DK172275B1 - Gener, som koder for BMP-2- og BMP-4-proteiner, vektorer indeholdende sådanne gener, celler transformeret med sådanne vektorer, BMP-2- og BMP-4-proteiner, fremgangsmåde til disses fremstilling, farmaceutiske præparater deraf og anvendelse deraf - Google Patents

Description

DK 172275 B1

Den foreliggende opfindelse angår gener, som koder for BMP-2- og BMP-4-proteiner, vektorer indeholdende sådanne gener, celler transformeret med sådanne vektorer, BMP-2- og BMP-4-proteiner, fremgangsmåde til disses fremstilling, 5 farmaceutiske præparater deraf og anvendelse deraf. Disse proteiner er i stand til at inducere bindevævsdannelse og benvævsdannelse.

Benvæv er højt specialiseret væv, som er karakteriseret ved en ekstensiv matriksstruktur dannet af fibrøse bund-10 ter af proteinet kollagen og proteoglycaner, ikke-kollage-niske proteiner, lipider og sure proteiner. Processerne med bendannelse og fornyelse/reparation af benvæv, som sker kontinuerligt gennem hele livet, udføres af specialiserede celler. Før den normale udvikling af lange knogler hos fostre 15 dannes der en bindevævsmodel. Knoglevæksten medieres formentlig af osteoblaster (benvævsdannende celler), medens gen-nelse af knogler tilsyneladende sker ved de forenede aktiviteter af benvævsresorberende celler, betegnet osteoklaster, og osteoblaster. Forskellige osteogene, bindevævsinducerende 20 og benvævsinducerende faktorer er blevet beskrevet, se f.eks.

EP patentansøgning nr. 148.155 og 169.016.

I EP 148.155 beskrives således en familie af immunologisk relaterede, osteogene faktorer ekstraheret fra en demineraliseret knoglematriks. De beskrevne aminosyresekven-25 ser af disse faktorer har ikke nogen homologi med proteinerne, som kodes af sekvenserne ifølge den foreliggende opfindelse og anses derfor at svare til andre proteiner.

I US 4.563.350 beskrives et præparat, som er en blanding indeholdende et osteogen faktor-(OF)-protein udvundet 30 af knogle, som er tilstrækkelig frit for urenheder til, at det er hypoimmunogent. I skriftet henvises til en fremgangsmåde, som er beskrevet i US patentansøgning nr. 630.938, til fremstilling af disse faktorer. To yderligere US patentskrifter, 4.774.228 og 4.774.322, beskriver, at proteinerne 35 beskrevet i den ovennævnte ansøgning siden er beskrevet som TGF-b-proteiner. OF-Proteinerne ifølge US patentskriftet 2 DK 172275 B1 er således forskellige fra BMP-2- og BMP-4-proteinerne ifølge den foreliggende opfindelse. Da rensningsprocessen ifølge US patentskriftet fører til proteiner, som svarer til TGF-b ifølge US 4.774.228 og 4.774.322, som adskiller sig fra 5 proteinerne ifølge den foreliggende opfindelse, foregriber US patentskriftet ikke den foreliggende opfindelse.

I WO 85/04173 beskrives en fremgangsmåde til udvinding og rensning af et knogleprotein, som er i stand til at stimulere chondrogenese. Dette protein er vandopløseligt og 10 surt i modsætning til proteinerne ifølge den foreligende opfindelse. Endvidere beskrives der ikke i skriftet nucleo-tid- eller aminosyresekvenser af de rensede proteiner, men blot en fremgangsmåde til udvinding af proteinerne. Ved denne fremgangsmåde fås tydeligvis ikke en sådan renhed, at 15 aminosyresekvensen og nucleotidsekvensen kan bestemmes. Endvidere beskrives proteinerne ifølge skriftet som chon-drogene, medens BMP-2- og BMP-4-proteinerne ifølge den foreliggende opfindelse fremkalder dannelse af bindevæv og/eller knoglevæv. Dette viser også, at proteinerne ifølge skriftet 20 adskiller sig fra proteinerne ifølge den foreliggende opfindelse.

Den foreliggende opfindelse angår følgende: 1. Et gen, som koder for humant BMP-2 og omfatter DNA-sekvensen anført i krav 1.

25 2. Et gen, som koder for et protein, som udviser egenskaber af humant BMP-2, og omfatter en DNA-sekvens: (a) som adskiller sig fra DNA-sekvensen anført i krav 1 i kodonsekvens på grund af degenerationen af den genetiske kode, 30 (b) som hybridiserer med DNA-sekvensen anført i krav 1 eller afsnit (a) ovenfor, eller (c) udgør et fragment, en allelisk eller anden variation af DNA-sekvensen anført i krav 1, hvad enten denne variation medfører ændringer i peptid-35 sekvensen eller ej.

3. Et gen, som koder for bovint BMP-2 og omfatter DNA- 3 DK 172275 B1 -sekvensen anført i krav 6.

4. Et gen, som koder for et protein, som udviser egenskaber af bovint BMP-2, og omfatter DNA-sekvenser: (a) som adskiller sig fra DNA-sekvensen anført i krav 5 6 i kodonsekvens på grund af degenerationen af den genetiske kode, (b) som hybridiserer med DNA-sekvensen anført i krav 6 eller afsnit (a) ovenfor, eller (c) udgør fragmenter, alleliske eller andre varia- 10 tioner af DNA-sekvensen anført i krav 6, hvad enten de nævnte variationer medfører ændringer i peptidsekvensen eller ej.

5. Et gen, som koder for humant BMP-4 og omfatter DNA--sekvensen anført i krav 11.

15 6. Et gen, som koder for et protein, som udviser egen skaber af BMP-4, og omfatter en DNA-sekvens: (a) som adskiller sig fra DNA-sekvensen anført i krav 11 i kodonsekvens på grund af degenerationen af den genetiske kode, 20 (b) som hybridiserer med DNA-sekvensen anført i krav 11 eller afsnit (a) ovenfor, eller (c) udgør et fragment, en allelisk eller anden variation af DNA-sekvensen anført i krav 11, hvad enten den nævnte variation medfører ændringer i 25 peptidsekvensen eller ej.

7. En vektor indeholdende et gen eller en DNA-sekvens ifølge opfindelsen i operativ forbindelse med en ekspressionskontrolsekvens .

8. En celle transformeret med en vektor ifølge opfin- 30 delsen.

9. Et protein, som udviser egenskaber af BMP-2, og som kodes af et gen eller en DNA-sekvens ifølge opfindelsen.

10. Et protein, som udviser egenskaber af BMP-4, og som kodes af et gen eller en DNA-sekvens ifølge opfindelsen.

35 11. En fremgangsmåde til fremstilling af et protein ifølge opfindelsen, omfattende dyrkning i et egnet dyrknings- 4 DK 172275 B1 medium af en celle ifølge opfindelsen og isolering af proteinet fra dyrkningsmediet.

12. Et farmaceutisk præparat indeholdende proteinerne ifølge opfindelsen, enkeltvis eller i kombination, og et 5 farmaceutisk acceptabelt bærestof.

13. Anvendelsen af proteiner ifølge opfindelsen, enkeltvis eller i kombination, til fremstilling af et farmaceutisk præparat til fremkaldelse af knogle- eller bindevævsdannelse.

10 Den foreliggende opfindelse angår således bl.a. to hidtil ukendte proteiner i renset form, som nærmere bestemt betegnes BMP-2 klasse I (eller BMP-2) og BMP-2 klasse II (eller BMP-4), hvor BMP betyder ben-morfogent protein. Disse proteiner er karakteriseret ved peptidsekvenser, der er de 15 samme som eller i det væsentlige er homologe med aminosyre-sekvenser, der er illustreret i tabel II, III og IV nedenfor. De er i stand til at fremkalde bendannelse på et forudbestemt sted. Disse beninducerende faktorer er yderligere karakteriseret ved biokemiske og biologiske egenskaber om-20 fattende aktivitet ved en koncentration på 10-1000 ng/g knogle ved en knogledannelsesbestemmelse in vivo hos rotter, der er beskrevet nedenfor. Proteinerne ifølge opfindelsen kan kodes af DNA-sekvenserne, der er vist i tabellerne, eller af sekvenser, der er i stand til at hybridisere dertil 25 og kode for polypeptider med knoglevækstfaktor-biologiske egenskaber eller andre på forskellig måde modificerede sekvenser, der udviser sådanne egenskaber.

Et af proteinerne ifølge opfindelsen betegnes BMP-2 klasse I (eller BMP-2). Det er karakteriseret ved i det 30 mindste en del af en peptidsekvens, der er samme eller i det væsentlige den samme som sekvensen af aminosyre nr. l til aminosyre nr. 396 i tabel III, der repræsenterer cDNA-hBMP-2 klasse I. Denne peptidsekvens kodes af den samme eller i det væsentlige den samme DNA-sekvens som vist ved 35 nukleotid nr. 356 til nukleotid nr. 1543 i tabel III. Den humane peptidsekvens anført i tabel VII har en længde på 5 DK 172275 B1 396 aminosyrer. hBMP-2 eller beslægtede beninducerende proteiner kan også være karakteriseret ved i det mindste en del af denne peptidsekvens. hBMP-2 klasse I er yderligere karakteriseret ved evnen til at inducere bendannelse.

5 Det homologe bovine beninducerende protein ifølge opfindelsen betegnet bBMP-2 klasse I (eller bBMP-2), har en DNA-sekvens anført i tabel II nedenfor, der repræsenterer den genomiske sekvens. Denne bovine DNA-sekvens har en mulig kodende sekvens for 129 aminosyrer efterfulgt af ca. 205 10 nuleotider (en formodet 3’-ikke-kodende sekvens). bBMP-2, klasse I er yderligere karakteriseret ved evnen til at inducere bendannelse. Et yderligere beninducerende proteinmateriale ifølge opfindelsen betegnes BMP-2 klasse II eller BMP-4. Det humane protein hBMP-2 klasse II (eller hBMP-4) 15 er karakteriseret ved i det mindste en del af den samme eller i det væsentlige den samme peptidsekvens mellem aminosyre nr. 1 til aminosyre nr. 408 i tabel IV, der repræsenterer cDNA af hBMP-2 klasse II. Denne peptidsekvens kodes af i det mindste en del af den samme eller i det væsentlige 20 den samme DNA-sekvens som vist ved nukleotid nr. 403 til nukleotid nr. 1626 i tabel IV. Denne faktor er yderligere karakteriseret ved evnen til at inducere bendannelse.

Ifølge et andet aspekt af opfindelsen tilvejebringes farmaceutiske præparater indeholdende en terapeutisk effektiv 25 mængde af et eller flere knoglevækstfaktor-polypeptider ifølge opfindelsen i et farmaceutisk acceptabelt bærestof. Disse præparater kan yderligere indeholde andre terapeutisk nyttige midler. De kan også omfatte en passende matriks til at føre proteinerne til stedet for knogledefekten og til 30 tilvejebringelse af en struktur til benvækst. Disse præparater kan anvendes ved metoder til behandling af et antal knogledefekter og periodontal sygdom. Disse metoder ifølge opfindelsen involverer indgivelse til en patient, der har behov for en sådan bendannelse, af en effektiv mængde af 35 mindst ét af de hidtil ukendte proteiner BMP-2 klasse I og BMP-2 klasse II som beskrevet i den foreliggende beskrivelse.

6 DK 172275 B1

Ifølge endnu et aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes DNA-sekvenser; der ved ekspression koder for et humant eller bovint polypeptid, der har evnen til at inducere benvævsdannelse. Sådanne sekvenser omfatter sekven-5 sen af nukleotider i retningen fra 5' til 3', der er illustreret i tabellerne II, III og IV. Alternativt omfatter den foreliggende opfindelse en DNA-sekvens, der hybridiserer under stringente betingelser med DNA-sekvenserne i tabel II, III og IV, eller en DNA-sekvens, der hybridiserer under 10 ikke-stringente betingelser med de illustrerede DNA-sekven-ser, og som ved ekspression koder for et protein, der har mindst én knoglevækstfaktor-biologisk egenskab. Endelig omfatter den foreliggende opfindelse allele eller andre variationer af sekvenserne i tabel II, III og IV, hvadenten 15 sådanne nukleotidændringer medfører ændringer af peptidsekvensen eller ej.

Et yderligere aspekt af opfindelsen er en vektor indeholdende en DNA-sekvens som ovenfor beskrevet bundet operativt til en ekspressionskontrolsekvens. En sådan vektor 20 kan anvendes ved en særlig fremgangsmåde til fremstilling af et knoglevækstfaktor-polypeptid, hvorved en cellelinie transformeret med en DNA-sekvens, der koder for ekspression af et knoglevækstfaktor-polypeptid bundet operativt til en ekspressionskontrolsekvens derfor, dyrkes. Ved denne frem-25 gangsmåde kan et antal kendte celler anvendes som værtsceller til ekspression af polypeptidet. I øjeblikket foretrukne cellelinier er pattedyr-cellelinier og bakterieceller.

Andre aspekter af og fordele ved den foreliggende opfindelse vil fremgå af den følgende detaljerede beskrivelse 30 og de foretrukne udførelsesformer derfor.

Proteinerne ifølge den foreliggende opfindelse er karakteriseret ved aminosyresekvenser eller dele deraf, som er de samme som eller i det væsentlige homologe med sekvenserne anført i tabel II, III og VI nedenfor. Disse protei-35 ner er også karakteriseret ved evnen til at inducere bendannelse.

7 DK 172275 B1

De her omhandlede knoglevækstfaktorer omfatter også faktorer, som kodes af sekvenser, der ligner de i tabel II, III og IV anførte, men hvori modifikationer er fremkommet naturligt (f.eks. allele variationer i nukleotidsekvensen, 5 der medføre aminosyreændringer i polypeptidet) eller er tilvejebragt tilsigtet. F.eks. kan syntetiske polypeptider helt eller delvis være kopier af kontinuerlige sekvenser af aminosyreresterne i tabel II, III og IV. Disse sekvenser kan, fordi de har primære, sekundære eller tertiære struktu-10 relle og konformationsmæssige karakteristika fælles med knoglevækstfaktor-polypeptider i tabel II, III og IV, have knoglevækstfaktor-biologiske egenskaber fælles dermed. De kan således anvendes som biologisk aktive erstatninger for naturligt forekommende knoglevækstfaktor-polypeptider ved 15 terapeutiske metoder.

Andre specifikke mutationer af sekvenserne af de her beskrevne knoglevækstfaktorer omfatter modifikationer ved det ene eller begge glycosyleringssteder. Manglende glyco-sylering eller kun delvis glycosylering skyldes aminosyre-20 substitution eller -udeladelser ved det ene eller begge de asparagin-bundne glycosylerings-genkendelsessteder, der er til stede i sekvenserne af knoglevækstfaktorerne vist i tabel II, III og IV. De asparagin-bundne glycosylerings-genkendelsessteder omfatter tripeptidsekvenser, der genkendes 25 specifikt af passende cellulære glycosyleringsenzymer. Disse tripeptidsekvenser er enten asparagin-X-threonin eller as-paragin-X-serin, hvori X sædvanligvis er enhver aminosyre. Forskellige aminosyresubstitutioner eller -udeladelser ved den første eller tredje aminosyreposition eller ved begge 30 positioner af et glycosylerings-genkendelsessted (og/eller aminosyreudeladelse ved den anden position) medfører ikke-glycosylering ved den modificerede tripeptidsekvens.

Den foreliggende opfindelse omfatter også de hidtil ukendte DNA-sekvenser, der er frie for tilknytning til DNA-35 sekvenser, der koder for andre proteinmaterialer, og som ved ekspression koder for knoglevækstfaktorer. Disse DNA- 8 DK 172275 B1 sekvenser omfatter de sekvenser, der er vist i tabel II, III og IV i en retning fra 5' til 3' og de sekvenser, der hybridiseres under stringente hybridiseringsbetingelser (jf. T. Maniatis et al., Molecular cloning (A Laboratory 5 Manual) Cold Spring Harbor Laboratory (1982), side 387-389) til DNA-sekvenserne i tabel II, III og IV.

DNA-Sekvenser, som hybridiseres til sekvenserne i tabel II, III og IV under ikke-stringente hybridiseringsbetingelser, og som ved ekspression koder for knoglevækstfak-10 torer, der 'har knoglevækstfaktor-biologiske egenskaber, koder også for knoglevækstfaktorer ifølge opfindelsen. F.eks. vil en DNA-sekvens, som har regioner med væsentlig homologi, f.eks. glycosyleringssteder eller disulfidbindinger, fælles med sekvenserne i tabel II, III og IV og koder for en knogle-15 vækstfaktor, der har en eller flere knoglevækstfaktor-biologiske egenskaber, klart kode for et medlem af denne hidtil ukendte gruppe af vækstfaktorer, selv om en sådan DNA-sekvens ikke vil hybridiseres stringent til sekvensen i tabel II, III og IV.

20 På lignende måde vil DNA-sekvenser, der koder for knoglevækstfaktor-polypeptider, som kodes af sekvenserne i tabel II, III og IV, men som adskiller sig med hensyn til kodonsekvens på grund af degeneration af den genetiske kode eller allele variationer (naturligt forekommende baseændrin-25 ger i artspopulationen, der eventuelt kan medføre en aminosy-reændring), også kode for de her omhandlede hidtil ukendte vækstfaktorer. Variationer i DNA-sekvenserne i tabel II, III og IV, som forårsages af punktmutationer eller af inducerede modifikationer for at forøge aktiviteten, halve-30 ringstiden eller produktionen af polypeptiderne, der kodes deraf, er også omfattet af opfindelsen.

Ifølge et andet aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes en fremgangsmåde til fremstilling af de hidtil ukendte osteoinduktive faktorer. Fremgangsmåden ifølge op-35 findelsen involverer dyrkning af en egnet celle eller cellelinie, der er blevet transformeret med en DNA-sekvens, 9 DK 172275 B1 der ved ekspression koder for et knoglevækstf aktor-polypeptid ifølge opfindelsen under kontrol af kendte regulatoriske sekvenser. Egnede celler eller cellelinier kan være pattedyrceller, såsom ovarieceller af kinesisk hamster (CHO-celler).

5 Selektionen af egnede pattedyr-værtsceller og metoder til transformation, dyrkning, forstærkning, screening og produktproduktion og -rensning er kendte, jf. f.eks. Gething og Sambrock, Nature, 293:620-625 (1981), eller alternativt

Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 5(7):1750-1759 (1985) eller 10 US patentskrift nr. 4.419.446. En anden egnet pattedyrcellelinie, som beskrives i eksemplerne nedenfor, er abe-COS- 1-cellelinien. En på lignende måde anvendelig pattedyr-cellelinie er CV-l-cellelinien.

Bakterieceller er egnede værtsorganismer. F.eks. er 15 forskellige stammer af E. coli (f.eks. HB101, MC1061) velkendte som værtsceller inden for det bioteknologiske område. Forskellige stammer af B. subtilis, Pseudomonas, andre ba-cillusarter og lignende kan også anvendes ved denne fremgangsmåde.

20 Mange stammer af gærceller, der er kendt af fagmanden, står også til rådighed som værtsceller til ekspression af polypeptiderne ifølge den foreliggende opfindelse. Desuden kan der om ønsket anvendes insektceller som værtsceller ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, jf. f.eks. Miller et 25 al., Genetic Engineering 8:277-298 (Plenum Press 1986) og deri anførte litteraturhenvisninger.

Ifølge et andet aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes vektorer til anvendelse ved fremgangsmåden til ekspression af disse hidtil ukendte osteoinduktive po-30 lypeptider. Vektorerne indeholder fortrinsvis de fuldstændige, hidtil ukendte DNA-sekvenser, som er beskrevet ovenfor, og som koder for de her omhandlede faktorer. Desuden indeholder vektorerne også passende ekspressionskontrolsekvenser, der muliggør ekspression af de beninducerende pro-35 teinsekvenser. Alternativt er vektorer, der indeholder modificerede sekvenser som ovenfor beskrevet, også udførelses- DK 172275 Bl 10 former for den foreliggende opfindelse og anvendelige ved fremstilling af de beninducerende proteiner. Vektorerne kan anvendes ved metoden til transformering af cellelinier og indeholder udvalgte regulatoriske sekvenser knyttet operativt 5 til de kodende DNA-sekvenser ifølge opfindelsen, som er i stand til at styre replikationen og ekspressionen deraf i udvalgte værtsceller. Anvendelige regulatoriske sekvenser til sådanne vektorer er kendte af fagmanden og kan vælges afhængigt af de valgte værtsceller. En sådan udvælgelse er 10 rutinemæssig og udgør ikke en del af den foreliggende opfindelse.

Et protein ifølge den foreliggende opfindelse, som inducerer knoglevækst under omstændigheder, hvor der ikke normalt dannes knogle, finder anvendelse ved heling af knog-15 lebrud. Et osteogent præparat, hvori der anvendes et eller flere af proteinerne ifølge opfindelsen, kan finde profylaktisk anvendelse ved heling af lukkede såvel som åbne brud samt ved forbedret fiksering af kunstige led. Ny bendannelse fremkaldt af et osteogent middel bidrager til reparation af 20 craniofaciale defekter, som er medfødte, fremkaldt af trauma eller fremkaldt ved onkologisk resektion, og er også nyttig ved kosmetisk plastisk kirurgi. En osteogen faktor ifølge opfindelsen kan være værdifuld ved behandling af periodontal sygdom og ved andre tandreparationsprocesser, sådanne midler 25 kan tilvejebringe omgivelser, der tiltrækker bendannende celler, stimulerer vækst af bendannende celler eller fremkalder differentiering af afkom af bendannende celler. Naturligvis kan proteinerne ifølge opfindelsen have andre terapeutiske anvendelser.

30 Et yderligere aspekt af opfindelsen er et terapeutisk præparat til heling af frakturer og andre tilstande, der er knyttet til knogledefekter eller periodontale sygdomme. Et sådant præparat indeholder en terapeutisk effektiv mængde af mindst ét af knoglevækstfaktor-proteinerne ifølge opfin-35 delsen. Knoglevækstfaktorerne ifølge opfindelsen kan være til stede i et terapeutisk præparat i blanding med et farma- 11 DK 172275 B1 ceutisk acceptabelt bærestof eller matriks. Yderligere terapeutiske præparater ifølge opfindelsen omfatter en terapeutisk mængde af en beninducerende faktor ifølge opfindelsen sammen med en terapeutisk mængde af mindst én af de andre 5 beninducerende faktorer ifølge opfindelsen. Desuden kan proteinerne ifølge opfindelsen eller en kombination af proteiner ifølge opfindelsen indgives sammen med en eller flere andre osteoinduktive faktorer, som de kan vekselvirke med. Endvidere kan de beninducerende proteiner kombineres med 10 andre midler, der er gunstige for behandlingen af de omhandlede knogledefekter. Sådanne midler omfatter, men er ikke begrænset til, forskellige vækstfaktorer. Fremstillingen af sådanne fysiologisk acceptable proteinpræparater, hvor der tages behørigt hensyn til pH-værdi, isotonicitet, stabi-15 litet og lignende, ligger inden for fagmandens rækkevidde.

Især kan BMP-2 klasse I anvendes særskilt i et farmaceutisk præparat. BMP-2 klasse I kan også anvendes i kombination med et eller flere af de andre proteiner ifølge opfindelsen. BMP-2 klasse I kan kombineres med BMP-2 klasse II.

20 Det kan også kombineres med BMP-3. Yderligere kan BMP-2 klasse I kombineres med BMP-2 klasse II og BMP-3.

BMP-2 klasse II kan anvendes særskilt i et farmaceutisk præparat. Det kan desuden anvendes i kombination med andre proteiner som ovenfor anført. Det kan endvidere anven-25 des i kombination med BMP-3.

Det terapeutiske præparat kan anvendes ved lokal indgivelse af præparatet som et implantat eller en anordning.

Ved indgivelsen er det terapeutiske præparat til anvendelse ifølge opfindelsen naturligvis i en pyrogenfri, fysiologisk 30 acceptabel form. Endvidere kan præparatet ønskeligt være indkapslet eller blive indsprøjtet i viskos form til tilførsel på stedet for knogleskade. Fortrinsvis vil præparatet af knoglevækstfremkaldende faktor omfatte en matriks, der er i stand til at føre den knoglevækstfremkaldende faktor til 35 stedet for knogleskade, tilvejebringe en struktur for den udviklende knogle og bindevævet og være optimalt i stand 12 DK 172275 B1 til at blive resorberet i kroppen. Sådanne matrikser kan være dannet af andre materialer, der i øjeblikket anvendes til andre medicinske implantationsformål.

Materialet vælges på basis af f.eks. biologisk for-5 enelighed, biologisk nedbrydelighed, mekaniske egenskaber, kosmetisk udseende og grænsefladeegenskaber. På lignende måde vil anvendelsen af de osteoinduktive faktorer bestemme den rette formulering. Mulige matrikser for de osteoinduktive faktorer kan være biologisk nedbrydelige og kemisk defineret, 10 men ikke begrænset til f.eks. calciumsulfat, tricalcium-phosphat, hydroxyapatit, polymælkesyre, polyanhydrider, eller de kan være biologisk nedbrydelige og biologisk veldefinerede, såsom knogle- eller hudkollagen, andre rene proteiner eller ekstracellulære matrikskomponenter, eller 15 de kan være ikke-bionedbrydelige og kemisk definerede, såsom sintret hydroxyapatit, bioglas, aluminater eller andre keramiske materialer, eller kombinationer af enhver af de ovennævnte typer af materialer, såsom polymælkesyre og hydroxyapatit eller kollagen og tricalciumphosphat. De biokeramiske 20 materialer kan eventuelt også ændres i sammensætning, såsom i calcium-aluminium-phosphat, og forarbejdning til ændring af f.eks. porestørrelse, partikelstørrelse, partikelform og biologisk nedbrydelighed.

Dosisplanen vil blive bestemt af den pågældende læge 25 på baggrund af forskellige faktorer, der modificerer virkningen af en sådan vækstfaktor, f.eks. den vægtmængde knogle der ønskes dannet, stedet for knogleskaden, tilstanden af den beskadigede knogle, patientens alder, køn og diæt, sværhedsgraden af en eventuel infektion, tidspunktet for ind-30 givelse og andre kliniske faktorer. Doseringen kan variere med typen af matriks anvendt ved rekonstitueringen og sammensætningen af BMP'er. Tilsætning af andre kendte vækstfaktorer, IGF-1 (insulinlignende vækstfaktor 1), til det færdige præparat kan også påvirke doseringen. Generelt bør doseringen 35 være i området ca. 10 til 106 ng protein pr. ønsket gram knoglevægt. Fremskridtet kan overvåges ved periodisk vurde- 13 DK 172275 B1 ring af knoglevæksten og/eller -reparationen, f.eks. ved røntgenfotografering. Sådanne terapeutiske præparater er også anvendelige til veterinære formål på grund af den manglende artsspecificitet hos beninducerende faktorer. Foruden 5 mennekser er især husdyr og raceheste ønskede patienter til en sådan behandling med de knogleinducerende faktorer ifølge opfindelsen.

De følgende eksempler illustrerer den foreliggende opfindelse med hensyn til udvinding og karakterisering af 10 de bovine proteiner og anvendelsen af disse til udvinding af de humane proteiner, tilvejebringelsen af de humane proteiner og exprimeringen af proteiner ved rekombinante metoder.

15 Eksempel 1

Isolering af bovin benvævsinducerende faktor.

Formalet bovint knoglepulver (20-120 mesh, Helitrex) præpareres ved procedurerne ifølge M. R. Urist et al., Proc.

20 Natl Acad. Sci USA 70:3511 (1973) med udeladelse af visse ekstraktionstrin som nedenfor anført. 10 kg af det formalede pulver demineraliseres ved successive udskiftninger af 0,6 N saltsyre ved 4°C over et tidsrum på 48 timer under kraftig omrøring. Den fremkomne suspension ekstraheres i 16 25 timer ved 4°C med 50 liter 2 M calciumchlorid og 10 mM ethy-lendiamintetraeddikesyre (EDTA), hvorefter der ekstraheres i 4 timer med 50 liter 0,5 M EDTA. Remanensen vaskes tre gange med destilleret vand, før den resuspenderes i 20 liter 4 M guanidinhydrochlorid (GuCl), 20 mM Tris (pH-værdi 7,4) 30 1 mM N-ethylmaleimid, 1 mM iodacetamid, 1 mM phenylmethyl- sulfonylfluorid som beskrevet i Clin. Orthop. Rel. Res. 171:213 (1982). Efter 16-20 timer fjernes den ovenstående væske og erstattes med yderligere 10 liter GuCl-puffer. Remanensen ekstraheres i yderligere 24 timer.

35 De rå GuCl-ekstrakter forenes, koncentreres ca. 20 gange på et Pellicon-apparat med en membran med en molekyl- 14 DK 172275 B1 vægtsafskæring på 10.000 og dialyseres derefter i 50 mM Tris, 0,1 M NaCl, 6 M urinstof (pH-værdi 7,2), som er startpufferen for den første søjle. Efter omfattende dialyse anbringes proteinet på en 4 liters DEAE-cellulosesøjle, og 5 de ikke-bundne fraktioner opsamles.

De ikke-bundne fraktioner koncentreres og dialyseres mod 50 mM NaAc, 50 mM NaCl (pH-værdi 4,6) i 6 M urinstof.

De ikke-bundne fraktioner anbringes på en carboxymethylcel-lulose-søjle. Protein, som ikke bindes til søjlen, fjernes 10 ved grundig vaskning med startpuffer, og materialet indeholdende beninducerende faktor desorberes fra søjlen med 50 mM NaAc, 0,25 mM NaCl, 6 M urinstof (pH-værdi 4,6). Proteinet fra dette elueringstrin koncentreres 20-40 gange, hvorefter det fortyndes 5 gange med 80 mM KPO4, 6 M urinstof (pH-værdi 15 6,0). pH-Værdien af opløsningen indstilles til 6,0 med 500 mM K2HP04. Prøven anbringes på en hydroxylapatitsøjle (LKB) ækvilibreret i 80 mM KP04, 6 M urinstof (pH-værdi 6,0), og alt ikke-bundet protein fjernes ved vaskning af søjlen med den samme puffer. Knoglevækstfaktor-aktivitet 20 elueres med 100 mM KP04 (pH-værdi 7,4) og 6 M urinstof.

Proteinet koncentreres ca. 10 gange, og der tilsættes fast NaCl til en slutkoncentration på 0,15 M. Dette materiale anbringes på en heparin-"Sepharose"-søjle, der er bragt i ligevægt i 50 mM KP04, 150 mM NaCl, 6 M urinstof (pH-værdi 25 7,4). Efter grundig vaskning af søjlen med startpuffer elu eres et protein med knoglevækstfaktoraktivitet med 50 mM KPO4, 700 mM NaCl, 6 M urinstof (pH-værdi 7,4). Denne fraktion koncentreres til et minimalt volumen, og 0,4 ml's portioner anbringes på "Superose 6"- og "Superose 12"-søjler, 30 der er forbundet i serie og bragt i ligevægt med 4 M GuCl, 20 mM Tris (pH-værdi 7,2), og søjlerne elueres med en strømningshastighed på 0,25 ml/min. Proteinet, der udviser beninducerende faktor-aktivitet har en relativ vandring svarende til et protein på ca. 30.000 dalton.

35 De ovenfor anførte fraktioner pooles, dialyseres mod 50 mM NaAc, 6 M urinstof (pH-værdi 4,6) og anbringes på en 15 DK 172275 B1

Pharmacia "Monos HR"-søjle. Søjlen elueres med en gradient op til 1,0 M NaCl, 50 mM NaAc, 6 M urinstof (pH-værdi 4,6). Aktive fraktioner forenes og indstilles til en pH-værdi på 3,0 med 10%'s trifluoreddikesyre (TFA). Materialet anbringes 5 på en 0,46 x 25 cm's "Vydac C4"-søjle i 0,1% TFA, og søjlen elueres med en gradient op til 90% acetonitril, 0,1% TFA (31,5% acetonitril, 0,1% TFA til 49,5% acetonitril, 0,1% TFA i 60 minutter ved 1 ml/minut). Aktivt materiale elueres ved ca. 40-44% acetonitril. Portioner af de aktive fraktioner 10 ioderes ved en af de følgende metoder: P. J. McConahey et al., Int. Arch. Allergy, 29:185-189 (1966); A. E. Bolton et al., Biochem J. . 133:529 (1973); og D. F. Bowen-Pope, J.

Biol. Chem.. 237:5161 (1982). De ioderede proteiner, der er til stede i disse fraktioner, analyseres ved SDS-gelelektro-15 forese og urinstof-"Triton X-100"-isoelektrisk fokusering.

På dette stadium vurderes den beninducerende faktor til at være ca. 10-50% ren.

Eksempel 2 20

Karakterisering af bovin beninducerende faktor A. Molekylvægt.

Ca. 20 Mg protein fra eksempel 1 frysetørres og genopløses i IX SDS-prøvepuffer. Efter 15 minutters opvarmning 25 til 37°C anbringes prøven på en 15%'s SDS-polyacrylamidgel og underkastes derefter elektroforese under afkøling. Molekylvægten bestemmes i forhold til for-farvede molekylvægtsstandarder (Bethesda Research Labs). Umiddelbart efter endt elektroforese opskæres gelbanen indeholdende beninducerende 30 faktor i 0,3 cm's stykker. Hvert stykke knuses, og der tilsættes 1,4 ml 0,1%'s SDS. Prøverne omrystes forsigtigt natten over ved stuetemperatur til eluering af proteinet. Hver gelskive afsaltes for at forhindre interferens ved den biologiske bestemmelse. Den ovenstående væske fra hver prøve 35 gøres sur til en pH-værdi på 3,0 med 10%'s TFA, filtreres gennem en 0,45 Mm membran og anbringes på en 0,46 x 5 cm's 16 DK 172275 B1 "Vydac C4"-søjle, hvorefter der elueres med en en gradient af 0,1% TFA til 0,1% TFA, 90% acetonitril. De rette knogle-vækstfaktor-holdige fraktioner forenes og rekonstitueres med 20 mg rottematrix. I dette gelsystem har størstedelen 5 af knoglevækstfaktorfraktionerne mobilitet som et protein med en molekylvægt på ca. 28.000-30.000 dalton.

B. Isoelektrisk fokusering.

Det isoelektriske punkt af knoglevækstfaktoraktivitet 10 bestemmes i et denaturerende isoelektrisk fokuseringssystem. "Triton X-100"-urinstof-gelsystemet (Hoeffer Scientific) modificeres på følgende måde: 1) 40% af de anvendte amfolyter er "Servalyte 3/10", 60% er "Servalyte 7-9". 2) Den anvendte katolyt er 40 mM natriumhydroxid. Ca. 20 pg protein fra 15 eksempel 1 frysetørres, opløses i prøvepuffer og anbringes på isoelektrofokuseringsgelen. Gelen underkastes isoelektrisk fokusering ved 20 watt, 10°C i ca. 3 timer. Derefter opskæres banen indeholdende knoglevækstfaktor i en 0,5 cm1 s skiver. Hver skive knuses i 1,0 ml 6 M urinstof, 5 mM Tris (pH-værdi 20 7,8), og prøverne omrøres ved stuetemperatur. Prøverne gøres sure, filtreres, afsaltes og underkastes bestemmelse som ovenfor beskrevet. Størstedelen af aktiviteten som bestemt ved bestemmelsen beskrevet i eksempel 3 vandrer på en måde, der stemmer overens med en pi-værdi på 8,8-9,2.

25 C. Underenheds-karakterisering.

Underenhedssammensætningen af knoglevækstfaktor bestemmes også. Ren knoglevækstfaktor isoleres fra en præparativ 15%'s SDS-gel som ovenfor beskrevet. En del af prøven 30 reduceres derefter med 5 mM DTT i prøvepuffer og underkastes igen elektroforese på en 15%'s SDS-gel. Proteinet på ca.

30 kd giver to hovedbånd ved ca. 20 kd og 18 kd samt et mindre bånd ved 30 kd. Bredden af de to bånd viser en heterogenitet, der mest sandsynligt forårsages af glycosylering, 35 anden modifikation efter translation, proteolytisk nedbrydning eller carbamylering.

DK 172275 B1 17

Eksempel 3

Biologisk aktivitet af beninducerende faktor

En knogledannelsesbestemmelse hos rotter ved den 5 generelle procedure ifølge Sampath og Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:6591-6595 (1983) benyttes til at vurdere den osteogene aktivitet af den bovine beninducerende faktor ifølge den foreliggende opfindelse, der er fremstillet i eksempel l. Denne bestemmelse kan også anvendes til at 10 vurdere beninducerende faktorer fra andre arter. Ethanolud-fældningstrinet erstattes med en dialyse af fraktionen, der skal underkastes bestemmelse, mod vand. Opløsningen eller suspensionen genopløses derefter i et flygtigt opløsningsmiddel, f.eks. 0,1-0,2%'s TFA, og den fremkomne opløsning 15 sættes til 20 mg rotte-matriks. Dette materiale fryses og frysetørres, og det fremkomne pulver indesluttes i gelatinekapsler nr. 5. Kapslerne implanteres subcutant i det ab-dominale thoraxområde af 21-49 dage gamle Evans-hanrotter. Implantaterne fjernes efter 7-14 dage. Halvdelen af hvert 20 implantat anvendes til analyse for alkalisk phosphatase (jf. A. H. Reddi et al., Proc. Natl. Acad. Sci.. 69:1601 (1972)), og halvdelen fikseres og forberedes til histologisk analyse. 1 μιη glycolmethacrylat-snit farves rutinemæssigt med Von Kossa-medium og syrefuchsin til påvisning af nyt 25 benmateriale. Alkalisk phosphatase, et enzym, som produceres af chondroblaster og osteoblaster under matriksdannelse, bestemmes også. Ny bindevævs- og benvævsdannelse følger ofte niveauerne af alkalisk phosphatase. Tabel I nedenfor illustrerer dosis-reaktionen af rottematriksprøverne in-30 klusive en kontrol, der ikke er behandlet med beninducerende faktor.

35 18 DK 172275 B1

Tabel I

Alkalisk phosphatase, 5 Implanteret protein*, μq Bindevæv enheder/liter 7.5 2 Ikke bestemt 2.5 3 445,7 0,83 3 77,4 10 0,28 0 32,5 0,00 0 31,0 *) På dette stadium er den beninducerende faktor ca. 10-15% ren.

15

Det dannede benvæv eller bindevæv er fysisk begrænset til rummet, der optages af matriksen. Prøverne analyseres også ved SDS-gelelektroforese og isoelektrofokusering som beskrevet ovenfor, efterfulgt af autoradiografi. Analyse 20 viser en korrelation af aktivitet med proteinbånd ved 28-30 kD og en pi-værdi 9,0. En ekstinktionskoefficient på 1 OD/mg-cm anvendes som et estimat for protein og til tilnærmelsesvis bestemmelse af renheden af ben inducerende faktor i en bestemt fraktion. Ved bendannelsesbestemmelserne hos 25 rotter in vivo på fortyndinger som ovenfor beskrevet er proteinet aktivt in vivo i en mængde på 10-200 ng protein/-gram ben til formentlig mere end 1 pg protein/gram ben.

Eksempel 4 30

Proteinsammensætnina af bovin beninducerende faktor

Proteinmaterialet fra eksempel 2A med en molekylvægt på 28-30 kD reduceres som beskrevet i eksempel 2C og nedbrydes med trypsin. Der isoleres ved standardprocedurer otte 35 tryptiske fragmenter, der har følgende aminosyresekvenser: 40 DK 172275 B1 19

Fragment 1: AAFLGDIALDEEDLG Fragment 2: AFQVQQAADL Fragment 3:NYQDMVVEG Fragment 4: STPAQDVSR 5 Fragment 5: N Q E A L R

Fragment 6: LSEPDPSHTLEE Fragment 7: F D A Y Y

Fragment 8: LKPSN7ATIQSIVE

10 Et mindre høj renset præparat af protein fra okseknogle fremstilles ifølge et rensningskema, der ligner det i eksempel 1 beskrevne. Rensningen adskiller sig i det væsentlige fra den ovenfor beskrevne ved udeladelsen af "DE-52"-søjlen, "CM-cellulose"-søjlen og "mono S"-søjlen samt ved en ombyt-15 ning af rækkefølgen af hydroxylapatit- og heparin-"Sepharo-se"-søjlerne. Kort fortalt indstilles den koncentrerede rå 4 M ekstrakt til en slutkoncentration af ethanol på 85% ved 4°C. Blandingen centrifugeres derefter, og bundfaldet genopløses i 50 mM Tris, 0,15 M natriumchlorid, 6,0 M urinstof.

20 Dette materiale fraktioneres derefter på heparin-"Sepharose" som beskrevet. Det heparinbundne materiale fraktioneres på hydroxyapatit som beskrevet. De aktive fraktioner pooles, koncentreres og fraktioneres ved højopløsnings-gelfiltrering (TSK 30.000 i 6 M guanidiumchlorid, 50 mM Tris, pH-værdi 25 7,2). De aktive fraktioner pooles, dialyseres mod 0,1% TFA

og fraktioneres derefter på en "04 Vydac" revers-fase-søjle som beskrevet. Præparatet reduceres og underkastes elektro-forese på en acrylamidgel. Proteinet svarende til 18 K-båndet elueres og nedbrydes med trypsin. Der isoleres tryptiske 30 fragmenter med følgende aminosyresekvenser:

Fragment 9: SLKPSNHATIQS7V Fragment 10: SFDAYYCS7A Fragment 11: VYPNMTVESCA

Fragment 12: VDFADI7W

35 20 DK 172275 B1

Det bemærkes, at de tryptiske fragmenter 7 og 8 i det væsentlige er de samme som fragmenterne 10 henholdsvis 9.

A. bBMP-2 5 To sonder bestående af pools af oligonucleotider udformes på basis af aminosyresekvensen af fragment 3 og syntetiseres på et automatiseret DNA-synteseapparat som beskrevet ovenfor.

Sonde nr. 1: ACNACCAT [A/G] T C [T/C] T G [A/G] A T 10 Sonde nr. 2: C A [A/G] G A [T/C] ATGGTNGTNGA

Disse sonder mærkes radioaktivt og anvendes til at screene det bovine genomiske bibliotek konstrueret på følgende måde: Bovint lever-DNA nedbrydes delvis med restrik-tionsendonucleaseenzymet Sau 3A og sedimenteres gennem en 15 saccharosegradient. Størrelsesfraktioneret DNA i området 15-30 kb ligeres derpå til lambda J1 BamHI arms-vektoren (Frischauf et al., J. Mol. Biol.. 170:827-842 (1983), Mullins et al., Nature 308: 856-858 (1984)). Biblioteket udplades med 8000 rekombinanter pr. plade. Nitrocellulosereplikaer i 20 to eksemplarer af de fremkomne plaques fremstilles og forstærkes ved en modifikation af proceduren ifølge Woo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75:3688-91 (1978). Den radioaktivt mærkede 17-mere sonde nr. 1 hybridiseres til sættet af filtre ved følgende metode: 25 Sonden behandles med kinase og hybridiseres til det andet sæt af filtre i 3 M tetramethylammoniumchlorid (TMAC) , 0,1 M natriumphosphat, pH-værdi 6,5, 1 mM EDTA, 5X Denhardts,

0,6% SDS, 100 μg/ml laksemælk-DNA ved 48°C og vaskes i 3 M

TMAC, 50 mM Tris, pH-værdi 8,0, ved 50°C. Disse betingelser 30 minimerer påvisningen af materialer, der ikke passer til sonde-poolen (se Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 82:1585-1588 (1985)). 400.000 rekombinanter screenes ved denne procedure.

En dobbelt positiv plaque-renses, og DNA isoleres 35 fra et pladelysat af den rekombinante bakteriofag betegnet λ bP-21. Bakteriofag bP-2l er deponeret hos ATCC under depo- 21 DK 172275 B1 neringsnummeret ATCC 40310 den 6. marts 1987. bP-21-klonen koder for den bovine vækstfaktor betegnet bBMP-2.

Den oligonukleotid-hybridiserende region af denne bBMP-2-klon lokaliseres til et ca. 1,2 kb Sac I-restrik-5 tionsfragment, som subklones i M13 og sekvensbestemmes ved standardmetoder. Den delvise DNA-sekvens og den afledte aminosyresekvens af dette Sac I-fragment og det tilstedende Hind III-Sac I-restriktionsfragment af bP-21 er vist nedenfor i tabel II. bBMP-2-peptidsekvensen fra denne klon har en 10 længde på 128 aminosyrer og kodes af DNA-sekvensen fra nu-kleotid nr. 1 til nukleotid nr. 387. Aminosyresekvensen svarende til det tryptiske fragment isoleret fra det bovine 28-30 kd-knoglemateriale er understreget i tabel II. Den understregede del af sekvensen svarer til det tryptiske 15 fragment 3 ovenfor, ud fra hvilket oligonukleotidsonderne for bBMP-2 er udformet. Den forudsagte aminosyresekvens viser, at det tryptiske fragment 3 foregås af en basisk rest (K) som forventet på baggrund af trypsins specificitet. Argininresten, der kodes af CGT-tripletten, formodes at 20 være carboxyterminussen af proteinet på basis af tilstedeværelsen af et stop kodon (TAG) i tilslutning dertil.

22 DK 172275 B1

Tabel II

(1) 15 30 45

GGC CAC GAT GGG AAA GGA CAC CCT CTC CAC AGA AGA GAA AAG CGG GHDGKGHPLHRREKR

60 75 90

CAA GCA AAA CAC AAA CAG CGG AAA CGC CTC AAG TCC AGC TGT AAG

QAKHKQRKRLKSSCK

105 120 135

AGA CAC CCT TTA TAT GTG GAC TTC AGT GAT GTG GGG TGG AAT GAC

RHPLYVDFSDVGWND

150 165 180

TGG ATC GTT GCA CCG CCG GGG TAT CAT GCC TTT TAC TGC CAT GGG

WIVAPPGYH AFYCHG

195 210 225

GAG TGC CCT TTT CCC CTG GCC GAT CAC CTT AAC TCC ACG AAT CAT

ECPFPLADHLNSTNH

240 255 270

GCC ATT CTC CAA ACT CTG GTC AAC TCA GTT AAC TCT AAG ATT CCC

AIVQTLVNSVNSKir 385 300 315

AAG GCA TGC TGT GTC CCA ACA GAG CTC AGC GCC AT< TCC ATG CTG

KACCVPTELSAISML

330 345 360

TAC CTT GAT GAG AAT GAG AAG GTG GTA TTA AAG AAC TAT CAG GAC

YLDENEKVVLK N Y O D

375 (129) 397 407

ATG GTT GTC GAG GGT TGT GGG TGT CGT TAGCACAGCA AAATAAAATA

Μ V V E G C G C R

417 427 437 447 457

TAAATATATA TATATATATA TTAGAAAAAC AGCAAAAAAA TCAAGTTGAC

467 477» 487 497 507

ACTTTAATAT TTCCCAATGA AGACTTTATT TATGGAATGG AATGGAGAAA

517 527 537 547 557

AAGAAAAACA CAGCTATTTT GAAAACTATA TTTATATCTA CCGAAAAGAA

567 577 587

GTTGGGAAAA CAAATATTTT AATCAGAGAA TTATT

23 DK 172275 B1

A. hBMP-2: Klasse I οα II

Det bovine genomiske HindIII/SacI-bBMP-2-fragment beskrevet i eksempel 4A subklones i en M13-vektor. En 32P-mærket enkeltstrenget DNA-sonde fremstilles ud fra et tem-5 plate-præparat af denne subklon. Denne sonde anvendes til at screene polyadenylerede RNA'er fra forskellige celle- og vævskilder. Polyadenylerede RNA'er fra forskellige celle- og vævskilder underkastes elektroforese på formaldehyd-agarose-geler og overfores til nitrocellulose ved metoden ifølge 10 Toole et al., se ovenfor. Sonden hybridiseres derefter til nitrocellulose-blottet i 50% formamid, 5 X SSC, 0,1% SDS, 40 mM natriumphosphat, pH-værdi 6,5, 100 μg/ml denatureret laksemælk-DNA og 5 mM vanadyl-ribonukleosider ved 42 °C natten over og vaskes ved 65°C i 0,2 X SSC, 0,1% SDS. Efter auto-15 radiografi påvises et hybridiserende bånd svarende til et mRNA på ca. 3,8 kb i banen indeholdende RNA fra den humane cellelinie U-2 OS. Hindlll/SacI-fragmentet mærkes med 32P ved nicktranslation og anvendes til at screene nitrocellulosef i lter-replikaerne af et U-2 OS cDNA-bibliotek ved hybri-20 disering i standardhybridiseringsbuffer ved 65°C natten over efterfulgt af vaskning i 1 X SSC, 0,1% SDS ved 65°C. Dette bibliotek konstrueres ved at syntetisere cDNA ud fra U-2 OS-polyadenyleret RNA og klone i λ gtlO ved velkendte metoder (Toole et al., se ovenfor). Tolv dobbelte positive 25 kloner udtages og udplades til dannelse af sekundære plader. Dobbelte nitrocellulosereplikaer fremstilles af de sekundære plader, og begge sæt hybridiseres til den bovine genomiske sonde på samme måde som ved gennemførelsen af den primære screening. Et sæt filtre vaskes derefter i 1 X SSC, 0,1% 30 SDS, og det andet sæt vaskes i 0,1 X SSC, 0,1% SDS ved 65°C.

To klasser af hBMP-2-cDNA-kloner er tydelige på basis af stærke (4 rekombinanter) eller svage (7 rekombinanter) hybridiseringssignaler under de mere stringente vasknings-betingelser (0,1 X SSC, 0,1% SDS). Alle 11 rekombinante 35 bakteriofager plaque-renses, der fremstilles DNA-præparater i lille skala ud fra pladelysater af hver af disse, og ind- 24 DK 172275 B1 satserne subklones i pSP65 og i M13 til sekvensanalyse. Sekvensanalyse af de stærkt hybridiserende kloner betegnet hBMP-2 klasse I (også kendt som BMP-2) viser, at de har en omfattende sekvenshomologi med sekvensen anført i tabel 5 II. Disse kloner er derfor cDNA, der koder for det humane ækvivalent af proteinet, der kodes af bBMP-2-genet, hvis delvise sekvens er anført i tabel II. Sekvensanalyse af de svagt hybridiserende rekombinanter betegnet hBMP-2 klasse II (også kendt som BMP-4) viser, at de også er ganske homo-10 loge med sekvensen anført i tabel III ved 3*-enden af deres kodende regioner, men mindre homologe i de mere 5'-regioner.

De koder således for et humant protein med en struktur, der ligner, men ikke er identisk med den ovenfor anførte.

hBMP-2 klasse I-cDNA-kloner med fuld længde fås på 15 følgende måde. 1,5 kb-indsatsen af en af klasse II-subklon-erne (II-10-1) isoleres og mærkes radioaktivt ved nicktrans-lation. Et sæt af nitrocellulosereplikaerne af U-2 OS cDNA--biblioteket screenet ovenfor (50 filtre, svarende til 1.000.000 rekombinante bakteriofager) rehybridiseres med 20 denne sonde under stringente betingelser (hybridisering ved 65°C i standardhybridiseringspuffer, vaskning ved 65°C i 0,2 X SSC, 0,1% SDS). Alle rekombinanter, som hybridiseres til den bovine genomiske sonde, som ikke hybridiseres til klasse Il-sonden, udtages og plaque-renses (10 rekombinan-25 ter). Der fremstilles pladelagre og fremstilles bakteriofag--DNA-præparater i lille skala. Efter subkloning i M13 viser sekvensanalyse, at fire af disse repræsenterer kloner, som overlapper den oprindelige klasse I-klonen. En af disse, λ U20S-39, indeholder en indsats på ca. 1,5 kb og er depo-30 neret hos ATCC den 16. juni 1987 under deponeringsnummeret 40345. Den delvise DNA-sekvens (samlet fra λ U20S-39 og flere andre hBMP-2 klasse I-cDNA-rekombinanter) og den afledte aminosyresekvens er anført nedenfor i tabel III. λ U20S-39 forventes at indeholde hele den nukleotidsekvens, 35 der er nødvendig for at kode hele det humane modstykke til proteinet BMP-2 klasse I, som kodes af det bovine genseg- 25 DK 172275 B1 ment, hvis delvise sekvens er anført i tabel II. Dette humane cDNA hBMP-2 klasse I indeholder en åben læseramme på 1188 bp, der koder for et protein på 396 aminosyrer. Dette protein på 396 aminosyrer har en molekylvægt på 45 kD baseret på 5 denne aminosyresekvens. Det antages, at denne sekvens repræsenterer det primære translationsprodukt. Proteinet foregås af en ikke-translateret 5'-region på 342 bp med stopkodoner i alle rammer. 13 bp-regionen, som går forud for denne ikke-translaterede 5'-region, repræsenterer en linker, der anven-10 des ved cDNA-kloningsproceduren.

26 DK 172275 B1

Tabel III

10 20 30 40 50 60 70

GTCGACTCTA GAGTCTGIGI CAGCACTIGG CTGGGGACIT CITGAACTIG CAGGGAGAAT AACITGCGCA

80 90 100 110 120 130 140

CCCCACITIG CGCOGGIGCC TTIGCCCCAG OGGAGCCIGC TTCGCCATCI CCG&GCCCCA æGCCCCTCC

150 160 170 180 190 200 210

ACTCCTOGGC CITGCCOGAC ACIGAGACGC TGTTCCCAGC GTGAAAAGAG AGACIGCGCG GCCGGCACCC

220 230 240 250 260 270 280

GGGAGAAGGA GGAGGCAAAG AAAAGGAAOG GACATTOGGT CCTIGCGCCA GGTCCTTIGA CCAGAGITTT

290 300 310 320 330 340 350

TCCAIGTCGA OGCTCTTTCA ATGGACGIGT CCCCGCGIGC TTCITAGAOG GACTGOGGTC T0CIAAAGGT

(1) 370 385 400

OGACC ATG GIG GCC GGG ACC CGC TGT CIT CIA GCG TIG CIG CTT CCC CAG GIC

MET Val Ala Gly Thr Arg Cys Leu Leu Ala Leu Leu Leu Pro Gin Val 415 430 445

CTC CIG CGC GGC GOG GCT CGC CTC GIT COG GAG CIG GGC CGC AGG AAG TTC GCG

Leu leu Gly Gly Ala Ala Gly Leu Val Pro Glu Leu Gly Arg Arg Lys Rie Ala 460 475 490 505

GCG GCG TOG TOG GGC CGC CCC TCA TCC CAG CCC TCT GAC GAG GIC CIG AGC GAG

Ala Ala Ser Ser Gly Arg Pro Ser Ser Gin Pro Ser Asp Glu Val Leu Ser Glu 520 535 550 565

TIC GAG TIG OGG CIG CTC AGC: ATG TIC GGC CIG AAA CAG AGA CCC ACC CCC AGC

Phe Glu Leu Arg Leu Leu Sav MET Rie Gly Leu Lys Gin Arg Pro Thr Pro Ser 580 595 610

AGG GAC GCC GIG GIG CCC CCC TAC ATG CIA GAC CIG TAT CGC AGG CAC TOG GGI

Arg Asp Ala Val Val Pro Pro lyr MET Leu Asp Leu Tyr Arg Arg His Ser Gly 625 640 655 670

CAG CCG GGC TCA CCC GCC CCA GAC CAC OGG TIG GAG AGG GCA GCC AGC OGA GCC

Gin Pro Gly Ser Pro Ala Pro Asp His Arg Leu Glu Arg Ala Ala Ser Arg Ala 685 700 715

AAC ACT GIG CGC AGC TTC CAC CAT GAA GAA TCI TIG GAA GAA CIA CCA GAA ACG

Asn Thr Val Arg Ser Rie His His Glu Glu Ser Leu Glu Glu Leu Pro Glu Thr 27 DK 172275 B1 730 745 760 775

AGT GGG AAA ACA ACC OGG AGA TTC TTC ΤΊΤ AAT TEA AGT TCT ATC CCC AOG GAG

Ser Gly Lys Thr Thr Arg Arg Fhe Fhe Rie Asn Leu Ser Ser Ile Pro Thr Glu 790 805 820 835 GAG ΤΤΓ ATC ACC TCA GCA GAG CTE CAG GIT TTC OGA GAA CAG AIG CAA GAT GCE Glu Fhe Ile Thr Ser Ala Glu Leu Gin Val Phe Arg Glu Gin MET Gin Asp Ala 850 865 880 TEA GGA AAC AAT AGC AGT TEC CAT CAC OGA ATT AAT ATE TAT GAA ATC ΑΙΑ AAA Leu Gly Asn Asn Ser Ser Fhe His His Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Ile Ile Lys 895 910 925 940 CCE GCA ACA GCC AAC TOS AAA TEC CCC GIG ACC AGT CEE TIG GAC ACC AGG TIG Pro Ala Thr Ala Asn Ser Lys Phe Pro Val Thr Ser Leu Leu Asp Thr Arg Leu 955 970 985

GIG AAT CAG AAT GCA AGC AGG TGG GAA AGT TIT GAT GTC ACC CCC GCE GIG ATG Val Asn Gin Asn Ala Ser Arg Trp Glu Ser Phe Asp Val Thr Pro Ala Val MET

1000 1015 1030 1045

CGG TGG ACT GCA CAG GGA CAC GCC AAC CAT GGA TIC GIG GTG GAA GIG GCC CAC

Arg Trp Thr Ala Gin Gly His Ala Asn His Gly Fhe Val Val Glu Val. Ala His 1060 1075 1090 1105 TIG GAG GAG AAA CAA GGT GIC TCC AAG AGA CAT GIT AGG ATA AGC AGC· ICj' Τ’Ύ! leu Glu Glu Lys Gin Gly Val Ser Lys Arg His Val Arg Ile Ser Aix> Ser i .

1120 1135 1150 CAC CAA GAT GAA CAC AGC TGG TCA CAG ATA AGG CCA TIG CIA GIA ACJ‘ TIT ££ His Gin Asp Glu His Ser Trp Ser Gin Ile Arg Pro Leu Leu Val Ihr Fhe Gly 1165 1180 1195 1210 CAT GAT GGA AAA GGG CAT CCT CTC CAC AAA AGA GAA AAA OGT CAA GCC AAA CAC His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg Gin Ala Lys His 1225 1240 1255 AAA CAG CGG AAA CGC CEE AAG TCC AGC TGT AAG AGA CAC CCT TIG TAC GTG GAC lys Gin Arg lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp 1270 1285 1300 1315

TTC AGT GAC GTG GGG TGG AAT GAC TGG ATE GIG GCE CCC COG GGG TAT CAC GCC

Fhe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Fro Gly Tyr His Ala 1330 1345 1360 1375 TEE TAC TGC CAC GGA GAA TGC CCE TIT CCT CIG GCE GAT CAT CIG AAC TCC ACT Fhe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Fhe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr 1390 1405 1420 AAT CAT GCC ATT GIT CAG AOG TIG GTC AAC TCT GTE AAC TCE AAG ATI CCT AAG Asn His Ala Ile Val Gin Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys 28 DK 172275 B1 1435 1450 1465 1480

GCA TCC TCT GTC COG ACA GAA CTC ACT GCT ATC TCG AIG CIG TAC CIT GAC GAG

Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser MET Leu Tyr Leu Asp Glu 5 1495 1510 1525

AAT GAA AAG GTT GIA ΊΤΑ AAG AAC TAT CAG GAC AIG CTT GTG GAG GCT TCT GGG

Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gin Asp MET Val Val Glu Gly Cys Gly 1540(396) 1553 1563 1573 1583 1593 1603 TCT CGC TACTACAGCA ΑΑΑΠΑΑΑΤΑ CATAAAIATA TAIAIAIAIA TAIAI'l'lTAG AAAAAAGAAA Cys Arg 10

AAAA

Humane cDNA-kloner af hBMP-2 klasse II med fuld længde 15 fås på følgende måde. 200 bp EcoRI/SacI-fragmentet fra 5'--enden af klasse II-rekombinanten II-10-1 isoleres fra plas-mid-subklonen, mærkes ved nicktranslation og hybridiseres til et sæt af dobbelte nitrocellulosereplikaer af U-2 OS--cDNA-biblioteket (25 filtre/sæt, hvilket repræsenterer 20 500.000 rekombinanter). Hybridiseringen og vaskningen gen nemføres under stringente betingelser som beskrevet ovenfor.

16 dobbelte positive motages og udplades til dannelse af sekundære plader. Nitrocellulosereplikaer af de sekundære plader fremstilles og hybridiseres til et oligonukleotid, 25 der er syntetiseret til at svare til sekvensen af II-10-1 og har følgende sekvens: CGGGCGCTCAGGATACTCAAGACCAGTGCTG. Hybridiseringen sker i standardhybridiseringspuffer ved 50°C med vaskning ved 50*C i 1 X SSC, 0,1% SDS. 14 rekom-binante bakteriofager, der hybridiserer til dette oligonu-3 0 kleotid, plaque-renses. Der fremstilles pladelagre og udføres fremstilling af bakteriofag-DNA i lille skala. Efter subklo-ning af tre af disse i M13 viser sekvensanalyse, at de repræsenterer kloner, som overlapper den oprindelige klasse

Il-klon. En af disse, λ U20S-3, er deponeret hos ATCC under 35 deponeringsnummeret 40342 den 16. juni 1987. U20S-3 indeholder en indsats på ca. 1,8 kb. Den delvise DNA-sekvens og 29 DK 172275 B1 den afledte aminosyresekvens af U20S-3 er vist nedenfor i tabel IV. Denne klon forventes at indeholde hele den nukleo-tidsekvens, der er nødvendig for at kode hele det humane BMP-2-klasse Il-protein. Dette cDNA indeholder en åben læse-5 ramme på 1224 bp, der koder for et protein på 408 aminosyrer, der foregås af en ikke-translateret 5'-region på 394 bp med stopkodoner i alle rammer og indeholder en ikke-translateret 3'-region på 308 bp efter stopkodonet i rammen. 8 bp-regio-nen, som går forud for den ikke-translaterede 5'-region, 10 repræsenterer en linker anvendt ved cDNA-kloningsproceduren. Dette protein på 408 aminosyrer har en molekylvægt på 47 kD og antages at repræsentere det primære translationsprodukt.

30 DK 172275 B1

Tabel IV

10 20 30 40 50 60 70

CTCEAGAGGG CAGAGGAGGA GGGAGGGAGG GAAGGAGOGC GGAGCCOGGC COGGAAGCIA GGTGACTGTG

80 90 100 110 120 130 140

GCATCCGAGC TGAGGGAOGC GAGCCTGAGA CGCCGCIGCT GCTCOGGCIG AGIATCIAGC TTCTCTCCCC

150 160 170 180 190 200 210

GAIGGGAITC OOCTCCAAGC TATCIOGAGC CTGCAGOGOC ACAGTCCCCG GCOCTOGOCC AGCTTCACTG

220 230 240 250 260 270 280

CAACOGTTCA. GAGGTCCCCA GGAGCTGCIG CTGGOGAGCC CGCIACTGCA GGGACCIATS GAGCCATICC

290 300 310 320 330 340 350

GIACTGCCAT CCOGAGCAAC GCACTGCTGC AGCITCCCIG AGCCITTCCA GCAAGTTIGT TCAAGA1TGG

360 370 380 390 400 (1)

CIGTCAAGAA TCATGGACTG TTATIATATC CCTTGTITTC TGTCAAGACA CC ATG ATT CCT

MET Ile Pro 417 432 447 462

GGT AAC OGA ATC CIG ATS CTC G?IT ΤΓΑ TIA TGC CAA GTC CIG CIA GGA GGC GOG

Gly Asn Arg MET Lsu ΜΞΠ’ Val Val Leu Leu Cys Gin Val Leu Leu Gly Gly Ala 477 492 507

AGC CAT GCT AGT TIG AIA CCT GAG AOG GGG AAG AAA AAA GTC GCC GAG ATT CAG

Ser His Ala Ser Leu Ile Pro Glu Thr Gly Lys Lys Lys Val Ala Glu Ile Gin 522 537 552 567

GGC CAC GOG GGA GGA GGC OGC TCA GGG CAG AGC CAT GAG CTC CIG OGG GAC TTC

Gly His Ala Gly Gly Arg Arg Ser Gly Gin Ser His Glu Leu Leu Arg Asp Rie 582 597 612 627

GAG GOS ACA CIT CIG CAG ATG TTT GGG CIG OGC OGC CGC CCG CAG CCT AGC AAG

Glu Ala Dir Leu Leu Gin MET Rie Gly Leu Arg Arg Arg Pro Gin Pro Ser Lys 642 657 672

AGT GCC GIC ATT CCG GAC TAC ATG CGG GAT CIT TAC OGG CIT CAG TCT GGG GAG

Ser Ala Val Ile Pro Asp Tyr MET Arg Asp Leu Tyr Arg Leu Gin Ser Gly Glu 687 702 717 732

GAG GAG GAA GAG CAG ATC CAC AGC ACT GGT CIT GAG TAT CCT GAG OGC CCG GCC

Glu Glu Glu Glu Gin Ile His Ser Thr Gly Leu Glu Tyr Pro Glu Arg Pro Ala 31 DK 172275 B1 747 762 777

AGC CGG GCC AAC ACC GIG AGG AGC TIC CAC CAC GAA GAA CAT CIG GAG AAC ATC

Ser Arg Ala Asn Thr Val Arg Ser Fhe His His Glu Glu His Leu Glu Asn Ile 792 807 822 837

CCA GGG ACC AGT GAA AAC TCT GCT TIT CGT TTC CTC ΤΠ AAC CTC AGC AGC ATC

Pro Gly Thr Ser Glu Asn Ser Ala Phe Arg Rie Leu Fhe Asn Leu Ser Ser Ile 852 867 882 897

CCT GAG AAC GAG GIG ATC TCC TCT GCA GAG CIT CGG CTC TIC OGG GAG CAG GIG

Pro Glu Asn Glu Val Ile Ser Ser Ala Glu Leu Arg Leu Fhe Arg Glu Gin Val 912 927 942

GAC CAG GGC CCT GAT TGG GAA AGG GGC TIC CAC CGT AIA AAC ATT TAT GAG GIT

Asp Gin Gly Pro Asp Trp Glu Arg Gly Fhe His Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Val 957 972 987 1002

ATG AAG CCC CCA GCA GAA GIG GIG CCT C-GG CAC CTC ATC ACA CGA CIA CIG GAC

MET Lys Pro Pro Ala Glu Val Val Pro Gly His Leu Ile Thr Arg Leu Leu Asp 1017 1032 1047

ACG AGA CIG GTC CAC CAC AAT GIG ACA CGG TGG GAA ACT TIT GAT GIG AGC CCT

Thr Arg Leu Val His His Asn Val Thr Arg Trp Glu Thr Fhe Asp Val Ser Pro 1062 1077 1092 1107

GCG GTC CIT CGC TGG ACC CGG GAG AAG CAG CCA AAC TAT GGG CIA GCC ATT GAG

Ala Val Leu Arg Trp Thr Arg Glu Lys Gin Pro Asn Tyr Gly Leu Ala Ile Glu 1122 1137 1152 1167

GIG ACT CAC CTC CAT CAG ACT CGG ACC CAC CAG GGC CAG CAT GTC AGG ATT AGC

Val Thr His Leu His Gin Thr Arg Thr His Gin Gly Gin His Val Arg Ile Ser 1182 1197 1212

CGA TOG TEA CCT CAA GGG AGT GGG AAT TGG GCC CAG CTC CGG CCC CTC CIG GTC

Arg Ser Leu Pro Gin Gly Ser Gly Asn Trp Ala Gin Leu Arg Pro Leu Leu Val 1227 1242 1257 1272

ACC ΤΤΓ GGC CAT GAT GGC CGG GGC CAT GCC TTG ACC CGA CGC CGG AGG GCC AAG

Thr Fhe Gly His Asp Gly Arg Gly His Ala Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ala Lys 1287 1302 1317

•CGT AGC CCT AAG CAT CAC TCA CAG CGG GCC AGG AAG AAG AAT AAG AAC TGC CGG

Arg Ser Pro Lys His His Ser Gin Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys Arg 1332 1347 1362 1377

CGC CAC TOG CTC TAT GIG GAC TTC AGC GAT GIG GGC TGG AAT GAC TGG ATT GTG

Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Fhe Ser Asp Veil Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val 1392 1407 1422 1437

GCC OCA OCA GGC TAC CAG GCC TTC TAC TGC CAT GGG GAC TGC CCC TIT CCA CIG

Ala Pro Pro Gly Tyr Gin Ala Fhe Tyr Cys His Gly Asp Cys Pro Fhe Pro Leu 32 DK 172275 B1 1452 1467 1482

GCT GAC CAC CTC AAC TCA ACC AAC CAT GCC ATT GTG GAG ACC CTG GTC AAT TCT

Ala Asp His Leu Asn Sar Thr Asn His Ala Ile Val Gin Thr Leu Val Asn Ser 1497 1512 1527 1542

GTC AAT TCC AGT ATC CCC AAA GCC TGT TGT GIG CCC ACT GAA CTG AGT GCC ATC

Val Asn Ser Ser Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile 1557 1572 1587

TCC ATG CTG TAC CTG GAT GAG TAT GAT AAG GTG GTA CTG AAA AAT TAT CAG GAG

Ser MET Leu Tyr Leu Asp Glu Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gin Glu 1602 ' 1617 (408) 1636 1646 1656 ATG GTA GIA GAG GGA TGT GGG TGC CGC TGAGATCAGG CAGTCCITGA GGATAGACAG MET Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg 1666 1676 1686 1696 1706 1716 1726

ATAIACACAC CACACACACA CACCACATAC ACCACACACA CACGITCCCA TCCACTCACC CACACACIAC

1736 1746 1756 1766 1776 1786 1796

ACAGACTGCT TCCTIAIAGC TGGACTTiTA ΤΠΑΑΑΑΑΑΑ AAAAAAAAAA AATGGAAAAA ATCCCIAAAC

1806 1816 1826 1836 1846 1856 1866

ATTCACCITG ACdTAITEA TGACITOAOG TGCAAATGIT TTGACCATAT TGATCATATA TT1TGACAAA

1876 1886 1896 1906 1916 1926 1936

ΑΤΑΙΑΠΤΑΤ AACIAOGTAT TAAAAGAAAA AAATAAAATG AGTCATIAIT TTAAAAAAAA AAAAAAAACT

1946

CTAGAGTOGA CGGAATTC

33 DK 172275 B1

Sekvenserne af BMP-2 klasse I og II som vist i tabel II, III, og IV har væsentlig homologi med /?-(B)- og 0-(A)-underenhederne af inhibiner. Inhibiner er en familie af hormoner, som i øjeblikket udforskes med henblik på anvendel-5 se ved svangerskabsforebyggelse, jf. A. J. Mason et al., Nature, 318:659-663 (1985). I mindre omfang er de også homologe med Miiller's inhiberende substans (MIS), et testikel-glycoprotein, som forårsager regression af de Miillerske gange under udviklingen af drengefostre og transformerende 10 vækstf aktor-/?- (TGF-b) , som kan hæmme eller stimulere vækst af celler eller få dem til at differentiere. Endvidere har sekvensen i tabel VII, der koder hBMP-2 klasse II, væsentlig homologi med Drosophila decapentaplegisk (DPP—C) locus-transkript, jf. J. Massaque, Cell, 49:437-438 (1987); R. W.

15 Padgett et al., Nature, 325:81-84 (1987); R.L. Cate et al., Cell 45: 685-698 (1986). Det betragtes derfor som muligt, at BMP-2 klasse II er den humane homolog af proteinet fremstillet ud fra dette transkript fra dette udviklingsmæssige mutant-locus.

20

Eksempel 6

Ekspression af benvævsinducerende faktorer

Til fremstilling af bovine, humane eller andre pat-25 tedyr-benvævsinducerende faktorer overføres DNA'et, som koder derfor, til en passende ekspressionsvektor og indføres i pattedyrceller ved konventionelle genmanipuleringsmetoder.

En fagmand kan konstruere pattedyr-ekspressionsvek-torer ved at anvende sekvensen anført i tabel II, III og IV 30 eller andre modificerede sekvenser og kendte vektorer, såsom pCD [Okayama et al., Mol. Cell Biol., 2:161-170 (1982)] og pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4:645-653 (1985)]. Transformationen af disse vektorer i egnede værtsceller kan medføre ekspression af osteoinduktive faktorer. En fagmand kan 35 manipulere sekvenserne anført i tabel II, II og IV ved at fjerne eller erstatte de pattedyr-regulatoriske sekvenser, 34 DK 172275 B1 der flankerer den kodende sekvens, med bakteriesekvenser til dannelse af bakterie-vektorer til intracellulær eller ekstracellulær ekspression af bakterieceller. F.eks. kan de kodende sekvenser manipuleres yderligere (f.eks. ligeres 5 til andre kendte linkere eller modificeres ved udeladelse af ikke-kodende sekvenser derfra eller ændring af nukleotider deri ved andre kendte metoder). Den modificerede sekvens, der koder for benvævsinducerende faktor, kan derefter indføjes i en kendt bakteriel vektor ved anvendelse af procedu-10 rer som f.eks. beskrevet af T. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5230-5233 (1980). Denne eksempelvise bakterielle vektor kan derefter transformeres i bakterielle værtsceller, og der kan derved eksprimeres benvævsinducerende faktor. Vedrørende en strategi til tilvejebringelse af eks-15 tracellulær ekspression af benvævsinducerende faktor i bakterieceller kan der f.eks. henvises til EP patentansøgning nr. 177.343.

Lignende manipulationer kan gennemføres til konstruktion af en insektvektor (se f.eks. procedurerne beskrevet i 20 offentliggjort EP patentansøgning nr. 155.476) til ekspression i insektceller. En gærvektor kan også konstrueres ved anvendelse af gær-regulatoriske sekvenser til intracellulær eller ekstracellulær ekspression af faktorerne ifølge den foreliggende opfindelse af gærceller (se f.eks. procedurerne 25 beskrevet i den offentliggjorte internationale ansøgning nr. W086/00639 og EP patentansøgning nr. 123.289).

En metode til opnåelse af høje niveauer af en osteo-induktiv faktor ifølge opfindelsen ud fra pattedyrceller involverer konstruktion af celler, der indeholder flere 30 kopier af det heterologe gen for benvævsinducerende faktor.

Det heterologe gen kan bindes til en forstærkelig markør, f.eks. genet for dihydrofolat-reduktase (DHFR), ved hjælp af hvilket celler, der indeholder et forøget antal genkopier, kan udvælges til formering i stigende koncentrationer af 35 methotrexat (MTX) ved procedurerne ifølge Kaufman og Sharp.

J. Mol. Biol., 159:601-629 (1982). Denne metode kan anvendes 35 DK 172275 B1 med et antal forskellige celletyper.

F.eks. kan et plasmid indeholdende en DNA-sekvens for en benvævsinducerende faktor ifølge opfindelsen knyttet operativt til andre plasmidsekvenser, der muliggør ekspres-5 sion deraf, og DHFR-ekspressionsplasmidet pAdA26SV(A)3 [Kaufman og Sharp, Mol. Cell. Biol., 2:1304 (1982)] sammen indføres i DHFR-defekte CHO-celler, DUKX-BII, ved calciumphos-phat-copræcipitation og transfektion. Transformanter, der eksprimerer DHFR, udvælges til vækst i α-medium med dialyse-10 ret kalvefosterserum, og selekteres derefter til forstærkning ved vækst i stigende koncentrationer af MTX (successive trin i 0,02, 0,2, 1,0 og 5 μΜ MTX) som beskrevet af Kaufman et al., Mol Cell Biol., 5:1750 (1983). Transformanterne klones, og ekspressionen af biologisk aktiv ben vævs inducer en-15 de faktor overvåges ved en rotte-bendannelsesbestemmelse. Ekspressionen af benvævsinducerende faktor bør stige med stigende niveauer af MTX-resistens. Lignende procedurer kan anvendes til fremstilling af andre benvævsinducerende faktorer.

20 Alternativt eksprimeres det humane gen direkte som ovenfor beskrevet. Aktiv benvævsinducerende faktor kan produceres i bakterier eller gærceller. Imidlertid er det i øjeblikket foretrukne ekspressionssystem til biologisk aktiv, rekombinant human benvævsinducerende faktor stabilt trans-25 formerede CHO-celler.

Som et specifikt eksempel på fremstilling af human benvævsinducerende faktor (hBMP-1) ifølge eksempel 5 frigøres indsatsen af U20S-1 fra vektorarmene ved nedbrydning med Sal I og subklones i pattedyr-ekspressionsvektoren pMT2CX 30 nedbrudt med Xho I. Plasmid-DNA fra denne subklon trans-ficeres i COS-celler ved DEAE-dextran-proceduren [Sompayrac og Danna, PNAS 78:7575-7578 (1981); Luthman og Magnusson,

Nucl. Acids Res. 11: 1295-1308 (1983)]. Serumfrit 24 timers konditioneret medium opsamles fra cellerne, idet der startes 35 40-70 timer efter transfektion.

Pattedyr-ekspressionsvektoren pMT2 Cla-Xho (pMT2 CX) 36 DK 172275 B1 er et derivat af p91023a (b) (Wong et al., Science 228:810--815, 1985), der adskiller sig fra sidstnævnte, at den indeholder et ampicillinresistensgen i stedet for et tetracyclin-resistensgen og endvidere indeholder et Xhol-sted til ind-5 føjelse af cDNA-kloner. De funktionelle elementer af pMT2 Cla-Xho er beskrevet af R.J. Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:689-693 (1985), og omfatter adenovirus VA-gener, SV40-replikationsstarten omfattende en enhancer på 72 bp, adenovirus stor sen promotor omfattende et 51-splejsningssted 10 og størstedelen af den tredelte adenovirus-ledersekvens, der er til stede på sent mRNA af adenovirus, et 3'-splejsnings-acceptorsted, en DHFR-indsats, SV40 tidligt polyadenyleringssted (SV40) og pBR322-sekvenser, som er nødvendige til formering i E. coli.

15 Plasmidet pMT2 Cla-Xho fås ved nedbrydning med EcoRI

af pMT2-VWF, som er deponeret hos ATCC under nr. 67122. Ved nedbrydning med EcoRI udskæres cDNA-indsatsen, som er til stede i pMT2-vWF, hvorved pMT2 fås i en lineær form, der kan ligeres og anvendes til at transformere E. coli HB 101 eller 20 DH-5 til ampicillinresistens. Plasmid pMT2-DNA kan fremstilles ved konventionelle metoder. pMT2CX konstrueres derefter ved at nedbryde pMT2 med Eco RV og Xbal, behandle det nedbrudte DNA med Klenow-fragmentet af DNA-polymerase I og ligere Cla-linkere (NEBiolabs, CATCGATG). Dette fjerner 25 baserne 2266 til 2421, idet der startes fra Hind III-stedet nær SV40-replikationsstarten og enhancer-sekvenserne af pMT2. Plasmid-DNA nedbrydes derefter med EcoRI, forsynes med stumpe ender som ovenfor beskrevet og ligeres til en EcoRI-adapter 30 5' P04-AATTCCTCGAGAGCT 3' 3' GGAGCTCTCGA 5’ nedbrydes med Xhol, og ligeres, hvorved der fås pMT2 Cla-Xho, der derefter kan anvendes til at transformere E. coli til ampicillinresistens. Plasmid pMT2 Cla-Xho-DNA kan frem-35 stilles ved konventionelle metoder.

37 DK 172275 B1

Eksempel 7

Biologisk aktivitet af eksprimeret benvævsinducerende faktor A. BMP-1 5 Til måling af den biologiske aktivitet af den ekspri- merede benvævsinducerende faktor (hBMP-1) , der er fremstillet i eksempel 6 ovenfor, renses faktoren delvis på en heparin-"Sepharose"-søjle. 4 ml transfektions-supernatant fra en 100 mm skål koncentreres ca. 10 gange ved ultrafiltrering 10 på en YM 10-membran og dialyseres derefter mod 20 mM tris, 0,15 M natriumchlorid, pH-værdi 7,4 (startpuffer). Dette materiale anbringes derefter på en 1,1 ml heparin-"Sepharo-se"-søjle i startpuffer. Ikke-bundne proteiner fjernes ved vaskning med 8 ml startpuffer, og bundne proteiner, herunder 15 BMP-1, desorberes ved vaskning med 3-4 ml 20 mM tris, 2,0 M natriumchlorid, pH-værdi 7,4.

Proteinerne bundet af heparin-søjlen koncentreres ca. 10 gange på en "Centricon 10", og saltet reduceres ved diafiltrering med 0,1% trifluoreddikesyre. En passende mængde 20 af denne opløsning blandes med 20 mg rottematriks og undersøges derefter for benvævs- og bindevævsdannelse in vivo som ovenfor beskrevet i eksempel 3. En supernatant-fraktion fra en "falsk" transfektion anvendes som kontrol.

Implantaterne indeholdende rottematriks, hvortil der 25 er sat specifikke mængder af humant BMP-1, fjernes fra rotterne efter 7 dage og forarbejdes til histologisk vurdering. Repræsentative snit af hvert implantat farves til undersøgelse af tilstedeværelsen af nyt knoglemineral med von Kossa-reagens og syrefuchsin, og for tilstedeværelsen af 30 bindevævs-specifik matriksdannelse under anvendelse af tolui-dinblåt. Celletyperne, som er til stede i snittet, samt det omfang, hvori disse celler udviser fænotype, vurderes.

Tilsætning af humant BMP-1 til matriksmaterialet medfører dannelse af bindevævslignende noduler 7 dage efter 35 implantation. Celler af chondroblast-type kan genkendes ved hjælp af formen og ekspresionen af metakromatisk matriks.

38 DK 172275 B1

Graden af aktivitet, der observeres for humant BMP-1, er afhængig af mængden af humant BMP-l-protein, der er sat til matriksen. Tabel IX viser dosis/reaktions-sammenhængen for humant BMP-protein i forhold til den observerede grad af 5 benvævsinduktion.

Tabel IX

Anvendt mængde Histologisk 10 Implantat nummer (svarende til ml vurdering transfektionsmediuml 86-134-1 10 BMP-1 C+2 15 876-134-2 3 BMP-1 C+l 876-134-3 1 BMP-1 C +/- 20 876-134-4 10 "FALSK" C - 876-134-5 3 "FALSK" C - 876-134-6 1 "FALSK" C - 25

Bindevævs-(c)-aktiviteten vurderes på en skala fra O(-) til 5.

Lignende aktivitetsniveauer ses i de heparin-"Sepha-30 rose"-fraktionerede COS-celleekstrakter. Delvis rensning gennemføres på lignende måde som ovenfor beskrevet, bortset fra at der inkluderes 6 M urinstof i alle puffere. Endvidere har BMP-2 ved en rotte-benvævsdannelsesbestemmelse som ovenfor beskrevet udvist en chondrogen aktivitet på lignende 3 5 måde.

De ovenfor beskrevne procedurer kan anvendes til at isolere andre benvævsinducerende faktorer af interesse ved anvendelse af de bovine benvævsinducerende faktorer og/eller humane benvævsinducerende faktorer som sonde-kilde, sådanne 40 andre benvævsinducerende faktorer kan finde lignende anvendelse til bl.a. knoglebrud-reparation.

Claims (28)

1. Gen, som koder for humant BMP-2 og omfatter følgende DNA-sekvens: 10 20 30 40 50 60 70 GTOGACTCTA GAGIGIGIGT CAGCACTIGG CIGGGGACTT CTIGAACTIG CAGGGAGAAT AACTIGOGCA 80 90 100 110 120 130 140 COCCACTTIG OGCCGGIGOC TTTCCXXXAG CGGAGCCIGC TTOGOCATCT OC3GAGCXXXA COGOCCCTCC 150 160 170 180 190 200 210 ACTCCTCGGC CITGCCOGAC ACIGAGAOGC TGTTOOCAGC GIGAAAAGAG AGACIGOGOG GCCGGCACCC 220 230 240 250 260 270 280 GGGAGAAGGA GGAGGCAAAG AAAAGGAAOG GACMTOGCT OCITGOGGCA GGTCCTTIGA OCAGAGTITT l 29.0' -300· . -310 . - 320 · ----330-- 340"; :350--- TCCAIGIGGA OGCIGTTTCA ATGGAOGIGT CCCOGOGTGC TTCITAGAOG GACTGOGGTC TCCTAAAC-GT (1) 370 385 400 CGACC AIG GIG GOC GGG AOC OGC TGT CIT CIA GCG TIG CIG CTT CCC CAG GTC MET Val Ala Gly Thr Arg Cys Leu Leu Ala Leu Leu Leu Pro Gin Val 415 430 445 CTC CIG GGC GGC GCG GCT GGC CTC GTT COG GAG CIG GGC OGC AGG AAG TTC C-OC- Leu Leu Gly Gly Ala Ala Gly Leu Val Pro Glu Leu Gly Arg Arg Lys Phe Ala 460 475 490 505 GOG GOG TOG TOG GGC OGC OCC TCA TCC CAG CCC TCT GAC GAG GTC CIG AGC GAG Ala Ala Ser Ser Gly Arg Pro Ser Ser Gin Pro Ser Asp Glu Val Leu Ser Glu 520 535 550 565 TTC GAG TIG GGG CIG CIO AGC ATG TIC GGC CIG AAA CAG AGA CCC ACC CCC AGC .Phe Glu Leu Arg leu Leu Ser MET Fhe Gly Leu Lys Gin Arg Pro Thr Pro Ser 580 595 610 AGG GAC GCC GIG GIG CCC CCC TAC ATG CIA GAC CIG TAT OGC AGG CAC TOG C-GT Arg Asp Ala Val Val Pro Pro Tyr MET Leu Asp Leu Tyr Arg Arg His Ser Gly 625 640 655 670 CAG CCG GGC TCA CCC GCC CCA GAC CAC OGG TIG GAG AGG GCA GCC AGC OGA GCC Gin Pro Gly Ser Pro Ala Pro Asp His Arg Leu Glu Arg Ala Ala Ser Arg Ala 685 700 715 AAC ACT GIG OGC AGC TIG CAC CAT GAA GAA TCT TIG GAA GAA CTA OCA GAA ACG Asn Thr Ved. Arg Ser Phe His His Glu Glu Ser Leu Glu Glu Leu Pro Glu Thr DK 172275 B1 730 745 760 775 AGT GGG AAA ACA ACC OGG AGA TIC TIC TIT AAT TEA ACT TCT ATC CCC AOG GAG Ser Gly lys Thr Dir Arg Arg Fhe Rie Rie Asn Leu Ser Ser Ile Pro Dir Glu 790 805 820 835 GAG TIT ATC ACC TCA GCA GAG CIT CAG GIT TIC OGA GAA CAG ATS CAA GAT GCE Glu Rie Ile Dir Ser Ala Glu Leu Gin Val Rie Arg Glu Gin MET Gin Asp Ala 850 865 880 TEA GGA AAC AAT AGC AGT TIC CAT CAC OGA ATT AAT ATT TAT GAA ATC ΑΙΑ AAA leu Gly Asn Asn ser Ser Rie His His Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Ile Ile lys 895 910 925 940 CCT GCA ACA GCC AAC TOG' AAA TIC CCC GIG ACC AGT CIT TIG GAC AOC AGG TIG Pro Ala Thr Ala Asn Ser lys Rie Pro Val Dir Ser Leu Tom Asp Dir Arg Leu 955 970 985 GIG AAT CAG AAT GCA AGO AGG TGG GAA AGT TIT GAT GTC AOC COC GCE GIG ATS Val Asn Gin Asn Ala Ser Arg Trp Glu Ser Rie Asp Val Dir Pro Ala Val MET 1000 1015 1030 1045 OGG TGG ACT GCA CAG GGA CAC GCC AAC CAT GGA TTC GIG GIG GAA GIG GCC CAC Arg Trp Dir Ala Gin Gly His Ala Asn His Gly Rie Val Val Glu Val Ala His 1060 1075 1090 1105 TIG GAG GAG AAA CAA .GGT GTC TCC AAG AGA CAT GTT AGG AIA AGC AGG TCT TIG leu Glu Glu iys "Gin'Gly' Val Ser Lys Arg His Val'Arg Ile Sér 'Arg Ser Leu 1120 1135 1150 CAC CAA GAT GAA CAC AGC TGG TCA CAG ATA AGG CCA TIG CIA GTA ACT TTT GGC His Gin Asp Glu His Ser Trp Ser Gin Ile Arg Pro leu Leu Val Thr Rie Gly 1165 1180 1195 1210 CAT GAT GGA AAA GGG CAT CCT CTC CAC AAA AGA GAA AAA CCT CAA GCC AAA CAC His Asp Gly Lys Gly His Pro leu His Lys Arg Glu Lys Arg Gin Ala Lys His 1225 1240 1255 AAA CAG OGG AAA CGC CIT AAG TOC AGC TCT AAG AGA CAC CCT TIG TAC GTG GAC Lys Gin Arg lys Arg Leu Lys Ser Ser cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp 1270 1285 1300 1315 •TTC ACT GAC GTG GGG TGG AAT GAC TGG ATT GIG GCT CCC COG GGG TAT CAC GCC Fhe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala 1330 1345 1360 1375 TTT TAC TGC CAC GGA GAA TGC CCT TTT OCT CIG C-CT GAT CAT CTC AAC TCC ACT Phe Tyr Cys His Gly Glu cys Pro Fhe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr 1390 1405 1420 AAT CAT GCC ATT GTT CAG AOG TIG GTC AAC TCT GTT AAC TCT AAG ATT CCT AAG Asn His AJLa Ile Val Gin Thr Leu Ved Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys DK 172275 B1 1435 1450 . 1465 1480 GCA TGC TUT GTC COG ACA GAA CTC AGT GCT ATC TOG ATG CIG TAC CTT GAC GAG Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser MET Leu Tyr Leu Asp Glu 1495 1510 1525 AAT GAA AAG GTT GTA TTA AAG AAC TAT CAG GAC ATG GTT GIG GAG GGT TCT GGG Asn Glu Lys Val Val Leu lys Asn Tyr Gin Asp MET Val Val Glu Gly Cys Gly 1540(396) 1553 1563 1573 1583 1593 1603 TCT OGC TACTACAGCA ΑΑΑΠΑΑΑΤΑ CATAAATATA TAIATATAIA TAXATTTTAG AAAAAAGAAA Cys Arg AAAA

2. Gen, som koder for humant BMP-2 og har aminosyre-sekvensen anført i krav 1.

3. Gen, som koder for et protein, som udviser egenskaber af humant BMP-2, og omfatter en DNA-sekvens: 15 (a) som adskiller sig fra en DNA-sekvens ifølge krav 1 i kodonsekvens på grund af degenerationen af den genetiske kode, (b) som hybridiserer med en DNA-sekvens ifølge krav 1 eller afsnit (a) ovenfor, eller 20 (c) udgør et fragment, en allelisk eller anden varia tion af en DNA-sekvens ifølge krav 1, hvad enten denne variation medfører ændringer i peptidsekvensen eller ej.

4. DNA-Sekvens ifølge krav 3, som er en genomisk 2 5 DNA-sekvens.

5. DNA-Sekvens ifølge krav 3, som er en cDNA-sekvens.

6. Gen, som koder for bovint BMP-2 og omfatter følgende DNA-sekvens: 30 35 DK 172275 B1 (1) 15 30 45 GGC CAC GAT GGG AAA GGA CAC CCT CTC CAC AGA AGA GAA AAG CGG GHDGKGHPLHRREKR 60 75 90 C AA GCA AAA CAC AAA CAG CGG AAA CGC CTC AAG TCC AGC TGT AAG QAKHKQRKRL KS SCK 105 120 135 AGA CAC CCT TTA TAT GTG GAC TTC AGT GAT GTG GGG TGG AAT GAC RHPLYVD'FS DVGWN D 150 165 180 TGG AT C GTT GCA CCG CCG GGG TAT CAT GCC TTT TAC TG C CAT GGG WIVAP 'PGYH AFYCHG 195 210 225 GAG TGC CCT TTT CCC CTG GCC GAT CAC CTT AAC TCC ACG AAT CAT ECPFPLADHLNSTNH 240 .255. 270 GCC · ATT' CTC’ CAA ACT -CTG = CTC AAC TCA GTT ’ AAC TCT'AAG ATT CCC AIVQTLVNSVNSKI P 38-5' 300 315 AAG GCA TGC TGT GTC CCA ACA GAG CTC AGC GCC ATC TCC ATG CTG KACCVPTELSAI SML 330 345 360 TAC CTT GAT GAG AAT GAG AAG GTG GTA TTA AAG AAC TAT CAG GAC YLDENEKVV LK N Y O D 375 - (129) 397 407 ATG GTT GTC GAG GGT TGT GGG TGT CGT TAGCACAGCA AAATAAAATA Μ V V E G C G C R 417 427 437 447 457 TAAATATATA TATATATATA TTAGAAAAAC AGCAAAAAAA TCAAGTTGAC 467 477 487 497 507 ACTTTAATAT TTCCCAATGA AGACTTTATT TATGGAATGG AATGGAGAAA 517 527 537 547 557 AAGAAAAACA CAGCTATTTT GAAAACTATA TTTATATCTA CCGAAAAGAA 567 577 587 GTTGGGAAAA CAAATATTTT AATCAGAGAA TTATT DK 172275 B1

7. Gen, som koder for bovint BMP-2 indeholdende amino-syresekvensen ifølge krav 6.

8. Gen, som koder for et protein, som udviser egenskaber af bovint BMP-2, og omfatter DNA-sekvenser: 5 (a) som adskiller sig fra en DNA-sekvens ifølge krav 7 i kodonsekvens på grund af degenerationen af den genetiske kode, (b) som hybridiserer med en DNA-sekvens ifølge krav 7 eller afsnit (a) ovenfor, eller 10 (c) udgør fragmenter, alleliske eller andre varia tioner af en DNA-sekvens ifølge krav 7, hvad enten de nævnte variationer medfører ændringer i peptidsekvensen eller ej.

9. DNA-Sekvens ifølge krav 8, som er en genomisk 15 DNA-sekvens.

10. DNA-Sekvens ifølge krav 8, som er en cDNA-sekvens.

11. Gen, som koder for humant BMP-4 og omfatter følgende DNA-sekvens: 10 20 30 40 50 ' 60 70 CTCIAGAGGG CAGAGGAGGA GGGAGGGAGG GAAGGAGOGC GGAGCOOGGC OOGGAAGC1A GGTGAGTCIG 80 90 100 110 - 120 130 140 GCATOCGAGC TCAGGGAOGC GAGCCTCACA CGCCGCTCCT GCT00GGCIG AGTATCTAGC TIGTCTCCCC 150 160 170 180 190 200 210 GATCGGATTC COJIXXAAGC TATCTOGAGC CTGCAGOGCC ACACTCCOOG GCCJCIOGCGC AGGITCACIG 220 230 240 250 260 270 280 CAACCGTTCA GAGGTCCCCA GGAGCTGCTC CTGGOGAGCC C3GCIACIX3CA GGGACCXATC GAGCCATTCC 290 300 310 320 330 340 350 GIAGTCCCAT CCOGAGCAAC GCACIGCIGC AGCITCCCTG AGCCITTCCA GCAAGTTIGT TCAAGAITCG •...... 360 ' 370 ' ' 380 390 ''Å00 (1) CTGTCAAGAA TCATCGACIG TTA1TA1ATC CXTTGTnTC TGTCAAGACA CC ATG ATT CCT ............MET.Ile Pro DK 172275 B1 417 432 447 462 GGT AAC CGA ATG CIG ATG GTC GIT ΊΤΑ ΊΤΑ TGC CAA GTC CIG CEA GGA GGC GOG Gly Asn Arg MET Leu MET Val Val Leu Leu Cys Gin Vad Leu Leu Gly Gly Ala 477 492 507 AGC CAT GCT AGT TIG ATA (XT GAG AOG GGG AAG AAA AAA GTC GCC GAG ATT CAG Ser His Ala Ser Leu Ile Kro Glu Thr Gly lys lys lys Val Ala Glu Ile Gin 522 537 552 567 GGC CAC GOG GGA GGA OGC CGC TCA GGG CAG AGC CAT GAG CTC CIG OGG GAC TTC Gly His Ala Gly Gly Arg Arg Ser Gly Gin Ser His Glu Leu Leu Arg Asp Rie 582 597 612 627 GAG GOG ACA CIT CIG CAG ATG TIT GGG CIG CGC OGC GGC CCG CAG CCT AGC AAG Glu Ala Thr Leu leu Gin MET Rie Gly Leu Arg Arg Arg Pro Gin Pro Ser lys 642 657 672 AGT GCC GTC ATT COG GAC TAC ATG OGG GAT CIT TAC OGG CIT CAG TCP GGG GAG Ser Ala Véd Ile Pro Asp Tyr MET Arg Asp Leu Tyr Arg Leu Gin Ser Gly Glu 687 702 717 732 GAG GAG GAA GAG CAG ATC CAC AGC ACT GGT CIT GAG TAT OCT GAG CGC COG GCC Glu Glu Glu Glu Gin Ile His Ser Thr Gly Leu Glu Tyr Pro Glu Arg Pro Ala 747 762 777 AGC OGG GCC AAC ACC GTG AGG AGC TTC CAC CAC GAA GAA CAT CIG GAG AAC ATC Ser Arg Ala Asn Tir Val Arg Ser Phe His His Glu Glu His-Leu-Glu Asn Ile 792 807 822 837 OCA GGG AOC AGT GAA AAC TCT GCT TIT OST TIC CTC ΤΤΓ AAC CTC AGC AGC ATC Pro Gly Tir Ser Glu Asn Ser Ala Rie Arg Rie Leu Rie Asn Leu Ser Ser Ile 852 867 882 897 CCT GAG AAC GAG GTG ATC TOC TCT GCA GAG CIT OGG CTC TIC OGG GAG CAG GIG Pro Glu Asn Glu Val Ile Ser Ser Ala Glu Leu Arg Leu Rie Arg Glu Gin Val 912 927 942 GAC CAG GGC CCT GAT TGG GAA AGG GGC TIC CAC OGT ATA AAC ATT TAT GAG GTT Asp Gin Gly Pro Asp Trp Glu Arg Gly Rie His Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Val 957 972 987 1002 ATG AAG CCC OCA GCA GAA GTG GIG CCT GGG CAC CTC ATC ACA CGA CIA CIG GAC MET Lys Pro Pro Ala Glu Val Val Pro Gly His Leu Ile Thr Arg Leu Leu Asp 1017 1032 1047 AOG AGA CIG GTC CAC CAC AAT GIG ACA OGG TGG GAA ACT ΤΊΤ GAT GIG AGC CCT Thr Arg Leu Val His His Asn Val Thr. Arg Tip Glu.,Thr .Phe Asp Val Ser ,Pro 1062 1077 1092 1107 GCG GTC CIT CGC TGG ACC OGG GAG.AAG CAG CCA AAC TAT GGG CTA GCC.ATT GAG . Ala Val Leu Arg Trp Thr Arg Glu Lys Gin Pro Asn Tyr Gly Leu Ala Ile Glu 1122 1137 1152 1167 GIG ACT CAC CTC CAT CAG ACT OGG ACC CAC CAG GGC CAG CAT GTC AGG ATT'AGC Val Thr His Leu His Gin Thr Arg Thr His Gin Gly Gin His Val Arg Ile Ser DK 172275 B1 1182 1197 1212 OGA T03 ΤΣΑ OCT CAA GGG AGT GGG AAT TGG GOC CAG CTC CGG COC CTC CIG GTC Arg Ser Lau Pro Gin Gly Ser Gly Asn Trp Ala Gin Leu Arg Pro Leu Leu Val .1227 1242 1257 1272 ACC TIT GGC CAT GAT GGC OGG GGC CAT GCC TIG ACC OGA OGC OGG AGG GCC AAG Dir Rie Gly His Asp Gly Arg Gly His Ala Leu Dir Arg Arg Arg Arg Ala lys 1287 1302 1317 OGT AGO (XT AAG CAT CAC TCA CAG OGG GCC AGG AAG AAG AAT AAG AAC TGC CGG Arg Ser Pro lys His His Ser Gin Arg Ala Arg lys lys Asn Lys Asn Cys Arg 1332 1347 1362 1377 OGC CAC TOG CTC TAT GIG GAC TIC AGC GAT GIG GGC TGG AAT GAC TGG ATT GTG Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Rie Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val 1392 1407 1422 1437 GCC OCA CCA GGC TAC CAG GCC TTC TAC TGC CAT GGG GAC TGC CCC ITT CCA CIG Ala Pro Pro Giv Tvr Gin Ala Rie TVr Cvs His Giv Asd Cvs Pro Rie Pro Leu 1452 1467 1482 GCT GAC CAC CTC AAC TCA ACC AAC CAT GCC ATT GIG CAG ACC CIG GTC AAT TCT Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gin Thr Leu Val Asn Ser 1497 1512 1527 1542 GTC AAT ICC AGT ATC CCC AAA GCC TGT TGT GIG CCC ACT GAA CIG AGT GCC ATC Val Asn Ser Ser Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile 1557 1572 1587 TCC ATC CIG TAC CIG GAT GAG TAT GAT AAG GTC GTA CIG AAA AAT TAT CAG GAG Ser MET Leu Tyr leu Asp Glu Tyr Asp lys Val Val Leu lys Asn Tyr Gin Glu 1602 1617 (408) 1636 1646 1656 ATC GIA GTA GAG GGA TCT GGG TGC OGC TGAGATCAGG CAGTCCITCA GGATAGACAG MET Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg 1666 . 1676 1686 1696 1706 1716 1726 ATATACACAC CACACACACA CACCACATAC ACCACACACA CAOGTTCCCA TCCACTCACC CACACACEAC 1736 1746 1756 1766 . 1776 1786 1796 ACAGACIGCT TCCITATAGC TCGACTJ.TIA ΤΠΑΑΑΑΑΑΑ AAAAAAAAAA AATCGAAAAA ATCOCTAAAC 1806 1816 1826 1836 1846 1856 1866 AITCAOCTTC ΑΟΟΙΤΆΤΓΓΑ TCACITrAOG TGCAAATCTr TTCACCATAT TCATCAIATA TTTIGACAAA 1876 1886 1896 1906 1916 1926 1936 ΑΤΑΪΑΓΠΑΤ AACIACGEAT TAAAAGAAAA AAATAAAATC AGTCATTATT TTAAAAAAAA AAAAAAAACT 1946 CTAGAGTOGA OGGAAITC DK 172275 B1

12. Gen, som koder for humant BMP-4, som har amino-syresekvensen anført i krav 11.

13. Gen, som koder for et protein, som udviser egenskaber af BMP-4, og omfatter en DNA-sekvens: 5 (a) som adskiller sig fra en DNA-sekvens ifølge krav 11 i kodonsekvens på grund af degenerationen af den genetiske kode, (b) som hybridiserer med en DNA-sekvens ifølge krav 11 eller afsnit (a) ovenfor, eller 10 (c) udgør et fragment, en allelisk eller anden va riation af en DNA-sekvens ifølge krav 11, hvad enten den nævnte variation medfører ændringer i peptidsekvensen eller ej.

14. DNA-Sekvens ifølge krav 13, som er en genomisk

15. DNA-Sekvens ifølge krav 13, som er en cDNA-sek- vens .

15 DNA-sekvens.

16. Vektor indeholdende genet eller DNA-sekvensen ifølge ethvert af kravene 1-15 i operativ forbindelse med 20 en ekspressionskontrolsekvens.

17. Celle transformeret med en vektor ifølge krav 16.

18. Celle ifølge krav 17, som er en pattedyrcelle, en bakteriecelle, en insektcelle eller en gærcelle.

19. Celle ifølge krav 18, som er en CHO-celle.

20. Protein, som udviser egenskaber af BMP-2, og som kodes af et gen eller en DNA-sekvens ifølge ethvert af kravene 1-10.

21. Protein, som udviser egenskaber af BMP-2, og som kan fås ved dyrkning i et egnet dyrkningsmedium af en celle 30 transformeret med en ekspressionsvektor indeholdende et gen eller en DNA-sekvens ifølge ethvert af kravene 1-10 og udvinding af proteinet fra dyrkningsmediet.

22. Protein, som udviser egenskaber af BMP-4, og som kodes af et gen eller en DNA-sekvens ifølge ethvert af kra- 35 vene 11-15.

23. Protein, som udviser egenskaber af BMP-4, og som DK 172275 B1 fremstilles ved dyrkning i et egnet dyrkningsmedium af en celle transformeret med en ekspressionsvektor indeholdende et gen eller en DNA-sekvens ifølge ethvert af kravene 11-15 og udvinding af proteinet fra dyrkningsmediet.

24. Fremgangsmåde til fremstilling af proteinet ifølge krav 21 eller eller 23, omfattende dyrkning i et egnet dyrkningsmedium af cellen ifølge krav 17 og isolering af proteinet fra dyrkningsmediet.

25. Farmaceutisk præparat indeholdende proteinerne 10 ifølge ethvert af kravene 20-23, enkeltvis eller i kombination, og et farmaceutisk acceptabelt bærestof.

26. Farmaceutisk præparat ifølge krav 25, yderligere omfattende en matriks, som er i stand til at føre præparatet til stedet for knogle- eller bindevævsdefekten og danne en 15 struktur til fremkaldelse af knogle- eller bindevævsdannelse.

27. Farmaceutisk præparat ifølge krav 25, hvor ma-triksen omfatter hydroxyapatit, kollagen, polymælkesyre eller tricalciumphosphat.

28. Anvendelse af et protein ifølge ethvert af kravene 20 20-23, enkeltvis eller i kombination, til fremstilling af et farmaceutisk præparat til fremkaldelse af knogle- eller bindevævsdannelse. 25 30 35