例えばグリコシル
化またはジスルフィド結合部位を第２〜８表の配列と共
有し、１種またはそれ以上の骨成長因子生物学的特性を
有する骨成長因子をコードするＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配
列が第２〜８表の配列とストリンジェント的にハイブリ
ダイゼーションしない場合でも、成長因子のこの新たな
科の一員を明らかにコードする。同様に、第２〜８表の
配列によりコードされる骨成長因子ポリペプチドをコー
ドするが、遺伝子コードの縮重またはアレリック変異
(アミノ酸変更を誘導する場合もしない場合もあり得る
種の集団における天然塩基の変形)故にコドン配列が異
なるＤＮＡ配列もまた、この明細書に記載された新規成
長因子をコードする。点突然変異または誘導修飾により
ポリペプチドの活性、半減期または生産の向上が誘発さ
れる第２〜８表のＤＮＡ配列における変形もまたこの発
明に包含される。 【００１４】この発明の別の態様は、新規骨誘導因子の
新規製造方法に関するものである。この発明の方法は、
既知調節配列の制御下、この発明の新規骨成長因子ポリ
ペプチドの発現をコードするＤＮＡ配列により形質転換
された適当な細胞またはセルラインの培養を含む。適当
な細胞またはセルラインは、ほ乳類細胞、例えばチャイ
ニーズ・ハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)であり得る。適当
なほ乳類宿主細胞の選択並びに形質転換、培養、増幅、
スクリーニング、および製品の製造および精製の方法は
当業界では周知である。例えば、ゲシングおよびサンブ
ルック、「ネイチャー」、２９３、６２０−６２５(１９
８１)または別法としてカウフマン等、「モル・セル・バ
イオル」、５(７)１７５０−１７５９(１９８５)または
ハウレイ等、アメリカ合衆国特許第４４１９４４６号参
照。後記実施例記載の別の適当なほ乳類セルラインは、
さるＣＯＳ−１セルラインである。同様に有用なほ乳類
セルラインはＣＶ−１セルラインである。 【００１５】細菌細胞は適当な宿主である。例えば、エ
シェリヒア・コリの様々な株(例、ＨＢ１０１、ＭＣ１
０６１)はバイオテクノロジー分野において宿主細胞と
してよく知られている。枯草菌(バシルス・サブチリ
ス)、プソイドモナス、他のかん菌などの様々な株もま
たこの方法において使用され得る。当業界の熟練者には
周知の多くの酵母細胞株もまた、この発明のポリペプチ
ドの発現用の宿主細胞として利用され得る。さらに、所
望により、昆虫細胞もこの発明の方法における宿主細胞
として利用され得る。例えば、ミラー等、「ジェネティ
ック・エンジニアリング」、８、２７７−２９８(プレナ
ム・プレス１９８６)およびその引用文献参照。この発
明の別の態様は、これらの新規骨誘導ポリペプチド類の
発現方法で使用されるベクターに関するものである。好
ましくは、これらのベクターは、この発明の新規因子を
コードする前述の完全な新規ＤＮＡ配列を含む。さらに
また、これらのベクターは、骨誘導蛋白質配列を発現さ
せる適当な発現制御配列を含む。他方、上記修飾配列が
組み込まれたベクターはまた、この発明の具体例であ
り、骨誘導蛋白質の製造に有用である。これらのベクタ
ーはセルラインの形質転換方法で使用され得、選択され
た宿主細胞におけるその複製および発現を指向し得るこ
の発明のＤＮＡコード配列と効果的に組み合わせて選択
された調節配列を含み得る。これらのベクターに有用な
調節配列は当業界の熟練者には周知であり、選択された
宿主細胞に応じて選択され得る。この選択は常套的であ
り、この発明の一部を形成するものではない。 【００１６】骨が正常には形成されない環境において骨
の成長を誘導するこの発明の蛋白質は、骨折の治癒に適
用性を有する。この発明の蛋白質の１種またはそれ以上
を用いる骨原性製剤は、閉鎖および複雑骨折の縮小並び
に人工関節の固定改善における予防的用途を有し得る。
骨原性薬剤により新たに誘導される骨形成は、先天的、
外傷性または腫よう切除による頭顔欠損の修復に貢献
し、美容形成外科においても有用である。この発明の骨
生成因子は、歯周病の処置および他の歯修復プロセスに
おいて貴重であり得る。これらの薬剤は、骨形成細胞を
誘引し、骨形成細胞の成長を刺激し、または骨形成細胞
の原種の分化を誘導する環境を提供する。勿論、この発
明の蛋白質は他の治療用途を有し得る。この発明の別の
態様は、骨折および骨欠損に関連した他の状態または歯
周病の修復を目的とする治療方法および組成物に関する
ものである。前記組成物は、この発明の骨誘導因子蛋白
質の少なくとも１種の治療有効量を含有する。この発明
による骨誘導因子は、医薬的に許容し得る賦形剤または
マトリックスと混合した状態で治療組成物中に存在し得
る。さらにこの発明の治療方法および組成物は、この発
明の骨誘導因子の治療有効量およびこの発明の他の骨誘
導因子の少なくとも１種の治療有効量を含む。さらに、
この発明による蛋白質またはこの発明の蛋白質の組合わ
せは、それが相互作用し得る１種またはそれ以上の骨誘
導因子と共に投与され得る。さらに、骨誘導蛋白質は、
問題の骨欠損の処置に有益な他の薬剤と組合わされ得
る。それらの薬剤には様々な成長因子が含まれるが、限
定される訳ではない。pＨ、等張性、安定性などに関し
て生理学的に許容し得る蛋白質組成物の製造は、当業界
の技術の範囲内である。 【００１７】特にＢＭＰ−１は、組成物において個々に
使用され得る。ＢＭＰ−１はまた、この発明の他の蛋白
質の１種またはそれ以上と組合わせて使用され得る。Ｂ
ＭＰ−１およびＢＭＰ−２・クラスＩは組合わせて使用
され得る。ＢＭＰ−１およびＢＭＰ−２・クラスIIもま
た組合わせて使用され得る。ＢＭＰ−１およびＢＭＰ−
３もまた組合わせて使用され得る。さらに、ＢＭＰ−１
は、この発明の他の蛋白質の２種または３種と組合わせ
て使用され得る。例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２・ク
ラスＩおよびＢＭＰ−２・クラスIIは組合わされ得る。
ＢＭＰ−１はまた、ＢＭＰ−２・クラスＩおよびＢＭＰ
−３と組合わされ得る。さらに、ＢＭＰ−１は、ＢＭＰ
−２・クラスIIおよびＢＭＰ−３と組合わされ得る。Ｂ
ＭＰ−１、ＢＭＰ−２・クラスＩ、ＢＭＰ−２・クラス
IIおよびＢＭＰ−３は組合わされ得る。ＢＭＰ−２・ク
ラスＩは、医薬組成物において個々に使用され得る。Ｂ
ＭＰ−２・クラスＩもまた、この発明の他の蛋白質の１
種またはそれ以上と組合わせて使用され得る。ＢＭＰ−
２・クラスＩは、ＢＭＰ−２・クラスIIと組合わされ得
る。それはまた、ＢＭＰ−３とも組合わされ得る。さら
にＢＭＰ−２・クラスＩは、ＢＭＰ−２・クラスIIおよ
びＢＭＰ−３と組合わされ得る。 【００１８】ＢＭＰ−２・クラスIIは、医薬組成物にお
いて個々に使用され得る。さらに、それは前述の他の蛋
白質と組合わせて使用され得る。さらに、それはＢＭＰ
−３と組合わせて使用され得る。ＢＭＰ−３は、組成物
において個々に使用され得る。さらにそれは、前述の様
々な組合わせで使用され得る。この治療方法は、インプ
ラントまたはデバイスとして組成物を局所投与すること
を含む。投与される場合、勿論この発明で使用される治
療組成物は、発熱物質を含まない、生理学的に許容し得
る形態を呈する。さらに、この組成物は、望ましくは骨
損傷部位への送達に適した粘稠性形態で封入または注射
され得る。好ましくは、骨成長誘導因子組成物は、骨誘
導因子を骨損傷部位に送達し、成長する硬骨および軟骨
構造を提供し得、最適状態で体内に再吸収され得るマト
リックスを含む。それらのマトリックスは、他の内植医
学適応例で現在使用されている他の材料により形成され
得る。 【００１９】材料の選択は、例えば、生物学的適合性、
生物分解性、機構特性、表面的外観および界面特性に基
づいて行なわれる。同様に、骨誘導因子の適用は適当な
製剤を限定する。骨誘導因子に適用され得るマトリック
スは、生物分解性で化学的に定義されるもの、例えば硫
酸カルシウム、燐酸トリカルシウム、ヒドロキシアパタ
イト、ポリ乳酸、ポリ無水物(ただし、これらに限定さ
れる訳ではない)、生物分解性で生物学的に明確に定義
されるもの、例えば骨もしくは皮膚コラーゲン、他の純
粋な蛋白質または細胞外マトリックス成分、非生物分解
性で化学的に定義されるもの、例えば焼結ヒドロキシア
パタイト、生体ガラス、アルミン酸塩または他のセラミ
ック、または前述のタイプの材料を幾つか組合わせたも
の、例えばポリ酪酸およびヒドロキシアパタイトまたは
コラーゲンおよび燐酸トリカルシウムであり得る。生体
セラミックもまた組成物、例えばカルシウム−アルミン
酸塩−燐酸塩において改変され得、例えば孔サイズ、粒
子サイズ、粒子形状および生物分解性の改変が行なわれ
得る。 【００２０】投与量については、この成長因子の作用を
修飾する様々な要因、例えば形成が望まれる骨の重量、
骨損傷の部位、損傷骨の状態、患者の年令、性別および
治療食、感染の重症度、投与時間および他の臨床要因を
考慮して担当医が決定する。用量は、再構成およびＢＭ
Ｐの組成物において使用されるマトリックスのタイプに
より変動し得る。最終組成物への他の既知成長因子、例
えばＩＧＦ１(インスリン様成長因子１)の追加もまた用
量に影響を与え得る。一般的に、投与量は、所望の骨重
量１ｇ当たり、蛋白質約１０〜１０6ナノグラムの範囲
内とすべきである。経過は骨成長および／または修復の
定期的評価(例、エックス線)によりモニターされ得る。
また、これらの治療組成物は、骨誘導因子における種特
異性の欠如故に現在獣医学適用においても貴重である。
ひとに加えて特定の家畜およびサラブレッドのうまは、
この発明の骨誘導因子による処置において望ましい患者
である。以下、実施例により、うし蛋白質の回収および
特性検定、それらの使用によるひと蛋白質の回収、ひと
蛋白質の獲得および組換え技術による蛋白質の発現にお
けるこの発明の実施態様を説明する。 【００２１】 【実施例】 実施例１ うし骨誘導因子の単離 ウリスト等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・
ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、７０:３５
１１(１９７３)の方法に従い、破砕したうしの骨粉(２
０−１２０メッシュ、ヘリトレックス)を製造する(ただ
し、下記の通り幾つかの抽出工程は省く)。１０ｋｇの
粉末を、４℃で４８時間激しい撹はん下、０.６ＮのＨ
Ｃｌを連続交換しながら脱塩する。生成した懸濁液を４
℃で１６時間２モルのＣaＣl2および１０ミリモルのエ
チレンジアミン-四酢酸[ＥＤＴＡ]５０ｌにより抽出
し、次いで５０ｌの０.５モルＥＤＴＡ中で４時間抽出
する。残留物を蒸留水で３回洗浄した後、「クリニカル
・オーソペディックス・アンド・リレーデット・リサー
チ」、１７１:２１３(１９８２)の記載に従い、４モルの
グアニジン塩酸塩[ＧuＣl]、２０ミリモルのトリス(pＨ
７.４)、１ミリモルのＮ−エチルマレイミド、１ミリモ
ルのヨードアセトアミド、１ミリモルのフェニルメチル
スルホニル・フッ素２０ｌに再懸濁する。１６〜２０時
間後、上清を除去し、別の１０ｌのＧuＣl緩衝液と置き
換える。残留物をさらに２４時間抽出する。 【００２２】粗ＧuＣl抽出物を合わせ、１００００分子
量遮断膜を備えたペリコン装置で約２０倍に濃縮し、次
いで５０ミリモルのトリス、０.１モルのＮaＣｌ、６モ
ルの尿素(pＨ７.２)、第一カラム用出発緩衝液に対して
透析する。充分透析後、蛋白質を４リットルＤＥＡＥセ
ルロースカラムに仕込み、未結合フラクションを集め
る。未結合フラクションを濃縮し、６モル尿素中５０ミ
リモルのＮaＡc、５０ミリモルのＮaＣl(pＨ４.６)に対
して透析する。未結合フラクションをカルボキシメチル
セルロースカラムに適用する。カラムに結合していない
蛋白質を出発緩衝液で充分洗浄することにより除去し、
骨誘導因子含有材料を５０ミリモルのＮaＡc、０.２５
ミリモルのＮaＣl、６モルの尿素(pＨ４.６)によりカラ
ムから脱着させる。この段階溶離から得られた蛋白質を
２０〜４０倍に濃縮し、次いで８０ミリモルＫＰＯ4、
６モル尿素(pＨ６.０)により５倍に希釈する。溶液のp
Ｈを５００ミリモルのＫ2ＨＰＯ4により６.０に調節す
る。８０ミリモルＫＰＯ4、６モル尿素(pＨ６.０)中で
平衡状態にしたヒドロキシルアパタイトカラム(ＬＫＢ)
に試料を適用し、同緩衝液でカラムを洗浄することによ
り、未結合蛋白質を全て除去する。骨誘導因子活性蛋白
質を１００ミリモルＫＰＯ4(pＨ７.４)および６モル尿
素により溶離させる。 【００２３】この蛋白質を約１０倍に濃縮し、固体Ｎa
Ｃlを加えて最終濃度０.１５モルとする。この材料を、
５０ミリモルＫＰＯ4、１５０ミリモルＮaＣl、６モル
尿素(pＨ７.４)中で平衡状態にしたヘパリン−セファロ
ースカラムに適用する。出発緩衝液でカラムを充分洗浄
後、骨誘導因子活性蛋白質を５０ミリモルＫＰＯ4、７
００ミリモルりＮaＣl、６モル尿素(pＨ７.４)により溶
離させる。このフラクションを最小体積に濃縮し、４モ
ルＧuＣl、２０ミリモルのトリス(pＨ７.２)により平衡
状態にしたスーパローズ６およびスーパローズ１２カラ
ム(一列に連結)に０.４ｍｌアリコートを適用し、カラ
ムを流速０.２５ｍｌ／分で展開する。骨誘導因子活性
を示す蛋白質は、約３００００ダルトンの蛋白質に対応
する相対移動を呈する。 【００２４】上記フラクションをプールし、５０ミリモ
ルＮaＡc、６モル尿素(pＨ４.６)に対して透析し、ファ
ルマシア・モノＳ ＨＲカラムに適用する。カラムを１.
０モルＮaＣl、５０ミリモルＮaＡc、６モル尿素(pＨ
４.６)への勾配により展開する。活性フラクションをプ
ールし、１０％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)によりpＨ３.
０とする。この材料を０.１％ＴＦＡ中０.４６×２５ｃ
ｍバイダックＣ４カラムに適用し、カラムを９０％アセ
トニトリル、０.１％ＴＦＡへの勾配により展開する(６
０分間で３１.５％アセトニトリル、０.１％ＴＦＡから
４９.５％アセトニトリル、０.１％ＴＦＡ、ただし１分
間１ｍｌの速度)。活性材料を約４０−４４％アセトニ
トリルで溶離する。マッコナヘイ等、「インターナショ
ナル・アーカイブス・オブ・アラージー」、２９:１８５
−１８９(１９６６)、ボルトン等、「バイオケミカル・
ジャーナル」、１３３:５２９(１９７３)およびボーウェ
ン-ポープ、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー」、２３７:５１６１(１９８２)の中の一法によ
り、適当なフラクションのアリコートをヨウ素化する。
これらのフラクション中に存在するヨウ素化蛋白質をＳ
ＤＳゲル電気泳動および尿素トリトンＸ１００等電点電
気泳動により分析する。この段階で、骨誘導因子を評価
すると、約１０−５０％純度である。 【００２５】実施例２ うし骨誘導因子の特性検定 Ａ．分子量 実施例１により得られた約２０μｇの蛋白質を凍結乾燥
し、１×ＳＤＳ試料緩衝液に再溶解する。３７℃で１５
分加熱後、試料を１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
に適用し、次いで冷却しながら電気泳動させる。予め染
色した分子量標準(ベゼスダ・リサーチ・ラブズ)と比べ
て分子量を測定する。完了直後、骨誘導因子含有ゲルレ
ーンを０.３ｃｍ片に切断する。各片をすり潰し、１.４
ｍｌの０.１％ＳＤＳを加える。試料を室温で一夜穏や
かに振り混ぜて蛋白質を溶離させる。各ゲル片を脱塩す
ることにより、生物学的検定における干渉を防ぐ。各試
料から得た上清を１０％ＴＦＡによりpＨ３.０に酸性化
し、０.４５ミクロン膜によりろ過し、０.４６ｃｍ×５
ｃｍＣ４バイダックカラムに入れ、０.１％ＴＦＡから
０.１％ＴＦＡ、９０％ＣＨ3ＣＮへの勾配により展開す
る。適当な骨誘導因子含有フラクションをプールし、２
０ｍｇのラット・マトリックスにより再構成する。この
ゲル・システムにおいて、骨誘導因子フラクションの大
部分は、約２８０００−３００００ダルトンの分子量を
有する蛋白質移動度を有する。 【００２６】Ｂ．等電点電気泳動 骨誘導因子活性の等電点を変性等電点電気泳動システム
において測定する。トリトンＸ１００尿素ゲルシステム
(ホーファー・サイエンティフィック)を次の要領で修正
する。１)使用される両性電解質の４０％はサーバライ
ト３／１０あり、６０％はサーバライト７−９である。
２)使用されるカソライト(catholyte)は４０ミリモルＮ
aＯＨである。実施例１で得られた約２０μｇの蛋白質
を凍結乾燥し、試料緩衝液に溶解し、等電点電気泳動ゲ
ルに適用する。ゲルを２０ワット、１０℃で約３時間移
動させる。完了時、骨誘導因子含有レーンを０.５ｃｍ
片に切断する。各片を１.０ｍｌの６モル尿素、５ミリ
モルのトリス(pＨ７.８)中ですり潰し、試料を室温で振
り混ぜる。試料を上記と同様に酸性化し、ろ過し、脱塩
し、検定する。実施例３記載の検定で測定された活性の
大部分は、８.８−９.２のpＩと一致する形で移動す
る。 【００２７】Ｃ．サブユニットの特性 骨誘導因子のサブユニット組成についても測定する。純
粋な骨誘導因子を上記と同様にプレパラティブ１５％Ｓ
ＤＳゲルから分離する。次いで試料の一部を試料緩衝液
中５ミリモルＤＴＴにより還元し、１５％ＳＤＳゲルに
おいて再電気泳動させる。約３０キロダルトン蛋白質
は、約２０キロダルトンおよび１８キロダルトンの箇所
で２本の大きなバンド並びに３０キロダルトンの箇所で
小さなバンドを生ずる。２本のバンドの広さは、恐らく
はグリコシル化、他の翻訳後修飾、蛋白質加水分解によ
る減成またはカルバミル化に起因すると思われる不均質
性を示す。 【００２８】実施例３ 骨誘導因子の生物学的活性 サンパスおよびレディ、「プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・
オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリ
カ」、８０:６５９１−６５９５(１９８３)の一般的方法
によるラット骨形成検定を用いることにより、実施例１
で得られたこの発明のうし骨誘導因子の骨生成活性を評
価する。またこの検定を用いて他の種類の骨誘導因子を
評価することも可能である。エタノール沈澱工程の代わ
りに検定フラクションの水に対する透析を行う。次い
で、溶液または懸濁液を揮発性溶媒、例えば０.１−０.
２％ＴＦＡに再溶解し、生成した溶液を２０ｍｇのラッ
ト・マトリックスに加える。この材料を冷凍し、凍結乾
燥し、生成した粉末を＃５ゼラチンカプセルに封入す
る。２１−４９日令の雄ロング・エバンス・ラットの腹
部胸領域にカプセルを皮下内植する。７−１４日後イン
プラントを除去する。各インプラントの半分を用いてア
ルカリ性ホスファターゼ分析[レディ等、「プロシーディ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オ
ブ・アメリカ」、６９:１６０１(１９７２)参照]を行
い、半分を固定し、組織分析を行う。常用手順で、１μ
ｍグリコメタクリレート部分をボン・コッサおよび酸性
フーシン(fuschin)で染色することにより、新規骨無機
質を検出する。アルカリ性ホスファターゼ、マトリック
ス形成プロセスにおいて軟骨芽細胞および骨芽細胞によ
り生産される酵素もまた測定される。新しい軟骨および
硬骨形成はしばしばアルカリ性ホスファターゼレベルと
相関する。下記第１表は、骨誘導因子により処理されな
かった対照を含むラット・マトリックス試料の用量応答
を示す。 【００２９】 【表１】 第１表内植蛋白質＊(μｇ) 軟骨 アルカリ性ホスファターゼ(μ/ｌ) ７.５ ２ 実施せず ２.５ ３ ４４５.７ ０.８３ ３ ７７.４ ０.２８ ０ ３２.５ ０.００ ０ ３１.０ ＊この段階で骨誘導因子は約１０−１５％の純度である。 【００３０】形成された硬骨または軟骨は、マトリック
スによりふさがれた空間に物理的に閉じ込められる。ま
た、前記と同様にＳＤＳゲル電気泳動および等電点電気
泳動により試料を分析し、次いでオートラジオグラフィ
ーを行う。分析は、pＩ９.０および２８−３０キロダル
トンでの蛋白質バンドと活性の相関関係を示す。１ＯＤ
／ｍｇ−ｃｍの消衰係数を蛋白質に関する推定値として
使用し、特定フラクション中の骨誘導因子の純度を近づ
ける。前記希釈物におけるインビボ ラット骨形成検定
において、蛋白質は、１０〜２００nｇ蛋白質／(骨)ｇ
〜恐らくは１μｇ蛋白質／(骨)ｇより大の比率でインビ
ボ活性を呈する。 【００３１】実施例４ うし骨誘導因子蛋白質組成物 ２８−３０キロダルトンの分子量を有する実施例２Ａの
蛋白質組成物を実施例２Ｃの記載に従い還元し、トリプ
シンで消化する。下記のアミノ酸配列を有する８種のト
リプシンフラグメントを標準的方法により単離する。 フラグメント１:ＡＡＦＬＧＤＩＡＬＤＥＥＤＬＧ フラグメント２:ＡＦＱＶＱＱＡＡＤＬ フラグメント３:ＮＹＱＤＭＶＶＥＧ フラグメント４:ＳＴＰＡＱＤＶＳＲ フラグメント５:ＮＱＥＡＬＲ フラグメント６:ＬＳＥＰＤＰＳＨＴＬＥＥ フラグメント７:ＦＤＡＹＹ フラグメント８:ＬＫＰＳＮ？ＡＴＩＱＳＩＶＥ 【００３２】実施例１記載の方法と類似した精製手順に
従い、うしの骨由来の蛋白質の低級精製製品を製造す
る。この精製手順は、ＤＥ−５２カラム、ＣＭセルロー
スカラムおよびモノＳカラムの省略並びにヒドロキシル
アパタイトおよびヘパリン・セファロースカラムの順で
の置き換えにより前記手順からは基本的に変化する。簡
単に述べると、濃縮粗４モル抽出物をエタノール(４度)
に加えて８５％最終濃度とする。次いで混合物を遠心分
離し、沈澱を５０ミリモルのトリス、０.１５モルＮaＣ
l、６.０モル尿素に再溶解する。次に、この材料を前記
と同様にヘパリン・セファロースにおいて分画化する。
ヘパリン結合材料を前記と同様にヒドロキシアパタイト
において分画化する。活性フラクションをプールし、濃
縮し、高度分離ゲルろ過において分画化する(６モルの
グアニジニウムクロリド、５０ミリモルのトリス(pＨ
７.２)中ＴＳＫ３００００)。活性フラクションをプー
ルし、０.１％ＴＦＡに対して透析し、次いで前記と同
様にＣ４バイダック逆相カラムにおいて分画化する。調
製物を還元し、アクリルアミドゲルで電気泳動する。１
８Ｋバンドに対応する蛋白質を溶離させ、トリプシンで
消化する。下記のアミノ酸配列を有するトリプシンフラ
グメントが分離される。 フラグメント９:ＳＬＫＰＳＮＨＡＴＩＱＳ？Ｖ フラグメント１０:ＳＦＤＡＹＹＣＳ？Ａ フラグメント１１:ＶＹＰＮＭＴＶＥＳＣＡ フラグメント１２:ＶＤＦＡＤＩ？Ｗ ただし、トリプシン・フラグメント７および８は、実質
的にそれぞれフラグメント１０および９であるものとす
る。 【００３３】Ａ．bＢＭＰ−１ レイズ、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー」、１８３(１):１−１２(１９８５)の方法に従い、
オリゴヌクレオチドのプール(または特有のオリゴヌク
レオチド)を成分とするプローブを設計し、自動ＤＮＡ
シンセサイザーで合成する。一プローブは、下記ヌクレ
オチド配列 TCCTCATCCAGGGCAATGTCGCCCAGGAAGGC を有する比較的長い(３２ヌクレオチド)「ゲスマー」[ツ
ール等、「ネイチャー」、３１２:３４２−３４７(１９８
４)]を成分としている。 遺伝子コードは同義性であるため(複数のコドンが同じ
アミノ酸をコードし得る)、プローブプールにおけるオ
リゴヌクレオチドの数は、真核生物におけるコドン使用
頻度、Ｇ:Ｔ塩基対の相対安定性および真核生物コード
配列におけるジヌクレオチドＣpＧの相対的希少性に基
づいて減らされる[ツール等(前出)参照]。第２セットの
プローブは、アミノ酸をコードし得る可能な配列を全て
含む短いオリゴヌクレオチド(長さ１７ヌクレオチド)に
より構成される。第２セットのプローブは下記配列を有
する。 (a)A [A/G] [A/G] TC [T/C] TC [T/C] TC [A/G] TC [T/
C] AA (b)A [A/G] [A/G] TC [T/C] TC [T/C] TC [A/G] TCNAG 括弧内のヌクレオチドは代替配列である。「Ｎ」はＡ、
Ｔ、ＣまたはＧを意味する。 【００３４】両場合において、プローブ設計に使用され
るアミノ酸配列の領域は、可能ならば高度変性コドンを
避けることにより選択される。オリゴヌクレオチドを自
動ＤＮＡシンセサイザーで合成する。次いで、ポリヌク
レオチドキナーゼおよび32Ｐ−ＡＴＰを用いてプローブ
に放射性標識を行う。これら２セットのプローブを用い
てうしゲノム組換え体ライブラリーをスクリーニングす
る。ライブラリーは次の要領で構築される。うし肝臓Ｄ
ＮＡを制限エンドヌクレアーゼ酵素Ｓau ３Ａにより部
分消化し、ショ糖勾配により沈降させる。次に、１５−
３０キロ塩基の範囲でのサイズ分画ＤＮＡをバクテリオ
ファージＢamＨＩベクターＥＭＢＬ３に結合する[フリ
シャウフ等、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー」、１７０:８２７−８４２(１９８３)]。ライ
ブラリーを１プレート当たり組換え体８０００個の割合
で培養する。プラークの重複ニトロセルロースレプリカ
を作成し、ウー等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナ
イテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、７５:３６８８−
９１(１９７８)の手順の修正法に従い増幅する。 【００３５】３２merプローブを32Ｐ−ガンマ−ＡＴＰ
によりキナーゼ化し、４５℃で５×ＳＳＣ、０.１％Ｓ
ＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌのサーモン精
液ＤＮＡ中１セットのフィルターとハイブリダイゼーシ
ョンし、４５℃で５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳにより洗
浄する。１７merプローブをキナーゼ化し、５０℃で３
モルのテトラメチルアンモニウムクロリド(ＴＭＡＣ)、
０.１モルの燐酸ナトリウム(pＨ６.５)、１ミリモルＥ
ＤＴＡ、５×デンハルツ、０.６％ＳＤＳ、１００μｇ
／ｍｌサーモン精液ＤＮＡ中他のセットのフィルターと
ハイブリダイゼーションし、５０℃で３モルＴＭＡＣ、
５０ミリモルのトリス(pＨ８.０)により洗浄する。これ
らの条件により、１７merプローブプールに対する不適
当な組合わせの検出は最小限となる[ウッド等、「プロシ
ーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステー
ツ・オブ・アメリカ」、８２:１５８５−１５８８(１９
８５)参照]。この方法により４０００００個の組換え体
をスクリーニングし、一デュプリケイト陽性をプラーク
精製する。ラムダbＰ−５０と称するこの組換え体バク
テリオファージのプレートリゼイトからＤＮＡを分離す
る。bＰ−５０は、１９８６年１２月１６日に受託番号
４０２９５としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション(アメリカ合衆国メリーランド、ロックビ
ル、パークローン・ドライブ１２３０１)(以後「ＡＴＣ
Ｃ」と称す)に寄託された。この寄託物およびこの明細書
に含まれる他の寄託物は、特許手続きを目的とする微生
物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約およびそ
の下での規則の必要条件を満たしている。このbＰ−５
０クローンは、bＢＭＰ−１と称するうし骨成長因子の
少なくとも一部をコードする。 【００３６】このbＢＭＰ−１クローンのオリゴヌクレ
オチド・ハイブリダイゼーション領域は、Ｍ１３中にサ
ブクローン化され、標準技術により配列された約８００
bpのＥcoＲＩフラグメントに対して局在している。ラム
ダbＰ−５０の部分的ＤＮＡ配列および誘導されたアミ
ノ酸配列を下記第２表に示す。牛骨２８〜３０kd材料か
ら分離されたトリプシンフラグメントに対応するアミノ
酸配列は、第２表の下線部である。この配列の最初の下
線部分は、オリゴヌクレオチドプローブが設計される上
記トリプシンフラグメント１に対応する。第二の下線部
分は、上記トリプシンフラグメント２に対応する。予測
されたアミノ酸配列は、トリプシンの特異性を考慮して
予想した通り、塩基性残基(Ｒ)がトリプシンフラグメン
ト２の前にあることを示す。第２表におけるヌクレオチ
ド位置＃２９２−２９３のカップレットＣＴに先行する
核酸配列は、コンセンサス受容配列(すなわち、ピリミ
ジン濃厚域、ＴＣＴＣＴＣＴＣＣ、次にＡＧ)の存在お
よび誘導されたアミノ酸配列の適当な位置における塩基
性残基の欠如に基づきイントロン(非コード配列)である
と思われる。このbＢＭＰ−１ゲノム配列は第２表にお
いて明白である。このゲノムクローンからの推定に基づ
くbＢＭＰ−１ペプチド配列は３７アミノ酸長であり、
第２表におけるヌクレオチド＃２９４〜＃４０４のＤＮ
Ａ配列によりコードされる。 【００３７】 【表２】【００３８】Ｂ．bＢＭＰ−２ フラグメント３のアミノ酸配列に基づき、オリゴヌクレ
オチドのプールを成分とする２種のプローブを設計し、
前記と同様に自動ＤＮＡシンセサイザーで合成する。 プローブ＃1:ＡＣＮＡＣＣＡＴ[Ａ/Ｇ]ＴＣ[Ｔ/Ｃ]ＴＧ
[Ａ/Ｇ]AＴプローブ＃２:ＣＡ[Ａ／Ｇ]ＧＡ[Ｔ／Ｃ]Ａ
ＴＧＧＴＮＧＴＮＧＡ これらのプローブを放射性標識し、これらを用いて、Ａ
項の記載に従い(ただし、ベクターはラムダＪ１ＢamＨ
１armsである)構築されたうしゲノムライブラリーをス
クリーニングする[ムリンズ等、「ネイチャー」、３０８:
８５６−８５８(１９８４)]。放射性標識１７−merプロ
ーブ＃１を、Ａ項記載の１７merプローブに関する方法
によるフィルターのセットとハイブリダイゼーションす
る。上記Ａ項記載の手順により４０００００個の組換え
体をスクリーニングする。一デュプリケイト陽性をプラ
ーク精製し、ＤＮＡを、ラムダbＰ−２１と称する組換
えバクテリオファージの培養リゼイトから分離する。バ
クテリオファージbＰ−２１は、１９８７年３月６日に
ＡＴＣＣ４０３１０の受託番号でＡＴＣＣに寄託され
た。bＰ−２１クローンは、bＢＭＰ−２と称するうし成
長因子をコードする。 【００３９】このbＢＭＰ−２クローンのオリゴヌクレ
オチド・ハイブリダイゼーション領域は、Ｍ１３中にサ
ブクローン化され、標準技術により配列決定された約
１.２キロ塩基のＳacＩ制限フラグメントに対して局在
する。このＳacＩフラグメントおよびbＰ−２１の隣接
ＨindIII−ＳacＩ制限フラグメントの部分的ＤＮＡ配列
および誘導されたアミノ酸配列を下記第３表に示す。こ
のクローンからのbＢＭＰ−２ペプチド配列は１２９ア
ミノ酸長であり、ヌクレオチド＃１〜ヌクレオチド＃３
８７のＤＮＡ配列によりコードされる。牛骨２８〜３０
kd材料から分離されたトリプシンフラグメントに対応す
るアミノ酸配列は、第３表の下線部である。この配列の
下線部分は、bＢＭＰ−２に関するオリゴヌクレオチド
プローブが設計される上記トリプシンフラグメント３に
対応する。予測されたアミノ酸配列は、トリプシンの特
異性を考慮して予想した通り、塩基性残基(Ｋ)がトリプ
シンフラグメント３の前にあることを示す。ＣＧＴトリ
プレットによりコードされるアルギニン残基は、それに
隣接する停止コドン(ＴＡＧ)の存在に基づき恐らく蛋白
質のカルボキシ末端であると思われる。 【００４０】 【表３】【００４１】Ｃ．bＢＭＰ−３ トリプシンフラグメント９(プローブ＃３)、１０(プロ
ーブ＃２)および１１(フ゜ロ-フ゛#1)のアミノ酸配列に基づい
て、オリゴヌクレオチドのプールを成分とするプローブ
を設計し、自動ＤＮＡシンセサイザーで合成する。 プローブ＃１:ＡＣＮＧＴＣＡＴ[Ａ／Ｇ]ＴＴＮＧＧ[Ａ
／Ｇ]ＴＡ プローブ＃２:ＣＡ[Ａ／Ｇ]ＴＡ[Ａ／Ｇ]ＴＡＮＧＣ[Ａ
／Ｇ]ＴＣ[Ａ／Ｇ]ＡＡ プローブ＃３:ＴＧ[Ａ／Ｇ／Ｔ]ＡＴＮＧＴＮＧＣ[Ａ／
Ｇ]ＴＧ[Ａ／Ｇ]ＴＴ 上記Ａ項で詳述したＴＭＡＣハイブリダイゼーション方
法により、ＥＭＢＬ３において構築された組換えうしゲ
ノムライブラリーをスクリーニングする。４０００００
個の組換え体を32Ｐで標識されたプローブ＃１により繰
り返しスクリーニングする。このプローブとハイブリダ
イゼーションした組換え体は全て二次培養として再培養
される。トリプリケイト・ニトロセルロース・レプリカ
は二次培養物から成り、前記と同様に増幅される。３セ
ットのフィルターを再びＴＭＡＣ条件下でプローブ＃
１、＃２および＃３とハイブリダイゼーションする。一
クローン、ラムダbＰ−８１９は３種のプローブ全てと
ハイブリダイゼーションする。これをプラーク精製し、
ＤＮＡをプレートリゼイトから分離する。バクテリオフ
ァージ ラムダbＰ−８１９は、１９８７年６月１６日に
ＡＴＣＣ４０３４４の受託番号下でＡＴＣＣに寄託され
た。このbＰ−８１９クローンは、bＢＭＰ−３と称する
うし骨成長因子をコードする。 【００４２】プローブ＃２とハイブリダイゼーションす
るbＰ−８１９の領域は局在して配列している。この領
域の部分的ＤＮＡおよび誘導されたアミノ酸配列を第４
Ａ表に示す。トリプシンフラグメント１０および１２に
対応するアミノ酸配列は下線部である。最初の下線部の
配列はフラグメント１２に対応し、第２の下線部の配列
はフラグメント１０に対応する。従って、プローブ＃２
とハイブリダイゼーションするbＰ−８１９のこの領域
は、少なくとも１１１個のアミノ酸をコードする。この
アミノ酸配列は、ヌクレオチド＃４１４〜＃７４６のＤ
ＮＡ配列によりコードされる。 【００４３】 【表４】 【００４４】プローブ＃１および＃３とハイブリダイゼ
ーションするbＰ−８１９の領域は局在して配列してい
る。この領域の部分的ＤＮＡおよび誘導されたアミノ酸
配列を第４Ｂ表に示す。トリプシンフラグメント９およ
び１１に対応するアミノ酸配列は下線部である。最初の
下線部の配列はフラグメント９に対応し、第２の下線部
の配列はフラグメント１１に対応する。プローブ＃１お
よび＃３とハイブリダイゼーションするbＰ−８１９の
この領域のペプチド配列は、第４Ｂ表のヌクレオチド＃
３０５〜＃４９３によりコードされる長さ６４個のアミ
ノ酸である。ＡＧＡトリプレットによりコードされるア
ルギニン残基は、それに隣接する停止コドン(ＴＡＡ)の
存在に基づき蛋白質のカルボキシ末端であると思われ
る。カップレットＴＣ(３０５−３０６位)に先行する核
酸配列は、コンセンサス受容配列(すなわち、ピリミジ
ン濃厚域、ＴＴＣＴＣＣＣＴＴＴＴＣＧＴＴＣＣＴ、次
にＡＧ)の存在および誘導されたアミノ酸配列の適当な
位置における塩基性残基以外の停止配列の存在に基づき
イントロン(非コード配列)であると思われる。 【００４５】従って、bＢＭＰ−３は、第４Ａ表および
第４Ｂ表のＤＮＡおよびアミノ酸配列を有することを特
徴とする。このクローンのペプチド配列は１７４アミノ
酸長であり、第４Ａ表のヌクレオチド＃４１４〜ヌクレ
オチド＃７４６および第４Ｂ表のヌクレオチド＃３０５
〜ヌクレオチド＃４９３のＤＮＡ配列によりコードされ
る。 【００４６】 【表５】【００４７】実施例５ ひと骨誘導因子 Ａ．hＢＭＰ−１ うしおよびひとの骨成長因子遺伝子は著しく相同性を示
すと思われるため、第２表のうしbＢＭＰ−１ ＤＮＡ配
列(またはその一部分)をプローブとして用いることによ
り、ひと遺伝子ライブラリーをスクリーニングする。う
しゲノムクローンの８００bp ＥcoＲＩフラグメントを
ニック翻訳により32Ｐで標識する。ひとゲノムライブラ
リー(ツール等、前出)を、１プレート当たり組換え体４
００００個の割合で２０プレートにおいて培養する。デ
ュプリケイト・ニトロセルロースフィルター・レプリカ
は、各プレートで構成されており、５０℃で約１４時間
５×ＳＳＣ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌ変性サ
ーモン精液ＤＮＡ、０.１％ＳＤＳ(標準ハイブリダイゼ
ーション溶液)中ニック翻訳プローブとハイブリダイゼ
ーションされる。次いで、フィルターを５０℃で１×Ｓ
ＳＣ、０.１％ＳＤＳにより洗浄し、オートラジオグラ
フィーに付す。５つのデュプリケイト陽性を分離し、プ
ラーク精製する。これらの組換えバクテリオファージの
うちの１種、ＬＰ−Ｈ１のプレート・リゼイトからＤＮ
Ａを得る。ＬＰ−Ｈ１は１９８７年３月６日にＡＴＣＣ
に寄託された(受託番号４０３１１)。このクローンは、
hＢＭＰ−１というひとゲノム骨成長因子の少なくとも
一部分をコードする。ＬＰ−Ｈ１のハイブリダイゼーシ
ョン領域は、２.５キロ塩基ＸbaＩ／ＨindIII制限フラ
グメントに対して局在している。 【００４８】ラムダＬＰ−Ｈ１の部分的ＤＮＡ配列およ
び誘導されたアミノ酸配列を下記第５表に示す。このク
ローンからのペプチド配列は３７アミノ酸長であり、ヌ
クレオチド＃３４４０〜ヌクレオチド＃３５５０のＤＮ
Ａ配列によりコードされる。第５表のコード配列の側面
には、約２８個のヌクレオチド(推定に基づく５'非コー
ド配列)および約１９個のヌクレオチド(推定に基づく
３'非コード配列)が存在する。第２表のbＢＭＰ−１配
列と第５表のhＢＭＰ−１ゲノム配列とを比較すると、
両配列間に顕著な相同性の存在することが示される。コ
ード領域のサイズおよび非コード領域の位置は、一般に
異なる種類の相同性遺伝子においても保持されているた
め、骨誘導因子遺伝子のコードおよび非コード領域の配
置は同定され得る。相同部位においてシグナルを生じる
ＲＮＡが側面に位置する、２種類の遺伝子間の相同性領
域は、コード領域を示す。 【００４９】 【表６】【００５０】第５表に示されたひとコード配列に特異的
なプローブを用いることにより、骨誘導因子を合成する
ひとセルラインまたは組織を同定する。このプローブは
次の方法に従い作成される。下記配列 (a)GGGAATTCTGCCTTTCTTGGGGACATTGCCCTGGACGAAGAGGACCT
GAG (b)CGGGATCCGTCTGAGATCCACAGCCTGCTGTACCTGGAAGGCCCTCA
GG を有する２種のオリゴヌクレオチドを自動シンセサイザ
ーで合成し、アニーリングし、エシェリヒア・コリＤＮ
ＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメントを用いて広
げ、制限酵素ＥcoＲＩおよびＢamＨＩにより消化し、Ｍ
１３ベクターに挿入する。次に、一本鎖32Ｐ標識プロー
ブは、標準技術によりこのサブクローンの鋳型調製物に
より作成される。ツール等の方法(前出)により、様々な
細胞および組織供給源由来のポリアデニル化ＲＮＡをホ
ルムアルデヒド-アガロースゲルにより電気泳動させ、
ニトロセルロースに移動させる。次いで、このプローブ
を、４２℃で一夜５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、
０.１％ＳＤＳ、４０ミリモルの燐酸ナトリウム(pＨ６.
５)、１００μｇ／ｍｌの変性サーモン精液ＤＮＡおよ
び５ミリモルのバナジルリボヌクレオシド中ニトロセル
ロース・ブロットとハイブリダイゼーションし、０.２
×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中６５℃で洗浄する。オート
ラジオグラフィーによると、ひと骨肉腫セルラインＵ−
２ ＯＳ由来のＲＮＡを含むレーンは、約４.３および
３.０キロ塩基のＲＮＡ種に対応するハイブリダイゼー
ション・バンドを含んでいる。 【００５１】cＤＮＡをＵ−２ ＯＳポリアデニル化ＲＮ
Ａから合成し、確立された技術により(ツール等、前出)
ラムダgt１０にクローン化する。このライブラリーから
の組換え体２００００個を５０プレートの各々において
培養する。デュプリケイト・ニトロセルロース・レプリ
カはこれらのプレートで構成される。前記オリゴヌクレ
オチドを32Ｐ−ガンマ−ＡＴＰによりキナーゼ化し、５
５℃で一夜標準ハイブリダイゼーション溶液中で２セッ
トのレプリカとハイブリダイゼーションする。次いで、
フィルターを５５℃で１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳによ
り洗浄し、オートラジオグラフィーに付す。ラムダＵ２
ＯＳ−１と称する一デュプリケイト陽性をプラーク精製
する。ラムダＵ２ＯＳ−１は１９８７年６月１６日にＡ
ＴＣＣに寄託された(受託番号４０３４３)。ラムダＵ２
ＯＳ−１の挿入体の全ヌクレオチド配列および誘導され
たアミノ酸配列を第６表に示す。このcＤＮＡクローン
は、分泌された蛋白質特有の疎水性リーダー配列が後に
続くメチオニンをコードし、ヌクレオチド位２２２６−
２２２８の停止コドンを含む。このクローンは、このア
ミノ酸配列に基づき分子量og８３キロダルトンを有する
７３０個のアミノ酸で構成される蛋白質をコードする、
２１９０bpのオープン・リーディング・フレームを含
む。このクローンは、第５表に示したコード領域と同じ
配列を含む。この蛋白質は、分泌後開裂してhＢＭＰ−
１蛋白質を生成する一次翻訳産物を示すと考えられる。
従って、このクローンは、ゲノムhＢＭＰ−１配列ラム
ダＬＰ−Ｈ１に含まれるひと遺伝子フラグメントに対応
するhＢＭＰ−１のcＤＮＡである。ただし、ＢＭＰ−１
のアミノ酸＃５５０〜＃５９０は、表皮成長因子並びに
プロテインＣ、第X因子および第IX因子の「成長因子」領
域と相同性である。 【００５２】 【表７】【表８】【表９】【表１０】【００５３】Ｂ．hＢＭＰ−２:クラスＩおよびII 実施例４Ｂ記載のＨindIII−ＳacＩうしゲノムbＢＭＰ
−２フラグメントをＭ１３ベクターにサブクローンす
る。32Ｐ−標識一本鎖ＤＮＡプローブは、このサブクロ
ーンの鋳型調製物から作成される。このプローブを用い
ることにより、Ａ項で前述された様々な細胞および組織
供給源由来のポリアデニル化ＲＮＡをスクリーニングす
る。約３.８キロ塩基のmＲＮＡ種に対応するハイブリダ
イゼーション・バンドは、ひとセルラインＵ−２ ＯＳ
由来のＲＮＡを含むレーンにおいて検出される。ＨindI
II−ＳacＩフラグメントをニック翻訳により32Ｐで標識
し、これを用いて、６５℃で一夜標準ハイブリダイゼー
ション緩衝液中でハイブリダイゼーションし、次いで６
５℃で１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳにより洗浄すること
により、前記Ｕ−２ ＯＳcＤＮＡライブラリーのニトロ
セルロース・フィルター・レプリカをスクリーニングす
る。１２個のデュプリケイト陽性クローンを取り上げ、
二次培養として再培養する。デュプリケイト・ニトロセ
ルロース・レプリカは二次培養物から成り、一次スクリ
ーニングを行なった場合と同様に両セット共うしゲノム
プローブとハイブリダイゼーションされる。次いで６５
°で一方のセットのフィルターを１×ＳＳＣ、０.１％
ＳＤＳで洗浄し、他方のセットを０.１×ＳＳＣ、０.１
％ＳＤＳで洗浄する。 【００５４】２クラスのhＢＭＰ−２ cＤＮＡクローン
は、高いストリンジェント洗浄条件下(０.１×ＳＳＣ、
０.１％ＳＤＳ)において、強い(４組換え体)または弱い
(７組換え体)ハイブリダイゼーション・シグナルに基づ
き明白である。１１組換えバクテリオファージ全部をプ
ラーク精製し、小規模ＤＮＡ調製物を各々の培養リゼイ
トから作成し、配列分析用に挿入体をpＳＰ６５および
Ｍ１３にサブクローン化する。hＢＭＰ−２・クラスＩ
と称する(ＢＭＰ−２としても知られている)強いハイブ
リダイゼーションクローンの配列分析は、それらが第３
表に示された配列と強い配列相同性を有することを示
す。従ってこれらのクローンは、bＢＭＰ−２遺伝子(こ
の部分配列は第３表に示されている)によりコードされ
る蛋白質のひと均等蛋白質をコードするcＤＮＡであ
る。hＢＭＰ−２・クラスIIと称する(ＢＭＰ−４として
も知られている)弱いハイブリダイゼーション組換え体
の配列分析は、それらもまた、それらのコード領域の
３'末端において第３表に示した配列と全く相同性であ
る(ただし、さらに大きい５'領域ではそれほどではな
い)ことを示す。すなわち、それらは、同一ではない
が、前記構造との類似構造を有するひと蛋白質をコード
する。 【００５５】完全長のhＢＭＰ−２・クラスＩcＤＮＡク
ローンも同様の方法で得られる。クラスIIサブクローン
の１つ(II−１０−１)の１.５キロ塩基挿入体を分離
し、ニック翻訳により放射性標識する。上記でスクリー
ニングされたＵ−２ ＯＳ cＤＮＡライブラリーのニト
ロセルロース・レプリカ(５０フィルター、１００００
００組換え体バクテリオファージに対応)の１セット
を、ストリンジェント条件下(標準ハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液中６５°でハイブリダイゼーション、６５°
で０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで洗浄)でこのプロー
ブとハイブリダイゼーションする。クラスIIプローブと
はハイブリダイゼーションしないうしゲノムプローブと
ハイブリダイゼーションする組換え体全部を選び取り、
プラーク精製する(１０組換え体)。プレートのストック
を作り、小規模バクテリオファージＤＮＡ調製物を作成
する。Ｍ１３へのサブクローニング後、配列分析は、こ
れらのうち４つが元のクラスＩクローンと部分的に一致
するクローンを表すことを示す。これらの中の１つ、ラ
ムダＵ２ＯＳ−３９は、約１.５キロ塩基の挿入体を含
んでおり、１９８７年６月１６日付けでＡＴＣＣに寄託
された(受託番号４０３４５)。部分的ＤＮＡ配列(ラム
ダＵ２ＯＳ−３９および幾つかの他のhＢＭＰ−２クラ
スＩcＤＮＡ組換え体から編集された)および誘導された
アミノ酸配列を下記第７表に示す。ラムダＵ２ＯＳ−３
９は、その部分配列が第３表に示されているうし遺伝子
セグメントによりコードされる蛋白質ＢＭＰ−２のひと
対応部全体をコードするのに必要なヌクレオチド配列を
全て含むものと予想される。このひとcＤＮＡ hＢＭＰ
−２クラスＩは、３９６個のアミノ酸から成る蛋白質を
コードする、１１８８bpのオープン・リーディング・フ
レームを含む。３９６個のアミノ酸から成るこの蛋白質
は、このアミノ酸配列に基づき４５キロダルトンの分子
量を有する。この配列は、一次翻訳産物を表すものと考
えられる。全フレームにおいて停止コドンを有する３４
２bpの５'未翻訳領域がこの蛋白質に先行する。この５'
未翻訳領域に先行する１３bp領域は、cＤＮＡクローニ
ング方法で使用されるリンカーを表す。 【００５６】 【表１１】 【表１２】【表１３】 【００５７】完全な長さのhＢＭＰ−２・クラスIIひとc
ＤＮＡクローンは、次の要領で得られる。クラスII組換
えII−１０−１の５'端部からの２００bp ＥcoＲＩ−Ｓ
acＩフラグメントをそのプラスミド・サブクローンから
分離し、ニック翻訳により標識し、Ｕ−２ ＯＳ cＤ
ＮＡライブラリー(２５フィルター／セット、５０００
００個の組換え体を示す)の１セットのデュプリケイト
・ニトロセルロース・レプリカとハイブリダイゼーショ
ンする。前記ストリンジェント条件下でハイブリダイゼ
ーションおよび洗浄を行う。１６デュプリケイト陽性を
選び取り、二次培養として再培養する。二次培養のニト
ロセルロース・フィルター・レプリカを作成し、II−１
０−１の配列と対応すべく合成された、下記配列 CGGGCGCTCAGGATACTCAAGACCAGTGCTG を有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション
する。５０℃で標準ハイブリダイゼーション緩衝液中で
ハイブリダイゼーションし、１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤ
Ｓにより５０°で洗浄する。このオリゴヌクレオチドと
ハイブリダイゼーションする１４組換えバクテリオファ
ージをプラーク精製する。プラーク・ストックを作り、
小規模バクテリオファージＤＮＡ調製物を作成する。こ
れらの中の３つをＭ１３にサブクローニング後、配列分
析は、それらが元のクラスIIクラスと部分的に一致する
クローンを表すことを示す。これらの中の１つ、ラムダ
Ｕ２ＯＳ−３は１９８７年６月１６日付けでＡＴＣＣに
寄託された(受託番号４０３４２)。Ｕ２ＯＳ−３は約
１.８キロ塩基の挿入体を含む。Ｕ２ＯＳ−３の部分的
ＤＮＡ配列および誘導されたアミノ酸配列を下記第８表
に示す。このクローンは、全ひとＢＭＰ−２・クラスII
蛋白質をコードするのに必要なヌクレオチド配列の全て
を含むものと予想される。このcＤＮＡは、全フレーム
において停止コドンを有する３９４bpの５'未翻訳領域
が先行し、４０８個のアミノ酸から成る蛋白質をコード
する、１２２４bpのオープン・リーディング・フレーム
を含み、イン-フレーム停止コドンの後に３０８bpの３'
未翻訳領域を含む。５'未翻訳領域に先行する８bp領域
は、cＤＮＡクローニング方法で使用されるリンカーを
表す。４０８個のアミノ酸から成る蛋白質は４７キロダ
ルトンの分子量を有し、一次翻訳産物を表すものと考え
られる。 【００５８】 【表１４】【表１５】【表１６】【００５９】第３、４、７および８表に示されたＢＭＰ
−２・クラスＩおよびII並びにＢＭＰ−３の配列は、イ
ンヒビンのベータ(Ｂ)(InhβB)およびベータ(Ａ)(Inhβ
A)サブユニットと顕著な相同性を有する。インヒビン
は、避妊における使用に関して現在研究されているホル
モンの一種である。メゾン等、「ネイチャー」、３１８:
６５９−６６３(１９８５)参照。さらに範囲を狭める
と、それらはまた、ムレリアン阻害物質(ＭＩＳ)、雄性
胚の成長中におけるムレリアン導管の退行を誘発する精
巣性糖蛋白質、および細胞の成長を阻害または刺激し
得、またはそれらを分化させ得る形質転換成長因子−ベ
ータ(ＴＧＦβ)とも相同性を呈する。さらに、hＢＭＰ
−２・クラスＩ、クラスIIをコードする第７表および第
８表の配列は、ドロソフィラ・デカペンタプレジック
(ＤＰＰ−Ｃ)遺伝子座転写体と顕著な相同性を有する。
マッサーグ、「セル」、４９:４３７−４３８(１９８
７)、パジェット等、「ネイチャー」、３２５:８１−８４
(１９８７)、ケート等、「セル」、４５:６８５−６９８
(１９８６)参照。従って、ＢＭＰ−２が、この発生的突
然変異遺伝子座からのこの転写体から作られた蛋白質の
ひと相同体であり得ることが考えられる。以下、これら
の相同性を第９表により示す。 【００６０】 【表１７】【００６１】Ｃ．ＢＭＰ−３ うしおよびひとの骨成長因子遺伝子が顕著な相同性を有
すると思われるため、第４Ａ表および第４Ｂ表のうしＤ
ＮＡ配列とハイブリダイゼーションすることが示された
オリゴヌクレオチド・プローブを用いてひとゲノム・ラ
イブラリーをスクリーニングする。これらのプローブを
用いてひとゲノムライブラリー(ツール等、前出)をスク
リーニングし、仮定的陽性を分離すると、前記と同様に
ＤＮＡ配列が得られる。この組換え体がひと骨誘導因子
分子の一部をコードするという証拠は、うし／ひと蛋白
質および遺伝子構造相同性に存する。一旦ひとＢＭＰ−
３分子の一部をコードするＤＮＡを含む組換えバクテリ
オファージが得られると、実施例５(Ａ)の記載と同様に
ひとコード配列をプローブとして用いることにより、Ｂ
ＭＰ−３を合成するひとセルラインまたは組織を同定す
る。mＲＮＡをオリゴ(dＴ)セルロース・クロマトグラフ
ィーにより選択し、cＤＮＡを確立された技術により(ツ
ール等、前出)合成し、ラムダgt１０においてクローン
化する。 【００６２】別法として、このひと骨誘導因子をコード
する全遺伝子は、必要ならば追加の組換えクローンにお
いて同定および生成され得る。このひと骨誘導因子遺伝
子のさらに別の３'または５'領域を含む追加の組換え体
は、元のクローンの端部(複数も可)における独特のＤＮ
Ａ配列を同定し、これらをプローブに用いてひとゲノム
ライブラリーを再スクリーニングすることにより生産さ
れ得る。次いで、この遺伝子は、標準的分子生物学技術
により単一プラスミドにおいて再会合され、細菌におい
て増幅され得る。次に、全ひとＢＭＰ−３因子遺伝子は
適当な発現ベクターに移入され得る。次いで、この遺伝
子を含む発現ベクターによりほ乳類細胞、例えばさるＣ
ＯＳ細胞をトランスフェクションし、その細胞において
ひと遺伝子が転写され、ＲＮＡは正確にスプライシング
される。トランスフェクションされた細胞の培地を、遺
伝子が完全であることの指標としてこの明細書に記載さ
れた骨誘導因子活性に関して検定する。これらの細胞か
らmＲＮＡを得、このmＲＮＡ供給源からcＤＮＡを合成
し、クローン化する。同様に上記方法を用い、プローブ
供給源としてうし骨誘導因子および／またはひと骨誘導
因子を利用することにより、興味の対象である他の種類
の骨誘導因子を分離することが可能である。これらの他
の種類の骨誘導因子は、特に骨折修復において似た有用
性を有し得る。 【００６３】実施例６ 骨誘導因子の発現 うし、ひとまたは他のほ乳類の骨誘導因子を製造するた
めに、常用的遺伝子工学技術により、それをコードする
ＤＮＡを適当な発現ベクターに移入し、ほ乳類細胞に導
入する。当業界の熟練者であれば、第２〜８表の配列ま
たは他の修飾配列並びに既知ベクター、例えばpＣＤ[岡
山等、「モル．セル・バイオル.」、２:１６１−１７０
(１９８２)]およびpＪＬ３、pＪＬ４[ゴフ等、「ＥＭＢ
Ｏ・ジャーナル」、４:６４５−６５３(１９８５)]を用
いることによるほ乳類発現ベクターの構築は可能であ
る。これらのベクターを用いた適当な宿主細胞の形質転
換により、骨誘導因子が発現され得る。当業界の熟練者
であれば、コード配列の側面に位置するほ乳類調節配列
を削除またはこれを細菌性配列と置き換えることにより
第２〜８表の配列を操作し、細菌細胞による細胞内また
は細胞外発現用細菌性ベクターを構築することが可能で
ある。例えば、コード配列はさらに操作(例、他の既知
リンカーと結合または他の公知技術によるそこからの非
コード配列の欠失もしくは存在するヌクレオチドの改編
による修飾)され得る。次いで、修飾骨誘導因子コード
配列は、例えば谷口等、「プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・
オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリ
カ」、７７:５２３０−５２３３(１９８０)に記載された
方法を用いて既知細菌性ベクターに挿入され得る。次い
で、この実例的細菌性ベクターにより細菌宿主細胞を形
質転換し、骨誘導因子を発現させ得る。細菌細胞におけ
る骨誘導因子の細胞外発現の実施戦略については、例え
ばヨーロッパ特許出願ＥＰＡ１７７３４３を参照。 【００６４】昆虫細胞で発現させる昆虫性ベクターの構
築についても同様の操作が実施され得る[例えば、公開
されたヨーロッパ特許出願１５５４７６記載の方法を参
照]。酵母ベクターもまた、酵母細胞によるこの発明の
因子の細胞内または細胞外発現を目的とする酵母調節配
列を用いて構築され得る。[例えば、公開ＰＣＴ出願Ｗ
Ｏ８６／００６３９およびヨーロッパ特許出願ＥＰＡ１
２３２８９参照]。ほ乳類細胞から高レベルの本発明骨
誘導因子を製造する方法は、異種骨誘導因子遺伝子の多
数のコピーを含む細胞の構築を含む。異種遺伝子は、増
幅可能なマーカー、例えばジヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨ
ＦＲ)遺伝子(この場合、カウフマンおよびシャープ、
「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」、１
５９:６０１−６２９(１９８２)の方法に従い、多量の
遺伝子コピーを含む細胞が、メトトレキセート(ＭＴＸ)
の高濃縮液における伸長に関して選択され得る)に結合
され得る。この方法は幾つかの異なる細胞タイプにより
使用され得る。例えば、この発明の骨誘導因子に関する
ＤＮＡ配列を含むプラスミドは、その発現を可能にする
他のプラスミド配列およびＤＨＦＲ発現プラスミドpＡd
Ａ２６ＳＶ(Ａ)３[カウフマンおよびシャープ、「モレキ
ュラー・アンド・セルラー・バイオロジー」、２:１３０
４(１９８２)]と効果的に組合わされて、燐酸カルシウ
ム共沈澱およびトランスフェクションによりＤＨＦＲ−
欠失ＣＨＯ細胞、ＤＵＫＸ−ＢＩＩ中に共に導入され得
る。ＤＨＦＲ発現形質転換体を、透析うし胎児血清を含
むアルファ培地での成長に関して選択し、続いてＭＴＸ
高濃縮液(０.０２、０.２、１.０および５マイクロモル
のＭＴＸにおける連続段階)での成長による増幅に関し
て選択する[カウフマン等、「モレキュラー・アンド・セ
ラー・バイオロジー」、５:１７５０(１９８３)の記載に
よる]。形質転換体をクローン化し、ラット骨形成検定
により生物学的活性骨誘導因子発現をモニターする。骨
誘導因子発現はＭＴＸ耐性のレベルが高くなると、増加
すべきである。同様の方法は、他の骨誘導因子の製造に
も使用され得る。 【００６５】別法として、ひと遺伝子は前記に従い直接
的に発現される。活性骨誘導因子は細菌または酵母細胞
において製造され得る。しかしながら、生物学的活性組
換えひと骨誘導因子に対して現在好ましい発現系は、安
定して形質転換されたＣＨＯ細胞である。一実施態様と
して、実施例５のひと骨誘導因子(hＢＭＰ−１)を製造
するためには、ＳalＩ消化によりＵ２ＯＳ−１の挿入体
をベクターarmsから放出させ、ＸhoＩにより消化された
ほ乳類発現ベクターpＭＴ２ＣＸにサブクローン化す
る。ＤＥＡＥ−デキストラン方法を用いて[ソンパイラ
ックおよびダンナ、「ＰＮＡＳ」、７８:７５７５−７５
７８(１９８１)、ルトマンおよびマグヌッソン、「ニュ
クレイック・アシッズ・リサーチ」、１１:１２９５−１
３０８(１９８３)]、このサブクローンからのプラスミ
ドＤＮＡによりＣＯＳ細胞をトランスフェクションす
る。血清不含有２４時間条件培地を細胞から集める(ト
ランスフェクションの４０−７０時間後開始)。ほ乳類
発現ベクターpＭＴ２ Ｃla−Ｘho(pＭＴ２ＣＸ)は、p９
１０２３(b)(ウォング等、「サイエンス」、２２８:８１
０−８１４、１９８５年)の誘導体であり、後者がテト
ラサイクリン耐性遺伝子ではなくアンピシリン耐性遺伝
子を含み、さらにcＤＮＡクローンの挿入に関するＸho
Ｉ部位を含む点で相異する。pＭＴ２Ｃla−Ｘhoの機能
的要素については既に記載されており(カウフマン、１
９８５年、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナ
イテッド・ステーツ・オブ・アメリカ、８２:６８９−
６９３)、アデノウイルスＶＡ遺伝子、７２bpエンハン
サーを含むＳＶ４０複製開始点、５'スプライス部位を
含むアデノウイルス主後期プロモーターおよびアデノウ
イルス三部分リーダー配列の大部分(アデノウイルス後
期mＲＮＡに存在)、３'スプライス受容部位、ＤＨＦＲ
挿入体、ＳＶ４０早期ポリアデニレーション部位(ＳＶ
４０)並びにエシェリヒア・コリにおける伸長に必要と
されるpＢＲ３２２配列が含まれる。 【００６６】プラスミドpＭＴ２ Ｃla−Ｘhoは、pＭＴ
２−ＶＷＦのＥcoＲＩ消化により得られる[アメリカ合
衆国、メリーランド、ロックビルのアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション(ＡＴＣＣ)に寄託された
(受託番号ＡＴＣＣ６７１２２)]。ＥcoＲＩ消化によりp
ＭＴ２−ＶＷＦに存在するcＤＮＡ挿入体が切除され、
線状形態のpＭＴ２が生成する。これを結合して用いる
ことにより、エシェリヒア・コリＨＢ１０１またはＤＨ
−５をアンピシリン耐性に形質転換することができる。
プラスミドpＭＴ２ ＤＮＡは常法により製造され得る。
次に、pＭＴ２をＥcoＲＶおよびＸbaＩで消化し、消化
されたＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラ
グメントで処理し、Ｃlaリンカー(ネバイオラブズ、Ｃ
ＡＴＣＧＡＴＧ)を結合することによりpＭＴ２ＣＸが構
築される。これは、ＳＶ４０複製開始点付近のＨindIII
部位から出発する塩基２２６６〜２４２１およびpＭＴ
２のエンハンサー配列を除く。次に、プラスミドＤＮＡ
をＥcoＲＩで消化し、前記と同様にブラント化し、Ｅco
ＲＩアダプターに結合し、 ５' ＰＯ4−ＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴ ３' ３' ＧＧＡＧＣＴＣＴＣＧＡ ５' ＸhoＩで消化し、結合することによりpＭＴ２ Ｃla−Ｘ
hoが得られ、次いでこれを用いてエシェリヒア・コリを
アンピシリン耐性に形質転換することができる。プラス
ミドpＭＴ２ Ｃla−Ｘho ＤＮＡは常法により製造され
得る。得られた骨誘導因子は、通常の蛋白質分離・精製
法によって分離及び精製される。これらの方法に特に限
定はなく、ゲル濾過法、アフィニティークロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマト
グラフィー、ＨＰＬＣ等を組み合わせて用いることがで
きる。分離・精製は、ラット骨形成検定による生物学的
活性および／または抽出ウシ骨誘導因子の特性検定結果
等を指標として効率的に用い得る。 【００６７】実施例７ 発現した骨誘導因子の生物学的活性 Ａ．ＢＭＰ−１ 上記実施例６で得られた発現した骨誘導因子(hＢＭＰ−
１)の生物学的活性を測定する。因子をヘパリン・セフ
ァロースカラムにおいて部分的に精製する。１枚の１０
０ｍｍ皿から得たトランスフェクション上清４ｍｌを、
ＹＭ１０膜を用いた限外ろ過により約１０倍に濃縮し、
次いで２０ミリモルのトリス、０.１５モルＮaＣｌ(pＨ
７.４)(出発緩衝液)に対して透析する。次に、この材料
を出発緩衝液中１.１ｍｌヘパリン・セファロースカラ
ムに適用する。出発緩衝液の８ｍｌ洗浄液により未結合
蛋白質を除去し、２０ミリモルのトリス、２.０モルＮa
Ｃｌ(pＨ７.４)の３−４ｍｌ洗浄液によりＢＭＰ−１を
含む結合蛋白質を脱着させる。ヘパリンカラムにより結
合した蛋白質をセントリコン１０において約１０倍に濃
縮し、０.１％トリフルオロ酢酸を用いてジアフィルト
レーションすることにより塩を還元する。この溶液の適
量を２０ｍｇのラットマトリックスと混合し、次いで前
記実施例３の記載に従いインビボ骨および軟骨形成に関
して検定する。ＭＯＣＫ(モック)トランスフェクション
上清分画を対照として使用する。特定量のひとＢＭＰ−
１が加えられたラットマトリックスを含むインプラント
を７日後にラットから除去し、組織評価を行う。各イン
プラントからの代表的部分を、新規骨無機質の存在に対
してボン・コッサおよび酸性フーシンにより染色し、軟
骨特異的マトリックス形成の存在に対してトルイジンブ
ルーにより染色する。その部分内に存在する細胞のタイ
プおよびこれらの細胞が表現型を示す程度を評価する。 【００６８】ひとＢＭＰ−１をマトリックス材料に加え
ると、内植の７日後に軟骨様小節が形成された。軟骨芽
(細胞)型細胞は、形状および異染性マトリックスの発現
により認識され得る。ひとＢＭＰ−１において観察され
る活性の量は、マトリックスに加えられたひとＢＭＰ−
１蛋白質の量により異なった。第９表は、観察された骨
誘導量に対するひとＢＭＰ−１蛋白質の用量応答関係を
示す。 【００６９】 第１０表インプラント番号 使用量(トランスフェク 組織学的スコア ション培地１ｍｌの当量) ８７６-１３４-１ １０ＢＭＰ−１ Ｃ＋２ ８７６-１３４-２ ３ＢＭＰ−１ Ｃ＋１ ８７６-１３４-３ １ＢＭＰ−１ Ｃ＋／− ８７６-１３４-４ １０ＭＯＣＫ Ｃ− ８７６-１３４-５ ３ＭＯＣＫ Ｃ− ８７６-１３４-６ １ＭＯＣＫ Ｃ− 【００７０】軟骨(c)活性を０(−)〜５の尺度に基づい
て評価した。類似レベルの活性は、ヘパリンセファロー
ス分画ＣＯＳ細胞抽出物においても観察される。６モル
尿素が全緩衝液に含まれること以外は前記方法と同様の
方法で部分精製を実施する。さらに、上記ラット骨形成
検定において、ＢＭＰ−２も同様に軟骨形成活性を示し
た。上記方法を用い、プローブ供給源としてうし骨誘導
因子および／またはひと骨誘導因子を利用することによ
り興味深い他の骨誘導因子を分離することができる。そ
れらの他の骨誘導因子は、特に骨折修復において似た有
用性を呈し得る。以上、この発明の好ましい実施態様に
ついて詳細に記載した。その実施に際し、これらの記載
事項を考慮して多くの修正および変更が行なわれること
は当業界の熟練者であれば容易に想到し得るはずであ
る。それらの修正および変更も後記請求の範囲内に包含
されるものと考えられる。 【００７１】 微 生 物 寄託機関の名称 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション 寄託機関の住所 １２３０１ パークローン・ドライブ ロックビル、メリーランド２０８５２、アメリカ合衆国寄託物の名称 ＡＴＣＣ番号 引用頁／行 寄託の日付 ＬＰ−Ｈ１ ４０３１１ ２９／２０ 1987年3月4日 bＰ５０ ４０２９５ ２０／３ 1986年12月15日 bＰ−２１ ４０３１０ ２２／１８ 1987年3月4日 Ｕ２ＯＳ−３ ４０３４２ ４４／２２ 1987年6月16日 ラムダU2-OS-1 ４０３４３ ３２／３３ 1987年6月16日 ラムダBP819 ４０３４４ ２５／２３ 1987年6月16日 Ｕ２ＯＳ-39 ４０３４５ ３９／２１ 1987年6月16日 【００７２】この発明によって下記の各事項が可能とな
る。 (１)医薬的に許容し得る賦形剤中に、(a)ＢＭＰ−１、
(b)ＢＭＰ−２・クラスＩ、(c)ＢＭＰ−２・クラスII、
(d)ＢＭＰ−３、およびそれらの混合物から成る群から
選ばれる蛋白質を含有して成る医薬組成物。 (２)蛋白質がＢＭＰ−１である、１記載の組成物。 (３)蛋白質がＢＭＰ−2・クラスＩである１記載の組成
物。 (４)蛋白質がＢＭＰ−2・クラスIIである１記載の組成
物。 (５)蛋白質がＢＭＰ−３である、１記載の組成物。 (６)さらに、骨または軟骨欠損部位に組成物を送達し、
骨形成誘導構造を提供し得るマトリックスを含む、１記
載の医薬組成物。 (７)マトリックスが、ヒドロキシアパタイト、コラーゲ
ン、ポリ乳酸および燐酸三カルシウムから成る群から選
択される材料を含む、６記載の組成物。 (８)骨または軟骨形成を必要とする患者における骨形成
誘導方法であって、１−７のいずれか１項記載の組成物
の有効量を患者に投与することを含む方法。 (９)ＢＭＰ−１をコードするＤＮＡ配列により形質転換
されたセルラインを適当な培養培地で培養し(ただし、
前記ＤＮＡ配列は適切な発現制御配列と組合わされてい
る)、培養培地からＢＭＰ−１を分離することを含むＢ
ＭＰ−１の製造方法。 (10)ＤＮＡ配列が実質的に下記ヌクレオチド配列を含ん
でいる、９記載の方法。 【表１８】【表１９】【表２０】【表２１】(11)ＢＭＰ−２・クラスＩをコードするＤＮＡ配列によ
り形質転換されたセルラインを適当な培養培地で培養し
(ただし、前記ＤＮＡ配列は適切な発現制御配列と組合
わされている)、培養培地からＢＭＰ−２・クラスＩを
分離することを含むＢＭＰ−２・クラスＩの製造方法。 (12)ＤＮＡ配列が実質的に下記ヌクレオチド配列を含ん
でいる、１１記載の方法。 【表２２】【表２３】【表２４】 【００７３】(13)ＢＭＰ−２・クラスIIをコードするＤ
ＮＡ配列により形質転換されたセルラインを適当な培養
培地で培養し(ただし、前記ＤＮＡ配列は適切な発現制
御配列と組合わされている)、培養培地からＢＭＰ−２
・クラスIIを分離することを含むＢＭＰ−２・クラスII
の製造方法。 (14)ＤＮＡ配列が実質的に下記ヌクレオチド配列を含ん
でいる、１３記載の方法。 【表２５】 【表２６】【表２７】(15)ＢＭＰ−３をコードするＤＮＡ配列により形質転換
されたセルラインを適当な培養培地で培養し(ただし、
前記ＤＮＡ配列は適切な発現制御配列と組合わされてい
る)、培養培地からＢＭＰ−３を分離することを含むＢ
ＭＰ−３の製造方法。 (16)ＤＮＡ配列が実質的に下記ヌクレオチド配列を含ん
でいる、１５記載の方法。 【表２８】および 【表２９】 (17)実質的に１０記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−１
の実質的特性を呈する蛋白質をコードする配列を含むＢ
ＭＰ−１をコードするcＤＮＡ配列。 (18)実質的に１２記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−２
・クラスＩの実質的特性を呈する蛋白質をコードする配
列を含むＢＭＰ−２・クラスＩをコードするcＤＮＡ配
列。 (19)実質的に１４記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−２
・クラスIIの実質的特性を呈する蛋白質をコードする配
列を含むＢＭＰ−２・クラスIIをコードするcＤＮＡ配
列。 (20)実質的に１６記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−３
の実質的特性を呈する蛋白質をコードする配列を含むＢ
ＭＰ−３をコードするcＤＮＡ配列。 (21)骨誘導蛋白質をコードするＤＮＡ配列および相同性
ＤＮＡを含むベクターであって、蛋白質をコードするＤ
ＮＡ配列が、 a．実質的に１０記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−１
の実質的特性を呈する蛋白質をコードする配列を含むＢ
ＭＰ−１をコードするＤＮＡ配列、 b．実質的に１２記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−２
・クラスＩの実質的特性を呈する蛋白質をコードする配
列を含むＢＭＰ−２・クラスＩをコードするＤＮＡ配
列、 c．実質的に１４記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−２
・クラスIIの実質的特性を呈する蛋白質をコードする配
列を含むＢＭＰ−２・クラスIIをコードするＤＮＡ配
列、および d．実質的に１６記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−３
の実質的特性を呈する蛋白質をコードする配列を含むＢ
ＭＰ−３をコードするＤＮＡ配列から成る群から選ばれ
たものである、ベクター。 (22)骨誘導蛋白質をコードするＤＮＡ配列を発現させ得
る２１記載のベクターにより形質転換された細胞および
前記細胞の子孫。 (23)ほ乳類細胞、細菌細胞、昆虫細胞および酵母細胞か
ら成る群から選ばれる、２２記載の形質転換細胞。 【００７４】(24) (a)(i)実質的に下記配列を有するcＤＮＡ 【表３０】 【表３１】【表３２】【表３３】および(１)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれ
とハイブリダイズし、(２)発現時に、実施例３のインビ
ボ・ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグ
ラム／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成
誘導能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配
列により形質転換された細胞を培養し、 (ii)実質的に上記(a)(i)記載のアミノ酸＃５１〜＃８７
の３７アミノ酸配列を含む蛋白質を前記細胞培地から回
収する工程により生産される蛋白質、 (b)(i)実質的に下記配列を有するcＤＮＡ 【表３４】【表３５】【表３６】 および(１)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれ
とハイブリダイズし、(２)発現時に、実施例３のインビ
ボ・ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグ
ラム／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成
誘導能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配
列により形質転換された細胞を培養し、 (ii)実質的に上記(b)(i)記載のアミノ酸＃２９９〜＃３
９６の９７アミノ酸配列を含む蛋白質を前記細胞培地か
ら回収する工程により生産される蛋白質、 (c)(i)実質的に下記配列を有するcＤＮＡ 【表３７】 【表３８】【表３９】および(１)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれ
とハイブリダイズし、(２)発現時に、実施例３のインビ
ボ・ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグ
ラム／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成
誘導能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配
列により形質転換された細胞を培養し、 (ii)実質的に上記(c)(i)記載のアミノ酸＃３１１〜＃４
０８の９７アミノ酸配列を含む蛋白質を前記細胞培地か
ら回収する工程により生産される蛋白質、 (d)(i)実質的に下記配列を有するcＤＮＡ 【表４０】および 【表４１】 および(１)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれ
とハイブリダイズし、(２)発現時に、実施例３のインビ
ボ・ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグ
ラム／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成
誘導能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配
列により形質転換された細胞を培養し、 (ii)実質的に上記(d)(i)記載のアミノ酸＃７９〜＃１７
５の９６アミノ酸配列を含む蛋白質を前記細胞培地から
回収する工程により生産される蛋白質、および (e)前記蛋白質の混合物 から成る群から選ばれる精製蛋白質の有効量を、医薬的
に許容し得る賦形剤と共に含んで成る医薬組成物であっ
て、実施例３のインビボ・ラット骨形成検定において約
１０−１０００ナノグラム／グラム(骨)の濃度で硬骨お
よび／または軟骨形成誘導能を呈する組成物。 【００７５】(25)さらに、骨または軟骨欠損部位に組成
物を送達し、骨形成誘導構造を提供し得るマトリックス
を含む、24記載の医薬組成物。 (26)マトリックスが、ヒドロキシアパタイト、コラーゲ
ン、ポリ酪酸および燐酸三カルシウムから成る群から選
択される材料を含む、25記載の組成物。 (27)骨または軟骨形成を必要とする患者における骨形成
誘導方法であって、24−26のいずれか１項記載の組成物
の有効量を患者に投与することを含む方法。 (28)24(a)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む
ベクターであって、前記配列が、 (a)実質的に24(a)に記載されたヌクレオチド配列、およ
び (b)(1)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハ
イブリダイズし、(2)発現時に実施例３のインビボ・ラ
ット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム／
グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導能
を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を含
む配列であるベクター。 (29)24(b)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む
ベクターであって、前記配列が、 (a)実質的に24(b)に記載されたヌクレオチド配列、およ
び (b)(1)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハ
イブリダイズし、(2)発現時に実施例３のインビボ・ラ
ット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム／
グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導能
を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を含
む配列であるベクター。 (30)24(c)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む
ベクターであって、前記配列が、 (a)実質的に24(c)に記載されたヌクレオチド配列、およ
び (b)(1)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハ
イブリダイズし、(2)発現時に実施例３のインビボ・ラ
ット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム／
グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導能
を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を含
む配列であるベクター。 (31)24(d)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む
ベクターであって、前記配列が、 (a)実質的に24(d)に記載されたヌクレオチド配列、およ
び (b)(1)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハ
イブリダイズし、(2)発現時に実施例３のインビボ・ラ
ット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム／
グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導能
を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を含
む配列であるベクター。 (32)前記ＤＮＡ配列を発現させ得る28、29、30および31
記載のベクターから成る群から選ばれたベクターにより
形質転換された細胞および前記細胞の子孫。 (33)ほ乳類細胞、細菌細胞、昆虫細胞および酵母細胞か
ら成る群から選ばれる、32記載の形質転換細胞。 (34)精製蛋白質の製造方法であって、(a)24(a)記載の蛋
白質をコードするＤＮＡ配列を含み、それを発現させ得
る細胞を生成し(ただし、この配列は、 (i)実質的に24(a)に記載されたヌクレオチド配列および (ii)(a)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれと
ハイブリダイズし、(b)発現時に実施例３のインビボ・
ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム
／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導
能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を
含む)、 (b)組換え体ＤＮＡを発現させ得る条件下、適当な培養
培地において前記の形質転換宿主細胞またはその子孫を
培養し、 (c)前記培養から前記蛋白質を分離および精製する工程
を含む方法。 【００７６】(35)精製蛋白質の製造方法であって、 (a)24(b)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含み、
それを発現させ得る細胞を生成し(ただし、この配列
は、 (i)実質的に24(b)に記載されたヌクレオチド配列および (ii)(a)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれと
ハイブリダイズし、(b)発現時に実施例３のインビボ・
ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム
／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導
能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を
含む)、 (b)組換え体ＤＮＡを発現させ得る条件下、適当な培養
培地において前記の形質転換宿主細胞またはその子孫を
培養し、 (c)前記培養から前記蛋白質を分離および精製する工程
を含む方法。 (36)精製蛋白質の製造方法であって、 (a)24(c)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含み、
それを発現させ得る細胞を生成し(ただし、この配列
は、 (i)実質的に24(c)に記載されたヌクレオチド配列および (ii)(a)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれと
ハイブリダイズし、(b)発現時に実施例３のインビボ・
ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム
／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導
能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を
含む)、 (b)組換え体ＤＮＡを発現させ得る条件下、適当な培養
培地において前記の形質転換宿主細胞またはその子孫を
培養し、 (c)前記培養から前記蛋白質を分離および精製する工程
を含む方法。 (37)精製蛋白質の製造方法であって、 (a)24(d)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含み、
それを発現させ得る細胞を生成し(ただし、この配列
は、 (i)実質的に24(d)に記載されたヌクレオチド配列および (ii)(a)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれと
ハイブリダイズし、(b)発現時に実施例３のインビボ・
ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム
／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導
能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を
含む)、 (b)組換え体ＤＮＡを発現させ得る条件下、適当な培養
培地において前記の形質転換宿主細胞またはその子孫を
培養し、 (c)前記培養から前記蛋白質を分離および精製する 工程を含む方法。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＪ
Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＤＴ
//(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 ジョン・エム・ウォズニー
アメリカ合衆国01749マサチューセッツ、
ハドソン、オールド・ボルトン・ロード
59番
(72)発明者 ヴィッキ・エイ・ローゼン
アメリカ合衆国02116マサチューセッツ、
ボストン、アパートメント４、マールバ
ロー・ストリート344番
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．分子中に下記アミノ酸配列 (a) イ) Ala Phe Leu Gly Asp Ile Ala Leu Asp Glu Glu Asp Leu Arg Ala Phe Gln Val Gln Gln Ala ロ) Asp Leu Arg ハ) Arg ニ) Ser Ser Ile Lys Ala Ala (但し、上記配列中、ロ)はイ)の後２個目から始まり、ハ)
はロ)の後５個目から始まり、ニ)はハ)の後２個目から始ま
る。)で示される部分アミノ酸配列、 (b) イ) Cys ロ) Arg His ハ) Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr ニ) Ala Phe Tyr Cys His Gly ホ) Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Serヘ) Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu ト) Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln チ) Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg (但し、上記配列中、ロ)はイ)の後２個目から始まり、ハ)
はロ)の後２個目から始まり、ニ)はハ)の後２個目から始ま
り、ホ)はニ)の後２個目から始まり、ヘ)はホ)の後２個目か
ら始まり、ト)はヘ)の後３個目から始まり、チ)はト)の後２
個目から始まる。)で示されるＣ末端部分アミノ酸配
列、または (c) Cys Ala Arg Arg Tyr Leu Lys Val Asp Phe Ala Asp Ile Gly Trp Ser Glu Trp Ile Ile Ser Pro Lys Ser Phe Asp Ala Tyr Tyr Cys Ser Gly Ala Cys Gln Phe Pro Met Pro Lys Ser Leu Lys Pro Ser Asn His Ala Thr Ile Gln Ser Ile Val Arg Ala Val Gly Val Val Pro Gly Ile Pro Glu Pro Cys Cys Val Pro Glu Lys Met Ser Ser Leu Ser Ile Leu Phe Phe Asp Glu Asn Lys Asn Val Val Leu Lys Val Tyr Pro Asn Met Thr Val Glu Ser Cys Ala Cys Arg で示されるＣ末端アミノ酸配列のいずれかを含み、実施
例３に記載されたインビボラット骨形成検定において硬
骨および／または軟骨形成誘導能を呈するポリペプチ
ド。 ２．分子中に下記アミノ酸配列 (a) イ) Ala Phe Leu Gly Asp Ile Ala Leu Asp Glu Glu Asp Leu Arg Ala Phe Gln Val Gln Gln Ala ロ) Asp Leu Arg ハ) Arg ニ) Ser Ser Ile Lys Ala Ala (但し、上記配列中、ロ)はイ)の後２個目から始まり、ハ)
はロ)の後５個目から始まり、ニ)はハ)の後２個目から始ま
る。)で示される部分アミノ酸配列、 (b) イ) Cys ロ) Arg His ハ) Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr ニ) Ala Phe Tyr Cys His Gly ホ) Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser ヘ) Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu ト) Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln チ) Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg (但し、上記配列中、ロ)はイ)の後２個目から始まり、ハ)
はロ)の後２個目から始まり、ニ)はハ)の後２個目から始ま
り、ホ)はニ)の後２個目から始まり、ヘ)はホ)の後２個目か
ら始まり、ト)はヘ)の後３個目から始まり、チ)はト)の後２
個目から始まる。)で示されるＣ末端部分アミノ酸配
列、または (c) Cys Ala Arg Arg Tyr Leu Lys Val Asp Phe Ala Asp Ile Gly Trp Ser Glu Trp Ile Ile Ser Pro Lys Ser Phe Asp Ala Tyr Tyr Cys Ser Gly Ala Cys Gln Phe Pro Met Pro Lys Ser Leu Lys Pro Ser Asn His Ala Thr Ile Gln Ser Ile Val Arg Ala Val Gly Val Val Pro Gly Ile Pro Glu Pro Cys Cys Val Pro Glu Lys Met Ser Ser Leu Ser Ile Leu Phe Phe Asp Glu Asn Lys Asn Val Val Leu Lys Val Tyr Pro Asn Met Thr Val Glu Ser Cys Ala Cys Arg で示されるＣ末端アミノ酸配列のいずれかを含み、実施
例３に記載されたインビボラット骨形成検定において硬
骨および／または軟骨形成誘導能を呈するポリペプチド
を有効成分とする、骨形成誘導剤。 ３．組換えＤＮＡを発現させ得る条件下、適当な培養培
地において、ベクターにより形質転換された細胞または
その後代細胞を培養し、その培養液から実施例３のイン
ビボラット骨形成検定において硬骨および／または軟骨
形成誘導能を呈するポリペプチドを分離、精製すること
を特徴とする、骨誘導因子の製造法：ただし、上記ベク
ターは、分子中に下記アミノ酸配列 (a) イ) Ala Phe Leu Gly Asp Ile Ala Leu Asp Glu Glu Asp Leu Arg Ala Phe Gln Val Gln Gln Ala ロ) Asp Leu Arg ハ) Arg ニ) Ser Ser Ile Lys Ala Ala (但し、上記配列中、ロ)はイ)の後２個目から始まり、ハ)
はロ)の後５個目から始まり、ニ)はハ)の後２個目から始ま
る。)で示される部分アミノ酸配列、 (b) イ) Cys ロ) Arg His ハ) Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr ニ) Ala Phe Tyr Cys His Gly ホ) Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser ヘ) Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu ト) Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln チ) Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg (但し、上記配列中、ロ)はイ)の後２個目から始まり、ハ)
はロ)の後２個目から始まり、ニ)はハ)の後２個目から始ま
り、ホ)はニ)の後２個目から始まり、ヘ)はホ)の後２個目か
ら始まり、ト)はヘ)の後３個目から始まり、チ)はト)の後２
個目から始まる。)で示されるＣ末端部分アミノ酸配
列、または (c) Cys Ala Arg Arg Tyr Leu Lys Val Asp Phe Ala Asp Ile Gly Trp Ser Glu Trp Ile Ile Ser Pro Lys Ser Phe Asp Ala Tyr Tyr Cys Ser Gly Ala Cys Gln Phe Pro Met Pro Lys Ser Leu Lys Pro Ser Asn His Ala Thr Ile Gln Ser Ile Val Arg Ala Val Gly Val Val Pro Gly Ile Pro Glu Pro Cys Cys Val Pro Glu Lys Met Ser Ser Leu Ser Ile Leu Phe Phe Asp Glu Asn Lys Asn Val Val Leu Lys Val Tyr Pro Asn Met Thr Val Glu Ser Cys Ala Cys Arg で示されるＣ末端アミノ酸配列のいずれかを含むポリペ
プチドをコードする塩基配列を有するものである。 ４．培養液から第４Ａ及び４Ｂ表に記載されたアミノ酸
配列のうち少なくともアミノ酸＃７９〜１７２、第６表
に記載されたアミノ酸配列のうち少なくともアミノ酸＃
５０〜７４、第７表に記載されたアミノ酸配列のうち少
なくともアミノ酸＃３８４〜３９２、または第８表に記
載されたアミノ酸配列のうち少なくともアミノ酸＃３９
６〜４０４のいずれかのアミノ酸配列をその部分配列と
して有するポリペプチドを分離、精製する、請求項３記
載の骨誘導因子の製造法。 ５．第６表に記載されたアミノ酸＃１〜７３０、第７表
に記載されたアミノ酸＃１〜３９６、または第８表に記
載されたアミノ酸＃１〜４０８のいずれかのアミノ酸配
列をコードする塩基配列を含むＤＮＡによって形質転換
された哺乳動物細胞またはその後代細胞を培養し、その
培養液から実施例３のインビボラット骨形成検定におい
て硬骨および／または軟骨形成誘導能を呈するポリペプ
チドを分離、精製する、請求項４記載の骨誘導因子の製
造法。
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