JPS6216421A - 誘導性コラ−ゲン・ベ−ス骨修復調製物 - Google Patents

誘導性コラ−ゲン・ベ−ス骨修復調製物

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JPS6216421A
JPS6216421A JP60234381A JP23438185A JPS6216421A JP S6216421 A JPS6216421 A JP S6216421A JP 60234381 A JP60234381 A JP 60234381A JP 23438185 A JP23438185 A JP 23438185A JP S6216421 A JPS6216421 A JP S6216421A
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    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は骨修復材に関する。さらに詳しくは、本発明は
軟骨原性／骨形成原性蛋白質のための非繊維性コラーゲ
ン担体に関する。
発明の背景 単純な骨折の治療以上の損傷または欠損骨の修復は必要
な骨組織の供給に３つの方法を用いている。もつとも簡
単な方法では、欠損した骨の代替物として永久的な補綴
が取り付けられ、補綴が宿主の骨格構造と一体となるよ
うに準備される。ここような骨代替物は生体適合性金属
のような人工材料で作製することができ、あるいは、宿
主のどこかの骨構造から由来する同種移植片で構成する
ことができる。もう少し複雑な方法は、周囲の健康な組
織からの骨の内部生長を支持するマ）　ＩＪソックス与
えることであり、ついで、マトリックスは吸収されうる
。第３の方法は、マトリックスおよび軟骨中間体と共に
またはなしで骨の内部生長を生化学的に誘導する骨形成
原性因子の両方を供給することである。
後者の２方法は、しばしば、各々、［伝導性（ｃｏｎｄ
ｕｃｔｉｖｅ　）　Ｊおよび［誘導性（１ｎｄｕｃｔｉ
ｖｅ　）　Ｊ修復とよばれ、その発達の歴史は望ましく
ない副作用なしにそれらの機能を発揮するのに充分な低
免疫原性の生物学的に由来した物質への進歩が続いてい
ることを示している。コラーゲンは骨の主有機成分であ
るので、隣接細胞による無機青成分の以降の沈積のため
のマトリックスとして、あるいはマトリックス中にコラ
ーゲンを用いることが広がっている。しかし、コラーゲ
ン自体は免疫原性である［テロペプチド（ｔｅｌｏｐｅ
ｐｔｉｄｅ　）　Ｊ　単位を含有し、このようなマトリ
ックス形成に用いるコラーゲンに関する大きな改善に、
「アテロペプチド（ａｔｅｌｏｐｅｐｔｉｄｅ　）　Ｊ
　コラーゲンの使用がある。
テロペプチドの除去または部分除去およびその結果とし
ての免疫原性応答の抑制は、それが宿主にとっては異質
の種から由来したコラーゲンの伝導性骨修復の実行、す
なわち、「異種」コラーゲンの使用を改善するので重要
となりうる。ヒト受容者にとっては、死体あるいは関係
のあるヒト供与者よりも、ブタ、ウシあるいは他の哺乳
動物源を調製物に使用でき、したがって、非常に安価な
、かつ、豊富な供給源を提供できるので、非常に重要ト
なる。一方、アテロペプチド含有コラーゲンはいくつか
の例においても有用である。
マ）　ＩＪソックス宿主と許容できる程に適合する必要
があるばかりでなく、軟骨および骨形成を誘導するいず
れの因子の調製も適合が必要であるので、誘導性移植を
用いる場合は非適合性の問題が増加する。早期の仕事に
おいては、このような因子を提供するために脱ミネラル
化した骨（ＤＭＢ）を移植調製物の一部に使用している
。例えば、米国特許第４４４０７５０号および第４４３
０７６０号ならびに米国特許出願第４１１６５９号参照
。
骨から骨誘導に関与する、多分、蛋白質である因子を精
製するために、種々の試みがなされている。
ユリスト（Ｕｒｉｓｔ　）　（ｙ）米国特許第４２９４
７５３号および第４４５５２５６号は、尿素または塩化
グアニジンを用いて脱ミネラル化骨から抽出され、再沈
殿される骨形態形成蛋白（ＢＭＰ）を開示している。こ
の因子をさらに精製することが、ユリストにより、クリ
ニカル・オーンピディスク・リレイテイング・リサーチ
（Ｃｌ１ｎ、　０ｒｔｈｏｐ、　Ｒｅｌ　。
Ｒｅｄ、）１６２　：２１９（１９８２）、谷イエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２０　：６８０（１９８３）およ
びプロシーディンゲス・オフ・ナショナル・アカデミ−
・オフ・サイエンス・オフ・ニー・ニス・エイ（Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　
）　８１　：　３７１（１９８４）に報告されている。
ユリストによって報告されたＢＭＰは１７５００〜１８
０００ダルトンの分子量を有し、ＰＨ４，８でカルボキ
シメチルセルロース（ＣＭＣ）に非吸着性である。
推定的に異なる骨形成因子（ＯＦ）蛋白質がすィジンお
よびトー−ｙ　ス（５ｅｙｅｄｉｎ　ａｎｄ　Ｔｈｏｍ
ａｓ　）によりＤＭＢから単離され、精製された（米国
特許第４４３４（１１）４号および１９８４年７月１６
日に出願され、同じ譲受人に譲渡された米国特許出願第
６３（１１）３８号参照）。これらの調製物は１つの因
子について、分子量約２６０００と表示しており、これ
は、ユリストの因子と異なり、ｐＨ４，８でＣＭＣに吸
着される。この因子は異種宿主において免疫原にならな
い程に充分精製された。
骨誘導性因子源を生体適合性担体と組合せる試みがなさ
れている。前記米国特許第４４４０７５０号はＤＭＢま
たはＤＭＢ抽出物と組合せた再構成アテロペプチド・コ
ラーゲン調製物を開示している。シェフリース（Ｊｅ［
ｆｒｉｅｓ　）の米国特許第４３９４３７０号はコラー
ゲン調製物（しかしながら、テロペプチド）およびＤＭ
Ｂの粗抽出物の組合せを開示している。このシェフリー
スの開示は、「ＢＭＰ　Ｊはその活性において種特異性
ではないとしているが、抽出物の出発物質として同種Ｄ
ＭＢの使用のみを例示しており、これは免疫原性による
問題を認識してのものと考えられる。また、シェフリー
スの開示は組成物中、最少５重量％のＤＭＢ抽出物の使
用を必要とする。コラーゲン担体との組合せかｉｎ　ｖ
ｉｖｏでテストされた例は見当らない。レジらはプロシ
ーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンス（Ｒｅｄｄｉ　。
ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　）　６９　：　１６０１（１９８３）におい
て、同種脱ミネラル化骨粉を用い、ラット宿主において
軟骨および骨形成を生じさせたことを記載している。サ
ンパス、ティー・ケイらはプロシーディンゲス・オブ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ニ
ー・ニス・ｘイ（Ｓａｍｐａｔｈ、　Ｔ、に、　ｅｔ　
ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ　、　Ｓｃｉ　、　（ＵＳＡ）　）　　８０　
　：　　６５９１〜６５９５（１９８３）において、同
種ラット骨コラーゲン粉末（骨形成原性因子を欠くと考
えられる）および低分子量骨形成因子（ユリストのもの
と考えられる）の組合せがラットにおける骨修復に有効
であることを示唆している。すなわち、骨形成因子は異
種であるが、前記サンパスにおいて開示された移植物の
伝導部によって与えられる担体は同種である。
供給および価格の考慮から、完全に異種骨誘導性担体移
植物を提供することが有利である。このため、担体およ
びＯＦ蛋白質の両方が許容できるほどに低免疫原性の、
ＯＦ蛋白質の有効な沈着を有する担体を提供することが
必要である。
発明の開示 本発明は、骨生長用の、化学的に明らかな低免疫原性担
体マトリックスおよび骨の内部生長を生化学的に促進さ
せる有効量の精製前誘導因子の両方を含む誘導性骨修復
用移植材料を提供するものである。軟骨組織の中間形成
も生じうる。本発明の組成物は、再構成、上張りまたは
歯周用目的のいずれにも、大きな、また、小さな骨欠損
の修復に利用できる。
かくして、１つの態様において、本発明は哺乳類宿主に
おいて骨生長を誘導し、支持するのに有効な組成物から
なり、該組成物は、低免疫原性とするに充分な程に不純
物のない骨から由来した、骨誘導有効量の軟骨原性／骨
形成原性（ＯＦ）蛋白質と、少なくとも５％、好ましく
は、少なくとも１０％の非繊維性コラーゲンを含有する
担体調製物を組合せてなる。担体調製物の残り（補足）
部分は、繊維性コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、リ
ン酸トリカルシウムまたはこれらの混合物のような、い
ずれの生体適合性材料とすることがで養る。
ＯＦは通常、組成物全体に基いて、精製ＯＦとして約１
〜１０００　ＰＰｍの量存在させ、組成物調製に用いる
ＱＦ調製物は、最大、２％ｗｔ／ｗｔＯＦ調製物を加え
ればよい程度に充分精製されたものである。
他の態様において、本発明は、本発明の組成物を移植す
ることにより、哺乳類において骨修復を行なう方法にも
関する。
図面の説明 第１図は、濃縮、再可溶化したＤＭＢからの抽出物（Ｄ
セフ　７　りＩＪ　ル（５ｅｐｈａｃｒｙｌ　）　Ｓ−
２００分画の結果を示す。１００００〜３００００ダル
トンの分子量範囲のフラクションＦ２がＯＦ活性を含む
。
第２図は、第１図のＦ２フラクションのＣＭＣ分画の結
果を示す。１００〜２５０ｍＭＮａＣ１の間で溶出する
フラクションがＯＦ活性を含む。
第３図は第２図のＣＭＣカラムからの１００〜２５０　
ｍＭ　ＮａＣｌフラクションについて行なったＲＰ−Ｈ
ＰＬＣの吸光度および電気泳動の結果を示す。
第４図は、第３図に示すＲＰ−ＨＰＬＣで得られた活性
フラクションを用いるエライザ（ＥＬ４ＳＡ）の結果を
示す。
第５図は、第２図に示すＣＭＣからの１００〜２　ｓ　
□　ｍＭ　ＮａＣｚ溶出物の電気泳動で得られたゲル・
フラクションについてのエライザの結果を示す。
Ａ、定義 本明細書においては、「骨誘導性」および「骨形成原性
」なる語は互換的に用いており、骨幹細胞の生骨組織へ
の変換を意味している。誘導は骨形成、すなわち、骨の
有機および無機成分の分泌′によるミネラル化骨の直接
形成をもたらすことができ、あるいは、骨誘導は軟骨の
中間形成をも包含しえ、すなわち、骨誘導因子は軟骨原
性でもありうる。事実、軟骨形成の特徴であるプロテオ
グリカンを本発明の組成物の骨誘導活性の指標として用
いる。
「から由来」するなる語を骨形成原性因子について用い
る場合、構造的類縁関係または相同を意味する。物理的
な由来に限定するものではない。
すなわち、骨「から由来」した骨形成原性因子とは、自
然に骨組織内で生成されるものと相同な、かつ、同様に
機能するアミノ酸鎖を有する因子または因子群を示し、
必ずしも、骨自体から直接単離された物質を意味するも
のではない。例えば、これは、合成的に、あるいは、組
換型ＤＮＡ技法を用いて作製してもよい。
「低免疫原性」なる語は許容できる生体適合性を意味す
る。多くの物質が、ある種の動物および適用では免疫原
性でありうるが、他の動物においては検知できるレベル
の特異免疫グロブリンを生じることができないことが知
られている。また、特異免疫グロブリンおよび炎症が完
全にないことが必須でない場合もあることも知られてい
る。したがって、本発明の組成物成分または組成物の記
載に用いる場合、「低免疫原性」なる語は、いずれの免
疫応答も許容できるレベル内にあることを意味する。
「アテロペプチド」なる語は、そのテロペプチドまたは
免疫原性部分を除去または部分的除去するために適宜処
理されたコラーゲンを意味する。
簡単に説明すると、コラーゲンは、アミノ酸鎖のくり返
しの三重螺旋状配置の束から構成される繊維構造からな
る。これらの三重螺旋配列は非螺旋構造、すなわち、「
テロペプチド」で終っており、「テロペプチド」は種々
のコラーゲン鏡開の架橋および、一部、コラーゲン調製
物の免疫原性に関与している。この構造の除去は、トリ
プシンのような適当な蛋白分解酵素による処理で行なう
ことができる。得られたアテロペプチドコラーゲンは、
主な種特異性免疫原が除去されているので、異種用途に
より適している。
「非繊維性コラーゲン」は、その天然の繊維構造を維持
しないように処理されたものである。したがって、この
語は、可溶化され、その天然の繊維形を再構成していな
いコラーゲンを意味する。
繊維構造は溶解により崩壊でき、繊維の再構成（繊維性
）または非特異的凝集（非繊維性）によって固体形に戻
ることができる。非繊維性コラーゲンは、例えば、まず
１．可溶化し、あるいは、せずに繊維を加熱するような
変性によって調製できる。
本発明で有用な非繊維性コラーゲンは、溶液、ゲル、ま
たは、凍結乾燥のような、溶解後、非特異的に凝集させ
た固体として用いられる。再構成、すなわち、繊維性形
に戻っていてはならない。
本発明の組成物におけるＯＦの割合（％）は、精製骨誘
導性蛋白質に基くもので、粗調製物ではない。以下の記
載から明らかなごとく、ＯＦ蛋白質を均一に精製する技
術が利用できるようになり、蛋白■と活性単位間の相関
性が確立できた。かくして、比較的不純な調製物も、そ
の活性の検定により、存在するＯＦの岬として評価でき
、所望の重量の精製蛋白質を与える調製物の量が計算で
きる。
Ｂ、概説 本発明の組成物は、異種的に使用した場合に低免疫原で
あるように充分精製された、有効量の骨誘導性因子（Ｏ
Ｆ）調製物と、担体調製物の混合物であり、担体調製物
はその重量の少なくとも５％、好ましくは、少なくとも
１０％の非繊維性コラーゲン調製物を含有する。この組
成物に必要な実際のＯＦ調製物の割合（％）は、もちろ
ん、その純度に依存する。
骨誘導性活性を示す蛋白質は、１９８４年７月６日に出
願され、同一譲受人に譲渡された米国特許出願第６３（
１１）３８号に開示されているごとく、均一に精製した
。かくして、有効レベルは、粗抽出物の量より、この精
製物質の含量によって理論的に計算できる。事実、本明
細書に記載のごとく組成物は精製因子に基いて計算され
ている。したがって、組成物は、はぼ全体がＯＦの精製
調製物用のコラーゲンマトリックスであり、すなわち、
それらは、約１〜１ｏ　ｏ　ｏ　ｐｐｍのＯＦ蛋白質を
含有する。しかし、ＯＦの純度の低い調製物を用いる場
合、混合物の２％までが、この調製物視であってもよい
。
異種宿主において低免疫原性であるに充分な純度の基準
に合うＯＦ調製物はいくつかの方法で調製できる。この
因子源としては、骨、象牙質、骨肉腫または軟骨肉腫お
よびＯＦを含有するを椎動物起源の他の組織が使用でき
る。ヒト、サル、ウシおよびラットからのＯＦ調製物は
、それらの異種移植における軟骨内骨を生じる能力が非
種特異性であることがサンパス、ティー・ケイらのプロ
シーディンゲス・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ
・サイエンス・オフ・ニー・ニス・エイ（ＳａｍｐａＬ
ｈ　、　Ｔ、に、ｅｔ　ａｌ　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　
、　Ａｃａｄ、５ｃｉ（ＵＳＡ））８０　：６５９１（
１９８３）によって示されている。すなわち、本発明の
混合物において使用できるＯＦはこれらの源から由来す
ることができ、事実、偶然または故意の手段により調製
され、修飾され、化学的合成法、組換型ＤＮＡ法または
他の方法により調製された、脊椎動物源から由来するそ
れらの蛋白質と実質的に類似する骨誘導活性を有するい
ずれの蛋白質でもよい。さらに、例えば、ユリストの骨
形態発生蛋白質も、充分に精製すれば用いることができ
る。ＯＦは、脊椎動物源から由来できる蛋白質と実質的
に類似なこと、骨誘導機能および許容できる低免疫原性
の要件のみを満足すればよい。
本発明の組成物において有用なＯＦの１つの有用な調製
法が米国特許出願第６３（１１）３８号に開示されてい
る。この方法は均一な蛋白質を生じる。
要約すると、この方法は、ブタまたはウシの長骨原料（
入手の容易性から）を機械的および研摩技術によって処
理してきれいにし、砕き、エーテルまたは酢酸エチルの
ような有機溶媒で抽出して脱脂し、通常、標準的な方法
を用いる強酸での抽出により脱ミネラル化し、ついで、
得られたＤＭＢを出発物質として用いることからなる。
因子を単離するため、ついで、ＤＭＢを、グアニジン塩
酸塩（少なくとも約４Ｍ）、尿素（８Ｍ）プラス塩のよ
うなカオトロピック剤または種々の他のカオトロピック
剤で抽出する。抽出は、好ましくは、抽出された蛋白質
の消化または変性可能性を減じるため、プロテアーゼ阻
害剤の存在下、低温で約４時間〜１日行なう。抽出後、
抽出剤は、水に対する透析、制御した電気泳動、モレキ
ュラー・シーブのような適当な手段あるいはその他の適
当な手段によって除去できる。抽出剤を除去あるいは除
去しない抽出物を、ついで、ゲル濾過に付し、標準的技
術を用いて約３００００ダルトン以下の分子量のフラク
ションを得る。この低分子量フラクションは競争イオン
を含まず、ついで、ｐｔ−を約４．５〜５．２、好まし
くは、約４６８で、尿素のような非イオン性カオトロピ
ック剤の存在下、ＣＭＣを用いるイオン交換クロマトグ
ラフィーに付す。他のカチオン交換体を用いることもで
きる。
カチオン交換クロマトグラフィーから得られた活性溶出
フラクションは直接、本発明の組成物において使用でき
る。また、これらは、所望により、逆相ＨＰＬＣまたは
非変性ゲル電気泳動によってさらに精製できる。これら
の２つの方法のいずれかを溶出物に適用する場合、均一
な蛋白質調製物か得られる。
別法として、前記のサイズ分別から得られた低分子量蛋
白質は、例えば、６Ｍ尿素および２０ｍＭリン酸ナトリ
ウムの存在下、約ｐＨ７，２で、ＤＥＡＥセルロースの
ようなアニオン交換樹脂で処理できる。この処理におい
て、透析後、尿素を除去した非蛋白質を用いることがで
きる。アニオン交換樹脂処理溶液中の蛋白質は凍結乾燥
により回収でき、０．０　Ｉ　Ｎ　ＨＣｌに対して透析
して安定化できる。この方法によるＯＦ含有溶液または
固体も、所望により、さらに精製できる。これは任意工
程である。このＯＦ蛋白質を満足するレベルに精製する
方法の１例は以下の６項に詳しく示す。いずれの場合も
、ＯＦ含有フラクションは、組成物において、コラーゲ
ンに対して２％ｗｔ／ｗｔを超える因子調製物を用いな
いように、充分精製されている。
組成物の担体部分は、少なくとも５％、好ましくは、少
なくとも１０％の非繊維性コラーゲンと、所望により、
繊維性コラーゲンまたはセラミックあるいは両方を含有
する。
用いる非繊維性コラーゲンは、溶液状コラーゲン、非特
異的に凝集している溶液状コラーゲンの凍結乾燥物、ゼ
ラチン担体またはこれらの混合物として供給することが
できる。
好ましい非繊維性コラーゲン源は、カリフォルニア州、
パロ・アルド、コラーゲン・コーポレーション（Ｃｏｌ
Ｃｏ１１ａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｐａ１ｏ　Ａ
ｌｔｏ。
Ｃａｌ　ｉ　ｆｏｒｎｉａ　）からチゲナ（Ｚｙｇｅｎ
ａ　）の商標の下に得られる溶液状コラーゲン（ＣＩＳ
）である。
しかし、いずれの非再構成コラーゲン調製物も使用でき
る。この非繊維性部分は、組成物中、少なくとも、約５
％の量存在させなければならない。
しかしながら、組成物の全°コラーゲン成分を構成して
もよい。本発明の組成物の特質は許容できる低免疫原性
である。したがって、この非繊維性コラーゲン成分の調
製物の全てにおいてコラーゲンのアテロペプチド型を用
いることが好ましい。しかし、移植組成物の形態、宿主
の感受性またはその他の理由により、組成物の低免疫原
性が損なわれなければ、テロペプチドが存在してもよい
。換言すれば、アテロペプチド非繊維性コラーゲンの使
用か好ましいが、必ずしも必要とするものではない。
組成物の残りの材料は、もしあれば、繊維性コラーゲン
調製物、セラミックまたは両方のようないずれの生体適
合性材料であってもよい。繊維性コラーゲンは種々の源
から由来でき、多数の繊維性コラーゲン調製物が入手可
能である。これらは、種々の哺乳類の骨または皮膚から
由来するコラーゲンを液体媒体中で可溶化または分散し
、ついで、繊維状の形で回収されたものである。繊維状
に再構成されているコラーゲン調製物には、例えば、コ
ラーゲン・コーポレーションから入手できるチデルマ（
Ｚｙｄｅｒｍａ　）コラーゲン・インブラント（ＺＣＩ
）が包含される。他の繊維状調製物には、未だ天然の繊
維状形を有する分散繊維であるアビテネア（ＡＶＩ　ｔ
ｅｎｅａ　）および分散調製物であり、ついで凍結乾燥
したコラーゲンフレーシア（Ｃｏｌｌａｇｅｎｆｌｅｅ
ｃｅａ　）が包含される。好ましイコラーゲンは、骨コ
ラーゲン粉末（ＢＣＰ）のような骨から由来したもので
ある。
ＢＣＰの調製は米国特許出願第６２８３２８号（１９８
４年７月６日出願、同一譲受人へ譲渡）に詳細に記載さ
れている。使用できる他のコラーゲン調製物、例えば、
ＺＣＩまたは凍結乾燥コラーゲン・ゲルのような非骨源
から再構成された調製物も、非繊維性成分と混合する許
容される充填材として有効である。
非コラーゲン性成分も単独で、あるいはコラーゲン性補
足材と共に使用してもよい。例えば、ヒドロキシアパタ
イト（ＨＡ）または他のリン酸カルシウム調製物のよう
なセラミック材料を用いることもできる。これらの材料
は硬組織移植物の構成に有用であることが開示されてお
り、したがつて、本発明の組成物の一部を構成するのに
適した生体適合性を有している。例えば、米国特許第４
３１４３８０号はＨＡ調製物を開示しており、ハヤシ、
ケイら、アーク・オルツブ・ドローマド・サージ（Ｈａ
ｙａｓｈｉ　、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｒｃｈ、０
ｒｔｈｏｐ。
Ｔｒａｕｍａｔ　Ｓｕｒｇ）９９　：２６５（１９８２
）はＨＡの別の形を開示している。
本発明の組成物は、アルミニウムまたは合金製のような
金属補綴と一緒に使用できる。例えば、米国特許第３８
２０１６７号はチタンまたはその合金製の補綴を記載し
ている。本発明の組成物は補綴と周囲の骨との間のいず
れの空隙をもふさぎ、したがって、補綴をよりしつかり
とその場に固定する働きをする。
本発明の組成物における非繊維性コラーゲンの必要な％
を補足するこれらの追加成分は単独でも、相互に混合し
て用いてもよく、また、全く用いないでもよい。これら
は、最終組成物の担体部分の９５％までを構成する。担
体中におけるこれらの追加成分の性質および調製法によ
り、組成物の性質を特定の型の骨再構成または修復操作
に適するように変えることができる。多くの用途用の好
ましい組成物においては、担体補足材は繊維性コラーゲ
ン、ヒドロキシアパタイトまたはこれらの混合物を含有
する。
本発明の組成物を構成する混合物の調製に適した方法に
おいては、非繊維性コラーゲンをＣＩＳのような溶液と
して、あるいはゼラチンとして供給し、所望により、例
えば、ＢＣＰまたは他の生体適合性材料のような追加成
分と混合する。しかし、ＨＡのようなある種のセラミッ
ク材料はつぎの工程で溶解しうるので、凍結乾燥後に加
えなければならない（後記参照）。得られた混合物を精
製ＯＦ含有調製物または精製蛋白質と混合し、希鉱酸、
例えば、０．０ＩＮ塩酸中、約４℃の低温にて１〜２時
間攪拌する。ついで、混合物をｐＨ約５以下で水に対し
て透析し、凍結乾燥して固体物質を得る。この固体物質
も追加の適合物質で補足することができる。
得られた固体物質の物性は前記方法を適宜修飾し、補足
担体材料の性質および量を調整することにより変えるこ
とができる。すなわち、組成物は粉末、シートまたは、
ブロックもしくはロッドのような硬い固体形とすること
ができる。固体物質は、上張り移植用片として、骨再構
成に、骨折の治療に、他の整形外科的適用における骨の
修復に用いるのに適した移植物に成形できる。固体組成
物をそのような移植物の成形に利用する方法およびそれ
らを移植する外科的方法は当該分野でよく知られており
、本発明はこれらの標準的な手段を用いるのに有用であ
る。
所望の場所に位置させる場合、移植組成物は１、骨誘導
因子の存在により、新たな軟骨および骨の生成を刺激す
ると共に、これらの物質の内部生長用のマトリックスを
提供する。
以下の実施例に記載のごとく、本発明の組成物は異種宿
主の皮下に移植すると、骨組織形成を刺激する能力があ
る。その能力は組成物を移植し、移植物の軟骨プロテロ
グリカン形成、カルシウムの存在およびアルカリ性ホス
ファターゼの存在について組織学的に評価することによ
り証明できる。
さらに、宿主生物は移植した物質に対して抗体反応を生
じないことも示す。
実施例 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。
組成物の成分の他の調製法および組成物の他の調製法も
、得られる組成物が本発明範囲のものであれば、それら
も本発明に包含するものである。
Ｃ９骨誘導因子の調製 Ｃ０１，予備抽出および精製工程 Ｃ１１，ａ、Ｃ，１，ｃは例示した全ての調製物に共通
である。Ｃ１ｌ、ｃに示すフラクションＦ２はついで数
種の別法に使用できる。まず、Ｃ，２項に示すごとく、
イオン交換クロマトグラフィーに付し、本発明の組成物
におけるＯＦ調製物として使用するＯＦ活性を有するフ
ラクションを集めることができる。つぎに、これらのフ
ラクションは、Ｃ１３項に示すような逆相ＨＰＬＣまた
はＣ９４項に示すようなゲル電気泳動に付してさらに精
製できる。これらのさらに精製した材料のいずれをも用
いることができ、使用すべき調製物の量はより少量でよ
い。さらに、Ｃ，１，ｃ項におけるフラクションＦ２で
示される物質はＣ３５項に示すようなりＥＡＥセルロー
スによる処理に付シてモヨイ。ＤＥＡＥセルロース処理
後、非吸着溶液も本発明の組成物に使用でき、また、カ
ルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）溶出物と同様な方
法でさらに精製できる。
すなわち、一般に、この項で示す精製技術に従って、カ
オトロピック剤による抽出、サイズ分別および以後のＤ
ＥＡＥまたはＣＭＣのいずれかによる処理の組合せによ
って適当な調製物を与えるための、充分な精製が行なわ
れる。その上の精製工程は任意である。
Ｃ１１，ａ　　脱ミネラル化骨（ＤＭＢ）の調製新鮮な
ウシ中足骨を屠殺場から得、ドライアイスを用いて輸送
する。骨から骨髄および非骨組織を除去し、４℃にてミ
ル中で粉砕する。粉砕骨を骨１にｇ当り、再蒸留水９．
４１で約１５分間づつ２回洗浄し、０．０１Ｎ塩酸中、
４℃にて一夜洗浄する。洗浄骨を３容のエタノールで３
回、ついで、３容のジエチルエーテルで３回脱脂する。
各洗浄は２０分間とし、いずれも室温で行なう。得られ
た脱脂骨粉を、４℃にて０．５Ｎ塩酸中（２５１／−脱
脂骨）で脱ミネラル化する。酸をデカンテーションして
除き、得られたＤＭＢをｐＨが４以上になるまで洗浄し
、ＤＭＢを吸引フィルター上で乾燥する。
ｃ、　１、ｂ　非コラーゲン性蛋白質の抽出Ｃ，１，ａ
項で調製したＤＭＢを１にｇ当り、３．３１の４Ｍグア
ニジン塩酸塩、１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤ
ＴＡ）、ｐＨ６，８，１ｍＭＰＭＳＦ、ＩＱｍＭ　ＮＥ
Ｍで１６時間抽出し、懸濁液を吸引押退し、非可溶性物
質を再び４時間抽出する。
可溶性フラクションを合し、アミコン（Ａｍ１ｃｏｎ　
）限外押退（ＩＯＫ）ユニットを用い、少なくとも５倍
濃縮し、濃縮物を４日間、３５容の冷脱イオン水に対し
、６回変えながら、透析し、凍結乾燥する。この項の全
ての操作は凍結乾燥を除いて４℃で行ない、凍結乾燥は
標準的な凍結乾燥条件下テ行なう。いくつかの場合には
、限外押退からの濃縮抽出物をＣ１１，０項のゲル沖過
工程に直接用いる。
Ｃ１ｌ、　ｃ　　ゲル沖過 ｃ、１．ｂからの限外ｒ過抽出物または凍結乾燥物を４
Ｍグアニジン塩酸塩に再溶解し、４Ｍグアニジン塩酸塩
、０．０２％ナトリウムアジド、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ６，８で平衡させたセファクリルＳ−２００カラム上
で分画する。フラクションを２８００ｍの吸光度により
、また、エライザによる軟骨原性活性〔サイジンら、ジ
ャーナル・オフ・セル・バイオロジー（５ｅｙｅｄｉｎ
　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．）９７　：
１９５０（１９８３）］を検定し、第１図に示すごとく
、フラクションを合する。最大の活性を有する低分子量
（ＬＭＷ、１００００〜３ｏｏｏｏダルトン）蛋白フラ
クションで構成される第１図のフラクションＦ２を脱イ
オン水１８０容に対し、６回変えながら透析し、凍結乾
燥する。
凍結乾燥を除き、全ての操作は室温で行なう。
Ｃ０２イオン交換クロマトグラフィー Ｃ，ｌ、　ｃ　項からのフラクションＦ２を６Ｍ尿素、
１０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＮＥＭ、５０ｍＭ酢酸ナ
トリウムに溶解し、１００００　ｒｐｍで５分間遠心分
離する。上澄液を、同じ緩衝液で平衡させた０Ｍ５２（
商業的に入手できるＣＭＣ）カラム上で分画する。カラ
ムを、同じ緩衝液中、１０ｍＭ〜４００　ｍＭ　ＮａＣ
ｌグラジェントを用いて溶出し、集めたフラクションを
、第２図に示すごとく、２８０　ｎｍにおける吸光度に
基づいて合する。
１００〜２５０ｍＭ　ＮａＣｌの間の溶串物を４日間、
１１０容の脱イオン水に対し、６回変えて透析し、凍結
乾燥する。前記の全ての操作は、透析（４℃）を除いて
室温で行なつ。
Ｃ０３，ＲＰ−ＨＰＬＣ Ｃ，２項の凍結乾燥フラクションを０．１％トリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解し、この溶液の一部をバイダッ
ク（Ｖｙｄａｃ）Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（内径４
．６調Ｘ　２５　ａｍ　）にのせ、１ｍｅ／分にて５分
間、０．１％ＴＦＡで°洗浄する。溶出溶媒は０．１％
ＴＦＡ中、２％／分の割合の０〜６０％アセトニトリル
・グラジェントである。活性物質を含有する２つのピー
クが得られる。ピークＡは約２９．５分、ピークＢは約
３１．３分のところにある。
第３図はピークＡおよびＢの吸光度および電気泳動的特
性（還元および非還元）を示す。
第４図は、ピークＡおよびＢの精製蛋白質を１．５．２
０および７５　ｎｆ／ｌｎｅの濃度で用いて行なったエ
ライザの結果を示す。これらの結果は明らかな用量応答
を示している。
Ｃ０４；　　ゲルによる精製 電気泳動 ｃ、２項の凍結乾燥フラクションを、ペイニム。
ニスおよびチャルクレイ、アール、アーカイブズ・オフ
・バイオケミストリー・アンド・バイオフイジクス（Ｐ
ａｙｎｉｍ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｃｈａｌｋｌｅｙ、　Ｒ
６，Ａｒｃｈ。
Ｂｉｏｃｈ、Ｂｉｏｐｈｙｓ　、　）　１３０　：　３
３７〜３４６　（１９６９）の一般的方法を用い、酢酸
−尿素ゲル上での電気泳動により分画する。ゲルスライ
スについてのエライザの結果を第５表に示す。結果は、
ＲＰ−ＨＰＬＣのピークＡおよびＢに匹敵する（ゲルス
ライス７および６に相当）。
Ｃ１５，アニオン交換樹脂による精製処理Ｃ０ｌ、ｃか
らの低分子量蛋白質のフラクションＦ２を６Ｍ尿素、２
０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，２，２０ｍＭＮａＣ
１およびプロテアーゼ阻害剤を含有する緩衝液に溶解す
る。ついで、溶液を、同じ緩衝液で平衡させたＤＥＡＥ
セルロースカラムにかける。ＯＦを含有する流出フラク
ションを水に対して透析して尿素を除去し、回収したＯ
Ｆを凍結乾燥する。別法として、流出分を０．０１Ｎ塩
酸に対して透析し、１〜１０岬／−の蛋白濃度で、Ｏ，
ＯＩＮ塩酸中で保持する。この溶液は数カ月の間安定で
ある。
Ｄ、非繊維性コラーゲンの調製 非繊維性コラーゲンは、商業的に入手できる溶液状コラ
ーゲ７（ＣＩＳ）、チゲナ（Ｚｙｇｅｎａ　）を用いる
ことにより、商業的な形態で供給できる。
これは、ｐＨ約２の可溶化コラーゲンのアテロペプチド
形である。
Ｅ、誘導性組成物の調製 Ｅ、１．非繊維性コラーゲンのみ 精製ＯＦと混合した非繊維性コラーゲンのみを含有する
組成物を調製するため、０．０１Ｎ塩酸中、１〜３ｑ／
艷のＣＩＳを、同様に０．０ＩＮ塩酸に溶解した部分精
製または高度精製ＯＦ（前記０項に記載）と混合し、最
終組成物中、約１０　ｐｐｍの量となるようにし、４℃
で１〜２時間攪拌する。
混合物を水に対して透析し、凍結乾燥する。
Ｅ、２．非繊維性コラーゲン＋ＢＣＰ 小さな割合（％）の非繊維性コラーゲンしか含有しない
組成物を調製するため、１〜３岬／−の濃度のＣＩＳを
骨コラーゲン粉末（前記米国特許出願第６２８３２８号
の記載に従って調製）と混合し、ＣＩＳから由来するコ
ラーゲンの濃度を総コラーゲンの５重量％とする。この
混合物に、前記Ｃ，５で示した部分精製ＯＦを、精製均
質物質に基いて５０　ｐｐｍとなるような量で加える。
この混合物を４℃で１〜２時間攪拌し、水に対して透析
し、凍結乾燥する。
Ｆ、誘導性移植物の検定 Ｆ、１６本発明の組成物の移植 Ｅ、２．で得られた凍結乾燥物質を２重量部の滅菌水で
再水和する。再水和した物質を湿潤重量約８０〜１００
岬のペレットにする。このペレットをゼラチンカプセル
に入れ、ペレットを雄ラットの腹胸域の皮下に移植する
。各ラットには両側部に同じ物質の移植物を移植し、テ
ストのため移植物は１４および２８日目に摘出する。摘
出した移植物を、組織学的に、アルカリ性ホスファター
ゼ活性、金属イオンおよび軟骨プロテオグリカンについ
ての検定によりテストした。
移植したラットの血清についても、移植物に対する循環
抗体についても試験する。
Ｆ、２．移植物の非免疫原性 ２８日後に移植動物から血清を採取し、エライヤ法（固
相酵素免疫測定法）を用い、移植物に対する抗体の存在
を検定した。マイクロタイターのウェルを、２０ｍＭ炭
酸塩緩衝液（１００１）、ｐＨ９，６中、組成物の各成
分２〜５ｙで４°Ｃにて一夜コートする。ウェルを０．
０５％ツイーン２０界面活性剤含有ＰＢ８で３回洗浄し
、未結合抗原を除去する。ついで、ラットの血清を２時
間添加し、ウェルをＰＢＳ−ツイーン２０界面活性剤で
３回洗浄する。ワサビ・パーオキシダーゼと結合したヤ
ギ抗ラットＩｇＧ（１：２ｏｏｏ希釈）を加え、ウェル
を室温で１．５〜２時間インキュベートする。
未結合ラベル抗体をＰＢＳ−ツイーン２０界面活性剤で
除去し、パーオキシダーゼ基質を加える。
プレートを室温で３０分間インキュベートし、プレート
をスキャンして光学的密度を調べる。
未希釈血清を用いても、血清をテストしたラットのいず
れにおいても抗体を検出できなかった。
対照はＤＭＢからの粗抽出物（すなわち、Ｃ０１，ｂに
従って調製した未分画物質）を注射したラットからの、
用いたエライサ法において陽性の血清からなり、高抗体
力価を与える。
Ｆ、３．移植物の特性−組織学 ７．１４および２８日後に摘出した移植物を、１０％中
性ホルマリン中で２６時間固定し、パラフィン封埋処理
して組織学的に評価する。封埋された組織から４〜６ミ
クロンの薄片を取り、ついで、ヘマトキシリン−エオシ
ンまたはセフラニンーＯで染色する。セフラニンー〇は
軟骨プロテオグリカンに対して選択性である。この方法
により、全ての移植物は軟骨プロテオグリカンの存在を
示した。
Ｆ、４．抽出青成分の検定 Ｅ、２項において調製したＯＦ含有マトリックスを６尾
のラットに移植し、また、陰性対照として、ＯＦを含有
しない同様なマトリックスを６尾のラットに移植した。
移植物を１４日および２８日後に摘出した。１４日の移
植物を、以下のごとく、プロテオグリカンおよびアルカ
リ性ホスファターゼの分析前に抽出し、２８日の移植物
をカルシウムイオンの測定に用いた。
Ｆ、４．ａ　　プロテオグリカンの形成軟骨プロテオグ
リカンをエライサ法により検定する。移植物を摘出後、
直ちに秤量し、抽出まで一７０℃で凍結する。抽出のた
め、移植物をスライスに切断し、チクマー・ティッシュ
マイザー（Ｔｅｋｍａｒ　Ｔｉｓｓｕｅｍｉｚｅｒ　）
中、最大セットで３０秒間、２回、冷抽出緩衝液中で均
質化する。抽出緩衝液は２０ｍＭＥＤＴＡ、ｌ　ｍＭ　
ＰＭＳ　Ｆ　オよび１０ｍＭ　ＮＥＭを含有するＰＨ５
，８（７）、６Ｍグアニジン塩酸塩、７５ｍＭ酢酸ナト
リウム　または４Ｍグアニジン塩酸塩、５ＱｍＭ酢酸で
ある。緩衝液は抽出した移植物の重量に等しい容量で用
い、試料を４℃で一夜（２０時間）インキュベートする
。ツイテ、試料を４°Ｃにて１２０００ｒＰｍで１時間
遠心分離し、上澄液を４℃で一夜、５０容の５０ｍＭ　
トリス、２００　ｍＭ　ＮａＣ／　、　ｐＨ７，４に対
して透析する。透析物を、レナードら、アーカイブズ・
オフ・バイオケミストリー・アンド・バイオロジオロジ
−（Ｒｅｎｎａｒｄ、　ｅｔ　ａｌ　、、　Ａｒｃｈ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ　）　２０７　：　
３９９（１９８０）およびサイジン・ニスら、ジャーナ
ル・オフ°セル・バイオロジー（５ｅｙｅｄｉｎ、　Ｓ
、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌＢｉｏｌ、）９７　
：１９５０　（１９８３）の記載に従い、ポリスチレン
・マイクロプレート〔フロー・ラボラドリース、マクリ
ーン、バージニア（ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
、　ＭｃＣｌｅａｎ、　Ｖｉｒｇｉｎｉａ　）　’：］
を用いて行なうエライザに付す。前記サイジン・ニスら
による記載に従って、スウオーム（Ｓｗａｒｍ）ラット
軟骨肉腫組織から抗血清およびプロテオグリカン標準を
調製する。ヤギ抗ウサギＩｇＧに結合したワサビ・パー
オキシダーゼを二次抗体として用い、試料をＰＢ５□、
０５％、ツイーン２０１．／ｆｎ１１３ＳＡの別々の溶
液中で検定し、シューアースら、クリ二カ・シミ力（５
ｈｕｕｒｅｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｌ１ｎ。
Ｃｈｉｍ、）８１　：１（１９７７）ｉｃ記載サすル阻
害エライサを用いて定量する。
ＯＦを含有する移植物は４９０±３０ｑ／ｇ湿潤組織の
プロテオグリカン含量を、ＯＦを含有しない移植物は３
５±５〜／ｙ湿潤組織のみを示した。
Ｆ、４．ｂ　　再抽出性カルシウム 骨の形成もカルシウムの測定により評価する。
移植物を小片に切断し、１　：　１０　（ｍ／ｖ）およ
び１：２０（ｍ／ｖ）の０．５Ｎ塩酸に懸濁し、イオン
を溶解する。試料を室温でさらに５日間インキュベート
し、１２００Ｏｒｐｍで４０分間遠心分離する。上澄液
のカルシウム濃度を原子吸光〔トレイス・アナリシス・
ラボラトリ−、ヘイワード、カリフォル＝７　（Ｔｒａ
ｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。
Ｈａｙｗａｒｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　）により測
定し、３０±５〜／７湿潤組織であることが判明した。
Ｆ、４．ｃ　　アルカリ性ホスファターゼの分析アルカ
リ性ホスファターゼ（ＡＰ　）の測定のため、移植物を
小片に切断し、３−の氷冷１，５ＭＮａＣ４，３ｒｎ　
Ｍ　Ｎ　ａ　ＨＣＯ３、ｐＨ７，５中で均質化する。均
質化試料を１２０００ｒＰｍで４℃にて５０分間遠心分
離し、上澄液の一部を冷蒸留水中で１：ｌＯに希釈する
。フギンスら、ジャーナル・オフ・エクスペリメンタル
・メジシン（Ｈｕｇｇｉｎｓ　。
ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　ＥｘｐｏＭｅｄ、）　１１４　
：　７６１（１９６１）の方法を用い、ポリスチレン・
プレートを用いてアルカリ性ホスファターゼを評定する
。初めからＯＦを含有する移植物は湿潤組織１２当り１
７±５ＡＰユニツトを示し、ＯＦを含有しない移植物は
ＡＰ活性を示さなかった。
【図面の簡単な説明】
第１図はＤＭＢ抽出物のセファクリルＳ−２００分画に
おけるクロマトグラム、第２図はＣＭＣ分画によるＬＭ
Ｗ蛋白質フラクションのクロマトグラム、第３図は第２
図のＣＭＣカラムからの１００〜２６０　ｍＭ　ＮａＣ
ｚフラクションについて行なったＲＰ−ＨＰＬＣの吸光
度および電気泳動の結果を示すグラフ、第４図は第３図
のＲＰ　　ＨＰＬＣ。 で得られた活性成分の工゛ライサの結果を示すグラフ、
第５図は第２図に示すＣＭＣからの１００〜２５０　ｍ
Ｍ　ＮａＣｌ溶出物の電気泳動で得られたゲル・フラク
ションのエライサ結果を示すグラフである。 特許出願人　コラーゲン・コーポレイション代理　人　
弁理士　青　山　葆ほか２名吸光度　２８０　ｎｍ 吸光度２８０　ｎｍ ｍＮａＣ１

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）異種宿主において低免疫原性であるに充分な純度
    の、骨から由来する蛋白質骨誘導性因子（ＯＦ）の骨誘
    導性有効量と、異種宿主において低免疫原性の、少なく
    とも５重量％の非繊維性コラーゲンを含有する担体を混
    合してなる脊椎動物における骨修復に有効な移植用低免
    疫原性組成物。
  2. （２）ＯＦが移植物の約１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍを構
    成する前記第（１）項の組成物。
  3. （３）担体が少なくとも１０重量％の非繊維性コラーゲ
    ンを含有する前記第（１）項の組成物。
  4. （４）非繊維性コラーゲンがアテロペプチド・コラーゲ
    ンである前記第（１）項の組成物。
  5. （５）非繊維性コラーゲンが溶液状コラーゲンとして与
    えられる前記第（１）項の組成物。
  6. （６）担体が９５％を超えない量の骨コラーゲン粉末を
    含有する前記第（１）項の組成物。
  7. （７）担体が９５％を超えない量のヒドロキシアパタイ
    トを含有する前記第（１）項の組成物。
  8. （８）担体が合計で９５％を超えない量の骨コラーゲン
    粉末およびヒドロキシアパタイトを含有する前記第（１
    ）項の組成物。
  9. （９）ＯＦが、骨のカオトロピツク抽出物のモレキユラ
    ー・シーブスによる処理での分子量３００００以下のフ
    ラクシヨンの単離を包含する方法により調製される前記
    第（１）項の組成物。
  10. （１０）ＯＦが、ＤＥＡＥセルロースにより処理し、非
    結合フラクシヨンを利用することにより、さらに精製さ
    れる前記第（９）項の組成物。
  11. （１１）ＯＦが、該フラクシヨンをカチオン交換樹脂に
    吸着させ、フラクシヨンを回収してさらに精製される前
    記第（９）項の組成物。
  12. （１２）ＯＦがＨＰＬＣにより、さらに精製されている
    前記第（１１）項の組成物。
  13. （１３）ＯＦがゲル電気泳動により、さらに精製されて
    いる前記第（１１）項の組成物。
  14. （１４）異種宿主において低免疫原性であるに充分な純
    度の、骨から由来する蛋白質骨誘導性因子の骨誘導性有
    効量と、異種宿主において低免疫原性の、少なくとも５
    重量％の非繊維性コラーゲンを含有する担体とを混合し
    てなる、異種宿主において低免疫原性の組成物を骨欠損
    部に移植することを特徴とする脊椎動物における骨修復
    方法。
JP60234381A 1984-10-24 1985-10-19 誘導性コラ−ゲン・ベ−ス骨修復調製物 Granted JPS6216421A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US664158 1984-10-24
US06/664,158 US4563350A (en) 1984-10-24 1984-10-24 Inductive collagen based bone repair preparations

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS6216421A true JPS6216421A (ja) 1987-01-24
JPH0555149B2 JPH0555149B2 (ja) 1993-08-16

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JP60234381A Granted JPS6216421A (ja) 1984-10-24 1985-10-19 誘導性コラ−ゲン・ベ−ス骨修復調製物

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EP (1) EP0182483B1 (ja)
JP (1) JPS6216421A (ja)
AT (1) ATE54830T1 (ja)
AU (1) AU585268B2 (ja)
CA (1) CA1266613A (ja)
DE (1) DE3578874D1 (ja)

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