JP2522568B2 - 骨形成デバイス - Google Patents

骨形成デバイス

Info

Publication number
JP2522568B2
JP2522568B2 JP1504771A JP50477189A JP2522568B2 JP 2522568 B2 JP2522568 B2 JP 2522568B2 JP 1504771 A JP1504771 A JP 1504771A JP 50477189 A JP50477189 A JP 50477189A JP 2522568 B2 JP2522568 B2 JP 2522568B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
bone
protein
bone morphogenetic
amino acid
osteogenic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP1504771A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH03500655A (ja
Inventor
クベラサンパス，サンガベル
オッパーマン・ハーマン
ルエガー，デーヴィッド・シー
オズカイナク，エンジン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Stryker Corp
Original Assignee
Stryker Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27391116&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2522568(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US07/179,406 external-priority patent/US4968590A/en
Priority claimed from US07/315,342 external-priority patent/US5011691A/en
Application filed by Stryker Corp filed Critical Stryker Corp
Publication of JPH03500655A publication Critical patent/JPH03500655A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2522568B2 publication Critical patent/JP2522568B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0024—Solid, semi-solid or solidifying implants, which are implanted or injected in body tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/227—Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/34—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3608—Bone, e.g. demineralised bone matrix [DBM], bone powder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3645—Connective tissue
    • A61L27/365—Bones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3645—Connective tissue
    • A61L27/3654—Cartilage, e.g. meniscus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61C—DENTISTRY; APPARATUS OR METHODS FOR ORAL OR DENTAL HYGIENE
    • A61C8/00—Means to be fixed to the jaw-bone for consolidating natural teeth or for fixing dental prostheses thereon; Dental implants; Implanting tools
    • A61C8/0003—Not used, see subgroups
    • A61C8/0004—Consolidating natural teeth
    • A61C8/0006—Periodontal tissue or bone regeneration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2310/00—Prostheses classified in A61F2/28 or A61F2/30 - A61F2/44 being constructed from or coated with a particular material
    • A61F2310/00005—The prosthesis being constructed from a particular material
    • A61F2310/00365—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、骨形成デバイス、哺乳動物中で骨形成を誘
導可能なタンパク質をコードする遺伝子とその産物を組
み換えDNA技術を用いて産生するための方法、哺乳動物
の骨から骨形成タンパク質を再現性よく精製する方法、
および、骨形成デバイスを用いた骨および軟骨修復法に
関するものである。
哺乳動物骨組織は、おそらく成長時および通常の骨治
癒の際に活性を持つ、一種以上のタンパク性物質を含ん
でいることが知られており、その物質は軟骨内の骨形成
を引き起こす細胞性現象の分化カスケードを誘導するこ
とができる。この活性因子は文献中で、骨形態発生タン
パク質、骨誘導タンパク質、骨形成タンパク質、オステ
オゲニンまたは骨誘導性タンパク質（osteoinductivepr
otein）として様々に呼ばれてきた。
骨分化の発生カスケードは、間葉細胞の補充、前駆細
胞の増殖、軟骨のカルシウム沈着、血管の侵入、骨形
成、再編成、および最後の骨髄分化からなる（レディ
（Reddi）（1981）Collagen Rel.Res.１:209−226）。
これらの表現型の形態転換を引き起こす詳細な機構は
いまだ明らかになっていないが、通常の骨基質の軟骨内
骨分化活性を分離抽出し、不活性な残存するコラーゲン
性基質と再構成させて完全な骨誘導活性を回復させられ
ることが示されている（サンパス（Sampath）とレディ
（Reddi）、（1981）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:7599
−7603）。このことにより、タンパク質抽出液が軟骨内
の骨をin vivoで誘導する活性をアッセイするための実
験法が与えられる。
骨誘導タンパク質であると予想されるこのタンパク質
は、50キロダルトン（kD）以下の分子量を持つことが示
された。種間移植実験から示されたように、数種の哺乳
動物が密接に関連したタンパク質を産生する（サンパス
（Sampath）とレディ（Reddi）（1983）Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 80:6591−6595）。
このタンパク質の潜在的な有用性は広く認識されてい
る。このタンパク質が容易に入手可能となることによ
り、整形外科医学、ある種の形成外科、および多様な歯
周および脳顔面頭蓋復元法を根本的に変えるであろうと
予測されている。
これらのタンパク質画分に関して観察された性質か
ら、骨形成活性を担う純粋な因子（群）の分離および同
定を目的として多数の研究室で熱心な研究が行われてき
た。
哺乳動物の骨から骨形成タンパク質を生成する技術の
現在の状態は、サンパスらによって開示されている（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA（1987）80）。ウリスト（Uris
t）ら（Proc.Soc.Exp.Biol.Med.（1984）173:194−19
9）は、塩化カルシウム−尿素、無機−有機溶媒混合物
を用いて鉱物質除去された皮質性骨から抽出し、グアニ
ジン−塩酸中で分離沈殿させ調製用ゲル電気泳動で回収
したヒト骨形成タンパク質を開示している。著者らは該
タンパク質画分は酸性ポリペプチドのアミノ酸構成を有
し、分子量は17〜80kDの範囲であることを報告してい
る。
ウリスト（Urist）ら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA（198
4）81:371−375）は、酸性ポリペプチドであって分子量
約18kDのウシ骨形態形成タンパク質抽出物を開示してい
る。該タンパク質とヒドロキシアパタイトクロマトグラ
フィーで分離された画分中に存在し、マウス後四半部筋
肉中での骨形成およびラットおよびイヌ頭蓋のトレフィ
ン欠陥の骨再生を誘導することを著者らは報告してい
る。骨から該抽出物を得る彼らの方法では、定義の曖昧
な不純な調製物が得られる。
1985年10月７日に出版されたヨーロッパ特許出願連続
番号第148,155号は、ウシ、ブタ、およびヒト由来の骨
形成タンパク質を開示することを意図している。該タン
パク質の一つ、発明者がP3タンパク質と呼んでいるもの
は分子量が22〜24kDであり、実質的に均質な状態にまで
精製されたと言われている。この物質は、動物に移植す
ると骨形成を誘導することが報告されている。
1988年１月14日に出願された、国際出願番号PCT/087/
01537号は骨誘導活性を有するウシ骨由来の不純な画分
を開示している。上述の出願らは、組み換えDNA技術に
よって産生された骨誘導因子であると予想される因子も
開示している。ヒトあるいはウシのゲノムあるいはcDNA
ライブラリーから４種のDNA配列（BMP−１、BMP−２ク
ラスＩ（またはBMP−２）、BMP−３、BMP−２クラスII
（またはBMP−４））が回収され、組み換え宿主細胞中
で明らかに発現された。発現されたタンパク質は骨形態
形成タンパク質であろうと出願人らは述べているが、骨
誘導は示されなかった。骨形態形成剤と題されたウリス
ト（Urist）ら、EP 0,212,474も参照のこと。ワン（Wan
g）ら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1988）85:9484−948
8）は、ウシの鉱物質除去した骨のグアニジン抽出物か
ら、ゲル溶出から分子量30kDと決定された塩基性タンパ
ク質として軟骨、骨形成活性を有するウシ骨形態形成タ
ンパク質の精製を開示している。該タンパク質の精製に
より、30、18、および16kDのタンパク質が得られ、これ
らは分離されると不活性であった。この結果から見て、
活性を持つ物質の正確な性質は決定されなかったと著者
らは認めている。
ウォズニー（Wozney）ら（Science（1988）242:1528
−1534）は、ウシ骨からまず精製された３つのポリペプ
チドに対応するヒトのポリペプチドをコードする完全長
のcDNAの単離を開示している。組み換え技術で発現され
た３つのヒトタンパク質はそれぞれ単独で、あるいは組
み合わせて軟骨形成を誘導できると著者らは報告してい
る。骨形成の証拠は報告されていない。
本発明の一つの目的は、同種移植および異種移植で骨
誘導可能な骨形成タンパク質が分散して含まれている基
質からなる骨形成装置を与えることである。別の目的
は、哺乳動物骨組織から骨形成タンパク質を単離する再
現性のある方法を与えることである。また別の目的は、
骨形成を担うタンパク質の解析を行うことである。さら
に別の目的は、ヒトを含む哺乳動物中で軟骨内の骨形成
を誘導可能な天然あるいは組み換え骨形成タンパク質を
与えることである。さらに別の目的は、骨形成タンパク
質をコードする遺伝子および組み換えDNA技術を用いて
それらを産生させる方法を与えることである。また別の
目的は、軟骨形成を誘導する方法を与えることである。
本発明の上述の、またそれ以外の目的および特徴は、
以下の説明、図、および請求の範囲から明らかとなるで
あろう。
発明の要約 本発明は、哺乳動物体に移植されるとその部位で軟骨
内骨形成および骨髄分化の完全な分化カスケードが誘導
される骨形成デバイスに関するものである。ここて開示
するように適切に修飾すると、該デバイスは軟骨形成の
誘導にも使用することができる。このデバイスはここで
はマトリックスと呼ぶ担体基質からなり、該マトリック
スは以下に述べるような性質を有しており、該マトリッ
クスには天然材料から精製された元来の形態の骨形成タ
ンパク質、あるいは組み換えDNA技術で産生したものの
どちらかが分散して含まれている。
これらの開発の鍵は、哺乳動物の骨から活性のある、
実質的に純粋な骨形成タンパク質を回収する方法、およ
びそれに続く天然の骨形成タンパク質のアミノ酸配列お
よび構造データの解析の発展が成功することである。該
タンパク質は1mgの移植あたり約0.8〜1.0ngの２分の１
最大値骨形成活性を有する。該タンパク質は二量体であ
ると考えられている。それは解離すると活性がなくなる
ようである。該タンパク質の複数の種の多様な組み合わ
せがヘテロ二量体あるいはホモ二量体として存在してい
るらしい。
本発明は、骨から抽出された、または組み換えDNA技
術で産生された天然の型の骨形成タンパク質を与える。
実質的に純粋な骨形成タンパク質としては、どのような
由来かには関わらず、多様なグリコシル化パターン、多
様なＮ末端を有する型、アミノ酸配列の相同性がある領
域を持つ関連したタンパク質のファミリー、および天然
のタンパク質の活性を持つ短縮型あるいは変異型タンパ
ク質が含まれる。天然の材料から得た骨形成タンパク質
はその元来の型では、グリコシル化されており、SDS−P
AGEで決定されたところでは約30kDの見かけの分子量を
持つ。還元されると、その30kDのタンパク質は約16kDお
よび18kDの見かけの分子量を持つ二つのグリコシル化さ
れたポリペプチド鎖が生じる。還元された状態では、30
kDタンパク質は検出可能な骨形成活性を示さない。脱グ
リコシル化されたタンパク質は骨形成活性を持ってお
り、約27kDの見かけの分子量を持っている。還元される
と、27kDタンパク質は約14kDと16kDの見かけの分子量を
持つ二つの脱グリコシル化されたポリペプチドを生じ
る。完全な分子および消化断片の解析から、天然の30kD
の骨形成タンパク質は以下のアミノ酸配列を含むことが
示唆された（疑問符は決定されていない残基を示す）： （１） Ｓ−Ｆ−Ｄ−Ａ−Ｙ−Ｙ−Ｃ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｃ
−Ｑ−Ｆ−Ｐ−Ｍ−Ｐ−K; （２） Ｓ−Ｌ−Ｋ−Ｐ−Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ａ−Ｔ−Ｉ−Ｑ
−Ｓ−Ｉ−V; （３） Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｖ−Ｐ−Ｔ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ａ−Ｉ
−Ｓ−Ｍ−Ｌ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｅ−Ｎ−Ｅ−K; （４） Ｍ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｓ−Ｉ−Ｌ−Ｆ−Ｆ−Ｄ−Ｅ
−Ｎ−K; （５） Ｓ−Ｑ−Ｅ−Ｌ−Ｙ−Ｖ−Ｄ−Ｆ−Ｑ−R; （６） Ｆ−Ｌ−Ｈ−Ｃ−Ｑ−Ｆ−Ｓ−Ｅ−Ｒ−Ｎ−S; （７） Ｔ−Ｖ−Ｇ−Ｑ−Ｌ−Ｎ−Ｅ−Ｑ−Ｓ−Ｓ−Ｅ
−Ｐ−Ｎ−Ｉ−Y; （８） Ｌ−Ｙ−Ｄ−Ｐ−Ｍ−Ｖ−V; （９） Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｖ−Ｐ−Ｇ−Ｉ−Ｐ−Ｅ−Ｐ−Ｃ
−Ｃ−Ｖ−Ｐ−E; （10） Ｖ−Ｄ−Ｆ−Ａ−Ｄ−Ｉ−G; （11） Ｖ−Ｐ−Ｋ−Ｐ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｐ−T; （12） Ｉ−Ｎ−Ｉ−Ａ−Ｎ−Ｙ−L; （13） Ｄ−Ｎ−Ｈ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｍ−Ｆ−Ｐ−Ｉ−Ａ
−Ｉ−N; （14） Ｄ−Ｅ−Ｑ−Ｔ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ａ−Ｒ−Ｒ−Ｋ
−Ｑ−Ｗ−Ｉ−？−P; （15） Ｄ−Ｉ−Ｇ−？−Ｓ−Ｅ−Ｗ−Ｉ−Ｉ−？−P; （16） Ｓ−Ｉ−Ｖ−Ｒ−Ａ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｐ−Ｇ−Ｉ
−Ｐ−Ｅ−Ｐ−？−？−V; （17） Ｄ−？−Ｉ−Ｖ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｑ−Ｙ−Ｈ−Ａ
−Ｆ−Y; （18） Ｄ−Ｅ−Ｎ−Ｋ−Ｎ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｖ−Ｙ
−Ｐ−Ｎ−Ｍ−Ｔ−Ｖ−E; （19） Ｓ−Ｑ−Ｔ−Ｌ−Ｑ−Ｆ−Ｄ−Ｅ−Ｑ−Ｔ−Ｌ
−Ｋ−？−Ａ−Ｒ−？−Ｋ−Q; （20） Ｄ−Ｅ−Ｑ−Ｔ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ａ−Ｒ−Ｒ−Ｋ
−Ｑ−Ｗ−Ｉ−Ｅ−Ｐ−Ｒ−Ｎ−？−Ａ−Ｒ−Ｒ−Ｙ−
L; （21） Ａ−Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｑ−Ｗ−Ｉ−Ｅ−Ｐ−Ｒ−Ｎ
−？−Ａ−？−Ｒ−Ｙ−？−？−Ｖ−D; （22） Ｒ−？−Ｑ−Ｗ−Ｉ−Ｅ−Ｐ−？−Ｎ−？−Ａ
−？−？−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｖ−Ｄ−？−Ａ−？−？−G. 実質的に純粋な形で該タンパク質を入手できること、
そのアミノ酸配列などの構造的な特徴を知ることによ
り、骨形成タンパク質をコードする元の遺伝子の同定、
クローニング、および発現が可能となる。翻訳後に適切
に修飾し、適当なマトリックスに混合し、ここで述べる
ように移植すると、これらのタンパク質は軟骨および軟
骨内骨の形成を誘導することができる。
部分的な配列データを基にしてここでデザインしたコ
ンセンサスDNA配列、および文献で開示されている調節
タンパク質との間に見いだされた相同性は、ゲノムライ
ブラリーおよびcDNAライブラリーから骨形成タンパク質
をコードする遺伝子を抽出するためのプローブとして有
用である。
コンセンサス配列の一つはこれまで同定されていなか
ったゲノムDNA配列の単離に使用され、それらの一部は
連結されると軟骨内骨形成を誘導できる領域を持つタン
パク質をコードしているものであった。OP1と呼ぶこの
タンパク質は以下に示す配列を持つ活性領域を有する。
より長い活性配列は以下のものである。
第1A図はOP1のゲノムDNA配列を示している。
上記プローブはさらに、上述のPCT/087/01537におい
て同定されたいくつかのDNA配列（文献中、BMP−２クラ
スIIおよびBMP−３と呼ばれている）を回収した。本発
明者らは、正しい構造をとらせると真の骨形成活性を有
する、すなわち、哺乳動物に正しく移植した場合に軟骨
内骨形成に至る完全なカスケードを誘導するタンパク質
群（CBMP−2a、CBMP−2b、およびCBMP−３）を、上記DN
A配列ならびに上記出版物に記載されているBMP−２クラ
スＩのある一部分がコードしていることを発見した。こ
れらの配列を以下に示す： 以上のように、本開示の観点から、熟練した遺伝学技
術者はcDNAライブラリーあるいはゲノムライブラリーか
ら適当なアミノ酸配列をコードする遺伝子を単離し、そ
れらを原核生物および真核生物を含む様々な型の宿主細
胞中で発現させ、ヒトを含む哺乳動物中で骨形成を誘導
可能な活性タンパク質を大量に産生させることができ
る。
実質的に純粋な骨形成タンパク質（すなわち、骨誘導
活性を持たないタンパク質の混入がない、天然由来のタ
ンパク質あるいは組み換えタンパク質）は、適当な輸送
系あるいは補助系（マトリックス）と組み合わせて臨床
での応用に有用である。マトリックスは粒子状物質ある
いは多孔性物質から作られる。孔は前駆体細胞の移動お
よびそれに続く分化と増殖が可能な大きさでなければな
らない。粒子のサイズは70−850μｍ、望ましくは70−4
20μｍの範囲内でなければならない。該マトリックスは
粒子性物質を密にパッキングして骨の欠損をつなぐよう
な形にすること、あるいは生体適合性（炎症を起こさな
い）であってin vivoで生物分解可能な物質を望みの形
にして構築して“一時的補助材”および移動性前駆体細
胞の補充のためのマトリックスとして、およびそれに続
く固定化と増殖のための基盤として働くように、作成さ
れる。目下のところ推奨される担体としては、顆粒状、
鉱物質除去され、グアニジン抽出された、種特異的（同
種）骨組織、および顆粒状で脱グリコシル化され（ある
いはHF処理した）、タンパク抽出され、鉱物質除去され
た異種骨組織が含まれる。任意に、このような異種骨組
織顆粒状マトリックスはトリプシンなどのプロテアーゼ
で処理してもよい。そのほかの有用なマトリックス物質
としては、コラーゲン、グリコリン酸と乳酸のホモポリ
マーおよびコポリマー、ヒドロキシアパタイト、リン酸
３カルシウム、およびそのほかのカルシウムリン酸塩が
含まれる。
ここで可能となり開示された骨形成タンパク質および
移植可能な骨形成デバイスにより、例えば後天的および
先天的脳顔面頭蓋およびその他の骨あるいは歯の異常を
矯正するための、予想可能な最適の骨形成を外科医が得
られるようになる（グロワッキ（Glowacki）ほか、（19
81）Lancet １:959−963）。動物実験で示されたよう
に、該デバイスは不連続骨折において、および骨形成が
必要とされる歯周での応用を含むそのほかの臨床的応用
においての局所的な軟骨内骨形成を誘導するために使用
される。もう一つの潜在的な臨床的応用は、例えば骨関
節炎の治療での、軟骨修復である。
図面の簡単な説明 本発明の上述およびその他の目的、その多様な特徴、
および本発明そのものは、添付した図と共に以下の説明
を読むことにより、より完全に理解されるであろう。
第1A図は、骨形成タンパク質“OP1"のゲノムコピーの
ヌクレオチド配列を示したものである。1880および1929
の間の満ち領域は実際には約1000ヌクレオチドを表して
いる； 第1B図は骨形成タンパク質“OP1"遺伝子へのコンセン
サス遺伝子／プローブのハイブリダイゼーションの模式
図である； 第２図は、ヘパリン−セファロース−I;HAP−ウルト
ロゲル；シービング−ゲル（セファクリル300）；およ
びヘパリン−セファロース−II上での精製の際のウシ骨
形成タンパク質（BOP）分画の結果を示す、溶出体積に
対するタンパク質濃度（吸光度で示される）のプロット
の集合である； 第３図は、非還元条件下（Ａ）および還元条件下
（Ｂ）での骨形成タンパク質のクマジーブルーで染色し
たSDSポリアクリルアミドゲルを写真で再現したもので
ある； 第４図は、酸化した（Ａ）、および還元した（Ｂ）30
kDタンパク質の炭水化物成分を示すSDSポリアクリルア
ミドゲルのConAブロットを写真で再現したものである； 第５図は、125I標識グリコシル化された（Ａ）、およ
び脱グリコシル化された非還元条件下（１）および還元
条件下（２）での骨形成タンパク質のSDSポリアクリル
アミドゲルのオートラジオグラムを写真で再現したもの
である； 第６図は、Ｖ−８プロテアーゼ（Ｂ）、エンドLys C
プロテアーゼ（Ｃ）、ペプシン（Ｄ）、およびトリプシ
ン（Ｅ）で30kD骨形成タンパク質を消化して得られたペ
プチドのSDSポリアクリルアミドゲルのオートラジオグ
ラムを写真で再現したものである。（Ａ）はコントロー
ルである。
第７図は、30kD BOP（Ａ）、16kDサブユニット
（Ｂ）、および18kDサブユニット（Ｃ）のトリプシンペ
プチド消化産物のHPLCクロマトグラムを集めたものであ
る； 第８図は、２回目のヘパリン−セファロースクロマト
グラフィー過程（第2D図参照）から回収された試料の逆
相Ｃ−18HPLCでの溶出プロファイルのHPLCクラマトグラ
ムである。重ね書きされているものは、各画分中の骨形
成率パーセントである； 第９図は、Ｃ−18で精製した骨形成ピーク画分のTSK3
000/2000ゲルでの溶出プロファイルのゲル浸透クロマト
グラムである。重ね書きしてあるのは各画分中の骨形成
率パーセントである； 第10図は、ヘパリン−セファロースＩ（Ａ）、HAP−
ウルトロゲル（Ｂ）、TSK3000/2000（Ｃ）、およびヘパ
リン−セファロースII（Ｄ）でのヒトタンパク質分画化
の結果を示す、溶出体積に対するタンパク質濃度（吸光
度で示されている）のグラフを集めたものである。矢印
は緩衝液の変化を示している； 第11図は、Ｃ−18での逆相HPLC（Ａ）、ヘパリン−セ
ファロースII（Ｂ）、TSK3000（Ｃ）、HAP−ウルトロゲ
ル（Ｄ）、およびヘパリン−セファロースＩ（Ｅ）を含
む多様な精製過程由来の試料の骨誘導活性に関する典型
的な投与量反応を示すグラフである； 第12図は、骨形成デバイス（Ａ）、担体コントロール
（Ｂ）、および鉱物質除去した骨（Ｃ）で処理した後の
ネコ骨欠損修復の放射線形態学的解析の棒グラフであ
る； 第13図は、骨形成タンパク質（COPO）に関するコンセ
ンサス遺伝子／プローブのDNA配列および対応するアミ
ノ酸配列を模式的に表したものである； 第14図は、SDSポリアクリルアミドゲルの30kD領域中
のピーク骨形成活性を示す、増加する分子量に対する骨
形成活性のグラフである； 第15図は、30kDタンパク質のゲルで精製されたサブユ
ニットを示すクマジーブルーで染色したSDSゲルを写真
で示したものである； 第16図は、18kDサブユニット（Ａ）および16kDサブユ
ニット（Ｂ）のエンドAsp Nプロテイナーゼ消化産物の
二つのHPLCクロマトグラムである； 第17図は、ラットモデルでの骨移植の組織学的検査を
写真で示したものである：担体のみ（Ａ）；担当とグリ
コシル化した骨形成タンパク質（Ｂ）；および担体と脱
グリコシル化した骨形成タンパク質（Ｃ）。矢印は造骨
細胞を示す； 第18図は異種マトリックス（脱グリコシル化されたウ
シマトリックス）の活性を示すグラフである；および、 第19A図および第19B図は、増加するタンパク質濃度
（投与量曲線、ng）に対して、カルシウム含量で測定さ
れるゲル溶出前後の天然材料から得られたOPの比活性を
示す棒グラフである。
発明の説明 哺乳動物の骨由来の粗抽出液中に存在する骨形成タン
パク質の単離を可能にする精製法が開発された。各分離
過程は既知の分離技術から構成されているが、尿素など
の変性剤の存在下でヘパリンおよびヒドロキシアパタイ
ト（HAP）に対するタンパク質の親和性を利用した一連
の分離の組み合わせが粗抽出液から純粋なタンパク質を
単離するための鍵であることが発見された。これらの重
要な分離過程は疎水性溶媒、ゲル排除クロマトグラフィ
ー、およびSDS−PAGEからの溶出と組合わされる。
この単離法により、あらゆる哺乳動物種から、十分量
の新鮮な骨が入手可能であれば、実質的に純粋な骨形成
タンパク質の大量産生が可能となる。新鮮なウシの骨が
入手可能であることと合わせて、この方法の実験に基づ
いた発展により、実質的に純粋なウシ骨形成タンパク質
（BOP）の単離が可能となった。BOPは、以下に述べるよ
うに重要なものとして解析されて来た；ネコ、ウサギ、
ラット中で軟骨および最終的には軟骨内骨の成長を誘導
する能力が研究されて来た；不均質な骨抽出物中に存在
する未知のタンパク質（群）によるものだとそれまで考
えられてきた骨形成の完全な分化カスケードをBOPが誘
導できることが示された；また、BOPは、不連続骨折を
含む整形外科系欠陥における軟骨内骨の形成を誘導する
ために用いられる。天然の形では、BOPはグリコシル化
されている二量体タンパク質である。しかし、BOPは、
脱グリコシル化された形で活性を持つ。部分的に塩基配
列決定が行われていた。その一次構造はここで示すアミ
ノ酸配列を含んでいる。
BOPのアミノ酸配列の解明により、ペプチド断片をコ
ードする核酸プローブのプールの構築が可能となる。ま
た、アミノ酸配列データ、配列に関して推定したコド
ン、および既知の遺伝子との部分的相同性の観察を基に
してここで述べるようにデザインしたコンセンサス核酸
配列もプローブとして使用された。プローブは、以下で
述べるように標準的なハイブリダイゼーション技術を用
いて活性のある哺乳動物骨形成タンパク質（OP）をコー
ドしている、通常生じるcDNAの単離に使用することもで
きる。そのmRNAは骨形成タンパク質を合成することが知
られている多様な種の細胞の細胞質中に存在している。
核mRNAを有する有用な細胞としては、例えば、骨あるい
は骨肉腫由来の骨芽細胞、肥大性軟骨細胞、および幹細
胞がある。該mRNAはcRNAライブラリーの産生に使用可能
である。あるいは、骨形成タンパク質をコードする適切
なDNAは、多様な哺乳動物種由来のクローン化されたゲ
ノムDNAライブラリーから回収することができる。
これらの発見により、単独あるいは組み合わせること
によって真の軟骨内骨を産生可能な完全に新しく、非天
然のタンパク質構造物をコードするDNAの構築が可能と
なる。また、それらにより、天然の材料から回収したcD
NA、あるいは市販の自動化された装置を用いてここで開
示する技術によって合成したcDNAから、元来の物質、短
縮化された型、変異タンパク質、類似体、融合タンパク
質、および多様なそのほかの改変体および構造物を発現
させることができる。これらのDNAは、確立されている
組み換えDNA技術を用いて原核生物あるいは真核生物宿
主細胞中で発現させることが可能であり、生物活性が必
要ならば、in vitroで酸化して再度形作らせることがで
きる。
骨からタンパク質を得るための単離方法、骨形成タン
パク質遺伝子の回収、組み換えタンパク質のデザインお
よび産生、基剤の性質、およびここで請求する目的物質
の性質、用途、作成法および使用法に関するそのほかの
重要な局面は、本発明の多様な局面を実施するために現
在知られている最適の方法を示している以下の記述から
さらに理解されるであろう。
Ａ BOPの精製 A1. 脱鉱物化した骨の調製 脱鉱物化したウシ骨基質は、すでに出版されている方
法によって調製した（サンパス（Sampath）とレディ（R
eddi）（1983）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:6591−659
5）。ウシ骨幹性骨（１〜10日令）を地域の屠殺場から
入手し、新鮮なうちに使用する。骨から筋肉および脂肪
を剥がし、骨膜を取り除き、冷水圧によって髄を除き、
冷たい純粋エタノールに短時間さらし、−20℃で保存す
る。次にそれらを乾燥させ、大きな挽き器の中で砕き、
粉砕することによって顆粒化した。液体窒素を用いるこ
とにより、過熱しないように注意する。粉砕した骨を70
〜420μｍの間の粒子サイズまで粉砕し、３倍体積のク
ロロホルム／エタノール（3:1）を用いて約２時間の洗
浄を２回行うことにより、脂肪を除く。顆粒状の骨を次
に１倍体積の純粋エタノールで洗浄し、一倍体積の無水
エーテル上で乾燥させた。脱脂肪化骨パウダー（別の方
法としては、アメリカン・バイオマテリアルズ社からウ
シ皮質骨パウダー（75〜425μｍ）を入手する）を次
に、10倍体積の0.5N HClを用いて４℃で40分間、４回鉱
物質除去する。最後に、多量の水で鉱物質除去した骨パ
ウダーを洗浄して中和させる。
A2. 分離抽出とエタノール沈澱 上述のように調製した、脱鉱物化骨基質を、５倍体積
のプロテアーゼ阻害剤（5mM ベンザミジン、44mM 6−
アミノヘキサノン酸、4.3mM N−エチルマレイミド、0.4
4mM フェニルメチルスルホニルフルオライド）を含む4
M グアニジン−HCl（Gu−HCl）、50mM トリス−HCl、p
H7.0を用いて、４℃で16時間、分離用の抽出を行う。そ
の懸濁液を濾過する。上清を集め、限外濾過ハローファ
イバーメンブレン（アミコン社、YM−10）を用いて１体
積まで濃縮する。濃縮液を遠心し（8,000×ｇで10分
間、４℃）、上清のエタノール沈澱を行う。１体積の濃
縮後に５倍体積の冷（−70℃）純粋エタノール（100
％）を加え、−70℃で16時間保持する。沈澱物を10,000
×ｇで10分間４℃で遠心して回収する。得られたペレッ
トを41の85％冷エタノールに再懸濁し、−70℃で60分間
インキュベートし、再度遠心する。沈澱物をもう一度85
％冷エタノールに懸濁し（21）、−70℃で60分間インキ
ュベートし、遠心する。次に、沈澱物を凍結乾燥する。
A3. ヘパリン−セファロース クロマトグラフィーＩ エタノール沈澱し、凍結乾燥して抽出した粗タンパク
質を25体積の0.15M NaClを含む6M尿素、50mMトリス−HC
l,pH7.0（緩衝液Ａ）に溶解し、8,000×ｇで10分間遠心
して清浄にした。ヘパリン−セファロースは緩衝液Ａを
用いてカラム平衡化を行う。タンパク質をカラムの上に
載せ、３カラム体積の開始緩衝液（0.15M NaClを含む緩
衝液Ａ）で洗浄した後に、タンパク質を0.5M NaClを含
む緩衝液Ａで溶出する。溶出液の吸光度を連続的に280n
mで追跡する。0.5M NaClで溶出されたタンパク質のプー
ル（約１カラム体積）を集め、４℃で保存する。
第2A図で示すように、ほとんどのタンパク質（約95
％）は結合せずに残る。約５％のタンパク質がカラムに
結合する。結合しなかった画分は、全体としてバイオア
ッセイを行っても、あるいはセファロースCL−6Bで部分
精製した後も骨誘導活性を示さない。
A4. ヒドロキシアパタイト−ウルトロゲルクロマトグ
ラフィー ヘパリン−セファロースから0.5M NaClを含む緩衝液
Ａで溶出したタンパク質の全体積を、0.5M NaClを含む
緩衝液Ａで平衡化したヒドロキシアパタイト−ウルトロ
ゲル（HAP−ウルトロゲル）（LKBインスツルメント社）
のカラムに直接アプライする。HAP−ウルトロゲルは平
衡化に先立ち、500mMリン酸ナトリウムを含む緩衝液Ａ
で処理する。吸着されないタンパク質を未結合画分とし
て集め、カラムを３体積の0.5M NaClを含む緩衝液Ａで
洗浄する。続いてカラムを100mMリン酸ナトリウムを含
む緩衝液Ａで溶出させた（第2B図）。
溶出する化合物は、アルカリホスファターゼ活性およ
び組織学的に調べると、軟骨内骨誘導を行える。生物学
的に活性のあるタンパク質は6M尿素および0.5M NaClの
存在下でHAPに結合するので、該タンパク質は骨鉱物質
に親和性を有し、リン酸イオンによってのみ置き換えら
れる。
A5. セファクリルＳ−300ゲル濾過クロマトグラフィー セファクリルＳ−300 HR（高分解能、5cm×100cmカラ
ム）はファルマシア社から入手し、4Mグアニジン−HC
l、50mMトリス−HCl,pH7.0で平衡化する。HA−ウルトロ
ゲルから結合したタンパク質画分を濃縮し、尿素から4M
グアニジン−HCl、50mMトリス−HCl,pH7.0へ、アミコン
限外濾過YM−10メンブレンを介して交換する。次に、こ
の溶液をシュライヒャー・アンド・シュエル社CENTREX
使い捨てマイクロフィルターで濾過する。約400mgのタ
ンパク質を含む約15mlの試料アリコートをカラムに載
せ、4Mグアニジン−HCl、50mMトリス−HCl、pH7.0で、
流速3ml/minで溶出する;12mlの画分を８時間以上集め、
タンパク質濃度をA280nmで測定する（第2C図）。各画分
のアリコートを骨形成に関してバイオアッセイを行う。
骨形成を形成し、見かけ分子量が35kD以下として泳動さ
れるこれらの画分をプールし、YM−10メンブレンを持つ
アミコン限外濾過システムで濃縮する。
A6. ヘパリン−セファロースクロマトグラフィー−II ゲル濾過クラマトグラフィーから得られた、プールし
た骨誘導画分を蒸留水（dH2O）に対して、次に0.1M NaC
lを含む6M 尿素、50mM トリス−HCl,pH7.0（緩衝液
Ａ）に対して十分に透析する。透析後の溶液を遠心で清
浄にする。試料をヘパリン−セファロースカラム（試料
緩衝液で平衡化したもの）にアプライする。３カラム体
積の開始緩衝液で洗浄した後、カラムを0.15M NaCl、お
よび0.5M NaClを含む緩衝液Ｂで連続的に展開する（第2
D図）。0.5M NaClで溶出されたタンパク質を集め、蒸留
水に対して十分に透析した。次に、30％アセトニトリ
ル、0.1％TFAに対して４℃で透析を行った。
A7. 逆相HPLC タンパク質をＣ−18バイダック（Vydac）シリカをベ
ースとしたHPLCカラムクロマトグラフィー（粒子サイズ
５μm;孔サイズ300A）によってさらに精製した。ヘパリ
ン−セファロース−II クロマトグラフで得られた骨誘
導画分をカラムに載せ、0.1％ TFA、10％アセトニトリ
ルで５分間洗浄する。第８図に示すように、結合したタ
ンパク質を10−30％アセトニトリルの直線勾配で15分間
にわたり、30−50％アセトニトリルで60分間にわたり、
および50−70％アセトニトリルで10分間にわたり、22℃
で流速1.5ml/minで溶出し、1.4ml試料をポリカーボネー
トチューブに集める。タンパク質をA214nmでの吸光度を
追跡する。カラム画分を骨誘導活性の存在、およびコン
カナバリンＡでブロット可能なタンパク質の存在に関し
て試験する。これらの画分をプールし、オートラジオグ
ラフィー、コンカナバリンＡブロッティング、およびク
マジーブルー染色によって30kDタンパク質の存在を生化
学的に解析する。次にそれらをin vivo骨形成活性に関
してアッセイを行なう。30kDタンパク質が存在しないと
生物学的活性は見いだされない。
A8. ゲル溶出 グリコシル化された、あるいは脱グリコシル化された
タンパク質をさらに解析するためにSDSゲル（集さ0.5m
m）から溶出する。125Iで標識した30kDタンパク質を、
収量を追跡するために各調製液に定常的に添加する。表
１は、試した多様な溶出緩衝液と125Iで標識したタンパ
ク質の収量を示している。
表１ SDSゲルからの30kDタンパク質の溶出緩衝液 ％溶出 （１）dH2O 22 （２）4Mグアニジン−HCl,トリス−HCl,pH7.0 2 （３）4Mグアニジン−HCl,トリス−HCl,pH7.0 0.5％トリトンｘ−100 93 （４）0.1％,SDS,トリス−HCl,pH7.0 98 表２は30kDあるいは脱グリコシル化された27kDゲル結
合タンパク質の単離に使用される過程を列挙したもので
ある。標準的な方法では、トリス−HCl緩衝液中に0.5％
トリトンx 100を含む4Mグアニジン−HCl、あるいは0.1
％SDSを含むトリス−HCl緩衝液を用いた拡散溶出を用
い、以下の部分で述べるようにin vivo骨形成活性を示
すためにゲルの27あるいは30kD領域からのタンパク質の
95％以上の溶出を行った。
表２ ゲルから溶出したタンパク質の調製 （Ｃ−18プールあるいは脱グリコシル化タンパク質と、
128I標識した30kDタンパク質） 1. 真空遠心で乾燥させる； 2. ペレットをH2Oで洗浄する； 3. ペレットを試料緩衝液に溶解する（還元剤は含まな
い）； 4. 前電気泳動した0.5mmミニゲルで電気泳動する； 5. 27あるいは30kDタンパク質を切り出す； 6. 0.1％SDS、50mMトリス−HCl、pH7.0でゲルから溶出
する； 7. CENTREXメンブレンで濾過する； 8. セントリコンチューブ（10kDメンブレン）中で濃縮
し、水で洗浄する。
ゲル溶出法による標識した30kDタンパク質の総収量は
載せた試料の50〜60％である。損失の殆どは、タンパク
質の重合および／またはスメアによる電気泳動過程で起
きている。
収量は、骨1kgあたり0.5から1.0μｇの実質的に純粋
な骨形成タンパク質が得られるものである。
A9. 16kD及び18kD種の単離 表３は、サブユニットの調製に関する方法を要約した
ものである。約10μｇのゲルから溶出した30kDタンパク
質（第３図）をカルボキシメチル化し、SDSゲル上で電
気泳動する。試料は、収量の追跡と、ゲルから16kDおよ
び18kD領域を切り出すためのインディケーターとして用
いるために、125I標識を含んでいる。第15図はゲルから
精製した16kDおよび18kDタンパク質のクマジーブルー染
色したゲルを示している。
表３ 30kDタンパク質のサブユニットの単離 （Ｃ−18プールと125I標識した30kDタンパク質） 1. SDSゲル上で電気泳動する。
2. 30kDタンパク質を切り出す。
3. 0.1％SDS、50mMトリス−HCl、pH7.0で溶出する。
4. セントリコンチューブ（10kDメンブレン）中で濃縮
し、H2Oで洗浄する。
5. 還元した試料をSDSゲル上で電気泳動する。
6. 16kDおよび18kDサブユニットを切り出す。
7. 0.1％SDS、50mMトリス−HCl、pH7.0で溶出する。
8. セントリコンチューブ中で濃縮し、H2Oで洗浄す
る。
9. １％SDS、0.4Mトリス−HCl、pH8.5中で還元し、カ
ルボキシメチル化する。
10. セントリコンチューブ中で濃縮し、H2Oで洗浄す
る。
B. BOPの生物学的解析 B1. ゲルスライス ゲルスライス実験により、単離された30kDタンパク質
が骨形成活性を担うタンパク質であることが確認され
る。
精製の最後の過程由来のゲルをスライスする。各画分
のタンパク質を、0.1％SDSを含む15mMトリス−HCl、pH
7.0、あるいは4Mグアニジン−HCl、0.5％非イオン性界
面活性剤（トリトンｘ−100）、50mMトリス−HClを含む
緩衝液中で抽出する。抽出したタンパク質を脱塩し、濃
縮し、軟骨内骨形成活性に関してアッセイを行う。結果
を第14図に示す。この図から、骨形成活性の大部分がゲ
ルの30kD領域のタンパク質によるものだということが明
らかである。高分子量領域中の活性は明らかにタンパク
質の重合によるものである。これらのタンパク質重合体
は、還元されると上述の16kDおよび18kD種を与える。
B2. Con−Ａ−セファロースクロマトグラフィー 30kDタンパク質を含む試料を0.1％SDS、50mMトリス−
HClを用いて可溶化し、同じ緩衝液で平衡化したコンカ
ナバリンＡ（Con−Ａ）のカラムにアプライする。結合
した物質を、0.5mMアルファーメチルマンノシドを含むS
DSトリス−HCl緩衝液で溶出する。結合画分および非結
合画分の双方の逆相クロマトグラフィーを行った後に、
Con−Ａ結合性物質は移植すると顕著な骨形成を引き起
こす。結合性物質のさらなる解析から、Con−Ａでブロ
ット可能な30kDタンパク質が示された。さらに、グリコ
シル化された30kDタンパク質は骨形成活性を担ってい
る。
B3. ゲル浸透クロマトグラフィー グアニジン−HCl中のTSK−3000/2000のどちらかを用
いてゲル浸透クロマトグラフィーによって、Ｃ−18クロ
マトグラフィーで得られた高比活性画分の分離を行った
（第９図）。その結果、骨誘導活性のピークはクマジー
ブルー染色で実質的に純粋な30kDタンパク質を含む画分
に溶出することが示されている。この画分をヨウ素化
し、オートラジオグラフィーにかけると30kDの強いバン
ドがヨウ素化されているタンパク質の90％を占めてい
る。該画分はin vivoで、移植あたり50から100ngの投与
量で骨形成を誘導する。
B4 生物学的活性のための構造的な必要条件 B4−１ 消化後の活性 30kD骨形成タンパク質の骨誘導における役割は明確に
確立されたが、タンパク質分解産物の解析から我々は、
in vivoでの活性に必要な最小構造を探し始めた。切断
実験の結果から、ペプシン処理では骨誘導活性を破壊す
ることはできないが、トリプシンあるいはCNBrでは活性
が完全になくなる。
生物学的活性に必要なペプシン消化産物を単離し、同
定するための実験が行われる。ペプシン消化に用いられ
る試料は20％〜30％の純度であった。用いた緩衝液は、
0.1％TFA水溶液である。酵素の基質に対する割合は、1:
10である。コントロール試料は酵素を加えないで作製し
た。分解混合液は室温で16時間インキュベートする。次
に、分解産物をゲル浸透クロマトグラフィーを用いて4M
グアニジン−HCl中で分離され、その画分をin vivoアッ
セイのために調製する。その結果、ペプシン消化産物の
ゲル浸透クラマトグラフィー由来の活性画分は8kD〜10k
Dの範囲の見かけの分子量を有するペプチドに対応する
ことが示されている。
B4−２ グリコシル化されていないタンパク質は活性を
持つ 骨形成活性に関しての炭水化物部分の重要性を理解す
るために、30kDタンパク質をHFを用いて科学的に脱グリ
コシル化させた（以下参照）。炭水化物がないことを確
実にするためにConAブロットによる反応産物のアリコー
トを解析した後、その物質のin vivoでの活性をアッセ
イした。そのバイオアッセイは陽性であり（すなわち、
第17C図で示されているように、組織学的な試験によっ
て決定されたように、脱グリコシル化されているタンパ
ク質は骨形成反応を引き起こす）、HFにさらすことによ
りタンパク質の生物学的機能は破壊されず、したがって
OP投与量は生物学的活性に炭水化物を必要としないこと
が示された。さらに、脱グリコシル化されたタンパク質
の比活性は、グリコシル化されている天然のタンパク質
とほぼ同じである。
B5. BOPの比活性 １）移植物のカルシウム含量を基にした２分の１最大
骨誘導活性を決定するため;2）ゲルスキャニング法を用
いナノグラムレベルでタンパク質を見積もるため；およ
び３）ゲルから溶出した30kD BOPの２分の１最大値骨誘
導活性にあたる投与量を確立するために、実験が行われ
た。その結果、ゲルから溶出した実験的に純粋な30kD骨
形成タンパク質は移植当たり5ng以下で骨を誘導し、移
植あたり20ng（約25mg）で２分の１最大値骨分化活性を
示すことが明らかになった。精製データから、骨形成タ
ンパク質は、ウシ骨からタンパク質1mgあたり47.750骨
形成ユニットであった最後のゲル溶出過程後に、367,30
7倍まで精製されたことが示唆されている。
B4（Ａ） ２分の１最大骨分化活性 骨誘導活性は、アルカリホスファターゼの比活性、お
よび12日目の移植物中のカルシウム含量によって生化学
的に決定した。アルカリホスファターゼの比活性の増加
は、骨形成の開始を示唆する。一方、カルシウム含量
は、移植物中で形成された骨の量に比例する。したがっ
て、骨形成は、ラットの12日目の移植物のカルシウム含
量を決定することによって計算され、骨形成ユニットと
して表され、これはラットの鉱物質除去した骨基質と比
較して２分の１の最大値骨誘導活性を示す量を表す。元
来の鉱物質除去したラット骨基質によって示される骨誘
導は、比較する際の最大骨分化活性であると考えられ
る。
B5（ｂ） ゲルスキャニング法を用いるタンパク質の見
積もり 標準曲線は、既知の量の標準タンパク質、ウシ血清ア
ルブミンを用いた。該タンパク質の濃度をさまざまに変
えて（50〜300ng）15％SDSゲルに載せ、電気泳動し、ク
マジーで染色し、脱染する。ゲルは580nmのゲルスキャ
ナーを用いて、あらかじめ決定された装置のところでス
キャンされた。タンパク質のバンドによって覆われた領
域は計算され、タンパク質の濃度に対して標準曲線が構
築される。未知のタンパク質濃度の試料を、BSAを標準
として電気泳動する。未知の試料を含むレーンがスキャ
ンされ、タンパク質の濃度が曲線の下の領域から決定さ
れる。
B5（ｃ） ゲル溶出および比活性 高度に精製され活性のあるＣ−18画分のアリコートを
SDSゲルに流し、第14図に示されているように分子量に
よってスライスする。タンパク質をスライスから0.5％
トリトンｘ−100を含む4Mグアニジン−HCl中に溶出し、
脱塩し、濃縮し、カルシウム含量によって決定されるよ
うに軟骨内骨形成活性に関してアッセイする。C18の高
度に活性なフラクションおよび実質的に純粋な30kDの骨
形成タンパク質からのゲル溶出物を、２分の１の最大骨
誘導活性を決定するために濃度を変えて移植する。
第14図は28−34kDに溶出されるタンパク質に依存する
骨誘導活性を示している。ゲル溶出過程後の活性の回復
はカルシウム含量によって決定された。第19A図および
第19B図は、ゲル溶出の前後にカルシウム含量で見積も
って、30kDタンパク質の多様な濃度に対する骨形成活性
を示している。ゲル溶出前は30kDタンパク質の２分の１
最大値活性が69ng毎25mg移植で、溶出後は21ng毎25mg移
植あることを示唆している。表４は、精製の各過程にお
ける骨形成タンパク質の収量、総比活性、および精製倍
率を示している。約500μｇのヘパリン−セファロース
１画分、130−150μｇのHA−ウルトロゲル画分、10−12
μｇのゲル濾過画分、４−５μｇのヘパリン−セファロ
ースII画分、0.4−0.5μｇのＣ−18高度精製画分、およ
び、20−25ngのゲル溶出された実質的な精製画分が25mg
の移植当たりの、２分の１最大値活性を示す明確な骨形
成に必要とされる。以上のように、mg移植当たり0.8−
1.0ngの精製骨形成タンパク質がin vivoで２分の１最大
値骨分化活性を示すのに必要である。
C. BOPの化学的解析 C1. 分子量と構造 最後の精製過程後のタンパク質を非還元SDSポリアク
リルアミドゲルで電気泳動を行うことにより、クマジー
ブルー染色（第3A図）およびオートラジオグラフィーの
双方で検出されたように約30kDの位置に拡散したバンド
が見られた。
BOPの解析をさらに広げるために、該タンパク質を還
元条件下で調べた。第３図はジチオスレイトール存在下
でのBOPのSDSゲルを表す。還元により、30kD BOPはクマ
ジーブルーで染色される二つの種:16kD種および18kD種
を産生する。還元により、生物学的活性は失われる。二
つの還元されたBOP種を解析して構造的に関連があるか
どうかを決定した。二つの種のアミノ酸構造およびペプ
チドマッピングの比較（以下に示す）では、殆ど差異が
認められず、天然のタンパク質は顕著な相同性を有する
二つの鎖からなっていることが示唆された。
C2. 炭水化物の存在 SDS−PAGEおよびニトロセルロース紙への転移の後、C
ON−Ａブロッティングによって炭水化物の存在を調べ
た。結果から、30kDタンパク質はCon−Ａによって対し
て高い親和性を持っており、タンパク質がグタコシル化
されていることが示唆された（第4A図）。さらに、Con
−Ａブロットの結果から、ゲルの30kD領域中にサブ構造
がある証拠が示され、グリコシル化の程度が多様である
ための不均質性が示された。還元後（第4B図）、Con−
Ａブロットにより二つの主要な構成物質が16kDと18kDに
ある証拠が示された。さらに、還元後は30kD領域にはグ
リコシル化されている物質はなかった。
炭水化物の存在を確実にし、結合している炭水化物の
量を見積もるために、30kDタンパク質をＮ−グリカナー
ゼ、広い特異性を持つ脱グリコシル化酵素で処理した。
125I標識した30kDタンパク質を該酵素と共にSDSの存在
下で37℃で24時間インキュベートした。SDS−PAGEから
観察されたように、処理した試料ははく27kDの位置に主
要な種として見られる（第5A図）。還元により、27kD種
は分子量が約14kD−16kDである種に還元される（第5B
図）。
30kDタンパク質の完全な脱グリコシル化を確実にする
ために、フッ化水素（HF）を用いた炭水化物の化学的切
断法を行った。Ｃ−18クロマトグラフィー過程からプー
ルした活性のある骨形成タンパク質をP2O5上で真空下で
ポリプロピレンチーブ内で乾燥させ、新しく蒸留した無
水HF50μを−70℃で加える。チューブの蓋を堅く閉め
た後、混合液をアイスバス中でときどき撹拌しながら１
時間０℃においた。乾燥した窒素ガスを連続的に吹き付
けて、HFを蒸発させる。チューブをアイスバスから取り
出し、残滓をP2O5とKOHペレット上で真空下で乾燥させ
る。
乾燥した後、試料を100μの50％アセトニトリル/0.
1％TFAに溶解し、SDSゲル分析、Con A結合および生物学
的アッセイのために分注する。分取した試料は、乾燥さ
せ、SDSゲル分析およびCon Aブロッティングのための調
製では、SDSゲルサンプルバッファーに溶解するか、生
物学的アッセイのためには、4Mグアニジン−HCl,50mM T
ris−HCl,pH7.0に溶解する。
この結果は、HF処理により試料から完全に糖鎖が除去
されることを示している:SDSゲル電気泳動を行いイモビ
ロン膜に転写した後Con Aブロッティングを行なうと、
この処理をした試料にはCon Aが結合しないが、一方、
未処理の対照は、30kDの位置で強く陽性を示す。処理し
た試料のクマシーゲルは、未処理の対照に存在する30kD
のバンドの代わりに27kDのバンドが存在することを示し
ている。
C3. 化学的ならびにこの酵素的切断 CNBrによる切断反応物は、炭水化物と結合した断片を
検出するためにCon Aの結合を用いて分析する。切断反
応は、CNBr存在、非存在下でトリフルオロ酢酸（TFA）
を用いて行なう。反応は、37℃で18時間行い、試料は真
空乾燥する。この試料を水で洗い、還元試薬を含むSDS
ゲルサンプルバッファーに溶解し、煮て、これをSDSゲ
ルにアプライする。電気泳動後、タンパク質をイモビロ
ン膜に転写し、Con Aの結合によって視覚化する。低濃
度の酸（１％）の中では、CNBrは16kDと18kDの分子種の
大半を１つの産物、つまり約14kDの分子種に分解してし
まう。10％TFAを用いた反応では、14kDの分子種は、CKB
r存在下、非存在下の両者において観察される。
これらの実験において、30kDタンパク質の分解産物を
検定するために、４種のタンパク質分解酵素:1）Ｖ−８
プロテアーゼ;2）エンドLys Cプロテアーゼ;3）ペプシ
ン；および４）トリプシンが用いられる。ペプシンを除
いて、酵素のための分解バッファーは0.1M 炭酸アンモ
ニウム,pH8.3である。ペプシンの反応は、0.1％TFA中で
行なう。分解容量は100μで、酵素と基質の比は、1:1
0である。125I−標識30kD骨形成タンパク質を検出のた
めに添加する。37℃で16時間インキュベートした後、分
解混合液を乾燥し、SDS−PAGEを行なうためにジチオス
レイトールを含むゲルサンプルバッファーに懸濁する。
第６図は、分解産物がSDSゲルのオートラジオグラフを
示している。この結果は、これらの条件では、トリプシ
ンによる切断のみが16KD/18kDの分子種を完全に分解
し、12kD周辺に主な分子種を生ずることを示している。
ペプシンによる分解により、より明確な、低分子量の分
子種が得られる。しかし、16kD/18kDS断片は、完全には
切断されなかった。Ｖ−８による切断は、１つの優性な
分子種を16kDに持つ限定分解を示す。
C4. タンパク質の配列決定 アミノ酸配列データを得るために、タンパク質をトリ
プシンあるいはエンドプロティナーゼAsp−Ｎ（EndoAsp
−Ｎ）で切断する。還元した30kDのタンパク質およびカ
ルボキシメチル化したタンパク質（約10μｇ）のトリプ
シンによる分解物は、TFA/アセトニトリル勾配により、
150μ／分の流速で、Ｃ−８ナロウボアカラム（13cm
×2.1mm ID）を用いた逆相HPLCによって分画した。勾配
は、（Ａ）0.06％TFA水溶液ならびに（Ｂ）水およびア
セトニトリル（1:4;v:v）に溶解した0.04％TFAを用い
た。方法は、10％Ｂを５分間、それに続き80％Ｂまでの
直線勾配を70分間、次に100％Ｂまでの直線勾配を10分
間である。HPLCプロフィール（第7A図）中のピークから
決定される断片を含む画分は、配列分析を行なうのに足
るだけの単一の成分を単離するために、同じ条件で少な
くとも１回は再クラマトグラフィーを行なう。
同様に切断された16kDおよび18kDサブユニットのHPLC
プロフィールは、第7B図と第7C図にそれぞれ示されてい
る。これらのペプチドマップが似ているということは、
このサブユニットが同一であるかまたは密接に関連して
いることを示唆している。
16kDおよび18kDのサブユニットは、EndoAsp−Ｎプロ
テイナーゼによって切断される。このタンパク質を、50
mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.8中で、0.5μｇのEndo
Asp−Ｎにより36℃、20時間処理する。分画の条件は30k
D,16kDおよび18kD分解物について既に述べた条件と同じ
である。このプロフィールは第16A図および第16B図に示
されている。
前述の方法を用いて作られた種々のペプチド断片は、
自動アミノ酸配列分析機（120AオンラインPTH分析機を
付属したアプライド・バイオシステム470A）で分析され
た。以下の配列データが得られた： （１） Ｓ−Ｆ−Ｄ−Ａ−Ｙ−Ｙ−Ｃ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｃ
−Ｑ−Ｆ−Ｐ−Ｍ−Ｐ−K; （２） Ｓ−Ｌ−Ｋ−Ｐ−Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ａ−Ｔ−Ｉ−Ｑ
−Ｓ−Ｉ−V; （３） Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｖ−Ｔ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ａ−Ｉ−Ｓ
−Ｍ−Ｌ−Ｙ−Ｌ−Ｄ−Ｅ−Ｎ−Ｅ−K; （４） Ｍ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｓ−Ｉ−Ｌ−Ｆ−Ｆ−Ｄ−Ｅ
−Ｎ−K; （５） Ｓ−Ｑ−Ｅ−Ｌ−Ｙ−Ｖ−Ｄ−Ｆ−Ｑ−R; （６） Ｆ−Ｌ−Ｈ−Ｃ−Ｑ−Ｆ−Ｓ−Ｅ−Ｒ−Ｎ−S; （７） Ｔ−Ｖ−Ｇ−Ｑ−Ｌ−Ｎ−Ｅ−Ｑ−Ｓ−Ｓ−Ｅ
−Ｐ−Ｎ−Ｉ−Y; （８） Ｌ−Ｙ−Ｄ−Ｐ−Ｍ−Ｖ−V; （９） Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｖ−Ｐ−Ｇ−Ｉ−Ｐ−Ｅ−Ｐ−Ｃ
−Ｃ−Ｖ−Ｐ−E; （10） Ｖ−Ｄ−Ｆ−Ａ−Ｄ−Ｉ−G; （11） Ｖ−Ｐ−Ｋ−Ｐ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｐ−T; （12） Ｉ−Ｎ−Ｉ−Ａ−Ｎ−Ｙ−L; （13） Ｄ−Ｎ−Ｈ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｍ−Ｆ−Ｐ−Ｉ−Ａ
−Ｉ−N; （14） Ｄ−Ｅ−Ｑ−Ｔ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ａ−Ｒ−Ｒ−Ｋ
−Ｑ−Ｗ−Ｉ−？−P; （15） Ｄ−Ｉ−Ｇ−？−Ｓ−Ｅ−Ｗ−Ｉ−Ｉ−？−P; （16） Ｓ−Ｉ−Ｖ−Ｒ−Ａ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｐ−Ｇ−Ｉ
−Ｐ−Ｅ−Ｐ−？−？−V; （17） Ｄ−？−Ｉ−Ｖ−Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｑ−Ｙ−Ｈ−Ａ
−Ｆ−Y; （18） Ｄ−Ｅ−Ｎ−Ｋ−Ｎ−Ｖ−Ｖ−Ｌ−Ｋ−Ｖ−Ｙ
−Ｐ−Ｎ−Ｍ−Ｔ−Ｖ−E; （19） Ｓ−Ｑ−Ｔ−Ｌ−Ｑ−Ｆ−Ｄ−Ｅ−Ｑ−Ｔ−Ｌ
−Ｋ−？−Ａ−Ｒ−？−Ｋ−Q; （20） Ｄ−Ｅ−Ｑ−Ｔ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ａ−Ｒ−Ｒ−Ｋ
−Ｑ−Ｗ−Ｉ−Ｅ−Ｐ−Ｒ−Ｎ−？−Ａ−Ｒ−Ｒ−Ｙ−
L; （21） Ａ−Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｑ−Ｗ−Ｉ−Ｅ−Ｐ−Ｒ−Ｎ
−？−Ａ−？−Ｒ−Ｙ−？−？−Ｖ−D;および （22） Ｒ−？−Ｑ−Ｗ−Ｉ−Ｅ−Ｐ−？−Ｎ−？−Ａ
−？−？−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｖ−Ｄ−？−Ａ−？−？−Ｇ C5. アミノ酸分析 酸化型（30kD）および還元型（16kDと18kD）BOPの試
料はゲル電気泳動し、加水分解および試料を誘導化する
ための従来の、市販されている試薬を用いたアミノ酸分
析、ならびにPico Tag（ミリポア社）システムを用いた
HPLCを行なうためにイモビロンに転写した。いくつかの
アミノ酸、特にシステインおよびイソロイシンの残基数
にいくらか変動があるものの、再現性がみられる。
得られた組成データは第５表に示されている。
＊ この結果は、ヒスチジンが低濃度で存在するため取
り入れられていない。
＊＊ システインは、標準タンパク質の過ギ酸加水分解
から通常得られる割合によって補正した。
16kDよび18kDサブユニットから得られた結果は、これ
らを合わせると無傷の30kDタンパク質から得られた数に
良く似ている。グリシンおよびセリンに対して得られた
高い数値は、ゲルから溶出した結果によくあっている。
D. ヒト骨形成タンパク質の精製 ヒト骨は、ボーン・バンク、（マサチューセッツ・ゼ
ネラル・ホスピタル、ボストン、マサチューセッツ州）
から入手し、上で開示された方法により細粉化、脱肪、
骨髄の除去および脱塩を行なった。320gの含塩骨基質か
ら70から80gの脱塩された骨基質が得られる。基質から
の拡散による抽出とエタノール沈澱により、12.5gのグ
アニジン−HCl抽出物が得られる。
エタノール沈澱物の３分の１（0.5g）が、4Mグアニジ
ン−HCl中でのゲル過に用いられる。（第10A図）。１
回の過当り、約70−80gのエタノール沈澱物を用い
る。in vivo骨誘導活性は30kDの領域にあるタンパク質
を含む画分に局在する。これを保存し、6M尿素,0.5M Na
Cl緩衝液で平衡化し、直接HAPカラムにかける；これに
結合したタンパク質は、100mMおよび500mMのリン酸を含
む同緩衝液を用いて段階的に溶出する（第10B図）。HAP
結合、非結合画分をバイオアッセイしたところ、100mM
リン酸で溶出された画分のみがin vivoでの骨誘導活性
を有することが示された。HAPクロマトグラフィーで得
られた生物学的に活性な画分は、低濃度の塩を含む緩衝
液を用いたヘパリン−セファロース・アフィニティー・
クロマトグラフィーにかける；結合したタンパク質は0.
5M NaClで溶出する（第10C図）。ヘパリンセファロース
画分をアッセイしたところ、0.5M NaClで溶出された画
分が骨−誘導活性を有することが示された。次に、この
活性画分をＣ−18逆相クロマトグラフィーにかけた（第
10D図）。
その後、この活性画分は上述したようにSDS−PAGEを
行い、実質的に純粋なヒト骨形成タンパク質からなる約
30kDのバンドを与える。
E. 無傷の骨形成タンパク質をコードする遺伝子単離の
ための生合成されたプローブ Ｅ−１ プローブのデザイン 第13図に示されている合成されたコンセンサス遺伝子
は、TGF−β遺伝子族との相同性から予想されるアミノ
酸に基づき、また、ヒトTGF−βで見つかっているヒト
コドン利用における偏りを用いて、ハイブリダイゼーシ
ョン・プローブとしてデザインされた。そして、このデ
ザインされたコンセンサス配列は、DNA合成機でつくら
れたオリゴヌクレオチドを集合させることからなる、既
存の技術を用いて構築された。
BOPから由来し、エドマン分解により配列決定された
トリプシン分解ペプチドは、以下の第６表に示されるよ
うに、ショウジョウバエDPPタンパク質の（遺伝子から
推定された）配列、アフリカツメガエルのVG1タンパク
質と高い相同性を示し、またインヒビンおよびTVF−β
とやや低い相同性を示すアミノ酸配列を与えた。
骨形成タンパク質のアミノ酸配列を決定する際に（こ
れから核酸配列を決定することが出来る）、以下の点を
考慮した： （１） 骨形成タンパク質のトリプシン分解断片のエド
マン分解によって決められたアミノ酸配列は、それが強
いシグナルを持ち：この遺伝子族のその他のものと整列
させたときに相同性あるいは保存的置換を示す限りにお
いて最も上位に置かれる； （２） 配列が４種全てのタンパク質と一致する場合
に、これは合成遺伝子配列に用いられる； （３） DPPおよびVglで一致するアミノ酸配列を用い
る； （４） VglあるいはDPPが相違しても、いずれか一方が
インヒビンあるいはTGF−βと一致する場合、この一致
したアミノ酸を選択する； （５） 全ての配列が相違する場合は、DPPの配列を第
一に選択するが、その場合、可能性としては変異を起こ
すことによりVgl配列を作製することも後の計画に含ま
れている。
これに加え、このコンセンサス配列は、ジスルフィド
結合および見かけ上の構造的相同性を保つようにデザイ
ンされている。
COPOという、はじめにデザインされた合成コンセンサ
ス遺伝子配列のひとつの目的は（第13図）、天然の遺伝
子を単離するプローブとして用いるためのものだった。
このため、このDNAは、ヒトコドン利用の偏りを用いて
デザインされた。これに代わるものとして、従来の技術
を用いて、前述の単離法にしたがって産生された骨形成
タンパク質の、アミノ酸配列のある部分をコードするよ
うな、一群のヌクレオチド配列からなるプローブが構築
されるかも知れない。こうしたプローブの集まりを用い
ることにより、無傷のタンパク質をコードするDNAを単
離することも可能であろう。
Ｅ−２ ゲノム・ライブラリーからの、骨形成タンパク
質をコードする遺伝子の検索 ラムダ・ファージ（Charon 4A）に組み込まれたヒト
・ゲノム・ライブラリー（マニアティス−ライブラリ
ー）を、COPOコンセンサス遺伝子をプローブとして用
い、検索した。はじめの検索は、500,000プラークにつ
いて行なった（それぞれ50,000プラークを10プレー
ト）。ハイブリダイゼーションシグナルを与える領域を
プレートから抜き出し、ファージ粒子を溶出し、これを
再びプレート当り2000−3000プラークの濃度で塗布し
た。２回目のハイブリダイゼーションによりプラークを
得、これをもう一度、今度は純粋なクローンが単離でき
るように、プレート当り約100プラークの濃度で塗布し
た。プローブ（COPO）は、増幅プラスミドからBamH I−
Pst I切断して得た300塩基対の断片であり、これは、フ
ァインバーグ（Feinberg）とフォーゲルシュタイン（Vo
gelstein）（1894）Anal.Biochem.137:226−267のラン
ダム・プライミング法にしたがって、α32 dCTPを用い
て標識した。プレハイブリダイゼーションは５×SSPE,1
0×デンハルト混合液,0.5％SDS中で50℃、１時間行なっ
た。ハイブリダイゼーションは上と同じ溶液にプローブ
を加えて一夜行なった。ニトロセルロース膜の洗いは、
１×SSPE,0.1％SDS中、低温で５分を１回行い、次に同
溶液中で50℃、２×30分間を２回行なった。この方法を
用いて、24個の陽性クローンが見いだされた。これまで
に全く報告のない遺伝子を含む２つはOP 1、すなわち以
下に述べる骨形成タンパク質−１と称された。そのほか
の２つは従来BMP−2bまたはBMP−２クラスIIとして知ら
れている遺伝子を、１つは従来BMP−３として知られる
遺伝子を単離した（米国特許明細書 第PCT US 87/0153
7号参照）。上記ハイブリダイゼーション条件は、本願
骨形成タンパク質をコードする遺伝子を単離するのに十
分なストリンジェンシーを有している。
従って、本願発明における「ハイブリダイゼーショ
ン」とは、24個の陽性クローンを見出すために用いられ
た上記に記載の条件のすべて、又はこれと実質的に同一
条件のすべてを満たすハイブリダイゼーションをいう。
ラムダ＃13DNAのサザン・ブロット分析により、約3kb
のBamH I断片がプローブにハイブリダイゼーションする
ことが示された（第1A図参照）。この断片は、分離さ
れ、ブルースクリプト・ベクター（のBamH Iサイト）に
サブクローニングされた。このクローンは、サザンブロ
ットおよびCOPOプローブへのハイブリダイゼーションに
よってさらに分析された。これにより、（約）1kbのEco
R I断片がこのプローブに強くハイブリダイゼーション
することが示された。この断片は、ブルースクリプト・
ベクターのEcoR Iサイトにサブクローニングされ、配列
が決定された。この配列の分析により、この断片がある
タンパク質、すなわち骨形成タンパク質−１（OP1）の
カルボキシル末端をコードする事が示された。このタン
パク質は、TGF−β族とのアミノ酸の相同性によって同
定された。この比較のために、システインパターンが用
いられ、次に隣接アミノ酸が比較された。コンセンサス
・スプライスシグナルはアミノ酸の相同性が終わったと
ころに見つかり、エクソンイントロン境界と名付けられ
た。３つのエクソンが組み合わされて、７個のシステイ
ンを含む機能を有するTGF−β−様ドメインを与えてい
る。２つのイントロンは、クンケル（Kunkel）の一本鎖
変異法を用いることにより、エクソンをまたいで、プラ
イマーを介してループ・アウトすることにより除去され
た。また、最初のシステインの上流に、EcoR Iサイトと
酸切断のためのAsp−Pro連結部位を導入し、３′末端に
は、同じ方法でPst Iサイトが加えられた。より進んだ
配列に関する情報（後ろから２番目のエクソン）は、挿
入断片の全長の配列を決定することによって得られた。
塩基配列決定は、一揃えの片方向から欠失クローンを作
製して行なった（オズカイナック（Ozkaynak）,E.,プト
ニィ（Putney）,S.（1987）Biotechniques,５:770−77
3）。この得られた配列は、OP1のTGF−β様領域の約80
％を含んでおり、第1B図に示されている。TGF−β様領
域の完全な配列は、はじめに、ラムダクローン＃13 DNA
のEcoR I切断により生ずる断片をサブクローニングし、
以前に明かとされていた配列と同様にして、TGF−β様
領域のはじめの部分（後ろから数えて３番目のエクソ
ン）を含む4kBの断片を配列決定することにより得られ
た。EcoR I−Pst I断片上の遺伝子は、酸切断部位を持
つ修飾型trp LE融合タンパク質を産生するために、trp
プロモーター−オペレーターによって調節される大腸菌
の発現ベクターに挿入された。OP1遺伝子は、天然材料
の配列中に見いだされるペプチドに実質的に一致するア
ミノ酸をコードしている。その活性領域と信じられる部
分の配列は、以下に示されている。
更に長い活性を有する配列は： コンセンサスプローブを用いて検索されてきた、その
他の３種の無傷の遺伝子がコードする、活性領域と信じ
られる部分のアミノ酸配列は： Ｅ−３ cDNAライブラリーの探査 無傷のタンパク質をコードするDNAの単離が可能なプ
ローブ群を利用するもう１つの例は、以下に示されてい
る。タンパク質を発現することが知られている細胞（例
えば、骨芽細胞あるいは骨肉腫）は、全細胞質RNAを単
離するために抽出された。mRNAを単離するために、オリ
ゴ−dTカラムを用いることが出来る。このmRNAは例えば
ゲル電気泳動によってサイズ分画することが出来る。目
的のmRNAを含む画分は、適当な宿主細胞中で一時的に発
現を誘導し、例えばイムノアッセイにおいては、骨形成
タンパク質のトリプシン分解断片由来のペプチドに対す
る抗体を用いて、骨形成タンパク質の存在を検定するこ
とによって決定できるだろう。次に、mRNA画分は、逆転
写酵素を用いて、単鎖cDNAへと逆転写される；そして、
もう一方の相補的DNA鎖は、cDNAを鋳型として合成する
ことが出来る。その後、２本鎖DNAは、細菌を形質転換
してcDNAライブラリーを生産するために用いるベクター
にライゲーションされる。
骨形成タンパク質の既知のアミノ酸配列に対するコド
ンに相補的な、放射性標識をしたコンセンサス配列、そ
の一部、あるいは合成デオキシオリゴヌクレオチドは、
標準的なDNA−DNAハイブリダイゼーション法を用いて、
cDNAライブラリーのどのDNAが全長の骨形成タンパク質
をコードしているかを固定するために用いられるだろ
う。
このcDNAは、次に、発現ベクターに組み込まれ、タン
パク質発現のために適当な宿主細胞に導入されるだろ
う。原核細胞が骨形成タンパク質に糖鎖を修飾すること
が出来ないことにより、このタンパク質の酵素活性が影
響を受けないため、宿主は、原核細胞でも真核細胞でも
可能である。有用な宿主細胞には、サッカロミセス、大
腸菌、および種々の哺乳動物培養細胞が含まれる。ベク
ターは、そのうえにタンパク質の分泌のための種々のシ
グナル配列をコードしたり、また、骨形成タンパク質を
融合タンパク質としてコードする事もできる。翻訳後、
タンパク質は細胞から精製あるいは培養液から回収する
ことが出来る。
E4. 遺伝子の調製 上述のようにして回収された天然の遺伝子の配列およ
びcDNAは、発現に用いることができる。上述の遺伝子
は、また、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを集
合させることにより生産され得る。15−100merのオリゴ
ヌクレオチドは、バイオサーチDNAモデル8600合成機で
合成され、トリス−ほう酸−EDTA緩衝液（TBE）中での
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）により精製で
きる。つぎに、このDNAは、ゲルから電気溶出する。重
複するオリゴマーは、T4ポリヌクレオチドキナーゼによ
りリン酸化し、PAGEにより精製可能なより大きな断片に
ライゲーションされることが出来る。
E5. 発現 この遺伝子は、大腸菌の種々の株といった適当な原核
細胞宿主あるいは、枯草菌、酵母、およびCHOや骨髄腫
などの様々な動物細胞において発現可能である。一般
に、発現は多くの細胞型および当業者によく知られた発
現系を用いて行なわれる。例えば、この遺伝子が大腸菌
中で発現される場合、pBR322に基づき、合成のtrpプロ
モーター−オペレーター、および修飾型trpLEリーダー
を含む発現ベクターを用いることができる。このベクタ
ーは、EcoR IおよびPst I制限酵素切断部位で開裂する
事ができ、また、例えばOP遺伝子断片をこの２つの部位
の間に挿入することが出来る。このOPタンパク質は、As
p−Proという配列を持つヒンジ部位を介してリーダータ
ンパク質に連結される。このヒンジにより、融合タンパ
ク質をAsp−Pro部位で希酸により化学的に開裂する事が
可能となる。
E6. 活性タンパク質の生産 以下の方法は、活性型の組換え体タンパク質を生産す
るために用いられるだろう。融合タンパク質を含む大腸
菌細胞を溶菌する。融合タンパク質は、分画溶解法によ
って精製される。切断は希酸によって行い、その結果生
じた切断産物は、切断されたタンパク質を分離するため
に、セファクリル−200HRあるいはSPトリスアシルカラ
ムに通す。還元されたOP画分を次にセミ−プレップＣ−
18カラムを用いてHPLCにかける。
OPに再び折りたたみ構造をとらせる条件は、50mM Tri
s−HClおよび6M Gu−HClを用いた、pH8.0におけるもの
である。試料は、４℃に18時間おくことにより、再び織
りたたみ構造をとらせた。
これらの方法は、前述したアミノ酸配列（長い方の分
子種）を持つOP1と呼ばれる活性型タンパク質を大腸菌
中で発現するために用いられてきた。
もし、タンパク質が動物細胞中で発現される場合、再
折りたたみ化は必要とされないだろう。
マトリックスの調製 A. マトリックスの性質に関する一般的な考察 後にバイオアッセイの節でのべられるキャリアーは、
生物学的に分解可能な合成のマトリックスあるいは、合
成した無機のマトリックス（例えば、HAP、コラーゲ
ン、リン酸三カルシウムあるいはポリ乳酸、ポリグリコ
ール酸、ならびに種々の共重合物）いずれかに置き換え
ることができる。もし、以下に伸べられるように前処理
を行なえば、異種移植骨も用いることができる。
表面の電荷、粒子サイズ、無機塩の存在およびマトリ
ックスと骨形成タンパク質を組み合わせるための方法論
など全てが、骨誘導をうまく行なうために、ある役割を
果たしていることが、研究により示されている。化学的
修飾により電荷を乱してやると、誘導応答が失われる。
粒子のサイズは、新しい骨の定量的応答に影響を与え
る;75から420μｍの間の粒子は、最大の応答を引き出
す。マトリックスが骨の無機塩で汚染されると、骨形成
が阻害されるだろう。最も大事なことは、マトリックス
上に骨形成タンパク質を配列するために用いられる方法
が、骨形成タンパク質およびマトリックス両者の物理
的、化学的状態に極めて感受性であることである。
骨マトリックス/OP移植の接触面における逐次的な細
胞反応は複雑である。多段階カスケードは、以下のもの
を含む：移植されたマトリックスへのフィブリンおよび
フィブロネクチンの結合、細胞の化学走性、繊維芽細胞
の増殖、軟骨芽細胞への分化、軟骨形成、血管の侵入、
骨形成、再編成および骨髄の分化。
骨形成タンパク質に対しうまく作用するキャリアー
は、いくつかの重要な機能を果たさなければならない。
キャリアーは、骨形成タンパク質に結合し、スロー・リ
リース・デリバリー・システム（slow release deliver
y system）として働き、骨の発達途上での各段階の細胞
応答を調節し、骨形成タンパク質を非特異的分解から保
護しなくてはならない。それに加え、選択された材料
は、in vivoで生物学的に適合可能でかつ生物学的に分
解されることができなければならない；キャリアーは、
新しい骨によって完全に置換されるまで、一時的な骨格
として機能しなければならない。生物学的な適合性は、
マトリックスが移植された際に顕著な炎症を誘起せず、
宿主動物に拒絶されないことが求められる。生物学的に
分解されるためには、マトリックスが新しい骨または軟
骨の発達途上で、宿主の体によって緩やかに吸収される
ことが必要である。ポリ乳酸（PLA）、ポリグリコール
酸（PGA）および種々の組合せは、in vivoで様々な溶解
速度を有している。骨の場合、溶解速度は移植が、皮膚
骨あるいは結締組織繊維骨で行なわれたかに大きく依存
している。
マトリックスの結合構造、粒子のサイズ、表面電荷の
存在、細胞の侵入を許すのに充分なサイズの粒子間の孔
および隙間の存在などは、全て有効なマトリックスとし
て機能するために重要でアる。マトリックスを新たな骨
に望まれる形に整形し、癒合不能を補う容積を持つこと
が好ましい。ラットにおける研究により、新しい骨は、
本質的には移植されたデバイスの容積を有したまま形成
されることが示されている。
マトリックスは、ゆるく付着する微粒子状の材料、例
えばコラーゲンから作られた、形状の維持する固体から
なるだろう。マトリックスはまた、鋳造された多孔性の
固体、あるいは単に、周囲の組織によって適切に保持さ
れた密に詰められた粒子の凝固物から成るかもしれな
い。粉砕した筋肉あるいはその他の組織も用いられるだ
ろう。大きな同種骨の移植は、その骨髄腔が浄化され、
粒子が充填され、骨形成タンパク質を散布しておけば、
マトリックスの担体として働き得る。
B. 生物学的に活性のある同種マトリックスの調製 無機塩を除いた骨マトリックスは、ここで述べるよう
に420μの過膜を通る骨粒子を生産するために、ラッ
ト大腿骨あるいは頚骨の脱水した骨幹から調製された。
この骨粒子を4Mのグアニジン−HClを用いた分離抽出に
かける。こうした処理により、骨マトリックスが軟骨分
化を誘導するもともとの能力が完全に失われる。残った
不溶性の物質がマトリックスを作り上げるために用いら
れる。この物質は、ほとんどがコラーゲンそのものであ
り、移植した際に、軟骨および骨を誘導することはな
い。全ての新しい標品は、使用前にその無機塩の含量と
偽陽性について検定される。骨マトリックスの生物活性
の全体的損失は、活性のある骨形成タンパク質画分ある
いは純粋なタンパク質を生物学的に不活性な不溶性のコ
ラーゲンマトリックスとともに再構成した際に回復す
る。骨形成タンパク質はいかなる脊椎動物、例えば、ウ
シ、ブタ、サルあるいはヒトから得ることができ、また
あるいは、組換え体DNA技術を用いて生産することもで
きる。
C. 異種移植において用いる、糖鎖を除いた骨マトリッ
クスの調製 骨形成タンパク質が他の種由来のコラーゲン性骨マト
リックスと再構成され、ラットに移植されると、骨は全
く形成されない。このことは、骨形成タンパク質が異種
性である（種特異的でない）が、一方マトリックスは種
特異的であり、おそらく本来の免疫原あるいは阻害成分
のために、種間の移植はできないことを示唆している。
したがって、これまで、骨に起因するマトリックスに対
しては、骨形成タンパク質がその骨誘導活性を完全に発
揮するために種特異的コラーゲン性骨マトリックスが必
要とされた。
全ての骨マトリックスの主成分は、Ｉ型コラーゲンで
ある。コラーゲンに加え、抽出された骨は、その容積の
５％をしめる非コラーゲンタンパク質を含んでいる。骨
マトリックスの多くの非コラーゲン成分は糖タンパク質
である。骨形成における糖タンパク質の生物学的な特徴
は知られていないが、その炭水化物含量のためにそれ自
身が強力な抗原性を示し、異種マトリックス中に存在す
る免疫原あるいは阻害成分を構成するだろう。
現在、もしはじめにマトリックスから免疫原および阻
害成分を除いてやれば、コラーゲン性骨マトリックス
は、異種移植において骨誘導活性に効果を及ぼすための
キャリアーとして用い得ることが見つかっている。この
マトリックスは、この目的を果たすために、例えばフッ
化水素を用いて化学的に糖鎖を除いてある。
上述のようにして調製されたウシ骨の残さをふるい分
けし、74−420μｍの粒子を回収する。この試料をP2O5
にのせ真空中で乾燥し、反応容器に移し、次に無水フッ
化水素（HF）（マトリックス1g当り10−20ml）を−70℃
でこの試料上にしたたらせる。反応容器の温度を０℃ま
で上昇させ、反応混合液をこの温度で120分間撹拌す
る。真空でHFを蒸発させた後、残留した酸を除くため
に、残さをKOHのペレット上において真空で完全に乾燥
させる。
どの程度糖鎖が除けたかは、共有結合していない炭水
化物を除去するために、試料を適当に洗った後、HF処理
の前と後で分取したマトリックス試料の炭水化物を分析
することから決定できる。
次に、糖鎖を除去した骨マトリックスについて、以下
に示した処理を行なう。
１）1g/200mlとなるようにTBS（Tris緩衝生理食塩水）
中に懸濁し、４℃で２時間撹拌する、あるいは6M尿素,5
0mM Tris−HCl,500mM NaCl,pH7.0（UTBS）に懸濁し、室
温で30分間撹拌する； ２）遠心し、段階１）と同様に、TBSあるいはUTBSで洗
う；そして、 ３）遠心；上清を棄却；残さを水で洗い；凍結乾燥す
る。
骨形成デバイスの組み立て 前に示したマトリックスと上述の骨形成タンパク質の
いずれかを用いた骨形成デバイスの組み立ては、以下の
ように行なうことができる。
A. エタノール沈澱 本方法において、マトリックス、グアニジン−HCl中
の骨形成タンパク質に添加された。試料は低温でボルテ
ックスにかけインキュベートした。次に、試料を鎖らに
ボルテックスにかけた。冷エタノールをこの混合液に加
え、これを撹拌してインキュベートした。遠心後（高速
遠心）、上清を棄却した。再構成されたマトリックス
は、水を加えた冷した濃エタノールで洗い、凍結乾燥し
た。
B. アセトニトリル・トリフルオロ酢酸凍結乾燥 本法において、アセトニトリル・トリフルオロ酢酸
（ACN/TFA）溶液中の骨形成タンパク質は、キャリアー
に添加された。試料は、数回激しくボルテックスにか
け、凍結乾燥した。
C. 尿素凍結乾燥 尿素緩衝液で調製されたこれらのタンパク質について
は、タンパク質をマトリックスと混合し、数回ボルテッ
クスし、次に凍結乾燥した。この凍結乾燥した材料は、
移植に「そのままで」用いることができる。
IN VIVOラット・バイオアッセイ 実質的に純粋なBOP、前出の性質を有するタンパク質
を含むBOPの豊富な抽出物および、組換え体タンパク質
のいくつかは、骨形成デバイスを生産するためにマトリ
ックスに取り込まれ、ラット内で軟骨についてアッセイ
された。ラットにおける研究は、骨形成効果は、骨形成
デバイス中に散布された骨形成タンパク質の投与量に依
存していることを示している。マトリックスのみが移植
されると、活性は全く観察されない。以下は、ここで開
示される骨形成デバイスが本発明の単離法に用いられた
とき、骨形成タンパク質の活性画分を決定するためにア
ッセイする方法、またタンパク質の構成および、生物学
的活性についてマトリックスを評価する方法について指
針を示している。
A. 皮下移植 サンパス（Sampath）とレディ（Raddi）（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA（1983）80:6591−6595）によって述べら
れている骨誘導のバイオアッセイは、参考文献に加えら
れているが、軟骨の分化活性の精製プロトコルを監視す
るために用いる。このアッセイは、エーテル麻酔をした
同種の受容体ラットの皮下部位に検定試料を移植するこ
とから成っている。28−32日齢の雄のロング−エバンス
ラットが用いられた。胸郭域上の皮膚に無菌状態で縦方
向の切開（1cm）を行ない、切開腔をブラントな切開に
よって作成した。約25mgの検定試料をこの切開腔深くに
移植し、切開腔を金属のスキンクリップで閉じた。移植
を行なった日を実験日とした。移植片は12日目に除去し
た。異型部位は、同型部位を用いて得られる結果で予想
される不明瞭さなしに骨誘導の研究を可能とする。
B. 細胞における事象 ラットにおける移植のモデルは、以下の点を含むマト
リックスによって誘導される軟骨発達段階を通して、調
節された進行の様子を示している：（１）第１日目で
は、多形核白血球による一次的な侵入が起き；（２）第
２、第３日目では、間葉細胞の移植と増殖が起き；
（３）第５、第６日目は、軟骨細胞が出現し；（４）第
７日目には軟骨組織マトリックス形成が起き；（５）第
８日には、カルシウムの沈着が起き；（６）第９、第10
日目には、血管の侵入、骨芽細胞が出現し、新骨が形成
され；（７）第12日から第18日では、骨芽細胞と骨の再
構成と、移植されたマトリックスの溶解が起き；（８）
第21日には、小骨において造血性骨髄の分化が起きる。
この結果は、新たな骨の形は、移植したマトリックスの
形に準ずることを示している。
C. 組織学的評価 組織切片および染色は、移植片において骨形成の程度
を決めるために好ましいものである。移植片はボインス
（Bouins）液で固定し、パラフィルムに包埋し、６−8m
mの切片に切る。トルイジン・ブルーあるいはヘモトキ
シリン／エオシンを用いた染色により、軟骨の最終的な
発達が明確に示される。通常、20日経た移植片であれ
ば、移植片が骨誘導活性を示すか否かを決めるには充分
である。
D. 生物学的マーカー 骨形成のマーカーとしては、アルカリ性ホスファター
ゼ活性を用いることができる。この酵素の活性は、移植
片をホモジナイズした後、分光学的に決定することがで
きる。活性は、in vivoで、第９−10日においてピーク
を示し、その後緩やかに減少する。組織学的に全く骨の
発達を示さない移植片は、これらのアッセイ条件下で殆
どあるいは全くアルカリ性ホスファターゼ活性を持たな
い。このアッセイは定量化ならびに、ラットから移植片
を除去した後、非常に速やかに骨形成の推定値を得るた
めに有用である。もつ１つの方法として、骨形成の量
は、移植片のカルシウム含量を測定することによって決
めることができる。
商業規模で生産することができる系統化を求めて、最
も有効な投与量／純度レベルを決定するために、いくつ
かの程度の純度を持った骨形成タンパク質を含む移植片
を用いて試験を行なった。結果は、アルカリ性ホスファ
ターゼの比活性、カルシウム含量および組織学的検定に
よって測定する。前述したように、アルカリ性ホスファ
ターゼの比活性は骨形成のはじめに上昇し、次いで減少
する。一方、カルシウム含量は、形成された骨の総量に
直接比例している。骨形成タンパク質による骨形成活性
は、「骨形成単位」によって表わされる。例えば、１骨
形成単位は、ラットの無機塩を除いた骨マトリックスを
対照とし、第12日の移植片のカルシウム含量によって決
定される値と比較したとき、その最大値の半分の骨形成
活性に必要とされるタンパク質量を表わしている。
E. 結果 投与量曲線は、種々のタンパク質の濃度をアッセイす
ることにより、精製系の多段階におけるin vivoでの骨
誘導活性について構築されている。第11図は、アルカリ
性ホスファターゼによって決められた場合の、ラットに
おける代表的な投与量曲線を示している。同様な結果
は、骨形成単位として表わした場合にも得られる。約10
−12μｇのTSK−画分、３−４μｇのヘパリン−セファ
ロース−II画分、0.4−0.5μｇのＣ−18カラム精製画分
および20−25ngのゲルから溶出された高度に精製された
30kDタンパク質が、明確な骨形成（最大活性の半分）の
ために必要とされる。通常、移植片25mg当り20−25ngの
実質的に純粋なタンパク質があれば、軟骨内骨を生産す
るためには充分である。したがって、さらに多くの投与
量を用いることもあるが、移植片1mgあたり１−2ngの骨
形成タンパク質を用いるのが妥当な投与量である。（骨
形成タンパク質の比活性に関するIB5の節を参照のこ
と。） 上に示したようにして発現されたOP1（長い方のも
の）は、組織学的に活性をアッセイした場合、移植片の
多くの領域において無数の軟骨細胞が存在すること、な
らびに、新たなマトリックスを形成している血管上皮を
囲んで骨芽細胞が存在することによって示されるよう
に、軟骨および骨形成を誘導した。
糖鎖を除去した異種コラーゲン性骨マトリックス
（例：ウシ）は、骨形成装置を調製するために同種異型
コラーゲン性骨マトリックスの代わりに用いられ、in v
ivoにおける骨誘導活性について、ラット内でバイオア
ッセイされている。この結果は、化学的に糖鎖を除いた
異種のコラーゲン性骨マトリックスが、軟骨内骨形成を
よく誘導することを示している（第19図）。アルカリ性
ホスファターゼの比活性によって示されるように、糖鎖
を除去した異種マトリックスは骨を誘導するが、一方、
未処理のウシ・マトリックスは誘導しないことは明かで
ある。
移植片の組織学的評価は、糖鎖を除いたウシ・マトリ
ックスは、ラットの残さマトリックスと一致した方法で
骨を誘導するだけでなく、軟骨の分化に関わる発達段階
を推進することも示唆している。ラットの残さを対照と
して比較すると、HF処理したウシ・マトリックスは、広
範囲に再構成した骨を含んでいる。骨髄成分で既に満た
された小骨は、第12日までに形成される。この、支持骨
誘導において、糖鎖を除いたウシ・マトリックスによっ
て刺激されるような深部の働きは、再現性があり、また
骨形成タンパク質の様々な濃度について投与量依存性が
ある。
動物に対する効能に関する研究 ウシ骨（BOP）由来の、実質的に純粋な骨形成タンパ
ク質や、上述の性質を持つBOPが多く含まれる骨形成画
分、ならびにいくつかの組換え体タンパク質は、マトリ
ックスに取り込まれ、骨形成デバイスを産じている。こ
れらのデバイスの骨誘導能の効果は、ネコおよびウサギ
標体で試験され、強力な骨形成誘導物であり、最終的に
無機塩を含んだ骨を形成する事がわかっている。以下
は、ここで開示された骨形成デバイスが臨床的なデバイ
スにおいてどの様に用いられるかに関する指針を示して
いる。
A. ネコを用いたモデル この研究の目的は、本発明の骨形成デバイスを試験す
るために、大動物への効果を見るモデルを確立し、大き
な骨の欠損の修復を明らかにし、整形外科手術患者でし
ばしば遭遇する骨折の非癒合を模擬実験するためのもの
である。この研究は、大哺乳動物モデルを用いることに
より、キャリアーを持つ骨形成タンパク質の移植が、損
傷あるいは再構成を行なう手術に続く骨の再生を、促進
できるか否かを評価するためにデザインされている。こ
の研究デザインの第一段階は、それ以上の介在物なし
に、刺激された骨折の非癒合に着実に進んでいくであろ
う大腿骨の骨切術による欠損を外科的に準備することか
らなる。創生された骨への骨形成デバイスの移植の効果
は、以下の研究プロトコルによって評価された。
Ａ−1. 方法 1bs以下の16匹の成長したネコに対し、側部の外科的
アプローチを通して、右の大腿骨において1cmの骨を片
側だけ欠損させた。他の実験では、2cmの骨欠損が作製
された。大腿は、欠損の正確な広がりを維持するため
に、８−穴のプレートを側面におくことにより、即座に
その内部が満たされた。外科的に作られたネコの大腿骨
の欠損部に移植された物質には３つの種類があり：グル
ープＩ（ｎ＝３）は、4Mグアニジン−HCl処理した（不
活性型の）ネコ脱無機塩型骨マトリックス粉（Gu−HCl
−DBM）（360mg）の移植と同じプレート固定を受ける対
照グループで；グループII（ｎ＝３）は、生物学的に活
性のあるネコ脱無機塩型骨マトリックス粉（DBM）（360
mg）を移植した陽性対照グループであり；グループIII
（ｎ＝10）は、Gu−HCl−DBMキャリアー試料の各々に骨
形成タンパク質を添加して、グループＩ−IIと同様な方
法を行なったものである。要約すると、グループIIIの
骨形成タンパク質で処理した動物は、グループＩの動物
と厳密に同じだが、骨形成タンパク質のみをただ１つよ
けいに加えた物質を移植された。
全ての動物は、術後カゴの中を任意に移動することが
許されている。いずれのネコも骨を標識するために、テ
トラサイクリンを注射されている（各週25mg/kg SQずつ
４週間）。グループIIIの４匹以外、全ての動物は大腿
骨の骨切除後４ケ月後に屠殺された。
Ａ−2. 放射体型測定 in vivoの放射体型測定は、大腿および骨切除部位の
正しい前部−後部像を一定に生ずるようにデザインされ
た軟Ｘ線ジグに置かれた、軽く麻酔をかけた動物の標準
化したＸ線像を手術直後、４、８、12および16週目にと
ることにより行なわれる。全てのＸ線像は、厳密に同じ
様式で、また厳密に各々の動物の同じ位置についてとら
れている。骨修復は、任意の点における分析により、無
機塩の蓄積量の関数として計算される。切り出された骨
に関する最終標本のラジオグラフィー分析は、屠殺後、
２断面について行なわれる。Ｘ線分析の結果は第12図に
示されており、骨損失の修復率として置換されている。
要約すると、第16週では、グループIIIの大腿骨の60％
が平均86％の骨欠損再生率で癒合している。これとは対
照的に、グループＩのGU−HCl−DMBを用いた陰性−対照
移植は、第４週で全く骨の成育がみられず、第８週およ
び第12週でも10％以下で、第16週でも16％（±10％）
で、５匹のうち１匹が少量の架橋された骨を示している
だけであった。グループIIのDMB陽性−対照移植は、第
４週で18％（±３％）の修復を示し、第８週では35％、
第８週では35％、第12週では50％（±10％）、第16週で
は70％（±12％）を示し、全ての月における骨形成タン
パク質に対しｐ〈0.01の統計的差異を示した。３匹のう
ち１匹（33％）は第16週で癒合している。
Ａ−3. 生体力学 切り出された検定試料および正常型の大腿骨は、直ち
に骨密度計による研究を行ない、整理食塩水で湿らせた
２枚のタオルに包み、２枚の密封したプラスチック・バ
ッグに入れ、後に研究するまで−20℃で保存した。骨修
復強度および破断実験は、骨強度、硬度および破断する
ためのエネルギー吸収および変形を定量化するためのイ
ンストロン（Instron）試験機に連結した、特別にデザ
インした金属性の４−ポイントの屈折ジグ上で破断させ
ることによって行なった。検定試料の大腿骨および正常
型の大腿骨に関する研究では、骨強度（ロード）はポン
ドで、破断力はジュールで得られる。正常型の大腿骨は
96（±12％）ポンドの強度を示す。骨形成タンパク質−
移植を行なった大腿骨は35（±４）ポンドだが、骨折部
位の表面域（骨欠損修復でみられる「砂時計」型によ
る）に対する補正を行なうこと、この値は正常骨の強度
と密接に相関した。一次元的な骨標本のみが25ポンドの
強度検定に使用できたが、この場合も、骨折表面域につ
いて補正をすると正常型骨と密接な相関を示した。
Ａ−4. 組織体型測定／組織学 生体力学的検定に続いて、骨は、直ちに骨折部位にお
いて縦方向に２枚の切片を切り、重量測定および体積測
定を行なった。半分を蛍光塗料の取り込み評価による、
標準的なカルシウム沈着骨の組織体型測定のために固定
し、もう半分を脱カルシウム化したヘモトキシリン／エ
オシン染料を用いた組織学的調製のために固定した。
Ａ−5. 生化学 骨修復部位（ｎ＝６）から選ばれた標本を、冷却した
0.15M NaCl,3mM NaHCO3,pH9.0中で、スペックス・フリ
ーザー・ミル（Spex freezeer mill）を用いてホモジナ
イズした。つぎに、上清のアルカリ性ホスファターゼ活
性および、沈澱物の酸可溶性画分の全カルシウム含量を
測定した。
Ａ−6. 組織病理学 研究されたすべての動物の検死において書き留められ
た最終的な検死報告は、何ら異常あるいは病理学的な発
見も明らかにしていない。全ての主要な臓器の一部は、
今後の研究のために保存されている。組織病理学的評価
は、以下の臓器の試料について行なった：心臓、肺、肝
臓、両方の腎臓、すい臓、両方の副腎、リンパ節、（実
験で用いた大腿骨の欠損部位に隣接した）左右の大腿骨
中部の大腿四頭筋。異常な病変あるいは病理学的な病変
はいずれの組織においても見られなかった。大体四頭筋
で見られた軽い病変は、欠損部位における外科的操作に
対する治癒反応にあたる。肺浮腫は、安楽死に起因する
ものである。なんらかの一般的な全身性の効果あるい
は、検定した特定の臓器についてなんらかの影響を与え
ているという証拠は一切ない。
Ａ−7. ネコにおける研究の要約 1cmおよび2cmの大腿骨を欠損したネコについての研究
から、配置された骨形成タンパク質を含むマトリックス
からなるデバイスが： （１）大動物において体重を支える骨の欠損を修復でき
る； （２）移植後短時間で（２週間以内）一貫して骨形成を
誘導できる； （３）軟骨の骨化により、体積当り正常骨に等しい強度
を持つ骨を誘導できることを示している。
さらに、全ての動物は、実験期間中健康であり、移植
されたデバイスに対し、臨床的あるいは組織学的反応を
起こした証拠を示さなかった。この骨欠損モデルにおい
て、対照骨を移植した部位においては殆ど治癒がみられ
なかったかあるいは全く治癒がみられなかった。この結
果は、骨形成デバイスを大きな、非癒合骨欠損の修復に
うまく利用することができるという証拠を与えている。
B. ウサギを用いたモデル B1. 方法と結果 本研究の目的は、対照動物において僅かなあるいは全
く骨の成長がなく、その結果、骨誘導が検定される場
合、強力に誘導できる物質しか陽性の結果を得ることが
できないというモデルを確立するためである。骨形成デ
バイスを移植したあるいは移植しない、1.5cmの欠損を
ウサギの尺骨に作製する。
Ｘ線分析により報告されている骨端閉鎖を有する、８
羽（10lbs以上）のニュージランド白ウサギが研究され
た。これら８羽の動物（１週および２週で１羽ずつ屠殺
された）のうち、11の尺骨欠損体について８週間の研究
全工程を行なった。いずれの場合（ｎ＝７）も、骨膜の
切除に続いて移植を受けない動物は、８週間の間はＸ線
写真上で癒合は形成されない。移植を受けない動物はい
ずれも、第４週にみられる周辺の骨から成育してくる骨
の薄い「殻」を発達させ、第８週までには、僅かながら
さらに発達する。全ての場合（ｎ＝４）において、第８
週までには、骨形成タンパク質を移植した動物において
顕著な骨誘導をともなうＸ線写真上の癒合が確立されて
いる。移植していない場合の修復とは反対に、この骨修
復は、除去された骨の部位で起きている。
放射体型測定分析により、第８週で屠殺した、90％の
骨形成タンパク質移植骨が修復され、18％の非移植骨が
修復されたことを明らかにしている。検死では、骨形成
タンパク質骨は正常に見えるが、一方「移植していな
い」骨部位には軟骨の繊維状組織がみられ、欠損部位に
おける軟骨あるいは骨修復の証拠はない。
Ｂ−2. 同種異型移植デバイス もう１つの実験において、1.5cmの尺骨欠損の骨髄孔
は、活性化された骨形成タンパク質ウサギ骨粉で埋めら
れており、この骨は、挿入の様式をとって同種異型移植
される。２つの対照尺骨は、第８週までは治癒されず、
古典的な「ぞうげ質」が出現する。これとは対照的に、
骨形成タンパク質処理した移植片は第４週までにはＸ線
写真上で「消失」し、第６週から第８週までの再度の無
機塩の蓄積が開始する。この同種異型移植片は、第８週
までにその各々の末端に弱い増殖性の骨形成をともなう
治癒を受ける。
このタイプのデバイスは、同種異型移植片の修復を促
進するために役立つ。
Ｂ−3. 要約 これらの、成熟したウサギの尺骨における、1.5cmの
骨膜欠損に関する研究は： （１）これが、骨の成長の研究に適当なモデルであり； （２）「移植を受けていない」あるいはGu−HCl陰性対
照である移植片は、少量の骨膜型骨を生ずるが、随質あ
るいは皮質骨の生育は起こさず； （３）骨形成タンパク質移植ウサギは対照グループとは
非常に異なる様式の増殖性骨増殖を示し； （４）はじめの研究から、外科的に欠損を作った後わず
か８週間で、この骨は正常骨の50％の強度を示し（体積
比では、正常の100％）； （５）骨形成タンパク質−同種異型移植片の研究によ
り、同種異型移植及び骨治癒両者に顕著な効果を示す。
ことを明らかにした。
本発明は、その性質あるいは基本的な特徴から離れる
ことなく、その他の特異的な態様をとることができる。
したがって、この態様は、全てにおいて前述の説明によ
るよりもむしろ、添付の請求の範囲によって示されてい
る本発明の範囲の説明を行なうものであって、制限を加
えるものとして考えられるべきではなく、そのため、請
求の範囲と同等の意味あるいは範囲に含まれる全ての変
更は、ここに包含されることを意図している。
請求の範囲は：
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＪ (72)発明者 ルエガー，デーヴィッド・シー アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02132，ウエスト・ロックスバリー，エ ッジミア・ロード 150，アパートメン ト ４ (72)発明者 オズカイナク，エンジン アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01757，ミルフォード，パーデュー・ド ライブ 44 (56)参考文献 国際公開88／205（ＷＯ，Ａ)

Claims (22)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】骨形成タンパク質であって、一対のポリペ
    プチド鎖が非還元状態において結合し、マトリックス中
    に配置されて哺乳動物に移植された際に該一対のポリペ
    プチド鎖が軟骨内骨形成を誘導し得る構造を有する二量
    体を形成する、骨形成タンパク質：ここで該タンパク質
    は、グリコシル化形態であり、該蛋白質の一対のポリペ
    プチド鎖の少なくとも一つが、 （ａ）以下の群から選択されるアミノ酸配列： および、 あるいは （ｂ）以下のヌクレオチド配列でコードされるアミノ酸
    配列： を含む、骨形成タンパク質。
  2. 【請求項２】前記骨形成タンパク質が、SDS−ゲル電気
    泳動で測定したときに、約30KDの分子量を有する、請求
    項１に記載の骨形成タンパク質。
  3. 【請求項３】骨形成タンパク質であって、一対のポリペ
    プチド鎖が非還元状態において結合して、マトリックス
    中に配置されて哺乳動物に移植された際に該一対のポリ
    ペプチド鎖が軟骨内骨形成を誘導し得る構造を有する二
    量体を形成する骨形成タンパク質：ここで該タンパク質
    は、非グリコシル化形態であり、該蛋白質の一対のポリ
    ペプチド鎖の少なくとも一つが、 （ａ）以下の群から選択されるアミノ酸配列： および、 あるいは （ｂ）以下のヌクレオチド配列でコードされるアミノ酸
    配列； を含む、骨形成タンパク質。
  4. 【請求項４】前記骨形成タンパク質が、SDS−ゲル電気
    泳動で測定したときに、約27KDの分子量を有する、請求
    項３に記載の骨形成タンパク質。
  5. 【請求項５】前記骨形成タンパク質が、1mg移植あたり
    約1.0〜2.0ngの、２分の１最大値骨形成活性を有する、
    請求項１ないし４いずれかに記載の骨形成タンパク質。
  6. 【請求項６】両方のポリペプチド鎖が、 （ａ）以下の群から選択されるアミノ酸配列： および、 あるいは （ｂ）以下のヌクレオチド配列でコードされるアミノ酸
    配列； 含む、請求項１ないし５いずれかに記載の骨形成タンパ
    ク質。
  7. 【請求項７】骨から単離され得、哺乳動物において軟骨
    形成および軟骨内骨形成を誘導し得る二量体の骨形成タ
    ンパク質であって、該タンパク質は一対のジスルフィド
    結合したポリペプチド鎖を有し、そして、以下のヌクレ
    オチド配列： を有するプローブとのハイブリダイゼーションにより回
    収されるDNA配列によりコードされるアミノ酸配列を含
    む、骨形成タンパク質。
  8. 【請求項８】前記骨形成タンパク質が、1mg移植あたり
    約1.0〜2.0ngの、２分の１最大値骨形成活性を有する、
    請求項７に記載の骨形成タンパク質。
  9. 【請求項９】前記タンパク質が、アミノ酸配列VPKPCCAP
    Tを含む、請求項７に記載の骨形成タンパク質。
  10. 【請求項１０】軟骨内骨形成を誘導する組成物であっ
    て、該組成物は、１またはそれ以上の骨形成タンパク質
    を含有し、該骨形成タンパク質は、一対のポリペプチド
    鎖が非還元状態において結合して、マトリックス中に配
    置されて哺乳動物に移植された際に該一対のポリペプチ
    ド鎖が軟骨内骨形成を誘導し得る構造を有する二量体を
    形成する骨形成タンパク質であり、：ここで該蛋白質の
    一対のポリペプチド鎖の少なくとも一つが、 以下のアミノ酸配列： または （ｂ）以下のヌクレオチド配列でコードされるアミノ酸
    配列： を含む組成物。
  11. 【請求項１１】少なくとも一つのポリペプチド鎖が、 （ａ）以下の群から選択されるアミノ酸配列： および、 （ｂ）骨から単離され得、そして以下のヌクレオチド配
    列： を有するプローブとのハイブリダイゼーションにより回
    収されるDNA配列によりコードされるアミノ酸配列； あるいは、 （ｃ）アミノ酸配列VPKPCCAPT; を含む、請求項10に記載の組成物。
  12. 【請求項１２】該１またはそれ以上のタンパク質の一対
    のポリペプチド鎖がヘテロダイマーである、請求項10ま
    たは11に記載の組成物。
  13. 【請求項１３】前記ポリペプチド鎖の一方がアミノ酸配
    列ACCVPTELSAISMLYLDENEKを含む、請求項10ないし12い
    ずれかの項に記載の組成物。
  14. 【請求項１４】前記組成物が、1mg移植あたり約1.0〜2.
    0ngの、２分の１最大値骨形成活性を有する、請求項10
    から13いずれかの項に記載の組成物。
  15. 【請求項１５】前記骨形成タンパク質の少なくとも１種
    が、アミノ酸配列VPKPCCAPTまたはアミノ酸配列ACCVPTE
    LSAISMLYLDENEKを含む骨形成タンパク質である、請求項
    14に記載の組成物。
  16. 【請求項１６】骨形成デバイスであって： （ａ）移動性前駆体細胞が侵入、増殖および分化し得る
    大きさの補助材としての、生体適合性であって、in viv
    oにおいて生分解性のマトリックス；および （ｂ）該マトリックスに配置されて該細胞に利用され得
    る、請求項10から15のいずれかに記載の組成物または請
    求項１から９のいずれかに記載の骨形成タンパク質； を含有する、デバイス。
  17. 【請求項１７】前記マトリックスが、粒径サイズが70〜
    850μｍであるパッキングされた粒子状物質を含む、請
    求項15に記載のデバイス。
  18. 【請求項１８】前記マトリックスが、（ａ）鉱物質除去
    され、タンパク抽出された同種骨組（ｂ）脱グリコシル
    化され、タンパク抽出され、鉱物質除去された異種骨組
    織、（ｃ）HF処理またはプロテアーゼ処理されて、タン
    パク抽出され、鉱物質除去された顆粒状の異種骨組織、
    （ｄ）コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、および、グ
    リコール酸および／または乳酸のポリマーからなる群か
    ら選択される物質、（ｅ）ゆるく付着する微粒子形状の
    材料からなる形状の維持する固体、（ｆ）多孔性固体、
    （ｇ）粉砕した筋肉、（ｈ）粉砕した組織、（ｉ）徐放
    性の薬剤送達系として作用し、骨発達段階における細胞
    応答の個々の段階を調節し、骨形成タンパク質を非特異
    的蛋白分解から保護し、生体適合性があり、生分解性で
    あるキャリアー、または（ａ）から（ｉ）のいずれかの
    組み合わせを含む、請求項16または17に記載のデバイ
    ス。
  19. 【請求項１９】哺乳動物内の移動性前駆体細胞が侵入し
    得る局所における軟骨および軟骨内骨形成、歯周の治
    療、軟骨の修復、同種異型移植片の修復の促進、骨関節
    炎の治療、不連続骨折の矯正、および、後天的または先
    天的な脳顔面頭蓋およびその他の骨あるいは歯の異常の
    矯正からなる群から選択される治療に用いるための請求
    項16から18のいずれかに記載のデバイス。
  20. 【請求項２０】哺乳動物内の移動性前駆体細胞が侵入し
    得る局所における軟骨および軟骨内骨形成、歯周の治
    療、軟骨の修復、同種異型移植片の修復の促進、骨関節
    炎の治療、不連続骨折の矯正、および、後天的または先
    天的な脳顔面頭蓋およびその他の骨あるいは歯の異常の
    矯正からなる群から選択される治療に用いるための請求
    項10から15のいずれかに記載の組成物。
  21. 【請求項２１】同種骨の骨髄腔に充填された請求項17か
    ら20のいずれかに記載のデバイス。
  22. 【請求項２２】哺乳動物内の移動性前駆体細胞が侵入し
    得る局所における軟骨および／または軟骨内骨形成、歯
    周の治療、軟骨の修復、同種異型移植片の修復の促進、
    骨関節炎の治療、不連続骨折の矯正、あるいは、後天的
    または先天的な脳顔面頭蓋およびその他の骨または歯の
    異常の矯正に用いる骨形成デバイスを製造する方法であ
    って、以下の工程： （ａ）移動性前駆体細胞が接着、増殖および分化し得る
    大きさの補助材としての、および／または徐放性の薬剤
    伝達系として作用する生体適合性であって、in vivoに
    おいて生分解性のマトリックス を提供する工程；および （ｂ）該マトリックスに、請求項10から15のいずれかに
    記載の組成物または請求項１から９のいずれかに記載の
    骨形成タンパク質を配置する工程； を包含する方法。
JP1504771A 1988-04-08 1989-04-07 骨形成デバイス Expired - Lifetime JP2522568B2 (ja)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/179,406 US4968590A (en) 1988-04-08 1988-04-08 Osteogenic proteins and polypeptides
US23263088A 1988-08-15 1988-08-15
US179,406 1989-02-23
US315,342 1989-02-23
US232,630 1989-02-23
US07/315,342 US5011691A (en) 1988-08-15 1989-02-23 Osteogenic devices

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP8003435A Division JP2933867B2 (ja) 1988-04-08 1996-01-11 骨形成デバイス

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH03500655A JPH03500655A (ja) 1991-02-14
JP2522568B2 true JP2522568B2 (ja) 1996-08-07

Family

ID=27391116

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP1504771A Expired - Lifetime JP2522568B2 (ja) 1988-04-08 1989-04-07 骨形成デバイス
JP1504777A Expired - Lifetime JP2548414B2 (ja) 1988-04-08 1989-04-07 生合成による骨形成蛋白質および該蛋白質を含む骨形成装置
JP7263371A Pending JPH08187084A (ja) 1988-04-08 1995-10-11 生合成による骨形成蛋白質および該蛋白質を含む骨形成装置
JP8003435A Expired - Lifetime JP2933867B2 (ja) 1988-04-08 1996-01-11 骨形成デバイス
JP8084325A Expired - Lifetime JP2869381B2 (ja) 1988-04-08 1996-04-05 骨形成デバイス

Family Applications After (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP1504777A Expired - Lifetime JP2548414B2 (ja) 1988-04-08 1989-04-07 生合成による骨形成蛋白質および該蛋白質を含む骨形成装置
JP7263371A Pending JPH08187084A (ja) 1988-04-08 1995-10-11 生合成による骨形成蛋白質および該蛋白質を含む骨形成装置
JP8003435A Expired - Lifetime JP2933867B2 (ja) 1988-04-08 1996-01-11 骨形成デバイス
JP8084325A Expired - Lifetime JP2869381B2 (ja) 1988-04-08 1996-04-05 骨形成デバイス

Country Status (8)

Country Link
US (4) US5814604A (ja)
EP (6) EP0714665B1 (ja)
JP (5) JP2522568B2 (ja)
AT (4) ATE134647T1 (ja)
AU (2) AU628050B2 (ja)
CA (2) CA1341610C (ja)
DE (6) DE68929453T2 (ja)
WO (2) WO1989009788A2 (ja)

Families Citing this family (122)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5902741A (en) * 1986-04-18 1999-05-11 Advanced Tissue Sciences, Inc. Three-dimensional cartilage cultures
US6432919B1 (en) 1986-07-01 2002-08-13 Genetics Institute, Inc. Bone morphogenetic protein-3 and compositions
US5459047A (en) 1986-07-01 1995-10-17 Genetics Institute, Inc. BMP-6 proteins
US5366875A (en) * 1986-07-01 1994-11-22 Genetics Institute, Inc. Methods for producing BMP-7 proteins
US5106748A (en) * 1986-07-01 1992-04-21 Genetics Institute, Inc. Dna sequences encoding 5 proteins
US6150328A (en) * 1986-07-01 2000-11-21 Genetics Institute, Inc. BMP products
US5543394A (en) * 1986-07-01 1996-08-06 Genetics Institute, Inc. Bone morphogenetic protein 5(BMP-5) compositions
US5013649A (en) * 1986-07-01 1991-05-07 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding osteoinductive products
US5187076A (en) * 1986-07-01 1993-02-16 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding BMP-6 proteins
US5939388A (en) * 1986-07-01 1999-08-17 Rosen; Vicki A. Methods of administering BMP-5 compositions
US20070166353A1 (en) * 1988-04-08 2007-07-19 Stryker Corporation Osteogenic proteins
US6919308B2 (en) * 1988-04-08 2005-07-19 Stryker Corporation Osteogenic devices
DE68929453T2 (de) * 1988-04-08 2003-11-20 Stryker Corp Osteogene Vorrichtungen
US5266683A (en) * 1988-04-08 1993-11-30 Stryker Corporation Osteogenic proteins
US6586388B2 (en) * 1988-04-08 2003-07-01 Stryker Corporation Method of using recombinant osteogenic protein to repair bone or cartilage defects
EP0408649A4 (en) * 1988-04-08 1991-11-27 Genetics Institute, Inc. Bone and cartilage inductive compositions
US5108436A (en) * 1988-09-29 1992-04-28 Collagen Corporation Implant fixation
US5284756A (en) * 1988-10-11 1994-02-08 Lynn Grinna Heterodimeric osteogenic factor
US5106626A (en) * 1988-10-11 1992-04-21 International Genetic Engineering, Inc. Osteogenic factors
ATE162223T1 (de) * 1989-03-28 1998-01-15 Genetics Inst Osteoinduktive zusammensetzungen
CA2024629C (en) * 1989-09-06 2001-07-24 Taiheiyo Cement Corporation Xenopus laevis bone morphogenic protein, dna encoding same and use thereof
DK0448704T3 (da) * 1989-10-17 1999-04-06 Stryker Corp Osteogene anordninger
US7378392B1 (en) 1990-05-16 2008-05-27 Genetics Institute, Llc Bone and cartilage inductive proteins
US5688678A (en) * 1990-05-16 1997-11-18 Genetics Institute, Inc. DNA encoding and methods for producing BMP-8 proteins
US5645591A (en) 1990-05-29 1997-07-08 Stryker Corporation Synthetic bone matrix
WO1992007004A1 (en) * 1990-10-18 1992-04-30 Creative Biomolecules, Inc. Osteogenic protein
DK0643767T3 (da) * 1990-10-18 1999-04-26 Stryker Corp Osteogene peptider
EP0513334A4 (en) * 1990-11-30 1993-08-04 Celtrix Laboratories, Inc. Use of a bone morphogenetic protein in synergistic combination with tgf--g(b) for bone repair
US5206023A (en) * 1991-01-31 1993-04-27 Robert F. Shaw Method and compositions for the treatment and repair of defects or lesions in cartilage
US5656593A (en) * 1991-03-11 1997-08-12 Creative Biomolecules, Inc. Morphogen induced periodontal tissue regeneration
US5652118A (en) * 1991-03-11 1997-07-29 Creative Biomolecules, Inc. Nucleic acid encoding a novel morphogenic protein, OP-3
US6090776A (en) * 1991-03-11 2000-07-18 Creative Bio Molecules, Inc. Morphogen treatment of organ implants
US5674844A (en) * 1991-03-11 1997-10-07 Creative Biomolecules, Inc. Treatment to prevent loss of and/or increase bone mass in metabolic bone diseases
US6395883B1 (en) * 1991-03-11 2002-05-28 Curis, Inc. Soluble morphogenic protein complex compositions of matter
US6495513B1 (en) 1991-03-11 2002-12-17 Curis, Inc. Morphogen-enhanced survival and repair of neural cells
US6399569B1 (en) 1991-03-11 2002-06-04 Curis, Inc. Morphogen treatments for limiting proliferation of epithelial cells
US6800603B2 (en) 1991-03-11 2004-10-05 Curis, Inc. Morphogen-induced neural cell adhesion
US5849686A (en) * 1991-03-11 1998-12-15 Creative Biomolecules, Inc. Morphogen-induced liver regeneration
US6194376B1 (en) 1991-03-11 2001-02-27 Creative Biomolecules, Inc. Method for modulating inflammatory response comprising administering morphogen
US5707810A (en) * 1991-03-11 1998-01-13 Creative Biomolecules, Inc. Method of diagnosing renal tissue damage or disease
US6077823A (en) * 1991-03-11 2000-06-20 Creative Biomolecules, Inc. Method for reducing tissue damage associated with ischemia-reperfusion or hypoxia injury
US6211146B1 (en) * 1991-03-11 2001-04-03 Curis, Inc. 60A protein-induced morphogenesis
CA2363965C (en) * 1991-03-11 2010-05-18 Curis, Inc. Protein-induced morphogenesis
ATE203166T1 (de) * 1991-03-11 2001-08-15 Curis Inc Protein-induzierende morphogenese
US5972884A (en) * 1991-03-11 1999-10-26 Creative Biomolecules, Inc. Morphogen treatment of gastrointestinal ulcers
US5652337A (en) * 1991-03-11 1997-07-29 Creative Biomolecules, Inc. OP-3-induced morphogenesis
US5650276A (en) * 1991-03-11 1997-07-22 Creative Biomolecules, Inc. Morphogenic protein screening method
US7056882B2 (en) 1991-03-11 2006-06-06 Curis, Inc. Treatment to prevent loss of and/or increase bone mass in metabolic bone diseases
US5118667A (en) * 1991-05-03 1992-06-02 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Bone growth factors and inhibitors of bone resorption for promoting bone formation
CA2102808A1 (en) 1991-05-10 1992-11-11 Hanne Bentz Targeted delivery of bone growth factors
US5693615A (en) * 1991-06-05 1997-12-02 The Procter & Gamble Company Therapeutic compositions for osteoinduction
ATE142460T1 (de) * 1991-06-21 1996-09-15 Genetics Inst Osteogene proteine enthaltende arzneimittel
US6287816B1 (en) 1991-06-25 2001-09-11 Genetics Institute, Inc. BMP-9 compositions
EP0601135B1 (en) * 1991-08-30 2005-11-02 Curis, Inc. Osteogenic proteins in the treatment of metabolic bone diseases
EP0601106B2 (en) * 1991-08-30 2003-11-05 Curis, Inc. Morphogen-induced modulation of inflammatory response
US6022853A (en) * 1991-08-30 2000-02-08 Creative Biomolecules, Inc. Morphogen-enriched dietary composition
US5270300A (en) * 1991-09-06 1993-12-14 Robert Francis Shaw Methods and compositions for the treatment and repair of defects or lesions in cartilage or bone
WO1993009229A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 Genetics Institute, Inc. Recombinant bone morphogenetic protein heterodimers, compositions and methods of use
US20080233170A1 (en) * 1992-02-21 2008-09-25 Stryker Corporation Osteogenic Proteins
CA2141554C (en) * 1992-07-31 2003-02-11 David C. Rueger Morphogen-induced nerve regeneration and repair
WO1994010203A2 (en) * 1992-11-03 1994-05-11 Creative Biomolecules, Inc. Op-3-induced morphogenesis
DE69434914T2 (de) * 1993-03-04 2007-10-31 Stryker Corp., Kalamazoo Verfahren und zusammensetzungen zur herstellung von rekombinantem osteogenischem protein
US5906827A (en) * 1994-06-03 1999-05-25 Creative Biomolecules, Inc. Matrix for the manufacture of autogenous replacement body parts
US6040431A (en) * 1995-06-07 2000-03-21 Stryker Corporation Single chain analogs of the TGF-β superfamily (morphons)
US5674292A (en) 1995-06-07 1997-10-07 Stryker Corporation Terminally sterilized osteogenic devices and preparation thereof
ATE364629T1 (de) * 1996-01-22 2007-07-15 Curis Inc Methoden zur herstellung von op-1 morphogen analoge
US6492508B1 (en) 1996-06-03 2002-12-10 United States Surgical Corp. A Division Of Tyco Healthcare Group Nucleic acids encoding extracellular matrix proteins
ZA9711580B (en) * 1996-12-25 1999-09-23 Hoechst Marion Roussel Ltd Process for the production of purified dimeric bone morphogenetic factors.
US6034062A (en) * 1997-03-13 2000-03-07 Genetics Institute, Inc. Bone morphogenetic protein (BMP)-9 compositions and their uses
US20010016646A1 (en) 1998-03-20 2001-08-23 David C. Rueger Osteogenic devices and methods of use thereof for repair of endochondral bone, osteochondral and chondral defects
US7041641B2 (en) 1997-03-20 2006-05-09 Stryker Corporation Osteogenic devices and methods of use thereof for repair of endochondral bone and osteochondral defects
EP2309261A1 (en) * 1997-05-30 2011-04-13 Stryker Corporation Methods for evaluating tissue morphogenesis and morphogenic activity
US5972368A (en) 1997-06-11 1999-10-26 Sdgi Holdings, Inc. Bone graft composites and spacers
US7147839B2 (en) 1998-05-29 2006-12-12 Curis, Inc. Methods for evaluating tissue morphogenesis and activity
US6846906B1 (en) 1998-10-07 2005-01-25 Stryker Corporation Modified proteins of the TGF-β superfamily, including morphogenic proteins
JP3786533B2 (ja) 1998-11-12 2006-06-14 善彦 西村 ペプチド及び骨形成促進剤
US6231528B1 (en) 1999-01-15 2001-05-15 Jonathan J. Kaufman Ultrasonic and growth factor bone-therapy: apparatus and method
DE19906096A1 (de) 1999-02-13 2000-08-17 Walter Sebald Protein mit einem Heparin-bindenden Epitop
DE10026713A1 (de) * 2000-05-30 2001-12-06 Walter Sebald Mutein einer Kette eines Proteins aus der Superfamilie des Wachstumsfaktors TGF-beta
US20020114795A1 (en) * 2000-12-22 2002-08-22 Thorne Kevin J. Composition and process for bone growth and repair
ES2321068T3 (es) * 2001-04-25 2009-06-02 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Matrices de suministro de farmacos para mejorar la curacion de heridas.
US7160725B2 (en) 2001-11-13 2007-01-09 Curis, Inc. Hedgehog signaling promotes the formation of three dimensional cartilage matrices
US8546334B2 (en) 2001-11-19 2013-10-01 Scil Technology Gmbh Device having osteoinductive and osteoconductive properties
US20050008629A1 (en) * 2002-05-08 2005-01-13 Interpore Orthopaedics, A Delaware Corporation Encapsulated AGF cells
US7166133B2 (en) 2002-06-13 2007-01-23 Kensey Nash Corporation Devices and methods for treating defects in the tissue of a living being
JP4358741B2 (ja) 2002-09-10 2009-11-04 スキール テヒノロギー ゲーエムベーハー 低酸素濃度下において骨誘導性タンパク質で被覆された金属インプラント
US20050020506A1 (en) * 2003-07-25 2005-01-27 Drapeau Susan J. Crosslinked compositions comprising collagen and demineralized bone matrix, methods of making and methods of use
US7534264B2 (en) * 2004-01-28 2009-05-19 Ultradent Products, Inc. Delivery system for bone growth promoting material
ES2350939T3 (es) 2004-03-10 2011-01-28 Scil Technology Gmbh Implantes recubiertos, su fabricación y uso de los mismos.
US7621963B2 (en) * 2005-04-13 2009-11-24 Ebi, Llc Composite bone graft material
US20060233849A1 (en) * 2005-04-13 2006-10-19 Simon Bruce J Composite bone graft material
US8506983B2 (en) * 2006-05-01 2013-08-13 Warsaw Orthopedic, Inc. Bone filler material
US20100209470A1 (en) * 2006-05-01 2010-08-19 Warsaw Orthopedic, Inc. An Indiana Corporation Demineralized bone matrix devices
US7838022B2 (en) 2006-05-01 2010-11-23 Warsaw Orthopedic, Inc Malleable implants containing demineralized bone matrix
US7771741B2 (en) * 2006-05-01 2010-08-10 Warsaw Orthopedic, Inc Demineralized bone matrix devices
US7718616B2 (en) 2006-12-21 2010-05-18 Zimmer Orthobiologics, Inc. Bone growth particles and osteoinductive composition thereof
US9056150B2 (en) * 2007-12-04 2015-06-16 Warsaw Orthopedic, Inc. Compositions for treating bone defects
CA2710798A1 (en) 2007-12-28 2009-07-09 Kuros Biosurgery Ag Pdgf fusion proteins incorporated into fibrin foams
US8840913B2 (en) * 2008-03-27 2014-09-23 Warsaw Orthopedic, Inc. Malleable multi-component implants and materials therefor
WO2010074039A1 (ja) 2008-12-26 2010-07-01 旭硝子株式会社 エチレン／テトラフルオロエチレン共重合体の造粒方法
US11078248B2 (en) 2010-03-19 2021-08-03 Lifenet Health BMP peptides and methods of use
EP2550006B1 (en) * 2010-03-24 2018-08-22 Lifenet Health Bmp-4 peptides&methods of use
WO2012048275A2 (en) 2010-10-08 2012-04-12 Caridianbct, Inc. Configurable methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system
AU2011329054B2 (en) 2010-11-15 2015-05-28 Zimmer Orthobiologics, Inc. Bone void fillers
EP2529764A1 (de) 2011-05-31 2012-12-05 Curasan AG Biologisch degradierbares kompositmaterial
US10207027B2 (en) 2012-06-11 2019-02-19 Globus Medical, Inc. Bioactive bone graft substitutes
US9539286B2 (en) 2013-10-18 2017-01-10 Globus Medical, Inc. Bone grafts including osteogenic stem cells, and methods relating to the same
US9486483B2 (en) 2013-10-18 2016-11-08 Globus Medical, Inc. Bone grafts including osteogenic stem cells, and methods relating to the same
US10633625B2 (en) 2013-11-16 2020-04-28 Terumo Bct, Inc. Expanding cells in a bioreactor
US9579421B2 (en) 2014-02-07 2017-02-28 Globus Medical Inc. Bone grafts and methods of making and using bone grafts
US9463264B2 (en) 2014-02-11 2016-10-11 Globus Medical, Inc. Bone grafts and methods of making and using bone grafts
EP3122866B1 (en) 2014-03-25 2019-11-20 Terumo BCT, Inc. Passive replacement of media
JP6830059B2 (ja) 2014-09-26 2021-02-17 テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド スケジュール化された細胞フィーディング
US10016529B2 (en) 2015-06-10 2018-07-10 Globus Medical, Inc. Biomaterial compositions, implants, and methods of making the same
US11426489B2 (en) 2015-06-10 2022-08-30 Globus Medical, Inc. Biomaterial compositions, implants, and methods of making the same
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
EP3464565A4 (en) 2016-05-25 2020-01-01 Terumo BCT, Inc. CELL EXPANSION
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
WO2018184028A2 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US11896736B2 (en) 2020-07-13 2024-02-13 Globus Medical, Inc Biomaterial implants and methods of making the same

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US621146A (en) * 1899-03-14 Presser-foot for sewing-machines
CH595293A5 (ja) * 1975-02-20 1978-02-15 Battelle Memorial Institute
US4294753A (en) * 1980-08-04 1981-10-13 The Regents Of The University Of California Bone morphogenetic protein process
US4455256A (en) * 1981-05-05 1984-06-19 The Regents Of The University Of California Bone morphogenetic protein
US4394370A (en) * 1981-09-21 1983-07-19 Jefferies Steven R Bone graft material for osseous defects and method of making same
US4434094A (en) * 1983-04-12 1984-02-28 Collagen Corporation Partially purified osteogenic factor and process for preparing same from demineralized bone
CA1229789A (en) * 1983-06-06 1987-12-01 David Baylink Polypeptides exhibiting skeletal growth factor activity
US4795804A (en) * 1983-08-16 1989-01-03 The Regents Of The University Of California Bone morphogenetic agents
NZ210699A (en) * 1984-01-04 1989-06-28 Int Genetic Eng Isolation of an osteogenic protein of the p3 immunologically related family
US4804744A (en) * 1984-01-04 1989-02-14 International Genetic Engineering, Inc. Osteogenic factors
US4563489A (en) * 1984-02-10 1986-01-07 University Of California Biodegradable organic polymer delivery system for bone morphogenetic protein
GB8413319D0 (en) * 1984-05-24 1984-06-27 Oliver Roy Frederick Biological material
US4620327A (en) * 1984-07-05 1986-11-04 Caplan Arnold I Process of adapting soluble bone protein for use in stimulating osteoinduction
ATE128715T1 (de) * 1984-07-16 1995-10-15 Celtrix Pharma Polypeptide induzierende faktoren in knochen und knorpel.
US4843063A (en) * 1984-07-16 1989-06-27 Collagen Corporation Polypeptide cartilage-inducing factors found in bone
US4563350A (en) * 1984-10-24 1986-01-07 Collagen Corporation Inductive collagen based bone repair preparations
US4817190A (en) 1985-08-27 1989-03-28 Motorola, Inc. Method for dynamically regrouping subscribers on a communications system
US5187076A (en) * 1986-07-01 1993-02-16 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding BMP-6 proteins
US4877864A (en) * 1987-03-26 1989-10-31 Genetics Institute, Inc. Osteoinductive factors
US5108922A (en) * 1986-07-01 1992-04-28 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding BMP-1 products
US5013649A (en) * 1986-07-01 1991-05-07 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding osteoinductive products
IL83003A (en) * 1986-07-01 1995-07-31 Genetics Inst Factors that soak bone formation
US5106748A (en) * 1986-07-01 1992-04-21 Genetics Institute, Inc. Dna sequences encoding 5 proteins
ZA874681B (en) * 1986-07-01 1988-04-27 Genetics Inst Novel osteoinductive factors
DE3775363D1 (de) * 1986-10-22 1992-01-30 Biotechnolog Forschung Gmbh Wachstumstimulierendes material, herstellungsverfahren und therapeutische zusammensetzung.
EP0336760A3 (en) * 1988-04-06 1991-03-13 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Bone-inducing protein
US6919308B2 (en) * 1988-04-08 2005-07-19 Stryker Corporation Osteogenic devices
US4975526A (en) * 1989-02-23 1990-12-04 Creative Biomolecules, Inc. Bone collagen matrix for zenogenic implants
US6586388B2 (en) * 1988-04-08 2003-07-01 Stryker Corporation Method of using recombinant osteogenic protein to repair bone or cartilage defects
US5258494A (en) * 1988-04-08 1993-11-02 Stryker Corporation Osteogenic proteins
US5266683A (en) * 1988-04-08 1993-11-30 Stryker Corporation Osteogenic proteins
US5011691A (en) * 1988-08-15 1991-04-30 Stryker Corporation Osteogenic devices
US5344654A (en) * 1988-04-08 1994-09-06 Stryker Corporation Prosthetic devices having enhanced osteogenic properties
US5250302A (en) * 1988-04-08 1993-10-05 Stryker Corporation Osteogenic devices
US5108753A (en) * 1988-04-08 1992-04-28 Creative Biomolecules Osteogenic devices
DE68929453T2 (de) * 1988-04-08 2003-11-20 Stryker Corp Osteogene Vorrichtungen
US5354557A (en) * 1988-04-08 1994-10-11 Stryker Corporation Osteogenic devices
EP0408649A4 (en) * 1988-04-08 1991-11-27 Genetics Institute, Inc. Bone and cartilage inductive compositions
US5162114A (en) * 1989-02-23 1992-11-10 Stryker Corporation Bone collagen matrix for xenogenic implants
US5324819A (en) * 1988-04-08 1994-06-28 Stryker Corporation Osteogenic proteins
US5106626A (en) * 1988-10-11 1992-04-21 International Genetic Engineering, Inc. Osteogenic factors
US5284756A (en) * 1988-10-11 1994-02-08 Lynn Grinna Heterodimeric osteogenic factor
ATE162223T1 (de) * 1989-03-28 1998-01-15 Genetics Inst Osteoinduktive zusammensetzungen
WO1991002744A1 (en) * 1989-08-21 1991-03-07 Celtrix Laboratories, Inc. Bone-specific protein
US5645591A (en) * 1990-05-29 1997-07-08 Stryker Corporation Synthetic bone matrix
US5674844A (en) * 1991-03-11 1997-10-07 Creative Biomolecules, Inc. Treatment to prevent loss of and/or increase bone mass in metabolic bone diseases
US5656593A (en) * 1991-03-11 1997-08-12 Creative Biomolecules, Inc. Morphogen induced periodontal tissue regeneration
US5652337A (en) * 1991-03-11 1997-07-29 Creative Biomolecules, Inc. OP-3-induced morphogenesis
US6022853A (en) * 1991-08-30 2000-02-08 Creative Biomolecules, Inc. Morphogen-enriched dietary composition
US5906827A (en) * 1994-06-03 1999-05-25 Creative Biomolecules, Inc. Matrix for the manufacture of autogenous replacement body parts
US5674292A (en) * 1995-06-07 1997-10-07 Stryker Corporation Terminally sterilized osteogenic devices and preparation thereof
US6281195B1 (en) * 1997-02-07 2001-08-28 Stryker Corporation Matrix-free osteogenic devices, implants and methods of use thereof
US20010016646A1 (en) * 1998-03-20 2001-08-23 David C. Rueger Osteogenic devices and methods of use thereof for repair of endochondral bone, osteochondral and chondral defects
US20030032586A1 (en) * 1997-05-15 2003-02-13 David C. Rueger Compositions for morphogen-induced osteogenesis
US20020015985A1 (en) * 1998-02-18 2002-02-07 Haruo Takahashi Immobilized enzymes
US6677432B1 (en) * 1998-10-07 2004-01-13 Stryker Corporation Mutations of the C-terminal portion of TGF-β superfamily proteins

Also Published As

Publication number Publication date
ATE243254T1 (de) 2003-07-15
ATE142644T1 (de) 1996-09-15
EP0723013B1 (en) 2003-06-18
EP0723013A2 (en) 1996-07-24
WO1989009788A2 (en) 1989-10-19
DE68927153D1 (de) 1996-10-17
AU3530589A (en) 1989-11-03
DE68925773D1 (de) 1996-04-04
WO1989009787A2 (en) 1989-10-19
EP1225225A2 (en) 2002-07-24
EP0714665B1 (en) 2003-01-22
JPH08187084A (ja) 1996-07-23
EP0723013A3 (en) 1998-01-14
JPH03500655A (ja) 1991-02-14
DE01201555T1 (de) 2004-07-08
WO1989009788A3 (en) 1990-02-08
CA1341610C (en) 2011-02-01
EP0362367A1 (en) 1990-04-11
US5814604A (en) 1998-09-29
EP0372031B1 (en) 1996-09-11
EP1221484A3 (en) 2002-09-18
EP1225225A3 (en) 2003-01-08
DE68929472T2 (de) 2004-05-13
AU628050B2 (en) 1992-09-10
AU3444989A (en) 1989-11-03
DE68929472D1 (de) 2003-07-24
US20030124169A1 (en) 2003-07-03
EP0372031A1 (en) 1990-06-13
US6297213B1 (en) 2001-10-02
DE68927153T2 (de) 1997-03-06
EP1221484A2 (en) 2002-07-10
AU618357B2 (en) 1991-12-19
EP0714665A2 (en) 1996-06-05
DE01201546T1 (de) 2004-07-08
JP2548414B2 (ja) 1996-10-30
DE68929453D1 (de) 2003-02-27
JPH03502579A (ja) 1991-06-13
JP2933867B2 (ja) 1999-08-16
DE68925773T2 (de) 1996-10-17
JPH08322570A (ja) 1996-12-10
EP0362367B1 (en) 1996-02-28
ATE231523T1 (de) 2003-02-15
ATE134647T1 (de) 1996-03-15
JPH08336390A (ja) 1996-12-24
DE68929453T2 (de) 2003-11-20
CA1338663C (en) 1996-10-22
EP0714665A3 (en) 1997-12-03
JP2869381B2 (ja) 1999-03-10
WO1989009787A3 (en) 1990-02-08
US20050054825A1 (en) 2005-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2522568B2 (ja) 骨形成デバイス
US7078221B2 (en) Nucleic acid molecules encoding osteogenic proteins
US5011691A (en) Osteogenic devices
US5324819A (en) Osteogenic proteins
US4968590A (en) Osteogenic proteins and polypeptides
US5108753A (en) Osteogenic devices
US5266683A (en) Osteogenic proteins
US5840325A (en) Osteogenic devices
JP3368260B2 (ja) 骨形成具
US6919308B2 (en) Osteogenic devices
US7176284B2 (en) Osteogenic proteins
EP0643767B1 (en) Osteogenic peptides
US5670336A (en) Method for recombinant production of osteogenic protein
US20080233170A1 (en) Osteogenic Proteins
WO1992007004A1 (en) Osteogenic protein
US20070166353A1 (en) Osteogenic proteins
US7429484B2 (en) Nucleic acid molecules encoding osteogenic proteins

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090531

Year of fee payment: 13

EXPY Cancellation because of completion of term