PT85225B

PT85225B - Processo para a preparacao de novos factores indutivos do desenvolvimento osseo e de composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT85225B
Application number: PT85225A
Authority: PT
Inventors: Elizabeth A Wang; John M Wozney; Vicki A Rosen
Original assignee: Genetics Institue Inc
Priority date: 1986-07-01
Filing date: 1987-07-01
Publication date: 1990-03-30
Also published as: WO1988000205A1; EP0688869A1; ATE419349T1; EP0313578B1; DK106288A; NZ220894A; GR871028B; IE75881B1; PT85225A; DE3752364T2; IL83003A; JPH02500241A; JP2713715B2; LU91005I2; AU613314B2; DE3752364D1; JPH06298800A; DE3751887D1; ATE234921T1; DE10399007I2

Description

PRÕ08SSO PARA A PREPARAÇÃO DE NOVOS FACTORES INDUTIVOS DO DESENVOLVIMENTO 0SSEO E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ' \ QUE OS CONTAI” i

A presente invenção refere-se a novos factores indutivos do desenvolvimento ósseo purificados que demonstram actividade in vivo para induzir a formaçSo de cartilagens e de osso, e a processos para a sua obtenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO osso é um tecido altamente diferenciado, caracterizado por uma estrutura matriz extensa formada por feixes fibrosos de uma proteína designada por colagénio e proteoglicanos, proteínas não colagénias, lípidos e proteínas acídicas. Os processos de formaçSo óssea e renovação/ /reparaçfio de tecido ósseo, que ocorre continuamente através da vida, são realizados por meio de células especializadas, 0 desenvolvimento dos ossos longos embrionários nor mais é precedido pela formação de um modelo cartilagíneo, 0 desenvolvimento ósseo é preeuiffívelmente mediado pelos osteoblastos, células que formam o osso, enquanto que a reconstrução do osso é aparentemente realizada pelas actividades conjuntas de células de reabsorção óssea, designadas osteoplastos e osteoblastos.

Um factor que induz o desenvolvimento ósseo nas

circunstâncias em que o osso não é formado normalmente, tem aplicação na cura de fracturas ósseas, Wa preparação osteo génica pode possuir uma utilidade profilática na redução dae fracturas fechadas ou das fracturas abertas assim como no melhoramento da fixação de ligações artificiais. A nova fo£ mação óssea induzida por um agente osteogénico contribuirá para a reparação de um trauma congénito, de um trauma indu sido ou defeitos craneofaciais induzidos por resseção oncológica, e ainda em cirurgia plástica cosmética. Os factores osteogénicos podem também ser valiosos para o tratamento de doenças periodontais, e outros processos de reparação dos dentes.

A reparação de fracturas, defeitos craneofaciais e defeitos periodontológicos são presentemente tratados com ua enxerto ósseo ou um i&plante sintético. Um auto-enxerto possui uma hipótese de sucesso mais elevada, mas o trauma cirúrgico e a quantidade de osso que tem que ser retirada do paciente apresenta maior desvantagem. Também são utilizados enxertos de ossos alogénicos. A disponibilidade de ossos de cadáver, a qualidade do osso proveniente de um banco, e a seminação potencial de doença humana são sérios problemas associados com este tratamento

Também são utilizadas cerâmas estes materiais são somicas tais como hidroxilapatite, mente ostéoconductores, isto é, o novo osso é geralmente ίοχ apenas de um modo adjacente ao implante e ao osso nork

Agentes químicos fisiològicamente compatíveis

(h.0ratonaβ/medicarnentos/factores de crescimento) capazes de induzirem a formação óssea num sítio predeterminado são, portanto, desejáveis. Tais agentes podem proporcionar um meio para atrair as células que formam o osso, estimular o desen-

volvimento de células que formam o osso ou induzir a dife renciação em progenitores de células que formam o osso. Uma varitdade de factores de indução óssea, osteogénicos e indutores de cartilagem têm sido descritos. Ver, por exemplo, os pedidos de patente de invenção Europeus 148, 155 θ 169.016 para apreciação do trabalho de outros autores neste campo. Contudo, os processos e técnicas conhecidos da técnica para a obtenção de actividades osteogénicas putativas são prolon gados e mal definidos e os factores identificados apenas mi nimamente e caracterizados debilmente.

Assim permanece uma necessidade para a técni-

ca de caracterização fisiológica e química cuidadosa de um factor osteoindutivo purificado de uma espécie de mamífero para utilização em diagnóstico, pesquisa e terapêutica das complicaçdes da formação óssea.

BREVE DESCRIÇÃO DESTÀ INVENÇÃO

A presente invenção proporciona factores de crescimento ósseo bovipo e humano substancialmente isento de outras proteínas humanas ou bovinas e caracterizados por sequências peptídicas iguais ou substancialmente homólogas às sequências de amino ácidos ilustradas nos quadros desde II até VIII a seguir. Estes factores também são caracteriza-

_4_ dos por certas características bioquímicas e biológicas de factores de desenvolvimento ósseo. Por exemplo, os facto í

res indutivos ósseos da presente invenção são ainda caracterizados por características biológicas e bioquímicas que in cluem actividade numa concentração compreendida entre 10 a

1000 ng/grama de osso num ensaio de formação óssea in vivo descrito a seguir. As sequências de DNA para os factores de crescimento ósseo da presente invenção podem ser codifi cadas pelas sequências de DNA descritas nos quadros ou sequências capazes de hibridarem para esse fim e que codificam polipéptidos com propriedades biológicas de factor de desenvolvimento ósseo ou outras sequências modificadas de modo diverso que demonstrem tais propriedades

Sr:

Como um exemplo de factor de desenvolvimento jgi· fé¹

ÓBseo da presente invenção cita-se o factor humano designado por hBMP-1. 0 hBMP-lis substancialmente isento da associaçSo com outros materiais proteináceos é caracterizado por uma sequência peptídica, a mesma ou substancialmente a mesma sequência de amino ácido desde o número 1 até ao amino ácido número 37 do quadro V a seguir, que representa o hBMP-1 genómico e do amino ácido número 1 até ao amino ácido número 730 do quadro VI que representa o cDNA de hBMP-1,

IP &

fc⁴·

Estas sequências peptídicas são la mesma, ou substancialmente a mesma, sequência de DNA, coRf mo descrita no nucleótido número 3440 até ao nucleótido número 3550 do quadro V e desde o nucleótido número 36 até ao >

nucleétldo número 2225 do quadro VI respectivamente.

m.

-5A sequência codificadora do Quadro V é flanqueada por aproximadamente 28 nucleótidos (presumivelmente uma sequência não codificadora 5'), assim como por aproximadamente 19 nucleótidos (uma presumível sequência não codificadora 3^r)· Estes polipéptidos hBMP-1 são ainda caracterizados por possuírem pelo menos uma propriedade biológica de factores de desenvolvimento ósseo.

Um exemplo de factores de desenvolvimento bovino da presente invenção designado por bBMP-1 é substancialmente isento associação com outros materiais protcínáceos. Ele é caracterizado por uma sequência peptídica que contêm a mesma ou substancialmente a mesma séquência desde o amino ácido número 1 até ao amino ácido número 37 do Quadro TI, a seguir, que representa o bBMP-1 genómico. Esta sequência peptídica é codificada nela mesma ou substancialmente a mes,ma sequência de DNA como representada desde os nucleótidos número 294 até ao nucleótido número 404 do Quadro II. A sequência peptídica bovina identificada no Quadro II a seguir, também possui um comprimento de 37 amino ácidos. No Quadro II esta sequência codificadora é flanqueada por aproximadamente 21 nucleótidos (uma presumível sequência não-codificadora 5*), assim como também por aproximadamente 19 nucleótidos (uma presumível sequência não codificadora 3'). 0 bBNP-1 é ainda caracterizado por possuir pelo menos uma propriedade biológica de factor de crescimento ósseo.

Outro exemplo de uma composição de proteínas indutora de osso humano, da presente invenção, é designada por

hBMP-1, alasse I, Esta é substancialmente isenta da associação com outros materiais proteináceos e caracterizada por uma aéquência peptídica que é a mesma ou substancialmente a mesma sequência de amino ácidos desde o número 1 até ao amino ácido número 396 do quadro VII, que representa o bBMP-2 do cDNA, classe I. Esta sequência peptídica é codificada por a mesma ου substancialmente a mesma sequência de DNA, como representada desde o nucleótido número 356 até ao nucleótido número 1543 do quadro VII. A sequência peptídica humana identificada no quadro VII tem 396 aminoácidos de comprimento. 0 hBMP-2 da classe I é ainda caracte rizado por possuir pelo menos uma propriedade biológica de factor de desenvolvimento ósseo.

Um segundo exemplo de um factor bovino da presente invenção designado por bBMP-2, classe I possui uma sequência dê DNA identificada no quadro III a seguir, que representa à sequência genómica. Esta sequência de DNA bovina possui 129 aminoácidos prováveis que codificam a sequência seguida por aproximadamente 2SÇl· nucleótidos (uma sequência presumível 3’ não codificadora).

Um outro exemplo de uma composição de uma proteína de indúção óssea humana da presente invenção é designada por hBMP-2, classe II. Esta é substancialmente isenta da associação com outros materiais proteináceos e é caracterizada por uma sequência peptídica igual ou substancialmente igual, à Sequência de aminoácidos, desde o aminoácido número 1 até ao aminoácido número 408 do quadro VIII. Esta seL /

-7BO · V . . . .

Ifc f f .: .1.qudncia peptídica é codificada pela sequência igual ou subs_> tancialmente igual à sequência de DNA descrita no quadro VIII desde o núcleótido número 403 até ao nucleótido número 1626 :íw.! ·. / do quadro VIII, que representa o cDNA

Este factor é ainda caracterizado por ϋΜ. propriedade biológica de factor de

Ainda um factor de indução sente invenção (bBMP-3) é substancialmente isenta da associaι.::··^:ί ¹ ¹ ui· ·.

çSo com outros polipéptidos bovinos ou humanos e é caracterizado pela sequência de presentados no Quadro IV genómica bovina. $sta é de hBMP-2, classe II.

possuir pelo menos crescimento ósseo.

óssea bovina da preDNA e sequência de aminoácidos reA e B, que representa a sequência *1 ptídica igual ou substancialmente igual aminoácidos representada no ^itedro IV A ácido número 1 até ao aminoácido número caracterizada por uma sequência peà mesma sequência de e B, desde o amino175. 0 BMP-3 é isea to ou substancialmente isento da associação com outros polipéptidos humanos e é ainda caracterizado por possuir pelo me‘.ca nos uma propriedade biológica de factor de desenvolvimento ósseo. Mste factor bovino pode ser utilizado como um instrumento para a tra proteína obtenção de uma proteína humana análoga ou oude indução óssea de mamífero. A caracterização . adequada deste factor de indução ósseo bovino da presente invençfio, proporciona o ”ponto de inicio” essencial para o méIH,..:· todo que utiliza esta sequência. Este método utiliza técnicas conhecidas dos técnicos desta matéria de engenharia ge/ nética, envolve a utilização da sequência de DNA bovina como sonda, para sondar uma biblioteca genómica humana ou uma biblioteca de cDNA; e a identificação das sequências de DNA que -l¹*

-8hibrldizam com as sondas. Um clone com uma sequência hibridizável é plaqueado, purificado e o DNA obtido é isolado, subclonado e submetido a uma análise de sequência de DNA. Assim um outro aspecto da presente invenção consiste num hBMP-3 proteínico humano, produzido por este método.

Um outro aspecto da presente invenção proporciona composições farmacêuticas que contêm uma quantidade terapêuticamente eficaz de um ou mais dos polipéptidos de factor de desenvolvimento ósseo de acordo com esta invenção. Estas composições podem ser utilizadas em métodos para o tratamento de um número de defeitos ósseos e doenças periodontológieas, Estes métodos de acordo com a presente invenção abrangem a administração a um doente de uma quantidade eficaz de peio menos um polipéptido como aqui descrito antes.

Ainda um outro aspecto da presente invenção consiste em Sèquências de DNA que codificam para a expressão de um polipéptido bovino ou humano que possui pelo menos uma pro priedade biológica de factor de desenvolvimento ósseo. Tais .. sequências incluem a sequência de nucleótidos na direcção 5' para 3* representadas nos Quadros II até VIII. De um modo altéSàativo, uma sequência de DNA que hibridiza sob condições restritas com a sequência de DNA dos Quadros de II a VIII ou uma sequência de DNA que hibridiza sob condições não restritas, com ae sequências de DNA representadas e que codifica a expressão de uma proteína que possui pelo menos uma pro^ríedade biológica de factor de crescimento ósseo estão incluídas na presente invenção.

Finalmente, variações alélicas das sequências do Quadro II até ao Quadro VIII, quer tais alterações nucleotídá.ias resultem em alterações nas sequências peptídicas ou nBo, também estão incluídas na presente invenção.

Ainda um outro aspecto da presente invenção coji siste num vector que contém uma sequência de DNA como referida antes numa associação operacional com uma sequência de controlo de expressão. Este vector pode ser utilizado num processo novo, para a nrodução de um polipéptido de factor de desenvolvimento ósseo, no qual é cultivada uma linha de células tfransformada com uma sequência de DNA que codifica ft,.;

a expressão de um polipéptido de factor de desenvolvimento ósseo numa associação operativa com a sua sequência de controle de expressão. -Este processo reivindicado pode utilig';· ¹ zar um número de células conhecidas como células hospedeiras para a expressão do polipéptido. Presentemente linhas de células preferidas são linhas de células de mamíferos e células bacterianas.

_; Outros aspectos e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes após consideração da descrição ΐ - g detalhada seguinte dos seus aspectos preferidos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO

A família de factores de crescimento ósseo proporcionada pela presente invenção é substancialmente isenta da associação com outras uroteínas humanas ou bovinas e ca10-

/ racteriza.da pelas sequências de amino ácidos iguais ou tancialménte homólogas às sequências representadas nos subsQuadros desde II até VIII a seguir. Os membros desta nova família de factores de crescimento também são carac+erizados por demonstrarem propriedades biológicas cimento ósseo.

de factor de cresA presente dos sintéticos que total invençSo também inclui polipéptiou parcialmente multiplicam continuadamente sequências de das nos Quadros desde II resíduos de aminoácidos representaa VIII. Estas sequências, em vir tude de compartilharem características conformacionais e es!?

ί Λ rf truturais, primárias, secundárias, ou terciárias, com polipéptidos de factor de crescimento ósseo nos Quadros desde I a VIII, podem possuir propriedades biológicas de factor de crescimento ósseo em comum com elas. Assim, estas podem ser utilizadas como substituintes biologicamente activos para os polipéptidos de factor de crescimento ósseo de primata de oóorrência, natural, em processos terapêuticos.

Os factores de crescimento ósseo proporcionados aqui também incluem factores codificados pelas sequências similares às sequências dos Quadros desde II a VIII, nas em qué modificações são de ocorrência natural ou por ocorrência deliberada por técnicas de genética.

Outras mutações específicas das sequências de factores de desenvolvimento ósseo descritos aqui envolvem modificaçêes de um ou ambos ausência de glicosilaçSo ou os sítios de glicosilaçSo. A apenas de glicosilação parcial

resulta na substituição de aminoácidos ou anulação de uma ou amboB os sítios de reconhecimento de glicosilação ligados à asparagina, presentes nas sequências dos factores de desenvolvimento Ósseo representados nos Quadros desde II são çfio sSo até VIII. Os sítios de reconhecimento de glicosilação ligados à asparagina compreendem sequências tripeptídicas que reconhecidas especificamente por enzimas de glicosilacelular apropriada. Estas sequências tri-peptídicas ou asparagipa-X-trionina ou asparagina-X-serina, em que

X representa usualmente um aminoácido. Uma variedade de substituições de aminoácido ou anulações de uma ou ambas as primeira ou terceira posições de aminoácidos de um sítio de reconhecimento de glicosilação (e/ou anulação de aminoácidos na segunda posição) resulta na não glicosilação na

sequência tripeptídica modificada.

a expressão de factores de desenvolvimento ósseo. Essequências de DNA incluem as representadas nos Quadros

A presente invenção também abrange as novas sequências de DNA isentas de associação com sequências de DNA que codificam outros materiais proteináceos, e que codifi^{!lí J}·^' ·^Ί ^|: cam

tas de II a YIII numa direcção 5’ a 3', e aquelas sequências que hibridizam sob condições restritas de hibridação (vêr, T. Maniatis et al, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor laboratory (1982), Pags. 387 a 389) para as sequências de DNA dos Quadros II - VIII. .

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As sequências, de DNA que hibridizam com as sequências dos Quadros II a VIII sob Condições de hibridação nflo restritas e que codificam a expressão para factores de .

desenvolvimento ósseo que possuem propriedades biológicas de factores de desenvolvimento ósseo, também codificam factores de desenvolvimento ósseo da presente invenção. Por exemplo, uma sequência de DNA mologia significativa, isto é fontes de dissulfureto, com a VIII e codificam um factor de sui uma ou mais propriedades volvimento ósseo, codifica de desta nova família de factorei que compartilha regiões de h£ sítios de glicosilação ou sequência dos Quadros II a desenvolvimento ósseo que posbiológicas de factor de desenum modo evidente um membro de crescimento, ainda que •uarai tal sequência de DNA não hibridize sob condições restritas com a sequência dos Quadros II a VIII.

De um modo similar, as sequências de DNA que codificam polipéptidos de factor de crescimento ósseo codificam a sequência dos Quadros II a VIII, mas que difere na sequência codão devido a degenerescências do código genético ou a variações alélicas (alterações de base de ocorrência natural nas espécies da população que podem eventualmente resultar numa troca de um aminoácido), também codificam os novos factores de crescimento aqui descritos. Variações nas sequências de DNA dos Quadros de II a VIII, que são motivadas por niutações pontuais ou por modificações induzidas para reforçar a actividade, semi-vida ou nrodução de polipéptidos codificados deste modo, também são abrangidas pela presente invenção.

Outro aspecto da presente invenção proporciona um novo método para a produção de novos factores osteoindutivos. 0 método da presente invenção envolve a cultura de

-13ι uma célula ou linha de células apropriadas, que foi transformada com uma sequência de DNA que codifica para a expressão de um polipéptido de factor de desenvolvimento ósseo no»0 sob o controle de sequências reguladoras conhecidas. Células ou linhas de células apropriadas, podem ser células de mamífero tais como as células de ovário de hamster Chinês (CHO), A selecção de células hospedeiras de mamífero apropriadas e métodos para transformação, cultura, ampliação, sondagem e produção de produtos e purificação são métodos conhecidos da técnica, Vêr, por exemplo, Gething e Sambrook, Nature, 293: 620-625 (1981), ou alternadamente Kaufman et al, Mol. Cell. Biol., 5 (7): 1750-1759 (1985) ou Howley et al, patente de invenção norte-americana 4,4.19,446, Outra linha de células de mamífero apropriada, que é descrita nos exemplos que se apresentam, é a linha de células COS-1 de macaco. Uma linha de células de mamífero de utilidade similar é a linha de células CV-1.

De um modo similarménte utilizável como células hospedeiras apropriadas pela presente invenção são as células bacterianas. Por exemplo, as várias estirpes de E. Coli (por exemplo, HB101, MC1061 e estirpes utilizadas nos exemplos que se seguem) são bem conhecidas como células hospedeiras no campo da biotecnologia. Várias estirpes de B. subtilis, Pseudomonas, outros bacilos e equivalentes também podem ser utilizados neste método.

Muitas estirpes de células de levedura conhecidas dos técnicos desta matéria também estão disponíveis como células hospedeiras para a expressão de polipéptidos da ιί;··'

-14presente invepção. Além disso, quando apropriado, células de insectos podem ser utilizadas como células hospedeiras no método da presente invenção. Vêr por exemplo, Miller et al, G-enetic Engineering, 8:277-298 (Plenum Press 1986) e referências aqui citadas.

Outro aspecto da presente invenção proporciona vectores para utilizar no método de expressão destes novos polipéptidos osteoindutores.

De preferência os vectores contêm as sequências completafe de DNA novas, descritas antes, que codificam para os novos factores da presente invenção. Além disso, os vectores também contêm sequências de controlo de expressão apropriadas que permitem a expressão das sequências de faCtor de indução éssea. De um modo alternativo, os vectores que incorporam sequências modificadas, como descrito antes, também são abrangidos pela presente invenção e utilizáveis na produção de factores de indução óssea. Os vectores podem ser utilizados no método de transformação de linhas de células e contêm sequências reguladoras selecionadas numa associação operacional com o DNA que codifica sequências destfi invenção que são capazes de dirigir a replicação e a sua expressão em células hospedeiras selecionadas. Sequências reguladoras utilizáveis para tais vectores são bem conhecidas dos técnicos nesta matéria e podem ser selecionadas dependendo das células hospedeiras escolhidas. Tal selecção é uma rotina e não faz parte da presente invenção.

Um outro asnecto da presente invenção é um mé

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MB' g,l ^! e composição terapêuticos para reparar fracturas e oucondíções relacionadas com defeitos ósseos ου doenças periodontológicas. Tais composições compreendem uma quantitras dade terapêuticamente eficaz de uma das comnosições de proteínas de factores de indução óssea da presente invenção. Os factores de indução óssea de acordo com a presente invenção podem estar presentes numa composição terapêutica, numa mistura com um veículo ou ihatriz aceitável em farmácia. BB disso, o método terapêutico e composições da presente í/·· :

invenção compreendem uma quantidade terapêutica de factor de indução óssea desta invenção com uma quantidade terapêutica de pelo menos um de outros factores de indução óssea desta invenção. Além disso, um factor de acordo com a presente invenção ou uma associação de factores da presente invenção podem ser coadministrados com um ou mais diferentes ^actores de indução óssea, que podem inter-agir com este. Além disso, a composição terapêutica pode ser associada benéficos para o tratamento de um defeito método terapêutico inclui com outros agentes ósseo em questão.

uma administração oral da composição sob a forma de um implante ou de um enxerto. Quando administrada a composição terapêutica para utilização nesta invenção é, de facto, sob uma forma fisiológica/ mente compatível, isenta de pirogénio. De preferência, a comíllj / posição do factor de indução de crescimento ósseo incluirá hí issÉi matriz capaz de libertar o factor de indução óssea para o sítio do osso danificado, proporcionando uma estrutura para o desenvolvimento ósseo e cartilagem e capaz de um modo óptimo de

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II «ill t,. ·! !.· .Ί. .·:

(t. ¹ ser reabsorvido no organismo. Uma matriz deste tipo pode ser realixada com outros materiais presentemente em utilização para outras aplicações médicas de implantação.

A composição de' factor de indução ósseo também pode éer de um modo alternativo incluída com outros materiais osteocondutores, tal como hidroxilapatite, cerâmica e equivalentes

Além disso, a composição pode ser desejada para encapsular ou injectar sob uma forma viscosa para lida alteração óssea. A preparação de compote' bertar no sítio £ sições proteínicas aceitáveis do ponto de vista fisiológico, ..... ' ‘ ; te têm que ter em atenção o pH, isotonia, estabilidade e outros fcte: ·/··.·,' 4

BU·' ' _z r factores familiares aos técnicos.

μ?

dico tendo em regime de dose deve ser determinado pelo móconsideração os vários factores que modificam

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V a acção de 'quantidade um de

I -j” ·- j

ΓχΤ pfactor de crescimento deste tipo, por exemplo, peso ósseo desejada a ser: obtido, o sítio da alteração óssea, a condição da alteração óssea, a idade do doente, sexo, e dieta, a gravidade de qualquer infecção, o tempo de administração e outros factores clínicos. Geraimente, o regime de dose deve estar compreendido nos limites 6 de anroximadamente 10 e 10 nanogramas ma de peso ósseo desejndo. 0 progresso por avaliação periódica do crescimento peraçSo, por exemplo por raio x. Tais de nroteína por granode ser controlado ósseo e/ou pela recucomposições terapêuticas são também presentemente disponíveis para a aplicação em veterinária devido à ausência de espécies específicas de factores de indução óssea. Particularmente animais doméstiv •7

cos e cavalos puro-sangue são doentes desejáveis para tais tratamentos com o factor de indução óssea da presente invençSo.

Os exemplos que se seguem são ilustrativos da na recolha e caracterização hovina, que empregam factores recolher factores de indução prática da presente invenção de factores de indução óssea de induçffo óssea bovina para óssea humana, obtendo os factores humanos e exprimindo os factores de indução óssea por meio de técnicas de recombinação genética.

EXEMPLO I

IS01AMENTQ_DE_UM VACTOR DE INDUÇÃO OSSEQ BOVINO

De acordo com o processo de M. R. Urist et al.,

Proc. Natl. Acad. Sei osso de boi em pó fino

USA, 70: 3511 (1973), preparou-se (20-120 malhas, Helitrex) com elimi de extração como se descreve a seguir. Desmineralizaram-se dez quilos do pó em mudanças sucessivas de HC1 a 0,6N à temperatura de 4°C durante um ped:

riodo de 48 horas sob agitação vigorosa. A suspensão resultante foi extraída durante 16 horas à temperatura de 4°C com 50 litros de CaCl^ 2M e lOmM de acido etilenodiamino-tetracético (EDTA), e seguido com 50 litros de EDTA a 0,5M.

vezes com água destilada antes naçSo de algumas fases de extração durante 4 horas resíduo foi lavado três de se fazer a sua resuspensâò em 20 litros de cloridrato de guanidina 4M (GuCl) , Tris

1820mM (pH 7,4), N-e tilmaleimida lmM, iodoacetamina lmM, flureto de fenil-metil-sulfomilo lmM como descrito em Clin.

Orthop. Rei.

T·

Res., 171: 213 (1982). Após 16 a 20 horas removeu-se o sobre- , • òaclante θ substituiu-se com outros 10 litros de tampão UuCl.

r¹ ; Extraiu-se o resíduo durante outras 24 horas. * fcq? < U'·4;

Reuniram-se os extractos brutos de GuCl, concen_r traram-se aproximadamente 20 vezes num aparelho Pellicon com ' uma membrana para pesos moleculares inferiores a 10 mil e em • seguida dializou-se o tampão inicial para a primeira coluna com 50 mM Tris, NaCl 0,lM, ureia 6M de pH 7,2. Após diálise fc extensiva a proteína foi introduzida numa coluna de celulose DEAE de 4 litros e recolheram-se as fracções não ligadas.

v - <

Concentraram-se as fracções não ligadas e diali- • zaram-se contra NaAc 50mM, NaCl 50mM(pH 4,6) em ureia 6M.

As fracçÕés não ligadas foram ampliadas numa coluna de carboximetilàelulose. Concentrou-se 20 a 40 vezes, a proteína proveniente desta fase e em seguida diluiu-se 5 vezes com ; KPO^ 80mM, ureia 6M de pH 6,0. Ajustou-se o pH da solução para 6 com KjHPO^ 500 mM. A amostra foi ampliada para uma coluna de hidroxilapatite (LKB) equilibrada em KPO^ 80 mM, ureia 6M, de pH 6,0 e removeram-se todas as proteínas não ligadas por meio de lavagem da coluna com 0 mesmo tampão. Bluiu-se a actividade de factor de indução ósseo com KPO^ 100 mM, de pH 7,4 e ureia 6M.

Concentrou-se a proteína aproximadamente dez vezes, e adicionou-se NaCl sólido para uma concentração final

ss-heparina, equilibrada com KPO^ 50 mM, NaCi 150 mM, ureia

K. tampão inicial, eluiu-se uma proteína com actividade de faO? ctor de indução óssea por meio de fosfato de potássio 50 mM, gL. cloreto de sódio 700 mM e ureia 6M de pH 7,4. ConcentrouK\. -se esta fracção para um volume mínimo e aplicaram-se aligtó quotas de 0,4 ml a colunas de superose 6 e superose 17 liK. gadas em série, e equilibradas com cloridrato de guanidina κ| 4M, Tris, 20M de pH de 7,2 e as colunas desenvolveram-se com ' um débito de 0,25 ml/minuto. A proteína que demonstrou actiL·.- vidade de factor de indução óssea tinha uma migração relatilizadas cpntra acetato de sódio 50 mM, ureia 6M de pH 4,6, e aplicadas a uma coluna Pharmacia Monos HR, )Desenvolveu-se a coluna éom um gradiente até l,0M de cloreto de sódio 50mM de acetato de sódio 6M de ureia de pH 4,6. As fracções activas reuniram-sé e ajustaram-se para pH 3,0 ou ácido trifluol··- : ' : , ro-acé$dtoMft a 10$ (TPA). Este material aplicou-se a uma coluna de 4,046 x 25 cm Vydac 04 em TPA a 0,1$ e a coluna desenvolveu com um gradiente até 90$ de acetonitrilo, 0,1$ de TPA (31,5$ de. acçtonitrilo, a 0,1$ de TPA, até 49,5$ de ace£ tonitrilo, 0,1$ de TPA durante 60 minutos num débito de l.jnl por minuto). 0 material activo é eluido aproximadamente em r nitrilo a 40-44$,

Aliquotas das fracções apropriadas foram ioda-20-

; -das por meio de um dos métodos seguintes: P. J. McConahey b‘? et al, Int. Arch. Allergy, 29:185-189 (1966); A. E. Bolton í et al, Biochem J., 133:529 (1973); e D. F, Bowen-Pope, J.

Γ, Biol. Chem,, 237:5161 (1982). As proteínas iodadas presen* tes nestas fracçBes analizaram-se por meio de electroforese £ sobre gel SDS e focagem isoeléctrica em ureia Triton x 100 Mesta altura, o factor de indução óssea avaliou-se numa pu6 reza aproximadamente entre 10% a 50%.

pão SDS 1X. Após 15 minutos de aquecimento a temperatura de ^./37^, a amostra foi aplicada a um gel de poliacrilamida SDS / a 15% e em seguida submetido à electroforese sob arrefecimento. 0 peso molecular determinou-se relativamente a pag drões de peso molecular pré-corados (Bethesda Research Labs). í--I-’ 66’·' ^-6 -’ - Et

Tmediatamente após a terminação, a banda de gel que contém gel foi dessalificada para impedir a interferência no ensaio

-21biológico. A fracção sobrenadante de cada amostra foi acidificada a pH 3,0 com ácido trifluoro-acético a 10%, filtrada através de uma membrana de 0,45 micra e impregnada numa coluna Vidac C4 de 0,46 cm por 5 cm desenvolvida com um gradiente de concentração até 0,1% de ácido trifluor-acético, de 0,1% de TFA, de 90% de cianeto de metilo. As fracções que continham o factor de indução ósseo apropriadas reuniram-se e reconstituiu-se com 20mg de matriz de rato. Neste sistema de gel as frscções de factor de indução óssea principais tinham a mobilidade de uma proteína que tinha um peso molecular de aproximadamente entre 28 000 e 30 000 daltons.

gQQ.age.in Ispeléctrica

Determinou-se o ponto isoeléctrico da actividade do factor de indução óssea no sistema de focagem isoeléctrica désnaturante. 0 sistema Triton xlOO de gel de ureia (Hoeffer Scientific) foi modificado do seguinte modo: 1) Dos amfolitos utilizados 40% eram servalite 3/10; 60% eram servalite 7-*9« 2) 0 catolito utilizado era hidróxido de sódio

40mM, I»iofilizaram-se aproximadamente 20^ug de proteína proveniente do Exemplo I, dissolveu-se num tampão de amostra e aplicou-êe a um gel de focagem iso-eléctrica. 0 gel desenvolveu-se a 20 watts, à temperatura de 10°C durante aproximadamente 3 horas. Quando terminou, a banda que continha o factor de indução ósseo foi dividida em tiras de 0,5 cm. Cada peça foi misturada em ureia 6M, l,0ml, Tris 5mM de pH

-22K' ^v' 7,8 e as amostras agitadas à temperatura ambiente. Deter >

minou-se o gradiente de pH do gel por imersão

W·····' ig··;|é

s.:

de 5mM ei 1,0 ml de água durante 2 horas. As ram acidificadas, filtradas, dessalificadas e mo se descreveu antes. A porção principal de determinada de acordo como ensaio descrito no migrou de uma maneira consistente com o ponto de

8,8 -.9,2

CaracterizaçgQ de Sub-unidade

Também se determinou a composição das tiras doseadas coactividade

Exemplo III isoeléctrico da sub-unidade de factor de indução ósseo. Isolou-se o factor de indução ósseo de um gel SDS a 15% preparativo como se descreveu antes. Uma porção da amostra foi em seguida reduzida com DTT 5πΛ num tampão de amostra e de novo submetido a gel SDS a <Jpctroforese em mente 30Td produziu duas bandas

15%.

proteína de aproximadaprincipais aproximadamente a 20 Kd e 18 Kd, assim como uma banda menor a 30 Kd. A laj;

gura das duas bandas indicava a muito provavelmente, por glicosilação, outra modificação heterogeneidade provocada, j» pós-translacional, degradação proteolítica ou carbamilação.

EXEMPLO III

Actividade Biológica de Factor de Indução Ossea

Utilizou-se um doseamento de formação óssea de rato de apordo com o processo geral de Sampath e Reddi,

-23MT - Proc. Matl. Acad. Sei. U.S.A., 80:6591-6595 (1983) para determinar a actividade osteogénica de factor de indução ósΚί&Ί gj. sea bovino da presente invenção obtido no Exemplo I. Este «w- . g

ET doseamento pode também ser utilizado para avaliar factores fofe’ í‘ ' Μ· V

EL· de indução óssea de outras espécies. A fase de precipitaκ. ção com etanol foi substituída por diálise da fraeção a Γ ser doseada, contra a água. A solução ou suspenção foi em H'.’ seguida redissolvida num solvente volátil, por exemplo, áciKl do triflúor-acético a 0,1 - 0,2$, e a solução resultante aK, dicionadW.a 20 mg de matriz de rato. Este material foi lioR filizado e o pó resultante acondicionado em cápsulas de geL latina número cinco. As cápsulas foram implantadas subcu'Γ

Euf taneamentú na área toráxico abdominal em ratos machos Evans

t. com 21 a 49 dias de idade. Os implantes foram removidos aO pós 7 dias. Metade de cada implante foi utilizada para a

BC, determinação da fosfase alcalina jvêr, A. H. Reddi et al., Kl Proc. Natl. Acad. Sei., 69 : 1601 (1972)J e metade foi fiEL xada e processada para análise histológica. Rotineiramente, |Κ, secçOes de glicol metacrilato de Ιμπι foram coradas com Von Br Kossa e fuccina ácida para se detectar mineral ósseo novo, ΒΓ.’ Também foi medida a fosfatase alcalina que é uma enzima produzida pelos condroblastos e osteoblastos no processo de formação da matriz. A cartilagem recente e a formação óssea estão muitas vezes relacionadas com os níveis de fosfatase alcalina. No Quadro I a seguir representa-se a dose de resposta de amostras de matriz de rato que incluem um controle não tratado com o factor de indução óssea.

-24*η

QUADRO I jttg de Proteína *

Implantada	Cartilagem	Fosf. Alc. /1/1
7,5	2	/Não efectuada
2,5	3	445,7
0,83	3 .	77,4
0,28	0	32,5
0,00	0	31,0

de indução ósseo é aproximadamente í Neste estádio o factor

10/ a 15/ puro.

osso ou

cartilagem formados estava fisicamente confinado com o espaço tras também foram analisadas e focagea iso-eléctrica como ocupado pela matriz. As amospor electroforese sob gel SDS se descreveu antes, seguido por autoradiografia. As análises revelaram tre a actividade das bandas ponto isoeléctrico de 9,0. extinção de 1 DO/mg-cm como uma correlação ende proteína

Utilizou-se a 28 e a 30 KD um coeficiente estimado para a proteína e e um de para a pureza aproximada de factores de indução óssea numa fracção particular. Nos ensaios de formação de osso no rato in vivo nas diluições, como descrito in vivo entre 10 a 200 ng de vavelmentè maior do que 1 jug antes, a proteína era proteína por grama de de proteína por grama

EXEMPLO IV activa osso, prç.

de osso

Composição Proteínica de Factor de Indução Óssea Bovino

A composição em proteínas do Exemplo IlA.de pe|I

....

so molecular entre 28 a 30 Kd foi reduzida como se descreveu no exemplo IIC e digerida com tripsina. Oito fragmentos tríptidos foram isolados

....... Έ as sequências de por processos habituais tendo aminoácidos seguintes:

.'fj'; 'f ee·

Fragmento •li'

Fragmento

1:

2:

3J

Fragmento Fragmento Fragmento Fragmento Fragmento

4:

6:

7:

8:

Uma preparação de

/.j' pureza menos elevada de prote£ na de osso bovino foi reduzida e submetida à electroforese sobre gel de acrilamida. Eluiu-se a proteína que correspondia a uma banda de 18K e digeriu-se com tripsina. Os fragmentos trípticos foram isolados e exibiam as seguintes sequências de aminoácidos:

;

Fragmentó

->

Fragmento

10: S

11: V

12: V

Verificou-se que os fragmentos trípticos 7 e 8

Bsí. τ ; ·’ -_r .

g_:; eram substancialmente iguais respectivamente aos fragmentos e 9, citados antes.

A. bBMP-1 »1.

Bll

Sondas constituídas por conjuntos de oligonucleótidos (ou por um único oligonucleótido ) foram designadas de acordo com o método de R. lathe, J. Mol. Biol., 183 (1):1-12 • (1985) e sintetizados num sintetizador de DNA automatizado. tJma sonda consiste num estimador relativamente longo (32 nucleótidos) {vêr J. J. Toole et al., Nature, 312:342-347 (1984)2] pbssuia a seguinte sequência nucleotídica: tcctcatccAgggcaatgtcgcccaggaaggc

Devido ao código genético ser degenerado (mais do que um *codão podia codificar para o mesmo aminoácido), reduziu-se o número de oligonucleótidos num conjunto de sondas fundamentado na frequência de utilização de codão nos eucariotas, a estabilidade relativa de pares de bases G:T e na relatiya falta de frequência dos dinucleótidos CpG em sequências codificadoras eucarióticas (vêr Toole et al., Supra.). 0 segundo conjunto de sondas consistia em oligonucleatidos mais pequenos (com o comprimento de 17 nucleótidos) que continha todas as sequências possíveis que podem codificar os aminoácidos. 0 segundo conjunto de sondas tinha as 'sequências seguintes.

(a) A (A/l) (A/G) TC (T/C) TC (T/C) TC (A/G) TC (T/C) ΑΑ (b) A (A/G) (A/G) TC (T/C) TC (T/C) TC (A/G) TCNAG

Os nucleótidos entre parenteses são alternativos. N representa quer A, T, C ou G.

Em ambos os casos as regioões da sequência de aminoácidos utilizada para desenhar a sonda foram escolhidas evitando-se degenerar de um modo acentuado tanto quanto pos-27 sível os codões. Os ologonucleótidos foram sintetizados num sintetizador de DNA automatizado; As sondas foram em seguida marcadas radioactivamente com polinucleótido Quinase e ATP-P³²,

Sstes dois conjuntos de sondas foram utilizados para sondar uma biblioteca recombinante genómica bovina. A biblioteca foi construída do seguinte modo: DNA de fígado bovino foi parcialmente digerido com a enzima de endonuclease de restrição Sau 3A e sedimentada com gradiente de sucrose. 0 DNA fraccionado com uma dimensão compreendida entre os limites de 15 e 30 Kb foi em seguida ligada ao vector EMBL3 do bactereofago Bam Hl ^Frischauf et al., J.

Mol. Biol., 170:827-842 (1983) . A biblioteca foi colocada em placas numa proporção de 8000 recombinantes por placa. As réplicas de nitrocelulose duplicadas das placas foram construídas é ampliadas de acordo com uma modificação do processo de Woo et al., Proc. Natl. Acad. Sei. Usa, 75: :3688-91 (1978).

i A sonda de 32 mer foi fosfatada com/32p-gamma-ATP e hibri.íizada num conjunto de filtros em SSC 5x, SDS

- 0,1%, Denharts 5x, e DNA de esperma de salmão a 100 ^g/ml à temperatura de 45°C e lavada com SSC 5x, SDS 0,1% à tem peratura de 45°C. As sondas com 17 mer foram fopfatadas e hibridizadas noutro conjunto de filtros em cloreto de tetrametilamónio 3M cloreto (TMAC), fosfato de sódio O,1M com PH de 6,5, EDTA ImM, Denharts 5x, SDS a 0,6%, DNA de esperma de salmão 100 jug/ml à temperatura de 48°C e levadas com

' TMAC 3M, Tris 50mM de pH 8,0 à temperatura de 50°C. Estas condições minimizam a detecção de erros para o conjunto de sondas de 17 mer. [yêr, Wood et al,, Proc. Natl. Acad. Sei

U.S.A., 82:1585-1588 (1985) 400 000 recombinantes foram sondados por este processo e uma réplica positiva foi colocada em placas para purificação. 0 DNA foi isolado de um lisadc de placa deste bacteriofago recombinante designado por lambda bP-50. 0 bP-50 está depositado na American

Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland sob o número de acesso 40295 depositado em 16 de Dezembro de 1986. Este clone bP-50 codifica o factor de desenvolvimento bovino designado por bBMP-1.

de bases do sequênciado

A região de hibridização oligonucleotídica deg te clone BMP-1 está localizada aproximadamente em 800 pares fragmento Eco RI que está subclonado no M13 e por meio de técnicas padrão. A sequência de e a sequência de aminoácidos derivada do lamba

DNA parcial

BP-50 representam-se no Quadro II

As sequências de aminoácidos correspondentes aos fragmentos trípticos isolados do material de 28 a 30 kd de osço bovino estão sublinhadas no Quadro II. A pri -í fracção sublinhada da sequência corresponde ao fragtríptico I referido mento sondas oligonucleótidas antes do qual são designadas as

A segunda porção sublinhada corresponde ao fragmento tríptico número 2 acima. A sequência de aminoácidos prevista indica que o fragmento triplico precedido por um resíduo básico (R) tal como esperado '<·

e é codificada por

em consideração à especificidade da tripsina. A sequência de ácido nucleico que precede o par CT nas posições do nucleétido número 292-293 no Quadro II, presume-se ser um intrSo (sequência não codificadora) fundamentado na presença de uma sequência aceitadora consensual (isto é, uma região rica em pirimidina TCTCTCTCC, seguida por AG) e a ausência do resíduo básico na posição apropriada na sequência de aminoàcidos derivada. A sequência peptídica bBMP-1 deste clone tem 37 aminoácidos de comprimento uma sequência de DNA desde o nucleútido nucleétido número 404.

: í !

f·’ ? ^;'^r . 7 1

B. bBMP-2 número 294 até ao e sintetizadas

Duas sondas que consistem nucleétidos foram designadas na base ácidos do Fragmento 3 r ; :

DNA automatizado como

Sonda #1: ACC N A C C

Sonda C A (A/G) G em conjuntos de oligoda sequência de aminonum sintetizador de se descreveu antes.

A T (A/G) T C (T/C) T G (A/G) A T

A (T/C) ATGGTNGTNGA

Estas são marcadas radioactivamente e utilizadas para sondar a biblioteca genémica bovina construída como se descreveu na parte A excento no facto do do com lambda J1 Bam Hl Qlullins et al., (1984). . A sonda de 17 mer marcada radioactivamente nú—t mero 1 foi hibridada no conjunto de filtros de acordo com o método para a sonda de 17 mer descrita na parte A.

,.!!:

..

vector ser reforçanature 308:856-858

Os 400 000 recombinantes foram sondados pelo pro-30' cesso descrito antes. Uma réplica positiva foi purificada em placa e o DNA isolado de um lisado da. placa a partir deste bacteriofago recombinante designado por lambda BP-21. 0 bacteriófago BP-21 está depositado na American Type Culture CoXlection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland sob o número de acesso 40310 em 6 de Março de 1987, 0 cl£ nê de BP-21 que codifica o factor de crescimento bovino foi designado por bBMP-2.

QUADRO II

280 290 (1) ; 308323

OCTIGOCTCT TCTCTCTCCA GCT GCC TÉC CTT GGG GAC ATC GCC CTG GAC GAG GAG ‘ Ala Ãie Leu Gly Asp Ile Ala Leu Asp Glu Glu

338 ^Z 353368

TTG AG§ GCC TIC CAA GIG CAG CAG GCT GCG GAC CTC AGA CAG CGT GCAACC

Ã^ LsuArg Ala lhe Gin Val Gin Gin Ala Ala Asp Leu Arg Gin Arg AlaDir

383 398 ( 37) 414424

CGC ABG TCt TCC ATC AAA GCT GCA GGTACACTGG GTACAGGCCA Arg Arg Sesr Ser Ile lys Ala Ala oligonucleótido que hibridiza a região deste clone bBMP-2 está localizado num Fragmento de restrição Sac I de aproximadamente 1,2 Kb que está subclonado no M13 e sequênciado por meio de técnicas padrão. A sequência de DNA parcial e a sequência de aminoácidos derivada deste Fragmento Sac I e o Fragmento de restrição Sac I - Hind III contiguo de BP-21 mostram-se no Quadro III a seguir. As sequências de aminoácidos que correspondem ao Fragmento tríptico isolado do material de 28 a 30 Kd de osso bovino estão .sublinhadas no Quadro III. A porção sublinhada da sequência corresponde ao Fragmento 3 tríptico, referido

antes, a partir do qual foram projectadas as sondas oligonucléSxídicas bBMP. A sequência de aminoácidos referida < 3- * _ltl;í λ » ψι antes indica que o Fragmento tríptico 3 e precedido por 1 um resíduo básico (K) como esperado tendo em consideração a especificidade da tripsína. 0 resíduo da arginina codificado pélo tripleto CGT presumiu-se ser o terminal carboxilo da proteína fundamentado na presença de um codão de paragem (TAG) adjacente a este.

C . bW-3 '

As sondas que consistiam em conjuntos de oligonucleótidos foram construídas na base de sequências de aminoácidos dos Fragmentos trípticos 9, 10 e 11, e sintetizadas num sintetizador de DNA automatizado.

Quadro III (1) 15 30 45. GGC GAT GGG AAA GGA CAC O^T CTC CAC AGA AGA GAA AAG OGG GÍDGKGHPLHRREKR

75 90 CAA $CA ΑΆΑ CAC AAA CAG OGG AAA CGC CTC AAG TCC AGC TCT AAG QÀKHKQRKRLKSSCK

105 120 135 AGA CAC CCT TIA ΤΑΓ CTG GAC TTC ACT GAT CTG GGG TGG AAT GAC R tPLYVDFSDVGWRD

150 165 180 TGG AlC CTT GCA CCG CCG GGG ΊΑΤ CAT GCC ΊΤΤ TAC TCC CAT GGG W1VAPPGYH AFYCHG

195 210 225 GAG IGC CCT ΊΊΤ OCC CIG GCC GAT CAC CIT AAC TCC AOG ΑΑΓ CAT EèPFPLADHLNSTNH

240 255 270 GQC £TT CTC CAA ACT CIO GTC AAC TCA GTT AAC TCT AAG ΑΤΓ CCC M f VQTLVNS VNSKIP

385 300 315

AAG GCA TCC TCT CTC OCA ACA GAG CIO AGC GCC ATC TCC AIG CIG KÀCCVPTELSAISML

330 345 360 TAC CIT GAT GAG ΑΑΓ GAG AAG GTG GTA TIA AAG AAC TAT CAG GAC YÍ DE NEKVVLK N Y O D

375 (129) 397 407 ASBG GTT CTC GAG GCT TCT GGG TCT CCT TAGCACAGCA AÀATAAAATA « f V E G C G C R

417 427 437 447 457 TAAMATAEA ΊΑΤΑΤΑΤΑΤΆ TIAGAAAAAC AGCAAAAAAA TCAAGTIGAC . 467 477 487 497 507 ACTÍSAATAT TTCOCAATCA AGACTTIATT TATCGAATGG AATGGAGAAA

517 527 537 547 557

AAGAAAAACA CAGCTATITT GAAAACIATA TITATATCIA COGAAAAGAA

567 577 587

CTWGAAAA CAAATATTIT AATCAGAGAA ΤΓΑΊΤ

-337 ( '

Sonda ^1: ACNGTCAT (A/G) T T N G G (A/G) T A (baseado no Fragmento 11)

Sonda #2: C A (A/G) T A (A/G) TANGC (A/G) T C (A/G) A A (baseado no fragmento 10) íl‘ÍÍS·:· ' ff ' f^?!j < Sonda T G (A/G/T^A T N G T N G C (A/G) T G (A/G) T T th- ' · f j (baseado no Fragmento 9)

Β*'*;:

Uma biblioteca genómica bovina recombinante consβ·.· . 'd truida no BMBL-3 foi sondada por o processo de hibridação fef, ff - ú de TMAC inferido detalhadamente antes na parte A. Os 400Ώ00 reeombinantes foram sondados em duplicado com a sonda número 3 2 que foi marcada com Ρ , Todos os reeombinantes que hibrldaram com esta sonda foram replicados segunda vez. Réplicas de nitrocelulose em triplicado foram construídas das segundas placas e amplificadas como se descreveu antes. Os fcr·· ' .

três conjuntos de filtros foram hibridizados para sondas numero 1, 2 e 3 ainda sob condições de TMAC. Um clone, lambda BP-819, hibridizou para todas as três sondas e foi plaqueado *’ para purificar e o DNA isolado de um lisado da placa. 0 bacteriofago lamba BP-819 está depositado na ATCC sob o número de acesso 40344 em 16 de Junho de 1987.

' * A região de BP-819 que hibridiza com as sondas número 1 e número 3 foi localizada e sequênciada. 0 DNA par

7^{| :}: f ciai e as sequências de aminoácido derivadas desta região representam-se no Quadro IV A. As sequências de aminoácidos que corresnondem ao Fragmento tríptico 9 e 11 estão sublinhg. das. Ό resíduo de arginina codificado pelo tripleto AGA pre sume-se ser o terminal carboxílico da proteína fundamentado

Êftffff : ff ’^Λ ff '· h '

na presença de um codão de paragem (TAA) adjacente àquele. A sequência de ácido nucleíco que precede o par TC (posições 305-306) presume-se ser um intrão (uma sequência não codifj. cadora) fundamentado na presença de uma sequência aceitadora consensual (isto é_t uma extenção rica em pirimidina, TTCTCCCTTTTCGTTCCT, seguida por AG) e a presença de um codão de paragem de preferência a um resíduo básico na posição apropriada da sequência de aminoácidos derivada.

A região diferente de BP-819 Que h.ibridiza com a sonda 2 foi localizada e sequênciada. 0 DNA parcial e as sequênciás de aminoácidos derivadas desta região representam-se no Quadro IV B. As sequências de aminoácidos que cor· respondem aos Fragmentos trípticos 10 e 12 estão sublinhados. 0 bBMP-3 foi portanto caracterizado por sequência de DNA e sequência de aminoácidos do Quadro IV A e Quadro IV B.

Hcíores^de Indução Ósseo Humanos

T

B·/· teu

A. hBMP-1

Devido ao facto dos genes de factor de desenvolvimento ósseo humano e bovino serem julgados significativamente homólogos, a sequência de DNA de BMP-1 bovino do Quadro II (ou as suas porções) foi utilizada como uma sonda pa ra sondar a biblioteca genómica humana. 0 Fragmento EcoRI

	473					488
GAG	AGG	AAG	CCT	TAC	AAG	ACT
Glu	Arg	Lys	Pro	iyr	Lys	Thr
			533
ΆΆΆ	AAG	AAA	CAG	AGG	AAG	GGA
Lys	Lys	Lys	Gin	Arg	Lys	Gly
578					593

				379
CCT	GGA	ATC	CCC	GAG	CCT	'TTT'
Pro	C-ly	Ile	Pro	G1U	Pro	cys
	424					439
TTA	TIC	ΊΤΤ	GAT	GAA	AAC	rxfvj
Leu	E-.e	Phe	Asd	Glu	Asn	Lys
			484			(175)
GTA	GAG	TCT	TCT	GCT	TCC	Λ2Α
Vai	C-lu	Ser	Cus	Ala	Cys	Arg

-35de 800 pires de bases do clone genómico bovino foi marcado com por corte translocado. Uma biblioteca genómica humana (Toole et al., Supra) foi plaqueada em 20 placas a 40 000 recombinantes por placa. A partir de cada placa construiram-se réplicas dos filtros de celulose em duplicado e híbridizaram-se com a sonda de corte translocado em SSC 5x, Denhardt 5x 100MG· por MI de DNA de esperma de salmão desnaturado, SDS 0,1% (solução de hibridação pedrão) à temperatura de 50°C durante aproximadamente 14 horas. 0s filtros foram em seguida lavados com SDS a 0,1%, SSC lx, à temperatura de 50°C e submetidos à autoradiografia. Cin co réplicas positivas foram isoladas e purificadas em placa, 0 D1TA obtido de um lisado de placa de um destes bacteriofágos recombinantes designado por LP-H1, depositado na ATCC sob o número de acesso 40 311 em 6 de Março de 1987. A região de hibridação do LP-H1 está localizada num Fragmento de restrição com 2,5 QB, XMI/Hiúd III. A sequência parcial de DNA e a sequência de aminoácidos derivada do lambda Ip-HI mostram-se no Quadro V.

QUADRO V

3419 3429 3439 (1)3454

CA53CCIGGC TlOITCTITr CTCTnAGCÍ? GCC ΠΤ CIT GGG GAC ATT GCC CIG GAC

Ala Ehe Leu Gly Asp Ile Ala Leu Asp

3469 3484 34993514

GAG GAC CIG AGG GCC TIC CAG GIA CAG CAG GCT GTG GAT CTC AGA OGG CAC

G3Lu Asp Leu Arg Ala She Gin Vai Gin Gin Ala Vai Asp Leu Arg Arg His

35» 3544 (37) 35603570

ACA GCT CCÇ? AAG TOC TCC ATC AAA GCT GCA GGTAAGCOGG GTCCCAAIGG

Ala Arg Iys Ser Ser Ile Iys Alá Ala /

- ι

Ο 1Ρ-ΗΙ foi depositado na American Type Culture Collection sob o núaiero de aceitação 40311, em 6 de Farço de 1987. Este clone codifica o factor humano designado por hBFP-1.

Devido à dimensão das regiões codificadoras e às posições das regiões não codificadoras, é geralmente con servado nos genes homólogos de diferentes espécies. As localizações das regiões codificadoras e não codificadoras dos genes de factor de indução óssea que podem ser identificados. Regiões de homologia entre as duas espécies de genes, flanqueadas por RNA que fornece sinais em sítios ho mólogos, indicam uma região codificadora.

Uma sonda específica para a sequência codificadora humana representada no Quadro V é utilizada para identificar uma linha de células humana ou tecido que sintetiza o factor de indução óssea. A sonda é executada de acordo com o método seguinte. Dois oligonucleótidos que possuem as sequências seguintes:

(a) GGGAATTCTGCCTTTCTTGGGGACATTGCCCTGGACGAAGAGGACCTGAG (b) CGGGATCCGTCTGAGATCCACAGCCTGCTGTACCTGGAAGGCCCTCAGG são sintetizados num sintetizador automático, circularizados, utilizando-se o Fragmento de Klenow de E. Coli de DNA polimerase I, digeridos com enzimas de restrição Eco RI e BamHI e inseridos num vector M13. Uma sonda de cadeia sim pies marcada com P foi, a seguir, construída de uma preparação de matriz deste subclone, por meio de técnicas habituais. Submeteram-se RNAs poli-adenilados de várias cé-37-

lulas e tecidos de várias origens a electroforese sobre geles de aldeído fórmico - agarose e transferiram-se para nitrocelulpse pelo método de Toole et al., Supra. A sonda foi em seguida hibridizada para nit.rocelulose em formamida a 50$, S|C 5x, SDS 0,1$, fosfato de sódio 40 mM de PH 6,5, 100 jug/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado, e 5 mM de vanadíl ribonucleósidos à temperatura de 40°C durante a noite e lavados à temperatura de 65°C em SSC 0,2X, SDS 0,1$, A seguir à autoradiografia, a banda que continha o RNA da linha U-2 de células de osteo-sarcoma humano, continha bandas hibrldadas que correspondiam às espécies de RNA de apr&

I'· ximadamente 4,3 e 3,0 Kb.

CDNA foi sintetizado a nartir de RNA poli-adenilado V-2 OS e clonado no lambda gt-10 por técnicas habituais (Toole et al., Supra). Os 20 000 recombinantes des ta biblioteca foram plaqueados em cada uma de 50 placas.

rgí .

Réplicas de nitrocelulose duplicadas foram construídas a partir destas placas. Os oligonucleótidos descritos antes

2 foram fosfatados com gamma ATP-P^ e hibridizados para os B/p dois conjuntos de réplicas à temperatura de 55°C durante a noite numa solução de hibridação padrão. Os filtros foram em seguida lavados com SSC lx, SDS a 0,1$ à temperatura de 55°C e submetidos à autoradiografia. Uma réplica positiva designadâ por lambda U-2 OS-1 foi purificada em placa. 0 lambda U2ÒS-1 está registado na ATCC sob o número de acesso 40 343 desde 16 de Junho de 1987.

gf

A sequência nucleótídica completa e a sequência de aminoácidos derivada da. inserção do lambda U20S-1 está representada no Quadro VI.

-38Ouadro VI

20 30 (1)50

CTAGAGGCCG CITCCCTCGC OGCCGCCCOG CCAGC ATCCCCGGCGTCGCCCGCCIGCCG MET Pro Gly Vai Ala Arg Leu Pro

80 95110

CTG CIG CTC GGG CTG CTG CTC CTC OOG OGT CCC GGC CC-G COG CIG GAC TIG GCC

Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Pro Arg Pro Gly Arg Pro Leu Asp leu Ala

125 140155

GAC TAC ACC TAT GAC CTG GOG GAG GAG GAC GAC TCG GAG CCC CTC AAC TAC AAA

Asp Tyr Ihr Tyr Asp leu Ala Glu Glu Asp Asp Ser Glu Pro leu Asn Tyr Lys

170 185 200215

GAC CCC TCC AAG GOG GCT GCC TTT CIT GGG GAC ATT GCC CTG GAC GAA GAG GAC

Asp Pro Çys Lys Ala Ala Ala Phe Leu Gly Asp Ile Ala Leu Asp Glu Glu Asp

230 245 260275

CIG AGG GCC TTC CAG GTA CAG CAG GCT GTC GAT CTC AGA CGG CAC ACA GCT CGT

Leu Arg Ala Phe Gin Vai Gin Gin Ala Vai Asp Leu Arg Arg His Ihr Ala Arg

290 305320

AAG TCC TCC ATC AAA GCT GCA GTT CCA GGA AAC ACT TCT ACC CCC AGC TCCCAG

Lys Ser Ser Ile Lys Ala Ala Vai Pro Gly Asn Ihr Ser Ihr Pro Ser CysGin

335 350 365380

AGC ACC AAC GGG CAG CCT CAG AGG GGA GCC TCT GGG AGA TCG AGA GGT AGATCC

Ser Thr Asn Gly Gin Pro Gin Arg Gly Ala cys Gly Arg Trp Arg Gly Arg Ser

395 410 425

OGT

AGC

OGG

GOG

AOG

TCC

OGA

CCA

GAG

OGT

GTC

TCG

CCC

GAT

GGG

GTC

Arg

Ser

Arg

Ala

Ihr

Ser

Arg

Pro

Glu

Arg

Vai

Trp

Pro

Asp

Gly

Vai

440

455

470

485

ATC

CCC

TTT

GTC

ATT

GGG

GGA

AAC

TTC

ACT

GGT

AGC

CAG

AGG

GCA

GTC

TTC

OGG

Ile

Pro

Phe

Vai

Ile

Gly

Asn

Phe

Ihr

Gly

Ser

Gin

Arg

Ala

Vai

Phe

Arg

500

515

530

545

CAG

GCC

ATC

AGG

CAC

TCG

GAG

AAG

CAC

ACC

TGT

GTC

ACC

TTC

CIG

GAG

CGC

ACT

Gin

Ala

MET

Arg

His

Trp

Glu

Lys

His

Ihr

Çys

Vai

Ihr

Phe

Leu

Glu

Arg

Ihr

560

575

590

GAC

GAG

GAC

AGC

TAT

AIT

GTC

TTC

ACC

TAT

OGA

CCT

TCC

GGG

TCC

TAC

Asp

Glu

Asp

Ser

Tyr

Ile

Vai

lhe

Ihr

lyr

Arg

Pro

Cys

Gly

Çys

Cys

Ser

Tyr

605

620

635

650

GTG

GGT

CCC

CGC

GGC

GGG

GGC

CCC

CAG

GCC

ATC

TCC

ATC

GGC

AAG

AAC

TGT

GAC

Vai

Gly

Arg

Gly

Pro

Gin

Ala

Ile

Ser

Ile

Gly

Lys

Asn

Çys

Asp

665 680 695

AAG TTC GGC AIT GTC GTC CAC GAG CIG GGC CAC GTC GTC GGC TTC TCG CAC GAA

Lys Phe Gly Ile Vai Vai His Glu Leu Gly His Vai Vai Gly Phe Trp His Glu

710 725 740 755

CAC ACT OGG CCA GAC OGG GAC OGC CAC GIT TCC ATC GIT OGT GAG AAC ATC CAG

His Thr Arg Pro Asp Arg Asp Arg His Vai Ser Ile Vai Arg Glu Asn Ile Gin

770 785 800 815 CCA GGG CAG GAG TAT AAC TTC CIG AAG ATC GAG CCT CAG GAG GTC GAG TCC CIG Pro Gly Gin Glu Tyr Asn Phe Leu Lys MET Glu Pro Gin Glu Vai Glu Ser Leu

830 845860

GGG GAG ACC TAT GAC TTC GAC AGC ATC ATC CAT TAC GCT OGG AAC ACA TTC TCC

Gly Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ser Ile MET His Tyr Ala Arg Asn Thr Phe Ser

875 890 905920

AGG GGC ATC TTC CTG GAT ACC ATT GTC CCC AAG TAT GAG GTG AAC GGG GTG AAA

Arg Gly Ile Fhe Leu Asp Thr Ile Vai Pro Lys Tyr Glu Vai Asn Gly Vai Lys

935 950965

CCT CCC ATT GGC CAA AGG ACA OGG CTC AGC AAG GGG GAC ΑΊΤ GCC CAA GCCOGC

Pro Pro Ile Gly Gin Arg Ihr Arg Leu Ser Lys Gly Asp Ile Ala Gin AlaArg

980 995 10101025

AAG CTT TAC AAG TCC CCA GCC TCT GGA GAG ACC CIG CAA GAC AGC ACA GGCAAC

Lys Leu Tyr Lys Cys Pro Ala Cys Gly Glu Ihr Leu Gin Asp Ser Thr GlyAsn

1040 1055 10701085

TTC TCC TCC CCT GAA TAC OOC AAT GGC TAC TCT GCT CAC ATC CAC TCC GTGTGG

Phe Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Asn Gly Tyr Ser Ala His MET His Cys VaiTrp

1100 11151130

OGC ATC TCT GTC ACA CCC GGG GAG AAG ATC ATC CIG AAC TTC AOG TCC CIGGAC

Arg Ile Ser Vai Thr Pro Gly Glu Lys Ile Ile Leu Asn Phe Ihr Ser Leu. Asp

1145 1160 11751190

CIG TAC OGC AGC OGC CIG TCC TCG TAC GAC TAT GIG GAG GTC OGA GAT GGCTTC

Leu Tyr Arg Ser Arg Leu cys Trp Tyr Asp Tyr Vai Glu Vai Arg Asp GlyFhe

1205 12201235

TGG AGG AAG GCG CCC CTC OGA GGC OGC TTC TCC GGG TCC AAA CTC CCT GAGCCT

Trp Arg Lys Ala Pro leu Arg Gly Arg Phe Cys Gly Ser Lys Leu Pro GluPro

1250 1265 12801295

ATC GTC TCC ACT GAC AGC OGC CTC TCG GIT GAA TTC OGC AGC AGC AGC AAT TCG

Ile Vai Ser Thr Asp Ser Arg Leu Trp Vai Glu Phe Arg Ser Ser Ser Asn Trp

1310 1325 1340 1355

GTT GGA AAG GGC TTC ΊΊΤ GCA GTC TAC GAA GCC ATC TCC GGG GGT GAT CTG AAA

Vai Gly Lys Gly Fhe Fhe Ala Vai Tyr Glu Ala Ile Cys Gly Gly Asp Vai Lys

1370 13851400

AAG GAC TAT GGC CAC ATT CAA TOG CCC AAC TAC CCA GAC GAT TAC OGG CCCAGC

Lys Asp Tyr Gly His Ile Gin Ser Pro Asn Tyr Pro Asp Asp iyr Arg ProSer

1415 1430 14451460

AAA GTC TGC ATC TGG OGG ATC CAG GTG TCT GAG GGC TTC CAC GTG GGC CTCACA

Lys Vai Cys He Trp Arg Ile Gin Vai Ser Glu Gly Fhe His Vai Gly LeuIhr

1475 14901505

TTC CAG TCC ΊΊΤ GAG ATT GAG OGC CAC GAC AGC TGT GCC TAC GAC TAT CTGGAG

Fhe Gin Ser Phe Glu Ile Glu Arg His Asp Ser Cys Ala lyr Asp lyr LeuGlu

1520 1535 15501565

GTG OGC GAC GGG CAC AGT GAG AGC AGC ACC CTC ATC GGG OGC TAC TGT GGCTAT

Vai Arg Asp Gly His Ser Glu Ser Ser Ihr Leu Ile Gly Arg lyr Cys Glylyr

1580 1595 1610 1625

GAG AAG CCT GAT GAC ATC AAG AGC AOG TCC AGC OGC CTC TGG CTC AAG TTC GTC

Glu

Lys

Pro

Asp

Ile

Lys

Ser

Ihr

Ser

Arg

Leu

Trp

Leu

Lys

Fhe

Vai

1640

1655

1670

TCT

GAC

GGG

TCC

ATT

AAC

AAA

GOG

C-GC

ΊΊΤ

GCC

GTC

AAC

TTT

TIC

AAA

GAG

GTG

Ser

Asp

Gly

Ser

Ile

Asn

Lys

Ala

Gly

Fhe

Ala

Vai

Asn

Fhe

Lys

Glu

Vai

1685

1700

1715

1730

GAC

GAG

TGC

TCT

OGG

CCC

AAC

OGC

GGG

GGC

TGT

GAG

CAG

OGG

TGC

CTC

AAC

ACC

Asp

Glu

Cys

Ser

Arg

Pro

Asn

Arg

Gly

Cys

Glu

Gin

Arg

cys

Leu

Asn

Ihr

1745

1760

1775

CIG

GGC

AGC

TAC

AAG

TGC

AGC

TGT

GAC

CCC

GGG

TAC

GAG

CIG

GCC

CCA

GAC

AAG

Leu

Gly

Ser

Tyr

Lys

cys

Ser

cys

Asp

Pro

Gly

Tyr

G1U

Leu

Ala

Pro

Asp

Lys

1790 1805 18201835

OGC OGC TGT GAG GCT GCT TGT GGC GGA TTC CTC ACC AAG CTC AAC GGC TCC ATC Arg Arg cys Glu Ala Ala Cys Gly Gly Fhe Leu Ihr Lys Leu Asn Gly Ser Ile

1850 1865 18801895

ACC AGC COG GGC TGG CCC AAG GAG TAC CCC CCC AAC AAG AAC TGC ATC TGGCAG

Thr Ser Pro Gly Trp Pro Lys Glu Tyr Pro Pro Asn Lys Asn Cys Ile TrpGin

1910 19251940

CTG GTG GCC CCC ACC CAG TAC OGC ATC TCC CIG CAG ΊΊΤ GAC TTC TTT GAGACA

Leu Vai Ala Pro Thr Gin Tyr Arg Ile Ser Leu Gin Phe Asp Phe Phe GluThr

1955 1970 19852000

GAG GGC AAT GAT GTG TGC AAG TAC GAC TTC GTG GAG GTG OGC AGT GGA CTC ACA

Glu Gly Asn Asp Vai Cys Lys Tyr Asp Phe Vai Glu Vai Arg Ser Gly Leu Thr

2015 2030 2045

GCT GAC TCC AAG CTG CAT GGC AAG TTC TGT GGT TCT GAG AAG CCC GAG GTC ATC

Ala Asp Ser Lys Leu His Gly Lys Fhe Cys Gly Ser Glu Lys Pro Glu Vai Ile

-41/ f

2060 2075 2090 2105

ACC TCC CAG TAC AAC AAC AIG OGC GIG GAG TTC AAG TCC GAC AAC ACC GTG TCC

Ihr Ser Gin lyr Asn Asn MET Arq Vai Glu lhe Lys Ser Asp Asn Ihr Vai Ser

2120 2135 21502165

AAA AAG GGC TTC AAG GCC CAC TTC TTC TCA GAA AAG AGG CCA GCT CIG CAGCCC

Lys Lys Gly Ehe Lys Ala His Ehe Phe Ser Glu Lys Arg Pro Ala Leu GinPro

2180 21952210

CCT OGG GGA OGC CCC CAC CAG CTC AAA TTC OGA GIG CAG AAA AGA AAC OGGACC

Pro Arg Gly Arg Pro His Gin Leu Lys lhe Arg Vai Gin Lys Arg Asn ArgIhr (730)

2225 2235 2245 2255 2265 22752285

CCC CAG TGAGGOCIGC CAGGCCTCCC GGACCCCITG TTACTCAGGA ACCTCACCIT GGACGGAATG Pro Gin

2295 2305 2315 2325 2335 23452355

GGAIGGGGGC TTCQGIGOCC ÀCCAACCCCC CACCTCCACT CIGCCAITCC GGCCCACCTC CCTCIGGC0G

2365 2375 2385 2395 2405 24152425

GACAGAACIG GIGCICICIT CTOCCCACTG IGCCOGTCCG OGGACOGGGG ACCCITCCCC GIGOOCTACC

2435 2445 2455 2465 2475 24852495

CCCTOCCAIT TIGAIGGIGT CIGIGACAIT TCCIGTIGIG AAGIAAAAGA GGGACCCCIG CGTCCIGCCT

CIAGA

Este clone de CDNA pres^me-se conter toda a sequência necessária para codificar a proteína precursora completa porque ele codifica uma Met seguida por uma sequência iniciadora hidrófoba característica de uma proteína secretada e contém

um codão de paragem nas posições 2226-2228. Este clone con tém uma cadeia de leitura aberta de 2190 pares de bases que codificam uma proteína com 730 aminoácidos. Este clone con tám a sequência idêntica à região codificadora representada no Quadro V e deste modo é um cDNA para hBMP-1 que corre ponde a um fragmento de gene humano contido na sequência genÓmica de lambda IP-H1.

B. ^; Cl^ass^{e 1 e} Alasse II fragmento bBMP-2 genómico bovino Hind IlI-SacI descrito no exemplo IV B foi subclonado no vector M13. Uma sonda de DNA de cadeia simples marcada com P foi construída a partir de uma preparação de matriz deste subclone. Esta sonda foi utilizada para sondar RNAs poli-adenilados de várias cálulas e fontes de tecido como descrito antes na parte A. Uma banda de hibridação que corresponde a uma espécie de RNA de aproximadamente 3,8 quilo bases foi detectado na banda que continha RNA proveniente da linha de células humanas U-2 OS. 0 fragmento Hind III Saci foi marcado com P por corte translocado para sondar as réplicas do filtro de nitrocelulose da biblioteca de cDNA de U20S descrita antes por meio de hibridação em tampão de hibridação padrão à temperatura de 65°C durante a noite, seguida de lavagem com SSC ΙΣ, SDS 0,1% à temperatura de 65°C. Doze cio· • nes positivos çopiados foram colocados em placas secundá^l u í rias. As réplicas de nitrocelulose copiadas foram construi das a partir das placas secundárias e ambos os conjuntos hi dribizados com a sonda genómica bovina como executado para / U a primeira sondagem. Um conjunto de filtros foi em seguida lavado em SSC IX, SDS 0,1%; o outro com SSC 0,1 X, SDS

;.ÍV

0,1% à temperatura de 65°C.

for(7 re (0,1

As duas classes de clones de cDNA de hBMP-2

São fundamentadosobviamente em sinais de hibridação tes (4 récombinantes) ou sinais de hibridação fracos combinantes) sob condições de lavagem mais restritas

X SSC, 0-1% SDS). Todos os onze bacteriofagos recombinantes foram plaqueados para purificação, feitas as preparações de DNA em pequena escala a partir de cada lisado de placa, e as inserções subclonadas no pSP65 θ no K13 para análise da sequência. A análise da sequência dos clones de hibridaçio forte (classe I) indicou que tinham uma homologia de sequência extensa com a sequência representada no Quadro III. Estes clones são portanto cDNA que codifica a equivalente humana da proteína codificada pelo gene sequênciá parcial está representada no Quadro III. lise de sequência dos recombinantes de hibridação m?

ca (classe II) indica que também estes são completamente ho mõlogos com a sequência representada no Quadro III na ex

1' li cuja

A anáis fratremidade 3’ das suas regiões codificadoras, mas menos nas regiões 5*. Assim, elas codificam uma proteína humana de estrutura similar, julgada não idêntica, à estrutura refe£

-44rida antes.

.

Os clones de cDNA da classe I de hBMP-2 de com 1« primento total foram obtidos do seguinte modo. Uma inserção com 1,5 Kb de um dos subclones da classe II (II-10-1) foi isolado e marcado radioactivamente por translocação de corte. Ujti conjunto de réplicas de nitrocelulose da biblioteca de cDNA de U20S sondada antes (50 filtros que correspondem a 1,000.000 de bacteriofagos recombinantes) foram hibridizados com esta sonda sob condições restritas (hibridação à temperatura de 65°C em tampão de hibridação padrão. Lavagem à mesma temperatura, com SSC 0,2X, SDS a 0,1%). Todos os recombinantes que hibridizaram com a sonda genómica bovina e que não hibridizaram com a sonda da classe II foram recolhidos e purificados em placa (10 recombinantes). Prepararam-se placas de reserva e preparações de DNA de bacteriófagb em pequena escala. Após sublonagem em 1’13,-a análise de séquência indicou que quatro destas representavam clones que sobrepunham os clones de classe I originais. Uma destas lambda U20S-39, continha uma inserção de aproximadamente 1,5Kb e foi depositado na ATCC sob o numero de acesso 40345. A sequência de DNA parcial (compilada do lambda U20S-39 θ divérsas outras recombinantes de cDNA da classe I) e sequências de aminoácidos derivada mostram-se no Quadro VII .

-45?

Quadro VII

20 70 40 50 6070

GTOGACTCIA GAGIGIGIGT CAGCACITGG CTGGGGACIT CTIGAACTIG CAGGGAGAAT. AACTTGCGCA

90 100 110 120 130140

CCCCACITIG OGOOGGIGCC TTIGCCCCAG OGGAGCCIGC TTOGCCATCT COGAGCCCCA COGCCCCTCC

150 160 170 180 190 200210

ACICCTCGGC CITGCCOGAC ACIGAGAOGC TGITCOCAGC GIGAAAAGAG AGACIGOGCG GCOGGCACOC

220 230 240 250 260 270280

GGGAGAAGGA GGAGGCAAAG AAAAGGAAOG GACATTOGGT CCTIGOGCCA GGTCCITTGA CCAGAGTTTT

290 300 310 320 330 340350

TCCAICTGGA OGCICTITCA ATCGAQJIGT CCCOGOGIGC TTCTIAGACG GACIGOGGTC TCCTAAAGGT (1) 370 385400

OGACC AIG GTC GCC GGG ACC OGC TCT CIT CIA GOG TIG CIG CIT CCC CAG GTC

MET Vai Ala Gly Thr Arg Çys Leu Leu Ala Leu Leu Leu Pro Gin Vai

415 430445

CTC CIG GGC GGC GOG GCT GGC CTC GTT CCG GAG CIG GGC OGC AGG AAG TTC GOG

Leu Leu Gly Gly Ala Ala Gly Leu Vai Pro Glu Leu Gly Arg Arg Lys Phe Ala

460 475 490505

GOG GOG TOG TOG GGC OGC CCC TCA TOC CAG CCC TCT GAC GAG GTC CTG AGC GAG

Ala Ala Ser Ser Gly Arg Pro Ser Ser Gin Pro Ser Asp Glu Vai Leu Ser Glu

520 535 550'*565

TTC GAG TIG OGG CIG CTC AGC ATG TTC GGC CIG AAA CAG AGA CCC ACC CCCAGC

Rie Glu Leu Arg Leu Leu Ser MET lhe Gly Leu Lys Gin Arg Pro Thr ProSer

580 595610

AGG GAC GCC GTC GTC CCC CCC TAC ATC CIA GAC CIG TAT CGC AGG CAC TOGGGI

Arg Asp Ala Vai Vai Pro Pro Tyr MET Leu Asp Leu iyr Arg Arg His SerGly

625 640 655670

CAG COG GGC TCA CCC GCC OCA GAC CAC OGG TIG GAG AGG GCA GCC AGC OGAGCC

Gin Pro Gly Ser Pro Ala Pro Asp His Arg Leu Glu Arg Ala Ala Ser Arg Ala

685 700 715

AAC ACT GTC OGC AGC TTC CAC CAT GAA GAA TCT TIG GAA GAA CTA CCA GAA AOG

Asn Thr Vai Arg Ser Fhe His His Glu Glu Ser Leu Glu Glu Leu Pro Glu Thr

730

745

760

775

46AGT GGG AAA ACA ACC CGG AGA TTC TTC ΊΤΤ AAT ΊΤΑ AGT TCT ATC CCC AOG GAG

Ser Gly Lys Thr. Ihr Arg Arg Phe Phe Fhe Asn Leu Ser Ser Ile Pro Ihr Glu

790 805 820835

GAG ΊΊΤ ATC ACC TCA GCA GAG CTT CAG GTT TTC CGA GAA CAG ATG CAA GATGCT

Glu Phe Ile Ihr Ser Ala Glu Leu Gin Vai Fhe Arg Glu Gin MET Gin AspAla

850 865 880

TTA GGA AAC AAT AGC AGT TTC CAT CAC CGA ATT AAT ATT TAT GAA ATC ATA AAA

Leu

Gly

Asn

Ser

Fhe

His

Arg

Ile

Asn

Ile

Tyr

Glu

Ile

Lys

895

910

925

940

CCT

GCA

ACA

GCC

AAC

TCG

AAA

TTC

CCC

GIG

ACC

AGT

CTT

TTG

GAC

ACC

AGG

TTG

Pro

Ala

Ihr

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Pro

Vai

Ihr

Ser

Leu

Asp

Ihr

Arg

Leu

955

970

985

GIG

AAT

CAG

AAT

GCA

AGC

AGG

IGG

GAA

AGT

ΤΊΤ

GAT

GTC

ACC

CCC

GCT

GIG

ATG

Vai

Asn

Gin

Asn

Ala

Ser

Arg

Trp

G1U

Ser

Rie

Asp

Vai

Ihr

Pro

Ala

Vai

MET

1000 1015 10301045

OGG TGG ACT GCA CAG GGA CAC GCC AAC CAT C-GA TTC GIG GTG GAA GTG GCC CAC Arg Trp Thr Ala Gin Gly His Ala Asn His Gly Fhe Vai Vai Glu Vai Ala His

1060 1075 10901105

HG GAG GAG AAA CAA GGT GTC TCC AAG AGA CAT CTT AGG ATA AGC AGG TCTTTG

Leu Glu Glu Lys Gin Gly Vai Ser Lys Arg His Vai Arg Ile Ser Arg SerLeu

1120 11351150

CAC CAA GAT GAA CAC AGC TGG TCA CAG ATA AGG CCA TIG CTA GTA ACT TTTGGC

His Gin Asp Glu His Ser Trp Ser Gin Ile Arg Pro Leu Leu Vai Thr PheGly

1165 1180 11951210

CAT GAT GGA AAA GGG CAT CCT CTC CAC AAA AGA GAA AAA CGT CAA GCC AAA CAC His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg Gin Ala Lys His

1225 12401255

AAA CAG OGG AAA OGC CTT AAG TCC AGC TGT AAG AGA CAC CCT TIG TAC GTGGAC

Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Çys Lys Arg His Pro Leu Tyr VaiAsp

1270 1285 13001315

TTC AGT GAC GIG GGG IGG AAT GAC IGG ATT GIG GCT CCC CCG GGG TAT CACGCC

Fhe Ser Asp Vai Gly Trp Asn Asp Trp Ile Vai Ala Pro Pro Gly Tyr HisAla

1330 1345 13601375

ΊΤΤ TAC TGC CAC GGA GAA TGC CCT ΊΤΤ CCT CIG GCT GAT CAT CIG AAC TCC ACT

Fhe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Ihr

1390 1405 1420

AAT CAT GCC ΑΊΤ GTT CAG AOG TIG GTC AAC TCT GIT AAC TCT AAG ATT CCT AAG

Asn His Ala Ile Vai Gin Ihr leu Vai Asn Ser Vai Asn Ser Lys Ile Pro Lys

1435

1450

1465

1480

-4ΊGCÁ TGC TGT GTC COG ACA GAA CIC AGT GCT ATC TOG AIG CPG TAC CIT GAC GAG

Ala Cys Cys Vai Pro Ihr Glu Leu Ser Ala Ile Ser ΜΕΓ Leu Tyr Leu Asp Glu

1495 1510 1525

AAT GAA AAG GIT GTA TIA AAG AAC TAT CAG GAC ATG GIT GTG GAG GGT TGT GGG

Asn Glu Lys Vai Vai Leu Lys Asn Tyr Gin Asp MET Vai Vai Glu Gly Cys Gly

1540 (396) 1553 1563 1573 1583 1593 1603

TGT OGC TAGTACAGCA ΆΆΑΤΤΑΑΑΤΑ CATAAATATA TATATATATA TATAimAG AAAAAAGAAA Cys Arg

AAAA

γΊ η p Q γη p	Ύ*(.	-* ρ . ·? ρ	p f*	coi’te t?··?'''locado ? liibrídizadc p*⁵??. n·'
conjunto cl	β	v^r/1)7	.io?	,-Ί ο -p 4 4- Ύ0 pp 1 ·;Ο Πχμ <* π ?) η p- ρ ρ Ο ’ν* ρ V» 4 Ία7 ·*
t o ca de c ^p	Γ\’	LX	^TT—0	Λ Ο¹ ί Ρ· U’ Ρ ρ 7 4 -ι-ι,Λ C· ρ f\ ν· .-λ .- νΐ Ί V * ‘1 Α * /'. c> ρ ·ρ --

csa Qo? filtros
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-49de 50° em SSC IX, SDS 0,1%. Purificaram-se em placa 14 bacteriófagos recombinantes que hibridizavam com este oligonucleótido. Prepararam-se placas de reserva e reaiizaram-se preparações de DNA de bacteriófago em pequena escala. Apds Bubclonagem, de 3 destas em M13 a análise de sequência indicou que elas representavam clones que envolviam o clone de classe II original. Uma destas, U20S-3 continha uma inserção com 1,8 Kb aproximadamente e foi registada na ATCC com o número de acesso 40342 em 6 de Junho de 1987. A sequência de DNA parcial e a sequência de aminoácidos derivada de U20S-3 representa-se no Quadro VIII a seguir.

Quadro VIII

20 30 40 50 6070

CICTAGAGGG CAGAGGAGGA GGGAGGGÀGG GAAGGAGOGC GGAGCCCGGC COGGAAGCTA GGTGAGTGTG

90 100 110 120 130140

GCATCCGAGC TGAGGGACGC GAGCCIGAGA OGCOGCTGCT GCTCOGGCTG AGTATCIAGC TIGICTCCCC

150 160 170 180 190 200210

GATGGGAITC COGTCCAAGC TATCIOGAGC CTGCAGOGCC ACAGTCCCOG GCCCTOGCCC AGGTTCACTG

220 230 240 250 260 270280

CAACOGITCA GAGGTCCCCA GGAGCIGCIG CIGGOGAGCC OGCTACIGCA GC-GACCTATC GAGCCATICC

290 300 310 320 330 340350

GTAGTGCCAT CCCGAGCAAC GCACIGCTGC AGCITCCCIG AGCCTITCCA GCAAGTHGT TCAAGATTCG

360 370 380 390 400(1)

CIGTCAAGAA TCATGGACIG TTAITATATG CCTIUTITIC TGTCAAGACA CC ATG ΑΊΤ CCT MET Ile Pro

417 432 447462

GGT AAC CGA ATC CIG ATC GTC GTT TTA TTA TGC CAA GTC CTC CIA GGA GGC GCG

Gly Asn Arg MET Leu MET Val Val Leu Leu Cys Gin Val Leu Leu Gly Gly Ala

477 492 507

AGC

CAi

GCT

AGT

TTG

ATA

CCT

GAG

AOG

GGG

AAG

AAA

GTC

GCC

GAG

ATT

CAG

Ser

His

Ala

Ser

Leu

Ile

Pro

Glu

Ihr

Gly

Lys

Val

Ala

Glu

Ile

Gin

522

537

552

567

GGC

CAC

GOG

GGA

OGC

TCA

GGG

CAG

AGC

CAT

GAG

CTC

OGG

GAC

TTC

Gly

His

Ala

Gly

Arg

Ser

Gly

Gin

Ser

His

Glu

Leu

leu

Arg

Asp

Rie

582 597 612627

GAG GOG ACA CIT CTC CAG ATC TTT GGG CTG OGC CGC OGC COG CAG CCT AGCAAG

Glu Ala Ihr Leu Leu Gin MET Fhe Gly Leu Arg Arg Arg Pro Gin Pro Serlys

642 657672

AGT GCC GTC ATT COG GAC TAC ATG OGG GAT CIT TAC CGG CTT CAG TCT GGGGAG

Ser Ala Val Ile Pro Asp iyr MET Arg Asp Leu Tyr Arg Leu Gin Ser GlyGlu

687 702 717732

GAG GAG GAA GAG CAG ATC CAC AGC ACT GGT CIT GAG TAT CCT GAG CGC COGGCC

Glu Glu Glu Glu Gin Ile His Ser Ihr Gly Leu Glu Tyr Pro Glu Arg Pro Ala

747

762

777

AGC

OGG

GCC

AAC

ACC

GTC

AGG

AGC

TTC

CAC

GAA

CAT

CTG

GAG

AAC

ATC

Ser

Arg

Ala

Asn

Ihr

Vai

Arg

Ser

Phe

His

Glu

G1U

His

leu

Glu

Asn

Ile.

792

807

822

837

CCA

GGG

ACC

AGT

GAA

AAC

TCT

GCT

ΙΊΤ

OCT

TTC

CTC

ΊΤΤ

AAC

CTC

AGC

ATC

Pro

Gly

Thr

Ser

G1U

Asn

Ser

Ala

Fhe

Arg

Fhe

Leu

Fhe

Asn

Leu

Ser

Ile

852

867

882

897

CCT

GAG

AAC

GAG

GCG

ATC

TCC

TCT

GCA

GAG

CIT

OGG

CTC

TTC

OGG

GAG

CAG

GTC

Pro

Glu

.Asn

Glu

Ala

Ile

Ser

Ala

Glu

Leu

Arg

Leu

Fhe

Arg

Glu

Gin

Vai

912

927

942

GAC

CAG

GGC

CCT

GAT

TCG

GAA

AGG

GGC

TTC

CAC

OCT

ATA

AAC

ΑΊΤ

TAT

GAG

GIT

Asp

Gin

Gly

Pro

Asp

Trp

G1U

Arg

Gly

Fhe

His

Arg

Ile

Asn

Ile

Tyr

Glu

Vai

957

972

987

1002

•

ATC

AAG

CCC

CCA

GCA

GAA

GTC

CCT

GGG

CAC

CTC

ATC

ACA

OGA

CTA

CTG

GAC

MET

Lys

Pro

Ala

Glu

Vai

Pro

Gly

His

Leu

Ile

Thr

Arg

Leu

Asp

1017

1032

1047

AOG

AGA

CTG

GTC

CAC

AAT

GTC

ACA

OGG

TGG

GAA

ACT

ΤΤΓ

GAT

GTC

AGC

CCT

Thr

Arg

leu

Vai

His

Asn

Vai

Thr

Arg

Trp

Glu

Thr

Fhe

Asp

Vai

Ser

Pro

1062 1077 1092 1107

GCG GTC CIT OGC TGG ACC CGG GAG AAG CAG CCA AAC TAT GGG CTA GCC ΑΊΤ GAG

Ala Vai Leu Arg Trp Thr Arg Glu Lys Gin Pro Asn Tyr Gly Leu Ala Ile Glu

1122 1137 1152 1167

GTC ACT CAC CTC CAT CAG ACT OGG ACC CAC	CAG	GC-C	CAG	CAT	GTC	AGG	ΑΊΤ	AGC
Vai Thr His Leu His Gin Thr Arg Thr His	Gin	Gly	Gin	His	Vai	Arg	Ile	Ser
1182 1197				1212
OGA TOG ΊΤΑ CCT CAA GGG ACT GGG AAT TGG	GCC	CAG	CTC	OGG	CCC	CTC	CTG	GTC
Arg Ser Leu Pro Gin Gly Ser Gly Asn Trp	Ala	Gin	Leu	Arg	Pro	Leu	Leu	Vai
1227 1242	1257				1272
ACC ΊΊΤ GGC CAT GAT GGC OGG GGC CAT GCC	TTC	ACC	OGA	OGC	OGG	AGG	GCC	AAG
Thr Fhe Gly His Asp Gly Arg Gly His Ala	Leu	Ihr	Arg	Arg	Arg	Arg	Ala	Lys
1287 1302			1317
OGT AGC OCT AAG CAT CAC TCA CAG OGG GCC	AGG	AAG	AAG	AAT	AAG	AAC	TCC	OGG
Arg Ser Pro Lys His His Ser Gin Arg Ala	Arg	Lys	Lys	Asn	Lys	Asn	cys	Arg
1332 1347 1362				1377
OGC CAC TOG CTC TAT GTC GAC TTC AGC GAT	GTC	GGC	TCG	AAT	GAC	TCG	AIT	GTC
Arg His Ser Leu Tyr Vai Asp Fhe Ser Asp	Vai	Gly	Trp	Asn	Asp	Tlp	Ile	Vai
1392 1407		1422				1437
GCC CCA CCA GGC TAC CAG GCC TTC TAC TCC	CAT	GGG	GAC	TCC	CCC	ΊΤΤ	CCA	CTC
Ala Pro Pro Gly iyr Gin Ala Phe Tyr Cys	His	Gly	Asp	Cys	Pro	Fhe	Pro	Leu

-521452 14671482

GCT GAC CAC CTC AAC TCA ACC AAC CAT GCC ΑΊΤ GIG CAG ACC CIG GIG AAT TCT Ala Asp His Leu Asn Ser Ihr Asn His Ala Ile Vai Gin Ihr Leu Vai Asn Ser

1497 1512 15271542

GTC AAT TCC ACT ATC CCC AAA GCC TCT TCT GIG CCC ACT GAA CIG ACT GCCATC

Vai Asn Ser Ser Ile Pro Lys Ala Cys Cys Vai Pro Ihr Glu Leu Ser AlaIle

1557 15721587

TCC ATG CTG TAC CIG GAT GAG TAT GAT AAG GIG GTA CIG AAA AAT TAT CAGGAG

Ser ΜΕΓ Leu Tyr Leu Asp Glu Tyr Asp Lys Vai Vai Leu Lys Asn Tyr GinGlu

1602 1617 (394) 1636 1646 16561666

ATG GTA GTA GAG GGA TCT GGG TCC OGC TCAGATCAGG CAGICCTIGA GGATAGACAG ATAIACACAC ΗΕΓ Vai Vai Glu Gly Cys Gly Cys Arg

1676 1686 1696 1706 1716 17261736

CACACACACA CACCACATAC ACCACACACA CACCTTCCCA TCCACTCACC CACACACIAC ACAGACIGCT

1746 1756 1766 1776 1786 17961806

TCCITATAGC TGGACmTA ΤΠΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΆΑΆΑΑ AATCGAAAAA ATCCCIAAAC ATTCACCTIG

1816 1826 1836 1846 1856 18661876

ΑΟσίΤΑΤΠΆ TCACITIAOG TGCAAATGIT TIGACCATAT TCATCAIATA TITIGACAAA ΑΤΑΤΑΓΠΑΤ

1886 1896 1906 1916 1926 19361946

AACTAOCTAT TAAAAGAAAA AAATAAAATG ACTCATIAIT ΊΊΆΑΑΑΑΑΑΑ AAAAAAAACT CTAGAGTOGA

CGGAAITC

Esperava-se que este clone contivesse toda a sequência de nucleótidos necessária para codificar a proteína humana completa* Este cDNA continha uma cadeia de leitura aberta com 1224 pares de bases, que codificava uma proteína com

408 aminoácidos precedida nor uma região não traduzida 5’ ; ; * com 394 pares de bases e codões de paragem em todas as cadeias, contendo uma região não traduzida 3' com 308 pares de bases a seguir ao codão de paragem na cadeia.

As sequências de BPM-2 da classe I e da Classe

II, assim como BMP-3 representam-se nos Quadros III, IV, VII e VIII e possuem homologia significativa com subunidades beta (B) e beta (A) de inibinas. As inibinas são uma família de hormonas que presentemente estão sob investigação para serem utilizadas como contraceptivos. Vêr, A, J, Mason et al., Matvre, 318:659-663 (1985). Numa extensão menor elas também apresentam homologia com a substância inibidora Mulle riana (MJS), uma glicoproteína testicular que causa a regres são do cãnal Mulleriano durante o desenvolvimento do embrião macho e Que transforma o factor de crescimento beta (TGF-b) que pode inibir ou estimular o desenvolvimento de células ou causar a sua diferenciação. Além disso, a sequência do Quadro VII possui homologia significativa com a transcrição do sítio deeapentaplégico da Drosofila (DPP-C), Consultar, J, Massague* Cell, 49:437-438 (1987); R. W. Padgett et al, Nature, 325:81-84 (1987); R. I. Cate et al., Cell 45:685-698 (1986). Considera-se poesível portanto que BMP-2 da classe II é a homóloga humana da proteína construída a par-547 * ^Jtir desta transcrição deste sítio mutante relativo ao desen, - ' ' E ^; Wyg ·®1 vilvimento.

c. »-2. Porque se presume que os genes de factor de desenvolvimento ósseo humano e bovino possuem homologia significativa, utilizaram-se sondas oligonucleotídicas que mostraram hibridlzar com a sequência de DNA bovina do Quadro IV para sondar uma biblioteca genómica humana. Uma biblioteca genómica humana (Toole et al., Supra) foi sondada, utilizando-se estas Sondas e isolaram-se as presumivelmente positivas e obteve-se a sequência de DNA como referido antes. Obviamente que estas recombinantes codificam uma fracção da molécula do factor de indução óssea humano relacionado com a proteína bovina/humana e homologias de estrutura do gene.

Uma vez que se obteve o bacteriófago recombinante que continha DNA que codifica uma fracção da molécula de BMP-3 humana a sequência codificadora humana foi utilizada como uma sonda como se descreveu no exemplo V A, para identificar uma linha de células humana ou tecido que sintetiza BMP-3. Selecionou-se mRNA por meio de cromatografia oligo (dT) celulose e o cDNA foi sintetizado e clonado no lambda gtlO por meio de téènicas habituais. (Toole et al, Supra).

De um modo alternativo, o gene completo que codifica est® factor de indução óssea humano pode ser identi

-55ficado e obtido em mais clones recombinantes se necessári Recombinantes adicionais que continham ainda regiões 3’ o 5* deste gene do factor de indução óssea humano pode ser obtido por meio de identificação das sequências de DNA único, na extremidade (S) do clone original e utilizando-se esta como sonda para sondar de novo a biblioteca genómica humana. 0 gene pode então ser reagrupado num plasmídio único por meio de técnicas de biologia molecular padrão e ampliado em bactérias. 0 gene do factor de BMP-3 humano completo pode em seguida ser transferido para o vector de expressão apropriado. 0 vector de expressão que contém o gene é em seguida transfectado para uma célula de mamífero, por exemplo células COS de macaco, onde o gene humano é transcrito θ o RNA correctamente excisado. Meios provenieji tes das células transfectadas foram analisados para actividade de factor de indução óssea como descrito antes, com uma indicação de que o gene estava completo. 0 mRNA foi obti do destas oélulas e o cDNA sintetizado desta fonte de mRNA e' clonado. Este processo foi descrito para a clonagem e expressão da eritropoietina por Lin et al., Supra.

Os processos descritos antes podem ser utilizados de um modo semelhante para isolar outras espécies de factor de indução óssea de interesse mediante a utilização de factor de indução óssea bovino e/ou factor de indução óssea humano como uma fonte de sondas. Tais outras espécies de factor de indução óssea podem encontrar utilidade idêntica, inter alia, na reparação de fracturas.

-56EXEMPLO VI

Expressão de Pactores de Indução flssea

A fim de se nroduzir factores de indução óssea bovino, humano, o DNA que os codifica foi transferido para um vector de expressão apropriado e introduzido em célulag de mamífero por meio de técnicas de engenharia genética coji vencionais.

Um técnico nesta matéria pode construir vecto res de expressão de mamíferos utilizando as sequências dos Quadros desde II a VIII ou outras sequências modificadas e vectores conhecidos tais como, pCD et al., Mol

Cell. Biol., 2:161-170 (1982^] e pJI3, pJI4 [jlough et al., Embo J, 4:645*653 (1985ÍJ. & transformação destes vectores em células hospedeiras apropriadas pode resultar na expressão de factores osteoindutores. Um técnico nesta matéria poderá manipular as sequências representadas nos Quadros de II a VIII mediante eliminação ou substituição de sequências reguladoras de mamíferos que flanqueiam a sequência codificadora com sequências bacterianas para criar vectores bacterianos para expressão intra-celular ou extra-celular por células bacterianas. Por exemplo, as sequências b

codificadoras podem ser ainda manipuladas (por exemplo, ligadas a outros adaptadores conhecidos ou modificadas por meio de anulação de sequências não-codificadoras provenientes destas ou por alteração nucleotídica nestas por outras técnicas conhecidas). A sequência codificadora do factor

-57de indução óssea modificada pode em seguida ser inserida num vector bacteriano conhecido utilizando-se processos como os descritos em T. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 77:5230-5233 (1980).

Este vector bacteriano eaamplar pode em seguida ser transformado nas células hospedeiras bacterianas e o factor de indução óssea ser expresso deste modo gía para a produção

Para o estabelecimento de uma estratéde expressão extra-celular de factor de indução Óssea em células bacterianas, pode-se consultar por ex-emplo o pedido de patente de invenção Europeu EPA / /177.343.

Manipulações idênticas podem ser realizadas para a construção de um vector de insecto (vêr, por exemplo os processos descritos no pedido de patente de invenção Europeu publicado número 155.476) para a expressão em células de insectos. Um vector de levedura também pode ser construido utilizando-se sequências reguladoras de levedura para a expressão intra-celular ou extra-celular dos factores da presente invenção por células de levedura, (vêr, por exemplo os processos descritos no pedido de patente de invenção publicado PCT W086/00639 e no pedido de patente de invenção europeu EPA 123.289).

Um método nara a nrodução de níveis elevados de um factor osteoindutor da presente invenção a partir de cé lulas de mamíferos envolve a construção de células que contêm cópias múltiplas do gene do factor de indução óssea heterólogo. 0 gene heterólogo pode ser ligado a um marca-

dor ampliável, por exemplo, o gene de di-hidrofolato redutase (DHFR) para o qual as células que contém cópias do gene aumentadas podem ser seleccionadas para propagsção em concentrações crescentes de metotrexato (MTX) de acordo com os processos de Kaufman e Sharp, J. Mol. Biol. 159:601-629 (1982). lista via pode ser utilizada para um número de di-

<1* fegentes tipos de células.

Por exemplo, um plasmídio que contem o gene do factor de indução óssea bovino do Quadro II numa associação eficaz com outras sequências plasmídicas que permitem a sua expressão e o.plasmídio pAdA26 SV (A) 3 [kaufman e Sharp,

Mol. Cell, Biol. 2:1304 , de expressão de DHPR pode

ser co-introduzido em células CHO, DHFR-deficientes, DUKX-BII, por co-precipite.ção com fosfato de cálcio e transfecção· Transformantes que exprimem DHFR são seleccionados pa ra o desenvolvimento em meio alfa com soro de vitela fetal dializado e subsequentemente, escolhidos para ampliação por desenvolvimento em concentrações crescentes de MTX (fases sequenciais em 0,02, 0,2, 1,0 e 5μΜ de MTX) como descrito por Kaufman et al,, Mol. Cell. Biol. 5:1750 (1983). 0s tranjg, formantes são clonados e a expressão do factor de indução óssea activa biológicamente é controlada por o ensaio da formação de osso de rato. A expressão do factor de indução óssea pode aumentar com níveis crescentes de resistência a MTX, Processos idênticos podem ser seguidos para se produzir outros factores de indução óssea.

De um modo alternativo, o gene humano é expres. 1

59ο :.- · bo directamente como se descreveu antes. 0 factor de indução óssea activo pode ser produzido em bactérias ou em células de’leveduras. Contudo, o sistema de expressão prefe.rido presentemente para o factor de indução óssea humano recombinante activo do nonto de vista biológico consiste em

H:’·- íi “ células ÇHO transformadas de um modo estável.

: :

Um exemplo específico, para produzir o factor de indução Óssea humano (hBMP-1) do exemplo V consiste na inserção de U20S-1 que é libertado dos prolongamentos do vector por digestão com Sal I e subclonado num vector pMT2CX de expressão de mamífero digerido com Xho I. 0 vector de expressão de mamífero, pMT2 Cla-Xho (pMT^ CX) é um derivado do P91023 (b) (Wong et al., Science 928:810-815, 1985) que difere do último no facto de conter o gene de resistênr cia à ampicilina em vez do gene de resistência à tetraciclina e conter ainda um sítio Xho-I para a inserção de clones ' i de cDNA.

Elementos funcionais de pMT2 Cla-Xho foram descritos por (Kaufman, R. J., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 82: :689-693) e incluem os genes do adenovírus VA, a origem SV40 de replicação que inclui o reforçador com 72 pares de bases, o promotor mais afastado principal do adenovírus que inclui o sítio de união 5' e a maior parte da sequência iniciadora tripartida do adenovírus presente nos mRNAS do último adenovírus, um sítio aceitador da união 3', uma inserção de o sítio de poliadenilação SV40 e as sequências de pBR322 necessárias para a propagação no E. Coli.

plasmideo pMT2 Cla-Xho é obtido por digestão

com EcoSI de pMT2 -VWF, que foi depositado na American Type

Culture Collection (ATCC), Rockville, MD (USA) sob o número de aceeso de ATCC 67122. A digestão com EcoRI corta a insergBõ de cDNA presente em pMT2-VWF, produzindo pMT2 sob a forma linear que pode ser ligado e utilizado para transformar o E. Coli HB 101 ou DH-5 para resistência à ampicilina. 0 DNA plasmídico pMT2 pode ser preparado por métodos convencionais. 0 pMT2CX é então construído por digestão de pMT2 com Eco RV e Xbal, tratando o DNA digerido com o fragmento deKlenow de DNA polimerase I, e ligando-se adaptadores Cia (NEBiolabs, CATCGATG). Isto remove as bases de 2266 até 2421 partindo do sítio Hind III perto da origem de SV40 da replicação e das sequências reforçadoras de pMT2. 0 DNA plasmídico é em seguida digerido com EcoRI, cortado como se réferiu antes, e ligado a um adaptador EcoRI,

5’ po₄-aattcctcgagagct 3’

3’ GGAGCTCTCGA 5* digerido com Xhol, e ligado, gerando o pMT2 Cla-Xho, que em seguida pode ser utilizado para transformar o E. Coli para resistência à ampicilina.

DNA do plasmídio pMT2 Cla-Xho pode ser preparado por métodos convencionais, 0 DNA plasmídico deste subclone é transfectado para células COS por meio do processo de dextrano-HEAE. JSompayrac and Danna PNAS 78:7575-7578 (1981); Luthman and Magnusson, Nucl. Acids Res. 11:1295-1308 ( .

meio condicionado de 24 horas isento de soro foi recolhido a partir das células com início de 40 a 70 horas após transfectação.

EXEMPLO VII

• Actividade Biológica de Factor de Indução Óssea Expresso

A» W-l

A medida da actividade biológica do factor de indução óssea expresso (hBMP-1) obtido no exemplo VI antes foi parcialmente purificado numa coluna de sefarose heparina. Concentrou-se aproximadamente 10 vezes quatro ml do sobrenadante proveniente da transfecção de uma placa de 1100 mm, por meio de ultra-filtração numa membrana 10 TM e 6 m s β ida cli2tJLi2j3-c!.o c o n t x* a Tris 20 niLl cl θ cloreto de sódio com um pH de 7,4 (tampão de iniciação). Este material foi em seguida aplicado a uma coluna de sefaróse heparina de,1 ml em tampão de iniciação. Removeram-se as proteínas não ligadas por lavagem com 8 ml de tampto de Iniciação e as proteínas ligadas, que incluíam o BMP-1 foram em seguida desabsorvidas por lavagem com 3 a 4 ml de Tris 20 mM, cloreto de sódio 2,0 M, de PH 7,4.

As proteínas ligadas à coluna de heparina foram concentradas 10 vezes aproximadamente num centricon 10 e o sal reduzido por meio de diafiltração com ácido trifluoracético a 0,1%, Quantidades apropriadas desta solução foram misturadas com 20 mg de matriz de rato e em seguida ensaiadas in vivo para a formação de cartilagem e osso co-62-

se descreveu préviamente no Exemplo III, Poi utilizado mo como um controle a fraccionação de sobrenadante de transfecçflo.

Os implantes que continham matriz de rato a que foram adicionadas quantidades específicas de BMP-1 humano foram removidos dos ratos após sete dias e processados pa; ra a avaliação histológica. Secções representativas da implante foram coradas para a presença de mineral novo com corante de Von Kossa e fulsina ácida, e com . de toluidina para a deteção de formação de matrizes específicas de cartilagem presente. Foram avaliados os tipos de células presentes na secção assim como a extensão para a qual estas células representavam.o fenotipo.

A adição de BMP-1 humano ao material da matriz

·. J ti :

resultou na formação de nodúlos idênticos a cartilagem sete dias após tos forajc de caos se o azul

In jg- ·

»/// b j jii í _s. tacromática

-1 humano era dependente da quantidade da proteína de BMP-1 humana adicionada à matriz. No Quadro IX representa-se a relação de dose-resposta da proteína BMP-1 humana para a quantidade de indução observada.

§//. ^{: :}· i .. '.i-jí a implantação. As células do tipo condroblasreconhecidas pela forma e expressão da matriz me, A quantidade de actividade obsevada para BMP-

63QUADRO Π

SCORE j'

ft *

	(equivalente em ml de
η ί'ΐ-. »	meio de transfecção)
J 876-134-1	10 BMP-1	C + 2
[ 876-134-2	3 BMP-1	C+l
=' 876-134-3	1 BMP-1	C +/-
876-134-4 \|íF^! ' '	10 MOCK	C -
876-134-5	3 MOCK	C -
L 876-134-6	1 MOCK	C -

A actividade foi medida numa escala de O(-) até

Níveis idênticos da actividade foram observados nos estratos de células COS fraccionadas na sefarose hepariidêntico na. A purificação parcial foi realizada de um modo como o descrito antes, excepto no facto da ureia 6M cluida em todos os tampões

Quantidades terapêuticas de cada um dos de indução ossea da presente invenção, que incluem as suas factores £ variantes tal como se descreveu antes, podem ser utilizadas individualmente para a reparação de fracturas e outras con ; diçBes relacionadas com deficiências ósseas ou doenças periodontológicas. Além disso, cada um dos factores de indução j£. dssea da presente invenção pode ser utilizado em associação comum ou mais outros factores de indução óssea da presente invenção. Por exemplo, hBMP-1 pode ser utilizado em associa-

com qualquer hBMP-2 Classe I, Classe II, BMP-3 ou qual-

quêr coa destes. De um modo idêntico pode ser uti-

lizado hBKP-2 Classe I, hBMP-2, ou BMP-3 em qualquer associação de factores de indução óssea da presente invenção. Também podem ser co-administrados factores de indução Óêsea ou suas associações, da presente invenção, com outros factores osteoindutores ou outros agenies terapêuticos.

Os factores de indução óssea da presente invenção podem ser utilizados conjuntamente com uma variedade de biomateriais que proporcionem condições apropriadas do ponto de vista terapêutico para a indução do crescimento ósseo.

De preferência as composições do factor de induÇão de crescimento ósseo da presente invenção são utilizadas conjuntamente com uma matriz capaz de libertar a compof sição do factor no sítio da danificação óssea proporcionando uma estrutura, para o desenvolvimento do osso e da cartilagem. Ή preferível que a matriz seja capaz de ser reabsort, vida no organismo. Há presentemente muitos materiais diferentes qúê são utilizados para a substituição de tecidos |_Si moles ou duros. 0 tipo de material a utilizar dependerá de f vários factores e a escolha terá que estar de acordo com o conhecimento destes por parte dos técnicos nesta matéria.

A escolha do material é baseada por exemplo, na biocompatibilidade, biodegradação, propriedades mecânicas, aparência estética e propriedades de inter-fase. De um modo idêntico, a aplicação do factor osteoindutor defi nirá a comnosição apropriada.

Matrizes potenciais para o factor osteoindutor podem ser biodegradáveis e definidas quimicamente, tal como, mas não limitadas ao sulfato de cálcio, trifosfato de cálcio, hidroxiapatite, ácido polilático, polianidridos; biodegradáveis e biologicamente bem definidos tais como osso ou colagénio dérmico, proteínas puras ou componentes de matriz e^tra-celular; não biodegradáveis e quimicamente definidos tais como, hidroxi-apatite sinterízado, biovidro, aluminatps, ou outras cerâmicas, ou associações de qualquer dos tipos mencionados antes de material tais como, ácido polilático com hidroxi-apatite ou colagénio e trifosfato de cálcio. As biocerâmicas devem também ser alteradas na sua composição, tal como fosfato-aluminato de cálcio e processadas para alterar por exemplo a dimensão do poro, a dimensão da partícula, o formato da partícula e a biogradibilidade.

Como se descreveu antes, o regime de dose deve / ser determinado pelo médico assistente considerando vários factores que modificam a acção de um tal factor de crescimento. A quantidade de osso qtié é formado está dependente da quantidade e tipo de factor utilizado e do tipo de matriz da composição final. 0 regime de dose deve estar compreendido nos limites entre 10-10^ng por grama de osso que se deseja obter. A dose pode variar com o tipo de matriz utilizado na reconstituição e a composição de BMP's. A adição de outros factores conhecidos tais como, IGP 1 (factor I de crescimento idêntico a insulina), para a composição final podem também afectar a dose.

As descrições anteriores promenorizam aspectos presentemente preferidos desta invenção. Admite-se que numerosas modificações e variações ocorram na prática aos técnicos nesta matéria tendo em consideração aquelas descrições, Estas modificações e variações são consideradas abrangidas no âmbito das reivindicações apensas.

Claims

1.- Processo para a preparação de um factor osteoindutivo, substancialmente isento da presença de outras substâncias proteicas e compreendendo uma sequência peptídica igual ou substancialmente igual a uma sequência contínua escolhida no grupo de sequências que consiste em (a) desde o aminoãcido n? 1 até ao aminoâcido n? 37 como se representa a seguir:

QUADRO N9 2

280 290 (1) 308323

CCITGCCTCT TCTCTCTCCA GCT GCC TTC CIT GGG GAC ATC GCC CTG GAC GAG GAG

Ala Fhe Leu Gly Asp Ile Ala Leu Aso Glu Glu

338 353368

GAC TTG AGG GCC TTC CAA GTG CAG CAG GCT GOG GAC CTC AGA CAG CCT GCA ACC

Asp Leu Arg Ala Phe Gin Vai Gin Gin Ala Ala Asp Lsu Arg Gin Arg Ala Thr

383 398 (37) 414424

CGC AGG TCT TCC ATC AAA GCT GCA GCTACACTGG CTACAGGCCA

Arg Arg Ser Ser Ile Lys Ala Ala (bj desde o aminoácido numero 1 até ao aminoácido número

37 representados a seguir

QUADRO N9 5

3419 3429 3439 (1)3454

CAGCCCTGGC TICTTCTTTT CTCITTAGCT GCC ΤΊΤ CIT GGG GAC ATT GCC CIG GAC Ala Phe Leu Gly Asp Ile Ala Leu Asp

3469 3484 34993514

GAA GAG GAC CIG AGG GCC TTC CAG GTA CAG CAG C-CT GTG GAT CTC AGA CGGCAC

Glu Glu Asp Leu Arg Ala Phe Gin Vai Gin Gin Ala Vai Asp Leu Arg ArgHis

3529 3544 (37) 35603570

ACA GCT OCT AAG TCC TCC ATC AAA GCT GCA GCTAAGCCGG GTGCCAATGG

Thr Ala Arg Lys Ser Ser Ile Lys Ala Ala e

(c) desde o aminoácido número 1 atê ao aminoácido número

730 representados a seguir:

-69QUADRO N9 VI

10 20 30 (1) 50

CTAGAGGCCG CTTCCCTCGC OGCCGCCCOG CCAGC ATC CCC GGC GTC GCC CGC CTG COG MET Pro Gly Vai Ala Arg Leu Pro

65 80 95 110 CTG CTG CTC GGG CTG CTC CTG CTC COG OGT CCC GGC OGG CCG CTG GAC TTC GCC Leu Leu leu Gly Leu leu Leu leu Pro Arg Pro Gly Arg Pro Leu Asp leu Ala 125 140 155 GAC TAC ACC TAT GAC CTG GOG GAG GAG GAC GAC TCG GAG CCC CTC AAC TAC AAA Asp Tyr Thr Tyr Asp Leu Ala Glu G1U Asp Asp Ser Glu Pro Leu Asn iyr Lys 170 185 200 215 GAC CCC TCC AAG GOG GCT GCC TTT CTT GGG GAC ATT C-CC CTG GAC GAA GAG GAC Asp Pro Cys Lys Ala Ala Ala Phe Leu Gly Asp Ile Ala Leu Asp Glu Glu Asp 230 245 260 275 CTG AGG GCC TTC CAG GTA CAG CAG GCT GTC GAT CTC AGA OGG CAC ACA GCT CGT Leu Arg Ala Fhe Gin Vai Gin Gin Ala Vai Asp Leu Arg Arg His Thr Ala Arg 290 305 320 AAG TCC TCC ATC AAA GCT GCA GTT CCA GGA AAC ACT TCT ACC CCC AGC TCC CAG Lys Ser Ser Ile Lys Ala Ala Vai Pro Gly Asn Ihr Ser Thr Pro Ser Cys Gin 335 350 365 380 AGC ACC AAC GGG CAG CCT CAG AGG GGA GCC TCT GGG AGA TCG AGA GCT AGA TCC Ser Ihr Asn Gly Gin Pro Gin Arg Gly Ala cys Gly Arg Trp Arg Gly Arg Ser 395 410 425 OGT AGC OGG OGG GOG GCG ACG TCC OGA CCA GAG OGT GTC TCG CCC GAT GGG GTC Arg Ser Arg Arg Ala Ala Thr Ser Arg Pro Glu Arg Vai Trp Pro Asp Gly Vai 440 455 470 485 ATC CCC TTT GTC ATT GGG GGA AAC TTC ACT QÁjX AGC CAG AGG GCA GTC TTC OGG Ile Pro lhe Vai Ile Gly Gly Asn lhe Thr Gly Ser Gin Arg Ala Vai Fhe Arg 500 515 530 545 CAG GCC ATC AGG CAC TCG GAG AAG CAC ACC TCT GTC ACC TTC CTC GGG CGC ACT Gin Ala MET Arg His Itp Glu Lys His Thr cys Vai Ihr Phe Leu Glu Arg Thr 560 575 590 GAC GAG GAC AGC TAT ATT GTC TTC ACC TAT OGA CCT TCC GGG TCC TCC TCC TAC Asp Glu Asp Ser Tyr Ile Vai Phe Ihr Tyr Arg Pro Cys Gly Cys Cys Ser Tyr 605 620 635 650 GTC OGC CGC GGC GGG GGC CCC CAG C-CC ATC TCC ATC GGC AAG AAC TCT GAC Vai Gly Arg Arg Gly Gly Gly Pro C-ln Ala Ile Ser Ile C-ly Lys Asn Cys Asp

-70'

665 630 695

AAG TTC GGC ATT GTG CTC CAC GAG CTG GGC CAC GTC GTC GGC TIC TC-G CAC GAA Lys Phe Gly Ile Vai Vai His Glu Leu Gly His Vai Vai Gly Phe Trp His Glu 710 725 740 755 CAC ACT CGG CCA GAC CGG GAC CGC CAC GTT TCC ATC GTT CGT GAG AAC ATC CAG His Thr Arg Pro Asp Arg Asp Arg His Vai Ser Ile Vai Arg Glu Asn lie Gin 770 785 800 815 CCA GGG CAG GAG TAT AAC TTC CTG AAG ATG GAG CCT CAG GAG GTG GAG TCC CTG Pro Gly Gin Glu Tyr Asn Phe Leu Lys MET Glu Pro Gin Glu Vai Glu Ser Leu 830 845 860 GGG GAG ACC TAT GAC TTC GAC AGC ATC ATG CAT TAC GCT CGG AAC ACA TTC TCC Gly Glu Thr Tyr Asp lhe Asp Ser Ile ΜΕΓ His Tyr Ala Arg Asn Thr Phe Ser 875 890 905 920 AGG GGC ATC TTC CTG GAT ACC ATT GTC CCC AAG TAT. GAG GTG AAC GGG GTG AAA Arg Gly Ile Fhe Leu Asp Thr Ile Vai Pro Lys Tyr G1U Vai Asn Gly Vai Lys 935 950 965 CCT CCC ATT GGC CAA AGG ACA CGG CTC AGC AAG GAC ATT GCC CAA GCC CGC Pro Pro Ile Gly Gin Arg Thr Arg Leu Ser Lys Gly Asp Ile Ala Gin Ala Arg 930 995 1010 1025 AAG CTT TAC AAG TGC CCA GCC TCT GGA GAG ACC CTG CAA GAC AGC ACA GGC AAC Lys Leu Tyr Lys Cys Pro Ala Cys Gly Glu Thr Leu Gin Asp Ser Thr Gly Asn 1040 1055 1070 1085 TTC TCC TCC CCT GAA TAC CCC AAT GGC TAC TCT GCT CAC ATG CAC TGC GTG TGG Phe Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Asn Gly Tyr Ser Ala His ΜΕΓ His cys Vai Trp 1100 1115 1130 CGC ATC TCT GTC ACA CCC GGG GAG AAG ATC ATC CTG AAC TTC ACG TCC CTG GAC Arg Ile Ser Vai Thr Pro C-ly Glu Lys Ile Ile Leu Asn Phe Thr Ser leu·. Asp 1145 1 .160 1 .175 1 .190 CTG TAC OGC AGC OGC CTG TGC TGG TAC GAC TAT GTG GAG GTC CGA GAT GGC TTC Leu iyr Arg Ser Arg Leu Cys Trp Tyr Asp Tyr Vai Glu Vai Arg Asp Gly Fhe

1205 12201235

TGG AGG AAG GOG CCC CTC OGA GGC CGC TTC TGC GGG TCC AAA CTC CCT GAGCCT

Trp Arg Lys Ala Pro Leu Arg Gly Arg Phe Cys Gly Ser Lys Leu Pro GluPro

1250 1265 12301295

ATC CTC TCC ACT GAC AGC CGC CTC TGG GTT GAA TTC CGC AGC AGC AGC AATTGG

Ile Vai Ser Thr Asp Ser Arg Leu Trp Vai Glu Phe Arg Ser Ser Ser AsnTrp

1310 1325 13401355

GTT GGA AAG GGC TTC TTT GCA CTC TAC GAA GCC ATC TGC GGG GCT GAT GTGAAA

Vai Gly Lys Gly Fhe Ehe Ala Vai Tyr Glu Ala Ile Cys Gly Gly Asp VaiLys

-711400

1370

1385

AAA GTC TCC ATC TCG CGG ATC CAG GTC TCT GAG GGC TTC CAC GTC GGC CTC ACA Lys Vai Cys Ile Trp Arg Ile Gin Vai Ser Glu Gly Phe His Vai Gly Leu Thr 1475 1490 1505 TTC CAG TCC ΤΓΤ GAG ATT GAG CGC CAC GAC AGC TGT GCC TAC GAC TAT CTG GAG Phe Gin Ser Fhe Glu Ile Glu Arg His Asp Ser Cys Ala iyr Asp Tyr Leu Glu 1520 1535 1550 1565 GTC CGC GAC GGG CAC AGT GAG AGC AGC ACC CTC ATC GGG CGC TAC TCT GGC TAT Vai Arg Asp Gly His Ser G1U Ser Ser Thr leu Ile Gly Arg Tyr Cys Gly Tyr 1530 1595 1610 1625 GAG ·* r· CCT GAC ATC AAG AGC ACG TCC * CC-C CTC TCG CTC AAG TTC CTC Glu Lys Pro Asp Asp Ile Lys Ser Thr Ser Ser Arg Leu Trp Leu Lys Phe Vai 1640 1655 1670 TCT GAC TCC ATT AAC AAA GCG C-GC TTT GCC CTC AAC ΊΤΤ TTC AAA GAG GTC Ser Asp Gly Ser Ile Asn Lys Ala Gly Phe Ala Vai Asn Phe Phe Lys Glu Vai 1685 1700 '1715 1730 GAC GAG TCC TCT CGG CCC AAC OGC GGG GGC TCT QàALs CAG OGG TCC CTC AAC ACC Asp Glu Cys Ser Arg Pro Asn Arg Gly Gly Cys Glu Gin Arg cys Leu Asn Thr 1745 1760 1775 CTG C-GC AGC TAC AAG TCC AGC TCT GAC CCC GGG TAC GAG CTG GCC CCA GAC AAG Leu Gly Ser Tyr Lys Cys Ser Cys Asp Pro Gly Tyr G1U Leu Ala Pro Asp Lys 1790 1805 1820 1835 OGC OGC TCT GAG GCT GCT TCT GGC GGA TTC CTC ACC AAG CTC AAC GGC TCC ATC Arg Arg Cys Glu Ala Ala cys Gly Gly Fhe Leu Ihr Lys Leu Asn Gly Ser Ile 1850 1365 1830 1895 ACC AGC CCG GGC TCG CCC AAG GAG TAC CCC CCC AAC AAG AAC TCC ATC TCG CAG Thr Ser Pro Gly Trp Pro Lys Glu Tyr Pro Pro Asn Lys Asn Cys Ile Trp Gin 1910 1925 1940 CTG GTC GCC CCC ACC CAG TAC ATC TCC CTC CAG ΊΤΤ GAC TTC ΤΊΤ ACA Leu Vai Ala Pro Ihr Gin Tyr Arg Ile Ser Leu Gin Phe Asp Phe Phe Glu Thr

-722060 2075 20902105

ACC TCC CAG TAC AAC AAC AIG CGC GTG GAG TTC AAG TCC GAC AAC ACC GTG TCC Thr Ser Gin Tyr Asn Asn MET Arg Vai Glu Phe Lys Ser Asp Asn Thr Vai Ser

2120 2135' 21502165

AAA AAG GGC TTC AAG GCC CAC TTC TTC TCA GAA AAG AGG CCA GCT CTG CAGCCC

Lys Lys Gly Phe Lys Ala His Phe Phe Ser Glu Lys Arg Pro Ala Leu GinPro

2180 21952210

CCT CGG GGA CGC CCC CAC CAG CTC AAA TTC OGA GTG CAG AAA AGA AAC CGGACC

Pro Arg Gly Arg Pro His Gin Leu Lys Phe Arg Vai Gin Lys Arg Asn ArgThr (730)

2225 2235 2245 2255 2265 22752285

CCC CAG TGAGGCCIGC CAGGCCTCCC GGACCCCITG TTACTCAGGA ACCTCACCIT C-GAOGGAATG Pro Gin

2295 2305 2315 2325 2335 23452355

GGAIGGGGGC TTCGGTGCCC ACCAACCCCC CACCTCCACT CIGCCATTCC GGCCCACCTC CCICTGGCOG

2365 2375 2385 2395 2405 24152425

GACAGAACIG GTGCICICIT CTCCCCACTG TGCCCGTCCG CGGACOGGGG ACCCTTCCCC GTGCCCTACC

2435 2445 2455 2465 2475 24852495

CCCTCCCAIT TIGAIGGTGT CIGIGACATT TCCTGTIGIG AAGTAAAAGA GGGACCCCTG OGTCCIGCCT

CTAGA caracterizado pelo facto de se cultivar uma linha de células trans formadas com uma sequência de DNA que codifica uma proteína capaz de exibir características biológicas e bioquímicas de factor indutivo de osso, de conter uma sequência peptídica igual ou substan cialmente igual a uma sequência contínua de uma sequência de amino ácidos e de se escolher de entre um grupo formado pelas sequências seguintes:

(a) desde o aminoãcido numero 1 atê ao aminoácido numero

37 representados a seguir:

-73s /

QUADRO 5

3419 3429 3439 (1)3454

CAGCCCTGGC ΊΊϋΓΓΟΓΠΤ CTCnTAGOT GCC ΊΤΤ CTT GGG GAC ATT GCC CTG GAC Ala Phe Leu Gly Asp Ile Ala Leu Asp

3469 3484 34993514

GAA GAG GAC CTG AGG GCC TTC CAG GIA CAG CAG GCT GIG GAT CTC AGA OGGCAC

Glu Glu Asp Leu Arg Ala Phe Gin Vai Gin Gin Ala Vai Asp Leu Arg ArgHis

3529 3544 (37) 35603570

ACA GCT CGT AAG TCC TCC ATC AAA GCT GCA GGTAAGCOGG GIGCCAATGG

Ihr Ala Arg Lys Ser Ser Ile Lys Ala Ala (b) desde o aminoãcido numero 1 até ao aminoâcido numero

730 representados a seguir:

»

Qua. 6

QUADRO N9 6

10 20 30 (1) 50

CTAGAGGCOG CITCCCTOGC OGCCGCCCOG CCAGC ATC CCC GGC GTC GCC OGC CTC COG MET Pro Gly Vai Ala Arg Leu Pro

65 80 95 110 CTC CIG CTC GGG CTC CTG CIG CTC CCG OGT CCC GGC OGG COG CTC GAC TTG GCC Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Pro Arg Pro Gly Arg Pro Leu Asp Leu Ala 125 140 155 GAC TAC ACC TAT GAC CIG GOG GAG GAG GAC GAC TOS GAG CCC CTC AAC TAC AAA Asp iyr Thr Tyr Asp Leu Ala Glu Glu Asp Asp Ser Glu Pro Leu Asn Tyr Lys 170 185 200 215 GAC ccc TCC AAG GOG GCT GCC ΤΓΓ CIT GGG GAC ATT GCC CTG GAC GAA GAG GAC Asp Pro Cys Lys Ala Ala Ala Phe Leu Gly Asp Ile Ala Leu Asp G1U Glu Asp 230 245 260 275 CTC AGG GCC TTC CAG GTA CAG CAG GCT GTC GAT CTC AGÀ OGG CAC ACA GCT OGT Leu Arg Ala Phe Gin Vai Gin Gin Ala Vai Asp Leu Arg Arg His Thr Ala Arg 290 305 320 AAG στγ* TCC ATC AAA GCT GCA GIT CCA GGA AAC ACT TCT ACC CCC AGC TCC CAG Lys Ser Ser Ile Lys Ala Ala Vai Pro Gly Asn Thr Ser Thr Pro Ser cys Gin 335 350 365 380 AGC ACC AAC GGG CAG CCT CAG AGG GGA GCC TCT AGA TCG AGA GGT AGA TCC Ser Thr Asn Gly Gin Pro Gin Arg Gly Ala cys Gly Arg Trp Arg Gly Arg Ser 395 410 425 OGT AGC cgg CGG GOG GOG AOG TCC OGA CCA GAG OGT GTC TGG CCC GAT GGG GTC Arg Ser Arg Arg Ala Ala Thr Ser Arg Pro Glu Arg Vai Trp Pro Asp Gly Vai 440 455 470 485 ATC CCC ΤΤΓ GTC ATT GGG GGA AAC TTC ACT GGT AGC CAG AGG GCA GTC TTC CGG Ile Pro Rie Vai Ile Gly Gly Asn Phe Thr Gly Ser Gin Arg Ala Vai Phe Arg 500 515 530 545 CAG GCC ATC AGG CAC TCG GAG AAG CAC ACC TGT GTC ACC TTC CTC GAG OGC ACT Gin Ala MET Arg His Trp Glu Lys His Thr Cys Vai Thr Phe Leu Glu Arg Thr

560 575 590

GAC GAG AGC ΊΑΤ ATT GTC TTC ACC TAT CGA CCT TCC GGG TCC TCC TCC TAC Asp Glu Asp Ser Tyr Ile Vai Phe Thr Tyr Arg Pro cys Gly Cys Ser Tyr 605 620 635 650 GTC GGT OGC OGC GGC GGG GGC CCC CAG GCC ATC TCC ATC GGC AAG AAC TCT GAC Vai Gly Arg Arg Gly Gly Gly Pro Gin Ala Ile Ser Ile C-ly Lys Asn Cys Asp

665 680695

AAG TTC GGC ATT GTC GTC CAC GAG CTC GGC CAC GTC GTC GGC TTC TCG CACGAA

Lys lhe Gly Ile Vai Vai His Glu Leu Gly His Vai Vai Gly lhe Trp HisGlu

710 725 740755

CAC ACT OGG CCA GAC CGG GAC CGC CAC GIT TCC ATC GIT CGT GAG AAC ATCCAG

His Thr Arg Pro Asp Arg Asp Arg His Vai Ser Ile Vai Arg Glu Asn IleGin

770 785 800815

CCA GGG CAG GAG TAT AAC TTC CIG AAG ATC GAG CCT CAG GAG GTC GAG TCCCIG

Pro Gly Gin Glu Tyr Asn lhe Leu Lys MET Glu Pro Gin Glu Vai Glu Serleu

830 845860

GGG GAG ACC TAT GAC TTC GAC AGC ATC ATC CAT TAC GCT OGG AAC ACA TTCTCC

Gly Glu Ihr Tyr Asp lhe Asp Ser Ile MET His Tyr Ala Arg Asn Thr lheSer

875 890 905920

AGC- C-GC ATC TTC CTC GAT ACC ATT GTC CCC AAG TAT GAG GTG AAC GGG GTGAAA

Arg Gly Ile Fhe Leu Asp Thr Ile Vai Pro Lys Tyr Glu Vai Asn Gly VaiLys

935 950965

CCT CCC ATT GGC CAA AGG ACA CGG CTC AC-C AAG GGG GAC ATT GCC CAA GCCCGC

Pro Pro Ile Gly Gin Arg Thr Arg Leu Ser Lys Gly Asp Ile Ala Gin AlaArg

980 995 10101025

AAG CIT TAC AAG TCC CCA GCC TCT GGA GAG ACC CTG CAA GAC AGC ACA GGCAAC

Lys Leu Tyr Lys Cys Pro Ala Cys Gly Glu Thr Leu Gin Asp Ser Thr GlyAsn

1040 1055 10701085

TTC TCC TCC CCT GAA TAC CCC AAT GGC TAC TCT GCT CAC ATC CAC TGC GTCTGG

Fhe Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Asn Gly Tyr Ser Ala His MET His Cys VaiTrp

1100 11151130

OGCATCTCTGTCACACCCGGGGAGAAGATCATCCTC AAC TTC ACG TCC CTC GAC Arg Ile Ser Vai Thr Pro Gly Glu Lys Ile Ile Leu Asn Phe Thr Ser Leu Asp

1145 1160 11751190

CIG TAC CGC AGC CGC CIG TGC TGG TAC GAC TAT GTC GAG GTC CGA GAT GGCTTC

Leu iyr Arg Ser Arg Leu cys Trp Tyr Asp Tyr Vai Glu Vai Arg Asp GlyPhe

1205 12201235

TCG AGG AAG GCG CCC CTC CGA GGC CGC TTC TCC GGG TCC AAA CTC CCT GAGCCT

Trp Arg Lys Ala Pro Leu Arg Gly Arg Phe Cys Gly Ser Lys Leu Pro GluPro

1250 1265 12801295

ATC GTC TCC ACT GAC AGC CGC CTC TGG GIT GAA TTC OGC AGC AGC AGC AAT TGG

Ile Vai Ser Thr Asp Ser Arg Leu Trp Vai Glu Phe Arg Ser Ser Ser Asn Ίϊρ

1310 1325 13401355

GTT GGA AAG GGC TTC TTT GCA GTC TAC GAA GCC ATC TGC GGG GGT GAT GTC AAA

Vai Gly Lys Gly lhe Phe Ala Vai Tyr Glu Ala Ile Cys Gly Gly Asp Vai Lys / -76.

ι·1370 1385 1400

AAG GAC TAT GGC CAC AIT CAA TCG CCC AAC TAC CCA GAC GAT TAC OGG CCC AGC

Lys Asp Tyr Gly His Ile Gin Ser Pro Asn Tyr Pro Asp Asp iyr Arg Pro Ser 1415 1430 1445 1460 AAA GTC TCC ATC TGG CGG ATC CAG GTC TCT GAG GGC TTC CAC GTC GGC CTC ACA Lys Val Cys Ile Ίϊρ Arg Ile Gin Val Ser Glu Gly lhe His Val Gly Leu Thr 1475 1490 1505 TTC CAG TCC TTT GAG AIT GAG OGC CAC GAC AGC TCT GCC TAC GAC TAT CTC GAG Phe Gin Ser Phe G1U Ile Glu Arg His Asp Ser çys Ala Tyr Asp iyr Leu Glu 1520 1535 1550 1565

GTC CGC GAC GGG CAC AGT GAG AGC AGC ACC CTC ATC GGG OGC TAC TCT GGC TAT Val Arg Asp Gly His Ser Glu Ser Ser Thr Leu Ile Gly Arg iyr Çys Gly Tyr 1580 1595 1610 1625 /* CTC GAT r> ATC AAG AGC AOG TCC OGC CTC TGG CTC AAG TTC GTC Glu Lys Pro Asp Asp Ile Lys Ser Thr Ser Ser Arg Leu Trp Leu Lys Rie Val 1640 1655 1670 TCT GAC GGG TCC AIT AAC AAA GCG C-GC ΠΊ 1 A 11 C-CC CTC AAC TTT TTC AAA λ*·* r* Ul-xvj GTC Ser Asp Gly Ser Ile Asn Lys Ala Gly Phe Ala Val Asn Phe Phe Lys Glu Val 1685 1700 1715 1730 GAC GAG TCC TCT CGG CCC AAC CGC GGG GGC TCT GAG CAG CGG TCC CTC AAC AOC Asp Glu cys Ser Arg Pro Asn Arg Gly Gly Çys Glu Gin Arg Çys Leu Asn Thr 1745 1760 1775 CTC GGC AGC TAC AAG TCC AGC TCT GAC CCC GGG TAC GAG CTC GCC CCA GAC AAG Leu Gly Ser Tyr Lys Çys Ser Çys Asp Pro Gly Tyr Glu Leu Ala Pro Asp Lys

1790 1805 1820 1835

OGC OGC TCT GAG GCT GCT TCT GGC GGA TTC CTC ACC AAG CTC AAC GGC TCC ATC Arg Arg Çys Glu Ala Ala Çys Gly Gly Phe Leu Thr Lys Leu Asn Gly Ser Ile 1850 1865 1880 1895 ACC AGC COG GGC TGG CCC AAG GAG TAC CCC CCC AAC AAG AAC TCC ATC TCG CAG Thr Ser Pro Gly Itp Pro Lys Glu iyr Pro Pro Asn Lys Asn Cys Ile Trp Gin 1910 1925 1940 CTC GTC GCC CCC ACC CAG TAC CGC ATC TCC CTC CAG TTT GAC TTC TTT GAG ACA leu Val Ala Pro Thr Gin Tyr Arg Ile Ser Leu Gin Fhe Asp Phe Phe G1U Thr 1955 1970 1985 2000 GGC ΛΛ1 GAT GTC TCC AAG TAC GAC TTC GTC r*·* GTC CGC ACT GGA CTC ACA Glu Gly Asn Asp Val Cys Lys Tyr Asp Phe Val G1U Val Arg Ser Gly Leu Ihr 2015 !030 2045 GCT GAC TCC AAG CTC CAT GGC AAG TTC TCT GCT TCT GAG AAG CCC GAG CTC ATC Ala Asp Ser Lys Leu His Gly Lys Fhe Cys Gly Ser Glu Lys Pro Glu Val Ile

-772060 2075 20902105

ACC TCC CAG TAC AAC AAC ATG OGC GTG GAG TTC AAG TCC GAC AAC ACC GIG' TCC

Hir Ser Gin iyr Asn Asn MET Arg Vai Glu Fhe Lys Ser Asp Asn Thr Vai Ser

2120 2135 21502165

AAA AAG GGC TTC AAG GCC CAC TTC TTC TCA GAA AAG AGG CCA GCT CIG CAG CCC

Lys Lys Gly Phe Lys Ala His Rie Phe Ser Glu Lys Arg Pro Ala Leu Gin Pro

2180 21952210

CCT CGG GGA CGC CCC CAC CAG CTC AAA TTC OGA GIG CAG AAA AGA AAC OGG ACC

Pro Arg Gly Arg Pro His Gin Leu Lys Phe Arg Vai Gin Lys Arg Asn Arg Ihr (730)

2225 2235 2245 2255 2265 22752285

CCC CAG TGAGGCCIGC CAGGCCICCC GGACCCCHG TIACTCAGGA ACCTCACCIT GGAOGGAATG

Pro Gin

2295 2305 2315

GGATGGGGGC TTCGGIGCCC ACCAACCCCC

2325 2335 23452355

CACCTCCACT CIGCCAITCC GGCCCACCTC CCIGIGGCOG

2365 2375 2385

GACAGAACIG GIGC7CTCTT CTCCCCAC2G

2395

2405 2415

2425

TGCCCGCCCG CGGACCGGGG ACCCTTCCCC

2435 2445 2455 2465 2475 2485 2495

CCCTCCCAIT TIGATGGTGT CIGIGACATT TCCIGTIGIG AAGTAAAAGA GGGACCCCIG CGTCCTGCCT »

CIAGA (c) desde o aminoãcido número 1 até ao aminoãcido número

396 representados a seguir

Quad.7

QUADRO 7 10 20 Xo 40 50 60 70 GTCGACICLrt. GAGTGTGIGT CAGCACTTCG CTCGGGACTT CTTCAACTTG CAGGGAGAAT AACTTGCGCA

90 100 110

120 130

140

CCCCACTTTC OGCCGGTCCC TITCCCCCAG CGGAGCCTCC TTOGCCATCT CCGAGCCCCA CCGCCCCTCC

150

ACTCCTCGGC

160 170

CCTGCCCGAC ACIGAGAOGC

180

TCTTCCCAGC

190 200

GTGAAAAGAG AGACIGCGCG

210

GCOGGCACCC

220

230 240

250

260 270

280

GC-GAGAAGGA GGAGGCAAAG AAAAGGAACG

GACATTCGGT

CCTIGCGCCA GGTCCTTTGA CCAGAGTTTT

290

300 310

320

330 340

350

TCCATCTCGA CGCTCTTTCA ATCGACGIGT CCCCGCGIGC TTCTTAGACG GACTC-OGGTC TCCTAAAGGT (1) 370 385400

OGACC ATG GTC GCC GGG ACC CGC TCT CIT CIA GCG TTC CTC CTT CCC CAGGTC

MET Vai Ala Gly Thr Arg Cys Leu Leu Ala Leu Leu Leu Pro GinVai

415 430445

CTC CTC GGC GGC GCG GCT GGC CTC GTT CCG GAG CTC GGC CGC AGG AAG TTC GOG Leu Leu Gly Gly Ala Ala Gly Leu Vai Pro Glu Leu Gly Arg Arg Lys Phe Ala

460 475 490 505 GCG GCG TCG TOG GGC OGC CCC TCA TCC CAG CCC TCT GAC GAG GTC CIG AGC GAG Ala Ala Ser Ser Gly Arg Pro Ser Ser Gin Pro Ser Asp Glu Vai Leu Ser Glu 520 535 550 •565 TTC GAG TTG CGG CIG CTC AGC ATC TTC GGC CTC AAA CAG AGA CCC ACC CCC AGC Phe Glu Leu Arg Leu Leu Ser MET Phe Gly Leu Lys Gin Arg Pro Thr Pro Ser 580 595 610 AGG GAC GCC GTC GTC CCC CCC TAC ATC CTA GAC CTC TAT CGC AGG CAC TCG GGT Arg Asp Ala Vai Vai Pro Pro Tyr MET Leu Asp Leu Tyr Arg Arg His Ser Gly 625 640 655 670 CAG CCG GGC TCA CCC GCC CCA GAC CGG TTG GAG AGG GCA GCC AGC CGA GCC Gin Pro Gly Ser Pro Ala Pro Asp His Arg Leu Glu Arg Ala Ala Ser Arg Ala 6S5 700 715 AAC ACT GTG CGC AGC TTC CAC CAT GAA GAA TCT TTG GAA GAA CTA CCA GAA AOG Asn Ihr Vai Arg Ser Phe His His Glu Glu Ser Leu Glu Glu Leu Pro Glu Thr

730

745

760

775 /

AGT GGG AAA ACA ACC CGG AGA TTC TTC TTT AAT TTA AGT TCT ATC CCC ACG GAG Ser Gly Lys Thr Thr Arg Arg Phe Phe Phe Asn Leu Ser Ser Ile Pro Thr Glu 790 805 820 835 GAG TTT ATC ACC TCA GCA GAG CIT CAG GTT TTC CGA GAA CAG ATG CAA GAT GCT Glu The Ile Thr Ser Ala Glu Leu Gin Vai The Arg G1U Gin MET C-ln Asp Ala

S50 8658S0

TTA GGA AAC AAT AGC AGT TTC CAT CAC CGA ATT AAT ATT TAT GAA ATC ATAAAA

Leu Gly Asn Asn Ser Ser Phe His His Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Ile IleLys

895 910 925940

CCT C-CA ACA GCC AAC TCG AAA TTC CCC GTG ACC AGT CTT TTG GAC ACC AGGTTG

Pro Ala Thr Ala Asn Ser Lys Phe Pro Vai Thr Ser Leu Leu Asp Thr ArgLeu

955 970985

GTG AAT CAG AAT GCA AGC AGG TGG GAA AGT TTT GAT GTC ACC CCC GCT GTC-ATG

Vai Asn Gin Asn Ala Ser Arg Trp C-lu Ser Phe Asp Vai Thr Pro Ala VaiΜΞΤ

1000 1015 10301045

OGG TGG ACT GCA CAG GGA CAC GCC AAC CAT GGA TTC GTG GTG GAA GTG GCCCAC

Arg Trp Thr Ala Gin Gly His Ala Asn His Gly Phe Vai Vai Glu Vai AlaHis

1060 1075 1090 1105

TIG GAG GAG AAA CAA GGT GTC TCC AAG AGA CAT GIT AGG ATA AGC AGG TCT TTG Leu G1U G1U Lys Gin Gly Vai Ser Lys Arg His Vai Arg Ile Ser Arg Ser Leu 1120 1135 1150 CAC CAA GAT GAA CAC AGC TGG TCA CAG ATA AGG CCA TTG CTA GTA ACT TTT GGC His Gin Asp Glu His Ser Trp Ser Gin Ile Arg Pro leu Leu Vai Ihr Phe Gly 1165 1180 1195 1210 CAT GAT GGA AAA GGG CAT CCT CTC CAC AAA AGA GAA AAA OGT CAA GCC AAA CAC His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg Gin Ala Lys His 1225 1240 1255 AAA CAG OGG AAA CGC CIT AAG TCC AGC TGT AAG AGA CAC rvvn TTG TAC GTG GAC Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu iyr Vai Asp 1270 1285 1300 1315 TTC AGT GAC GTG GGG TGG AAT GAC TGG ATT GTG GCT CCC COG GGG TAT CAC GCC Phe Ser Asp Vai Gly Trp Asn Asp Trp Ile Vai Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala 1330 1345 1360 1375 TTT TAC TGC CAC GGA GAA TGC CCT Γ!ΊΤ1 Ή XÁ* CCT CTG C-CT GAT CAT CTG AAC TCC ACT Phe Tyr Cys His Gly G1U Cys Pro Phe Pro leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr 1390 1405 1420 AAT CAT GCC ATT GIT CAG AOG TTG GTC AAC TCT GTT AAC TCT AAG ATT CCT AAG Asn His Ala Ile Vai Gin Thr Leu Vai Asn Ser Vai Asn Ser Lys Ile Pro Lys

1435

1450

1465

1480

GCATCCTCTGTCCOGACAGAACTCAGTGCrATCTOGATCCIGTACCTTGACGAG

Ala Çys Cys Vai Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser MET Leu Tyr Leu Asp Glu

1495 1510 1525

AAT GAA AAG GTT CTA TTA AAG AAC TAT CAG GAC ATC GTT GTC GAG GGT TCT GGG Asn Glu Lys Vai Vai Leu Lys Asn Tyr Gin Asp ΜΞΤ Vai Vai Glu Gly Cys Gly

1540(396) 1553 1563 1573 15S3 1593 1603

TCT CGC TAGTACAGCA AAATIAAATA CATAAATATA TATATATATA TATATITTAG AAAAAAGAAA cys Arg

AAAA

I

-81(d) desde o aminoácido número 1 até ao aminoácido número 408 representados a seguir;

Qua. 8

QUADRO 8

10 20 30 40 50 6070

CTCTAGAGGG CAGAGGAC-GA GGGAGGGÂGG GAAGGAGCGC GGAGCCOGGC CCGGAAGCIA GGTCAGTCTC

80 90 100 110 120 130140

GCATCOGAGC TGAGGGAOGC GAGCCTCAGA CGCCGCTCCT GCTCCGGCTC AGTATCIAGC TTCTCTCCCC »

150 160 170 180 190 200210

GATCGGATTC CCGTCCAAGC TATCTOGAGC CTCCAGCGCC ACAGTCCCCG GCCCTCGCCC AGGTCCACTC

220 230 240 250 260 2702S0

CAACCGTCCA GAGGTCCCCA GGAGCTCCIG CIGGCGAGCC OGCTACTCCA GGGACCIATC GAGCCATCOC

290 300 310 320 330 340350

GTAGTCCCAT CCCGAGCAAC GCACTCCTCC AGCTCCCCTC AGCCTTCCCA GCAAGTTTCT TCAAGATTCG

360 370 380 390 400(1)

CTCTCAAGAA TCATCGACTC TCATCAIATC OCTCGITTCC TCTCAAGACA CC ATC ATCCCT

MET Ile Pro

417 432 447 462

GCT AAC OGA ATC CTC ATC GTC GTC TCA TCA TCC CAA GTC CTC CIA GGA GGC GOG Gly Asn Arg MET Leu MET Vai Vai Leu Leu çys Gin Vai Leu Leu Gly Gly Ala 477 492 507 AGC CAI GCT AGT TTC ATA CCT GAG AOG GGG AAG AAA AAA GTC GCC GAG ATC CAG Ser His Ala Ser Leu Ile Pro G1U Thr Gly Lys Lys Lys Vai Ala G1U Ile Gin 522 537 552 567 GGC CAC GOG GGA GGA OGC OGC TCA GGG CAG AGC CAT GAG CTC CTC CGG GAC TTC Gly His Ala Gly Gly Arg Arg Ser Gly Gin Ser His Glu Leu Leu Arg Asp Phe 582 597 612 627 GAG GOG ACA crr CIG CAG ATC TTC GGG CTC OGC OGC OGC CCG CAG CCT AGC AAG Glu Ala Ihr Leu Leu Gin MET Phe Gly Leu Arg Arg Arg Pro Gin Pro Ser Lys 642 657 672 AGT GCC GTC ATC CCG GAC TAC ATC OGG GAT CTC TAC CGG CTC CAG TCT GGG GAG Ser Ala Vai Ile Pro Asp Tyr MET Arg Asp Leu iyr Arg Leu Gin Ser Gly Glu 687 702 717 732 GAG GAG GAA GAG CAG ATC CAC AGC ACT GCT CTC TAT CCT /*·* r·· CGC CCG GCC Glu Glu Glu Glu Gin Ile His Ser Thr Gly Leu Glu iyr Pro Glu Arg Pro Ala

-83747 762 777

AGC CGG GCC AAC ACC GTG AGG AGC TTC CAC CAC GAA GAA CAT CTC GAG AAC ATC Ser Arg Ala Asn Thr Vai Arg Ser Phe His His Glu Glu His Leu G1U Asn Ile 792 807 822 837 CCA GGG ACC AGT GAA AAC TCT GCT TTT CGT TTC CTC τη AAC CTC AGC AGC ATC Pro Gly Thr Ser G1U Asn Ser Ala Phe Arg Phe Leu Phe Asn Leu Ser Ser Ile 852 867 882 897 ccr GAG AAC GAG GCG ATC TCC TCT GCA GAG CIT CGG CTC TTC CGG GAG CAG GTC Pro G1U Asn G1U Ala Ile Ser Ser Ala Glu Leu Arg Leu Phe Arg Glu Gin Vai 912 927 942 GAC CAG GGC CCT GAT TCG GAA AGG GGC TTC CAC CGT ATA AAC ATT TAT GAG GTT Asp Gin Gly Pro Asp Trp Glu Arg Gly Phe His Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Vai 957 972 9S7 L002 ATC AAG ccc CCA (λλ GAA GTG GTG CCT GGG CAC CTC ATC ACA CGA CTA CTC GAC MEJT Lys Pro Pro Ala G1U Vai Vai Pro Gly His Leu Ile Thr Arg Leu Leu Asp 1017 1032 1047 ACG AGA CTC GTC CAC CAC AAT GTG ACA CGG TGG GAA ACT TTT GAT GTC AGC CCT Thr Arg leu Vai His His Asn Vai Thr Arg Trp Glu Thr Phe Asp Vai Ser Pro 1062 1077 1092 1107 GCG GTC CIT OGC TCG ACC CGG GAG AAG CAG CCA AAC TAT GGG CTA GCC ATT GAG Ala Vai Leu Arg Trp Thr Arg Glu Lys Gin Pro Asn Tyr Gly Leu Ala Ile Glu 1122 1137 1152 1167 GTC ACT CAC CTC CAT CAG ACT CGG ACC CAC CAG GGC CAG CAT GTC AGG ATT AGC Vai Thr His Leu His Gin Thr Arg Thr His Gin Gly Gin His Vai Arg Ile Ser 1182 1197 1212 CGA TOG ΤΤΆ ccr CAA GGG AGT GGG AAT TGG GCC CAG CTC CGG CCC CTC CTC GTC Arg Ser Leu Pro Gin Gly Ser Gly Asn Trp Ala Gin Leu Arg Pro Leu Leu Vai 1227 1242 1257 1272 ACC TTT GGC CAT GAT GGC CGG GGC CAT GCC TTC ACC OGA. CGC CGG AGG GCC AAG Thr Phe Gly His Asp Gly Arg Gly His Ala Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ala Lys 1287 1302 1317 OGT AGC ccr AAG CAT CAC TCA CAG CGG GCC AGG AAG AAG AAT AAG AAC TCC CGG Arg Ser Pro Lys His His Ser Gin Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys Arg 1332 1347 1362 1377 CGC CAC TOG CTC rr'·» Iaú, GTG GAC TTC AGC uAi GTG GGC TCG > T· GAC TCG ATT GTG Arg His Ser Leu Tyr Vai Asp Phe Ser Asp Vai Gly Trp Asn Asp Trp Ile Vai 1392 J .407 1 .422 1437 GCC CCA CCA GGC TAC CAG GCC TTC TAC TCC CAT GGG GAC TCC CCC TTT CCA CTC Ala Pro Pro C-ly Tyr Gin Ala Phe Tyr cys His Gly Asp Cys Pro Phe Pro Leu

1452 14671432

GCT GAC CAC CTC AAC TCA ACC AAC CAT GCC ΑΊΤ GTG CAG ACC CTG GTC AAT TCT

Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Vai Gin Ihr leu Vai Asn Ser

1497 1512 15271542

GTC AAT TCC AGT ATC CCC AAA GCC TGT TGT GTG CCC ACT GAA CTG AGT GCCATC

Vai Asn Ser Ser Ile Pro Lys Ala cys Çys Vai Pro Ihr Glu leu Ser AlaIle

1557 15721537

TCC ATG CTG TAC CTG GAT GAG TAT GAT AAG GTG GIA CTG AAA AAT TAT CAGGAG

Ser ΜΞΤ leu iyr Leu Asp Glu Tyr Asp Lys Vai Vai Leu Lys Asn Tyr GinGlu

1602 1617 (394) 1636 1646 16561666

AIG GTA GLA GAG GGA TCT GGG TGC CGC TGAGATCAGG CACTCCTIGA GGATAGACAG ATAT.ACACAC MET Vai Vai Glu Gly Çys Gly Cys Arg

1746 1756 1766 1776 1786 17961806

TCCTTATAGC TGGACTCTTA ΤΤΤΑΑΑΆΑΑΑ ΑΆΑΑΑΑΑΑΑΑ AATGGAAA-AA ATCCCIAAAC AITCACCTTG

1816 1826 1836 1846 1856 18661876

ACCTTATCTA TGACTTTACG TGCAAATGIT TTGACCATAT TGATCATATA TTTTGACAAA ATAIATCTAT

1886 1396 1906 1916 1926 19361946

AACTACCTAT TAAAAGAAAA AAATAAAATG ACTCACTACT ΊΤΑΑΑΑΑΆΆΆ AAAAAAAACT CTAGAGIOGA

CGGAATTC ou (e) desde o aminoãcido numero 1 até ao aminoãcido número

175 representados a seguir:

Quad.6

-85QUADRO 6

10 20 30 (D

CTAGAGGCCG CITCOCIOGC OGCOGCCOQG OCAGC ATC MET

COC GGC GIG GCC CGC Pro Gly Vai Ala Arg

CIG

Leu

COG

Pro

65 80 95 110 CIG CIG CIG GGG CIG CIG CIG CTC COG OGT CCC GGC OGG COG CIG GAC TIG GCC Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Pro Arg Pro Gly Arg Pro Leu Asp Leu Ala 125 140 155 GAC TAC ACC TAT GAC CIG GCG GAG GAG GAC GAC TCG GAG CCC CTC AAC TAC AAA Asp Tyr Thr Tyr Asp leu Ala Glu Glu Asp Asp Ser Glu Pro Leu Asn Tyr Lys 170 .185 200 215 GAC CCC TCC AAG GOG GCT GCC τη· CIT GGG GAC ATT GCC CTC GAC GAA GAG GAC Asp Pro Cys Lys Ala Ala Ala lhe Leu Gly Asp Ile Ala Leu Asp Glu Glu Asp 230 245 260 275 CIG AGG GCC TTC CAG GTA CAG CAG GCT GTG GAT CTC AGA OGG CAC ACA GCT OGT Leu Arg Ala Phe Gin Vai Gin Gin Ala Vai Asp Leu Arg Arg His Thr Ala Arg 290 305 320 AAG TCC TCC ATC AAA GCT GCA GIT CCA GGA AAC ACT TCT ACC CCC AGC TGC CAG Lys Ser Ser Ile Lys Ala Ala Vai Pro Gly Asn Thr Ser Thr Pro Ser cys Gin 335 350 365 380 AGC ACC AAC GGG CAG CCT CAG AGG GGA GCC TCT GGG AGA TCG AGA GGT AGA TCC Ser Ihr Asn Gly Gin Pro Gin Arg Gly Ala cys Gly Arg Trp Arg Gly Arg Ser 395 410 425 OGT AGC OGG OGG GOG GCG AOG TCC CGA CCA GAG CGT GTC TGG CCC GAT GGG GTC Arg Ser Arg Arg Ala Ala Thr Ser Arg Pro Glu Arg val Trp Pro Asp Gly Val 440 455 470 485 ATC CCC ΊΤΤ GTC ATT GGG GGA AAC TTC ACT GGT AGC CAG AGG GCA GTC TTC CGG Ile Pro Phe Vai Ile Gly Gly Asn Phe Thr Gly Ser Gin Arg Ala Val Phe Arg 500 515 530 545 CAG GCC AIG AGG CAC TCG GAG AAG CAC ACC TCT CTC ACC TTC CTC GAG CGC ACT Gin Ala MET Arg His Ίϊρ G1U Lys His Thr cys Vai Thr Phe Leu Glu Arg Thr 560 575 590 GAC GAG GAC AGC TAT ATT GIG TTC ACC TAT CGA CCT TCC GGG TC? TCC TCC TAC Asp Glu Asp Ser Tyr Ile Vai Phe Thr Tyr Arg Pro Cys Gly Cys Cys Ser Tyr 605 620 635 650 GTC GGT CGC CGC GGC GGG GGC CCC CAG GCC ATC TCC ATC GGC AAG AAC TCT GAC Vai Gly Arg Arg Gly Gly Gly Pro Gin Ala Ile Ser Ile Gly Lys Asn cys Asp

-86665 680 695

AAG TTC GGC ATT CTG GTC CAC GAG CTG GGC CAC GTC GTC GGC TTC TGG CAC GAA Lys Fhe Gly Ile Vai Vai His Glu Leu Gly His Vai Vai Gly Fhe Trp His Glu

710 725 740 755

CAC ACT OGG CCA GAC OGG GAC OGC CAC GTT TCC ATC GTT OGT GAG AAC ATC CAG His Ihr Arg Pro Asp Arg Asp Arg His Vai Ser Ile Vai Arg Glu Asn Ile Gin 770 785 800 815 CCA GGG CAG GAG TAT AAC TTC CTG AAG ATC GAG CCT CAG GAG CTG GAG TCC CTG Pro Gly Gin Glu iyr Asn Fhe Leu Lys MET Glu Pro Gin Glu Vai Glu Ser Leu 830 845 860 GGG GAG ACC TAT GAC TTC GAC AGC ATC ATC CAT TAC GCT CGG AAC ACA TTC TCC Gly G1U Ihr iyr Asp Fhe Asp Ser Ile MET His Tyr Ala Arg Asn Ihr Fhe Ser 875 890 905 920 AGG GGC ATC TTC CTG GAT ACC ATT GTC CCC AAG TAT GAG GTG AAC AAA Arg Gly Ile Fhe Leu Asp Ihr Ile Vai Pro Lys Tyr Glu Vai Asn Gly Vai Lys 935 950 965 CCT CCC ATT GGC CAA AGG ACA CGG CTC AGC AAG GGG GAC ATT GCC CAA GCC OGC Pro Pro lie Gly Gin Arg Ihr Arg Leu Ser Lys Gly Asp Ile Ala Gin Ala Arg 980 995 1010 1025 AAG CIT TAC AAG TGC OCA GCC TGT GGA GAG ACC CTG CAA GAC AGC ACA GGC AAC Lys Leu Tyr Lys Cys Pro Ala Cys Gly Glu Ihr leu Gin Asp Ser Ihr Gly Asn 1040 1055 1070 1085 TTC TCC TCC CCT GAA TAC CCC AAT GGC TAC TCT GCT CAC ATC CAC TGC CTG TGG lhe Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Asn Gly lyr Ser Ala His MET His cys Vai Trp 1100 1115 1130 OGC ATC TCT GTC ACA CCC GGG GAG AAG ATC ATC CTG AAC TTC ACG TCC CTG GAC Arg Ile Ser Vai Ihr Pro Gly Glu Lys Ile Ile Leu Asn Phe Ihr Ser Leu Asp 1145 1160 1175 1190 CTG TAC OGC AGC CGC CIG TGC TGG TAC GAC TAT GTC GAG GTC CGA GAT GGC TIC Leu Tyr Arg Ser Arg Leu cys Trp iyr Asp iyr Vai Glu Vai Arg Asp Gly Fhe 1205 1220 1235 TGG AGG AAG GOG CCC CTC OGA GGC CGC TTC TGC GGG TCC AAA CTC CCT GAG CCT lip Arg Lys Ala Pro Leu Arg Gly Arg Phe Cys Gly Ser Lys Leu Pro Glu Pro 1250 1265 1 .280 1 .295 ATC GTC TCC ACT GAC > /·/*, AiA. CGC CTC TGG GCT GAA TTC CGC AGC AGC AGC AAT TCG Ile Vai Ser Ihr Asp Ser Arg Leu Trp Vai Glu Phe Lr*-* Ser Ser Ser Asn Trp 1310 1325 1 .340 ] .355 GTT GGA AAG GGC TTC TTT GCA GTC TAC GAA GCC ATC TGC GGG GCT GAT GTG AAA Vai Gly Lys Gly Fhe Fhe Ala Vai lyr Glu Ala Ile cys Gly Gly Asp Vai Lys

/ y

-871370 1385 1400

AAG GAC TAT GGC CAC ATT CAA TOG CCC AAC TAC CCA GAC GAT TAC OGG CCC AGC Lys Asp Tyr Gly HÍS Ile Gin Ser Pro Asn Tyr Pro Asp Asp iyr Arg Pro Ser 1415 1430 1445 1460 AAA GTC TCC ATC TCG CGG ATC CAG GTC TCT GAG GGC TTC CAC GTG GGC CTC ACA Lys Vai cys Ile Trp Arg Ile Gin Vai Ser Glu Gly Fhe His Vai Gly Leu Ihr 1475 1490 1505 TTC CAG TCC TTT GAG ATT GAG OGC CAC GAC AGC TCT GCC TAC GAC TAT CTC GAG Fhe Gin Ser Fhe Glu Ile Glu Arg His Asp Ser Cys Ala Tyr Asp iyr Leu G1U 1520 1535 1550 1565 GIG OGC GAC GGG CAC AGT GAG AGC AGC ACC CTC ATC GGG OGC TAC TCT GGC TAT Vai Arg Asp Gly His Ser Glu Ser Ser Thr leu Ile Gly Arg Tyr cys Gly Tyr 1530 L595 1610 1625 GAG ·* -¾ /-» CCT GAT ATC AAG AGC AOG TCC AGC CGC CTC TCG CTC AAG TTC GTC Glu Lys Pro Asp Asp Ile Lys Ser Thr Ser Ser Arg Leu Trp Leu Lys Fhe Vai 1640 1655 1670 TCT GAC GGG TCC ATT AAC AAA GOG GGC TTT GCC GTC AAC TTT TTC AAA GAG GTG Ser Asp Gly Ser Ile Asn Lys Ala Gly Fhe Ala Vai Asn Fhe Fhe Lys G1U Vai 1685 1700 1715 1730 GAC GAG TCC TCT CGG CCC AAC OGC GGG GGC TCT GAG CAG OGG TCC CTC AAC ACC Asp Glu cys Ser Arg Pro Asn Arg Gly Gly cys Glu Gin Arg cys Leu Asn Ihr 1745 1760 1775 CTG GGC AGC TAC AAG TCC AGC TCT GAC CCC GGG TAC GAG CTC GCC CCA GAC AAG Leu Gly Ser iyr Lys cys Ser Cys Asp Pro Gly iyr Glu Leu Ala Pro Asp Lys 1790 1805 1820 1835 OGC OGC TCT GAG GCT GCT TCT GGC GGA TTC CTC ACC AAG CTC AAC GGC TCC ATC Arg Arg cys Glu Ala Ala cys Gly Gly Fhe Leu Ihr Lys Leu Asn Gly Ser Ile 1850 1865 1880 1895 ACC AGC COG GGC TCG CCC AAG GAG TAC CCC CCC AAC AAG AAC TCC ATC TCG CAG Thr Ser Pro Gly Itp Pro Lys Glu iyr Pro Pro Asn Lys Asn Cys Ile Trp Gin 1910 1925 1940 CTG GTG GCC CCC ACC CAG TAC CGC ATC TCC CTG CAG TTT GAC TTC TTT GAG ACA Leu Vai Ala Pro Thr Gin iyr Arg Ile Ser Leu Gin Fhe Asp Phe Phe Glu Ihr 1955 1970 1985 * !000 r* GGC K > «i ΛΛΧ GAT GTC rry*·*-, AAG TAC GAC TTC GTC GAG GTC OGC AGT GGA CTC ACA Glu Gly Asn Asp Vai Cys Lys iyr Asp Phe Vai G1U Vai Arg Ser Gly Leu Ihr 2015 * >030 * >045 GCT GAC TCC AAG CTC CAT GGC AAG TTC TCT GCT TCT GAG AAG CCC GAG GTC ATC Ala Asp Ser Lys Leu His Gly Lys Fhe cys Gly Ser Glu Lys Pro Glu Vai Ile

-882060 2075 20902105

ACC TCC CAG TAC AAC AAC ATC OGC GTC GAG TTC AAG TCC GAC AAC ACC GTC TCC

Thr Ser Gin Tyr Asn Asn MET Arg Vai Glu Fhe lys Ser Asp Asn Thr Vai Ser

2120 2135 21502165

AAA AAG GGC TTC AAG GCC CAC TTC TTC TCA GAA AAG AGG CCA GCT CTC CAG CCC

Lys Lys Gly Fhe Lys Ala His Fhe Fhe Ser Glu Lys Arg Pro Ala Leu Gin Pro

2180 21952210

CCT OGG GGA OGC OCC CAC CAG CTC AAA TTC OGA GTC CAG AAA AGA AAC OGG ACC

Pro Arg Gly Arg Pro His Gin Leu Lys Fhe Arg Vai Gin Lys Arg Asn Arg Thr (730)

2225 2235 2245 2255 2265 22752285

CCC CAG TGAGGCCTGC CAGGCCTCCC GGACCCCTTG TTACTCAGGA ACCTCACCTT GGAOGGAATC Pro Gin

2295 2305 2315 2325 2335 23452355

GGATGGGGGC TTCGGTCCCC ACCAACCCCC CACCTCCACT CTGCCATTCC GGCCCACCTC CCTCIGGCOG

2365 2375 2385 2395 2405 24152425

GACAGAACTC GTGCTCTCTT CTCCCCACTG TGCCCGTCCG CGGACOGGGG ACCCTTCCCC GTCCCCTACC

2435 2445 2455 2465 2475 24852495

CCCTCCCATT TTCATCGTCT CTGTCACATT TCCTGTTCTG AAGTAAAAGA GGGACCCCTC CGTCCTCCCT

CIAGA e de a referida sequência de DNA ser uma associação actuante com uma sua sequência de controlo de expressão.

2,- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obter o factor osteoindutivo, substancialmente isento de outras substâncias proteicas e compreendendo uma sequência peptídica substancialmente igual a uma sequência contínua e escolhida entre as sequências seguintes:

(a) desde o aminoácido número 1 atê ao aminoácido número 129 representados a seguir:

-89QUADRO 3

(D 15 ceír 30 45 GGC CAC GAT GGG AAA GGA CAC CTC CAC AGA AGA GAA AAG CGG G H D G K G H P L H R R E K R 60 75 90 CAA GCA AAA CAC AAA CAG CGG AAA CGC CTC AAG TCC AGC TGT AAG Q A K H K Q R K R L K S S c K 105 120 135 AGA CAC CCT ΊΤΑ TAT GTC GAC TTC AGT GAT GTC C-GG TGG AAT GAC R H P L Y V D F S D V G W N D 150 165 180 TGG ATC GIT GCA CCG CCG GGG TAT CAT GCC ΤΓΤ TAC TGC C-MJ. Lvu W I V A P P G Y H A F Y C H G 195 210 225 GAG TGC CCT ΊΊΤ CCC CTC GCC GAT CAC CIT AAC TCC AOG AAT CAT E C P F P L A D H L N s T N H 240 255 270 GCC ATT CTC CAA ACT CTC GTC AAC TCA GIT AAC TCT AAG ATT CCC A I V Q T L V N S V N s K I P 385 300 315 AAG GCA TGC TCT GTC CCA ACA GAG CTC AGC GCC ATC TCC ATC CTG K A c C V P T E L S A I s M L 330 345 360 TAC CIT GAT GAG AAT GAG AAG GTC GTA TIA AAG AAC TAT CAG GAC Y L D E N E K V V I» K N Y 0 D 375 (129 ) 397 407 ATG GIT GTC GAG GGT TGT GGG TGT CGT TAGCACAGCA ΑΑΑΤΑΑΆΑΤΑ M V V E G C G C R 417 427 437 447 457

TAAATATATA TATATATATA TTAGAAAAAC AGCAAAAAAA TCAAGTTGAC

467 477 487 497 507

ACITIAATAT TTCCCAATCA AGACTTTATT TATC-GAATCG AATGGAGAAA

587

577

567

-90(b) desde o aminoacido numero 1 ate ao aminoacido numero 396 representados a seguir:

10 20 ?o CTCGACTCTA GAG1u'xgiGx‘ CAGCACTTCG 80 90 100 CCCCACTTTG CGCCGGTGCC TTTGCCCCAG 150 160 170 ACTCCTCGGC CTTC-CCCGAC ACIGAGACGC 220 230 240 GGGAGAAGGA GGAGGCAAAG AAAAGGAAOG 290 300 310

TCCATCTGGA CGCTCTTTCA ATGGACCTCT

QUADRO > 1 40 50 60 70 CTGGGGACTT CTTGAACTTG CAGGGAGAAT AACTTGCGCA 110 120 130 140 OGGAGCCTGC TTOGCCATCT CCGAGCCCCA CCGCCCCTCC 180 190 200 210 TGTTCCCAGC GTGAAAAGAG AGACTGCGCG GCCGGCACCC 250 260 270 280 GACATTCGCT CCTTGOGCCA GCTCCTTTGA CGAGAGTTZT 320 330 340 350 CCCCGCCTGC TTCTTAGACG GACTGOGCTC TCCTAAAC-GT

(1) 370 385 400

OGACC ATG GIG GCC GGG ACC CGC TCT CTT CTA GCG TTG CTG CTT CCC CAG GTC

MET Vai Ala Gly Thr Arg cys leu . Leu Ala Leu Leu Leu Pro Gin Vai

415 430 445

CTC CTG GGC GGC GOG GCT GGC CTC CTT CCG GAG CTG GGC OGC AGG AAG TTC GOG Leu Leu Gly Gly Ala Ala Gly Leu Vai Pro Glu Leu Gly Arg Arg Lys Fhe Ala 460 475 490 505 GCG GOG TCG TCG GGC OGC CCC TCA TCC CAG CCC TCT GAC GAG CTC CTG AGC GAG Ala Ala Ser Ser Gly Arg Pro Ser Ser Gin Pro Ser Asp Glu Vai Leu Ser Glu 520 535 550 •565 TTC GAG TTG CGG CTG CTC AGC ATG TTC GGC CTG AAA CAG AGA CCC ACC CCC AGC Phe Glu leu Arg leu Leu Ser MET Phe Gly Leu Lys Gin Arg Pro Thr Pro Ser 580 595 610 AGG GAC GCC GTG CTG CCC CCC TAC ATG CTA GAC CTG TAT CGC AGG CAC TCG GCT Arg Asp Ala Vai Vai Pro Pro iyr MET Leu Asp Leu Tyr Arg Arg His Ser Gly 625 640 655 670 CAG CCG GGC TCA CCC GCC CCA GAC CAC CGG TTG GAG AGG GGA GCC AGC OGA GCC Gin Pro Gly Ser Pro Ala Pro Asp His Arg Leu Glu Arg Ala Ala Ser Arg Ala 685 700 715 AAC ACT GTG CGC AGC TTC CAC CAT GAA GAA TCT TTG GAA GAA CTA CCA GAA AOG Asn Thr Vai Arg Ser Fhe His His Glu Glu Ser Leu Glu G1U Leu Pro Glu Ihr

730

745

760

775

AGT GGG AAA ACA ACC OGG AGA TTC TTC TTT AAT TTA AGT TCT ATC CCC ACG GAG Ser Gly Lys Thr Thr Arg Arg The Phe Phe Asn Leu Ser Ser Ile Pro Thr Glu 790 805 820 835 GAG ΊΊΤ ATC ACC TCA GCA GAG CTt CAG GTT TTC OGA GAA CAG ATC CAA GAT GCT Glu Phe Ile Ihr Ser Ala Glu Leu 'Gin Vai The Arg Glu Gin MET Gin Asp Ala 850 865 880 TTA GGA AAC AAT AGC AGT TTC CAT CAC OGA ATT AAT ATT TAT GAA ATC ATA AAA Leu Gly Asn Asn Ser Ser Phe His His Arg Ile Asn Ile Tyr G1U Ile Ile Lys 895 910 925 940 CCT GCA ACA GCC AAC TCG AAA TTC CCC GTC ACC AGT CTT TTG GAC ACC AGG TTG Pro Ala Ihr Ala Asn Ser Lys Phe Pro Vai Thr Ser Leu Leu Asp Thr Arg Leu 955 970 985 GTG AAT CAG AAT GCA AGC AGG TGG GAA AGT TTT GAT GTC ACC CCC GCT GTC ATC Vai Asn Gin Asn Ala Ser Arg lip Glu Ser Phe Asp Vai Ihr Pro Ala Vai MET 100( D 1015 1030 1045 OGG TGG ACT GCA CAG GGA CAC GCC AAC CAT GGA TTC GTC GTC GAA GTG GCC CAC Arg Trp Thr Ala Gin Gly His Ala Asn His Gly Phe Vai Vai Glu Vai Ala His 1060 1075 1090 1105 TTG GAG GAG AAA CAA GGT GTC TCC AAG AGA CAT GIT AGG ATA AGC AGG TCT TTG Leu Glu Glu Lys Gin Gly Vai Ser Lys Arg His Vai Arg Ile Ser Arg Ser Leu 1120 1135 1150 CAC CAA GAT GAA CAC AGC TCG TCA CAG ATA AGG CCA TTC CTA GTA ACT TTT GGC His Gin Asp Glu His Ser Trp Ser Gin Ile Arg Pro Leu Leu Vai Ihr lhe Gly 1165 1180 1195 1210 CAT GAT GGA AAA GGG CAT CCT CTC CAC AAA AGA GAA AAA OGT CAA GCC AAA CAC His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg G1U Lys Arg Gin Ala Lys His 1225 1240 1255 AAA CAG CGG AAA CGC CTT AAG TCC AGC TGT AAG AGA CAC CCT TTC TAC GTC GAC Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser çys Lys Arg His Pro Leu Tyr Vai Asp 1270 1285 1300 1315 TTC AGT GAC GTC GGG TCG AAT GAC TCG ATT GTC GCT CCC COG GGG TAT CAC GCC Phe Ser Asp Vai Gly Trp Asn Asp Trp Ile Vai Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala 1330 1345 1360 1 .375 TTT TAC TCC CAC GGA GAA TCC CCT TTT CCT CTC GCT GAT CAT CTC AAC TCC ACT Phe Tyr Cys His Gly Glu cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Ihr 1390 1405 1 .420 AAT CAT GCC ATT GTT CAG ACG TTC GTC AAC TCT GIT AAC TCT AAG ATT CCT AAG Asn His Ala Ile Vai Gin Thr Leu Vai Asn Ser Vai Asn Ser Lys Ile Pro Lys

1435

1450

1465

14S0

GCA TGC TGT GTC COG ACA GAA CTC AGT GCT ATC TOG ATG CTG TAC CTT GAC GAG

Ala Cys Çys Vai Pro Ihr Glu Leu Ser Ala Ile Ser ΜΕΓ Leu Tyr Leu Asp Glu

1495 1510 1525

ΑΆΤ GAA AAG GTT CTA ΊΤΑ AAG AAC TAT CAG GAC ATG GTT CTG GAG GCT TGT GGG

Asn Glu Lys Vai Vai Leu Lys Asn iyr Gin Asp ΜΞΣΓ Vai Vai Glu Gly Cys Gly

1540(396) 1553 1563 1573 1583 1593 1603

TGT CGC TACTACAGCA AAATTAAATA CATAAATATA TATATATATA TATAITITAG AAAAAAGAAA Çys Arg

AAAA

3.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obter um factor osteoindutivo substancial mente isento da presença de outras substâncias proteicas e consis tindo em uma sequência peptidica substancialmente igual a uma sequência contínua escolhida entre as sequências seguintes:

(a) desde o aminoãcido número 1 até ao aminoãcido número 408 representados a seguir:

Quad.8

QUADRO 8

10 20 30

CTCTAGAGGG CAGAGGAGGA GGGAC-GGÃC-G

40 50

GAAGGAGOGC GGAGCCOGGC

60 70

CCGGAAGCIA GGTGAGTGTG

80 90 100 110 120 130 140

GCATCCGAGC TCAGGGACGC GAGCCIGAGA CGCCGCIGCT GCTCCGGCIG AGTATCIAGC TTGTCTCCOC

150 160 170 180 190 200 210

GATGGCATTC COGTCCAAGC TATCTOGAGC CIGCAC-CGCC ACAGTCCCOG GCCCICGCCC AGCTTCACIG

220

230 240

250 260

270

280

CAACCGTCCA GAGGTCCCCA GGAGCIGCIG

CIGGCGAGCC CGCIACIGCA GGGACCTATG

290 300 310 320 330 340 350

GTAGIGCCAT CCOGAGCAAC GCACIGCTGC AGCTTCCCIG AGCCITTCCA GCAAGTTTGT TCAAGATTGG

360 370

380 390

CIGTCAAGAA TCATGGACTG TTAITATATG CCTTGTTTTC TGTCAAGACA CC ATG ΑΤΓ CCT

ΜΞΤ Ile Pro

417 432 447 462 GGT AAC CGA ATG CTG ATG GTC ctt ΤΊΑ TTA TGC CAA GTC CTG CIA GGA GGC GCG Gly Asn Arg ΜΕΓ Leu ΜΞΤ Vai Val Leu Leu Cys Gin Val Leu Leu Gly Gly Ala 477 492 507 AGC CAI GCT AGT TIG ATA CCT GAG AOG GGG AAG AAA AAA GTC GCC GAG ΑΤΓ CAG Ser His Ala Ser Leu Ile Pro Glu Thr Gly Lys Lvs Lys Val Ala Glu Ile Gin 522 537 552 567 GGC CAC GCG GGA GGA OGC OGC TCA GGG CAG AGC CA.T GAG CTC CTG CGG GAC TTC Gly His Ala Gly Gly Arg Arg Ser Gly Gin Ser His G1U Leu Leu Arg Asp Phe 582 597 612 627 GAG GCG ACA cn CIG CAG ATG τη GGG CTG CGC CGC CGC CCG CCT AGC AAG Glu Ala Thr Leu Leu Gin MET Phe Gly leu Arg Arg Arg Pro Gin Pro Ser Lys 642 657 672 AGT GCC GTC An CCG GAC TAC ATG CGG zw* ’Ή lanx cn TAC CGG cn TCT GGG GAG Ser Ala Vai Ile Pro Asp Tyr MET Arg Asp Leu Tyr Arg Leu Gin Ser Gly Glu 687 702 717 732 GAG GAG GAA GAG CAG ATC CAC AGC ACT GGT cn GAG TAT CCT GAG CGC CCG GCC Glu Glu Glu Glu Gin Ile His Ser Thr Gly Leu G1U Tyr Pro Glu Arg Pro Ala

747 762777

AGC OGG GCC AAC ACC GTC AGG AGC TTC CAC CAC GAA GAA CAT CTC GAG AACATC

Ser Arg Ala Asn Thr Vai Arg Ser Phe His His Glu Glu His Leu Glu AsnIle

792 807 822837

CCA GGG ACC AGT GAA AAC TCT GCT ΤΓΤ OGT TTC CTC TTT AAC CTC AGC AGCATC

Pro Gly Thr Ser Glu Asn Ser Ala Phe Arg Phe Leu Phe Asn leu Ser SerIle

852 867 882897

CCT GAG AAC GAG GCG ATC TCC TCT GCA GAG CIT CGG CTC TTC CGG GAG CAGGTC

Pro Glu Asn Glu Ala Ile Ser Ser Ala Glu Leu Arg Leu Phe Arg Glu GinVai

912 927942

GAC CAG GGC CCT GAT TCG GAA AGG GGC TTC CAC CGT ATA AAC ATT ΊΑΤ GAG GIT

Asp Gin Gly Pro Asp Trp Glu Arg Gly Phe His Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Vai

957 972 9871002

ATC AAG CCC CCA GCA GAA GTC GTC CCT GGG CAC CTC ATC AGA CGA CIA CTC GAC

MET Lys Pro Pro Ala Glu Vai Vai Pro Gly His Leu Ile Thr Arg Leu Leu Asp

1017 10321047

ACG AGA CTC GTC CAC CAC AAT GTC ACA CGG TCG GAA ACT ΊΤΤ GAT GTC AGCCCT

Thr Arg Leu Vai His His Asn Vai Thr Arg Trp Glu Thr Phe Asp Vai SerPro

1062 1077 10921107

GCG GTC CIT CGC TGG ACC OGG GAG AAG CAG CCA AAC TAT GGG CIA GCC ATTGAG

Ala Vai Leu Arg Trp Thr Arg Glu Lys Gin Pro Asn Tyr Gly Leu Ala IleGlu

1122 1137 11521167

GTC ACT CAC CTC CAT CAG ACT CGG ACC CAC CAG GGC CAG CAT GTC AGG ATTAGC

Vai Thr His leu His Gin Thr Arg Thr His Gin Gly Gin His Vai Arg IleSer

1182 11971212

OGA TCG ΤΓΑ CCT CAA GGG AGT GGG AAT TCG GCC CAG CTC CGG CCC CTC CTGGIC

Arg Ser Leu Pro Gin Gly Ser Gly Asn Trp Ala Gin Leu Arg Pro Leu LeuVai

1227 1242 12571272 acctitggccatgatggccggggccatgccttcacccgaogcoggagg GCC AAG Thr Phe Gly His Asp Gly Arg Gly His Ala Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ala Lys

1287 13021317

OGT AGC CCT AAG CAT CAC TCA CAG OGG GCC AGG AAG AAG AAT AAG AAC TCC CGG Arg Ser Pro Lys His His Ser Gin Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys Arg

1332 1347 13621377

CC-C CAC TCG CTC TAT GTC GAC TTC AGC GAT GTC GGC TCG AAT GAC TGG ATTGTC

Arg His Ser Leu Tyr Vai Asp Phe Ser Asp Vai Gly Trp Asn Asp Trp IleVai

1392 1407 14221437

GCC CCA CCA GGC TAC CAG GCC TTC TAC TCC CAT GGG GAC TCC CCC TIT CCA CTG

Ala Pro Pro Gly Tyr Gin Ala Phe Tyr Cys His Gly Asp Cys Pro Phe Pro Leu

-951452 14671432

GCT GAC CAC CTC AAC TCA ACC AAC CAT GCC ATT GTG CAG ACC CTG GTC AAT TCT

Ala Asp His Leu Asn Ser Ihr Asn His Ala Ile Val Gin Ihr Leu Val Asn Ser

1497 1512 15271542

GTC AAT TCC AGT ATC CCC AAA GCC TGT TGT GTG CCC ACT GAA CTG AGT GCC ATC

Val Asn Ser Ser Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile

1557 15721587

TCC ATG CTG TAC CTG GAT GAG TAT GAT AAG GTG GIA CTG AAA AAT TAT CAG GAG

Ser MET Leu iyr Leu Asp Glu Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn iyr Gin Glu

1602 1617 (394) 1636 1646 16561666

ATG GTA GTA GAG GGA TGT GGG TGC CGC IGAGATCAGG CAGTCCTTGA GGATAGACAG ATATACACAC MET Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg

1676 16S6

T /*»*

1746 1756

TCCITATAGC TCGACTTTIA

1816 1826

ACCTTATITA TGACTTTACG

1696 1706 1716 17251735

ACCACACACA CAOGTTCCCA TCCACTCACC CACACACTAC ACAGACTC-CT

1766 177617S5

1’1‘lAAAAAAA AAAAAAAAAA AATGGAAAAA

1796 1305

AICCCTAAAC ATTCACCTTG

1836 1846 1856 18661876

TGCAAATGTT TTGACCATAT IGATCAIATA TITTGACAAA ΑΤΑΊΑΊΤΣΑΤ

1886 1896 19061916

AACTACGTAT TAAAAGAAAA AAATAAAATG AGTCATTATT

1926 1936 1946

TTAAAAAAAA AAAAAAAACT CTAGAGTOGA

OGGAATTC

4.- processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obter um factor osteoindutivo substancialmente isento da presença de outras substâncias proteicas e consistindo em uma sequência peptídica, igual ou substancialmente igual a uma sequência contínua constituída pela sequencia desde o aminoâcido número 1 até ao aminoácido número 175 representados a seguir:

QUADRO 4 a

2S4 294 304 (112)319

CTAACCTCTG TTCTCCCTTT TCGITCCIAG TCT TTC AAG CCA TCA AAT CAC GCT ACC Ser Leu Lys Pro Ser Asn His Ala Thr

334 349 364 379 ATC CAG ACT AIA CTG AGA GCT GTC GGG CTC CTC CCT GGA ATC ccc p* r* Uno CCT TCC Ile C-ln Ser Ile Vai Arg· Ala Vai Gly Vai Vai Pro Gly Ile Pro Glu Pro cys 394 409 424 439 TCT GTC CCA GAA AAG ATC TCC TCA CTC AGC ATC TTA TTC TTT GAT GAA AAC AAG Cys Vai Pro Glu Lys MET Ser Ser Leu Ser Ile Leu Phe Phe Asp Glu Asn Lys 454 469 484 (175) AAT GTC GTA CTT AAA GTA TAT CCA AAC ATG ACA GTA f * /** OMO TCT TGT GCT TCC zwn Asn Vai Vai Leu Lys Vai Tyr Λ. Asn Τ’- 1 » G1U Ser Cvs Ala Cys Arg

503 513 523533

TAACCTCGTC AAGAACTCAT CTGGATGCTT AACTCAATCG

QUADRO 4 b

383 393 403413

GAGGAGGAAG C3CTCTA0GG GGGZCCTtá: GCCTCTCCAG /

(1) 428

AAC AAT GAG CIT CCT GGG GCA Asn Asn Glu Leu Pro Gly Ala

443 458 473 488 GAA TAT CAG TAC AAG GAG GAT GAA CTA TCG GAG GAG AGG AAG CCT TAC AAG ACT G1U Tyr Gin Tyr Lys Glu Asp Glu Vai Tip Glu Glu Arg Lys Pro Tyr Lys Thr 503 518 533 CTT CAG ACT CAG CCC CCT GAT AAG ACT AAG AAC AAA AAG AAA GAG AGG AAG GGA Leu Gin Thr Gin Pro Pro Asp Lys Ser Lys Asn Lys Lys Lys Gin Arg Lys Gly 548 563 578 593 CCT /ix r* Lno AAG ACT CAG ACG CTC CAG TTT GAT GAA CAG ACC CTC * ZW ΛΛΟ ΛΛΟ GCA Pro Gin Gin Lys Ser Gin Tnr Leu Gin lhe Asp Glu Gin Thr Leu Lys Lys Ala 608 623 638 AGA AGA AAG CAA TCG ΑΊΤ GAA CCC CGG AAT TCT GCC AGA CGG TAC CTT AAA GTC Arg Arg Lys Gin Trp Ile Glu Pro Arg Asn Cys Ala Arg Arg Tyr Leu Lys Vai 653 668 683 698 GAC TTC CCA GAT ATT C-GC TCG ACC GAA TCG ATT ATT TCC CCC AAG TCC TTC GAT Asp Phe Ala Asp Ile Gly Trp Ser Glu Trp Ile Ile Ser Pro Lys Ser Phe Asp 713 728 743 (111 .) 756 766 GCC ΓΓ* T? TAC TGC TCC GGA GCC- TCC CAG TTC CCC ATC CCA AAG UinoÁJUnTIU TiTxlUUxUU Ala Tyr Tyr Cys Ser Gly Ala Cys Gin Phe Pro ΜΞΓ Pro Lys

776786

TGTCCTTCCC ATTTCCATAG

-97/ < *

5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado ainda pelo facto de o factor obtido ser capaz de estimular a actividade de desenvolvimento de ossos em um ensaio in vivo de formação de ossos de rato, em uma concentração compreendida entre cerca de 1 e cerca de 1000 nanogramas por grama de osso.

6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado ainda pelo facto de o factor obtido:

(a) possuir um peso molecular aparente compreendido entre 28 e 30 Kd, determinado pelo processo de electroforese sobre gel de SDS-poliacrilamida; e (b) apresentar um ponto isoelêctrico compreendido entre um pH cerca de 8 a cerca de 9,2 determinado mediante electrofocagem (focagem eléctrica).

7.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se escolher a referida sequência de DNA, que contêm uma sequência nucleotídica contínua, de entre um grupo constituído pelas sequências nucleotídicas seguintes:

(a) desde o nucleotido número 3440 até ao nucleotido número 3550 representados a seguir:

Quad.5

QUADRO 5

3419 3429 3439(1)

CAGCCCIGGC ΙΊΌΓΓΟΠΤΓ CTCnTAGQT GCC TTT CIT

3454

GGG GAC ATT GCC CTG GAC

Ala Phe Leu Gly Asp Ile Ala Leu Asp

3469 3434 34993514

GAA GAG GAC CTG AGG C-CC TTC CAG GTA CAG CAG GCT GTG GAT CTC AGA CGGCAC

Glu Glu Asp Leu Arg Ala Phe Gin Vai Gin Gin Ala Vai Asp Leu Arg ArgHis

3529 3544 (37) 35603570

ACA GCT CGT AAG TCC TCC ATC AAA GCT GCA GGTAAGCCGG GTGCCAATGG

Thr Ala Arg Lys Ser Ser Ile Lys Ala Ala (b) desde o nucleótido numero 36 até ao nucleótido número 2225 representados a seguir:

Qua. 6

QUADRO N9 6

10 20 30 (1)

CTAGAGGCCG CTTCCCTCGC OGCCGCCCOS CCAGC ATC

MFT

CCC GGC GTC GCC OGC Pro Gly Vai Ala Arg

CTC COG Leu Pro

65 80 95 110 CTC CTC CTC GGG CTC CTC CTC CTC COG OGT CCC GGC OGG CCG CIG GAC TTC GCC Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Pro Arg Pro Gly Arg Pro Leu Asp Leu Ala 125 140 155 GAC TAC AOC TAT GAC CTC GCG GAG GAG GAC GAC TCG GAG CCC CTC AAC TAC AAA Asp iyr Ihr Tyr Asp leu Ala Glu Glu Asp Asp Ser Glu Pro leu Asn Tyr Lys 170 185 200 215 GAC CCC TCC AAG GCG GCT GCC TTT CTT GGG GAC ATT GCC CTC GAC GAA GAG GAC Asp Pro Cys Lys Ala Ala Ala Phe Leu Gly Asp Ile Ala Leu Asp G1U Glu Asp 230 245 260 275 CTC AGG GCC TTC CAG CTA CAG CAG GCT GTC GAT CTC AGA OGG CAC ACA GCT CCT Leu Arg Ala Fhe Gin Vai Gin Gin Ala Vai Asp Leu Arg Arg His Thr Ala Arg 290 3C5 320 AAG TCC TCC ATC AAA GCT GCA GTT CCA GGA AAC ACT TCT ACC CCC AGC TCC CAG Lys Ser Ser Ile Lys Ala Ala Vai Pro Gly Asn Thr Ser Thr Pro Ser cys Gin 335 350 365 380 AGC ACC AAC GGG CAG CCT CAG AGG GCC TCT GGG AGA TCG AGA GCT AGA TCC Ser Ihr Asn Gly Gin Pro Gin Arg Gly Ala cys Gly Arg Trp Arg Gly Arg Ser 395 410 425 OGT AGC CGG CGG GOG GOG AOG TOC CGA OCA GAG OGT GTC TCG CCC GAT GGG GTC Arg Ser Arg Arg Ala Ala Thr Ser Arg Pro Glu Arg Vai Trp Pro Asp Gly Vai 440 455 470 485 ATC CCC TTT CTC ATT GGG GGA AAC TTC ACT GCT AGC CAG AGG GGA GTC TTC OGG Ile Pro Fhe Vai Ile Gly Gly Asn Fhe Ihr Gly Ser Gin Arg Ala Vai Fhe Arg 500 515 530 545 CAG GCC ATC AGG CAC TCG GAG AAG CAC ACC TCT GTC ACC TTC CTC GGG OGC ACT Gin Ala MET Arg His Trp Glu Lys His Ihr cys Vai Thr Phe Leu Glu Arg Thr 560 575 590 GAC GAG GAC AGC TAT ATT GTC TTC ACC TAT CGA CCT TCC GGG TCC TCC TCC TAC Asp Glu Asp Ser Tyr Ile Vai Fhe Thr Tyr Arg Pro Cys Gly Cys cys Ser Tyr 605 620 635 650 GTC GCT OGC OGC GGC GGG GGC CCC CAG GCC ATC TCC ATC GGC AAG AAC TCT GAC Vai Gly Arg Arg Gly Gly Gly Pro Gin Ala Ile Ser Ile Gly Lys Asn Cys Asp

100665 680695

AAG TTC GGC AIT CTG GTC CAC GAG CTG GGC CAC GTC CTC GGC TTC TGG CAC GAA

Lys Phe Gly Ile Val Val His Glu Leu Gly His Val Val Gly Fhe Ttp His Glu

710 725 740755

CAC ACT CGG CCA GAC CGG GAC OGC CAC CTT TCC ATC CTT CGT GAG AAC ATC CAG

His Thr Arg Pro Asp Arg Asp Arg His Val Ser Ile Val Arg Glu Asn Ile Gin

770 785 800815

CCA GGG CAG GAG TAT AAC TTC CTG AAG ATG GAG CCT CAG GAG GGG GAG TCC CTG

Pro Gly Gin Glu Tyr Asn Phe Leu Lys MET Glu Pro Gin Glu Val Glu Ser Leu

830 845860

GGG GAG ACC TAT GAC TTC GAC AGC ATC ATG CAT TAC GCT OGG AAC ACA TTC TCC

Gly Glu Thr Tyr Asp Fhe Asp Ser Ile MET His Tyr Ala Arg Asn Thr Fhe Ser

875 890 905920

AGG GGC ATC TTC CTG GAT ACC AIT CTC CCC AAG TAT GAG CTG AAC GGG CTG AAA

Arg Gly Ile Fhe Leu Asp Thr Ile Val Pro Lys Tyr Glu Val Asn Gly Val Lys

935 950965

CCT CCC AIT GGC CAA AGG ACA CGG CTC AGC AAG GGG GAC AIT GCC CAA GCC CGC

Pro Pro Ile Gly Gin Arg Thr Arg Leu Ser Lys Gly Asp Ile Ala Gin Ala Arg

980 995 10101025

AAG CIT TAC AAG TGC CCA GCC TCT GGA GAG ACC CTG CAA GAC AGC ACA GGC AAC

Lys Leu Tyr Lys Cys Pro Ala Cys Gly Glu Thr Leu Gin Asp Ser Thr Gly Asn

1040 1055 10701085

TTC TCC TCC CCT GAA TAC CCC AAT GGC TAC TCT GCT CAC ATG CAC TGC CTG TGG

Fhe Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Asn Gly Tyr Ser Ala His MET His Çys Val Trp

1100 11151130

CGC ATC TCT CTC ACA CCC GGG GAG AAG ATC ATC CTG AAC TTC ACG TCC CTGGAC

Arg Ile Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Ile Ile Leu Asn Fhe Thr Ser LeuAsp

1145 1160 11751190

CTG TAC OGC AGC CGC CTG TGC TGG TAC GAC TAT CTG GAG CTC CGA GAT GGCTTC leu Tyr Arg Ser Arg Leu Çys Trp Tyr Asp Tyr Val Glu Val Arg Asp GlyPhe

1205 12201235

TGG AGG AAG GCG CCC CTC CGA GGC CGC TTC TGC GGG TCC AAA CTC CCT GAGCCT

Trp Arg Lys Ala Pro Leu Arg Gly Arg Phe Cys Gly Ser Lys Leu Pro GluPro

1250 1265 12S01295

ATC CTC TCC ACT GAC AGC CGC CTC TGG CTT GAA TTC CGC AGC AGC AGC AATTGG

Ile Val Ser Thr Asp Ser Arg Leu Trp Val Glu Phe Arg Ser Ser Ser AsnTrp

1310 1325 13401355

CTT GGA AAG GGC TTC TTT GCA GTC TAC GAA GCC ATC TGC GGG GGT GAT CTGAAA

Val Gly Lys Gly Fhe Fhe Ala Val Tyr Glu Ala Ile Cys Gly Gly Asp ValLys

101

1370 1385 1400

AAG GAC TAT GGC CAC ATT CAA TOG CCC AAC TAC CCA GAC GAT TAC CGG CCC AGC Lys Asp iyr Gly His Ile Gin Ser Pro Asn lyr Pro Asp Asp Tyr Arg Pro Ser 1415 1430 1445 1460 AAA GTC TGC ATC TGG OGG ATC CAG GTG TCT GAG GGC TTC CAC GTG GGC CTC ACA Lys Vai cys Ile Ttp Arg Ile Gin Vai Ser Glu Gly Fhe His Vai Gly Leu Thr 1475 1490 1505 TTC CAG TCC TTT GAG ATT GAG CGC CAC GAC AGC TGT GCC TAC GAC TAT CTG GAG Fhe Gin Ser Fhe Glu Ile Glu Arg His Asp Ser Cys Ala Tyr Asp Tyr Leu Glu 1520 1535 1550 1565 GTG CGC GAC GGG CAC AGT GAG AGC AGC ACC CTC ATC GGG CGC TAC TGT GGC TAT Vai Arg Asp Gly His Ser G1U Ser Ser Thr Leu Ile Gly Arg Tyr Cys Gly Tyr 1530 1595 1610 1625 Z· * Z* CCT GAT GAC ATC AAG AGC AOG TCC Λιλ. CGC CTC TGG CTC AAG TTC GTC Glu Lys Pro Asp Asp Ile Lys Ser Ihr Ser Ser Arg Leu Trp Leu Lys Fhe Vai 1640 1655 1670 TCT GAC GGG TCC ATT AAC AAA GCG TTT GCC GTC AAC TTT TTC AAA GTG Ser Asp Gly Ser Ile Asn Lys Ala Gly Fhe Ala Vai Asn Phe Fhe Lys Glu Vai 1685 1700 1715 1730 GAC GAG TGC TCT OGG CCC AAC OGC GGG GGC TGT GAG CAG CGG TGC CTC AAC ACC Asp Glu Cys Ser Arg Pro Asn Arg Gly Gly Cys Glu Gin Arg Cys Leu Asn Thr 1745 1760 1775 CTG GGC AGC TAC AAG TGC AGC TGT GAC CCC GGG TAC GAG CTG GCC CCA GAC AAG Leu Gly Ser iyr Lys Cys Ser cys Asp Pro Gly Tyr Glu Leu Ala Pro Asp Lys 1790 1805 1820 1835 OGC CGC TGT GAG GCT GCT TGT GGC GGA TTC CTC ACC AAG CTC AAC GGC TCC ATC Arg Arg cys Glu Ala Ala cys Gly Gly Fhe Leu Thr Lys Leu Asn Gly Ser Ile 1850 1865 1830 1895 ACC AGC CCG GGC TGG CCC AAG GAG TAC CCC CCC AAC AAG AAC TGC ATC TGG CAG Ihr Ser Pro Gly Trp Pro Lys Glu Tyr Pro Pro Asn Lys Asn cys Ile Trp Gin 1910 1925 1940 CTG GTG GCC CCC ACC CAG TAC OGC ATC TCC CTG CAG TTT GAC TTC TTT GAG ACA Leu Vai Ala Pro Thr Gin Tyr Arg Ile Ser Leu Gin Phe Asp Fhe Fhe Glu Thr 1955 1970 19S5 !000 Z*> I— GC-C AAT GAT GTG TGC AAG TAC GAC TTC GTG GAG GTG CGC AGT GGA CTC ACA Glu Gly Asn Asp Vai Cys Lys Tyr Asp Phe Vai G1U Vai Arg Ser Gly Leu Ihr 1015 z >030 1045 GCT GAC TCC AAG CIG CAT GGC AAG TTC TGT GGT TCT GAG AAG CCC GAG GTC ATC Ala Asp Ser Lys Leu His Gly Lys Phe Cys Gly Ser Glu Lys Pro Glu Vai Ile

102

2060 2075 20902105

ACC TCC CAG TAC AAC AAC AIG OGC GIG GAG TTC AAG TCC GAC AAC AOC GTC TCC Ihr Ser Gin Tyr Asn Asn MET Arg Val Glu Phe lys Ser Asp Asn Ihr Val Ser

2120 2135 21502165

AAA AAG GGC TTC AAG GCC CAC TTC TTC TCA GAA AAG AGG CCA GCT CIG CAGCCC

Lys Lys Gly Phe Lys Ala His Phe Phe Ser Glu Lys Arg Pro Ala Leu GinPro

2180 21952210

CCT CGG GGA OSC CCC CAC CAG CTC AAA TTC OGA GIG CAG AAA AGA AAC CGGACC

Pro Arg Gly Arg Pro His Gin Leu Lys Fhe Arg Val Gin Lys Arg Asn ArgIhr (730)

2225 2235 2245 2255 2265 22752285

CCC CAG TCAGGCCTCC CAGGCCTCCC GGACCCCTTC TIACTCAGGA ACCTCACCIT GGAOGGAATC Pro Gin

2295 2305 2315 2325 2335 234523Ξ5

GGATCGGGGC TTCGGTGCCC ACCAACCCCC CACCTCCACT CIGCCAITCC GGCCCACCTC CCTCIGGCCG

2365 2375 2385 2395 2405 24152425

GACAGAACTG GTCCTCTCTT CTCCCCACTG TGCCCGTCCG CGGACCGGGG ACCCTTCCCC GIGCCCIACC

2435 2445 2455 2465 2475 24852495

CCCTCCCATT TTCATCGIGT CTCIGACAIT TCCIGITCTC AAGTAAAAGA GGGACCCCIG CGICCIGCCT

CTAGA (c) desde o nucleotido número 356 até ao nucleotido número 1543 representados a seguir:

Qua· 7

-104/

QUADRO N<? 7

10 20 ?0 40 50

GTCGACTCTA GAGIGIGIGT CAGCACTTGG CTGGGGACIT CTIGAACTIG

60 70

CAGGGAGAAT AACITGCGCA

90 100 110

120

CCCCACITTG CGCOGGTGCC TITGCCCCAG CGGAGCCIGC TTCGCCATCT

130 140

CCGAGCCCCA CCGCCCCICC

150 160 170 180 190

ACTCCTCGGC CTTGCCCGAC ACTGAGACGC TGTTCCCAGC GTGAAAAGAG

200 210

AGACTGCGCG GCOGGCACCC

220 230 240 250 260 7. » * /*/*' ry~* XJ-.-GOGCCA

290

300

310

320

330

340 350

TCCAIGZGGA OGCTCITTCA ATGGAOGTGT CCCCGCGIGC TTCITAGACG GACTGCGGTC TCCTAAAGG (1) 370 385 400

CGACC ATG GIG GCC C-GG ACC CC-C TGT CIT CTA GOG TTG CIG CTT CCC CAG GTC

ΜΞΓ Vai Ala Gly Thr Arg Cys Leu Leu Ala Leu Leu Leu Pro Gin Vai

415 430 445 CTC CTG GGC GGC GOG GCT GGC CTC GIT COG GAG CIG GGC CGC AGG AAG TTC GOG leu Leu Gly Gly Ala Ala Gly Leu Vai Pro Glu Leu Gly Arg Arg Lys Phe Ala 460 475 490 505 GOG GOG TOG TCG GGC CGC CCC TCA TCC CAG CCC TCT GAC GAG GTC CIG AGC GAG Ala Ala Ser Ser Gly Arg Pro Ser Ser Gin Pro Ser Asp Glu Vai Leu Ser Glu 520 535 550 565 TTC GAG TTG CGG CTG CTC AGC ATG TTC GGC CIG AAA CAG AGA ACC CCC AGC Phe Glu Leu Arg Leu Leu Ser MET Phe Gly Leu Lys Gin Arg Pro Thr Pro Ser 580 595 610 AGG GAC GCC GIG GIG CCC CCC TAC ATG CIA GAC CIG TAT CGC CAC TOG GGT Arg Asp Ala Vai Vai Pro Pro iyr Ι-ΈΤ leu Asp Leu Tyr Arg Arg His Ser Gly 625 640 655 670 CAG CCG GGC TCA CCC GCC CCA GAC CAC Laáj TIG /*51 f* Urtw AGG GCA GCC AGC OGA GCC Gin Pro Gly Ser Pro Ala Pro Asp His Δ*-*-*· Leu Glu Aro Ala Ala Ser Arg Ala 685 700 715 AAC Acr GIG CGC 51 /*«*5 TTC CAC CAT GAA GAA TCT TTG GAA GAA CIA CCA GAA AOG Asn Thr Vai Arg Ser Phe His His G1U Glu Ser Leu Glu Glu Leu Pro Glu Thr

730

745

760

775

-105

AGT GGG AAA ACA ACC CGG AGA TTC TTC TTT AAT TTA AGT TCT ATC CCC ACG GAG Ser Gly Lys Thr Thr Arg Phe Phe Phe Asn Leu Ser Ser Ile Pro Ihr Glu 790 805 820 835 GAG TTT ATC ACC TCA GCA GAG CTt CAG GTT TTC CGA GAA CAG ATC CAA GAT GCT Glu Phe Ile Thr Ser Ala Glu Leu’ Gin Vai Phe Arg Glu Gin MET C-ln Asp Ala 850 865 880 TTA GGA AAC AAT AGC AGT TTC CAT CAC CGA ATT AAT ATT TAT /-·> (ολλ ATC ATA AAA Leu Gly Asn Asn Ser Ser Phe His His Arg Ile Asn Ile iyr Glu Ile Ile Lys 895 910 925 940 CCT GCA ACA GCC AAC TCG AAA TTC CCC GTC ACC AGT CIT TTC GAC ACC AGG TTG Fro Ala Thr Ala Asn Ser Lys Phe Pro Vai Ihr Ser Leu Leu Asp Ihr Arg Leu 955 970 985 GTC AAT CAG AAT GCA AGC AGG TCG GAA AGT TTT 1 GTC ACC CCC C-CT GTC Vai Asn Gin Asn Ala Ser Arg Trp Glu Ser Phe Asp Vai Ihr Pro Ala Vai MET 1000 1015 1030 1045 CGG TCG ACT CAG GGA CAC GCC AAC CAT GGA TTC GTC GTC GAA GTC GCC CAC Arg Trp Ihr Ala Gin Gly His Ala Asn His Gly Fhe Vai Vai Glu Vai Ala His 1060 1075 1090 1105 TTC GAG GAG AAA CAA GGT GTC TCC AAG AGA CAT GIT AGG ATA AGC AGG TCT TTC Leu Glu Glu Lys Gin Gly Vai Ser Lys Arg His Vai Arg Ile Ser Arg Ser Leu 1120 1135 1150 CAC CAA GAT GAA CAC AGC TCG TCA CAG ATA AGG CCA TTC CIA CTA ACT TTT GGC His Gin Asp Glu His Ser Trp Ser Gin Ile Arg Pro Leu Leu Vai Ihr Phe Gly 1165 1180 1195 1210 CAT GAT GGA AAA GGG CAT CCT CTC CAC AAA AGA GAA AAA CCT CAA GCC AAA CAC His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg Gin Ala Lys His 1 .225 1 .240 1 .255 AAA CAG AAA CGC CTT AAG TCC AGC TCT AAG AGA CAC CCT TTC TAC GTC GAC Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Çys Lys Arg His Pro Leu Tyr Vai Asp

1270 1285 1300 1315

TTC AGT GAC GTC GGG TCG AAT GAC TGG ATT GTG GCT CCC CCG GGG TAT GAC GCC Phe Ser Asp Vai Gly Trp Asn Asp Trp Ile Vai Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala

1330 1345 1360 1375

TTT TAC TCC CAC GGA GAA TCC CCT TTT CCT CTC GCT GAT CAT CTC AAC TCC ACT

Phe Tyr Cys His Gly Glu Çys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Ihr

1390 1405 1420

AAT CAT GCC ATT GTT CAG ACG TTC GTC AAC TCT GTT AAC TCT AAG ATT CCT AAG

Asn His Ala Ile Vai Gin Ihr Leu Vai Asn Ser Vai Asn Ser Lys Ile Pro Lys

1435

1450

1465

1480

-106GCA TCC TCT GTC COG ACA GAA CTC AGT GCT ATC TCG ATC CTG TAC CIT GAC GAG

Ala Cys Çys Vai Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser MET Leu Tyr Leu Asp Glu

1495 _t 1510 1525

AAT GAA AAG GIT GIA ΊΤΑ AAG AAC TAT CAG GAC ATC GTT GTC GAG GGT TCT GGG

Asn Glu Lys Vai Vai Leu Lys Asn Tyr Gin Asp ΜΞΓ Vai Vai Glu Gly Cys Gly

1540(396) 1553 1563 1573 15S3 1593 1603

TGT OGC TAGIACAGCA ΑΑΑΊΤΑΑΑΤΑ CATAAATATA TATATATATA TATALTTTAG AAAAAAGAAA Cys Arg

AAAA (d) desde o nucleotido número 403 até ao nucleotido número 1626 representados a seguir:

Qua.8

-107QUADRO N9 8

10 20 30 40 50 6070

CTCTAGAGGG CAGAGGAGGA GGGAGGGÀGG GAAGGAGOGC GGAGCCCGGC CCGGAAGCTA GGTCACTCTG

80 90 100 110 120 130140

GCATCOGAGC TGAGGGAOGC GAGCCTCAGA OGCCGCTCCT GCTCOGGCTC ACTATCTAGC TTCTCTCCCC

150 160 170 180 190 200210

GATGGGATTC CCCTCCAAGC TATCTCGAGC CTCCAGCGCC ACAGTCCCCG GCCCTOGCCC AGCTTCACTG

220 230 240 250 260 270280

CAACCCTTCA GAGCTCCCCA GGAGCTGCTC CTC-GCGAGCC CGCTACTGCA GC-GACCTATC GAGCCATTCC

290 300 310 320 330 3403Ξ0

CTACTGCCAT CCCGAGCAAC GCACTCCTGC AGCITCCCTG AGCCTTTCCA. GCAAGTUGT TCAAGATTGG

360 370 380 390 400(1)

CTCTCAAGAA TCATCGACTG TTATTATATG CCTIGTCTTC TCTCAAGACA CC ATC ATT

MET Ile

CCT

Pro

417 432 447 462 GCT AAC OGA ATG CTC ATG GTC GTT ΊΤΑ TTA TCC CAA GTC CTC CTA GGA GGC GCG Gly Asn Arg MET Leu MET Vai Vai Leu Leu Cys Gin Vai Leu Leu Gly Gly Ala 477 492 507 AGC CAT GCT ACT TTC ATA CCT GAG ACG GGG AAG AAA AAA GTC C-CC GAG ATT CAG Ser His Ala Ser Leu Ile Pro Glu Thr Gly Lys Lys Lys Vai Ala Glu Ile Gin 522 537 552 567 GGC CAC GCG GGA GGA CGC CGC TCA GGG CAG AGC CAT GAG CTC CTC CGG GAC' TTC Gly His Ala Gly Gly Arg Arg Ser Gly Gin Ser His Glu Leu Leu Arg Asp Phe 582 597 612 627 GAG GOG ACA CIT CTC CAG ATC ΤΊΤ GGG CTG OGC CGC OGC COG CCT AGC AAG Glu Ala Ihr Leu Leu Gin MET Phe Gly Leu Arg Arg Arg Pro Gin Pro Ser Lys

642 657 672

ACT GCC CTC ATT COG GAC TAC ATC OGG GAT CTT rr-H OGG CTT /S* /* TCT GGG GAG Ser Ala Vai Ile Pro Asp Tyr MET Arg Asp Leu Tyr Arg Leu C-ln Ser Gly Glu 687 702 717 732 GAG GAG GAA GAG CAG ATC CAC AGC ACT GCT L'l‘i' GAG TAT CCT CGC CCG GCC Glu Glu Glu Glu Gin Ile His Ser Thr Gly Leu Glu Tyr Pro Glu Arg Pro Ala

108-

747 762 777

AGC OGG GCC AAC ACC GTG AGG AGC TTC CAC CAC GAA GAA CAT CTG GAG AAC ATC Ser Arg Ala Asn Thr Vai Arg Ser Phe His His Glu Glu His Leu Glu Asn Ile 792 807 822 837 CCA Λ·»/-*/” ACC AGT GAA AAC TCT GCT TTT OGT TTC CTC TTT AAC CTC AGC AGC ATC Pro Gly Thr Ser Glu Asn Ser Ala Phe Arg Phe Leu Phe Asn Leu Ser Ser Ile 852 867 882 897 CCT GAG AAC GAG GCG ATC TCC TCT GCA GAG CIT CGG CTC TTC CGG GAG GTG Pro Glu Asn Glu Ala Ile Ser Ser Ala Glu Leu Arg Leu Phe Arg Glu Gin Vai 912 927 942 GAC CAG GGC CCT GAT TGG GAA AGG GGC TTC CAC CGT ATA AAC ATT TAT GAG GTT Asp Gin Gly Pro Asp Trp Glu Arg Gly Phe His Arg Ile Asn Ile Tyr C-lu Vai 957 972 9S7 1002 AAG CCC GAA GTG GTG CCT /·*/*/· Lvc CAC CTC ATC λΟλ CGA CTA CTG GAC MET Lys Pro Pro Ala Glu Vai Vai Pro Gly His Leu Ile Thr Arg leu Leu Asp 1017 ] .032 1047 ACG AGA CTG GTC CAC CAC AAT GIG aGA CGG TGG GAA ACT r ι 1 ·ι;ι GAT GTG AGC CCT Thr Arg Leu Vai His His Asn Vai Thr Arg Trp Glu Thr Phe Asp Vai Ser Pro 1062 1077 1092 1107 GCG GTC CTT CGC TGG ACC CGG GAG AAG CAG CCA AAC TAT GGG CTA GCC ATT GAG Ala Vai Leu Arg Trp Thr Arg Glu Lys Gin Pro Asn Tyr Gly Leu Ala Ile Glu

1122 1137 1152 1167

GTG ACT CAC CTC CAT CAG ACT CGG ACC CAC CAG GGC CAG CAT GTC AGG ATT AGC Vai Thr His Leu His Gin Thr Arg Thr His Gin Gly Gin His Vai Arg Ile Ser 1182 1197 1212 OGA TCG ΊΤΆ CCT CAA GGG AGT GGG AAT TGG GCC CAG CTC OGG CCC CTC CIG GTC Arg Ser Leu Pro Gin Gly Ser Gly Asn Trp Ala Gin Leu Arg Pro Leu Leu Val 1227 1242 1257 1272 ACC TTT GGC CAT GAT GGC OGG GGC CAT GCC TIG ACC OGA CGC CGG AGG GCC AAG Thr Phe Gly His Asp Gly Arg Gly His Ala Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ala Lys 1287 1302 1317 CGT AGC CCT AAG CAT CAC TCA CAG CGG GCC AGG AAG AAG AAT AAG AAC TGC OGG Arg Ser Pro Lys His His Ser Gin Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys Arg 1332 1347 1362 1377 CGC CAC TCG CTC TAT GIG Cxnv- TTC AGC GAT GIG GGC TGG AAT GAC TGG ATT GIG Arg His Ser leu Tyr Vai Asp Phe Ser Asp Vai Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val

1392 1407 1422 1437 GCC CCA CCA GGC TAC CAG GCC TTC TAC TGC CAT GGG GAC TGC CCC TTT CCA CTG Ala Pro Pro Gly Tyr Gin Ala Phe Tyr Cys His Gly Asp Cys Pro Phe Pro Leu

-109-

1452 14671482

GCT GAC CAC CTC AAC TCA ACC AAC CAT GCC ATT GTG CAG ACC CTG GTC AAT TCT Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Vai Gin Thr Leu Vai Asn Ser

1497 1512 15271542

GTC AAT TCC AGT ATC CCC AAA GCC TGT TGT GTG CCC ACT GAA CTG AGT GCCATC

Vai Asn Ser Ser Ile Pro Lys Ala Cys Cys Vai Pro Thr Glu Leu Ser AlaIle

1557 15721587

TCC ATG CIG TAC CTG GAT GAG TAT GAT AAG GTG GTA CTG AAA AAT TAT CAGGAG

Ser ΜΞΤ leu Tyr Leu Asp Glu Tyr Asp Lys Vai Vai Leu Lys Asn Tyr GinGlu

1602 1617 (394) 1636 1646 16561666

ATG GTA GTA GAG GGA TGT GGG TGC CGC TGAGATCAGG CAGTCCTTGA GGATAGACAG ATATACACAC

ΜΞΤ Vai Vai Glu Gly Cys Gly cys Arg

1676 1686 1696 1706 1716 17261736

CACACACACA CACCACAIAC ACCACACACA CACGGTCCCA TCCACTCACC CACACACTAC ACAGACIGCT

1746

1756

1766

1776

1786

1796

1806

1816 1826 1836 1846 1856 1866 1876

ACCTTATTTA TGAdTIACG TGCAAATGTT TIGACCATAT TGATCAIATA TTTTGACAAA ΑΤΑΤΑΤΤΣΑΤ

1886 1896 1906 1916 1926 1936 1946

AACTACGTAT TAAAAGAAAA AAATAAAATG AGTCATIATT TTAAAAAAAA AAAAAAAACT CTAGAGTCGA

B OGGAATTC (e) desde o nucleótido número 414 até ao nucleótido número 746 representados a seguir:

Quad.4a

Quadro 4a

284 294 3Q4 (112) 319

CTAACCTCTG TTCTCCCTTT TOCTTCCTAG TCT TTC AAG CCA TCA AAT CAC GCT ACC Ser Leu Lys Pro Ser Asn His Ala Thr

334 349 364 ATC CAG ACT ATA GTG AGA GCT CTG GGG CTC GTC CCT GGA ATC CCC Ile C-ln Ser Ile Vai Arg Ala Vai Gly Vai Vai Pro Gly Ile Pro 394 409 424 TCT CTG CCA GAA AAG ATG TCC TCA CTC AGC ATC TTA TTC ΤΓΤ GAT Cys Vai Pro Glu Lys Ι-ΞΤ Ser Ser Leu Ser Ile Leu Phe Phe Asp 454 469 4 = 4 AAT CTG CTA CCT AAA CTA rr*·* CCA AAC » «-T-y— ACA CTA GAC- TCT /TV·*—' Asn Vai Vai Leu Lys Vai Tyr Pro Asn Ι-ΞΤ . G — Glu Ser Cys

503

513

379

GAG CCT TCC

Glu Pro Cys

439

GAA AAC AAG Glu Asn Lys

523 533 e desde o nucleotido numero 305 até ao nucleotido número 493 representados a seguir:

Quad- 4b

-111-

Quadro .4 b

383 393 403413

GAGGAGGAAG OGGTCTACGG GGGTCCTTCf GCCTCTGCAG (1) 428

AAC AAT GAG CTT CCT GGG GCA

Asn Asn Glu Leu Pro Gly Ala

443 458 473 488 GAA TAT CAG TAC AAG GAG GAT GAA GTA TGG GAG GAG AGG AAG CCT TAC AAG ACT Glu iyr Gin Tyr Lys Glu Asp Glu Vai Trp Glu Glu Arg Lys Pro Tyr Lys Thr 503 518 533 CTT CAG ACT CAG CCC CCT GAT > * /ΛΛΟ AGT AAG AAC AAA AAG AAA /-»·* r» AGG AAG GGA Leu Gin Thr Gin Pro Pro Asp Lys Ser Lys Asn Lys Lys Lys C-ln Arg Lys Gly 548 563 573 593 CCT CAG CAG AAG AGT CAG ACG CTC CAG ΤΓΤ GAT GAA CAG ACC CTG AAG AAG C-QA Pro Gin Gin Lys Ser Gin Thr Leu Gin Rie Asp Glu Gin Thr leu Lys Lys Ala 608 623 638 AGA AGA AAG CAA TGG ATT GAA CCC CGG AAT TGT GCC AGA CGG TAC CTT AAA GTG Arg Arg Lys Gin Trp Ile Glu Pro Arg Asn cys Ala Arg Arg Tyr Leu Lys Vai 6=3 668 683 698 GAC t f i v·» GCA GAT ATT GGC TGG ?./*<» AkSV GAA TC-G ATT ATT TCC CCC AAG TCC TTC GAT Aso Phe Ala Aso Ile Gly n*s***i A ItaZ Ser Glu Trp Ile Ile Ser Pro Lys Ser Phe Asp

713 728 743 (111) 756766

GCC TAT TAC TGC TCC GGA GCG TGC CAG TTC CCC ATG CCA AAG GTAGCCATTG THTTTGTCC

Ala Tyr Tyr Cys Ser Gly Ala Cys Gin Fhe Pro MET ProLys

776786

TGTCCTTCCC ATTTCCATAG

8.- Processo para a preparação de uma composição farmacêutica apropriada para o tratamento de deficiências ósseas, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade efectiva de um factor obtido de acordo com uma qualquer das reivindicações

1, 2, 3, ou 4 com uma matriz, aceitável em farmácia, capaz de li bertar o referido factor no local da deficiência óssea.

9.- Vector de transformação,caracterizado pelo facto de conter uma sequência de cDNAque codifica uma proteína capaz de exibir características biológicas e bioquímicas de factor de indução óssea e de a referida sequência de cDNA ser uma sequência nucleotídica contínua igual ou substancialmente igual a uma sequência escolhida de entre um grupo formado pelas sequências nucleotídicas seguintes:

(a) desde o nucleotido número 36 até ao nucleotido número 2225 representados a seguir:

Qua.6

-113-

QUADRO N9 6

10 20 30 (1)

CTAGAGGCCG citccctogc ogcogcoccg CCAGC ATC

CCC GGC GTC GCC CGC CTC CCG

MET Pro Gly Vai Ala Arg Leu Pro

65 80 95 110 CTC CTC CTC GGG CTC CTC CTC CTC CCG OGT CCC GGC OGG COG CTC GAC TTC GCC Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Pro Arg Pro Gly Arg Pro Leu Asp Leu Ala 125 140 155 GAC TAC ACC TAT GAC CTC GOG GAG GAG GAC GAC TOG GAG CCC CTC AAC TAC AAA Asp Tyr Thr Tyr Asp Leu Ala Glu Glu Asp Asp Ser Glu Pro leu Asn Tyr Lys 170 185 200 215 GAC CCC TCC AAG GCG GCT GCC TTT CIT GGG GAC ATT GCC CTC GAC GAA GAG GAC Asp Pro cys Lys Ala Ala Ala Phe Leu Gly Asp Ile Ala Leu Asp Glu Glu Asp 230 245 260 275 CTC AGG GCC TTC CAG GTA CAG CAG GCT GTG GAT CTC AGA OGG CAC ACA GCT CGT Leu Arg Ala Phe Gin Vai Gin Gin Ala Vai Asp leu Arg Arg His Thr Ala Arg 290 305 320 AAG TCC TCC ATC AAA GCT GCA GTT CCA GGA AAC ACT TCT ACC CCC AGC TCC CAG Lys Ser Ser Ile Lys Ala Ala Vai Pro Gly Asn Thr Ser Thr Pro Ser cys Gin 335 350 365 380 AGC ACC AAC GGG CAG CCT CAG AGG GGA GCC TCT (jCaj AGA TCG AGA GGT AGA TCC Ser Ώιτ Asn Gly Gin Pro Gin Arg Gly Ala cys Gly Arg Trp Arg Gly Arg Ser 395 410 425 CGT AGC CGG CGG GCG GCG ACG TCC OGA OCA GAG OGT GTC TCG CCC GAT GGG GTC Arg Ser Arg Arg Ala Ala Thr Ser Arg Pro Glu Arg Vai Trp Pro Asp Gly Vai 440 455 470 485 ATC CCC TTT GTC ATT GGG GGA AAC TTC ACT GGT AGC CAG AGG GGA GTC TTC .OGG Ile Pro Fhe Vai Ile Gly Gly Asn Fhe Thr Gly Ser Gin Arg Ala Vai Fhe Arg 500 515 530 545 CAG GCC ATC ΛΛ7 CAC TCG GAG AAG CAC ACC TCT GTC ACC TTC CTC GAG CGC ACT Gin Ala MET Arg His Trp Glu Lys His Thr cys Vai Thr Fhe leu G1U Arg Thr 560 575 590 GAC GAG z*n z·» UÃV AGC TAT ATT GTG TTC ACC TAT OGA CCT TCC GGG TC? TCC TCC TAC Asp Glu Asp Ser Tyr Ile Vai Fhe Thr Tyr Arg Pro cys Gly Cys cys Ser Tyr 605 620 635 650 GTG GGT CGC CGC GGC GGG LájC CCC CAG GCC ATC TCC ATC GGC AAG AAC TCT GAC Vai Gly Arg Arg Gly Gly Gly Pro Gin Ala Ile Ser Ile Gly Lys Asn Cys Asp

-114y

665 680 695

AAG TTC GGC ATT GTC GTC CAC GAG CTC GGC CAC GTC GTC GGC TTC TCG CAC GAA lys Phe Gly Ile Vai Vai His Glu Leu Gly His Val Val Gly Phe Trp His Glu 710 725 740 755 CAC ACT OGG CCA GAC OGG GAC OGC CAC GTT TCC ATC GIT OGT GAG AAC ATC CAG His Ihr Arg Pro Asp Arg Asp Arg His Vai Ser Ile Val Arg Glu Asn Ile Gin 770 785 800 815 CCA GGG CAG GAG TAT AAC TTC CTC AAG ATC GAG CCT CAG GAG GTC GAG TCC CTC Pro Gly Gin Glu Tyr Asn Phe Leu Lys ΜΕΓ Glu Pro Gin Glu Val Glu Ser Leu 830 845 860 GGG GAG ACC TAT GAC TTC GAC AGC ATC ATC CAT TAC GCT OGG AAC ACA TTC TCC Gly G1U Ihr Tyr Asp Phe Asp Ser Ile MET His iyr Ala Arg Asn Ihr Phe Ser 875 890 905 920 AGG GGC ATC TTC CTG GAT ACC ATT GTC CCC AAG TAT /** /** LAb GTC AAC Uíjvt GTC AAA Arg Gly Ile Phe Leu Asp Ihr He Vai Pro Lys Tyr Glu Val Asn Gly Val Lys 935 950 965 CCT CCC ATT GGC CAA AGG ACA CGG CTC AGC AAG GGG GAC ATT CAA GCC CGC Pro Pro Ile Gly Gin Arg Tnr Arg Leu Ser Lys Gly Asp Ile Ala Gin Ala Arg 980 995 1010 1025 AAG CTT TAC AAG TCC CCA GCC TCT GGA GAG ACC CTC CAA GAC AGC ACA GGC AAC Lys Leu Tyr Lys çys Pro Ala Çys Gly Glu Ihr Leu Gin Asp Ser Ihr Gly Asn 1040 1055 1070 1085 TTC TCC TCC CCT GAA TAC CCC AAT GGC TAC TCT GCT CAC ATC CAC TCC GTC TCG Phe Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Asn Gly Tyr Ser Ala His MET His Çys Val Trp 1100 1115 1130 CGC ATC TCT GTC ACA CCC GGG GAG AAG ATC ATC CTC AAC TTC AGG TCC CTC GAC Arg Ile Ser Vai Ihr Pro C-ly Glu Lys He Ile Leu Asn Phe Ihr Ser Leu. Asp 1145 1 .160 1 .175 I .190 CTC TAC OGC AGC OGC CTC TCC TCG TAC GAC TAT GTC GAG GTC OGA t» UA-l GGC TTC leu Tyr Arg Ser Arg Leu Çys Trp Tyr Asp iyr Val Glu Val Arg Asp Gly Phe

1205 12201235

TGG AGG AAG GCG CCC CTC OGA GGC CGC TTC TCC GGG TCC AAA CTC CCT GAG CCT Trp Arg Lys Ala Pro Leu Arg Gly Arg Phe Cys Gly Ser Lys Leu Pro Glu Pre

1250 1265 12801295

ATC GTC TCC ACT GAC AGC OGC CTC TCG GIT GAA TTC CGC AGC AGC AGC AATTCG

Ile Vai Ser Ihr Asp Ser Arg Leu Trp Vai Glu Phe Arg Ser Ser Ser AsnTrp

1310 1325 13401355

GIT GGA AAG GGC TTC TTT GCA GTC TAC GAA GCC ATC TCC GGG GCT GAT GTCAAA

Vai Gly Lys Gly Phe Phe Ala Vai Tyr Glu Ala He Cys Gly Gly Asp VaiLys

-1151370 1385 1400

AAG GAC TAT GGC CAC ATT CAA TCG CCC AAC TAC CCA GAC GAT TAC OGG CCC AGC Lys Asp iyr Gly His Ile Gin Ser Pro Asn Tyr Pro Asp Asp Tyr Arg Pro Ser 1415 1430 1445 1460 AAA GTC TCC ATC TCG CGG ATC CAG GTC TCT GAG GGC TTC CAC GTC GGC CTC ACA Lys Vai Cys Ile Trp Arg Ile Gin Vai Ser Glu Gly Fhe His Vai Gly Leu Thr 1475 1490 1505 TTC CAG TCC TTT GAG ATT GAG OGC CAC GAC AGC TCT GCC TAC GAC TAT CTC GAG Fhe Gin Ser Fhe Glu Ile Glu Arg His Asp Ser Cys Ala Tyr Asp iyr Leu Glu 1520 1535 1550 1565 GTC OGC GAC ϋϋό CAC AGT GAG AGC AGC ACC CTC ATC GGG CGC TAC TCT GGC TAT Vai Arg Asp Gly His Ser Glu Ser Ser Thr Leu Ile Gly Arg Tyr cys Gly Tyr 1530 1595 1610 1625 · Z-, CCT GAT GAC ATC AAG Λχλ- ACG TCC AGC CGC CTC TCG CTC AAG TTC GTC Glu Lys Pro Asp Asp Ile Lys Ser Thr Ser Ser Arg leu Trp Leu Lys Fhe Vai 1640 1655 1670 TCT GAC GGG TCC ATT AAC AAA GOG TTT GCC GTC AAC ryrfrn ÍTTV’ AAA GAG GTG Ser Asp Gly Ser Ile Asn Lys Ala Gly Phe Ala Vai Asn Phe Fhe Lys Glu Vai 1685 1700 1715 1730 GAC GAG TCC TCT CGG CCC AAC OGC GGG GGC TGT GAG CAG OGG TCC CTC AAC ACC Asp Glu cys Ser Arg Pro Asn Arg Gly Gly cys Glu Gin Arg cys Leu Asn Thr 1745 1760 1775 CTG GGC AGC TAC AAG TCC AGC TCT GAC CCC GGG TAC GAG CTC GCC CCA GAC AAG Leu Gly Ser Tyr Lys Cys Ser cys Asp Pro Gly Tyr Glu Leu Ala Pro Asp Lys 179( D 1805 1820 1835 OGC CGC TGT GAG GCT GCT TGT GGC GGA TIC CTC ACC AAG CIC AAC GGC TCC ATC Arg Arg cys Glu Ala Ala cys Gly Gly Phe Leu Thr Lys Leu Asn Gly Ser Ile 1850 1865 1880 1895 ACC AGC CCG GGC TGG CCC AAG GAG TAC CCC CCC AAC AAG AAC TCC ATC TGG CAG Thr Ser Pro Gly Trp Pro Lys Glu lyr Pro Pro Asn Lys Asn cys Ile Trp Gin 1910 1925 1940 CTG GTG GCC CCC ACC CAG TAC OGC ATC TCC CTC CAG TTT GAC TTC TTT GAG ACA Leu Vai Ala Pro Thr Gin Tyr Arg Ile Ser Leu Gin Fhe Asp Phe Fhe Glu Thr 1955 1970 1985 2000 GAG GGC AAT GAT GTC TCC AAG rr·* r· GAC TTC GTC GAG GTC OGC AGT GGA CTC ACA Glu Gly Asn Asp Vai Cys Lys Tyr Asp Fhe Vai Glu Vai Arg Ser Gly Leu Thr >015 2030 2 !045 GCT GAC TCC AAG CTC CAT GGC AAG TTC TGT GGT TCT GAG AAG CCC GAG CTC ATC Ala Asp Ser Lys Leu His Gly Lys Fhe cys Gly Ser Glu Lys Pro Glu Vai Ile

2060 2075 20902105

ACC TCC CAG TAC AAC AAC ATC OGC GTC GAG TTC AAG TCC GAC AAC ACC GIG TCC

Thr Ser Gin Tyr Asn Asn MET Arg Vai Glu Fhe lys Ser Asp Asn Ihr Vai Ser

2120 2135 21502165

AAA AAG GGC ITC AAG GCC CAC TTC TTC TCA GAA AAG AGG CCA GCT CIG CAG CCC

Lys Lys Gly Fhe Lys Ala His Fhe Fhe Ser Glu Lys Arg Pro Ala Leu Gin Pro

2180 21952210

CCT OGG GGA OGC CCC CAC CAG CTC AAA TTC OGA GTC CAG AAA AGA AAC OGG ACC

Pro Arg Gly Arg Pro His Gin Leu Lys Fhe Arg Vai Gin Lys Arg Asn Arg Ihr (730)

2225 2235 2245 2255 2265 22752285

CCC CAG TCAGGCCTCC CAGGCCTCCC GGACCCCITC TIACTCAGGA ACCTCACCTT GGAOGGAATC Pro Gin

2295 2305 2315 2325 2335 23452355

GGATCGGGGC TTCGGTCOCC ACCAACCCCC CACCTCCACT CTCCCAITCC GGCCCACCIC CCTCTCGCCG

2365 2375 2385 2395 2405 24152425

GACAGAACTC GTCCTCICTT CTCCCCACIG TCCCCGTCCG CGGACOGGGG ACCCTTCCCC GTCCCCTACC

2435 2445 2455 2465 2475 24852495

CCCTCCCAIT TTCATCGTCT CrciGACATT TCCTCITCTC AAGTAAAAGA GGGACCCCTC OGTCCTCCCT

CTAGA (b) desde o nucleotido inúmero 356 até ao nucleotido numero 1543 representados a seguir:

Quad.7

QUADRO N9 7

10 20 70 40 50 60 70 CTCGACTCIA UAíjIGáVjXVíI¹ CAGCACTIGG CTGGGGACTT CTTGAACITG CAGGGAGAAT AACITGCGCA 80 90 100 110 120 130 140 CCCCACITIG CGCOGCTGCC TTIGCCCCAG OGGAGCCIGC TTCGCCATCT CCGAGCCCCA CCGCCCCTCC 150 160 170 180 190 200 210 ACICCICGGC CTIGCCOGAC ACIGAGAOGC TGTTCCCAGC GTGAAAAGAG AGACTGCGCG

230 240

C-GAGGCAAAG AAAAGGAAOG c-σ

290

TCCAIGIGGA

300 310

CGCTCTITCA ATGGACCTGT

320

CCCCGCCTGC

330

TTCITAGACG (1) 370 385 400

OGACC ATG GIG GCC GGG ACC CGC TCT CIT CTA GCG TTG CIG CTT CCC CAG GTC

MET Vai Ala Gly Thr Arg Cys Leu Leu Ala Leu Leu Leu Pro Gin Vai

415 430 445 CTC CIG GGC GGC GCG GCT GGC CTC GIT COG GAG CIG GGC CGC AGG AAG TTC GCG leu Leu Gly Gly Ala Ala Gly Leu Vai Pro G1U Leu Gly Arg Arg Lys Fhe Ala 460 475 490 505 GCG GCG TCG TCG GGC CGC CCC TCA TCC CAG CCC TCT GAC GAG GTC CIG AGC GAG Ala Ala Ser Ser Gly Arg Pro Ser Ser Gin Pro Ser Asp Glu Vai Leu Ser Glu 520 535 550 '565 TTC GAG TTG CGG CTG CTC AGC ATG TTC GGC CIG AAA CAG AGA CCC ACC CCC AGC Phe Glu Leu Arg Leu Leu Ser MET Phe Gly Leu Lys Gin Arg Pio Thr Pro Ser 580 595 610 AGG GAC GCC CTG GIG CCC CCC TAC ATG CIA GAC CIG TAT CGC AGG CAC TOG GCT Arg Asp Ala Vai Vai Pro Pro Tyr MET Leu Asp Leu Tyr Arg Arg His Ser Gly 625 640 655 670 CAG CCC GGC TCA CCC GCC CCA GAC CAC CGG TTG GAG AGG GCA GCC AGC CGA C-CC Gin Pro Gly Ser Pro Ala Pro Asp His Arg leu Glu Arg Ala Ala Ser Arg Ala 685 700 715 AAC ACT GIG CGC AGC TTC CAC CAT GAA GAA TCT TTG GAA GAA CTA CCA GAA ACG Asn Thr Vai Arg Ser Fhe His His Glu Glu Ser Leu Glu Glu Leu Pro Glu Thr

730

745

760

775

-118-

AGT GGG AAA ACA ACC CGG AGA TTC TTC TTT AAT TTA AGT TCT ATC CCC ACG GAG Ser Gly Lys Ihr Arg Arg Phe Phe Phe Asn Leu Ser Ser Ile Pro Ihr Glu 790 805 820 835 GAG ΊΤΓ ATC ACC TCA GCA GAC CTT CAG GTT TTC OGA GAA CAG ATC CAA GAT GCT Glu Phe Ile Thr Ser Ala Glu Leu' Gin Vai Phe Arg Glu Gin 1ET Gin Asp Ala 850 865 880 TTA GGA AAC AAT AGC AGT TTC CAT CAC CGA ATT AAT ATT TAT GAA ATC ATA AAA Leu Gly Asn Asn Ser Ser Phe His His Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Ile Ile Lys 895 910 925 940 CCT GCA ACA GCC AAC TCG AAA TTC CCC GTC ACC CTT TTC GAC ACC AGG TTC Pro Ala Ihr Ala Asn Ser Lys Phe Pro Vai Thr Ser leu Leu Asp Thr Arg Leu 955 970 985 GTC AAT CAG AAT GCA AC-C AGG TCG GAA AGT TTT GAT GTC ACC CCC C-CT GTC ATC Vai Asn Gin Asn Ala Ser Arg Trp Glu Ser Phe Asp Vai Thr Pro Ala Vai ΜΞΓ 1000 1015 1030 1045 CGG TCG ACT GCA CAG GGA CAC GCC AAC CAT GGA TTC GTG GTC GAA GTC GCC CAC Arg Trp Ihr Ala Gin Gly His Ala Asn His Gly Fhe Vai Vai Glu Vai Ala His 1060 1075 1090 1105 TTC GAG GAG AAA CAA GGT GTC TCC AAG AGA CAT GTT AGG ATA AGC AGG TCT TTG Leu G1U Glu Lys Gin Gly Vai Ser Lys Arg His Vai Arg Ile Ser Arg Ser Leu 1120 1135 1150 CAC CAA GAT GAA CAC AGC TCG TCA CAG ATA AGG CCA TTC CIA GTA ACT th GGC His Gin Asp Glu His Ser Trp Ser Gin Ile Arg Pro Leu Leu Vai Ihr Phe Gly

1165 1180 11951210

1225 12401255

AAA CAG CGG AAA CGC CTT AAG TCC AGC TCT AAG AGA CAC CCT TTC TAC GTG GAC Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Vai Asp

1270 1285 13001315

TTC AGT GAC GTG GGG TCG AAT GAC TCG ATT GTG GCT CCC CCG GGG TAT CAC GCC Phe Ser Asp Vai Gly Trp Asn Asp Trp Ile Vai Ala Pro Pro Gly iyr His Ala

1330 1345 13601375

TTT TAC TCC CAC GGA GAA TCC CCT TTT CCT CTG GCT GAT CAT CTG AAC TCCACT

Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn SerIhr

1390 14051420

AAT CAT GCC ATT GTT CAG ACG TTC GTC AAC TCT GTT AAC TCT AAG ATT CCTAAG

Asn His Ala Ile Vai Gin Ihr Leu Vai Asn Ser Vai Asn Ser Lys Ile ProLys

1435

1450

1465

1480 ι

-119GCA TGC TGT GTC CCG ACA GAA CTC AGT GCT ATC TCG ATG CTG TAC CTT GAC GAG

Ala cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser MET Leu iyr Leu Asp Glu

1495 1510 1525

AAT GAA AAG GTT GTA TTA AAG AAC TAT CAG GAC ATG GTT GTG GAG GGT TGT GC-G

Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gin Asp MET Val Val Glu Gly Cys Gly

1540(396) 1553 1563 1573 1583 1593 1603

TGT CGC TAGTACAGCA AAATTAAATA CAIAAATATA ΤΆΤΑΤΑΤΑΤΑ TATATTTTAG AAAAAAGAAA Cys Arg

AAAA (c) desde o nucleotido número 403 até ao nucleotido número 1626 representados a seguir:

Quad.8 /

* -120Quadro N9 8

10 20 30 40 50 60 70 CTCTAGAGGG CAGAGGAGGA GGGAGGGÀGG GAAGGAGCGC GGAGCCOGGC CCGGAAGCTA GGTCAGTCTC

90 100

110

120

130 140

GCATCCGAGC TCAGGGACCC GAGCCTCAGA OGCCGCIGCT GCICOGGCTC AGTATCIAGC TTCTCTCCCC

150

160 170

180

190

200

210

GATCGGAITC CCGTCCAAC-C TATCTOGAGC CTCCAGCGCC ACAGTCCCCG GCCCTCGCCC AGGTTCACTG

220

230 240

250

260 270 280

CAACCGTTCA GAGGTCCCCA GGAGCTCCIG CTCGCGAGCC

CGCTACTCCA GGGACCTATC

290 300 310 320 330 340 350

GTAGTCCCAT CCCGAGCAAC GCACTCCTCC AGCTTCCCTC AGCCTCTCCA GCAAGTTTCT TCAAGATTCG

360 370 380 390 400 (1)

CTCTCAAGAA TCATCGACTC TTATTATATC CCTTCTHTC TCTCAAGACA CC ATC AIT CCT MET Ile Pro

417 432 447 462 C-GT AAC CGA ATC CTC ATC GTC GTC ΤΣΑ ΊΤΑ TCC CAA GTC CTC CTA GGA GGC GOG Gly Asn Arg MET Leu MET Vai Vai Leu Leu Çys Gin Vai Leu Leu Gly Gly Ala 477 492 507 AGC CAT GCT AGT TTC ATA CCT GAG ACG GGG AAG AAA AAA GTC GCC GAG ATC CAG Ser His Ala Ser leu Ile Pro Glu Thr Gly Lys Lys Lys Vai Ala Glu Ile Gin Ô22 537 552 567 GGC CAC GOG GGA GGA OGC OGC TCA GGG CAG AC-C CAT CTC CTC CGG GAC TTC Gly His Ala Gly Gly Arg Arg Ser Gly Gin Ser His GlU Leu Leu Arg Asp Phe 582 597 612 627 GAG GOG ACA CTT CTC CAG ATC TTC GGG CTC CGC CGC CGC CCG <*·*. /-» CCT AGC AAG Glu Ala Thr Leu Leu Gin MET Phe Gly Leu Arg Arg Arg Pro Gin Pro Ser Lys 642 657 672 AGT GCC GTC ATC COG GAC TAC ATC OGG GAT CTT TAC CGG CTT r** z· TCT ΟΐΛί GAG Ser Ala Vai Ile Pro Asp Tyr MET Arg Asp Leu iyr Arg Leu Gin Ser Gly Glu 687 702 717 732 GAG GAG GAA GAG CAG ATC CAC AGC ACT CTT TAT CCT CGC CCG GCC Glu Glu Glu Glu Gin Ile His Ser Thr Gly Leu Glu iyr Pro C-lu Arg Pro Ala

-121-

747 762 777

AGC CGG GCC AAC ACC GTG AGG AGC TTC CAC CAC GAA GAA CAT CTG GAG AAC ATC Ser Arg Ala Asn ihr Vai Arg Ser Phe His His Glu Glu His Leu Glu Asn Ile 792 807 822 837 CCA GGG ACC AGT GAA AAC TCT GCT TTT CGT TTC CTC TTT AAC CTC AGC AGC ATC Pro Gly Ihr Ser Glu Asn Ser Ala lhe Arg Phe Leu Phe Asn Leu Ser Ser Ile 852 867 882 897 CCT GAG AAC GAG GOG ATC TCC TCT bui GAG CIT CGG CTC TTC CGG GAG CAG GTG Pro G1U Asn Glu Ala Ile Ser Ser Ala Glu Leu Arg Leu Phe Arg Glu Gin Vai 912 927 942 GAC CAG GGC CCT GAT TGG GAA AGG GGC ITC CAC CGT ATA AAC ATT TAT GAG GTT Asp Gin Gly Pro Asp Trp Glu Arg Gly Phe His Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Vai 957 972 9S7 1002 ATC- AAG CCC CCA GCA GAA GTG GTG CCT CAC CTC ATC aLA CGA CTA CTG GAC ΜΕΓ Lys Pro Pro Ala Glu Vai Vai Pro Gly His Leu Ile Ihr Arg Leu Leu Asp 1017 1032 1047 ACG AGA CTG GTC CAC CAC AAT GTG ACA CGG GAA ACT TCT GAT GTG AGC CCT Ihr Arg Leu Vai His His Asn Vai Ihr Arg Trp Glu Ihr Fhe Asp Vai Ser Pro 1062 1077 1092 1107 GOG GTC CIT CGC TGG ACC CGG GAG AAG CAG CCA AAC TAT GGG CIA GCC ATT GAG Ala Vai Leu Arg Trp Thr Arg Glu Lys Gin Pro Asn iyr Gly Leu Ala Ile Glu 1122 1137 1152 1167 GTG ACT CAC CTC CAT CAG ACT CGG ACC CAC UAkj GGC CAG CAT GTC AGG ATT AGC Vai Ihr His leu His Gin Ihr Arg Ihr His Gin Gly Gin His Vai Arg Ile Ser 1182 1197 1212 OGA TOG ΊΤΑ CCT CAA GGG AGT GGG AAT TGG GCC CAG CTC CGG CCC CTC CTG GTC Arg Ser Leu Pro Gin Gly Ser Gly Asn Trp Ala Gin Leu Arg Pro Leu Leu Vai 1227 1242 1257 1272 ACC TCT GGC CAT GAT GGC CGG GGC CAT GCC TTG ACC CGA CGC CGG AGG GCC AAG Ihr Phe Gly His Asp Gly Arg Gly His Ala Leu ihr Arg Arg Arg Arg Ala Lys 1287 1302 1317 CGT AGC CCT AAG CAT CAC TCA CAG OGG GCC AGG AAG AAG AAT AAG AAC TGC OGG Arg Ser Pro Lys His His Ser Gin Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys Arg 1332 1347 1362 1377 UoV CAC TOG CTC TAT GTG GAC TTC AGC lartX GTG GGC TGG AAT GAC TGG ΑΊΤ GTG Arg His Ser Leu Tyr Vai Asp Phe Ser Asp Vai Gly Trp Asn Asp 'TS-r. Ile Vai 1392 1407 1 .422 1437 GCC CCA CCA GGC TAC CAG GCC TTC TAC TGC CAT GGG GAC TGC CCC TCT CCA CTG Ala Pro Pro Gly Tyr Gin Ala Phe Tyr cys His C-ly Asp Cys Pro Phe Pro Leu

-1221452 14671432

GCT GAC CAC CTC AAC TCA ACC AAC CAT GCC ATT GTG CAG ACC CTG GTC AATTCT

Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Vai Gin Thr leu Vai AsnSer

1497 1512 15271542

GTC AAT TCC AGT ATC CCC AAA GCC TGT IGT GTG CCC ACT GAA CTG AGT GCCATC

Vai Asn Ser Ser Ile Pro Lys Ala Cys Çys Vai Pro Thr Glu Leu Ser AlaIle

1557 157215S7

TCCATGCTGTACCTGGATGAGTATGATAAGGTCGTACIGAAAAATTATCAGGAG

Ser MET Leu Tyr Leu Asp Glu Tyr Asp Lys Vai Vai leu Lys Asn Tyr Gin Glu

1602 1617 (394) 1636 1646 16561666

ATG GTA GTA GAG GGA TGT GGG TGC CGC TGAGATCAGG CAGTCCTTGA GGATAGACAG AIATACACAC

MET Vai Vai Glu Gly Cys Gly Çys Arg

1686

1716

1726 λ-*

1735

ACAGACIC-CT

1746 1756 1766 1776 1736 17961806

TCCTTATAGC TGGACimA ΤΠΑΑΑΑΑΑΑ AAAAAAAAAA AATGGAAAAA AuCOCTAAAC ATICACCTCG

1816 1326 1836 1846 1856 18661876

ACCTTATTTA TGACTTIACG TGCAAAIGTT TIGACCATAT TGAICAIAIA TTTTGACAAA ΑΤΑΙΑΤΠΑΤ

1886 1896 1906 1916 1926 19361946

AACIAOGIAT TAAAAGAAAA AAAIAAAATG ACTCATIATT TTAAAAAAAA AAAAAAAACT CIAGAGTCGA

CGGAAITC e de a referida sequência se ligar de uma forma atuante com uma sua sequência de o controlo de expressão.

10.- Sequência de cDNA, caracterizada pelo facto de codi ficar un factor de indução óssea e de conter una sequência nucleotídica contínua igual ou substancialnente igual a una sequencxa nucleotídica escolhida de entre un grupo constituído pelas sequencias nucleotídicas seguintes:

123 (a) desde o nucleotido número 36 até ao nucleotido número 2225 representados a seguir:

10 20 30 (1) 50

CTAGAGGCOG CTTCCCTCGC CGCOGCCCCG CCAGC ATG CCC GGC GIG GCC OGC CIG COG MET Pro Gly Val Ala Arg leu Pro

65 80 95 110 CTG CTG CTC GGG CTG CTG CTG CTC COG OGT CCC GGC OGG COG CTG GAC TTC GCC leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Pro Arg Pro Gly Arg Pro Leu Asp Leu Ala 125 140 155 GAC TAC ACC TAT GAC CTG GOG GAG GAG GAC GAC TCG GAG CCC CTC AAC TAC AAA Asp Tyr Ihr Tyr Asp Leu Ala G1U Glu Asp Asp Ser Glu Pro Leu Asn Tyr Lys 170 185 200 215 GAC CCC IGC AAG GOG GCT GCC TTT CTT GGG GAC ATT GCC CTC GAC GAA GAG GAC Asp Pro cys Lys Ala Ala Ala Bie Leu Gly Asp Ile Ala Leu Asp Glu Glu Asp 230 245 260 275 CTG AGG GCC TTC CAG GTA CAG CAG GCT GTG GAT CTC AGA CGG CAC ACA GCT OGT Leu Arg Ala íhe Gin Val Gin Gin Ala Val Asp Leu Arg Arg His Ihr Ala Arg 290 305 320 AAG TCC TCC ATC AAA GCT GCA GTT CCA GGA AAC ACT TCT ACC CCC AGC IGC CAG Lys Ser Ser Ile Lys Ala Ala Val Pro Gly Asn Ihr Ser Ihr Pro Ser cys Gin 335 350 365 380 AGC ACC AAC GGG CAG CCT CAG AGG GGA GCC TGT GGG AGA TCG AGA GGT AGA TCC Ser Ihr Asn Gly Gin Pro Gin Arg Gly Ala cys Gly Arg Trp Arg Gly Arg Ser 395 410 425 OGT AGC OGG OGG GOG GOG AOG TCC CGA CCA GAG OGT GIG TGG CCC GAT GGG GTC Arg Ser Arg Arg Ala Ala Ihr Ser Arg Pro Glu Arg Val Trp Pro Asp Gly Val 440 455 470 485 ATC CCC TTT GTC AIT GGG GGA AAC TTC ACT GGT AGC CAG AGG GCA GTC ITC .OGG Ile Pro íhe Val Ile Gly Gly Asn Phe Ihr Gly Ser Gin Arg Ala Val The Arg 500 515 530 545 CAG GCC ATG AGG CAC TGG GAG AAG CAC ACC TGT GTC ACC TTC CTC GIG CGC ACT Gin Ala MET Arg His Trp Glu Lys His Ihr cys Val Ihr Phe Leu Glu Arg Ihr 560 575 590 GAC GAG GAC AGC TAT ATT GTG TTC ACC TAT CGA CCT TGC GGG TGC TGC TCC TAC Asp Glu Asp Ser iyr Ile Val The Ihr Tyr Arg Pro cys Gly Cys Cys Ser Tyr 605 620 635 650 GTG CGC CGC Z” >“·?-· GGG GGC CCC CAG GCC ATC TCC ATC GGC AAG AAC TGT GAC Val Gly Arg Arg Gly Gly Gly Pro Gin Ala Ile Ser Ile Gly Lys Asn cys Asp

-124·

AAG lys

TTC Phe

665 GGC ATT CTG CTC Gly Ile Val Val

CAC His

GAG Glu

680

CIG GGC CAC CTC Leu Gly His Val

CTC

Val

695

GGC TTC TCG CAC Gly Phe Trp His

GAA Glu

725

740

755

710

CAC ACT CGG CCA GAC CGG GAC CGC CAC CTT TCC ATC CTT CCT GAG AAC ATC CAG His Ihr Arg Pro Asp Arg Asp Arg His Val Ser Ile Val Arg Glu Asn Ile Gin 770 785 800 815 CCA GGG CAG GAG TAT AAC TTC CTC AAG ATC GAG CCT CAG GAG CTG GAG TCC CTC Pro Gly Gin G1U iyr Asn Phe Leu Lys MET Glu Pro Gin Glu Val G1U Ser Leu 830 845 860 GGG GAG ACC TAT GAC TTC GAC AGC ATC ATC CAT TAC GCT CGG AAC ACA TTC TCC Gly G1U Ihr Tyr Asp Phe Asp Ser Ile MET His Tyr Ala Arg Asn Ihr Phe Ser 875 890 905 920 AGG ATC TTC CTG Urt-L ACC ATT CTC CCC AAG TAT GTC AAC GGG CTG AAA Arg Gly Ile Phe Leu Asp Thr Ile Val Pro Lys Tyr Glu Val Asn Gly Val Lys 935 950 965 CCT CCC ATT GGC CAA AGG ACA CGG CTC AGC AAG GGG GAC ATT CTC CAA Pro Pro Ile Gly Gin Arg Ihr Arg Leu Ser Lys Gly Asp Ile Ala Gin Ala Arg 930 995 1010 1025 AAG COT TAC AAG TCC CCA GCC TCT GGA GAG ACC CTC CAA GAC ACT ACA AAC Lys Leu Tyr Lys cys Pro Ala Cys Gly Glu Ihr Leu Gin Asp Ser Thr Gly Asn 1040 1055 1070 1085 TTC TCC TCC CCT GAA TAC CCC AAT GGC TAC TCT GCT CAC ATC CAC TCC CTG TCG Phe Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Asn Gly Tyr Ser Ala His MET His cys Val Trp 1100 1115 1130 OGC ATC TCT GTC ACA CCC GGG GAG AAG ATC ATC CTC AAC TTC ACG TCC CTC GAC Arg Ile Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Ile Ile Leu Asn Phe Thr Ser Leu Asp 1145 1160 1175 1190 CIG TAC OGC AGC OGC CIG TCC TCG TAC GAC TAT GTC GAG GTC CGA GAT GGC TTC Leu iyr Arg Ser Arg Leu Cys Trp iyr Asp Tyr Val Glu Val Arg Asp Gly Phe 1205 1220 1235 TCG AGG AAG GCG fW' CTC CGA GGC CCT TTC TCC GGG TCC AAA CTC CCT GAG CCT Trp Arg Lys Ala Pro Leu Arg Gly Arg Phe Cys Gly Ser Lys Leu Pro G1U Pro 1250 1265 12S0 1295 ATC CTC TCC ACT GAC * r·/*' Aksv CGC CTC TCG CTT GAA TTC CCT ·* ACT AGC AAT TCG Ile Val Ser Thr Asp Ser Arg Leu Trp Val Glu Phe L Vr-r Λ-u Ser Ser Ser Asn Trp 1310 1325 1340 1355 GTT GGA AAG GGC TTC TTT GCA CTC TAC GAA GCC ATC TCC GGG GCT GAT GTC AAA Val Gly Lys Gly Phe Phe Ala Val Tyr Glu Ala Ile Cys Gly Gly Asp Val Lys

-1251370 1385 1400

AAG GAC TAT GGC CAC ATT CAA TCG CCC AAC TAC CCA GAC GAT TAC (TCG CCC AGC Lys Asp Tyr Gly His Ile Gin Ser Pro Asn Tyr Pro Asp Asp Tyr Arg Pro Ser 1415 1430 1445 1460 AAA GTC TGC ATC TCG CGG ATC CAG GTC TCT GAG GGC TTC CAC GTC GGC CTC ACA Lys Vai cys Ile Trp Arg Ile Gin Vai Ser Glu Gly Rie His Vai Giy Leu Thr 1475 1490 1505 TTC CAG TCC TTT GAG ATT GAG CGC CAC GAC AGC TCT GCC TAC GAC TAT CTC GAG Phe Gin Ser Phe Glu Ile Glu Arg His Asp Ser cys Ala Tyr Asp Tyr Leu Glu 1520 1535 1550 1565 GTC CGC GAC GGG CAC ACT GAG AGC AGC ACC CTC ATC GGG CGC TAC TCT GGC TAT Vai Arg Asp Gly His Ser Glu Ser Ser Thr Leu Ile Gly Arg Tyr cys Gly Tyr 1580 1595 1610 1625 CTLw •k Ληα CCT GAT GAC ATC AAG AGC AOG TCC * CGC CTC TCG CTC AAG TTC CTC Glu Lys Pro Asp Asp Ile Lys Ser Thr Ser Ser Arg Leu Trp Leu Lys Phe Vai 1640 1655 1670 TCT GAC GGG TCC ATT AAC * H Hl GCG C-GC TTT GCC GTC AAC »'1' ί » !» X X X ** » ·* ΛΛη GAG GTC Ser Asp Gly Ser Ile Asn Lys Ala Gly Phe Ala Vai Asn Phe Phe Lys Glu Vai 1685 1700 1715 1730 GAC GAG TGC TCT CTC CCC AAC OGC GGG GGC TCT GAG CAG CGG TGC CTC AAC ACC Asp Glu cys Ser Arg Pro Asn Arg Gly Gly Cys Glu Gin Arg cys Leu Asn Thr 1745 1760 1775 CTG C-GC AGC TAC AAG TGC AGC TCT GAC CCC GGG TAC GAG CTC GCC CCA GAC AAG Leu Gly Ser Tyr Lys cys Ser cys Asp Pro Gly Tyr Glu Leu Ala Pro Asp Lys 1790 1805 1820 1835 CGC (TCC TCT GAG GCT GCT TGT GGC GGA TTC CTC ACC AAG CTC AAC GGC TCC ATC Arg Arg Cys Glu Ala Ala cys Gly Gly Rie Leu Thr Lys Leu Asn Gly Ser Ile 1850 1865 1880 1895 ACC AGC COS GGC TGG CCC AAG GAG TAC CCC CCC AAC AAG AAC TGC ATC TGG CAG Thr Ser Pro Gly Trp Pro Lys Glu Tyr· Pro Pro Asn Lys Asn cys Ile Trp Gin 1910 1925 1940 CTG GTC GCC CCC ACC CAG TAC CGC ATC CTC CAG TTT GAC TTC TTT GAG ACA Leu Vai Ala Pro Thr Gin Tyr Arg Ile Ser Leu Gin Phe Asp Phe Phe G1U Thr

1955 1970 1985 2000

GAC- GGC AAT GAT GTC TGC AAG TAC GTC TTC GTC GTC GTC CGC AGT GGA CTC ACA

Glu Gly Asn Asp Vai Cys Lys Tyr Asp Phe Vai Glu Vai Arg Ser Gly Leu Thr

2015 2030 2045

GCT GAC TCC AAG CTC CAT GGC AAG TTC TCT GCT TCT GAG AAG CCC GAG GTC ATC

Ala Asp Ser Lys Leu His Gly Lys Phe Cys Gly Ser Glu Lys Pro Glu Vai Ile

-126-

2060 2075 20902105

ACC TCC CAG TAC AAC AAC ATG OGC CTG GAG TTC AAG TCC GAC AAC ACC GTC TCC Thr Ser Gin Tyr Asn Asn MET Arg Vai Glu The lys Ser Asp Asn Thr Vai Ser

2120 2135 21502165

AAA AAG GGC TTC AAG GCC CAC TTC TTC TCA GAA AAG AGG CCA GCT CTG CAGCCC

Lys Lys Gly Fhe Lys Ala His Phe lhe Ser Glu Lys Arg Pro Ala Leu GinPro

2180 21952210

CCT OGG GGA OGC CCC CAC CAG CTC AAA TTC OGA GTC CAG AAA AGA AAC CGGACC

Pro Arg Gly Arg Pro His Gin Leu Lys Fhe Arg Vai Gin Lys Arg Asn ArgThr (730)

2225 2235 2245 2255 2265 22752285

CCC CAG TGAGGCCTGC CAGGCCTCCC GGACCCCITC TTACTCAGGA ACCTCACCTT GGAOGGAATC Pro Gin

2295 2305 2315 2325 2335 23452355

GGATGGGGGC TTCGCTGCCC ACCAACCCCC CACCTCCACT CTGCCATTCC GGCCCACCTC CCTCTCGCOG

2365 2375 2385 2395 2405 24152425

GACAGAACTC GTCCTCTCTT CTCCCCACTG TGCCCCTCCG CGG.-.CCGGGG ACCCTTCCCC CTGCCCTACC

2435 2445 2455 2465 2475 24852495

CCCTCCCATT TTGATGCTCT CTCTGACAIT TCCTCTTCTG AACTAAAAGA GGGACCCCTC OCTCCTGCCT

CTAGA (b) desde o nucleotido numero 356 até ao nucleotido número 1543 representados a seguir:

Qua. 7

-127QUADRO N9 7

10 20 Xo

CTCGACTCTA GACTCTCTCT CAGCACTTGG

CTGGGGACTT

CTTGAACTTG

CAGGGAGAAT

CCCCACTITC

90 100

OGCCGCTGCC TTTGCCCCAG

110

OGGAGCCTGC

120

TTOGCCATCT

130

CCGAGCCCCA

150

ACTCCTCGGC

180

ICTTCCCAGC

190

CTGAAAAGAG

210

GCOGGCACCC

230 240

GGAGGCAÀAG AAAAGGAACG

270

290

TCCATCTGGA

300 310

CGCTCTTICA ATGGAOCTCT

320

CCCCGCCTGC

330

ITCTTAGAOG

340

GACTGOGCTC (1)

OGACC ATG CTG GCC

MET Vai Ala

CIG CTT Leu Leu

400

CCC CAG

Pro Gin Vai

CTC

415

445

430

CTC CIG GGC GGC GCG GCT GGC CTC CTT CCG GAG CTG GGC OGC AGG AAG TTC GOG Leu leu Gly Gly Ala Ala Gly Leu Vai Pro Glu Leu Gly Arg Arg Lys Phe Ala 460 475 490 505 GCG GCG TOG TCG GGC OGC CCC TCA TCC CAG CCC TCT GAC GAG CTC CTG AGC GAG Ala Ala Ser Ser Gly Arg Pro Ser Ser Gin Pro Ser Asp G1U Vai Leu Ser Glu 520 535 550 565 TTC GAG TTG CGG CTG CTC AGC ATG TTC GGC AAA CAG AGA CCC ACC CCC AGC Phe Glu Leu Arg Leu Leu Ser MET Fhe Gly Leu Lys Gin Arg Pro Ihr Pro Ser 580 595 610 AGG GAC GCC GTG CTG CCC CCC TAC ATG CTA GAC CTG TAT CGC AGG CAC TOG GCT Arg Asp Ala Vai Vai Pro Pro iyr MET Leu Asp Leu Tyr Arg Arg His Ser Gly 625 640 655 670 CAG CCG GGC TCA CCC GCC CCA GAC CAC CGG TTG vjnia AGG GCA GCC AGC CGA GCC Gin Pro Gly Ser Pro Ala Pro Asp His Arg Leu C-lu Arg Ala Ala Ser Arg Ala 685 700 715 AAC ACT GTG CGC AGC TTC CAC CAT GAA GAA TCT TTG GAA GAA CTA CCA GAA AOG Asn Ihr Vai Arg Ser Fhe His His Glu Glu Ser Leu Glu Glu Leu Pro Glu Ihr

745

730

760

775

-128-

AGT GGG AAA ACA ACC OGG AGA TTC TTC TTT AAT ΤΓΑ AGT TCT ATC CCC ACG GAG Ser Gly Lys Thr Thr Arg Arg Phe Phe Phe Asn leu Ser Ser Ile Pro Thr Glu

790 805 820 835 GAG TTT ATC ACC TCA GCA GAG CTT CAG GTT TTC CGA GAA CAG ATG CAA GAT GCT Glu Phe Ile Thr Ser Ala Glu Lev'Gln Val Phe Arg Glu Gin MET Gin Asp Ala

850 TTA GGA AAC AAT AGC AGT TTC CAT Leu Gly Asn Asn Ser Ser Phe His 895 910 CCT GCA ACA GCC AAC TOG AAA TTC Pro Ala Thr Ala Asn Ser Lys Phe 955 CTG AAT CTiiu AAT GCA AGC AGG TGG Val Asn Gin Asn Ala Ser Arg Trp 1000 1015

OGG TGG ACT GCA CAG C-GA CAC GCC Arg Trp Thr Ala Gin Gly His Ala

865880

CAC OGA ATT AAT ATT TAT GAA ATC ATAAAA

His Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Ile IleLys

925940

CCC GTG ACC AGT CTT TTG GAC ACC AGGTTG

PTo Val Thr Ser Leu Leu Asp Thr ArgLeu

970985

GAA AGT TTT GAT GTC ACC CCC GCT GTGATG

Glu Ser Phe Asp Val Thr Pro Ala ValΜΞΓ

10301045

AAC CAT GGA TTC GTG GTG GAA GTG GCCCAC

Asn His Gly Phe Val Val Glu Val AlaHis

1060 1075 1090 1105 TTG GAG GAG AAA CAA GCT GTC TCC AAG AGA CAT GIT AGG ATA AGC AGG TCT TIG Leu Glu Glu Lys Gin Gly Val Ser Lys Arg His Val Arg Ile Ser Arg Ser Leu 1120 1135 1150 CAC CAA GAT GAA CAC AGC TGG TCA CAG ATA AGG CCA TIG CTA CTA ACT TTT GGC His Gin Asp Glu His Ser Trp Ser Gin Ile Arg Pro Leu Leu Val Thr Phe Gly 1165 1180 1195 1210 CAT GAT GGA AAA GGG CAT CCT CTC CAC AAA AGA GAA AAA CGT CAA GCC AAA CAC His Asp Gly Lys Gly His Pro leu His Lys Arg Glu Lys Arg Gin Ala Lys His

1225 12401255

AAA CAG CGG AAA CGC CTT AAG TCC AGC TGT AAG AGA CAC CCT TIG TAC GTGGAC

Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr ValAsp

1270 1285 13001315

TTC AGT GAC GIG GGG TGG AAT GAC TGG ATT GTG GCT CCC CCG GGG TAT CACGCC

Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr HisAla

1330 1345 13601375

TTT TAC TGC CAC GGA GAA TGC CCT TTT CCT CTG GCT GAT CAT CTG AAC TCCACT

Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn SerThr

1390 14051420

AAT CAT GCC ATT GTT CAG ACG TTG GTC AAC TCT CTT AAC TCT AAG ATT CCTAAG

Asn His Ala Ile Val Gin Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile ProLys

1435

1450

1465

1480

-129X

GCA TCC TCT GTC CCG ACA GAA CTC AGT GCT ATC TOG ATC CTC TAC CTT GAC GAG

Ala Cys Cys Vai Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser MET Leu Tyr Leu Asp Glu

1495 1510 1525

AAT GAA AAG GTT GTA TTA AAG AAC TAT CAG GAC .iTG GTT GTG GAG GGT TCT GGG

Asn Glu Lys Vai Vai Leu Lys Asn Tyr Gin Asp ΜΞΤ Vai Vai Glu Gly Cys Gly

1540(396) 1553 1563 1573 1583 1593 1603

TCT CGC TAGTACAGCA AAATTAAATA CATAAATATA TATATATATA TATATTTTAG AAAAAAGAAA Cys Arg

AAAA e

(c) desde o nucleótido numero 403 até ao nucleótido número

1626 representados a seguir:

Quad.8

-130Quadro N9 8

10 20

CTCTAGAGGG CAGAGGAGGA gggagggAgg gaaggagogc ggagcccggc ccggaagcta ggtgagtctc

80 90 100 110 120 130 140 GCATCCGAGC TCAGGGACGC GAGCCTCAGA OGCCGCTCCT GCTCCGGCTC AGTATCTAGC TTCTCTCCCC 150 160 170 180 190 200 210 GATCGGATTC CCGTCCAAGC TATCTCGAGC CTCCAGCGCC ACAGTCCCCG GCCCTOGCCC AGGTTCACTC 220 230 240 250 260 270 280

CAACCGTTCA GACOTCCCCA GGAGCTCCTG CTCGCGAGCC OGCIACTGCA GGGACCTATC GAGCCATTCC

290 300 310 320 330 340350

GTAGTC-CCAT CCCGAGCAAC GCACIGCIGC AGCTTCCCTG AGCCITTCCA C-CAAGITTCT TCAAGATTCG

360 370 380 390 400(1)

CTCTCAAGAA TCATCGACTC TTAITATATC CCTTCnTTC TCTCAAGACA. CC ATC ATT CCT MET Ile Pro

417 432 447 462 GGT AAC CGA ATC CTC ATC GTC GIT TTA TTA TCC CAA GTC CTC CIA GGA GGC C-CG Gly Asn Arg MET Leu MET Vai Vai Leu leu Cys Gin Vai Leu Leu Gly Gly Ala 477 492 507 AGC CAT GCT AGT TTC ATA CCT GAG AOG GGG AAG AAA AAA GTC GCC GAG ATT CAG Ser His Ala Ser Leu Ile Pro Glu Thr Gly Lys Lys Lys Vai Ala Glu Ile Gin 522 537 552 567 GGC CAC GOG GGA GGA OGC OGC TCA GGG CAG AGC CAT GAG CTC CTC CGG GAC’ TTC Gly His Ala Gly Gly Arg Arg Ser Gly Gin Ser His Glu Leu Leu Arg Asp Phe 582 597 612 627 GAG GCG ACA CTT CTC CAG ATC TTT GGG CTC CGC CGC OGC CCG CCT AGC AAG Glu Ala Thr Leu Leu Gin MET Phe Gly Leu Arg Arg Arg Pro Gin Pro Ser Lys

642 657672

AGT GCC GTC ATT CCG GAC TAC ATC OGG GAT CTT TAC CGG CTI CAG TCT GGG GAG Ser Ala Vai Ile Pro Asp Tyr MET Arg Asp Leu Tyr Arg Leu Gin Ser Gly Glu

687 702 717732

GAG GAG GAA GAG CAG ATC CAC AGC ACT GGT CTT GAG TAT CCT GAG OGC CCGGCC

Glu Glu Glu Glu Gin Ile His Ser Thr Gly Leu Glu Tyr Pro Glu Arg Pro Ala

-131

747 762777

AGC OGG GCC AAC ACC GTC AGG AGC TTC CAC CAC GAA GAA CAT CTC GAG AAC ATC

Ser Arg Ala Asn Thr Val Arg Ser Fhe His His Glu Glu His Leu Glu Asn Ile

792 807 822837

CCA GGG ACC AGT GAA AAC TCT GCT TTC OGT TTC CTC TTC AAC CTC AGC AGC ATC

Pro Gly Thr Ser Glu Asn Ser Ala Phe Arg Phe Leu Phe Asn Leu Ser Ser Ile

852 867 882897

CCT GAG AAC GAG GCG ATC TCC TCT GCA GAG CIT CGG CTC TTC CGG GAG CAG GTC

Pro Glu Asn Glu Ala Ile Ser Ser Ala Glu Leu Arg Leu Phe Arg Glu Gin Val

912 927942

GAC CAG GGC CCT GAT TGG GAA AGG GGC TTC CAC CGT ATA AAC AIT TAT GAGGTC

Asp Gin Gly Pro Asp Trp Glu Arg Gly Phe His Arg Ile Asn Ile Tyr GluVal

957 972 9871002

ATC AAG CCC CCA GCA GAA GTC GTC CCT GGG CAC CTC ATC ACA CGA CIA CTCGAC

MET Lys Pro Pro Ala Glu Val Val Pro Gly His Leu Ile Thr Arg Leu LeuAsp

1017 10321047

ACG AGA CTC GTC CAC CAC AAT GTC ACA CGG TCG GAA ACT TTT GAT GTC AGCCCT

Thr Arg Leu Val His His Asn Val Thr Arg Trp Glu Thr Fhe Asp Val SerPro

1062 1077 10921107

GCG GTC CIT CGC TCG ACC OGG GAG AAG CAG CCA AAC TAT GGG CIA GCC ATTGAG

Ala Val Leu Arg Trp Thr Arg Glu Lys Gin Pro Asn Tyr Gly leu Ala IleGlu

1122 1137 11521167

GTC ACT CAC CIC CAT CAG ACT CGG ACC CAC CAG GGC CAG CAT GTC AGG AITAGC

Val Tnr His Leu His Gin Thr Arg Thr His Gin Gly Gin His Val Arg IleSer

1182 11971212

CGA TCG ΊΤΑ CCT CAA GGG AGT GGG AAT TCG GCC CAG CTC CGG CCC CTC CTCGTC

Arg Ser Leu Pro Gin Gly Ser Gly Asn Trp Ala Gin Leu Arg Pro Leu LeuVal

1227 1242 1257 '1272

ACC TTC GGC CAT GAT GGC OGG GGC CAT GCC TTC ACC OGA OGC OGG AGG GCCAAG

Thr Phe Gly His Asp Gly Arg Gly His Ala Leu Thr Arg Arg Arg Arg AlaLys

1287 13021317

CGT AGC CCT AAG CAT CAC TCA CAG OGG GCC AGG AAG AAG AAT AAG AAC TCCCGG

Arg Ser Pro Lys His His Ser Gin Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn CysArg

1332 1347 13621377

CGC CAC TCG CTC TAT GTC GAC TTC AGC GAT GTC GGC TCG AAT GAC TCG ATCGTC

Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Tip IleVal

1392 1407 1422 1437

C-CC CCA CCA GGC TAC CAG GCC TTC TAC TCC CAT GGG GAC TCC CCC TTC CCA CTC

Ala Pro Pro Gly Tyr Gin Ala Fhe Tyr Cys His Gly Asp Cys Pro Fhe Pro Leu

-1321452 14671432

GCT GAC CAC CTC AAC TCA ACC AAC CAI GCC ATT GTG CAG ACC CTG GTC AAT TCT

Ala Asp His Leu Asn Ser Ihr Asry His Ala Ile Vai Gin Ihr Leu Vai Asn Ser

1497 1512 15271542

GTC AAT TCC AGT ATC CCC AAA GCC TGT TGT GTG CCC ACT GAA CTG AGT GCCATC

Vai Asn Ser Ser Ile Pro Lys Ala Cys Cys Vai Pro Ihr Glu Leu Ser AlaIle

1557 15721587

TCC ATG CTG TAC CIG GAT GAG TAT GAT AAG GTG GTA CIG AAA AAT TAT CAGGAG

Ser MET Leu Tyr Leu Asp Glu Tyr Asp Lys Vai Vai Leu Lys Asn iyr GinGlu

1602 1617 (394) 1636 1646 16561666

ATG GTA GTA GAG GGA TGT GGG TGC CGC TGAGATCAGG CAGTCCTTGA GGATAGACAG ATATACACAC

MET Vai Vai Glu Gly Cys Gly Cys Arg

1676 1686 1696 1706 1716 17261736

CACACACACA CACCACATAC ACCACACACA CACGTTCCCA TCCACTCACC CACACACTAC ACAGACIGCT

1746

TCCTTAIAGC

1756

TGGACTTTTA

1766 1776 1786 17961836

ΤΠΑΑΑΑΑΑΑ AAAAAAAAAA AATGGAAAAA ATCCCIAAAC ATTCACCTTG

1816 1826 1836 1846 1856 18661876

ACCTTATTIA IGACITIACG TGCAAATGTT TIGACCATAT TGATCAIAIA TTTTGACAAA ΑΤΑΊΑΤΓΙΑΤ

1886 1896 1906 1916 1926 19361946

AACTACGTAT TAAAAGAAAA AAATAAAATG AGTCATIATT ΙΊΑΑΑΑΑΑΑΑ AAAAAAAACT CTAGAGTCGÀ

OGGAATTC

11.- Processo para a preparação de uma composição farma cêutica, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade efectiva de pelo menos um factor obtido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 2, 3 ou 4 com uma matriz escolhida entre;

(a) hidroxapatite;

(b) colagénio;

(c) ácido poliláctico; e (d) fosfato tricãlcico.

-133-

12.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para a indução da formação de ossos, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade efectiva de uma proteína escolhida no grupo que consiste em:

a) uma sequência de aminoácidos ou uma sua parte substancialmente com a representação seguinte:

QUADRO N9 5

3419 3429 343<?

CAGCCCIGGC TICTTCCTTT CTCTCTAGÇT (1) 3454

GCC TCT CCT GGG GAC ACT GCC CIG GAC Ala Phe Leu Gly Asp Ile Ala Leu Asp

3469 34S4 34993514

GAA GAG GAC CTG AGG GCC CTC CAG GTA CAG CAG GCT GTG GAT CTC AGA CGGCAC

Glu Glu Asp Leu Arg Ala Phe Gin Vai Gin Gin Ala Vai Asp leu Arg ArgHis

3529 3544 (37) 35603570

ACA GCT CGT AAG TCC TCC ATC AAA GCT GCA GGTAAGCCGG GTGCCAATGG

Ihr Ala Arg Lys Ser Ser Ile Lys Ala Ala

Quad.6

-134-

QUADRO N9 6

10 20 30 (1)

CIAGAGGCCG CTTCCCTCGC OGCCGCCCQG CCAGC ATG

MET

CCC GGC GTG GCC OGC CTG CCG Pro Gly Val Ala Arg Leu Pro

65 80 95 110 CTG CTG CTC GGG CTG CTG CTG CTC COG OGT CCC GGC OGG COG CTG GAC TTC GCC Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Pro Arg Pro Gly Arg Pro Leu Asp Leu Ala 125 140 155 GAC TAC ACC TAT GAC CIG GOG GAG GAG GAC GAC TCG GAG CCC CTC AAC TAC AAA Asp Tyr Ihr Tyr Asp Leu Ala Glu Glu Asp Asp Ser Glu Pro Leu Asn Tyr Lys 170 185 200 215 GAC CCC TCC AAG GOG GCT GCC ΙΊΤ CTT GGG GAC ATT GCC CTG GAC GAA GAG GAC Asp Pro cys Lys Ala Ala Ala Phe Leu Gly Asp Ile Ala Leu Asp Glu Glu Asp 230 245 260 275 CTG AGG GCC ITC CAG GTA CAG CAG GCT GTC GAT CTC AGA OGG CAC ACA GCT OGT Leu Arg Ala Phe Gin val Gin Gin Ala Val Asp Leu Arg Arg His Thr Ala Arg 290 305 320 AAG TCC TCC ATC AAA GCT GCA GIT CCA GGA AAC ACT TCT ACC CCC AGC TCC CAG Lys Ser Ser Ile Lys Ala Ala Val Pro Gly Asn Ihr Ser Ihr Pro Ser Çys Gin 335 350 365 380 AGC ACC AAC GGG CAG CCT CAG AGG GGA GCC TCT GGG AGA TCG AGA GCT AGA TCC Ser Ihr Asn Gly Gin Pro Gin Arg Gly Ala Çys Gly Arg Trp Arg Gly Arg Ser 395 410 425 CCT AGC OGG CGG GOG GOG AOG TCC OGA CCA GAG OGT GTC TCG CCC GAT GGG GTC Arg Ser Arg Arg Ala Ala Ihr Ser Arg Pro Glu Arg Val Trp Pro Asp Gly Val 440 455 470 485 ATC CCC ΤΓΤ GTC ATT GGG GGA AAC TTC ACT GCT AGC CAG AGG GCT GTC TTC OGG Ile Pro Phe Val Ile Gly Gly Asn Phe Ihr Gly Ser Gin Arg Ala Val Phe Arg 500 515 530 545 CAG GCC ATG AGG CAC TCG GAG AAG CAC ACC TCT GTC ACC TTC CTC CTG OGC ACT Gin Ala MET Arg His Trp G1U Lys His Ihr cys Val Ihr Phe Leu Glu Arg Thr 560 575 590 GAC GAG GAC AGC TAT ATT TTC ACC TAT OGA CCT TCC GGG TGC TCC TCC TAC Asp Glu Asp Ser Tyr Ile Val Phe Ihr Tyr Arg Pro Cys Gly Cys Cys Ser Tyr 605 620 635 650 GIG GCT OGC CGC GGC GGG GGC CCC CAG GCC ATC TCC ATC GGC AAG AAC TCT GAC Val Gly Arg Arg Gly Gly Gly Pro Gin Ala Ile Ser Ile Gly Lys Asn Cys Asp

f

-135•s

665 6S0 695 AAG TTC GGC ATT GTG GTC CAC GAG CTG GGC CAC GTC GTC GGC TCC TGG CAC GAA Lys Phe Gly Ile Val Val His Glu Leu Gly His Val Val Gly Phe Trp His Glu 710 725 740 755 CAC ACT CGG CCA GAC CGG GAC CGC CAC GTT TCC ATC GIT CCT GAG AAC ATC CAG His Thr Arg Pro Asp Arg Asp Arg His Val Ser Ile Val Arg Glu Asn Ile Gin 770 785 800 815 CCA GGG CAG GAG TAT AAC TTC CIG AAG ATG GAG CCT CAG GAG CTG <·* T HW» CTG Pro Gly Gin Glu Tyr Asn Fhe Leu Lys MET Glu Pro Gin Glu Val Glu Ser Leu 830 845 860 GGG GAG ACC TAT GAC TTC GAC AGC ATC ATG CAT TAC GCT CGG AAC ACA TCC TCC Gly Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ser Ile ΜΞΤ His Tyr Ala Arg Asn Thr Phe Ser 875 890 905 920 AGG GGC ATC TTC CTG GAT ACC ATT GTC CCC AAG GAG GTG AAC GGj GTG AAA Arg Gly Ile Phe Leu Asp Thr Ile Val Pro Lys Tyr Glu Val Asn Gly Val Lys 935 950 965 CCT CCC ATT GGC CAA AGG AGA CGG CTC AGC AAG GAC ATT GCC CAA GCC CGC Pro Pro Ile Gly C-ln Arg Thr Arg Leu Ser Lys Gly Asp Ile Ala Gin Ala Arg 930 995 1010 1025 AAG CIT TAC AAG TGC CCA GCC TOT GGA GAG ACC CTG CAA GAC AGC AAC Lys Leu Tyr Lys Cys Pro Ala Cys Gly Glu Thr Leu Gin Asp Ser Thr Gly Asn 1040 1055 1070 1085 TTC TCC TCC CCT GAA TAC CCC AAT GGC TAC TCT GCT CAC ATG CAC TGC GTG TGG Phe Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Asn Gly Tyr Ser Ala His MET His Cys Val Trp 1100 1115 1130 OGC ATC Ter GTC ACA CCC GGG GAG AAG ATC ATC /ττν-· AAC TTC ACG TCC CTG GAC Arg Ile Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Ile Ile Leu Asn Phe Thr Ser Leu Asp 1145 1160 1175 1190 CTG TAC OGC AGC CGC CTG TGC TGG TAC GAC TAT GTG GAG GTC CGA TTC Leu Tyr Arg Ser Arg Leu Cys Trp iyr Asp Tyr Val Glu Val Arg Asp Gly Phe 1205 1220 1235 TGG AGG AAG GCG CCC CTC OGA GGC OGC TTC TGC GGG TCC AAA CTC CCT GAG CCT Trp Arg Lys Ala Pro Leu Arg Gly Arg Phe Cys Gly Ser Lys Leu Pro Glu Pro 1250 1265 1 .2S0 1 .295 ATC GTC TCC ACT GAC AGC CGC CTC TGG GTC GAA TCC CGC AGC Γ*** Τ’ AV7V ΛΛ1 TGG Ile Val Ser Thr Asp Ser Arg Leu Trp Val G1U Phe Arg Ser Ser Ser Asn Trp

1310 1325 1340 1355

GTC GGA AAG GGC TTC ΤΤΓ GCA GTC TAC GAA GCC ATC TCC GGG GCT GAT GTC AAA

Val Gly Lys Gly Phe lhe Ala Val Tyr Glu Ala Ile Cys Gly Gly Asp Val Lys .-1361370 1355 1400

AAG GAC TAT GGC CAC ATT CAA TOG CCC AAC TAC CCA GAC GAT TAC OGG CCC AGC Lys Asp Tyr Gly HÍS Ile Gin Ser Pro Asn Tyr Pro Asp Asp Tyr Arg Pro Ser 1415 1430 1445 1460 AAA GTC TCC ATC TCG CGG ATC CAG GTC TCT GAG GGC TTC CAC GTC GGC CTC ACA Lys Vai cys Ile Trp Arg Ile Gin Vai Ser Glu Gly Phe His Vai Gly Leu Thr 1475 1490 1505 TTC CAG TCC TTT GAG ATT GAG CGC CAC GAC AGC TCT GCC TAC GAC TAT CTC GAG Phe Gin Ser Phe Glu Ile Glu Arg His Asp Ser Cys Ala Tyr Asp Tyr Leu Glu 1520 1535 1550 1565 GTC CGC GAC GGG CAC AGT GAG AGC AGC ACC CTC ATC GGG CGC TAC TCT GGC TAT Vai Arg Asp Gly His Ser Glu Ser Ser Thr Leu Ile Gly Arg Tyr Cys Gly Tyr 1530 1595 1610 1625 GAG ·»·»/- CCT GAT GAC AZC AAG ACG TCC 7» r·*-! CGC CIC TCG CTC AAG TTC GTC Glu Lys Pro Asp Asp Ile Lys Ser Thr Ser Ser Arg Leu Trp Leu Lys Phe Vai 1640 1655 1670 TCT GAC TCC ATT AAC AAA GCG GGC TTT GCC GTC AAC TCT '1 iL H Ύ > ΛΑΛ GAG GTC Ser Asp Gly Ser Ile Asn Lys Ala Gly Phe Ala Vai Asn Phe Phe Lys G1U Vai 1685 1700 1715 1730 GAC TCC TCT CGG CCC AAC OGC GGG GGC TCT /»* r· Lsrúj CAG OGG TCC CTC AAC ACC Asp Glu cys Ser Arg Pro Asn Arg Gly Gly Cys Glu Gin Arg Cys Leu Asn Thr 1745 1760 1775 CTC GGC AGC TAC AAG TCC AGC TCT GAC CCC GGG TAC GAG CTC GCC CCA GAC AAG leu Gly Ser Tyr Lys cys Ser cys Asp Pro Gly Tyr G1U leu Ala Pro Asp Lys 1791 3 1805 1820 1835 OGC CGC TCT GAG GCT GCT TCT GGC GGA TTC CTC ACC AAG CTC AAC GGC TCC ATC Arg Arg Cys Glu Ala Ala Cys Gly Gly Phe Leu Thr Lys Leu Asn Gly Ser Ile 1850 1865 1880 1895 ACC AGC CCG GGC TCG CCC AAG GAG TAC CCC CCC AAC AAG AAC TCC ATC TCG CAG Thr Ser Pro Gly Trp Pro Lys Glu Tyr Pro Pro Asn Lys Asn Cys Ile Trp Gin 1910 1925 1940 CTC GTC GCC CCC ACC CAG TAC CGC ATC TCC CTG CAG TTT GAC TTC TTT GAG ACA Leu Vai Ala Pro Thr Gin Tyr Arg Ile Ser Leu Gin Phe Asp Phe Phe Glu Thr 1955 1970 1985 >000 GAG G\jC ΛΛ.1 GAT GTC TCC AAG TAC GAC rrv' 1 j. <, GTG Grvj (TTC OGC AGT GGA CTC ACA Glu Gly Asn Asp Vai Cys Lys Tyr Asp Phe Vai Glu Vai Arg Ser Gly Leu Thr 2015 2030 2045 GCT GAC TCC AAG CTC CAT GGC AAG TTC TCT GGT TCT GAG AAG CCC GAG GTC ATC Ala Asp Ser Lys Leu His Gly Lys Phe Cys Gly Ser Glu Lys Pro Glu Vai Ile

-137

2060 2075 20902105

ACC TCC CAG TAC AAC AAC ATG OGC JTG GAG TTC AAG TCC GAC AAC ACC GTG TCC Thr Ser Gin Tyr Asn Asn MET Arg Vai Glu Fhe lys Ser Asp Asn Thr Vai Ser

2120 2135' 21502165

AAA AAG GGC TTC AAG GCC CAC TTC TTC TCA GAA AAG AGG CCA GCT CTC CAGCCC

Lys Lys Gly lhe Lys Ala His Phe Phe Ser Glu Lys Arg Pro Ala Leu GinPro

2180 21952210

CCT CGG GGA CGC CCC CAC CAG CTC AAA TTC CGA GTC CAG AAA AGA AAC OGGACC

Pro Arg Gly Arg Pro His Gin Leu Lys Fhe Arg Vai Gin Lys Arg Asn ArgThr (730)

2225 2235 2245 2255 2265 22752285

CCC CAG TCAGGCCTCC CAGGCCTCCC GGACCCCITC TTACTCAGGA ACCTCACCIT GGACGGAATC Pro Gin

2295 2305 2315 2325 2335 234523=5

GGATCGGGGC TTCGGTGCCC ACCAACCCCC CACCTCCACT CTGCCAITCC GGCCCACCIC CCICTGGCCG

2385

CTCCCCACTG

2415

GTGCCCTACC

2435 2445

2455

2465 2475

2485

2495

CCCTCCCATT TTGATGGTGT CTCTGACATT TCCTGTTCTC AAGTAAAAGA GGGACCCCTG CGTCCTGCCT

CTAGA

b) uma sequência de-aminoácidos ou uma sua parte substan· cialmente como se representa, a seguir:.

Quad.7

-13810 20

GTCGACTCTA GrtGICTGTGT

J0 40 50 60 70

CAGCACTTGG CTGGGGACTT CTTGAACTTG CAGGGAGAAT AACTTGCGCA

90 100 110 120 130

140

CCCCACTTTG CGCCGCTGCC TTTGCCCCAG CGGAGCCTGC ITOGCCATCT COGAGCCCCA CCGCCCCTCC

150 160 Y10 180 190 200 210 ACTCCTCGGC CTTGCCCGAC ACTGAGAOGC ICTTCCCAGC GTGAAAAGAG AGACTGOGOG GCCGGCACCC 220 230 240 250 260 270 280 GGGAGAAGGA AAAAC-GAAOG GACATTCGCT CCTTGCGOCA ΙΎ*> j. · Xksri CGAGAGTTTT

290 300 310

TCCAICTGGA OGCTCTTTCA ATGGACGIGT

320

OCOO3CGIGC

330

TTCTTAGACG

340

GACTGOGGTC (1) 370 385 400

OGACC ATG CTG GCC GGG ACC CGC TCT CIT CTA GOG TIG CTG CTT CCC CAG GTC

MET Vai Ala Gly Thr Arg Cys Leu Leu Ala Leu leu leu Pro Gin Vai

415 430 445

CTC CTG GGC GGC GCG GCT GGC CTC GTT CCG GAG CTG GGC CGC AGG AAG TTC GCG Leu Leu Gly Gly Ala Ala Gly Leu Vai Pro G1U Leu Gly Arg Arg Lys Phe Ala 460 475 490 505 GOG GCG TOG TOG GGC OGC CCC TCA TCC CAG CCC TCT GAC GAG GTC CTG AGC GAG Ala Ala Ser Ser Gly Arg Pro Ser Ser Gin Pro Ser Asp Glu Vai Leu Ser Glu 520 535 550 -565 TTC GAG TTG OGG CTG CTC AGC ATG TTC GGC CTG AAA CAG AGA CCC ACC CCC AGC Phe Glu Leu Arg Leu Leu Ser MET Phe Gly Leu Lys Gin Arg Pro Thr Pro Ser 580 595 610 AGG GAC GCC CTG GTG CCC CCC TAC ATG CTA GAC CTG TAT OGC AGG CAC TOG GCT Arg Asp Ala Vai Vai Pro Pro Tyr MET Leu Asp Leu Tyr Arg Arg His Ser Gly 625 640 655 670 CAG CCG GGC TCA CCC GCC CCA GAC CAC CGG TTG GAG AGG GCA GCC AGC OGA GCC Gin Pro Gly Ser Pro Ala Pro Asp His Arg Leu G1U Arg Ala Ala Ser Δ·»τ Λ-u Ala 685 700 715 AAC aL-x CTG CGC AGC TTC CAC CAT GAA GAA TCT TTG GAA GAA CTA CCA GAA AOG Asn Ihr Vai Arg Ser Phe His His Glu Glu Ser Leu Glu Glu Leu Pro Glu Ihr

730

745

760

775

-139-

QUADRO N9 7

AGT GGG AAA ACA ACC CGG AGA TTC TTC TTT AAT m*·» AGT TCT ATC CCC ACG GAG Ser Gly Lys Ihr Thr Arg Arg Phe Phe Phe Asn Leu Ser Ser Ile Pro Ihr Glu 790 805- 820 835 GAG TTT ATC ACC TCA GCA GAG CTT CAG GTT TTC CGA GAA CAG ATG CAA GAT GCT Glu Phe Ile Ihr Ser Ala Glu LeVGln Val Phe Arg Glu Gin MET Gin Asp Ala 850 865 880 TTA GGA AAC AAT AGC AGT TTC CAT CAC CGA ATT AAT ATT TAT GAA ATC ATA AAA Leu Gly Asn Asn Ser Ser Phe His His Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Ile Ile Lys 895 910 925 940 CCT C-CA ACA GCC AAC TOS AAA TTC CCC GTG ACC n /—-n CTT TTG GAC ACC AGG TTG Pro Ala Ihr Ala Asn Ser Lys Phe Pro Val Ihr Ser leu Leu Asp Ihr Arg Leu 955 970 985 GTG AAT CAG AAT GCA AGC AGG TCG GAA AGT ΤΓΓ CiAx GTC ACC CCC GCT GTG ATG Val Asn Gin Asn Ala Ser Arg TXD Glu Ser Phe Asp Val Pro Ala Val MET 1000 1015 1030 1045 CGG TGG ACT GCA CAG GGA CAC GCC AAC CAT GGA TTC GTG GTC GAA GTC GCC CAC Arg Trp Ihr Ala Gin Gly His Ala Asn His Gly Phe Val Val Glu Val Ala His 1060 1075 1090 1105 TTG GAG GAG AAA CAA GGT GTC TCC AAG AGA CAT GTT AGG ATA AGC AGG TCT TTC leu Glu Glu Lys Gin Gly Val Ser Lys Arg His Val Arg Ile Ser Arg Ser Leu 1120 1135 1150 CAC CAA GAT GAA CAC AGC TCG TCA CAG ATA AGG CCA TTC CTA GTA ACT TTT GGC His Gin Asp Glu His Ser Trp Ser Gin Ile Arg Pro Leu Leu Val Ihr Phe Gly 1165 1180 1195 1210 CAT GAT GGA AAA GGG CAT CCT CTC CAC AAA AGA GAA AAA OGT CAA GCC AAA CAC His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg Gin Ala Lys His 1225 1240 1255 AAA CAG OGG AAA CGC CTT AAG TCC AGC TGT AAG AGA CAC CCT TTC TAC GTC GAC Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu iyr Val Asp 1270 1285 1300 1315 TTC AGT GAC GTG GGG TGG AAT GAC TGG ATT GTG GCT CCC COG GGG TAT CAC C-CC Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly iyr His Ala 1330 1345 1360 1375 TTT TAC IGC CAC GGA GAA TGC CCT TTT CCT CTC GCT GAT CAT CTC AAC TCC ACT Phe Tyr Cys His Gly Glu cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr

1290 1405 1420

AAT CAT GCC ATT GTT CAG ACG TTC GTC AAC TCT GTT AAC TCT AAG ATT CCT AAG

Asn His Ala Ile Val Gin Ihr leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys

1425

1450

Ί SZZ

-140i

GCA TCC TCT GTC COG ACA GAA CTC AGT GCT ATC TOG ATC CTC TAC CIT GAC GAG

Ala Çys Cys Vai Pro Ihr Glu Leu Ser Ala Ile Ser MET Leu Tyr Leu Asp Glu

1495 , I5io 1525

AAT GAAAAGGTrGIATTAAAGAACTATCAGGACATCGTTGTCGAGGGTTCTGGG

Asn Glu Lys Vai Vai leu Lys Asn Tyr Gin Asp MET Vai Vai Glu Gly Cys Gly 154° (396) 1553 1563 1573 1583 1593 1603

TGT OGC TAGIACAGCA AAATTAAATA CATAAATATA TATATATATA ΊΑ,ΤΑΤΓΤΤΑΟ AAAAAAGAAA Cys Arg

ΑΑΆΑ

c) uma sequência de aminoácidos ou uma sua parte substancial mente como se representa a seguir

QUADRO N9 4 a

284 294 3Q4 (112)

CTAACCTGTC TTCTCCCITT TCGTTCCIAG TCT TTC AAG Ser Leu Lys

CCA Pro

319

TCA AAT CAC Ser Asn His

GCT ACC Ala Thr

334 349 364 379 ATC CAG AGT ATA GTC AGA GCT GTC GGG GTC GTC CCT GGA ATC CCC CCT TCC Ile Gin Ser Ile Vai Arg Ala Vai Gly Vai Vai Pro Gly Ile Pro Glu Pro Cys 394 409 424 439 TCT GTC CCA GAA AAG ATC TCC TCA CTC AGC ATC rrr* χ TTC ΊΊΤ GAT GAA AAC AAG Cys Vai Pro Glu Lys ΜΞΤ Ser Ser Leu Ser Ile Leu Phe Phe Asp Glu Asn Lys 4Ξ4 469 * <“ · hli (17Ξ AAT GTC- GIA CIT > *» * r—* ΛΛΛ U-Λ -Λα CCA ΛΛ\- ATC % /-Il Λ^Λ GTA GAC- TCT TGT C-CT TCC Λ*-=Λ Asn Vai Vai Leu Lys Vai Asn V ~ 'Τ****· Vai Glu Ser Cys Ala Cys Arg

)

-141

QUADRO 4b

383 393 403 413 (1) 428

GAGGAGGAAG CGGTCTACGG GGCTCCTTCT GCCTCTGCAG AAC AAT GAG CTT CCT GGG GCA

Asn Asn Glu Leu Pro Gly Ala

443 458 473 488 GAA TAT CAG TAC AAG GAG GAT GAA CTA TGG GAG GAG AGG AAG CCT TAC AAG ACT Glu Tyr Gin Tyr Lys Glu Asp Glu Val Trp Glu Glu Arg Lys Pro TfT Lys Ihr 503 518 533 CTT Γ /* U-rvj AC* /* CCC CCT GAT AAG ACT *·*/* ΛΛν· AAC AAA AAG AAA CAG AGG AAG GGA Leu C-lr. ** Gin Pro Pro Asp Lys Ser Lys Asn Lys Lys Lys Gin Arg Lys Gly 543 563 578 593 CCT CAG CAG AAG ACT CAG ACG CTC CAG Ί\Γλ GAT GAA CAG ACC CTG AAG AAG GCA Pro Gin Gin Lys Ser Gin Thr Leu Gin Phe Asp Glu Gin Thr Leu Lys Lys Ala 6G8 623 638 AGA AGA AAG CAA TGG ATT GAA CCC OGG AAT TCT GCC AGA CGG TAC CTT AAA GTG Arg Arg Lys Gin ΤΤρ Ile Glu Pro Arg Asn Cys Ala Arg Arg Tyr Leu Lys Val 6=3 663 633 693 kj»**»¹* TTC GAj. Λα x (λλ. TGG AGC GAA TC-G ATT ATT TCC CCC AAG TCC TTC GAT Asp Phe Ala Asp Ile C-ly ’Τ'Χ'ρ Ser Glu Trp Ile Ile Ser Pro Lys Ser Phe Asp GCC 713 TGC TCC GCG 728 TTC CCC ATG 743 (111) 756 TAT ílrv— GGA TGC CAG CuA b-j-ftUUUUiG ΤΧ'ΓΓΓΓ Ala Tyr Tyr Cys Ser Gly Ala cys Gin Phe PTO MET Pro Lys

776 786

TGTCCTTCCC ATTTCCATAG e a sua contrapartida humana;

d) uma sequência de aminoãcidos ou uma sua parte substancial mente com a representação seguinte:

Quad.8

-142

QUADRO N<? 8

10 20 30 40 50 60 70

CTCTAGAGGG CAGAGGAGGA GGGAGGGAGG GAAGGAGCGC GGAGCCCGGC COGGAAGCIA. GGTGAGTGTG

100

110

120 130

140

GCATCOGAGC TGAGGGACGC GAGCCIGAGA OGCOGCIGCT GCICOGGCIG AGTATCTAGC TTGTCTCCCC

150 160 170 180 190 200 210

GATGGGATTC CCGTCCAAGC TATCTCGAGC CTGCAGOGCC ACAGTCCCOG GCCCTOGCCC AGGITCACTG

220 230

240

250

260

270

280

CAACCGTTCA GAGGTCCCCA GGAGCTGCTG CTGGCGAGCC CGCIACIGCA. GGGACCIATG GAGCCATTCC

290 300 310 320 330 340 350

GTACTC-CCAT CCCGAGCAAC GCACTGCTGC AGCTTCCCTG AGCCITTCCA GCAAGITIGT TCAAGATTGG

360 370

380 390

400 (1)

CIGTCAAGAA TCATGGACTG TTATTATATG CCTTGTTTIC TGTCAAGACA CC ATG ATT CCT

MET Ile Pro

417 432 447 462 GGT AAC CGA ATG CTG ATG GTC GTT TTA TTA TGC CAA GTC CTG CIA GGA GGC GCG Gly Asn Arg MET Leu MET Vai Vai Leu Leu cys Gin Vai Leu Leu Gly Gly Ala 477 492 507 AGC CAT GCT AGT TTG ATA CCT GAG ACG GGG AAG AAA AAA GTC GCC GAG ATT CAG Ser His Ala Ser Leu Ile Pro Glu Thr dy Lys Lys Lys Vai Ala G1U Ile Gin 522 537 552 567 GGC CAC GOG GGA GGA CGC CGC TCA GGG CAG AGC CAT GAG CTC CTG CGG GAC TTC Gly His Ala Gly Gly Arg Arg Ser Gly Gin Ser His G1U Leu Leu Arg Asp Phe 582 597 612 627 /-·» r* WW GCG ACA CIT CTG CAG ATG TTT GGG CTG CGC CGC CGC CCG CAG CCT AGC AAG GlU Ala Ihr Leu Leu Gin MET Phe Gly Leu Arg Arg Arg Pro Gin Pro Ser Lys 642 657 672 AGT GCC GTC ATT COG GAC TAC ATG OGG GAT CTT CGG CIT CAG TCT GGG GAG Ser Ala Vai Ile Pro Asp Tyr MET Arg Asp Leu Tyr Arg Leu Gin Ser Gly Glu 687 702 717 732 GAG GAG GAA GAG CAG ATC CAC AGC ACT GGT CTT GAG TAT CCT GAG CGC CCG GCC Glu Glu Glu Glu Gin Ile His Ser Thr Gly Leu Glu Tyr Pro Glu Arg Pro Ala

-143747 762 777

AGC CGG GCC AAC ACC CTG AGG AGC TTC CAC CAC GAA GAA CAT CTG GAG AAC ATC Ser Arg Ala Asn Thr Val Arg Ser Phe His His Glu Glu His Leu Glu Asn Ile 792 807 822 837 CCA GGG ACC AGT GAA AAC TCT GCT TTT OGT TTC CTC TTT AAC CTC AGC AGC ATC Pro Gly Thr Ser Glu Asn Ser Ala Phe Arg Phe Leu Phe Asn leu Ser Ser Ile 852 867 882 897 CCT GAG AAC GAG GCG ATC TCC TCT GCA GAG CTT CGG CTC TTC CGG GAG CAG GTC Pro Glu Asn Glu Ala Ile Ser Ser Ala G1U Leu Arg Leu Phe Arg Glu Gin Val 912 927 942 GAC CAG GGC CCT GAT TGG GAA AGG GGC TTC CAC CCT ATA AAC AIT TAT GAG CTT Asp Gin Gly Pro Asp Trp Glu Arg Gly Phe His Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Val 957 972 987 1002 ATG * * /-» CCC CCA kjwi GAA CTG CTG CCT GGG CAC CTC ATC ACA CGA CIA CTG GAC MET Lys Pro Pro Ala Glu Val Val Pro Gly His Leu Ile Thr Arg Leu Leu Asp 1017 1032 1047 ACG AGA CIG GTC CAC CAC AAT CTG ACA OGG TCG GAA ACT TCT GAT GTC AGC CCT Thr Arg Leu Val His His Asn Val Thr Arg Trp Glu Thr Fhe Asp Val Ser Pro 1062 1077 1092 1107 GCG CTC CIT OGC TGG ACC OGG GAG AAG CAG CCA AAC TAT GGG CIA GCC ΑΤΓ GAG Ala Val Leu Arg Trp Thr Arg Glu Lys Gin Pro Asn Tyr Gly Leu Ala Ile Glu 1122 1137 1152 1167 CTG ACT CAC CTC CAT CAG ACT CGG ACC CAC CAG GGC CAG CAT GTC AGG AIT AGC Val Thr His Leu His Gin Thr Arg Thr His Gin Gly Gin His Val Arg Ile Ser 1182 1197 1212 OGA TCG TTA CCT CAA GGG ACT GGG AAT TCG GCC Uniu CTC OGG CCC CTC CTC GTC Arg Ser Leu Pro Gin Gly Ser Gly Asn Trp Ala Gin Leu Arg Pro leu Leu Val 1227 1242 1257 1272 ACC TCT GGC CAT GAT GGC OGG GGC CAT GCC TTC ACC CGA OGC OGG AGG GCC AAG Thr Phe Gly His Asp Gly Arg Gly His Ala Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ala Lys 1287 1302 1317 OGT AGC CCT AAG CAT CAC TCA CAG OGG GCC AGG Ύ 51 r* nnu AAG AAT Anu AAC TCC CGG Arg Ser Pro Lys His His Ser Gin Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn cys Arg 1332 1347 1362 1 .377 CGC CAC TCG CTC TAT GAC TTC AGC UÀX GTC TCG AAT GAC TGG AIT GTC Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val 1392 1 .407 1 .422 1437 GCC CCA CCA GGC TAC CAG GCC TTC TAC TCC CAT búu GAC TCC CCC TTT CCA CTC Ala Pro Pro C-ly Tyr Gin Ala Phe Tyr cys His Gly Asp Cys Pro Fhe Pro Leu

-144—

1452 14671482

GCT GAC CAC CTC AAC TCA ACC AAC .CAT GCG ATT GIG CAG ACC CTG GTC AAT TCT

Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gin Thr Leu Val Asn Ser

1497 1512 15271542

GTC AAT TCC AGT ATC CCC AAA GCC TGT TGT GTG CCC ACT GAA CTG AGT GCCATC

Val Asn Ser Ser Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser AlaIle

1557 15721587

TCC ATG CTG TAC CTG GAT GAG TAT GAT AAG GTG GTA CIG AAA AAT TAT CAGGAG

Ser MET Leu Tyr Leu Asp Glu Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr GinGlu

1602 1617 (394) 1636 1646 16561666

ATG GTA GTA GAG GGA TGT GGG TGC CGC TGAGATCAGG CAGTCCTTGA GGATAGACAG ATATACACAC ΗΕΓ Val Val Glu Gly Çys Gly Cys Arg

1676 16S6

1696

1706 1716

1726

1746

1756 1766

1776

1786

1796

18C5

TCCITAIAGC

1816 1826 1836 1846 1856 1866 1875

ACCTTATTTA TGACITTACG TGCAAAIGTT TIGACCATAT TCAICATATA TTTTGACAAA ATATATTTAT

1886 1896 1906 1916 1926 1936 1946

AACTAOGTAT TAAAAGAAAA AAATAAAATG AGTCATIATT ΤΙΑΑΆΑΑΑΑΑ AAAAAAAACT CIAGAGTCGÀ

CGGAATTC e suas misturas com um veículo apropriado aceitável em farmacia