JPS59190919A - 部分的に精製された成骨因子，及び鉱物質除去された骨又は骨肉腫からのその調製方法 - Google Patents

部分的に精製された成骨因子，及び鉱物質除去された骨又は骨肉腫からのその調製方法

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JPS59190919A
JPS59190919A JP59014983A JP1498384A JPS59190919A JP S59190919 A JPS59190919 A JP S59190919A JP 59014983 A JP59014983 A JP 59014983A JP 1498384 A JP1498384 A JP 1498384A JP S59190919 A JPS59190919 A JP S59190919A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術的分野） 本発明は蛋白質化学及び骨成形の分野にある。
更に詳しくは、本発明は鉱物質除去された骨から得られ
軟骨及び成骨誘導活性を示す部分的に精製された抽出物
に関する。
（技術的背景） 骨又は骨肉腫に存在し骨形成を誘発する化学物質を単離
し特性化する努力は先行技術で報告されている。合衆国
特許第４，２９４，７５３号は、「骨形前形成蛋白質」
と呼ばれる成骨誘発剤を鉱物質除去された骨から部分的
に単離することを記述している。骨形前形成蛋白質は十
分に特性化されず、粗製の骨又は象牙質組織抽出物とし
て得られた。粗製蛋白質を得る方法は、骨組織の鉱物質
を除去し、中性塩と尿素又はグアニジンとの水溶液で、
鉱物質除去された骨から因子を抽出し、粗製蛋白質を沈
澱させるために抽出液から尿素又はグラニシンを除去す
るというものであった。
粗製性形態形成蛋白のイオン交換による精製は、ユリス
トａエム・アール（Ｕｒｉｓｔ，　Ｍ．Ｒ．）ら、（１
：！ｉｎ．　Ｏｒｔｈｐａｅｄｉｃｓ　ａｎｄ　Ｒｅｌ
ａｔｅｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　（１！３８２年）１６２
巻２１９〜２３２頁が報告している。粗製蛋白質をそれ
ぞれ６ＭとＩＭの尿素水溶液に再溶解し再沈澱させた。
最終沈澱物を６Ｍ尿素中に取り出し、ＰＨ４　、８で０
Ｍセルロース（陽イオン交換体）でのクロでトグラフィ
にかけた。未吸着画分をｐＨ７　、２で更にＤＥＡＥセ
ルロース（陰イオン交換体）でのクロマトグラフィにか
けた。両分離物からの吸着、未吸着双方の両分を生物検
定にかけると、各分離物の未吸着画分だけが成骨誘発活
性を示すことがわかった。ゲル゛濾過によってＤＥＡＥ
未吸着画分から高分子著蛋白質が分離された。
（目的） 本発明の主な目的は、ユリストらが報告した因子とは異
なるか、又はそれより純粋な、部分的に精製された成骨
因子を提供するにある。
（発明の構成概要） 本発明の成骨因子はを椎動物の骨と骨肉腫の中に含まれ
、次の特徴をもっている： （ａ）非繊維性蛋白質である、 （ｂ）約７．０のＰＨでジエチルアミンエチルセルロー
ス陰イオン交換体によって吸着されない。
（ｃ）約４　、　８のＰＨでカルボキシメチルセルロー
ス陽イオン交換体によって吸着される、（ｄ）約３０，
０００ダルトンより低い分子量をもっている。
粒状鉱物質除去骨又は骨肉腫からこの成骨因子を部分的
に精製する方法は、鉱物質除去された骨又は骨肉腫から
液体で解離性の非繊維性蛋白質抽出剤で非繊維性蛋白質
を抽出し、イオン交換クロマトグラフィによって抽出液
から因子を精製することからなり、以下の点を特徴とし
ている：（ａ）抽出液を初めに約６．８ないし約７．２
のｐＨで陰イオン交換体と接触させる、 （ｂ）陰イオン交換体からの未吸着画分を約４．５ない
し約５．２のｐＨで陽イオン交換体と接触させる、 （ｃ）陽イオン交換体からの吸着画分を溶離する、 （ｄ）約３０，０００ダルトンより低い分子量をもつ物
質を溶離液から分離する。
（好適な実施の態様） 本発明に使用される骨又は骨肉腫は、種々の哺乳類給源
から収集できる。同種及び異種の給源を使用できる。骨
肉腫は実験動物で誘発できる。牛と豚の骨、好ましくは
反骨が通常その入手しやすさのため用いられよう。初め
に骨の表面をこするかブラシ掛けをして骨膜を物理的に
除去することによってきれいにする。次に骨を破゛片に
するか粉砕し、非常に温和な酸水溶液、例えば、０．０
１ＮＨＣ文で破片をかきまぜながら洗い、破片に残って
いる水溶性物質を除去する。洗浄を低目の温度で、ふつ
うは約０　’Ｃないし１８°Ｃ１好ましくは約５°Ｃで
、洗浄液をたびたび変えながら行なうのが好ましい。次
に破片を乾燥し、次に脂質を除くためにエタノール、酢
酸メチル及びジエチルエーテルのような一つないしそれ
以−１−の親油性溶媒での抽出によって脱脂する。
骨の１ヨな鉱物質成分は燐酸カルシウムである。
本明細書で用いられる用語「燐酸カルシウム」は、種々
のポリ燐酸カルシウム、水酸アパタイト、クロルアパタ
イト等のような、骨の中に存在する多くのカルシウム−
燐複合体及び化合物類を包括するものとする。燐酸カル
シウムは通常、骨の鉱物質成分の約８０％を占める。骨
のその他の鉱物質成分には炭酸カルシウム、弗化カルン
ウム、塩化カルシウム及び燐酸マグネシウムが含まれる
。これらの鉱物質は通常、希鉱酸及び有機酸にｉ［溶で
あり、このような酸類は骨の蛋白質成分を消化さぜずに
骨の鉱物質を除去するために使用できる。骨の鉱物質除
去に使われる酸濃度は、ふつう０．１Ｍないし１．０Ｍ
であろう、０．５Ｍの濃度の塩酸が好ましい。骨を酸と
接触させるのは、通常的Ｏ′Ｃないし約２５°Ｃの範囲
の温度で１時間ないし数日間であろう。骨からの鉱物質
の抽出は、かきまぜによって容易になる。抽出完了後、
沈降、濾過、又はその他慣用の固体−液体分離技術など
によって骨を酸から分離する。生ずる消化されていない
鉱物質除去された骨を水洗して吸着された酸を除去する
。
鉱物質除去後、イオン結合を解離し骨の非コラーゲン性
蛋白質を可溶化するような水性液体抽出剤に骨を接触さ
せることによって、（プロテオグリカン類を含めた）非
コラーゲン性蛋白質を鉱物質除去された骨から抽出する
。この抽出剤は、本明細書では時に「解離性の非繊維性
蛋白質抽出剤」と呼ぶ。この抽出は、抽出される蛋白質
の消化又は変性を抑制するような条件下に行なわれる。
使用できる解離性抽出剤の例は、゛グアニジン用酸塩（
少なくとも約４モル）、尿素（８Ｍ）と塩（ＩＭ）との
混合物、及びドデシル硫酸ナトリウム（少なくとも約１
容星％）である。好ましい抽出剤は４Ｍグアニジン塩酸
塩（ｐＨ６，８）である。抽出剤は、少なくとも約１０
＝１、ふつうは約１５＝１ないし２０：１の骨／抽出剤
比（Ｖ／Ｗ）で、温和にかきまぜながら骨と混合される
。抽出される蛋白質の消化又は変性の可能性を減じるた
めに、蛋白質抑制剤の存在下に低目の温度で抽出を行な
うのが好ましい。温度は通常、０℃ないし２０℃、好ま
しくは、０°Ｃないし５℃の範囲にある。抽出媒体中に
包含できるプロテアーゼ抑制剤の例は、弗化フェニルメ
チルスルホニル、Ｎ−エチルマレイミド、ベンズアミジ
ン及び６−アミノヘキサン酸である。抽出媒体ｐＨは、
使用される抽出剤によって変わる。抽出媒体と骨を、ふ
つうは約１６〜２４時間接触させる。
抽出完了後、未溶解の骨を遠心分離又は濾通のような慣
用の固／ｉ体分離技術によって抽出液から分離する。所
望により、沈澱又は透析のくり返しによって抽出液を更
に仕上げ処理してもよい。
成骨因子の精製における第二段階は分離用イオン交換グ
ロマトグラフィである。このクロマトグラフィは次の２
小工程で実施される。すなわち（＋）陰イオン交換体で
の分別と、それに続＜　（２）陽イオン交換体での分別
。陰イオン交換分別では、非コラーゲン性蛋白質を約６
．８ないし７．２、好ましくは約７．０のＰＨで陰イオ
ン交換体と接触させる。セルロースイオン交換体類、及
び架橋されたデキストラン又はポリアクリルアミドから
誘導されたイオン交換ゲルが、使用可能な陰イオン交換
体の例である。セルロース陰イオン交換体が好ましい。
ジエチルアミノエチルが陰イオン交換体の好ましい官能
基である。陰イオン交換分別はカラム又は回分式操作で
実施できる。
非コラーゲン性蛋白質は、上記抽出剤（蛋白質を溶液状
態に保つ）の一つと、好ましくはさらに、平衡化された
交換体と接触させた時に有効な量のプロテアーゼ抑制剤
とを含有する水溶液中に存在する。溶液を所望するｐＨ
まで緩衝する。交換体を平衡状態に到達させるのに十分
な接触時間を取るべきである。回分式操作では、抽出液
の未吸着画分を遠心分離又は濾過によって陰イオン交換
材料から分離できる。いずれの場合も、抽出液の未吸着
画分は望んでいる成骨因子を含有しており、これを収集
又は分離して、更に陽イオン交換体で分別する。
陽イオン交換分別は、陰イオン交換手工程からの未吸着
画分を約４．５ないし約５．２、好ましくは約４．８の
ｐＨで陽イオン交換体と接触させることによって行なわ
れる。使用できる陽イオン交換体の例は、入手できるセ
ルロース陽イオン交換体と、ポリアクリルアミド及び架
橋されたデキストランから誘導される陽イオン交換ゲル
である。セルロース陽イオン交換体か好ましい。カルボ
キシルメチルが陽イオン交換に好ましい官能基である。
陽イオン交換体と接触させる前に、陰イ１ オン交換段階の未吸着画分中の緩衝液を透析などによっ
て両分から除去する。未吸着画分中の蛋白質を、必要に
応じて再溶解し、溶液を陽イオン交換の所望ｐＨまで緩
衝する。次に溶液を平衡化された陽イオン交換樹脂と、
この場合も交換が平衡に達するのに十分な時間に接触さ
せる。陽イオン交換分別で、陽イオン交換体に吸着され
る溶液の両分が、所望の成骨因子を含有しており、陽イ
オン交換体から回収されねばならない。交換を回分式で
行なう時には、交換体をまず溶液の未吸着画分から分離
する。次に残留する未吸着材料を除去するために、交換
体を出発緩衝液で洗う。
陽イオン交換体の洗浄後、これに吸着された非コラーゲ
ン性の蛋白質は、適当なｐＨ又はイオン強度の溶離剤で
の溶離によって回収される。所望により、段階的又は勾
配溶離を利用すると、吸着された蛋白質の示差溶離が行
なわれる。本方法でカルボキシメチルセルロースを陽イ
オン交換体として使用すると、約１０ないし約４００　
ｍ　Ｍの範囲のイオン強度をもつ緩衝液を使用して、成
骨間２ 子を交換体から溶離できる。
精製の最終段階では、３０にダルトンまでの溶離液両分
を回収するために溶離液を分子量によって分別する。こ
の分別は、ゲル濾過又は他の慣用の分離技術によって実
施できる。部分的に精製された因子は、透析又は凍結乾
燥のような慣用手段によって溶離液の３０にダルトンま
での両分から回収できる。部分的に精製された物質は、
移植部位で骨形成を誘発するために、担体と共に又は担
体なしに哺乳類に移植できる。
以下の実施例は本発明方法と、それによってつくられる
部分的に精製された成骨因子を更に例示するものである
。この実施例は、いかなる形においても本発明を制限す
る意図のものではない。
゛された　の・製 屠殺場から新たに得た牛中足骨の一７０℃に凍結したも
のを使用した。骨の骨膜を除き、直径ＩＣＩＩより小さ
な破片に破砕し、大型ミルで粉砕した。粉末化した骨を
４℃で一夜０．ＯＩＮＨＣＭ中で洗った。次にこれを３
倍量のエタノールで約２０分ずつ３回洗浄し、ジエチル
エーテルで同じようにくり返し、脱脂を行なった。脱脂
された骨の粉末から４℃で０．５Ｎ　　ＨＣｌ中で鉱物
質を除去した。酸を除去し、鉱物質除去された骨の粉末
を１０倍量の水で２回洗った。
トコラーゲンＰ−”白　の　出 鉱物質除去骨の粉末を１０倍量の４Ｍグアニジン−ＨＣ
ｌ、１５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）
　　ｐＨ６，５、ｌ　ｍ　Ｍ　７　ｘ　ニルメチルスル
ホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）及び１０ｍＭＮ−ｘチ
ルマレイミド（Ｎ　Ｅ　Ｍ）で４°Ｃ１１６時間抽出し
た。懸濁液を１０，０００ｒｐｍで３０分遠心分離した
。ペレットを４Ｍグアニジン溶液の別の５倍量で洗い、
上と同じく遠心分離した。可溶性の画分を一緒にし、ア
ミコン限外濾過（ＩＯＫ）装置を使用して、限外濾過に
よって少なくとも５倍量を濃縮した。同じ装置を用いて
６Ｍ尿素、１ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭＮＥＭ、２０ｍＭ燐
酸ナトリウム（ｐＨ７，０）及び５０ｍＭ　　ＮａＣ，
Ｑを含有する溶液に対して’ａｌｉｉ液を透析するか、
又は水に対して透析して凍結乾燥する。
′　　イオン ６Ｍ尿素、　　１ｍＭ　　Ｐ　Ｉ’ｖｊＳ　　Ｆ　、　
１ｍＭＮＥＭ、２０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐ）１７．０
）及び５０ｍＭ　　ＮａＣ１で平衡化された陰イオン交
換体のジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース（
ホワットマン）を、抽出液のイオン交換による精製の第
一工程に使用した。可溶性抽出物又は凍結乾燥抽出物を
ＤＥＡＥセルロース平衡化緩衝掖市で液衡化又は溶解し
、交換体と混合してｌ又は２時間穏ゆかにかきまぜた。
６Ｍ尿素、１０ｍ’Ｍ　　Ｎａ０文、１ｍＭ　　ＰＭＳ
Ｆ、１ｍＭＮＥＭ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，
８）で平衡化されたカルボキシメチル（ＣＭ）セルロー
スを使用して、陽イオン交換クロマトグラフィにより、
未吸着物を更に分別した。未吸着物を０Ｍセルロースと
混合し、スラリーを５０ｃｃカラム充填に用いた。カラ
ムを上の緩衝液中でｌｏｍＭＮａＣｌで洗った。同じ緩
衝液中で５０ｍＭから５ ４００ｍＭまでのＮａＣ文勾配を使用して吸着蛋白質を
溶離した。画分を集め、それらの吸着炭と電気泳動分布
に基づいて一緒にした。２８０ｎｍにおける両分の光学
濃度（ＯＤ）の読取りを行なった。第１図はこれらの読
取り値を作図したものである。両分２３〜３２を一緒に
し、水に対して透析し、凍結乾燥した。
を亙處ｊ −緒にした画分を次に６Ｍ尿素、１０ｍＭＮａＣｌ、１
０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、ｐＨ７（代わりに４Ｍグアニジン
、０．０２％ＮａＮ、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、ｐＨ６，
８を使用できる）中で平衡化された七フアクリルＳ−２
００カラム上で分別した。２８０ｎｍで両分のＯＤ読取
りを行なった。第２図はこれらの読取り値を作図したも
のである。両分４５〜５３を一緒にし、これがＳ−２０
０低分子量（３０にダルトンまで）の蛋白質両分を構成
している。この両分を０．０５ＮＮ　Ｈ３ＨＣ０３に対
して透析し、凍結乾燥した。
との実施例に報告された種々の両分の成骨誘発６ 活性を、アガロース中のラット筋肉腺維芽細胞にＩＩ型
コラーゲン及び軟骨プロテオグリカン類を合成させる能
力によって検定した。検定に用いた材料と方法は次のと
おりであった。
生後１９日のスブラーグ争ドーリ一種のラット胎児の上
肢から筋肉組織を無菌的に切り取った。
組織を刻み、１０％牛脂児血清及び培地ｍ見当りペニシ
リン５０単位とストレプトマイシン５０ｇを加えたイー
グル最少必須栄養培Ｊｉ（ＭＥＭ）中で培養した。細胞
の成長はふつう１週間以内に全面成長に達した。全面成
長の時点で細胞をトリプシン処理し、１：２に分割し、
最初の３継代以内に実験に使用した。
（Ｅｅｌ！　（Ｉｎ２年）３０巻２１５〜２２４頁に記
述された方法によって細胞をアガロースゲル中に埋め込
んだ。しばらくして１％高融点アガロース（バイオラッ
ド、井１６２−０１００）１．０ｍＭを各々の３５ｍｍ
容器に加え、室温で水平面とでゲル化させた。３８℃に
平衡化させた２％低融点アガロース（バイオラッド、＃
１６２−００１７）を同量の２Ｘ濃縮したハムＦ−１２
栄養混合物と混合し、３８℃に保持した。アガロース／
Ｆ−１２溶液を次いで同量の細胞懸濁液と混合し、各容
器に１．５ｍＱずつ加えた。固まったら、培地３．０ｍ
Ｊ１でゲルを覆い、５９６　Ｃ０２、９５％空気の中で
３７°Ｃで培養し、週に２回栄養を与えた。細胞懸濁液
用と栄養供給用の培地は、ハムＦ−１２にｌＯ％熱不活
性化牛脂児血清、０．５％ニワ）・り胎児エキス（任意
）、ヘニシリン、／ストレプトマイシンを加え、試験用
画分を補ったものからなっていた。アガロース溶液を使
用の１５分前に１２１℃でオートクレーブにかけて滅菌
した。最終的細胞濃度は３５　ｍ　ｍ容器当たり３ＸＩ
Ｏ６の細胞であった。培養は重複して行なった。
１４〜２１Ｂの培養後、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　
（１ｆｌ１７０年〕４５巻４３４〜４３８頁に記述され
た方法によってゲルを固定、染色した。ゲルを燐酸緩衝
された食塩水＜ｐＢｓ）中で２回手短かに洗い、４０％
ホルマリンで画定し、蒸留水でゆすぎ、２５％アセトン
中０．５％トルイジンブルーで染色し、蒸留水で一夜洗
った。
固定後、各ゲルを組織学的処理のため除去した。ゲルを
脱水し、透明にしてパラフィンに埋め込んだ。ゲル表面
に対して垂直と平行に４〜６ＪＬ　ｍの切片を摩った。
切片をトルイジンブルーかサフラニンＯで染色した。プ
ロテオグリカン基質の沈着を異調染色（トルイジンブル
ーで紫色、サフラニン０でオレンジ色）によって決定し
た。
３．７．１４日と抽出液で処理したゲルから、２倍量の
６Ｍグアニジン−ＨＣ交、０．０７５Ｍ酢酸ナトリウム
、２０ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＰＭＳ　Ｆ、ｌｏｍＭ　　
ＮＥＭ、ｐＨ５，８、中における均質化後、４℃、１８
時間の振とうによって、プロテオグリカン類及びコラ−
ケンを抽出した。アガロースを遠心分離（１５Ｋｒｐｍ
、３０分）によって除去した。０．２ｍＭＰＭＳＦ（最
終グアニジンＨＣｃｉａ度約０．０５Ｍ）を含有する１
０倍量の水に対して、４”Ｃで上澄液を透析した。試料
を凍結乾燥し、１／１（１１，の木に再懸濁した。（最
終グアニジンＨＣす温度約０．５Ｍ）。
９ 次に、レナード（Ｒｅｒ＋ｎａｒｄ）ら、Ａｎａｌ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ。
（１９８０年）１０４巻２０５〜２１４頁に木質的に記
述されたとおりに、固相酵素免疫測定法 （Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ）によってプロテオグリカン類と
ＩＩ型コラーゲンを測定した。標準的手法によって軟骨
プロテオグリカン類と■１型コラーゲンに対する抗血清
をウサギで創出した。免疫用のプロテオグリカンとＩＩ
型コラーゲンはスヮーム種のラット軟骨肉腫から単離さ
れた。ＩＩ型コラーゲンの抗血清は、臭化シアンセファ
ロースカラムを用いて親和精製された。
ＥＬＩＳＡの場合、微量滴定容器を２０ｍＭ炭酸塩緩衝
液（ｐＨ９，６）中の適当な抗原２００ＪＬＩにより、
４°Ｃで一夜被覆した（容器当たりｉｏｏ〜１０１００
０ｎ。未結合抗原を除くために０．０５％ツイーン２０
型界面活性剤を含有する０、９％Ｎ　ａ（、Ｑで容器を
３回洗った。プロテオグリカン類及びＩＩ型コラーゲン
を抑制ＥＬＩＳＡで測定した。試料の一部（１０〜１０
０　＃Ｌ）を、１　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ牛血清アルブミ
ン２゜ と０．０５％ツイーン２０型界面活性剤を含有し、適当
な抗血清（１：　５００の親和精製ぎれた１１型又は１
　＋　２０００のプロテオグリカン）を加えた燐酸緩衝
食塩水（ＰＢＳ）中で、室温で２時間培養した。次に培
養混合物２００　ｇｌ’ｅ抗原被覆されたプレートに、
室温で４５〜６０分間に加えた。ＰＢＳ−ツイーン２０
型界面活性剤で３回洗った後、ワサビダイコン　パーオ
キシダーゼに複合体化されたヤキ抗ウサギＩｇＧ（タボ
、１：２００）と室温で１時間に加えた。結合していな
い第二抗体をＰＢＳ−ツイーン２０型界面活性剤と一緒
に除去し、基質（０−フエこレンジアミン、０．１Ｍ＜
えん酸塩中１　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｆＬ　、　ｐ　Ｈ４，
６）を３０〜６０分間に加えた。２Ｍ硫酸５０μ文の添
加によって反応を停止した。反応媒体の分光光度計の読
取り（４９２ｎｍ）を行ない、標準曲線と比較して、Ｉ
Ｉ型コラーゲン及びプロテオグリカンの産生が誘発され
ていたかどうかを決定した。これらの検定結果（＋は誘
発あり、−は誘発なしを示す）を下表にまとめである。
画−分　　　　　　　　比他う−ゲン　　ズ三デオ久旦
力りｍ対照　　　　　　　　　　　　　−− 抽出液　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　
　＋ＤＥＡＥ吸着　　　　　　　　−− ＤＥＡＥ未吸着　　　　　　　　＋　　　　　　　　　
＋ＣＭ吸着　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　
＋ＣＭ未吸着　　　　　　　　　　−−
【図面の簡単な説明】 第１図は、実施例の分離用イオン交換からの溶離液両分
の光学濃度グラフである。 第２図は、実施例のゲル濾過画分の光学濃度グラフであ
る。 出順人　　　　コラーゲン・コーポレイション代理人　
　　弁理士　　加　藤　　　朝　道３ Ｆ工６　−１−

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、鉱物質除去された粒状の骨又は骨肉腫からの成骨因
    子を部分的に精製する方法であって、鉱物質除去された
    骨又は骨肉腫からの非繊維性蛋白質を、液状かつ解離性
    の非繊維性蛋白質抽出剤で抽出し、イオン交換クロマト
    グラフィによって抽出液から成骨因子を分離することか
    らなり、以下の工程を特徴とする方法： （ａ）抽出液を始めに約６．８ないし約７．２のｐＨで
    陰イオン交換体と接触させる、 （ｂ）陰イオン交換体からの未吸着画分を約４．５ない
    し約５．２のｐＨで陽イオン交換体と接触させる、 （ｃ）陽イオン交換体からの吸着画分を溶離する、 （ｄ）約３０，０００ダルトンより低い分子量をもつ非
    繊維性蛋白質を溶離液から単離する。 ２、工程ｈ）〜（Ｃ）がそれぞれプロテアーゼ抑制剤の
    存在下に実施ｙれることを更に特徴とする、特許請求の
    範囲第１項の方法。 ３、陰イオン交換体と陽イオン交換体がセルロース性イ
    オン交換体であることを更に特徴とする、特許請求の範
    囲第１項の方法。 ４、陰イオン交換体がジエチルアミノエチルセルロース
    、陽イオン交換体がカルボキンメチルでルロースであり
    、工程（ａ）が約７．０のｐＨで行なわれ、工程（ｂ）
    が約４．８のｐＨで行なわれることを更に特徴とする、
    特許請求の範囲第３項の方法。 ５、工程（ｄ）がゲル濾過によって行なわれることを更
    に特徴とする、特許請求の範囲第１項の方法。 ６、抽出液から抽出剤を除去し、抽出液中の非繊維性蛋
    白質を陰イオン交換体と接触させるために６Ｍ尿素に溶
    解し、陰イオン交換体がジェチ〕レアミノエチルセルロ
    −ス が約７．０であり、陽イオン交換体がカルボキンメチル
    セルロースで、工程（Ｃ）のｐＨが約４、８であること
    を更に特徴とする、特許請求の範囲第２項の方法。 ７、η、物質除去された骨又は骨肉腫からの非繊維性蛋
    白質を、液状かつ解離性の非繊維性蛋白質抽出剤で抽出
    し、イオン交換クロマトグラフィによって抽出液から成
    骨因子を分離することからなり、以下の工程を含む方法
    により部分的に精製された成骨因子： （ａ）抽出液を始めに約６．８ないし約７．２のｐＨで
    陰イオン交換体と接触させる、 （ｂ）陰イオン交換体からの未吸着画分を約４、５ない
    し約５．２のｐＨで陽イオン交換体と接触させる、 （ｃ）陽イオン交換体からの吸着画分を＃離する、 ｃｄ）約３０，０００ダルトンより低い分子量をもつ非
    ＃１！雄性蛋白質を溶離液から単離する。 ８、を椎動物の骨に存在する部分的に精製された成骨因
    子で、以ドを特徴とするもの： （ａ）非繊維性である、 （ｂ）約７．０のｐＨでジエチルアミノエチルセルロー
    ス陰イオン交換体によって吸着されない、 （Ｃ）　約４　、　ｓのｐＨでカルボキシメチルセルロ
    ース陽イオン交換体によって吸着される、（ｄ）約３　
    ０　、０００ダルトンより低い分子量をもつ。
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