JP3093682B2 - 新規骨誘導組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】この発明は、新規蛋白質およ
びそれらの製造方法に関するものである。これらの蛋白
質は軟骨および硬骨の形成を誘導し得る。 【０００２】 【従来の技術】骨は、蛋白質コラーゲンの線維束、およ
びプロテオグリカン、非コラーゲン性蛋白質、脂質およ
び酸性蛋白質により形成された広範なマトリックス構造
を特徴とする高度に分化した組織である。一生を通じて
連続的に行なわれる骨形成および骨組織の再生／修復の
プロセスは、分化細胞により行なわれる。正常な胎長骨
の発達の前に、軟骨のひな形が形成される。骨の成長は
恐らく「骨芽細胞」(骨形成細胞)の介在によると思われる
が、骨の再建は明らかに骨吸収細胞、いわゆる「破骨細
胞」および骨芽細胞の結合活性により行なわれる。様々
な骨原性軟骨誘導および硬骨誘導因子が報告されてい
る。それらに関しては、例えばヨーロッパ特許出願第１
４８１５５号および同第１６９０１６号参照。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】この発明は、純粋形態
の新規蛋白質を提供する。具体的には、４種の新規蛋白
質は、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２・クラスＩ(またはＢＭ
Ｐ−２)、ＢＭＰ−３およびＢＭＰ−２・クラスII(また
はＢＭＰ−４)(ただし、ＢＭＰは骨形態形成蛋白質であ
る)と称する。これらの蛋白質は、後記表２〜８に示し
たアミノ酸配列と同一または実質的に相同性のペプチド
配列を特徴とする。それらは予め定められた部位での骨
形成を誘導し得る。さらにこれらの骨誘導因子は、後記
インビボラット骨形成検定における１０〜１０００ng／
g(骨)の濃度での活性を含む生化学的および生物学的特
性を特徴とする。この発明の蛋白質は、表に示したＤＮ
Ａ配列、またはそれとハイブリダイゼーションし、骨成
長因子の生物学的特性を有するポリペプチドをコードし
得る配列またはそれらの特性を示す他の様々な修飾配列
によりコードされ得る。 【０００４】この発明の蛋白質の１つはＢＭＰ−１とい
う。ひとＢＭＰ−１またはhＢＭＰ−１の一部分は、ゲ
ノムhＢＭＰ−１フラグメントを表す後記表５のアミノ
酸＃１〜アミノ酸＃３７またはhＢＭＰ−１ cＤＮＡを
表す表６のアミノ酸＃１〜アミノ酸＃７３０の配列と同
一または実質的に同じペプチド配列を有することを特徴
とする。さらに、hＢＭＰ−１または関連骨誘導因子
は、これらの配列の少なくとも一部分を有することを特
徴とし得る。これらのペプチド配列は、表５のヌクレオ
チド＃３４４０〜ヌクレオチド＃３５５０および表６の
ヌクレオチド＃３６〜ヌクレオチド＃２２２５にそれぞ
れ示された配列と同一または実質的に同じＤＮＡ配列に
よりコードされる。さらに、これらのhＢＭＰ−１ポリ
ペプチドは骨形成誘導能を有することを特徴とする。h
ＢＭＰ−１は、骨１g当たり１０〜１０００ngの濃度で
インビボ ラット骨形成検定において活性を呈する。 【０００５】この発明の相同性うし成長因子(bＢＭＰ−
１と称す)は、ゲノムbＢＭＰ−１フラグメントを表す後
記表２のアミノ酸＃１〜アミノ酸＃３７の配列と同一ま
たは実質的に同じ配列を含むペプチド配列を有すること
を特徴とする。このペプチド配列は、後記表２のヌクレ
オチド＃２９４〜ヌクレオチド＃４０４に示された配列
と同一または実質的に同じＤＮＡ配列によりコードされ
る。後記表２で同定されたうしペプチド配列もまた３７
アミノ酸長である。さらに、bＢＭＰ−１は骨形成誘導
能を特徴とする。この発明の別の骨誘導蛋白質組成物
は、ＢＭＰ−２・クラスＩ(またはＢＭＰ−２)と称す
る。それは、cＤＮＡ hＢＭＰ−２・クラスＩを表す表
７のアミノ酸＃１〜アミノ酸＃３９６の配列と同一また
は実質的に同じペプチド配列の少なくとも一部分を有す
ることを特徴とする。このペプチド配列は、表７のヌク
レオチド＃３５６〜ヌクレオチド＃１５４３に示された
配列と同一または実質的に同じＤＮＡ配列によりコード
される。表７で同定されたひとペプチド配列は３９６ア
ミノ酸長である。またhＢＭＰ−２または関連骨誘導蛋
白質もこのペプチド配列の少なくとも一部分を有するこ
とを特徴とし得る。さらにhＢＭＰ−２・クラスＩは、
骨形成誘導能を特徴とする。 【０００６】hＢＭＰ−２・クラスＩ(またはhＢＭＰ−
２)と称するこの発明の相同性うし骨誘導蛋白質は、ゲ
ノム配列を表す後記表３で同定されたＤＮＡ配列を有す
る。このうしＤＮＡ配列は、予想される１２９アミノ酸
コード配列、次いで約２０５個のヌクレオチド(３'非コ
ード配列)を有する。さらにhＢＭＰ−２・クラスＩは骨
形成誘導能を特徴とする。この発明の別の骨誘導蛋白質
組成物は、ＢＭＰ−２・クラスIIまたはＢＭＰ−４と称
する。ひと蛋白質hＢＭＰ−２・クラスII(またはhＢＭ
Ｐ−４)は、hＢＭＰ−２・クラスIIのcＤＮＡを表す表
８のアミノ酸＃１〜アミノ酸＃４０８間の配列と同一ま
たは実質的に同じペプチド配列の少なくとも一部分を有
することを特徴とする。このペプチド配列は、表８のヌ
クレオチド＃４０３〜ヌクレオチド＃１６２６に示され
た配列と同一または実質的に同じＤＮＡ配列の少なくと
も一部分によりコードされる。さらにこの因子は、骨形
成誘導能を特徴とする。 【０００７】この発明のさらに別の骨誘導因子、ＢＭＰ
−３は、うし相同体bＢＭＰ−３により示される。bＢＭ
Ｐ−３は、うしゲノム配列を表す表４Ａおよび４ＢのＤ
ＮＡ配列およびアミノ酸配列を有することを特徴とす
る。それは、表４Ａおよび４Ｂのアミノ酸＃１〜アミノ
酸＃１７４と同一または実質的に同じペプチド配列の少
なくとも一部分を有することを特徴とする。さらにＢＭ
Ｐ−３は、骨形成誘導能を特徴とする。うし因子は、類
縁体ひとＢＭＰ−３蛋白質または他のほ乳類骨誘導蛋白
質を得るための道具として使用され得る。このうし骨誘
導因子の特性を正確に表すと、この配列を用いる方法に
おける本質的「出発点」が得られる。遺伝子工学技術分野
における熟練者に周知の技術を用いるこの方法は、プロ
ーブとしてうしＤＮＡ配列を使用してひとゲノムまたは
cＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、このプ
ローブとハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列を同定
することを含む。ハイブリダイゼーション可能な配列を
有するクローンは精製されたプラークであり、ＤＮＡは
そこから分離され、サブクローンされ、ＤＮＡ配列分析
が行なわれる。すなわち、この発明の別の態様は、この
方法により製造されたひと蛋白質hＢＭＰ−３である。 【０００８】この発明の別の態様は、医薬的に許容し得
る賦形剤中にこの発明によるうし成長因子ポリペプチド
の１種またはそれ以上の治療有効量を含有する医薬組成
物に関するものである。さらに、これらの組成物は他の
治療上有用な薬剤を含有し得る。またそれらは、骨欠損
部位への蛋白質送達および骨成長構造の提供に適したマ
トリックスを含み得る。これらの組成物は、幾つかの骨
欠損および歯周病の処置方法において使用され得る。こ
の発明によると、これらの方法は、骨形成を必要とする
患者に、本明細書に記載された新規蛋白質ＢＭＰ−１、
ＢＭＰ−２・クラスＩ、ＢＭＰ−２・クラスIIおよびＢ
ＭＰ−３の少なくとも１種の有効量を投与することを必
然的に伴う。 【０００９】さらにこの発明の別の態様は、骨形成誘導
能を有するひとまたはうしポリペプチドの発現をコード
するＤＮＡ配列に関するものである。それらの配列は、
表２〜８に示された５'−３'方向のヌクレオチド配列を
含む。他方、ストリンジェント条件下で表２〜８のＤＮ
Ａ配列とハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列、また
は非ストリンジェント条件下で示されたＤＮＡ配列とハ
イブリダイゼーションし、少なくとも１種の骨成長因子
生物学的特性を有する蛋白質の発現をコードするＤＮＡ
配列もこの発明に包含される。最後に、表２〜８の配列
の対立遺伝子または他の変形もまた、それらのヌクレオ
チド変形の結果としてのペプチド配列の変形の存否に拘
わらず、この発明に含まれる。 【００１０】さらにこの発明の別の態様は、前記ＤＮＡ
配列を発現制御配列と効果的に組み合わせて含むベクタ
ーに関するものである。このベクターは、発現制御配列
と効果的に共同して骨成長因子ポリペプチドの発現をコ
ードするＤＮＡ配列により形質転換されたセルラインが
培養される、骨成長因子ポリペプチドの新規製造方法に
おいて使用され得る。この発明の方法は、ポリペプチド
発現用の宿主細胞として幾つかの公知細胞を使用し得
る。現在好ましいセルラインはほ乳類セルラインおよび
細菌細胞である。以下、詳細な記載および好ましい実施
態様を熟考すれば、この発明の他の態様および利点は明
らかである。 【００１１】 【課題を解決するための手段】この発明の蛋白質は、後
記表２〜８に示された配列と同一または実質的に相同性
のアミノ酸配列またはその一部分を有することを特徴と
する。これらの蛋白質もまた骨形成誘導能を特徴とす
る。また、この明細書に記載された骨成長因子は、表２
〜８の配列に類似した配列によりコードされる因子を含
むが、その配列に対する修飾は、自然に行なわれるか
(例、ポリペプチドにおけるアミノ酸変更を誘導し得る
ヌクレオチド配列における対立遺伝子的改編)または慎
重な工学的処理により行なわれる。例えば、合成ポリペ
プチドは、表２〜８のアミノ酸残基の連続配列を全体的
または部分的に複製し得る。これらの配列は、表２〜８
の骨成長因子ポリペプチドと共有の一次、二次または三
次構造および立体配座特性により、共通して骨成長因子
生物学的特性を有し得る。すなわち、それらは、治療プ
ロセスにおいて天然骨成長因子ポリペプチドの生物学的
活性代用物として使用され得る。 【００１２】この明細書に記載された骨成長因子の配列
の他の特異的突然変異体は、グリコシル化部位の一方ま
たは両方の修飾を伴う。グリコシル化の不在または一部
のみのグリコシル化は、表２〜８に示された骨成長因子
の配列に存在するアスパラギン結合グリコシル化認識部
位の一方または両方におけるアミノ酸置換または欠失に
起因する。アスパラギン結合グリコシル化認識部位は、
適当な細胞のグリコシル化酵素により特異的に認識され
るトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列
は、アスパラギン−Ｘ−トレオニンまたはアスパラギン
−Ｘ−セリン(ただし、Ｘは通常アミノ酸である)であ
る。グリコシル化認識部位の第一または第三アミノ酸位
の一方または両方における様々なアミノ酸置換または欠
失(および／または第２位におけるアミノ酸欠失)は、修
飾トリペプチド配列における非グリコシル化をもたら
す。またこの発明は、他の蛋白質性材料をコードするＤ
ＮＡ配列との随伴がなく、骨成長因子の発現をコードす
る新規ＤＮＡ配列を(アレリック)包含する。これらのＤ
ＮＡ配列は、５'−３'方向の表２〜８に示された配列お
よびストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件
[マニアチス等、「モレキュラー・クローニング(ア・ラ
ボラトリー・マニュアル)」、コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー(１９８２)、３８７〜３８９頁参
照]下で表２〜８のＤＮＡ配列とハイブリダイゼーショ
ンする配列を含む。 【００１３】緩和ハイブリダイゼーション条件下で表２
〜８の配列とハイブリダイゼーションし、骨成長因子生
物学的特性を有する骨成長因子の発現をコードするＤＮ
Ａ配列はまた、この発明の骨成長因子もコードする。例
えば、重要な相同性を有する領域、例えばグリコシル化
またはジスルフィド結合部位を表２〜８の配列と共有
し、１種またはそれ以上の骨成長因子生物学的特性を有
する骨成長因子をコードするＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列
が表２〜８の配列とストリンジェント的にハイブリダイ
ゼーションしない場合でも、成長因子のこの新たな科の
一員を明らかにコードする。同様に、表２〜８の配列に
よりコードされる骨成長因子ポリペプチドをコードする
が、遺伝子コードの縮重またはアレリック変異(アミノ
酸変更を誘導する場合もしない場合もあり得る種の集団
における天然塩基の変形)故にコドン配列が異なるＤＮ
Ａ配列もまた、この明細書に記載された新規成長因子を
コードする。点突然変異または誘導修飾によりポリペプ
チドの活性、半減期または生産の向上が誘発される表２
〜８のＤＮＡ配列における変形もまたこの発明に包含さ
れる。 【００１４】この発明の別の態様は、新規骨誘導因子の
新規製造方法に関するものである。この発明の方法は、
既知調節配列の制御下、この発明の新規骨成長因子ポリ
ペプチドの発現をコードするＤＮＡ配列により形質転換
された適当な細胞またはセルラインの培養を含む。適当
な細胞またはセルラインは、ほ乳類細胞、例えばチャイ
ニーズ・ハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)であり得る。適当
なほ乳類宿主細胞の選択並びに形質転換、培養、増幅、
スクリーニング、および製品の製造および精製の方法は
当業界では周知である。例えば、ゲシングおよびサンブ
ルック、「ネイチャー」、２９３、６２０−６２５(１９
８１)または別法としてカウフマン等、「モル・セル・バ
イオル」、５(７)１７５０−１７５９(１９８５)または
ハウレイ等、アメリカ合衆国特許第４４１９４４６号参
照。後記実施例記載の別の適当なほ乳類セルラインは、
さるＣＯＳ−１セルラインである。同様に有用なほ乳類
セルラインはＣＶ−１セルラインである。 【００１５】細菌細胞は適当な宿主である。例えば、エ
シェリヒア・コリの様々な株(例、ＨＢ１０１、ＭＣ１
０６１)はバイオテクノロジー分野において宿主細胞と
してよく知られている。枯草菌(バシルス・サブチリ
ス)、プソイドモナス、他のかん菌などの様々な株もま
たこの方法において使用され得る。当業界の熟練者には
周知の多くの酵母細胞株もまた、この発明のポリペプチ
ドの発現用の宿主細胞として利用され得る。さらに、所
望により、昆虫細胞もこの発明の方法における宿主細胞
として利用され得る。例えば、ミラー等、「ジェネティ
ック・エンジニアリング」、８、２７７−２９８(プレナ
ム・プレス１９８６)およびその引用文献参照。この発
明の別の態様は、これらの新規骨誘導ポリペプチド類の
発現方法で使用されるベクターに関するものである。好
ましくは、これらのベクターは、この発明の新規因子を
コードする前述の完全な新規ＤＮＡ配列を含む。さらに
また、これらのベクターは、骨誘導蛋白質配列を発現さ
せる適当な発現制御配列を含む。他方、上記修飾配列が
組み込まれたベクターはまた、この発明の具体例であ
り、骨誘導蛋白質の製造に有用である。これらのベクタ
ーはセルラインの形質転換方法で使用され得、選択され
た宿主細胞におけるその複製および発現を指向し得るこ
の発明のＤＮＡコード配列と効果的に組み合わせて選択
された調節配列を含み得る。これらのベクターに有用な
調節配列は当業界の熟練者には周知であり、選択された
宿主細胞に応じて選択され得る。この選択は常套的であ
り、この発明の一部を形成するものではない。 【００１６】骨が正常には形成されない環境において骨
の成長を誘導するこの発明の蛋白質は、骨折の治癒に適
用性を有する。この発明の蛋白質の１種またはそれ以上
を用いる骨原性製剤は、閉鎖および複雑骨折の縮小並び
に人工関節の固定改善における予防的用途を有し得る。
骨原性薬剤により新たに誘導される骨形成は、先天的、
外傷性または腫よう切除による頭顔欠損の修復に貢献
し、美容形成外科においても有用である。この発明の骨
生成因子は、歯周病の処置および他の歯修復プロセスに
おいて貴重であり得る。これらの薬剤は、骨形成細胞を
誘引し、骨形成細胞の成長を刺激し、または骨形成細胞
の原種の分化を誘導する環境を提供する。勿論、この発
明の蛋白質は他の治療用途を有し得る。この発明の別の
態様は、骨折および骨欠損に関連した他の状態または歯
周病の修復を目的とする治療方法および組成物に関する
ものである。前記組成物は、この発明の骨誘導因子蛋白
質の少なくとも１種の治療有効量を含有する。この発明
による骨誘導因子は、医薬的に許容し得る賦形剤または
マトリックスと混合した状態で治療組成物中に存在し得
る。さらにこの発明の治療方法および組成物は、この発
明の骨誘導因子の治療有効量およびこの発明の他の骨誘
導因子の少なくとも１種の治療有効量を含む。さらに、
この発明による蛋白質またはこの発明の蛋白質の組合わ
せは、それが相互作用し得る１種またはそれ以上の骨誘
導因子と共に投与され得る。さらに、骨誘導蛋白質は、
問題の骨欠損の処置に有益な他の薬剤と組合わされ得
る。それらの薬剤には様々な成長因子が含まれるが、限
定される訳ではない。pＨ、等張性、安定性などに関し
て生理学的に許容し得る蛋白質組成物の製造は、当業界
の技術の範囲内である。 【００１７】特にＢＭＰ−１は、組成物において個々に
使用され得る。ＢＭＰ−１はまた、この発明の他の蛋白
質の１種またはそれ以上と組合わせて使用され得る。Ｂ
ＭＰ−１およびＢＭＰ−２・クラスＩは組合わせて使用
され得る。ＢＭＰ−１およびＢＭＰ−２・クラスIIもま
た組合わせて使用され得る。ＢＭＰ−１およびＢＭＰ−
３もまた組合わせて使用され得る。さらに、ＢＭＰ−１
は、この発明の他の蛋白質の２種または３種と組合わせ
て使用され得る。例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２・ク
ラスＩおよびＢＭＰ−２・クラスIIは組合わされ得る。
ＢＭＰ−１はまた、ＢＭＰ−２・クラスＩおよびＢＭＰ
−３と組合わされ得る。さらに、ＢＭＰ−１は、ＢＭＰ
−２・クラスIIおよびＢＭＰ−３と組合わされ得る。Ｂ
ＭＰ−１、ＢＭＰ−２・クラスＩ、ＢＭＰ−２・クラス
IIおよびＢＭＰ−３は組合わされ得る。ＢＭＰ−２・ク
ラスＩは、医薬組成物において個々に使用され得る。Ｂ
ＭＰ−２・クラスＩもまた、この発明の他の蛋白質の１
種またはそれ以上と組合わせて使用され得る。ＢＭＰ−
２・クラスＩは、ＢＭＰ−２・クラスIIと組合わされ得
る。それはまた、ＢＭＰ−３とも組合わされ得る。さら
にＢＭＰ−２・クラスＩは、ＢＭＰ−２・クラスIIおよ
びＢＭＰ−３と組合わされ得る。 【００１８】ＢＭＰ−２・クラスIIは、医薬組成物にお
いて個々に使用され得る。さらに、それは前述の他の蛋
白質と組合わせて使用され得る。さらに、それはＢＭＰ
−３と組合わせて使用され得る。ＢＭＰ−３は、組成物
において個々に使用され得る。さらにそれは、前述の様
々な組合わせで使用され得る。この治療方法は、インプ
ラントまたはデバイスとして組成物を局所投与すること
を含む。投与される場合、勿論この発明で使用される治
療組成物は、発熱物質を含まない、生理学的に許容し得
る形態を呈する。さらに、この組成物は、望ましくは骨
損傷部位への送達に適した粘稠性形態で封入または注射
され得る。好ましくは、骨成長誘導因子組成物は、骨誘
導因子を骨損傷部位に送達し、成長する硬骨および軟骨
構造を提供し得、最適状態で体内に再吸収され得るマト
リックスを含む。それらのマトリックスは、他の内植医
学適応例で現在使用されている他の材料により形成され
得る。 【００１９】材料の選択は、例えば、生物学的適合性、
生物分解性、機構特性、表面的外観および界面特性に基
づいて行なわれる。同様に、骨誘導因子の適用は適当な
製剤を限定する。骨誘導因子に適用され得るマトリック
スは、生物分解性で化学的に定義されるもの、例えば硫
酸カルシウム、燐酸トリカルシウム、ヒドロキシアパタ
イト、ポリ乳酸、ポリ無水物(ただし、これらに限定さ
れる訳ではない)、生物分解性で生物学的に明確に定義
されるもの、例えば骨もしくは皮膚コラーゲン、他の純
粋な蛋白質または細胞外マトリックス成分、非生物分解
性で化学的に定義されるもの、例えば焼結ヒドロキシア
パタイト、生体ガラス、アルミン酸塩または他のセラミ
ック、または前述のタイプの材料を幾つか組合わせたも
の、例えばポリ酪酸およびヒドロキシアパタイトまたは
コラーゲンおよび燐酸トリカルシウムであり得る。生体
セラミックもまた組成物、例えばカルシウム−アルミン
酸塩−燐酸塩において改変され得、例えば孔サイズ、粒
子サイズ、粒子形状および生物分解性の改変が行なわれ
得る。 【００２０】投与量については、この成長因子の作用を
修飾する様々な要因、例えば形成が望まれる骨の重量、
骨損傷の部位、損傷骨の状態、患者の年令、性別および
治療食、感染の重症度、投与時間および他の臨床要因を
考慮して担当医が決定する。用量は、再構成およびＢＭ
Ｐの組成物において使用されるマトリックスのタイプに
より変動し得る。最終組成物への他の既知成長因子、例
えばＩＧＦ１(インスリン様成長因子１)の追加もまた用
量に影響を与え得る。一般的に、投与量は、所望の骨重
量１g当たり、蛋白質約１０〜１０⁶ナノグラムの範囲内
とすべきである。経過は骨成長および／または修復の定
期的評価(例、エックス線)によりモニターされ得る。ま
た、これらの治療組成物は、骨誘導因子における種特異
性の欠如故に現在獣医学適用においても貴重である。ひ
とに加えて特定の家畜およびサラブレッドのうまは、こ
の発明の骨誘導因子による処置において望ましい患者で
ある。以下、実施例により、うし蛋白質の回収および特
性検定、それらの使用によるひと蛋白質の回収、ひと蛋
白質の獲得および組換え技術による蛋白質の発現におけ
るこの発明の実施態様を説明する。 【００２１】 【実施例】 実施例１ うし骨誘導因子の単離 ウリスト等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・
ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、７０:３５
１１(１９７３)の方法に従い、破砕したうしの骨粉(２
０−１２０メッシュ、ヘリトレックス)を製造する(ただ
し、下記の通り幾つかの抽出工程は省く)。１０kgの粉
末を、４℃で４８時間激しい撹はん下、０.６ＮのＨＣl
を連続交換しながら脱塩する。生成した懸濁液を４℃で
１６時間２モルのＣaＣl₂および１０ミリモルのエチレ
ンジアミン−四酢酸[ＥＤＴＡ]５０lにより抽出し、次
いで５０lの０.５モルＥＤＴＡ中で４時間抽出する。残
留物を蒸留水で３回洗浄した後、「クリニカル・オーソ
ペディックス・アンド・リレーデット・リサーチ」、１
７１：２１３(１９８２)の記載に従い、４モルのグアニ
ジン塩酸塩[ＧuＣl]、２０ミリモルのトリス(pＨ７.
４)、１ミリモルのＮ−エチルマレイミド、１ミリモル
のヨードアセトアミド、１ミリモルのフェニルメチルス
ルホニル・フッ素２０lに再懸濁する。１６〜２０時間
後、上清を除去し、別の１０リットルのＧuＣl緩衝液と
置き換える。残留物をさらに２４時間抽出する。 【００２２】粗ＧuＣl抽出物を合わせ、１００００分子
量遮断膜を備えたペリコン装置で約２０倍に濃縮し、次
いで５０ミリモルのトリス、０.１モルのＮaＣl、６モ
ルの尿素(pＨ７.２)、第一カラム用出発緩衝液に対して
透析する。充分透析後、蛋白質を４リットルＤＥＡＥセ
ルロースカラムに仕込み、未結合フラクションを集め
る。未結合フラクションを濃縮し、６モル尿素中５０ミ
リモルのＮaＡc、５０ミリモルのＮaＣl(pＨ４.６)に対
して透析する。未結合フラクションをカルボキシメチル
セルロースカラムに適用する。カラムに結合していない
蛋白質を出発緩衝液で充分洗浄することにより除去し、
骨誘導因子含有材料を５０ミリモルのＮaＡc、０.２５
ミリモルのＮaＣl、６モルの尿素(pＨ４.６)によりカラ
ムから脱着させる。この段階溶離から得られた蛋白質を
２０〜４０倍に濃縮し、次いで８０ミリモルＫＰＯ₄、
６モル尿素(pＨ６.０)により５倍に希釈する。溶液のp
Ｈを５００ミリモルのＫ₂ＨＰＯ₄により６.０に調節す
る。８０ミリモルＫＰＯ₄、６モル尿素(pＨ６.０)中で
平衡状態にしたヒドロキシルアパタイトカラム(ＬＫＢ)
に試料を適用し、同緩衝液でカラムを洗浄することによ
り、未結合蛋白質を全て除去する。骨誘導因子活性蛋白
質を１００ミリモルＫＰＯ₄(pＨ７.４)および６モル尿
素により溶離させる。 【００２３】この蛋白質を約１０倍に濃縮し、固体Ｎa
Ｃlを加えて最終濃度０.１５モルとする。この材料を、
５０ミリモルＫＰＯ₄、１５０ミリモルＮaＣl、６モル
尿素(pＨ７.４)中で平衡状態にしたヘパリン−セファロ
ースカラムに適用する。出発緩衝液でカラムを充分洗浄
後、骨誘導因子活性蛋白質を５０ミリモルＫＰＯ₄、７
００ミリモルりＮaＣl、６モル尿素(pＨ７.４)により溶
離させる。このフラクションを最小体積に濃縮し、４モ
ルＧuＣl、２０ミリモルのトリス(pＨ７.２)により平衡
状態にしたスーパローズ６およびスーパローズ１２カラ
ム(一列に連結)に０.４mlアリコートを適用し、カラム
を流速０.２５ml／分で展開する。骨誘導因子活性を示
す蛋白質は、約３００００ダルトンの蛋白質に対応する
相対移動を呈する。 【００２４】上記フラクションをプールし、５０ミリモ
ルＮaＡc、６モル尿素(pＨ４.６)に対して透析し、ファ
ルマシア・モノＳ ＨＲカラムに適用する。カラムを１.
０モルＮaＣl、５０ミリモルＮaＡc、６モル尿素(pＨ
４.６)への勾配により展開する。活性フラクションをプ
ールし、１０％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)によりpＨ
３．０とする。この材料を０．１％ＴＦＡ中０.４６×
２５cmバイダックＣ４カラムに適用し、カラムを９０％
アセトニトリル、０.１％ＴＦＡへの勾配により展開す
る(６０分間で３１.５％アセトニトリル、０.１％ＴＦ
Ａから４９.５％アセトニトリル、０.１％ＴＦＡ、ただ
し１分間１mlの速度)。活性材料を約４０−４４％アセ
トニトリルで溶離する。マッコナヘイ等、「インターナ
ショナル・アーカイブス・オブ・アラージー」、２９：
１８５−１８９(１９６６)、ボルトン等、「バイオケミ
カル・ジャーナル」、１３３：５２９(１９７３)および
ボーウェン-ポープ、「ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー」、２３７：５１６１(１９８２)の中
の一法により、適当なフラクションのアリコートをヨウ
素化する。これらのフラクション中に存在するヨウ素化
蛋白質をＳＤＳゲル電気泳動および尿素トリトンＸ１０
０等電点電気泳動により分析する。この段階で、骨誘導
因子を評価すると、約１０−５０％純度である。 【００２５】実施例２ うし骨誘導因子の特性検定 Ａ．分子量 実施例１により得られた約２０μgの蛋白質を凍結乾燥
し、１×ＳＤＳ試料緩衝液に再溶解する。３７℃で１５
分加熱後、試料を１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
に適用し、次いで冷却しながら電気泳動させる。予め染
色した分子量標準(ベゼスダ・リサーチ・ラブズ)と比べ
て分子量を測定する。完了直後、骨誘導因子含有ゲルレ
ーンを０.３cm片に切断する。各片をすり潰し、１.４ml
の０.１％ＳＤＳを加える。試料を室温で一夜穏やかに
振り混ぜて蛋白質を溶離させる。各ゲル片を脱塩するこ
とにより、生物学的検定における干渉を防ぐ。各試料か
ら得た上清を１０％ＴＦＡによりpＨ３.０に酸性化し、
０.４５ミクロン膜によりろ過し、０.４６cm×５cmＣ４
バイダックカラムに入れ、０.１％ＴＦＡから０.１％Ｔ
ＦＡ、９０％ＣＨ₃ＣＮへの勾配により展開する。適当
な骨誘導因子含有フラクションをプールし、２０mgのラ
ット・マトリックスにより再構成する。このゲル・シス
テムにおいて、骨誘導因子フラクションの大部分は、約
２８０００−３００００ダルトンの分子量を有する蛋白
質移動度を有する。 【００２６】Ｂ．等電点電気泳動 骨誘導因子活性の等電点を変性等電点電気泳動システム
において測定する。トリトンＸ１００尿素ゲルシステム
(ホーファー・サイエンティフィック)を次の要領で修正
する。１)使用される両性電解質の４０％はサーバライ
ト３／１０あり、６０％はサーバライト７−９である。
２)使用されるカソライト(catholyte)は４０ミリモルＮ
aＯＨである。実施例１で得られた約２０μgの蛋白質を
凍結乾燥し、試料緩衝液に溶解し、等電点電気泳動ゲル
に適用する。ゲルを２０ワット、１０℃で約３時間移動
させる。完了時、骨誘導因子含有レーンを０.５cm片に
切断する。各片を１.０mlの６モル尿素、５ミリモルの
トリス(pＨ７.８)中ですり潰し、試料を室温で振り混ぜ
る。試料を上記と同様に酸性化し、ろ過し、脱塩し、検
定する。実施例３記載の検定で測定された活性の大部分
は、８.８−９.２のpＩと一致する形で移動する。 【００２７】Ｃ．サブユニットの特性 骨誘導因子のサブユニット組成についても測定する。純
粋な骨誘導因子を上記と同様にプレパラティブ１５％Ｓ
ＤＳゲルから分離する。次いで試料の一部を試料緩衝液
中５ミリモルＤＴＴにより還元し、１５％ＳＤＳゲルに
おいて再電気泳動させる。約３０キロダルトン蛋白質
は、約２０キロダルトンおよび１８キロダルトンの箇所
で２本の大きなバンド並びに３０キロダルトンの箇所で
小さなバンドを生ずる。２本のバンドの広さは、恐らく
はグリコシル化、他の翻訳後修飾、蛋白質加水分解によ
る減成またはカルバミル化に起因すると思われる不均質
性を示す。 【００２８】実施例３ 骨誘導因子の生物学的活性 サンパスおよびレディ、「プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・
オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリ
カ」、８０：６５９１−６５９５(１９８３)の一般的方
法によるラット骨形成検定を用いることにより、実施例
１で得られたこの発明のうし骨誘導因子の骨生成活性を
評価する。またこの検定を用いて他の種類の骨誘導因子
を評価することも可能である。エタノール沈澱工程の代
わりに検定フラクションの水に対する透析を行う。次い
で、溶液または懸濁液を揮発性溶媒、例えば０.１−０.
２％ＴＦＡに再溶解し、生成した溶液を２０mgのラット
・マトリックスに加える。この材料を冷凍し、凍結乾燥
し、生成した粉末を＃５ゼラチンカプセルに封入する。
２１−４９日令の雄ロング・エバンス・ラットの腹部胸
領域にカプセルを皮下内植する。７−１４日後インプラ
ントを除去する。各インプラントの半分を用いてアルカ
リ性ホスファターゼ分析[レディ等、「プロシーディング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・
アメリカ」、６９:１６０１(１９７２)参照]を行い、半
分を固定し、組織分析を行う。常用手順で、１μmグリ
コメタクリレート部分をボン・コッサおよび酸性フーシ
ン(fuschin)で染色することにより、新規骨無機質を検
出する。アルカリ性ホスファターゼ、マトリックス形成
プロセスにおいて軟骨芽細胞および骨芽細胞により生産
される酵素もまた測定される。新しい軟骨および硬骨形
成はしばしばアルカリ性ホスファターゼレベルと相関す
る。下記表１は、骨誘導因子により処理されなかった対
照を含むラット・マトリックス試料の用量応答を示す。 【００２９】 【表１】 表１内植蛋白質＊(μg) 軟骨 アルカリ性ホスファターゼ(μ/l) ７.５ ２ 実施せず ２.５ ３ ４４５.７ ０.８３ ３ ７７.４ ０.２８ ０ ３２.５ ０.００ ０ ３１.０ ＊この段階で骨誘導因子は約１０−１５％の純度である。 【００３０】形成された硬骨または軟骨は、マトリック
スによりふさがれた空間に物理的に閉じ込められる。ま
た、前記と同様にＳＤＳゲル電気泳動および等電点電気
泳動により試料を分析し、次いでオートラジオグラフィ
ーを行う。分析は、pＩ９.０および２８−３０キロダル
トンでの蛋白質バンドと活性の相関関係を示す。１ＯＤ
／mg−cmの消衰係数を蛋白質に関する推定値として使用
し、特定フラクション中の骨誘導因子の純度を近づけ
る。前記希釈物におけるインビボ ラット骨形成検定に
おいて、蛋白質は、１０〜２００ng蛋白質／(骨)g〜恐
らくは１μg蛋白質／(骨)gより大の比率でインビボ活性
を呈する。 【００３１】実施例４ うし骨誘導因子蛋白質組成物 ２８−３０キロダルトンの分子量を有する実施例２Ａの
蛋白質組成物を実施例２Ｃの記載に従い還元し、トリプ
シンで消化する。下記のアミノ酸配列を有する８種のト
リプシンフラグメントを標準的方法により単離する。 フラグメント１：ＡＡＦＬＧＤＩＡＬＤＥＥＤＬＧ フラグメント２：ＡＦＱＶＱＱＡＡＤＬ フラグメント３：ＮＹＱＤＭＶＶＥＧ フラグメント４：ＳＴＰＡＱＤＶＳＲ フラグメント５：ＮＱＥＡＬＲ フラグメント６：ＬＳＥＰＤＰＳＨＴＬＥＥ フラグメント７：ＦＤＡＹＹ フラグメント８：ＬＫＰＳＮ？ＡＴＩＱＳＩＶＥ 【００３２】実施例１記載の方法と類似した精製手順に
従い、うしの骨由来の蛋白質の低級精製製品を製造す
る。この精製手順は、ＤＥ−５２カラム、ＣＭセルロー
スカラムおよびモノＳカラムの省略並びにヒドロキシル
アパタイトおよびヘパリン・セファロースカラムの順で
の置き換えにより前記手順からは基本的に変化する。簡
単に述べると、濃縮粗４モル抽出物をエタノール(４度)
に加えて８５％最終濃度とする。次いで混合物を遠心分
離し、沈澱を５０ミリモルのトリス、０.１５モルＮaＣ
l、６.０モル尿素に再溶解する。次に、この材料を前記
と同様にヘパリン・セファロースにおいて分画化する。
ヘパリン結合材料を前記と同様にヒドロキシアパタイト
において分画化する。活性フラクションをプールし、濃
縮し、高度分離ゲルろ過において分画化する(６モルの
グアニジニウムクロリド、５０ミリモルのトリス(pＨ
７.２)中ＴＳＫ３００００)。活性フラクションをプー
ルし、０.１％ＴＦＡに対して透析し、次いで前記と同
様にＣ４バイダック逆相カラムにおいて分画化する。調
製物を還元し、アクリルアミドゲルで電気泳動する。１
８Ｋバンドに対応する蛋白質を溶離させ、トリプシンで
消化する。下記のアミノ酸配列を有するトリプシンフラ
グメントが分離される。 フラグメント９：ＳＬＫＰＳＮＨＡＴＩＱＳ？Ｖ フラグメント１０：ＳＦＤＡＹＹＣＳ？Ａ フラグメント１１：ＶＹＰＮＭＴＶＥＳＣＡ フラグメント１２：ＶＤＦＡＤＩ？Ｗ ただし、トリプシン・フラグメント７および８は、実質
的にそれぞれフラグメント１０および９であるものとす
る。 【００３３】Ａ．bＢＭＰ−１ レイズ、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー」、１８３(１)：１−１２(１９８５)の方法に従
い、オリゴヌクレオチドのプール(または特有のオリゴ
ヌクレオチド)を成分とするプローブを設計し、自動Ｄ
ＮＡシンセサイザーで合成する。一プローブは、下記ヌ
クレオチド配列 TCCTCATCCAGGGCAATGTCGCCCAGGAAGGC を有する比較的長い(３２ヌクレオチド)「ゲスマー」[ツ
ール等、「ネイチャー」、３１２:３４２−３４７(１９８
４)]を成分としている。 遺伝子コードは同義性であるため(複数のコドンが同じ
アミノ酸をコードし得る)、プローブプールにおけるオ
リゴヌクレオチドの数は、真核生物におけるコドン使用
頻度、Ｇ：Ｔ塩基対の相対安定性および真核生物コード
配列におけるジヌクレオチドＣpＧの相対的希少性に基
づいて減らされる[ツール等(前出)参照］。第２セット
のプローブは、アミノ酸をコードし得る可能な配列を全
て含む短いオリゴヌクレオチド（長さ１７ヌクレオチ
ド)により構成される。第２セットのプローブは下記配
列を有する。 (a) A [A/G] [A/G] TC [T/C] TC [T/C] TC [A/G] TC [T
/C] AA (b) A [A/G] [A/G] TC [T/C] TC [T/C] TC [A/G] TCNAG 括弧内のヌクレオチドは代替配列である。「Ｎ」はＡ、
Ｔ、ＣまたはＧを意味する。 【００３４】両場合において、プローブ設計に使用され
るアミノ酸配列の領域は、可能ならば高度変性コドンを
避けることにより選択される。オリゴヌクレオチドを自
動ＤＮＡシンセサイザーで合成する。次いで、ポリヌク
レオチドキナーゼおよび³²Ｐ−ＡＴＰを用いてプローブ
に放射性標識を行う。これら２セットのプローブを用い
てうしゲノム組換え体ライブラリーをスクリーニングす
る。ライブラリーは次の要領で構築される。うし肝臓Ｄ
ＮＡを制限エンドヌクレアーゼ酵素Ｓau ３Ａにより部
分消化し、ショ糖勾配により沈降させる。次に、１５−
３０キロ塩基の範囲でのサイズ分画ＤＮＡをバクテリオ
ファージＢamＨＩベクターＥＭＢＬ３に結合する[フリ
シャウフ等、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー」、１７０:８２７−８４２(１９８３)]。ライ
ブラリーを１プレート当たり組換え体８０００個の割合
で培養する。プラークの重複ニトロセルロースレプリカ
を作成し、ウー等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ
・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、７
５：３６８８−９１(１９７８)の手順の修正法に従い増
幅する。 【００３５】３２merプローブを³²Ｐ−ガンマ−ＡＴＰ
によりキナーゼ化し、４５℃で５×ＳＳＣ、０.１％Ｓ
ＤＳ、５×デンハルツ、１００μg／mlのサーモン精液
ＤＮＡ中１セットのフィルターとハイブリダイゼーショ
ンし、４５℃で５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳにより洗浄
する。１７merプローブをキナーゼ化し、５０℃で３モ
ルのテトラメチルアンモニウムクロリド(ＴＭＡＣ)、
０.１モルの燐酸ナトリウム(pＨ６.５)、１ミリモルＥ
ＤＴＡ、５×デンハルツ、０.６％ＳＤＳ、１００μg／
mlサーモン精液ＤＮＡ中他のセットのフィルターとハイ
ブリダイゼーションし、５０℃で３モルＴＭＡＣ、５０
ミリモルのトリス(pＨ８.０)により洗浄する。これらの
条件により、１７merプローブプールに対する不適当な
組合わせの検出は最小限となる[ウッド等、「プロシーデ
ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・
オブ・アメリカ」、８２：１５８５−１５８８(１９８
５)参照]。この方法により４０００００個の組換え体を
スクリーニングし、一デュプリケイト陽性をプラーク精
製する。ラムダbＰ−５０と称するこの組換え体バクテ
リオファージのプレートリゼイトからＤＮＡを分離す
る。bＰ−５０は、１９８６年１２月１６日に受託番号
４０２９５としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション(アメリカ合衆国メリーランド、ロックビ
ル、パークローン・ドライブ１２３０１)(以後「ＡＴＣ
Ｃ」と称す)に寄託された。この寄託物およびこの明細書
に含まれる他の寄託物は、特許手続きを目的とする微生
物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約およびそ
の下での規則の必要条件を満たしている。このbＰ−５
０クローンは、bＢＭＰ−１と称するうし骨成長因子の
少なくとも一部をコードする。 【００３６】このbＢＭＰ−１クローンのオリゴヌクレ
オチド・ハイブリダイゼーション領域は、Ｍ１３中にサ
ブクローン化され、標準技術により配列された約８００
bpのＥcoＲＩフラグメントに対して局在している。ラム
ダbＰ−５０の部分的ＤＮＡ配列および誘導されたアミ
ノ酸配列を下記表２に示す。牛骨２８〜３０kd材料から
分離されたトリプシンフラグメントに対応するアミノ酸
配列は、表２の下線部である。この配列の最初の下線部
分は、オリゴヌクレオチドプローブが設計される上記ト
リプシンフラグメント１に対応する。第二の下線部分
は、上記トリプシンフラグメント２に対応する。予測さ
れたアミノ酸配列は、トリプシンの特異性を考慮して予
想した通り、塩基性残基(Ｒ)がトリプシンフラグメント
２の前にあることを示す。表２におけるヌクレオチド位
置＃２９２−２９３のカップレットＣＴに先行する核酸
配列は、コンセンサス受容配列(すなわち、ピリミジン
濃厚域、ＴＣＴＣＴＣＴＣＣ、次にＡＧ)の存在および
誘導されたアミノ酸配列の適当な位置における塩基性残
基の欠如に基づきイントロン(非コード配列)であると思
われる。このbＢＭＰ−１ゲノム配列は表２において明
白である。このゲノムクローンからの推定に基づくbＢ
ＭＰ−１ペプチド配列は３７アミノ酸長であり、表２に
おけるヌクレオチド＃２９４〜＃４０４のＤＮＡ配列に
よりコードされる。 【００３７】 【表２】 【００３８】Ｂ．bＢＭＰ−２ フラグメント３のアミノ酸配列に基づき、オリゴヌクレ
オチドのプールを成分とする２種のプローブを設計し、
前記と同様に自動ＤＮＡシンセサイザーで合成する。 プローブ＃１：ＡＣＮＡＣＣＡＴ[Ａ/Ｇ]ＴＣ[Ｔ/Ｃ]Ｔ
Ｇ[Ａ/Ｇ]ＡＴ プローブ＃２：ＣＡ[Ａ／Ｇ]ＧＡ[Ｔ／Ｃ]ＡＴＧＧＴＮ
ＧＴＮＧＡ これらのプローブを放射性標識し、これらを用いて、Ａ
項の記載に従い(ただし、ベクターはラムダＪ１ＢamＨ
１armsである)構築されたうしゲノムライブラリーをス
クリーニングする[ムリンズ等、「ネイチャー」、３０
８：８５６−８５８(１９８４)]。放射性標識１７−mer
プローブ＃１を、Ａ項記載の１７merプローブに関する
方法によるフィルターのセットとハイブリダイゼーショ
ンする。上記Ａ項記載の手順により４０００００個の組
換え体をスクリーニングする。一デュプリケイト陽性を
プラーク精製し、ＤＮＡを、ラムダbＰ−２１と称する
組換えバクテリオファージの培養リゼイトから分離す
る。バクテリオファージbＰ−２１は、１９８７年３月
６日にＡＴＣＣ４０３１０の受託番号でＡＴＣＣに寄託
された。bＰ−２１クローンは、bＢＭＰ−２と称するう
し成長因子をコードする。 【００３９】このbＢＭＰ−２クローンのオリゴヌクレ
オチド・ハイブリダイゼーション領域は、Ｍ１３中にサ
ブクローン化され、標準技術により配列決定された約
１.２キロ塩基のＳacＩ制限フラグメントに対して局在
する。このＳacＩフラグメントおよびbＰ−２１の隣接
ＨindIII−ＳacＩ制限フラグメントの部分的ＤＮＡ配列
および誘導されたアミノ酸配列を下記表３に示す。この
クローンからのbＢＭＰ−２ペプチド配列は１２９アミ
ノ酸長であり、ヌクレオチド＃１〜ヌクレオチド＃３８
７のＤＮＡ配列によりコードされる。牛骨２８〜３０kd
材料から分離されたトリプシンフラグメントに対応する
アミノ酸配列は、表３の下線部である。この配列の下線
部分は、bＢＭＰ−２に関するオリゴヌクレオチドプロ
ーブが設計される上記トリプシンフラグメント３に対応
する。予測されたアミノ酸配列は、トリプシンの特異性
を考慮して予想した通り、塩基性残基(Ｋ)がトリプシン
フラグメント３の前にあることを示す。ＣＧＴトリプレ
ットによりコードされるアルギニン残基は、それに隣接
する停止コドン(ＴＡＧ)の存在に基づき恐らく蛋白質の
カルボキシ末端であると思われる。 【００４０】 【表３】【００４１】Ｃ．bＢＭＰ−３ トリプシンフラグメント９(プローブ＃３)、１０(プロ
ーブ＃２)および１１(プローブ＃１)のアミノ酸配列に
基づいて、オリゴヌクレオチドのプールを成分とするプ
ローブを設計し、自動ＤＮＡシンセサイザーで合成す
る。 プローブ＃１:ＡＣＮＧＴＣＡＴ[Ａ／Ｇ]ＴＴＮＧＧ[Ａ
／Ｇ]ＴＡ プローブ＃２:ＣＡ[Ａ／Ｇ]ＴＡ[Ａ／Ｇ]ＴＡＮＧＣ[Ａ
／Ｇ]ＴＣ[Ａ／Ｇ]ＡＡ プローブ＃３:ＴＧ[Ａ／Ｇ／Ｔ]ＡＴＮＧＴＮＧＣ[Ａ／
Ｇ]ＴＧ[Ａ／Ｇ]ＴＴ 上記Ａ項で詳述したＴＭＡＣハイブリダイゼーション方
法により、ＥＭＢＬ３において構築された組換えうしゲ
ノムライブラリーをスクリーニングする。４０００００
個の組換え体を³²Ｐで標識されたプローブ＃１により繰
り返しスクリーニングする。このプローブとハイブリダ
イゼーションした組換え体は全て二次培養として再培養
される。トリプリケイト・ニトロセルロース・レプリカ
は二次培養物から成り、前記と同様に増幅される。３セ
ットのフィルターを再びＴＭＡＣ条件下でプローブ＃
１、＃２および＃３とハイブリダイゼーションする。一
クローン、ラムダbＰ−８１９は３種のプローブ全てと
ハイブリダイゼーションする。これをプラーク精製し、
ＤＮＡをプレートリゼイトから分離する。バクテリオフ
ァージ ラムダbＰ−８１９は、１９８７年６月１６日に
ＡＴＣＣ４０３４４の受託番号下でＡＴＣＣに寄託され
た。このbＰ−８１９クローンは、bＢＭＰ−３と称する
うし骨成長因子をコードする。 【００４２】プローブ＃２とハイブリダイゼーションす
るbＰ−８１９の領域は局在して配列している。この領
域の部分的ＤＮＡおよび誘導されたアミノ酸配列を表４
Ａに示す。トリプシンフラグメント１０および１２に対
応するアミノ酸配列は下線部である。最初の下線部の配
列はフラグメント１２に対応し、第２の下線部の配列は
フラグメント１０に対応する。従って、プローブ＃２と
ハイブリダイゼーションするbＰ−８１９のこの領域
は、少なくとも１１１個のアミノ酸をコードする。この
アミノ酸配列は、ヌクレオチド＃４１４〜＃７４６のＤ
ＮＡ配列によりコードされる。 【００４３】 【表４】【００４４】プローブ＃１および＃３とハイブリダイゼ
ーションするbＰ−８１９の領域は局在して配列してい
る。この領域の部分的ＤＮＡおよび誘導されたアミノ酸
配列を表４Ｂに示す。トリプシンフラグメント９および
１１に対応するアミノ酸配列は下線部である。最初の下
線部の配列はフラグメント９に対応し、第２の下線部の
配列はフラグメント１１に対応する。プローブ＃１およ
び＃３とハイブリダイゼーションするbＰ−８１９のこ
の領域のペプチド配列は、表４Ｂのヌクレオチド＃３０
５〜＃４９３によりコードされる長さ６４個のアミノ酸
である。ＡＧＡトリプレットによりコードされるアルギ
ニン残基は、それに隣接する停止コドン(ＴＡＡ)の存在
に基づき蛋白質のカルボキシ末端であると思われる。カ
ップレットＴＣ(３０５−３０６位)に先行する核酸配列
は、コンセンサス受容配列(すなわち、ピリミジン濃厚
域、ＴＴＣＴＣＣＣＴＴＴＴＣＧＴＴＣＣＴ、次にＡ
Ｇ)の存在および誘導されたアミノ酸配列の適当な位置
における塩基性残基以外の停止配列の存在に基づきイン
トロン(非コード配列)であると思われる。 【００４５】従って、bＢＭＰ−３は、表４Ａおよび４
ＢのＤＮＡおよびアミノ酸配列を有することを特徴とす
る。このクローンのペプチド配列は１７４アミノ酸長で
あり、表４Ａのヌクレオチド＃４１４〜ヌクレオチド＃
７４６および表４Ｂのヌクレオチド＃３０５〜ヌクレオ
チド＃４９３のＤＮＡ配列によりコードされる。 【００４６】 【表５】 【００４７】実施例５ ひと骨誘導因子 Ａ．hＢＭＰ−１ うしおよびひとの骨成長因子遺伝子は著しく相同性を示
すと思われるため、表２のうしbＢＭＰ−１ ＤＮＡ配列
(またはその一部分)をプローブとして用いることによ
り、ひと遺伝子ライブラリーをスクリーニングする。う
しゲノムクローンの８００bp ＥcoＲＩフラグメントを
ニック翻訳により³²Ｐで標識する。ひとゲノムライブラ
リー(ツール等、前出)を、１プレート当たり組換え体４
００００個の割合で２０プレートにおいて培養する。デ
ュプリケイト・ニトロセルロースフィルター・レプリカ
は、各プレートで構成されており、５０℃で約１４時間
５×ＳＳＣ、５×デンハルツ、１００μg／ml変性サー
モン精液ＤＮＡ、０.１％ＳＤＳ(標準ハイブリダイゼー
ション溶液)中ニック翻訳プローブとハイブリダイゼー
ションされる。次いで、フィルターを５０℃で１×ＳＳ
Ｃ、０.１％ＳＤＳにより洗浄し、オートラジオグラフ
ィーに付す。５つのデュプリケイト陽性を分離し、プラ
ーク精製する。これらの組換えバクテリオファージのう
ちの１種、ＬＰ−Ｈ１のプレート・リゼイトからＤＮＡ
を得る。ＬＰ−Ｈ１は１９８７年３月６日にＡＴＣＣに
寄託された(受託番号４０３１１)。このクローンは、h
ＢＭＰ−１というひとゲノム骨成長因子の少なくとも一
部分をコードする。ＬＰ−Ｈ１のハイブリダイゼーショ
ン領域は、２.５キロ塩基ＸbaＩ／ＨindIII制限フラグ
メントに対して局在している。 【００４８】ラムダＬＰ−Ｈ１の部分的ＤＮＡ配列およ
び誘導されたアミノ酸配列を下記表５に示す。このクロ
ーンからのペプチド配列は３７アミノ酸長であり、ヌク
レオチド＃３４４０〜ヌクレオチド＃３５５０のＤＮＡ
配列によりコードされる。表５のコード配列の側面に
は、約２８個のヌクレオチド(推定に基づく５'非コード
配列)および約１９個のヌクレオチド(推定に基づく３'
非コード配列)が存在する。表２のbＢＭＰ−１配列と表
５のhＢＭＰ−１ゲノム配列とを比較すると、両配列間
に顕著な相同性の存在することが示される。コード領域
のサイズおよび非コード領域の位置は、一般に異なる種
類の相同性遺伝子においても保持されているため、骨誘
導因子遺伝子のコードおよび非コード領域の配置は同定
され得る。相同部位においてシグナルを生じるＲＮＡが
側面に位置する、２種類の遺伝子間の相同性領域は、コ
ード領域を示す。 【００４９】 【表６】 【００５０】表５に示されたひとコード配列に特異的な
プローブを用いることにより、骨誘導因子を合成するひ
とセルラインまたは組織を同定する。このプローブは次
の方法に従い作成される。下記配列 (a) GGGAATTCTGCCTTTCTTGGGGACATTGCCCTGGACGAAGAGGACCTGAG (b) CGGGATCCGTCTGAGATCCACAGCCTGCTGTACCTGGAAGGCCCTCAGG を有する２種のオリゴヌクレオチドを自動シンセサイザ
ーで合成し、アニーリングし、エシェリヒア・コリＤＮ
ＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメントを用いて広
げ、制限酵素ＥcoＲＩおよびＢamＨＩにより消化し、Ｍ
１３ベクターに挿入する。次に、一本鎖³²Ｐ標識プロー
ブは、標準技術によりこのサブクローンの鋳型調製物に
より作成される。ツール等の方法(前出)により、様々な
細胞および組織供給源由来のポリアデニル化ＲＮＡをホ
ルムアルデヒド-アガロースゲルにより電気泳動させ、
ニトロセルロースに移動させる。次いで、このプローブ
を、４２℃で一夜５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、
０.１％ＳＤＳ、４０ミリモルの燐酸ナトリウム(pＨ６.
５)、１００μg／mlの変性サーモン精液ＤＮＡおよび５
ミリモルのバナジルリボヌクレオシド中ニトロセルロー
ス・ブロットとハイブリダイゼーションし、０.２×Ｓ
ＳＣ、０.１％ＳＤＳ中６５℃で洗浄する。オートラジ
オグラフィーによると、ひと骨肉腫セルラインＵ−２
ＯＳ由来のＲＮＡを含むレーンは、約４.３および３.０
キロ塩基のＲＮＡ種に対応するハイブリダイゼーション
・バンドを含んでいる。 【００５１】cＤＮＡをＵ−２ ＯＳポリアデニル化ＲＮ
Ａから合成し、確立された技術により(ツール等、前出)
ラムダgt１０にクローン化する。このライブラリーから
の組換え体２００００個を５０プレートの各々において
培養する。デュプリケイト・ニトロセルロース・レプリ
カはこれらのプレートで構成される。前記オリゴヌクレ
オチドを³²Ｐ−ガンマ−ＡＴＰによりキナーゼ化し、５
５℃で一夜標準ハイブリダイゼーション溶液中で２セッ
トのレプリカとハイブリダイゼーションする。次いで、
フィルターを５５℃で１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳによ
り洗浄し、オートラジオグラフィーに付す。ラムダＵ２
ＯＳ−１と称する一デュプリケイト陽性をプラーク精製
する。ラムダＵ２ＯＳ−１は１９８７年６月１６日にＡ
ＴＣＣに寄託された(受託番号４０３４３)。ラムダＵ２
ＯＳ−１の挿入体の全ヌクレオチド配列および誘導され
たアミノ酸配列を表６に示す。このcＤＮＡクローン
は、分泌された蛋白質特有の疎水性リーダー配列が後に
続くメチオニンをコードし、ヌクレオチド位２２２６−
２２２８の停止コドンを含む。このクローンは、このア
ミノ酸配列に基づき分子量og８３キロダルトンを有する
７３０個のアミノ酸で構成される蛋白質をコードする、
２１９０bpのオープン・リーディング・フレームを含
む。このクローンは、表５に示したコード領域と同じ配
列を含む。この蛋白質は、分泌後開裂してhＢＭＰ−１
蛋白質を生成する一次翻訳産物を示すと考えられる。従
って、このクローンは、ゲノムhＢＭＰ−１配列ラムダ
ＬＰ−Ｈ１に含まれるひと遺伝子フラグメントに対応す
るhＢＭＰ−１のcＤＮＡである。ただし、ＢＭＰ−１の
アミノ酸＃５５０〜＃５９０は、表皮成長因子並びにプ
ロテインＣ、第Ｘ因子および第IX因子の「成長因子」領域
と相同性である。 【００５２】 【表７】 【表８】【表９】【表１０】 【００５３】Ｂ．hＢＭＰ−２:クラスＩおよびII 実施例４Ｂ記載のＨindIII−ＳacＩうしゲノムbＢＭＰ
−２フラグメントをＭ１３ベクターにサブクローンす
る。³²Ｐ−標識一本鎖ＤＮＡプローブは、このサブクロ
ーンの鋳型調製物から作成される。このプローブを用い
ることにより、Ａ項で前述された様々な細胞および組織
供給源由来のポリアデニル化ＲＮＡをスクリーニングす
る。約３.８キロ塩基のmＲＮＡ種に対応するハイブリダ
イゼーション・バンドは、ひとセルラインＵ−２ ＯＳ
由来のＲＮＡを含むレーンにおいて検出される。ＨindI
II−ＳacＩフラグメントをニック翻訳により³²Ｐで標識
し、これを用いて、６５℃で一夜標準ハイブリダイゼー
ション緩衝液中でハイブリダイゼーションし、次いで６
５℃で１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳにより洗浄すること
により、前記Ｕ−２ ＯＳcＤＮＡライブラリーのニトロ
セルロース・フィルター・レプリカをスクリーニングす
る。１２個のデュプリケイト陽性クローンを取り上げ、
二次培養として再培養する。デュプリケイト・ニトロセ
ルロース・レプリカは二次培養物から成り、一次スクリ
ーニングを行なった場合と同様に両セット共うしゲノム
プローブとハイブリダイゼーションされる。次いで６５
°で一方のセットのフィルターを１×ＳＳＣ、０.１％
ＳＤＳで洗浄し、他方のセットを０.１×ＳＳＣ、０.１
％ＳＤＳで洗浄する。 【００５４】２クラスのhＢＭＰ−２ cＤＮＡクローン
は、高いストリンジェント洗浄条件下(０.１×ＳＳＣ、
０.１％ＳＤＳ)において、強い(４組換え体)または弱い
(７組換え体)ハイブリダイゼーション・シグナルに基づ
き明白である。１１組換えバクテリオファージ全部をプ
ラーク精製し、小規模ＤＮＡ調製物を各々の培養リゼイ
トから作成し、配列分析用に挿入体をpＳＰ６５および
Ｍ１３にサブクローン化する。hＢＭＰ−２・クラスＩ
と称する(ＢＭＰ−２としても知られている)強いハイブ
リダイゼーションクローンの配列分析は、それらが表３
に示された配列と強い配列相同性を有することを示す。
従ってこれらのクローンは、bＢＭＰ−２遺伝子(この部
分配列は表３に示されている)によりコードされる蛋白
質のひと均等蛋白質をコードするcＤＮＡである。hＢＭ
Ｐ−２・クラスIIと称する(ＢＭＰ−４としても知られ
ている)弱いハイブリダイゼーション組換え体の配列分
析は、それらもまた、それらのコード領域の３'末端に
おいて表３に示した配列と全く相同性である(ただし、
さらに大きい５'領域ではそれほどではない)ことを示
す。すなわち、それらは、同一ではないが、前記構造と
の類似構造を有するひと蛋白質をコードする。 【００５５】完全長のhＢＭＰ−２・クラスＩcＤＮＡク
ローンも同様の方法で得られる。クラスIIサブクローン
の１つ(II−１０−１)の１.５キロ塩基挿入体を分離
し、ニック翻訳により放射性標識する。上記でスクリー
ニングされたＵ−２ ＯＳ cＤＮＡライブラリーのニト
ロセルロース・レプリカ(５０フィルター、１００００
００組換え体バクテリオファージに対応)の１セット
を、ストリンジェント条件下(標準ハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液中６５°でハイブリダイゼーション、６５°
で０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで洗浄)でこのプロー
ブとハイブリダイゼーションする。クラスIIプローブと
はハイブリダイゼーションしないうしゲノムプローブと
ハイブリダイゼーションする組換え体全部を選び取り、
プラーク精製する(１０組換え体)。プレートのストック
を作り、小規模バクテリオファージＤＮＡ調製物を作成
する。Ｍ１３へのサブクローニング後、配列分析は、こ
れらのうち４つが元のクラスＩクローンと部分的に一致
するクローンを表すことを示す。これらの中の１つ、ラ
ムダＵ２ＯＳ−３９は、約１.５キロ塩基の挿入体を含
んでおり、１９８７年６月１６日付けでＡＴＣＣに寄託
された(受託番号４０３４５)。部分的ＤＮＡ配列(ラム
ダＵ２ＯＳ−３９および幾つかの他のhＢＭＰ−２クラ
スＩcＤＮＡ組換え体から編集された)および誘導された
アミノ酸配列を下記表７に示す。ラムダＵ２ＯＳ−３９
は、その部分配列が表３に示されているうし遺伝子セグ
メントによりコードされる蛋白質ＢＭＰ−２のひと対応
部全体をコードするのに必要なヌクレオチド配列を全て
含むものと予想される。このひとcＤＮＡ hＢＭＰ−２
クラスＩは、３９６個のアミノ酸から成る蛋白質をコー
ドする、１１８８bpのオープン・リーディング・フレー
ムを含む。３９６個のアミノ酸から成るこの蛋白質は、
このアミノ酸配列に基づき４５キロダルトンの分子量を
有する。この配列は、一次翻訳産物を表すものと考えら
れる。全フレームにおいて停止コドンを有する３４２bp
の５'未翻訳領域がこの蛋白質に先行する。この５'未翻
訳領域に先行する１３bp領域は、cＤＮＡクローニング
方法で使用されるリンカーを表す。 【００５６】 【表１１】【表１２】【表１３】 【００５７】完全な長さのhＢＭＰ−２・クラスIIひとc
ＤＮＡクローンは、次の要領で得られる。クラスII組換
えII−１０−１の５'端部からの２００bp ＥcoＲＩ−Ｓ
acＩフラグメントをそのプラスミド・サブクローンから
分離し、ニック翻訳により標識し、Ｕ−２ ＯＳ cＤ
ＮＡライブラリー(２５フィルター／セット、５０００
００個の組換え体を示す)の１セットのデュプリケイト
・ニトロセルロース・レプリカとハイブリダイゼーショ
ンする。前記ストリンジェント条件下でハイブリダイゼ
ーションおよび洗浄を行う。１６デュプリケイト陽性を
選び取り、二次培養として再培養する。二次培養のニト
ロセルロース・フィルター・レプリカを作成し、II−１
０−１の配列と対応すべく合成された、下記配列 CGGGCGCTCAGGATACTCAAGACCAGTGCTG を有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション
する。５０℃で標準ハイブリダイゼーション緩衝液中で
ハイブリダイゼーションし、１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤ
Ｓにより５０°で洗浄する。このオリゴヌクレオチドと
ハイブリダイゼーションする１４組換えバクテリオファ
ージをプラーク精製する。プラーク・ストックを作り、
小規模バクテリオファージＤＮＡ調製物を作成する。こ
れらの中の３つをＭ１３にサブクローニング後、配列分
析は、それらが元のクラスIIクラスと部分的に一致する
クローンを表すことを示す。これらの中の１つ、ラムダ
Ｕ２ＯＳ−３は１９８７年６月１６日付けでＡＴＣＣに
寄託された(受託番号４０３４２)。Ｕ２ＯＳ−３は約
１.８キロ塩基の挿入体を含む。Ｕ２ＯＳ−３の部分的
ＤＮＡ配列および誘導されたアミノ酸配列を下記表８に
示す。このクローンは、全ひとＢＭＰ−２・クラスII蛋
白質をコードするのに必要なヌクレオチド配列の全てを
含むものと予想される。このcＤＮＡは、全フレームに
おいて停止コドンを有する３９４bpの５'未翻訳領域が
先行し、４０８個のアミノ酸から成る蛋白質をコードす
る、１２２４bpのオープン・リーディング・フレームを
含み、イン-フレーム停止コドンの後に３０８bpの３'未
翻訳領域を含む。５'未翻訳領域に先行する８bp領域
は、cＤＮＡクローニング方法で使用されるリンカーを
表す。４０８個のアミノ酸から成る蛋白質は４７キロダ
ルトンの分子量を有し、一次翻訳産物を表すものと考え
られる。 【００５８】 【表１４】 【表１５】【表１６】 【００５９】表３、４、７および表８に示されたＢＭＰ
−２・クラスＩおよびII並びにＢＭＰ−３の配列は、イ
ンヒビンのベータ(Ｂ)(Inhβ_B)およびベータ(Ａ)(Inhβ
_A)サブユニットと顕著な相同性を有する。インヒビン
は、避妊における使用に関して現在研究されているホル
モンの一種である。メゾン等、「ネイチャー」、３１８:
６５９−６６３(１９８５)参照。さらに範囲を狭める
と、それらはまた、ムレリアン阻害物質(ＭＩＳ)、雄性
胚の成長中におけるムレリアン導管の退行を誘発する精
巣性糖蛋白質、および細胞の成長を阻害または刺激し
得、またはそれらを分化させ得る形質転換成長因子−ベ
ータ(ＴＧＦβ)とも相同性を呈する。さらに、hＢＭＰ
−２・クラスＩ、クラスIIをコードする表７および表８
の配列は、ドロソフィラ・デカペンタプレジック(ＤＰ
Ｐ−Ｃ)遺伝子座転写体と顕著な相同性を有する。マッ
サーグ、「セル」、４９：４３７−４３８(１９８７)、パ
ジェット等、「ネイチャー」、３２５：８１−８４(１９
８７)、ケート等、「セル」、４５：６８５−６９８(１９
８６)参照。従って、ＢＭＰ−２が、この発生的突然変
異遺伝子座からのこの転写体から作られた蛋白質のひと
相同体であり得ることが考えられる。以下、これらの相
同性を表９により示す。 【００６０】 【表１７】 【００６１】Ｃ．ＢＭＰ−３ うしおよびひとの骨成長因子遺伝子が顕著な相同性を有
すると思われるため、表４Ａおよび４ＢのうしＤＮＡ配
列とハイブリダイゼーションすることが示されたオリゴ
ヌクレオチド・プローブを用いてひとゲノム・ライブラ
リーをスクリーニングする。これらのプローブを用いて
ひとゲノムライブラリー(ツール等、前出)をスクリーニ
ングし、仮定的陽性を分離すると、前記と同様にＤＮＡ
配列が得られる。この組換え体がひと骨誘導因子分子の
一部をコードするという証拠は、うし／ひと蛋白質およ
び遺伝子構造相同性に存する。一旦ひとＢＭＰ−３分子
の一部をコードするＤＮＡを含む組換えバクテリオファ
ージが得られると、実施例５(Ａ)の記載と同様にひとコ
ード配列をプローブとして用いることにより、ＢＭＰ−
３を合成するひとセルラインまたは組織を同定する。m
ＲＮＡをオリゴ(dＴ)セルロース・クロマトグラフィー
により選択し、cＤＮＡを確立された技術により(ツール
等、前出)合成し、ラムダgt１０においてクローン化す
る。 【００６２】別法として、このひと骨誘導因子をコード
する全遺伝子は、必要ならば追加の組換えクローンにお
いて同定および生成され得る。このひと骨誘導因子遺伝
子のさらに別の３'または５'領域を含む追加の組換え体
は、元のクローンの端部(複数も可)における独特のＤＮ
Ａ配列を同定し、これらをプローブに用いてひとゲノム
ライブラリーを再スクリーニングすることにより生産さ
れ得る。次いで、この遺伝子は、標準的分子生物学技術
により単一プラスミドにおいて再会合され、細菌におい
て増幅され得る。次に、全ひとＢＭＰ−３因子遺伝子は
適当な発現ベクターに移入され得る。次いで、この遺伝
子を含む発現ベクターによりほ乳類細胞、例えばさるＣ
ＯＳ細胞をトランスフェクションし、その細胞において
ひと遺伝子が転写され、ＲＮＡは正確にスプライシング
される。トランスフェクションされた細胞の培地を、遺
伝子が完全であることの指標としてこの明細書に記載さ
れた骨誘導因子活性に関して検定する。これらの細胞か
らmＲＮＡを得、このmＲＮＡ供給源からcＤＮＡを合成
し、クローン化する。同様に上記方法を用い、プローブ
供給源としてうし骨誘導因子および／またはひと骨誘導
因子を利用することにより、興味の対象である他の種類
の骨誘導因子を分離することが可能である。これらの他
の種類の骨誘導因子は、特に骨折修復において似た有用
性を有し得る。 【００６３】実施例６ 骨誘導因子の発現 うし、ひとまたは他のほ乳類の骨誘導因子を製造するた
めに、常用的遺伝子工学技術により、それをコードする
ＤＮＡを適当な発現ベクターに移入し、ほ乳類細胞に導
入する。当業界の熟練者であれば、表２〜８の配列また
は他の修飾配列並びに既知ベクター、例えばpＣＤ[岡山
等、「モル．セル・バイオル.」、２：１６１−１７０(１
９８２)]およびpＪＬ３、pＪＬ４[ゴフ等、「ＥＭＢＯ・
ジャーナル」、４：６４５−６５３(１９８５)]を用いる
ことによるほ乳類発現ベクターの構築は可能である。こ
れらのベクターを用いた適当な宿主細胞の形質転換によ
り、骨誘導因子が発現され得る。当業界の熟練者であれ
ば、コード配列の側面に位置するほ乳類調節配列を削除
またはこれを細菌性配列と置き換えることにより表２〜
８の配列を操作し、細菌細胞による細胞内または細胞外
発現用細菌性ベクターを構築することが可能である。例
えば、コード配列はさらに操作(例、他の既知リンカー
と結合または他の公知技術によるそこからの非コード配
列の欠失もしくは存在するヌクレオチドの改編による修
飾)され得る。次いで、修飾骨誘導因子コード配列は、
例えば谷口等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ
・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、７７：
５２３０−５２３３(１９８０)に記載された方法を用い
て既知細菌性ベクターに挿入され得る。次いで、この実
例的細菌性ベクターにより細菌宿主細胞を形質転換し、
骨誘導因子を発現させ得る。細菌細胞における骨誘導因
子の細胞外発現の実施戦略については、例えばヨーロッ
パ特許出願ＥＰＡ１７７３４３を参照。 【００６４】昆虫細胞で発現させる昆虫性ベクターの構
築についても同様の操作が実施され得る[例えば、公開
されたヨーロッパ特許出願１５５４７６記載の方法を参
照]。酵母ベクターもまた、酵母細胞によるこの発明の
因子の細胞内または細胞外発現を目的とする酵母調節配
列を用いて構築され得る。[例えば、公開ＰＣＴ出願Ｗ
Ｏ８６／００６３９およびヨーロッパ特許出願ＥＰＡ１
２３２８９参照]。ほ乳類細胞から高レベルの本発明骨
誘導因子を製造する方法は、異種骨誘導因子遺伝子の多
数のコピーを含む細胞の構築を含む。異種遺伝子は、増
幅可能なマーカー、例えばジヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨ
ＦＲ)遺伝子(この場合、カウフマンおよびシャープ、
「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」、１
５９：６０１−６２９(１９８２)の方法に従い、多量の
遺伝子コピーを含む細胞が、メトトレキセート(ＭＴＸ)
の高濃縮液における伸長に関して選択され得る)に結合
され得る。この方法は幾つかの異なる細胞タイプにより
使用され得る。例えば、この発明の骨誘導因子に関する
ＤＮＡ配列を含むプラスミドは、その発現を可能にする
他のプラスミド配列およびＤＨＦＲ発現プラスミドpＡd
Ａ２６ＳＶ(Ａ)３[カウフマンおよびシャープ、「モレキ
ュラー・アンド・セルラー・バイオロジー」、２：１３
０４(１９８２)]と効果的に組合わされて、燐酸カルシ
ウム共沈澱およびトランスフェクションによりＤＨＦＲ
−欠失ＣＨＯ細胞、ＤＵＫＸ−ＢＩＩ中に共に導入され
得る。ＤＨＦＲ発現形質転換体を、透析うし胎児血清を
含むアルファ培地での成長に関して選択し、続いてＭＴ
Ｘ高濃縮液(０.０２、０.２、１.０および５マイクロモ
ルのＭＴＸにおける連続段階)での成長による増幅に関
して選択する[カウフマン等、「モレキュラー・アンド・
セラー・バイオロジー」、５:１７５０(１９８３)の記載
による]。形質転換体をクローン化し、ラット骨形成検
定により生物学的活性骨誘導因子発現をモニターする。
骨誘導因子発現はＭＴＸ耐性のレベルが高くなると、増
加すべきである。同様の方法は、他の骨誘導因子の製造
にも使用され得る。 【００６５】別法として、ひと遺伝子は前記に従い直接
的に発現される。活性骨誘導因子は細菌または酵母細胞
において製造され得る。しかしながら、生物学的活性組
換えひと骨誘導因子に対して現在好ましい発現系は、安
定して形質転換されたＣＨＯ細胞である。一実施態様と
して、実施例５のひと骨誘導因子(hＢＭＰ−１)を製造
するためには、ＳalＩ消化によりＵ２ＯＳ−１の挿入体
をベクターarmsから放出させ、ＸhoＩにより消化された
ほ乳類発現ベクターpＭＴ２ＣＸにサブクローン化す
る。ＤＥＡＥ−デキストラン方法を用いて[ソンパイラ
ックおよびダンナ、「ＰＮＡＳ」、７８：７５７５−７５
７８(１９８１)、ルトマンおよびマグヌッソン、「ニュ
クレイック・アシッズ・リサーチ」、１１:１２９５−１
３０８(１９８３)]、このサブクローンからのプラスミ
ドＤＮＡによりＣＯＳ細胞をトランスフェクションす
る。血清不含有２４時間条件培地を細胞から集める(ト
ランスフェクションの４０−７０時間後開始)。ほ乳類
発現ベクターpＭＴ２ Ｃla−Ｘho(pＭＴ２ＣＸ)は、p９
１０２３(b)(ウォング等、「サイエンス」、２２８：８１
０−８１４、１９８５年)の誘導体であり、後者がテト
ラサイクリン耐性遺伝子ではなくアンピシリン耐性遺伝
子を含み、さらにcＤＮＡクローンの挿入に関するＸho
Ｉ部位を含む点で相異する。pＭＴ２ Ｃla−Ｘhoの機能
的要素については既に記載されており(カウフマン、１
９８５年、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナ
イテッド・ステーツ・オブ・アメリカ、８２：６８９−
６９３)、アデノウイルスＶＡ遺伝子、７２bpエンハン
サーを含むＳＶ４０複製開始点、５'スプライス部位を
含むアデノウイルス主後期プロモーターおよびアデノウ
イルス三部分リーダー配列の大部分(アデノウイルス後
期mＲＮＡに存在)、３'スプライス受容部位、ＤＨＦＲ
挿入体、ＳＶ４０早期ポリアデニレーション部位(ＳＶ
４０)並びにエシェリヒア・コリにおける伸長に必要と
されるpＢＲ３２２配列が含まれる。 【００６６】プラスミドpＭＴ２ Ｃla−Ｘhoは、pＭＴ
２−ＶＷＦのＥcoＲＩ消化により得られる[アメリカ合
衆国、メリーランド、ロックビルのアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション(ＡＴＣＣ)に寄託された
(受託番号ＡＴＣＣ６７１２２)]。ＥcoＲＩ消化によりp
ＭＴ２−ＶＷＦに存在するcＤＮＡ挿入体が切除され、
線状形態のpＭＴ２が生成する。これを結合して用いる
ことにより、エシェリヒア・コリＨＢ１０１またはＤＨ
−５をアンピシリン耐性に形質転換することができる。
プラスミドpＭＴ２ ＤＮＡは常法により製造され得る。
次に、pＭＴ２をＥcoＲＶおよびＸbaＩで消化し、消化
されたＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラ
グメントで処理し、Ｃlaリンカー(ネバイオラブズ、Ｃ
ＡＴＣＧＡＴＧ)を結合することによりpＭＴ２ＣＸが構
築される。これは、ＳＶ４０複製開始点付近のＨindIII
部位から出発する塩基２２６６〜２４２１およびpＭＴ
２のエンハンサー配列を除く。次に、プラスミドＤＮＡ
をＥcoＲＩで消化し、前記と同様にブラント化し、Ｅco
ＲＩアダプターに結合し、 ５' ＰＯ₄−ＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴ ３' ３' ＧＧＡＧＣＴＣＴＣＧＡ ５' ＸhoＩで消化し、結合することによりpＭＴ２ Ｃla−Ｘ
hoが得られ、次いでこれを用いてエシェリヒア・コリを
アンピシリン耐性に形質転換することができる。プラス
ミドpＭＴ２ Ｃla−Ｘho ＤＮＡは常法により製造され
得る。得られた骨誘導因子は、通常の蛋白質分離・精製
法によって分離及び精製される。これらの方法に特に限
定はなく、ゲル濾過法、アフィニティークロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマト
グラフィー、ＨＰＬＣ等を組み合わせて用いることがで
きる。分離・精製は、ラット骨形成検定による生物学的
活性および／または抽出ウシ骨誘導因子の特性検定結果
等を指標として効率的に用い得る。 【００６７】実施例７ 発現した骨誘導因子の生物学的活性 Ａ．ＢＭＰ−１ 上記実施例６で得られた発現した骨誘導因子(hＢＭＰ−
１)の生物学的活性を測定する。因子をヘパリン・セフ
ァロースカラムにおいて部分的に精製する。１枚の１０
０mm皿から得たトランスフェクション上清４mlを、ＹＭ
１０膜を用いた限外ろ過により約１０倍に濃縮し、次い
で２０ミリモルのトリス、０.１５モルＮaＣl(pＨ７.
４)(出発緩衝液)に対して透析する。次に、この材料を
出発緩衝液中１.１mlヘパリン・セファロースカラムに
適用する。出発緩衝液の８ml洗浄液により未結合蛋白質
を除去し、２０ミリモルのトリス、２.０モルＮaＣl(p
Ｈ７.７４)の３−４ml洗浄液によりＢＭＰ−１を含む結
合蛋白質を脱着させる。ヘパリンカラムにより結合した
蛋白質をセントリコン１０において約１０倍に濃縮し、
０.１％トリフルオロ酢酸を用いてジアフィルトレーシ
ョンすることにより塩を還元する。この溶液の適量を２
０mgのラットマトリックスと混合し、次いで前記実施例
３の記載に従いインビボ骨および軟骨形成に関して検定
する。ＭＯＣＫ(モック)トランスフェクション上清分画
を対照として使用する。特定量のひとＢＭＰ−１が加え
られたラットマトリックスを含むインプラントを７日後
にラットから除去し、組織評価を行う。各インプラント
からの代表的部分を、新規骨無機質の存在に対してボン
・コッサおよび酸性フーシンにより染色し、軟骨特異的
マトリックス形成の存在に対してトルイジンブルーによ
り染色する。その部分内に存在する細胞のタイプおよび
これらの細胞が表現型を示す程度を評価する。 【００６８】ひとＢＭＰ−１をマトリックス材料に加え
ると、内植の７日後に軟骨様小節が形成された。軟骨芽
(細胞)型細胞は、形状および異染性マトリックスの発現
により認識され得る。ひとＢＭＰ−１において観察され
る活性の量は、マトリックスに加えられたひとＢＭＰ−
１蛋白質の量により異なった。表９は、観察された骨誘
導量に対するひとＢＭＰ−１蛋白質の用量応答関係を示
す。 【００６９】 表１０インプラント番号 使用量(トランスフェク 組織学的スコア ション培地１mlの当量) ８７６-１３４-１ １０ＢＭＰ−１ Ｃ＋２ ８７６-１３４-２ ３ＢＭＰ−１ Ｃ＋１ ８７６-１３４-３ １ＢＭＰ−１ Ｃ＋／− ８７６-１３４-４ １０ＭＯＣＫ Ｃ− ８７６-１３４-５ ３ＭＯＣＫ Ｃ− ８７６-１３４-６ １ＭＯＣＫ Ｃ− 【００７０】軟骨(c)活性を０(−)〜５の尺度に基づい
て評価した。類似レベルの活性は、ヘパリンセファロー
ス分画ＣＯＳ細胞抽出物においても観察される。６モル
尿素が全緩衝液に含まれること以外は前記方法と同様の
方法で部分精製を実施する。さらに、上記ラット骨形成
検定において、ＢＭＰ−２も同様に軟骨形成活性を示し
た。上記方法を用い、プローブ供給源としてうし骨誘導
因子および／またはひと骨誘導因子を利用することによ
り興味深い他の骨誘導因子を分離することができる。そ
れらの他の骨誘導因子は、特に骨折修復において似た有
用性を呈し得る。以上、この発明の好ましい実施態様に
ついて詳細に記載した。その実施に際し、これらの記載
事項を考慮して多くの修正および変更が行なわれること
は当業界の熟練者であれば容易に想到し得るはずであ
る。それらの修正および変更も後記請求の範囲内に包含
されるものと考えられる。 【００７１】 微 生 物 寄託機関の名称 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション 寄託機関の住所 １２３０１ パークローン・ドライブ ロックビル、メリーランド２０８５２、アメリカ合衆国寄託物の名称 ＡＴＣＣ番号 引用頁／行 寄託の日付 ＬＰ−Ｈ１ ４０３１１ ２９／２０ 1987年3月4日 bＰ５０ ４０２９５ ２０／３ 1986年12月15日 bＰ−２１ ４０３１０ ２２／１８ 1987年3月4日 Ｕ２ＯＳ−３ ４０３４２ ４４／２２ 1987年6月16日 ラムダU2-OS-1 ４０３４３ ３２／３３ 1987年6月16日 ラムダBP819 ４０３４４ ２５／２３ 1987年6月16日 Ｕ２ＯＳ-39 ４０３４５ ３９／２１ 1987年6月16日 【００７２】この発明によって下記の各事項が可能とな
る。 (１)医薬的に許容し得る賦形剤中に、(a)ＢＭＰ−１、
(b)ＢＭＰ−２・クラスＩ、(c)ＢＭＰ−２・クラスII、
(d)ＢＭＰ−３、およびそれらの混合物から成る群から
選ばれる蛋白質を含有して成る医薬組成物。 (２)蛋白質がＢＭＰ−１である、１記載の組成物。 (３)蛋白質がＢＭＰ−２・クラスＩである１記載の組成
物。 (４)蛋白質がＢＭＰ−２・クラスIIである１記載の組成
物。 (５)蛋白質がＢＭＰ−３である、１記載の組成物。 (６)さらに、骨または軟骨欠損部位に組成物を送達し、
骨形成誘導構造を提供し得るマトリックスを含む、１記
載の医薬組成物。 (７)マトリックスが、ヒドロキシアパタイト、コラーゲ
ン、ポリ乳酸および燐酸三カルシウムから成る群から選
択される材料を含む、６記載の組成物。 (８)骨または軟骨形成を必要とする患者における骨形成
誘導方法であって、１−７のいずれか１項記載の組成物
の有効量を患者に投与することを含む方法。 (９)ＢＭＰ−１をコードするＤＮＡ配列により形質転換
されたセルラインを適当な培養培地で培養し(ただし、
前記ＤＮＡ配列は適切な発現制御配列と組合わされてい
る)、培養培地からＢＭＰ−１を分離することを含むＢ
ＭＰ−１の製造方法。 (10)ＤＮＡ配列が実質的に下記ヌクレオチド配列を含ん
でいる、９記載の方法。 【表１８】【表１９】【表２０】【表２１】 (11)ＢＭＰ−２・クラスＩをコードするＤＮＡ配列によ
り形質転換されたセルラインを適当な培養培地で培養し
(ただし、前記ＤＮＡ配列は適切な発現制御配列と組合
わされている)、培養培地からＢＭＰ−２・クラスＩを
分離することを含むＢＭＰ−２・クラスＩの製造方法。 (12)ＤＮＡ配列が実質的に下記ヌクレオチド配列を含ん
でいる、１１記載の方法。 【表２２】【表２３】【表２４】 【００７３】(13)ＢＭＰ−２・クラスIIをコードするＤ
ＮＡ配列により形質転換されたセルラインを適当な培養
培地で培養し(ただし、前記ＤＮＡ配列は適切な発現制
御配列と組合わされている)、培養培地からＢＭＰ−２
・クラスIIを分離することを含むＢＭＰ−２・クラスII
の製造方法。 (14)ＤＮＡ配列が実質的に下記ヌクレオチド配列を含ん
でいる、１３記載の方法。 【表２５】【表２６】【表２７】 (15)ＢＭＰ−３をコードするＤＮＡ配列により形質転換
されたセルラインを適当な培養培地で培養し(ただし、
前記ＤＮＡ配列は適切な発現制御配列と組合わされてい
る)、培養培地からＢＭＰ−３を分離することを含むＢ
ＭＰ−３の製造方法。 (16)ＤＮＡ配列が実質的に下記ヌクレオチド配列を含ん
でいる、１５記載の方法。 【表２８】 および 【表２９】 (17)実質的に１０記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−１
の実質的特性を呈する蛋白質をコードする配列を含むＢ
ＭＰ−１をコードするcＤＮＡ配列。 (18)実質的に１２記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−２
・クラスＩの実質的特性を呈する蛋白質をコードする配
列を含むＢＭＰ−２・クラスＩをコードするcＤＮＡ配
列。 (19)実質的に１４記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−２
・クラスIIの実質的特性を呈する蛋白質をコードする配
列を含むＢＭＰ−２・クラスIIをコードするcＤＮＡ配
列。 (20)実質的に１６記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−３
の実質的特性を呈する蛋白質をコードする配列を含むＢ
ＭＰ−３をコードするcＤＮＡ配列。 (21)骨誘導蛋白質をコードするＤＮＡ配列および相同性
ＤＮＡを含むベクターであって、蛋白質をコードするＤ
ＮＡ配列が、 a．実質的に１０記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−１
の実質的特性を呈する蛋白質をコードする配列を含むＢ
ＭＰ−１をコードするＤＮＡ配列、 b．実質的に１２記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−２
・クラスＩの実質的特性を呈する蛋白質をコードする配
列を含むＢＭＰ−２・クラスＩをコードするＤＮＡ配
列、 c．実質的に１４記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−２
・クラスIIの実質的特性を呈する蛋白質をコードする配
列を含むＢＭＰ−２・クラスIIをコードするＤＮＡ配
列、および d．実質的に１６記載のヌクレオチド配列または厳密な
条件下でそれとハイブリダイズし、発現時にＢＭＰ−３
の実質的特性を呈する蛋白質をコードする配列を含むＢ
ＭＰ−３をコードするＤＮＡ配列から成る群から選ばれ
たものである、ベクター。 (22)骨誘導蛋白質をコードするＤＮＡ配列を発現させ得
る２１記載のベクターにより形質転換された細胞および
前記細胞の子孫。 (23)ほ乳類細胞、細菌細胞、昆虫細胞および酵母細胞か
ら成る群から選ばれる、２２記載の形質転換細胞。 【００７４】(24)(a)(i)実質的に下記配列を有するcＤ
ＮＡ 【表３０】 【表３１】【表３２】【表３３】 および(１)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれ
とハイブリダイズし、(２)発現時に、実施例３のインビ
ボ・ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグ
ラム／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成
誘導能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配
列により形質転換された細胞を培養し、 (ii)実質的に上記(a)(i)記載のアミノ酸＃５１〜＃８７
の３７アミノ酸配列を含む蛋白質を前記細胞培地から回
収する工程により生産される蛋白質、 (b)(i)実質的に下記配列を有するcＤＮＡ 【表３４】 【表３５】【表３６】 および(１)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれ
とハイブリダイズし、(２)発現時に、実施例３のインビ
ボ・ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグ
ラム／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成
誘導能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配
列により形質転換された細胞を培養し、 (ii)実質的に上記(b)(i)記載のアミノ酸＃２９９〜＃３
９６の９７アミノ酸配列を含む蛋白質を前記細胞培地か
ら回収する工程により生産される蛋白質、 (c)(i)実質的に下記配列を有するcＤＮＡ 【表３７】【表３８】【表３９】 および(１)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれ
とハイブリダイズし、(２)発現時に、実施例３のインビ
ボ・ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグ
ラム／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成
誘導能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配
列により形質転換された細胞を培養し、 (ii)実質的に上記(c)(i)記載のアミノ酸＃３１１〜＃４
０８の９７アミノ酸配列を含む蛋白質を前記細胞培地か
ら回収する工程により生産される蛋白質、 (d)(i)実質的に下記配列を有するcＤＮＡ 【表４０】 および 【表４１】 および(１)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれ
とハイブリダイズし、(２)発現時に、実施例３のインビ
ボ・ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグ
ラム／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成
誘導能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配
列により形質転換された細胞を培養し、 (ii)実質的に上記(d)(i)記載のアミノ酸＃７９〜＃１７
５の９６アミノ酸配列を含む蛋白質を前記細胞培地から
回収する工程により生産される蛋白質、および (e)前記蛋白質の混合物から成る群から選ばれる精製蛋
白質の有効量を、医薬的に許容し得る賦形剤と共に含ん
で成る医薬組成物であって、実施例３のインビボ・ラッ
ト骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム／グ
ラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導能を
呈する組成物。 【００７５】(25)さらに、骨または軟骨欠損部位に組成
物を送達し、骨形成誘導構造を提供し得るマトリックス
を含む、２４記載の医薬組成物。 (26)マトリックスが、ヒドロキシアパタイト、コラーゲ
ン、ポリ酪酸および燐酸三カルシウムから成る群から選
択される材料を含む、２５記載の組成物。 (27)骨または軟骨形成を必要とする患者における骨形成
誘導方法であって、２４−２６のいずれか１項記載の組
成物の有効量を患者に投与することを含む方法。 (28)２４(a)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含
むベクターであって、前記配列が、 (a)実質的に２４(a)に記載されたヌクレオチド配列、お
よび (b)(1)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハ
イブリダイズし、(2)発現時に実施例３のインビボ・ラ
ット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム／
グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導能
を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を含
む配列であるベクター。 (29)２４(b)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含
むベクターであって、前記配列が、 (a)実質的に24(b)に記載されたヌクレオチド配列、およ
び (b)(1)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハ
イブリダイズし、(2)発現時に実施例３のインビボ・ラ
ット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム／
グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導能
を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を含
む配列であるベクター。 (30)２４(c)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含
むベクターであって、前記配列が、 (a)実質的に２４(c)に記載されたヌクレオチド配列、お
よび (b)(1)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハ
イブリダイズし、(2)発現時に実施例３のインビボ・ラ
ット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム／
グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導能
を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を含
む配列であるベクター。 (31)２４(d)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含
むベクターであって、前記配列が、 (a)実質的に２４(d)に記載されたヌクレオチド配列、お
よび (b)(1)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハ
イブリダイズし、(2)発現時に実施例３のインビボ・ラ
ット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム／
グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導能
を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を含
む配列であるベクター。 (32)前記ＤＮＡ配列を発現させ得る２８、２９、３０お
よび３１記載のベクターから成る群から選ばれたベクタ
ーにより形質転換された細胞および前記細胞の子孫。 (33)ほ乳類細胞、細菌細胞、昆虫細胞および酵母細胞か
ら成る群から選ばれる、３２記載の形質転換細胞。 (34)精製蛋白質の製造方法であって、 (a)２４(a)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含
み、それを発現させ得る細胞を生成し(ただし、この配
列は、 (i)実質的に24(a)に記載されたヌクレオチド配列および (ii)(a)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれと
ハイブリダイズし、(b)発現時に実施例３のインビボ・
ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム
／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導
能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を
含む)、 (b)組換え体ＤＮＡを発現させ得る条件下、適当な培養
培地において前記の形質転換宿主細胞またはその子孫を
培養し、 (c)前記培養から前記蛋白質を分離および精製する工程
を含む方法。 【００７６】(35)精製蛋白質の製造方法であって、 (a)２４(b)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含
み、それを発現させ得る細胞を生成し(ただし、この配
列は、 (i)実質的に２４(b)に記載されたヌクレオチド配列およ
び (ii)(a)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれと
ハイブリダイズし、(b)発現時に実施例３のインビボ・
ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム
／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導
能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を
含む)、 (b)組換え体ＤＮＡを発現させ得る条件下、適当な培養
培地において前記の形質転換宿主細胞またはその子孫を
培養し、 (c)前記培養から前記蛋白質を分離および精製する工程
を含む方法。 (36)精製蛋白質の製造方法であって、 (a)２４(c)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含
み、それを発現させ得る細胞を生成し(ただし、この配
列は、 (i)実質的に２４(c)に記載されたヌクレオチド配列およ
び (ii)(a)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれと
ハイブリダイズし、(b)発現時に実施例３のインビボ・
ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム
／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導
能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を
含む)、 (b)組換え体ＤＮＡを発現させ得る条件下、適当な培養
培地において前記の形質転換宿主細胞またはその子孫を
培養し、 (c)前記培養から前記蛋白質を分離および精製する工程
を含む方法。 (37)精製蛋白質の製造方法であって、 (a)２４(d)記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含
み、それを発現させ得る細胞を生成し(ただし、この配
列は、 (i)実質的に２４(d)に記載されたヌクレオチド配列およ
び (ii)(a)厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれと
ハイブリダイズし、(b)発現時に実施例３のインビボ・
ラット骨形成検定において約１０−１０００ナノグラム
／グラム(骨)の濃度で硬骨および／または軟骨形成誘導
能を呈することを特徴とする蛋白質をコードする配列を
含む)、 (b)組換え体ＤＮＡを発現させ得る条件下、適当な培養
培地において前記の形質転換宿主細胞またはその子孫を
培養し、 (c)前記培養から前記蛋白質を分離および精製する工程
を含む方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/435 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 1/21 // Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/02 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ０３１３４６ (32)優先日 昭和62年３月26日(1987．3．26) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０３４２ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０３４３ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０３４４ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０３４５ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０２９５ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０３１０ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０３１１ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７１２２ (72)発明者 ジョン・エム・ウォズニー アメリカ合衆国01749マサチューセッツ、 ハドソン、オールド・ボルトン・ロード 59番 (72)発明者 ヴィッキ・エイ・ローゼン アメリカ合衆国02116マサチューセッツ、 ボストン、アパートメント４、マールバ ロー・ストリート344番

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．表２、３、４Ａ及び４Ｂ、５、６、７、もしくは８
   に記載されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、また
   はストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件下、
   これらの配列とハイブリダイズし、発現時に実施例３の
   インビボラット骨形成検定において硬骨および／または
   軟骨形成誘導能を呈するポリペプチドをコードする塩基
   配列のいずれかを含むＤＮＡにより形質転換された細胞
   またはその子孫を培養し、培養液を精製することにより
   製造し得る、実施例３のインビボラット骨形成検定にお
   いて硬骨および／または軟骨形成誘導能を呈する、精製
   培養物。 ２．表４Ａ及び４Ｂ、６、７、もしくは８に記載された
   アミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を含むＤ
   ＮＡを用いて製造し得る、請求項１記載の培養物。 ３．表２、３、４Ａ及び４Ｂ、５、６、７、もしくは８
   に記載されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、また
   はストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件下、
   これらの配列とハイブリダイズし、発現時に実施例３の
   インビボラット骨形成検定において硬骨および／または
   軟骨形成誘導能を呈するポリペプチドをコードする塩基
   配列のいずれかを含むＤＮＡにより形質転換された細胞
   またはその子孫を培養し、培養液を精製することにより
   製造し得る、実施例３のインビボラット骨形成検定にお
   いて硬骨および／または軟骨形成誘導能を呈する、精製
   培養物を含む、骨形成誘導剤。 ４．更にマトリックスを含む、請求項３記載の誘導剤。 ５．マトリックスがヒドロキシアパタイト、コラーゲ
   ン、ポリ酪酸および燐酸三カルシウムからなる群から選
   択される、請求項４記載の誘導剤。