JPH01158964A - 改良された誘導性コラーゲンを主成分とする骨修復調製物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は骨修復材料の調製方法および該方法により調製
された材料に関する。さらに詳しくは。

本発明は軟骨形成性／骨形成タンパクを含む、コラーゲ
ン／無機質担体の調製に関する。

（従来の技術） 骨欠損および骨折の生理学的修復は、細胞の分化および
骨の無機質成分の形成を促進する因子によって仲介され
ることは良く知られている。最近。

これらの活性が著しい１つまたは複数の因子を同定する
試みがなされている。米国特許第４．４４０．７５０号
および第４．４３０．７６０号には、移植物において。

あるいは注入に必要な、天然に存在するあらゆる因子の
代わりをする無機物除去管粉末（ＤＭＢ）の使用が開示
されている。Ｕｒｉｓｔの米国特許第４，２９４，７５
３　　　　。

号および第４，４５５，２５６号には、骨形態形成タン
パク（ＢＭＰ）が開示されている。これは、尿素または
塩化グアニジンを用いる無機物除去骨から抽出され１次
いで再沈澱されるものである。この因子をさらに精製し
たものは、　Ｕｒｉｓｔにより報告されている：Ｕｉｎ
　Ｏｒ庚並」剰」悦しく１９８２）　　１競：　２１９
゜５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８３）　２２０：６８０；お
よびＰｒｏｃ　Ｎａｔｌ　ＡｃａｄＳｃｉ　（ＵＳＡ）
　８１：３７１゜ＢＭＰについてＵｒｉｓｔが記載した
ちのとは異なる特徴を有する骨形成因子タンパクは、　
ＤＭＢから単離されて、　５ｅｙｅｄｉｎおよびＴｈｏ
ｍａｓにより精製された（米国特許第４，４３４，０９
４号および第４，６２７，９８２号）。

上記因子は、骨の再形成を助けるので、骨修復のために
投与される組成物に含有させるのが望ましいとされてい
る。米国特許第４．４４０，７５０号（前出）では、再
構成アテロペプチドコラーゲン調製物が、　ＤＭＢまた
はＤＭＢ抽出物のキャリアとして使用された。Ｊｅｆｆ
ｅｒｉｅｓの米国特許第４　、３９４　、３７０号には
、粗ＤＭＢ抽出物のキャリアとして、非アテ口ペプチド
コラーゲン組成物が開示されている。これはＵｒｉｓｔ
の出版物に引用されている。

さらに別の研究が、　Ｒｅｄｄｉ　らにより行われてい
る（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（１９８
３）　６９：１６０１）。この文献には、ラット宿主動
物における同種起源の無機物除去管粉末の使用について
記載されている。

Ｓａｍｐａｔｈ、　Ｔ、に、ら（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　
Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（１９８３）８０：６５９１）は、
数多くの種からの骨形成因子をさらに精製することを報
告した。

米国特許第４，５６３，３５０号（本出願の優先権主張
の基礎をなす米国特許出願の親出願は、この米国特許の
一部継続出願である）には、コラーゲン骨修復組成物の
使用について記載されている。しかし、この組成物には
、効果的に誘導活性をもたらす非繊維状コラーゲンの存
在が必要である。本出願の優先権主張の基礎をなす米国
特許出願の親出願である米国特許第８１６，２６８号（
１９８６年１月６日出願；この米国特許出願は同じ譲受
人に譲渡されており、参照文献としてここに採用する）
には。

低免疫原性の非繊維状または繊維状コラーゲンに加えて
、硬質組織移植物に対して少なくとも７５％（ｗｔ／ｗ
ｔ）の無機質を含有する組成物が記載されている。その
出願に記載されている調製物は以下のような方法により
調製される。すなわち、コラーゲンとキャリアの無機質
成分との分離を妨げるような条件下で、適切な均質混合
を必要とせず、かつその望ましさも認めないような方法
である。その出願に記載され、提案された調製物におい
ては。

やはり骨形成因子を含有する約３■／　ｍｌの溶液状の
コラーゲンが固体無機質粉末と混合され、得られた材料
が凍結乾燥される。もう１つの方法では。

骨形成因子と無機質との凍結乾燥混合物を用いてペース
トが８円型され、これが６０ｔｎｇ／ｍｌｌのＺｙｄｅ
ｒｍ　＠コラーゲン移植物繊維状コラーゲン懸濁液に添
加される。

骨の伝導性修復用のコラーゲン／無機質調製物。

すなわち新しい軟骨および骨細胞の内方成長を可能にす
るが、外因性骨誘導因子が導入されていないマトリック
スも記載されている。米国特許第８４８、４４３号（１
９８６年４月４日出願；この米国特許出願は米国特許第
７１７，０７２号の一部継続出願であるが、今では放棄
されている。しかし、同じ譲受人に譲渡されており、参
照文献としてここに採用する）には６０〜９８重量％の
無機質と２〜４０重量％のコラーゲンとを含有する。無
機質とアテロペプチドコラーゲンとの湿潤混合物および
乾燥混合物の調製が記載されている。これらの組成物は
、固体粉末無機質と、　６５ｍｇ／成のコラーゲン懸濁
液とを混合することにより調製される。得られた混合物
は、ペーストとして使用されるか、あるいは常温常圧で
乾燥される。

Ｂｅ１ｌの米国特許第４，４８５，０９７号には、線維
芽細胞および無機質除去費粉末を含有するコラーゲン格
子について記載されている。しかし、これは無機質含有
量を持たない。

米国特許第４，０９７，９３７号には、コラーゲンと混
合して、骨の置換混合物が得られるヒドロキシアパタイ
トセラミック材料について記載されている。

上記組成物のいずれも、骨の移植に直接使用でき、かつ
含有されている骨形成因子の効果的な供給による骨修復
の仲介が効果的であるような、均質かつ硬質の調製物が
得られない。

（発明の要旨） 骨形成因子の効果的なキャリアである乾燥プロテーゼは
、均質かつ強力であって、それに含有される骨形成因子
により骨の内方成長を誘導し得るものが得られるという
ことが見い出された。この結果は、まず骨形成因子調製
物の溶液を、コラーゲンまたは無機質成分と混合し１次
いで残りの成分を、この混合物と組み合わせて、全懸濁
液中のコラーゲン濃度が３０〜１００ｍｇ／ｄ程度の調
製物とすることにより達成される。次いで、この混合物
を常圧で、わずかに高い温度で乾燥する。ｍｍ　Ｗ方法
がこようにして行われる場合、得られた組成物は、圧縮
強度が少なくとも２０Ｎ／ｃ＋ｆｌであり、剛性を有す
るという特徴、および均一に分散し、生物学的に活性で
、かつ利用可能な骨形成因子が包含されているという特
徴を有する。これらの組成物はまた低免疫原性でもある
。

このようにして１ある局面においては１本発明は、リン
酸カルシウムの微粒子無機質成分を６０〜９８重景％、
好ましくは７５〜９５重量％と、アテロペプチド精製コ
ラーゲン調製物を２〜４０％、好ましくは５〜２５％と
、そして有効量の骨形成因子（ＯＦ）との混合物から実
質的に成る固体骨修復組成物を目的としている。有効量
のある評価規準は、「部分的に精製された」骨形成因子
抽出物（ＯＦＢ）の約０．５〜４％を含有させることに
より得られる活性に相当する。該因子およびキャリアの
いずれも。

低免疫原性であるのに充分なほど純粋である。ＯＦＦは
、活性においで充分に濃縮されているので、調製物にお
いて４％（ｗｔ／ｗｔ）のＯＦＥという、挙げられてい
る最大量が必要とされているだけである。

これらの組成物は、三成分全部の分布に関して均質であ
る。含有される叶が生物学的に活性かつ利用可能である
。そして圧縮係数が少なくとも２０Ｎ／ｃｒＡであると
いう特徴を有する。

脊椎動物における骨修復を実施するための移植に適した
本発明の低免疫原性組成物は、６０〜９８％の無機粒子
；２〜４０％のアテロペプチド低免疫原性コラーゲン；
および有効量の０Ｆｌｉ製物から実質的に成り、移植物
は２０Ｎ／ＣＩＩＮより大きな圧縮係数の多孔質硬質固
体であり、かつその成分に関して均質であり、そして該
ＯＦは生物学的に活性かつ利用可能な形態にある。

脊椎動物における骨修復を実施するための移植に適した
本発明の他の低免疫原性組成物は、骨に由来するタンパ
ク骨誘導性因子（ＯＦ）の骨誘導的に有効な量と、少な
くとも７５重景％の無機質キャリアとを含有し、該ＯＦ
は異種宿主において低免疫原性であるのに充分なほど純
粋である。

他の局面では１本発明は、これらの組成物の調製方法に
関する。−船釣に、これらの方法は、上記の混合物成分
を混合し、コラーゲン濃度が、調節された乾燥の前に、
３０〜１００ｍｇ／ｍ１であるような懸濁液とし、そし
てこの懸濁液を、固体材料が得られるのに充分なほど水
分含量が減少するまで。

常圧下にて乾燥させることを特徴とする。

本発明の方法は、脊椎動物における骨修復を実施するた
めの移植に適した低免疫原性組成物の調製方法であって
、該組成物は、異種宿主において低免疫原性であるのに
充分なほど純粋であるタンパク骨誘導性因子（ＯＦ）の
骨誘導的に有効な量と。

該組成物の６０〜９８％を構成する無機質および該組成
物の２〜４０％を構成するコラーゲンから実質的に成る
成分を有するキャリアとを含有し、該方法は、（ａ）該
組成物のコラーゲン、無機質、およびＯＦ酸成分含む均
一な水性懸濁液を、該懸濁液中のコラーゲン濃度が３０
〜１００ｍｇ／ｍＲになるように調製すること；および
（ｂ）該懸濁液を常圧下にて調節された乾燥に供し、硬
質の固体を得ること、を包含する。

（発明の構成） Ａ、定且 ここで用いられているように、「骨誘導性」および「骨
形成」という用語は、互換的に使用され。

骨の始原細胞が生きた骨組織へ転換することを意味する
。骨誘導は、骨形成、すなわち骨の有機成分および無機
成分の分泌による無機質化骨の直接形成をもたらし得る
。あるいは、骨誘導は、軟骨の中間形成をも伴い得る。

すなわち、骨誘導因子はまた。軟骨形成性であり得る。

実際には、軟骨形成の特徴を示すプロテオグリカンが２
本発明の組成物の骨誘導活性の指標として用いられる。

ここで骨形成因子に関して使用される場合、「由来する
Ｊという表現は、構造的関係または相同性を意味する。

これは物理的な由来に限定されない。従って、骨から「
由来する」骨形成因子は。

１つまたは複数の因子が、骨組織において本来産生され
る因子のアミノ酸配列に対して、相同性を有し、かつ同
様の機能を有するアミノ酸配列を持つことを示す。これ
は必ずしも、使用される材料が骨それ自体から直接単離
されることを意味しているわけではない。この材料は９
例えば合成により、あるいは組換えＤＮＡ技術を用いて
製造されるものであってもよい。

「低免疫原性」とは、許容し得る生物学的適合性を示す
。多くの物質が、ある種の動物および適用においては免
疫原性であり得るが、別の場合には特定の免疫グロブリ
ンの検出可能レベルを上昇させることはできないことは
理解されている。特定の免疫グロブリンおよび炎症が完
全に存在しないということが、必ずしも必要とされない
ことも理解されている。従って、「低免疫原性」とは。

本発明の組成物成分または組成物を記載するために使用
される場合には、すべての免疫応答が許容レベル内にあ
ることを意味するように機能的に定義される。

「アテロペプチドコラーゲン」とは、テロペプチドまた
は免疫原性部分を除去するか、あるいは一部除去するよ
うに適切に処理されたコラーゲンを意味する。簡単に説
明すれば、コラーゲンは。

繰り返しのアミノ酸配列からなる三重らせん構造の束か
ら構成される繊維状構造を含む。これらの三重らせん配
列は非らせん構造で終結している。

これらの非らせん構造は、様々なコラーゲン積置の架橋
、および部分的にはコラーゲン調製物の免疫原性の両方
の原因ともなる「テロペプチド」である。これらの構造
の除去は、適切なタンパク分解酵素９例えばトリプシン
による処理によって行なうことができる。主な種特異的
免疫原がこのようにして除去されているので、得られた
アテロペプチドコラーゲンは異種間の使用に対してより
適している。

「非繊維状コラーゲン」は、その本来の繊維状構造を維
持しないように処理されている。従って。

この用語は、可溶化され、かつその本来の繊維状形態に
再構成されていないコラーゲンを意味する。

繊維状構造は溶解により粉砕し得る。これは、繊維（原
繊維）を再構成することにより、あるいは非特異的凝集
（非原繊維）により、固体形態に戻すことができる。

ｒＯＦＥ　Ｊまたは［部分的に精製された叶Ｅ」として
示される骨形成因子抽出物は、以下に記載される骨から
の部分的に精製された抽出物と定義される。これは、米
国特許第４，６２７，９８２号（参照文献としてここに
採用する）に記載されているように、カチオン交換樹脂
に結合させ、そしてそれから溶離された１分子量が３０
，０００より小さな両分である。本発明の組成物におけ
るＯＦＦの割合は、記載された「部分的に精製された」
調製物に関して与えられている。しかし、低免疫原性で
あるのに充分なほど純粋であれば、同等量の骨形成活性
が得られる他の調製方法を用いても良いことは理解され
る。これらの抽出物の骨形成活性は、その中に含まれる
１つまたはそれ以上の骨形成因子（ＯＦ）の存在による
。この１つまたは複数の因子（ＯＦ）の組成物への供給
は、抽出物（ＯＦＥ）の形態で行なうことができる。あ
るいは、１つまたは複数の因子の合成形態またはその組
合せを使用してもよい。

もちろん、「部分的に精製された」と言われるものより
純度の高いＯＦＥまたはＯＦ調製物を、同様の活性レベ
ルで、ここで特定されたものに対応する量で使用するこ
ともできる。

「ＯＦ」は、抽出物から得られたものでも、化学的に合
成されたものでもよく、それ自体が抽出物の骨形成活性
の原因となる１つまたは複数の因子として定義される。

ＯＦはまた。骨形成′活性および天然物質の薬理学的挙
動を保持する。すなわち本発明の組成物においても依然
として生物学的に利用可能な、天然に存在する物質の変
異体をも包含する。

（以下余白） 従って、「部分的に精製されたＯＦＦと同等のＯＦの割
合（％）」とは、０．５〜４％の割合で、前記のような
「部分的に精製されたＯＦＥ　Ｊの使用により得られた
活性を提供する叶調型物の量のことを言う。一般に、同
種または異種の宿主における使用に必要な低免疫原性の
レベルを達成するためには、同様に精製された。あるい
はより高度に精製された調製物が必要とされるため、当
量は前記範囲内またはそれ以下となる。高度に精製され
た抽出物または合成物質が使用されるならば、より小さ
い割合（％）が効果的である。

本発明の方法による混合物の「撹拌」とは１例えばかき
まぜ、振盪、振動等のような従来の手段により、混合物
の粒子の運動を機械的に起こすことを言う。

［インキュベーティングｊとは、８周節されたまたは特
定の条件下で、所定の時間にわたって、被検物質または
混合物を保持することを意味する。

ここでは、水分含量は、この期間を通じて同じである。

本発明の組成物についてここで示される割合（％）は、
東」［レカ２特定の成分のＷ　ｔ／Ｗ　ｔ％である。水
は。

多くの場合（常時ではないが）これらの組成物の重要な
部分であるが、その割合（％）は、該組成物において所
望の物理的性質によって様々である。

例えば組成物は、多くの場合乾燥状態で保存され。

その後乾燥状態で移植されるか、あるいは移植のために
再水和される。

「調節された乾燥」とは、常圧および室温で行なわれる
。水分を除去する方法のことを意味する。

もちろん、はぼ大気圧を維持するために空気を用いる必
要はない。例えば窒素も使用しうる。しかしながら、こ
こでの組成物に関して、大きな安定性の問題は無いので
、空気を選択するのが便宜上量もよい。乾燥過程を速め
るために、温度を室温よりやや上げてもよい。

Ｂ、二瓜煎脱所 本発明の組成物は、異種間で使用される時、低免疫原性
となるほど精製されている。骨誘導性因子（ＯＦ）調製
物の有効量分と９本発明の組成物の無機質／コラーゲン
キャリア等の低免疫原性キャリアとの混合物である。該
組成物において必要とされる特定のＯＦ調製物の割合（
％）は、当然調製物の純度によるが１前記のような、１
部分的に精製された叶Ｅ」については、０．５〜４％の
範囲が適している。より高度に精製さ°れたＯＦは、相
応して、より少ない量で使用され得る。

旺■袈闘 異種の宿主において、低免疫原性であるほどの純度の基
準に合うＯＦ調製物は、いくつかの方法で調製されうる
。この因子源として、骨、象牙質。

骨肉腫、または軟骨肉腫、および叶を含むを推動物起源
の他の組織を使用しうる。ヒト、サル、ウシおよびラッ
ト起源のＯＦを含む調製物は、異種間移植において軟骨
性骨を作る能力において種特異的でないということが示
されている。　　（Ｓａｍｐａｔｈ。

Ｔ、に、ら、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ
　（ＵＳＡ）　　（１９８３）　８０：６５９１　）。

従って１本発明の混合物において使用しうるＯＦは、こ
れらの源のいずれに由来するものでもよく、実際、を推
動物に由来するタンパクに実質的に類似した骨誘導活性
を有するタンパクであれば、このようにして調製された
ものであっても。

偶然のあるいは意図的手段で改変されたものであっても
、化学的合成１組替えＤＮＡ技術あるいは他のそのよう
な方法によって調製されたものであってもよい。さらに
例えば、　Ｕｒｉｓｔの骨の形態発生的タンパクも、充
分に精製すればおそらく使用し得る。ＯＦはを推動物源
に由来しうるタンパクへの実質的類似性、骨誘導性機能
、および許容し得る低い免疫原性の要求条件にだけ合え
ばよい。

本発明の組成物において有用な、［部分的に精製された
ＯＦＥ　Ｊを調製するための１つの有用な方法が、米国
特許筒４．６２７，９８２号（前記）に記載されている
。簡潔に記載すれば、これは、先ずブタまたはウシの長
管材料（容易に入手できるため）を２機械的および研磨
技術によって処理して、清浄にし、かつ粉砕し、エーテ
ルまたは酢酸エチル等の有機溶媒を用いた抽出により脱
脂し、その後。

通常標準的技術を用いた１強酸での抽出により無機質を
除去し１次いで得られた無機質除去骨（ＤＭＢ）を出発
物質として用いることにより開始される。

その後、可溶化ＯＦＢを得るために、　ＤＭＢをカオト
ロピック試薬で抽出する。抽出されたタンパクの消化ま
たは変性の可能性を低減するために、好ましくは抽出を
プロテアーゼ阻害剤の存在下で。

１日あたり約４時間にわたって、低温で実施する。

抽出後、抽出剤を適切な手段２例えば水に対する透析、
調節された電気泳動、またはゲル濾過、あるいは他のい
かなる適切な手段によって除去してもよい。その後、除
去した抽出剤を用いて、あるいは用いずに抽出物をゲル
濾過または他のサイズ調整法に供し、標準的技術を用い
て、約３０，０００ダルトン以下の分子量の両分を得る
。

低分子量の両分は、競合イオンから遊離され。

ついで前述の「部分的に精製された叶Ｅ」を得るために
３例えば尿素のような非イオン性カオトロピック試薬の
存在下、はぼｐＨ４，５〜５．２で２例えばＣＭＣとの
陽イオン交換を用いるか、あるいは例えばほぼｐＨ７，
，２における６Ｍ尿素および２０ｍＭリン酸ナトリウム
の存在下で、　　ＤＥＡＥ−セルロースの陰イオン交換
を用いて、イオン交換クロマトグラフィに供する。

ＯＦは陽イオン交換樹脂に吸着され、適切な条件下で遊
離される。陽イオン交換クロマトグラフィから得られる
活性溶離画分は２本発明の組成物において［部分的に精
製された０ＦＥＪとして直接使用され得る。０．５〜４
％の割合の範囲は、最終組成物中の部分的に精製された
タンパクのし／訂％に基づいている。

「部分的に精製されたＯＦＥ　Ｊに含まれるＯＦは。

０．０１〜０．１Ｍのリン酸ナトリウムを添加して、　
ｐＨ６〜８のリン酸塩緩衝液中で沈澱させることにより
、さらに精製され得る。ついで沈澱物は、非イオン性カ
オトロピック試薬に再溶解され、　ＨＰＬＣによるヒド
ロキシアパタイトカラムでクロマトグラフィーに供され
る。

または、　ＤＭＢに由来する低分子量画分を、陰イオン
交換樹脂による処理に供することにより得られる非吸着
材料は、　ＯＦ活性を含み、この非吸着タンパクはまた
。尿素除去のための透析後、［部分的に精製されたＯＦ
Ｅ　Ｊの同等物として適切な割合（％）で使用されても
よい。陰イオン交換樹脂処理溶液中のタンパクは、凍結
乾燥により回収され得るか、あるいは０．０ＩＮの）Ｉ
ＣＩに対する透析によって安定化され得る。（１部分的
に精製された０ＦＥＪはまた。前述の陰イオン交換樹脂
を用いた処理に供することもできる。これは代替工程と
してよりはむしろ追加工程として利用される。）陰イオ
ン交換処理は、　１９８２年に発行された特許には記載
されていないため、詳細を以下に記載する。

ゲルからの低分子量、あるいは陽イオン交換溶出液から
のＯＦ含有画分を、６Ｍ尿素、　２０ｍＭリン酸ナトリ
ウム、　ｐＨ７，２、２０ｍＭ　ＮａＣ１およびプロテ
アーゼ阻害剤を含む緩衝液中に溶解する。ついで。

この溶液を、同じ緩衝液を用いて平衡化したＤＥＡＥセ
ルロースカラムに流す。ＯＦを含むフロー・スルー画分
を、水に対し透析して尿素を除去し、叶を凍結乾燥によ
って回収する。または、フロー・スルー容積分を、　０
．０ＩＮのＭＣＩに対して透析し、　０．０ＩＮＨＣＩ
中、１〜１０ｍｇ／ｍｌのタンパク濃度で保存する。

これらの溶液は数ケ月間安定であり、凍結乾燥できる。

部分的に精製されたＯＦＦは、単にＯＦすなわち骨形成
活性の原因となる１つまたは複数の因子の便宜的な源と
して記載されていることに留意すべきである。ＯＦはま
た。他の源９例えばＵｒｉｓｔのＢＭＰの精製された形
態、または合成材料からも得られる。合成材料はまた。

天然の対応物の生物学的活性および生物学的利用可能性
を保持する天然の物質の変異体を含み得る。本発明は、
　ＯＦ源とは無関係に、誘導性骨成長を提供するのに有
効な組成物を対象とする。

（以下余白） −先」−史１− 好ましい組成物のキャリアの部分は１組成物に対して６
０〜９０％、好ましくは７５％、より好ましくは約８５
〜９５％の無機質成分、および繊維状もしくは非繊維状
コラーゲンまたはその両方から選択された追加成分を与
える。

無機質成分は、一般に種々の形態のリン酸カルシウム、
好ましくはヒドロキシアパタイト（１１八）およびリン
酸トリカルシウム（ＴＣＰ）　、または最も好ましくは
それらの混合物から選択される。ＨＡおよびＴＣＰはい
ずれも市販されており、多数のメツシュサイズおよび多
孔性から選択することもできる。

これらの材料は、硬質の組織移植物の構成に有用である
ことが開示されており、従って本発明の組成物の一部を
含有するのに適した生物学的適合性を有する。例えば、
　ＨＡ調製物を開示している米国特許筒４，３１４，３
８０号、およびＨＡの別の形態を開示している１（ａｙ
ａｓｈｉ、　Ｋ、　　らのＡｒｃｈ　０ｒｔｈｏ　　Ｔ
ｒａｕｍａｔ鉦■（１９８２）　９９：２６５を参照ノ
コと。ＨＡとＴＣＰとの混合物を含有する組成物に関し
ては、無機質含量が９５％またはそれ以下であることが
特に好ましく。

ＨＡのみについては９８％までを使用しうる。

本発明の組成物の特性は、許容しうる程度に低免疫原性
である。従って、非繊維状または繊維状コラーゲン成分
のアテロペプチド形態を用いるのが一般に好ましい。し
かしながら、移植された組成物の形状、宿主の感光性、
あるいは何らか他の理由によって２組成物を許容できな
くするほどアテロペプチドの存在が低免疫原性に対して
有害ではないような例もあり得る。換言すれば、アテロ
ペプチドコラーゲンの使用は好ましいが、必ずしも必要
であるわけではない。低免疫原性は、異種のコラーゲン
の源の使用を可能にするのに特に重要である。例えば、
免疫原性を充分に低減することによってウシまたはブタ
のコラーゲンを、ヒトの被検者に用いることができる。

非繊維状コラーゲンは、溶液状コラーゲンとして、ある
いは非特異的に会合している。溶液状コラーゲンの凍結
乾燥形態として供給さ６れ得る。非繊維状コラーゲンの
好ましい源は、溶液状コラーゲン（ＣＩＳ）（Ｃｏｌｌ
ａｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ＋　Ｐａ１ｏ　Ａｌ
ｔｏ。

Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａの商品名Ｖ　ｉ　ｔｒｏｇｅｎ　
＠として入手可能）である。しかしながら、いかなる非
再構成コラーゲン調製物を使用してもよい。

繊維状コラーゲンは１種々の源に由来するものであって
もよく、当該分野において多数の繊維状コラーゲン調製
物が利用できる。当該分野においては２種々の哺乳動物
の骨または皮膚に由来するコラーゲンが可溶化されるか
あるいは液状媒体中に分散され、ついで繊維状の形態で
回収される。

コラーゲンが再構成されて繊維状になっている調製物に
は９例えばＺｙｄｅｒｍ　＠コラーゲン移植物（ＺＣＩ
）（Ｃｏｌｌａｇｅｎ　　Ｃｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ、　
　Ｐａ１ｏ　　Ａｌｔｏ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから入
手可能）が含まれる。他の繊維状調製物には２本来の繊
維状形態を保ったまま分散された繊維であるＡｖｉｔｅ
ｎｅ＠、およびその後に冷凍乾燥される分散された調製
物であるＣｏｌｌａｇｅｎｆＣｏ１１ａ■が含まれる。

（従って、これら後者の調製物は「再構成コされていな
い。） ■炭窃勿立敗 本発明の組成物（これは、６０〜９８％、好ましくは７
５〜９５％の微粒子無機質と、２〜４０％、好ましくは
５〜２５％のコラーゲンと、０．５〜４％の、前述の如
く部分的に精製されたＯＦＨによって供給されたものま
たはその同等物等のような有効量のＯＦとを含有する）
は、以下に記載された方法によって調製される場合、そ
の調製法に起因する所定の望ましい特性を有する。先ず
第１に、全ての成分は充分に純粋であるか、さもなけれ
ば組成物が宿主中で低免疫原性であるように調製されな
ければならないことに留意すべきである。第２に、　Ｏ
Ｆ酸成分、均一に分散され、かつ生物学的に活性で有用
でなければならない。最後″に、無機質およびコラーゲ
ン成分は均一に分散されなければならず。

組成物は多孔質であり、海綿状であるよりはむしろ硬質
である。圧縮係数は、少な（とも２０Ｎ／ｃ＋ｆｌであ
る。

コラーゲン／無機質成分に関する均質性は、効果的に視
覚評価できる。移植物内のＯＦの均一性は。

調製法によって保証される。これは、標本の一部の標準
的分析法によって証明され得る。ＯＦの生物学的利用可
能性および活性は、骨形成を誘導する移植物の能力によ
り評価される。この評価には種々の方法が利用できるが
、最も著名なものは組織学的試験である。さらに、以下
に示されるように。

アルカリホスファターゼのレベルを、生化学レベルにお
ける骨形成を評価するために使用できる。

カルシウムレベルの評価およびプロテオグリカンについ
ての分析による軟骨形成のモニター等、他の基準も利用
しうる・。必要に応じて、移植物の低免疫原性は、移植
された材料またはその成分と反応する抗体についての宿
主の血清レベルをモニターすることによって確かめられ
得る。

圧縮係数の分析には、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅ
ｔｙ　ｆｏｒＴｅｓｔｉｎｇ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓが公
表した圧縮係数測定ガイドラインに従って、市販の装置
２例えばＩｎｓ　ｔｒｏｎ　＠の汎用テストモデル４２
０２を使用しうる。

この測定を行なうために１組成物をまず初めに５〜２４
時間、生理食塩水に浸漬する。この浸漬は。

完全な湿潤を保証できるだけの時間行われる。ついで組
成物を試験装置に入れる。材料に弾性があるならば、材
料をさらに圧縮するために、顕微鏡レベルで固有の構造
を粉砕する必要があるような点に達するまで、材料は容
易に圧縮される。材料が硬質であれば２弾性のある材料
の場合より変形しないでその点に達する。コラーゲン／
無機質混合物については、顕微鏡的組織は、三重らせん
それ自体によりまず維持されるが、また繊維の各成分の
コラーゲン三重らせん部分間の相互作用および繊維相互
の結合によっても維持される。これらの組織レベルのい
ずれをも粉砕する圧縮は、中空の空間の容積を減少させ
る一般的な圧縮より困難である。もちろん組成物中のコ
ラーゲン鎖がより高度に組織化され、かつ架橋されてい
ればいるほど、この顕微鏡的圧縮はより困難となる。

従って、高い圧縮係数（Ｎ／Ｃ１１！単位で測定された
）は、顕微鏡レベルにおける高い組織化のレベル。

特にコラーゲン分子間の貰い架橋のレベルを示す。

低い圧縮係数は、架橋が低いことを示す。適切な物理的
取扱い特性および移植物としての結合性の維持のために
、圧縮係数は適度に高く、少なくとも約２０Ｎ／ａ＋ｔ
またはそれ以上であることが重要である。圧縮係数の上
限レベルは材料の性質によって決定され、この種の組成
物は、実際、架橋の程度に関わらず１００Ｎ／ＣＴ１１
よりはるかに大きい係数値に達することはできないと考
えられている。とにかく、圧縮係数が２０Ｎ／ｃ１１１
を越え、好ましい範囲が２０〜３ＯＮ／ＣＴｌ１である
ことは１本発明の組成物に対して適切な物理的特性を維
持する上で重要である（より高い強度が所望されるなら
、下記のように組成物を熱硬化して５０〜６ＯＮ／ｃ＋
ｆｌの圧縮係数を得ることができる）。本発明の方法に
より調製され、得られた組成物は、必要な圧縮抵抗強度
が達成されるのを確認するために、この測定によって評
価される。

（以下余白） 則迩Ｉハ暮」装 本発明の方法において９組成物は、生物学的に利用し得
るＯＦが得られるような、高い圧縮係数の固体均質調製
物が得られるような方法で調整される。このような結果
を得るために１Ｍｉ成物の最終乾燥工程は、３０〜１０
０　ｍｇ／ｍｌの濃度のコラーゲン懸濁液、必要量の無
機質、および懸濁液中に均一に分散された叶を含む混合
物を用いて実施されなければならない。この材料は、実
質的に大気圧で。

好ましくはわずかに高い温度で乾燥されなければならな
い。最終工程における凍結乾燥による乾燥により２強度
および均質性について同一ではない。

海面状生成物が生じる。

従って１本発明の組成物を得るために必要とされる方法
において、懸濁液をＯＦと共に撹拌し、所望の形状に成
形しここに述べられたような調節された条件下において
乾燥を行う。上記懸濁液中には、最終的なコラーゲンの
割合が組成物中に２〜４０％、好ましくは５〜２５％と
なるのに充分な、低免疫原性の、好ましくはアテロペプ
ヂド、好ましくは再構成繊維状コラーゲンが、３０〜１
００　ｍｇ／ｍｌの割合で、そして、最終的な無機質の
割合が６０〜９８％、好ましくは７５〜９５％となるの
に充分な微粒子状の無機質が含有される。上記叶は９部
分的に精製されたＯＦＥ調製物が０．５〜４％の割合で
含有されるのと同等の活性を有するのに充分な量である
。調節された条件下における乾燥は、少なくとも２０Ｎ
／ｃｗｔの圧縮係数を有する固体材料となるような水分
量に達するまで続けられる。

より大きな物理的強度９例えば約５０〜６ＯＮ／ａｆｌ
の圧縮係数を有する組成物を調製するために、上記生成
物を、５０〜１２０°Ｃ１好ましくは７５〜９０°Ｃで
４〜１６８時間にわたり熱硬化させる。調製を開始する
ために、　ＯＦの希釈水溶液（ある実施態様においては
温和な酸の溶液）を、キャリア全部または一部と混合す
る。キャリアは１本質的に無機質およびコラーゲン成分
からなるので、　ＯＦは、予備工程においてコラーゲン
または無機質調製物と混合されてもよく、あるいは、　
ＯＦはキャリアのＭ、　Ｓ液中に混合されてもよい。

一般に、無機質は微粒子として添加される。コラーゲン
は、始めは懸濁液またはゲル（繊維状コラーゲン、　Ｆ
Ｃ）または溶液（非繊維状コラーゲン。

ＮＦＣ）として添加される。

あるプロトコルにおいては、　ＯＦは予備工程において
コラーゲンと混合される。そして、その混合物は、室温
で約１２〜２４時間にわ、たってインキュベ−１・され
、遠心分離によって回収され、コラーゲンの濃度が、緩
衝溶液中に、３０〜１００　ｍｇ／ｍｌの範囲となるよ
うに調整されて再懸濁される。次に。

この懸濁液を撹拌により無機質成分と混合し、所望の形
状に成形し、そして、低温または室温における調節され
た乾燥に供する。あるいは、予備工程において無機質を
撹拌下に添加し、そして、混合物を低温または室温にお
ける調節された乾燥に供する。次に、コラーゲン成分は
、所定のコラーゲン濃度を有する凝集塊を形成するよう
に添加され、所望の形状に成形され１次いで調節された
乾燥に付される。

関連したプロトコルにおいては、コラーゲンおよび／ま
たは無機質成分のどちらかまたは両方の合計の一部９例
えば１／２または１／３または３／４が。

予備工程において添加され、残りがその後に添加されて
もよい。添加される各成分の部分は、同量である必要は
ない。

調節された乾燥は、　ＯＦをキャリアに組込み、かつ均
質性を保持するのに役立つ。調節された乾燥の条件は時
間および温度に関連するので１　当然。

互いに関連する。しかし、−船釣に、室温が好ましい。

適温は、１〜４０°Ｃの範囲であり。

好ましくは約１５〜３７°Ｃである。これらの条件下に
おいて、効果的な時間の範囲は１０〜２０時間であり。

便宜的には一晩である。

調節された乾燥方法において、懸濁液は、感知しうる水
分がなくなるまで１能動または受動ガス流、好ましくは
空気流で、同様に１例えば窒素のような不活性ガス流で
乾燥される。次に、乾燥生成物は保存され、再成形が必
要である場合には使用のために再水和され、あるいは直
接使用され得る。

下記に、典型的なプロトコルの例を示す。第１図は１本
発明の３つの特別に好ましい方法の図式第１図ａにおい
て、希釈溶液中のＯＦ調製物は。

適当な量の無機質、好ましくは多孔質ＨＡ／　ＴＣＰ混
合物と混合され、充分に混合される。次に、材料を空気
乾燥して、無ｍ質とＯＦとが充分に結合した混合物を得
る。ＯＦ抽出物の精製レベルに従って。

最終的な組成物における叶の必要な活性を得るために、
相対的な量が選択される。

次に、コラーゲン成分が、再構成繊維状アテロペプチド
コラーゲン６０〜７０ｍｇ／ｍｌ　のコラーゲン懸濁液
として供給される。この濃度のコラーゲンは。

市販のＺｙｄｅｒｍ　ＣｏｌＣｏ１１ａ　Ｉｍｐｌａｎ
ｔとして供給され得、あるいはこれは第１図ａに示され
るように標準的な方法を用いて調製され得る。この方法
においては、溶液状コラーゲンを適当な濃度の塩基性リ
ン酸塩緩衝液でインキュベートし、そして、中性ｐＨで
適当に希釈して所望の濃度とし、生じた沈澱物を回収す
ることにより調製される。次に、コラーゲン成分および
無機質／　ＯＦ混合物が合併される。これらは、全混合
物中に無機質の割合が６０〜９８％、好ましくは７５〜
９５％、そして、コラーゲンの割合が５〜２５％となる
ように、そして１部分的に精製されたＯＦＥ　ｍｌ製物
の０．５〜４％の活性が得られるのに充分なＯＦと共に
合併される。これらの材料は、撹拌して充分に混合され
、適温での空気乾燥の前に所望の形状に成形される。

第１図すに示された他の方法においては、　ＯＦ調製物
は、溶液中でコラーゲン（非繊維状）と結合してしる。

希釈コラーゲンを、　０．２Ｍのリン酸塩緩衝液１／１
０容で処理することによって再構成し。

ＯＦを含む沈澱物を形成する。リン酸塩緩衝液のｐＨは
、最終ｐＨが７，０〜７．５となるように選択される。

室温での適当な時間のインキュベーション、つまり、約
１２〜２４時間インキュベーションの後、沈澱物を遠心
分離して回収する。濃度を適当なレベル。

つまり、３０〜１００■／ｍｌに調製した後、　ＯＦを
含むコラーゲンマトリックスを、微粒子状の無機質と混
合し、成形し、適温で空気乾燥して、所望の固体移植物
を得る。第１図Ｃに示されるように、無機質とＯＦ調製
物との充分な混合物を凍結乾燥によって乾燥し、固体無
機物／　ＯＦを得１次いで、これを成形および空気乾燥
に適した濃度で、繊維状コラーゲンと混合してもよい。

もちろん、調節された乾燥工程に供される最終混合物が
、必要とされる割合の組成物の均一で均質な混合物を含
み、そして、　３０〜１００　ｍｇ／ｍｌのレベルでコ
ラーゲンが含まれるのに充分な水を懸濁液中に含んでい
る限り、他のプロトコルを使用することもできる。

本発明の組成物は、成形して、骨の再構成、骨折治療、
およびその他の整形外科の用途（例えば脊椎融合術）に
おけるアンレー移植物としての使用に適した形状とする
。そのような移植物を形成するために固体組成物を使用
する方法、およびそれらを移植するための外科的方法は
、当接術においてよく知られており９本発明の組成物は
、これらの標準的手段を用いるのに有用である。

所望の位置に置かれると、移植組成物は、新しい軟骨お
よび骨の内方成長のためのマトリックスを与え、そして
、骨誘導性因子の存在により、これらの物質の生成に刺
激を与える。

■戒嬰曵使■ 本発明の組成物は、外傷、疾病または先天性の欠陥によ
って引き起こされた大きなまたは小さな骨の欠陥を修正
するために、該分野において一般に知られた方法で使用
される。

下記の特定の実施例に記載されているように。

これらの組成物は、異種宿主の皮下に移植されると、骨
組織形成を刺激し得る。それらの、そのような能力は１
組成物を外移植し、核外移植物を。

軟骨プロテオグリカンの形成、カルシウムの存在および
アルカリホスファターゼの存在について。

組織学的に評価することによって、確認することができ
る。（軟骨プロテオグリカンは、軟骨形成の目安であり
、アルカリホスファターゼは２石灰化肥大性軟骨の指標
である。）さらに、宿主生体には、移植物質に対して反
応する抗体がないことが示される。

ち−ＪＪ廿桝 次の実施例によって２本発明を説明する。得られる組成
物が添付の特許請求の範囲内にあるならば２組成物の成
分の調製および組成物自体の調製の別の方法も本発明の
範囲に入る。

生後３０〜３４日のオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅ
ｙラットの腹面胸郭部分に、試料を、皮下的に移植した
。

各ラットは１両側面に、同じ材料の２つの移植を受けた
。そして、試験のための外移植物を、１４日および２８
日目に取り出した。この外移植片を、１４日および２８
日目に取り出した。この外移植片を。

組織学的に、そしてアルカリホスファターゼ活性測定に
より、検定した。

タタ盲　の　　　・　　・け １４日および２８日目後に取り出された外移植物を。

１０％中性ホルマリンで２６時間をかけて固定し、その
後、パラフィン包埋処理することによって９組職掌的評
価を行った。４〜６ミクロンの切片を。

包埋組織から摂取し、続いてこれをヘマトキシリン−エ
オシン、またはサフラニン−０で染色した。

サフラニン−〇は、軟骨プロテオグリカンに対して選択
的である。

アルカリホスファターゼ八 アルカリホスファターゼレベルは、骨形成の指標として
使用され得る。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を測定
するために、外径植物を小片に裁断し。

水冷下の１．５Ｍ　ＮａＣ１，３ｍＭ　ＮａＨＣＯ：＋
、　ｐＨ７，５，３ｍｌｌ中でホモジナイズした。次に
、ホモジナイズした試料を、４°Ｃにて１２．　ＯＯＯ
ｒｐｍで５０分間遠心分離し。

上清の一部を、冷蒸留水で１＝１０に希釈した。

Ｈｕｇｇｉｎｓ　らの、　Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　（１９
６１）１１４．７６１の方法ヲヲアルカリホスファター
ゼを評価するために採用し、ポリスチレンプレートを用
いた。

ｔｉＪの　　、 ２８日後に、移植した動物から血清を取り出し。

酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）法を用いて、移植
材料に対する抗体の存在についての検定を行う。

マイクロタイターのウェルを、４°Ｃにて一夜１組成物
の各成分２〜５ｇ　　（ｐＨ９，６の２０ｍＭ炭酸塩緩
衝液中（ｔｏｏ：１）で被覆した。結合していない抗原
を除去するために、ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　
２０界面活性剤を含むＰＢＳで３回洗浄する。

次いで血清を２時間にわたり室温で添加し、ウェルを、
　ＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎ　２０界面活性剤で３回洗浄す
る。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ラッ
トＩｎＧ（１：　２０００！！釈）を添加し、ウェルを
。

１．５〜２時間、室温にてインキュベートする。

その後、結合していない標識抗体を、界面活性体を含む
ＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎ　２０で除去し、ペルオキシダー
ゼ基質を添加する。プレートを室温で３０分間インキュ
ベートし、そして、プレートをスキャンニングし、吸光
度を求める。

可　カルシウムの渭 骨の形成もまた。カルシウム測定によって評価し得る。

外径植物を小片に裁断し、　０．５Ｎ　ＨＣＩ中に１　
：　１０（ｍ／Ｖ）および１　：２０（ｍ／Ｖ）となる
ように懸？完し、骨を溶解させる。試料をさらに室温で
５日間インキュヘー）　Ｌ’、　１２．００Ｏｒｐｍで
４０分間遠心分離する。そして、上清のカルシウム濃度
を、原子吸光により測定する（Ｔｒａｃｅ　Ａｎａｌｙ
ｓｉｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｈａｙｔｖａｒｄ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）　　。

部分的に精製されたＯＦＥを、０．０ＩＮノＨＣ１中３
　ｍｇ／ｍ１の溶液として用いた。

ＯＦＥ溶液５．４　ｍｌの試料を＋　２２　ｍｌ　Ｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ　ＣＩＳと共に、４°Ｃにて５分間撹拌す
る。Ｚｉｍｍｅｒ　Ｃｏｒｐ。

Ｗａｒｓａｗ、　ＩＮから入手した。微粒子形態の多孔
質１１Ａ／ＴＣＰセラミツク５６９ｍｇを添加し、混合
物を４°Ｃで５分間インキュベートし２次いで凍結乾燥
した。

得られた固体は、セラミック８７．５％、非繊維状コラ
ーゲン（ＮＦＣ）　１０％および叶Ｅ２．５％であった
。

％はすべで重量単位で表示される。この方法で調製され
た組成物を、第２図および第３図に「実施例２」として
示す（実施例５参照）。同じ方法で。

対照調製物を調製したが、　ＯＦＦ溶液の代わりに０．
０ＩＮのＨＣＩ　を使用した。

遺Ｊ１」１ 部分的に精製されたＯＦＥを、　　３　ｍｇ／ｍｌ溶液
（０，０１ＮＨＣＩ中）として用いた。ＯＦＢ溶液の５
．４　ｍｌの試料を、　Ｚｉｍｍｅｒ　Ｃｏｒｐ、Ｗａ
ｒｓａｗ、ＩＮから入手したＨＡ／ＴＣＰ５６９　ｍｇ
と共に２０°Ｃで５分間撹拌し１次いで３７°Ｃにて空
気乾燥した。得られた固体を、　６５ｍｇ／ｍｌのｚｙ
ｄｅｒｍコラーゲンの移植物（繊維状コラーゲン）１゜
０ｍｌ　と充分に混合し、再び３７°Ｃで空気乾燥して
。

完全に乾燥させた。得られた固体は、セラミック８７．
５％、繊維状コラーゲン１０％、そして、０ＦＥ２．５
％であった。％はすべで重量単位で表示されている。組
成物を、第２図および第３図に「実施例３」として示す
。同じ方法で、対照調製物を調製したが、　　ＯＦＦ？
ｇ液のを代わりに０．０１ＮのＨＣＩを使用した。

部分的に精製されたＯＦＥを、　　３　ｍｇ／ｍ＋溶液
（０，０１ＮのＨＣＩ中）として用いた。ＯＦ　Ｅ　？
Ｗ液の試料６．５ｍｌを、　Ｖｉｔｒｏｇｅｎコラーゲ
ン　溶液（３ｍｇ／ｍｌ　）　２５ｍ１および０．２Ｍ
　ＮａｚＨＰＯ４１０，０９Ｍ　ＮａＯＨ，ｐＨ１１，
２，３，５ｍｌと共に撹拌した。混合物を、室温で、１
６〜２０時間。

つまり便宜上−晩インキユベートした。得られたＯＦＥ
と繊維状コラーゲン（ＰＣ）との共沈澱物を、■３゜０
００　Ｘｇにて３０分間遠心分離することにより回収し
た。共沈澱物のタンパク濃度を、　ＰＢＳで６５ｍｇ／
ｍｌに調整した。

このＯＦＥとＰＣとの共沈澱物６５ｍｇ／ｍｌ　を、　
ＨＡ／　ＴＣＰ（Ｚｉｍｍｅｒ、　　Ｃｏｒｐ、、Ｗａ
ｒｓａｗ　ＩＮから入手）　５６９　ｍｇと混合し、３
７°Ｃで空気乾燥して、完全に乾燥させた。

得られた固体は、セラミック８７．５％、繊維状コラー
ゲン１０％、および０ＦＦ２．５％であった。％はすべ
で重量単位で表示されている。同じ方法で、対照調製物
を調製したが、　　ＯＦＦ溶液の代わりに０．０１Ｎの
ＨＣＩを使用した。

実施例２により調製された材料（凍結乾燥されたＯＦＥ
／ＮＦＣ／セラミック）を、はぼ半分の容量の水で水和
し、５分間浸漬し、移植に先立って、所望の大きさに成
形した。

実施例３により調製された材料（空気乾燥されたＯＦＥ
／ＦＣ／セラミック）を、乾燥形態で移植した。

宜■杉威 アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の活性レベルを。

移植後１４日および２８日後について第２図に示す。

ＯＦＦ含有組成物のすべてが、１４日後には高いレベル
の肝油性を示した。２８日後には。

骨形成工程の完成の途中で予期されるように、すべての
レベルが低下した。しかし、「実施例３」の材料は、顕
著に、より高いレベルを示すしている。

則１１り遣炙験 外径植物の組織学的誘導試験の結果を第３図Ａ（１４日
）および第３図Ｂ（２８日）に示す。ＯＦＥを含むすべ
ての試料は、１４日後に中程度〜良好な軟骨および骨の
形成を示した。２８日までに、良好な骨形成および骨髄
分化があった。どちらの時点でも、実施例３に従って調
製された本発明の組成物は、実施例２による空気乾燥を
行わずに調製された材料より、効果的に骨形成を促進す
るようであった。

（発明の要約） 骨修復用の無機質／コラーゲン／叶（骨形成因子）誘導
性移植物の改良された調製方法は、常圧条件下にて、７
５〜９５％の無機粒子、５〜２５％のコラーゲン、およ
び有効量のＯＦ　（例えば、０．５〜４％の部分的に精
製されたＯＦＥまたはその同等物）の懸濁液を乾燥する
ことを利用する。この方法において、乾燥に供される懸
濁液中のコラーゲン濃度は、３０〜１００■／　ｍｌで
ある。得られた移植物は以下の点で改善されている。す
なわち、これらの移植物は１組成が均一であり、生物学
的に活性かつ利用可能な形態でのＯＦを含有すると同時
に、高い圧縮係数をも有する。

４　　゛　　の　　　な云゛日 第１図はいくつかの典型的な本発明の方法を示す図であ
る。

第２図はアルカリホスファターゼを指標として用いた本
発明の組成物の骨形成活性を示す図である。

第３図Ａおよび第３図Ｂは組織学的評価を規準として用
いた。これら組成物の骨成長の結果を示す図である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、脊椎動物における骨修復を実施するための移植に適
   した低免疫原性組成物の調製方法であって、 該組成物は、異種宿主において低免疫原性であるのに充
   分なほど純粋であるタンパク骨誘導性因子（ＯＦ）の骨
   誘導的に有効な量と、該組成物の６０〜９８％を構成す
   る無機質および該組成物の２〜４０％を構成するコラー
   ゲンから実質的に成る成分を有するキャリアとを含有し
   、 該方法は、 （ａ）該組成物のコラーゲン、無機質、およびＯＦ成分
   を含む均一な水性懸濁液を、該懸濁液中のコラーゲン濃
   度が３０〜１００ｍｇ／ｍｌになるように調製すること
   ；および （ｂ）該懸濁液を常圧下にて調節された乾燥に供し、硬
   質の固体を得ること、 を包含する方法。 ２、前記固体が少なくとも２０Ｎ／ｃｍ＾２の圧縮係数
   を有するまで前記乾燥が続行される、特許請求の範囲第
   １項に記載の方法。 ３、さらに、（ｂ）の生成物の熱硬化を包含する、特許
   請求の範囲第１項に記載の方法。 ４、前記熱硬化が、５０〜１２０℃にて４〜１６８時間
   実施される、特許請求の範囲第３項に記載の方法。 ５、前記（ａ）の懸濁液が、ＯＦの希釈溶液を無機質粒
   子と混合し、得られた混合物を乾燥し、そしてその乾燥
   混合物を、３０〜１００ｍｇ／ｍｌのコラーゲンを含有
   する再構成アテロペプチド繊維状コラーゲン懸濁液と混
   合することにより調製される、特許請求の範囲第１項に
   記載の方法。 ６、前記（ａ）の懸濁液が、ＯＦの溶液を溶液状コラー
   ゲンに添加し、コラーゲンおよびＯＦを沈澱させ、コラ
   ーゲン濃度が３０〜１００ｍｇ／ｍｌになるように沈澱
   物を再懸濁し、次いで得られた懸濁液を無機質粒子と混
   合することにより調製される、特許請求の範囲第１項に
   記載の方法。 ７、特許請求の範囲第１項から第６項に記載の方法によ
   り調製された、骨修復組成物。 ８、脊椎動物における骨修復を実施するための移植に適
   した低免疫原性組成物であって、 該組成物は、６０〜９８％の無機粒子；２〜４０％のア
   テロペプチド低免疫原性コラーゲン；および有効量のＯ
   Ｆ調製物から実質的に成り、 移植物が２０Ｎ／ｃｍ＾２より大きな圧縮係数の多孔質
   硬質固体であり、かつその成分に関して均質であり、そ
   して該ＯＦが生物学的に活性かつ利用可能な形態にある
   、組成物。 ９、前記有効量のＯＦ調製物が、０．５〜４％の部分的
   に精製されたＯＦまたはその同等物である、特許請求の
   範囲第８項に記載の組成物。 １０、脊椎動物における骨修復を実施するための移植に
   適した低免疫原性組成物であって、 該組成物は、骨に由来するタンパク骨誘導性因子（ＯＦ
   ）の骨誘導的に有効な量と、少なくとも７５重量％の無
   機質キャリアとを含有し、 該ＯＦは異種宿主において低免疫原性であるのに充分な
   ほど純粋である、組成物。 １１、以下の組成物から成る群より選択される特許請求
   の範囲第１０項に記載の低免疫原性組成物：（ａ）８７
   ．５％の骨コラーゲン粉末および１０％の非繊維状コラ
   ーゲンを含有する組成物であって、そのＯＦ量が、部分
   的に精製されたＯＦとして移植物の約２．５重量％の割
   合で含ませることにより得られるＯＦ量に相当する組成
   物； （ｂ）８５〜９５％の無機質キャリアおよび５〜１５％
   のアテロペプチドコラーゲンを含有する組成物であって
   、そのＯＦ量が、部分的に精製されたＯＦを移植物の約
   ０．５〜４重量％の割合で含ませることにより得られる
   ＯＦ量に相当する組成物； （ｃ）８７．５％のＴＣＰ／ＨＡ混合物および１０％の
   非繊維状コラーゲンを含有する組成物であって、そのＯ
   Ｆ量が、部分的に精製されたＯＦとして移植物の約２．
   ５重量％の割合で含ませることにより得られるＯＦ量に
   相当する組成物；および （ｄ）９１．５％のＴＣＰ／ＨＡ混合物および６％の再
   構成非繊維状コラーゲンを含有する組成物であって、そ
   のＯＦ量が、部分的に精製されたＯＦとして移植物の約
   ２．５重量％の割合で含ませることにより得られるＯＦ
   量に相当する組成物。