DE69434914T2

DE69434914T2 - Verfahren und zusammensetzungen zur herstellung von rekombinantem osteogenischem protein

Info

Publication number: DE69434914T2
Application number: DE69434914T
Authority: DE
Inventors: David C. Hopkinton RUEGER; William K. Brookline JONES; Robert F. Holliston TUCKER; Hermann Medway Oppermann; Engin Milford Ozkaynak; Kuber T. Meday SAMPATH
Original assignee: Stryker Corp
Current assignee: Stryker Corp
Priority date: 1993-03-04
Filing date: 1994-03-04
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2014-03-05
Also published as: JPH08510446A; WO1994020539A1; CA2157387C; AU6358894A; EP0687272B1; EP0687272A1; DE69434914D1; AU682176B2; CA2157387A1; JP2005002127A

Description

Beziehung zu verwandten Anmeldungen
Die vorliegende Anmeldung ist eine Teilfortführungsanmeldung der Anmeldung USSN 08/027,070, eingereicht am 04. März 1993, die eine Teilfortführungsanmeldung der Anmeldung USSN 07/841,646, eingereicht am 21. Februar 1992, jetzt US-Patent Nr. 5,266,683, ist, deren Offenbarungen durch diesen Hinweis hier einbezogen sind.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf osteogene Proteine und insbesondere auf Verfahren und Zusammensetzungen zu ihrer Herstellung und Reinigung.
Hintergrund der Erfindung
Osteogene Proteine sind allgemein bekannt und im Stand der Technik beschrieben. Man vergleiche z.B. die US-Patente 4 968 590, 5 011 691, 5 018 753 und 5 266 683 sowie die verschiedenartigen wissenschaftlichen Artikel, die in der wissenschaftlichen Literatur veröffentlicht sind. Man vgl. z.B. Ozkaynak u.a. (1990) EMBO J 9 2085-2093, Ozkaynak u.a., J.Biol. Chem. 267 13198-13205, Sampath u.a. (1993) PNAS 90: 6004-6008, Wozney u.a. (1988) Science 242: 1528-1534, Wang u.a. (1988) PNAS 85: 9484-9488, Wang u.a. (1990) PNAS 87: 2220-2224 und Celeste u.a. (1990) PNAS 87: 9843-9847. Der Stand der Technik beschreibt, wie osteogene Proteine von Knochen zu isolieren und wie diese Proteine kodierende Gene zu identifizieren und wie sie unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie auszuprägen sind.
Die Proteine, die die Klasse echter osteogener Proteine definieren, bilden eine Gruppe von Proteinen, die eine Anzahl bewahrter struktureller Merkmale gemeinsam haben. Jedes Protein kann als solches eine endochondrale Knochenbildung in einem Säuger induzieren, wenn es richtig gefaltet, dimerisiert und disulfidgebunden wird, um eine dimere Spezies mit der entsprechenden dreidimensionalen Gestaltung zu bilden, ohne daß die Hinzufügung anderer osteogener oder nicht-osteogener Proteine erforderlich ist. Typischerweise werden osteogene Proteine an einer Stelle zur Knocheninduktion in einem Säuger in Verbindung mit einer geeigneten Matrix mit der entsprechenden Ausbildung zur Ermöglichung der Infiltration, Proliferation und Differenzierung von migrierenden Progenitorzellen gebracht. Das Konstrukt eines osteogenen Proteins, das an die Oberflächen einer geeigneten Matrix adsorbiert wird, wird in der Fachwelt allgemein als ein osteogenes Element bezeichnet. Die Proteine können von Knochen isoliert werden oder das das Protein kodierende Gen wird rekombinant in einer geeigneten Wirtszelle hergestellt. Verfahren zur Herstellung von osteogenen Proteinen und Zubereitungen osteogener Elemente sind im einzelnen im Stand der Technik beschrieben. Man vgl. z.B. US-Patent Nr. 5 011 691 oder 5 266 683, deren Offenbarungen durch diesen Hinweis oben einbezogen sind.
Verbesserte Verfahren für die rekombinante Ausprägung von osteogenen Proteinen sind eine anstehende Bemühung auf diesem Fachgebiet. Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Verbesserung der Verfahren zur Herstellung und Reinigung von osteogenen Proteinen mit einer hohen spezifischen Aktivität und zur Zubereitung von osteogenen Elementen zu schaffen, die diese Proteine beinhalten. Noch eine weitere Aufgabe besteht darin, Mittel zur Unterscheidung zwischen der löslichen Form des Proteins und der Spezies des reifen osteogenen Proteins zu schaffen, die typischerweise für die Zubereitung osteogener Elemente benutzt wird, und polyklonale und monoklonale Antikörper zur Verfügung zu stellen, die in der Lage sind, zwischen diesen verschiedenartigen Spezies zu unterscheiden Eine weitere Aufgabe besteht darin, Verfahren zur Herstellung von Antikörpern anzugeben, die beide Formen des Proteins erkennen können. Noch eine weitere Aufgabe besteht darin, Verfahren zur Überwachung jeder und aller dieser Formen des Proteins in einem Fluid einschließlich Serum und Herstellungsmedium anzugeben. Das US-Patent Nr. 4 857 956 und Urist u.a. (1984) Proc. Exp. Bio. Med. 176: 474-475, beschreiben eine Serumuntersuchung zur Feststellung eines angenommenermaßen eine osteogene Aktivität aufweisenden Proteins. Das Protein ist nicht ein Mitglied der Familie von hier beschriebenen osteogenen Proteinen, die sich im Molekulargewicht, strukturellen Merkmalen und in der Löslichkeit von diesen Proteinen unterscheiden.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein isolierter Bindungspartner nach der vorliegenden Erfindung ist im Anspruch 1 definiert, und bevorzugte Merkmale des isolierten Bindungspartners sind in den Ansprüchen 2-7 angegeben. Ein Verfahren zum Identifizieren einer löslichen Form eines osteogenen Proteins in Lösung nach der vorliegenden Erfindung ist im Anspruch 8 definiert, und bevorzugte Merkmale des Verfahrens sind in den Ansprüchen 9-18 angegeben. Eine Ausrüstung zum Nachweisen einer löslichen Form eines osteogenaktiven Proteins in Lösung nach der vorliegenden Erfindung ist im Anspruch 19 definiert, und bevorzugte Merkmale des Verfahrens sind in den Ansprüchen 20-22 angegeben.
Es wurde nun gefunden, daß osteogenes Protein, wie nachstehend definiert, bei einer Absonderung in Kulturmedium von Säugerzellen als eine signifikante Fraktion des abgesonderten Proteins eine lösliche Form des Proteins enthält und daß diese lösliche Form die reife dimere Spezies enthält, einschließlich abgeschnittener Formen von dieser, nicht kovalent assoziiert mit zumindest einer und vorzugsweise zwei Pro-Domänen. Es ist ferner gefunden worden, daß Bindungspartner, wie nachstehend definiert, mit einer spezifischen Bindungsaffinität für ein Epitop an einem osteogenen Protein oder einer Vorläuferpolypeptidkette zur Unterscheidung zwischen diesen beiden Formen des Proteins benutzt werden können. Vorzugsweise ist der Bindungspartner ein Protein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Bindungsprotein ein Antikörper, der monoklonal, polyklonal oder biosynthetisch hergestellt sein kann. Diese Bindungspartner können als Teil eines Reinigungsschemas verwendet werden, um die reife oder lösliche Form des Proteins zu isolieren sowie die Menge der hergestellten reifen und löslichen Formen zu quantifizieren. Die Antikörper können als Teil eines Herstellungsprotokolls zur Überwachung der pharmakologischen Reinheit einer osteogenen Proteinzubereitung für therapeutische oder andere klinische Anwendungsfälle verwendet werden. Speziell ist nun hier ein Verfahren geschaffen, das gewährleistet, daß nur eine gewünschte Form eines Proteins in einer Zusammensetzung vorhanden ist. Zusätzlich können Bindungspartner hergestellt werden, die beide Proteinformen erkennen und die mit Vorteil zur Überwachung der Menge des Gesamtproteins in Lösung verwendet werden können. Diese Bindungspartner können auch als ein Teil diagnostischer Behandlungen zur Überwachung der Konzentration von osteogenem Protein in Lösung in einem Körper und zum Erkennen von Fluktuationen in der Konzentration der Proteine in ihren verschiedenartigen Formen verwendet werden.
Die vorstehenden und weiteren Zielsetzungen, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung weiter verdeutlicht.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung einer osteogenen Proteinpolypeptidkette in Ausprägung von einer die Sequenz kodierenden Nukleinsäure, wobei die querschraffierte Zone die Signalsequenz, die gepunktete Zone die Pro-Domäne, die schraffierte Zone den N-Terminus ("N-Terminalverlängerung") der reifen Proteinsequenz und die offene Zone die C-Terminalzone der Sequenz des reifen Proteins darstellt, die die bewahrte Sieben-Cysteindomäne definiert, wobei die bewahrten Cysteine durch senkrechte gestrichelte Linien angegeben sind,
2 listet die Sequenzen der N-terminalen Verlängerungen der reifen Formen der verschiedenen osteogenen Proteine auf und
3 ist ein Gelfiltrationssäulenelutionsprofil eines löslichen osteogenen Proteins (OP-1), hergestellt und gereinigt von einer Säugerzellenkultur durch IMAC, S-Sepharose und S-200HR-Chromatografie in TBS (Trispuffersalzlösung), wobei V_o das Leervolumen, ADH Alkoholdehydrogenase (MW 150 kDa), BSA Bovinserumalbumin (MW 67 kDa), CA Karbonatdehydrase (MW 29kDa) und CytC Cytochrom C (MW 12.5 kDa) ist.
Detaillierte Beschreibung
Es wurde nun eine lösliche Form echter osteogener Proteine gefunden, wobei das Protein im wesentlichen aus der Aminosäurensequenz des Proteins besteht. Die lösliche Form ist ein nicht-kovalent assoziierter Komplex, der den Pro-Domäne oder ein Fragment von diesem umfaßt, nicht kovalent assoziiert oder komplexiert mit ei ner dimeren Proteinspezies mit osteogener Aktivität, wobei jedes Polypeptid des Dimeren weniger als 200 Aminosäuren besitzt und zumindest das C-terminale Sechs- und vorzugsweise Sieben-Cysteingrundgerüst umfaßt, das durch die Reste 335-431 bzw. 330-431 von Seq. ID Nr. 1 definiert ist.
Vorzugsweise umfassen die Polypeptidketten der dimeren Spezies die reifen Formen dieser Sequenzen oder abgeschnittene Formen von diesen. Bevorzugte abgeschnittene Formen umfassen die intakte C-terminale Domäne und zumindest 10 Aminosäuren der N-terminalen Verlängerungssequenz z.B. vorzugsweise zumindest die durch die Reste 320-330 von Seq. ID 1 definierte Sequenz. Die löslichen Formen dieser osteogenen Proteine können von Kulturzellenmedium, einem Fluid eines Säugerkörpers, isoliert oder in vitro zubereitet werden.
In vivo kann die Pro-Domäne unter physiologischen Bedingungen dazu dienen, die Transportfähigkeit der Proteine zu verstärken und/oder die Proteine vor Proteasen und Radikalfängermolekülen einschließlich Antikörpern zu schützen. Die Pro-Domänen können auch bei der Zielrichtung der Proteine auf Gewebe, z.B. auf Knochen, helfen.
Die Proteine, die durch die Erfindung vorgesehen und hier als "osteogene Proteine" bezeichnet werden, sind echte osteogene Proteine, die als solche in der Lage sind, eine endochondrale Knochenbildung zu induzieren, wenn sie in einen Säuger in Verbindung mit einer Matrix implantiert werden, ohne daß die Hinzufügung anderer osteogener oder nicht-osteogener Proteine erforderlich wäre. Eine detallierte Be schreibung dieser Proteine zeigen z.B. die US-Patente 4968590, 5011691 und die US-Anmeldung 841646 mit Hinweisen auf verschiedenartige Mitglieder der Proteinfamilie, die bis heute identifiziert sind. Diese Familienmitglieder umfassen OP1, OP2 und die Proteine, die in der Fachwelt als "knochenmorphogene Proteine" bezeichnet werden: BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 und BMP-9 sowie verschiedenartige bekannte Speziesvarianten einschließlich Vgr, Vgl, 60A und DPP und biosynthetische osteogene Konstrukte einschließlich COP1, 3, 5, 7 und 16.
Die Mitglieder dieser Familie von Proteinen, die eine Unterklasse der TGF-β-Superfamilie von Proteinen sind, haben gemeinsame strukturelle Merkmale, die schematisch in 1 dargestellt sind, sowie beträchtliche Aminosäurensequenzhomologie in ihren C-terminalen Bereichen einschließlich einer bewahrten Sieben-Cysteinstruktur. Wie in der Figur veranschaulicht, werden die Proteine zur Translation gebracht als eine Vorläuferpolypeptidsequenz 10 mit einer N-terminalen Signalpeptidsequenz 12 (der "pre-pro"-Bereich, angezeigt in der Figur durch Querschraffur), typischerweise weniger als etwa 30 Resten, gefolgt durch einen "pro"-Bereich 14, angezeigt in der Figur durch Punktieren, und die zum Erbringen der reifen Sequenz 16 abgespalten wird. Die reife Sequenz umfaßt sowohl den bewahrten C-terminalen Sieben-Cysteinbereich 20 als auch eine N-terminale Sequenz 18, die hier als eine N-terminale Verlängerung bezeichnet wird und die sich in signifikanter Weise in der Sequenz zwischen den verschiedenartigen osteogenen Proteinen ändert. Die Cysteine sind in der Figur durch vertikale gestrichelte Linien 22 dargestellt. Die Polypeptidketten dimerieren und diese Dimere werden typischerweise durch zumindest eine Zwischenketten-Disulfidbindung stabilisiert, die die beiden Polypeptidket tenuntereinheiten verbindet. Die reifen Untereinheiten, die von Säugerzellen hergestellt werden, haben typischerweise Molekulargewichte im Bereich von etwa 15-23 kD, in Abhängigkeit vom Grad der Glykosylierung und N-terminalen Trunkation. Die dimeren Spezies haben dann typischerweise ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 30-40 kD.
Das Signalpeptid wird während oder kurz nach der Translation an einer Spaltungsstelle abgespaltet, die in einer gegebenen Sequenz unter Verwendung der Methode Von Heijne ((1986) Nucleic Acids Research 14: 4683-4691) vorherbestimmt werden kann. Die "Pro"-Form der Proteinuntereinheit, 24 in 1, umfaßt sowohl die Pro-Domäne als auch die reife Domäne, durch Peptidbindung miteinander verbunden. Typischerweise wird diese Pro-Form abgespalten, während das Protein noch in der Zelle ist, und die Pro-Domäne bleibt nicht kovalent assoziiert mit der reifen Form der Untereinheit zur Bildung einer löslichen Spezies, die anscheinend die primäre Form ist, die von Säugerkulturzellen abgesondert wird. Typischerweise verwendeten frühere Reinigungstechniken Denaturierungsbedingungen, die den Komplex disassoziierten.
Andere lösliche Formen osteogener Proteine, die von Säugerzellen abgesondert werden, umfassen Dimere der Pro-Formen dieser Proteine, wobei die Pro-Domäne nicht von der reifen Domäne abgespalten ist, und "Halb-Dimere", wobei eine Untereinheit eine Pro-Form der Polypeptidkettenuntereinheit und die andere Untereinheit die abgespaltene reife Form der Polypeptidkettenuntereinheit (einschließlich abge schnittener Formen von dieser), vorzugsweise nicht kovalent assoziiert mit einer abgespaltenen Pro-Domäne, umfaßt.
Die isolierte Pro-Domäne hat typischerweise Zonen von Hydrophobie nach Bestimmung sowohl durch Analyse der Sequenz als auch durch Charakterisierung ihrer Eigenschaften in Lösung. Die isolierten Pro-Domänen allein sind typischerweise nicht voll löslich in wässrigen Lösungen. Demgemäß kann, ohne auf irgendeine gegebene Theorie beschränkt zu sein, die nicht kovalente Assoziierung der abgespaltenen Pro-Domänee mit den dimeren Spezies reifen osteogenen Proteins eine Wechselwirkung eines hydrophoben Anteils einer gegebenen Pro-Domäne mit einem entsprechenden hydrophoben Bereich bei der dimeren Spezies beinhalten, deren Wechselwirkung einen sonst exponierten hydrophoben Bereich des reifen Dimers vor einem Einwirkenlassen wässriger Umgebungen schützt bzw. "verbirgt", was die Affinität der reifen dimeren Spezies für wässrige Lösungen verstärkt.
Wie die hier beschriebenen osteogenen Proteine hat auch TGF-β eine Pro-Domäne, die sich nicht kovalent mit der reifen TGF-β-Proteinform verbindet. Jedoch enthält der TGF-β-Pro-Domäne, anders als die hier beschriebenen osteogenen Proteine, zahlreiche Cysteine und bildet Disulfidbindungen mit einem spezifizischen Bindungsprotein. Die TGF-β-Pro-Domäne ist auch an einem oder mehreren Mannoseresten phosphoryliert, während dies die Pro-Domänen des osteogenen Proteins typischerweise nicht sind.
Wie oben beschrieben umfaßt die aktive Form des osteogenen Proteins, nachstehend mit OP-1 beispielhaft angegeben, bekanntermaßen eine dimere Spezies, die sich aus der reifen Sequenz (z.B. Aminoräuren 293-431 von Seq. ID Nr. 1) oder einer abgeschnittenen Form von dieser zusammensetzt, in entsprechender Disulfidverbindung zur Erzeugung einer osteogenen dimeren Spezies. Diese osteogenen Proteine, in ihren reifen Formen, sind neutral zu Basisproteinen (z.B. pl im Bereich von etwa 7 bis 8) und sind, in veränderlichen Maßen, unter physiologischen Bedingungen verhältnismäßig unlöslich. Es wurde nun gefunden, daß diese Proteine von Säugerzellen in einer löslichen Form abgesondert werden und daß diese Form die reife dimere Spezies (hier auch als die "gereinigte Spezies" bezeichnet) umfaßt, nicht kovalent assoziiert mit einer oder mehreren Kopien der Pro-Domäne. Diese Form des Proteins ist wahrscheinlich die Form, die im Blutstrom vorhanden ist. Anders als die latente Form von TGF-β wird Aktivität durch diese Form des osteogenen Proteins nicht verhindert. Die lösliche Form selbst kann aktiv sein, oder sie kann dissoziieren zum Freisetzen der reifen dimeren Spezies, wenn das Protein ein Zielgewebe, wie etwa Knochengewebe, erreicht hat.
Somit können jetzt Antikörper erzeugt werden, die ein osteogenes Protein von Interesse erkennen, und diese Antikörper können dann zur Kontrolle von Kulturmedium oder endogenen Werten von osteogenem Protein in einem Körperfluid, wie etwa Serum, Vollblut oder Peritonealfluid, verwendet werden. Vorzugsweise hat der Antikörper eine Bindungsspezifität für die lösliche Form. Derartige Antikörper können unter Verwendung der Pro-Domäne oder eines Teils davon als Antigen oder vorzugsweise den löslichen Komplex selbst erzeugt werden. Die Pro-Domäne kann man vorzugsweise dadurch erhalten, daß der lösliche Komplex isoliert und dann die nicht kovalent assoziierte Pro-Domäne von der reifen Domäne unter Verwendung von Standardverfahren getrennt wird, z.B. durch Trennen der Komplexkomponenten durch chromatografische Mittel, vorzugsweise durch Ionenaustausch-Chromatografie in Gegenwart eines Denaturierungsmittels, z.B. 6M Harnstoff. Alternativ können das Pro-Protein in seiner monomeren Form als Antigen verwendet und die anstehenden Antikörper durch Westernblot oder andere Standard-Immunoassays auf diejenigen gescreent werden, die die Pro-Form oder lösliche Form des Proteins von Interesse, nicht jedoch die reife Form erkennen. Wo Antikörper erwünscht sind, die in der Lage sind, sowohl lösliche als auch reife Formen des Proteins zu identifizieren, wird vorzugsweise der Komplex selbst als Antigenquelle benutzt. Einzelheiten der Antikörperherstellung und beispielhafte Immunoassays sind nachstehend angegeben. Ebenfalls angegeben ist ein Beispiel zum Feststellen von löslichem osteogenem Protein in einer Körperfluidprobe.
Die als vorteilhaft bei den Verfahren und Zusammensetzungen nach der Erfindung angesehenen Proteine beinhalten Formen mit variierenden Glycosylationsmustern und variierenden N-Termini. Sie können auf natürlichem Wege vorkommen oder biosynthetisch abgeleitet werden sowie durch Ausprägung von rekombinanter DNA in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen hergestellt werden. Die Proteine sind aktiv als Einzelspezies (z.B. als Homodimere) oder kombiniert als gemischte Spezies. Zweckdienliche Sequenzen und eukaryotische sowie prokaryotische Ausprägungssysteme sind weithin im Stand der Technik beschrieben. Man vergleiche z.B. die US-Patente Nr. 5061911 und Nr. 5266683 bezüglich zweckentsprechender Ausprägungssysteme. Zweckdienliche Sequenzen sind in den US-Patenten Nrn. 4968590, 5011691, 5018753 und 5266683 angegeben sowie bei Ozkaynak u.a. (1990) EMBO J 9: 2085-2093, Ozkaynak u.a., J.Biol.Chem. 267: 13198-13205, Sampath u.a. (1993) PNAS 90: 6004-6008, Wozney u.a. (1988) Science 242: 1528-1534, Wang u.a. (1988) PNAS 85. 9484-9488, Wang u.a. (1990) PNAS 87: 2220-2224, Celeste u.a. (1990) PNAS 87: 9843-9847, Weeks u.a. (1987) Cell 51: 861-867, Padgett u.a. (1987) Nature 32581-84, Wharton u.a. (1991) PNAS 88: 9214-9218, Lyons u.a. (1989) PNAS 86: 4554-4558 und in der internationalen PCT-Anmeldung WO93/00432 hinsichtlich OP1, OP2, DPP, 60A, Vg1, Vgr-1 und der BMP-2-6 und BMP-9-Proteine. Demgemäß werden diese Proteine einschließlich Alleler Spezies und anderer natürlich vorkommender und biosynthetischer Sequenzvarianten von diesen als nutzbringend im Rahmen der vorliegenden Anmeldung angesehen. Weitere nützliche Sequenzen beinhalten biosynthetische Konstrukte einschließlich, ohne Beschränkung, die im US-Patent Nr. 5011691 als COP-1, -3, -5, -7, -16 angeführten Sequenzen und chimären Konstrukten, die durch Kombinieren von Sequenzen von zwei oder mehr verschiedenen osteogenen Proteinen geschaffen werden. Wie für den Durchschnittsfachman ersichtlich, können chimäre Konstrukte ohne weiteres unter Anwendung der Standardmolekularbiologie und Mutagenesetechniken geschaffen werden, die verschiedenartige Bereiche unterschiedlicher osteogener Sequenzen zur Schaffung einer neuer Sequenz verbinden, und diese Formen des Proteins sind hier ebenfalls vorgesehen.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der nach der Erfindung vorgesehenen Proteine beinhaltet Proteine, deren Aminosäurensequenz im cysteinreichen C- Terminalbereich eine Identität von mehr als 60%, vorzugsweise mehr als 65%, mit der Aminosäurensequenz von OPS (z.B. Reste 335-431 von Seq. ID Nr. 1) besitzt.
Nach einem weiteren bevorzugten Aspekt sieht die Erfindung osteogene Proteine vor, die Spezies von Polypeptidketten mit der generischen, hier als "OPX" bezeichneten Aminosäurensequenz umfassen, die die Homologien zwischen den verschiedenartigen identifizierten Spezies der osteogenen Proteine OP1 und OP2 aufnimmt und die durch die nachstehend und in der Sequenz ID Nr. 5 angegebene Aminosäurensequenz beschrieben ist.
wobei Xaa bei Rest 2 = (Lys oder Arg), Xaa bei Rest 3 = (Lys oder Arg), Xaa bei Rest 11 = (Arg oder Gln), Xaa bei Rest 16 = (Gln oder Leu), Xaa bei Rest 19 = (Ile oder Val), Xaa bei Rest 23 = (Glu oder Gln), Xaa bei Rest 26 = (Ala oder Ser), Xaa bei Rest 35 = (Ala oder Ser), Xaa bei Rest 39 = (Asn oder Asp), Xaa bei Rest 41 = (Tyr oder Cys), Xaa bei Rest 50 = (Val oder Leu), Xaa bei Rest 52 = (Ser oder Thr), Xaa bei Rest 56 = (Phe oder Leu), Xaa bei Rest 57 = (Ile oder Met), Xaa bei Rest 58 = (Asn oder Lys), Xaa bei Rest 60 = (Glu, Asp oder Asn), Xaa bei Rest 61 = (Thr, Ala oder Val), Xaa bei Rest 65 = (Pro oder Ala), Xaa bei Rest 71 = (Gln oder Lys), Xaa bei Rest 73 = (Asn oder Ser), Xaa bei Rest 75 = (Ile oder Thr), Xaa bei Rest 80 = (Phe oder Tyr), Xaa bei Rest 82 = (Asp oder Ser), Xaa bei Rest 84 = (Ser oder Asn), Xaa bei Rest 89 = (Lys oder Arg), Xaa bei Rest 91 = (Tyr oder His) und Xaa bei Rest 97 = (Arg oder Lys).
Nach einem weiteren bevorzugten Aspekt sieht die Erfindung osteogene Proteine vor, die durch Nucleinsäuren kodiert werden, welche zu DNA- oder RNA-Sequenzen hybridisieren, die den C-terminalen Sieben-Cysteinbereich von OP1 oder OP2 unter strengen Hybridisierungsbedingungen kodieren. So, wie hier verwendet, werden strenge Hybridisierungsbedingungen definiert als Hybridisierung in 40% Formamid, 5 × SSPE, 5 × Denhardt's Lösung und 0,1% SDS bei 37°C über Nacht und Waschen in 0,1 × SSPE, 0,1% SDS bei 50°C (vgl. z.B. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis u.a., Herausgeber, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1989).
Brauchbare Pro-Domänen beinhalten die nachstehend beschriebenen Pro-Domänen voller Länge sowie verschiedenartige abgeschnittene Formen von diesen, insbesondere abgeschnittene Formen, die an proteolytischen Arg-Xaa-Xaa-Arg-Spaltungsstellen abgespalten werden. Zum Beispiel umfassen bei OP-1 mögliche Pro-Sequenzen durch die Reste 30-292 (Form mit voller Länge), 48-292 und 158-292 definierte Sequenzen. Die Komplexstabilität von löslichem OP-1 wird verstärkt, wenn die Pro-Domäne die Form voller Länge und nicht eine abgeschnittene Form umfaßt, wie etwa die abgeschnittene Form 48-292, insofern als die Reste 30-47 eine Sequenzhomologie zu den N-terminalen Bereichen anderer osteogener Proteine zeigen und angenommenermaßen eine besondere Nutzanwendung bei der Verstärkung der Komplexstabilität für sämtliche osteogenen Proteine besitzen. Demgemäß sind die gegenwärtig bevorzugten Pro-Sequenzen diejenigen, die die Form voller Länge der Pro-Domäne für ein gegebenes Morphogen kodieren (siehe unten). Andere Pro-Sequenzen, für die eine Nützlichkeit gesehen wird, beinhalten biosynthetische Pro-Sequenzen, insbesondere diejenigen, die eine Sequenz beinhalten, welche vom N-terminalen Bereich einer oder mehrerer Pro-Sequenzen osteogenen Proteins abgeleitet sind.
Eine kurze Beschreibung von OP-1 wird nachstehend gegeben, gefolgt von Beispielen, die zeigen, wie lösliche Formen dieser Proteine zu isolieren und wie Antikörper zu erzeugen und zu identifizieren sind, die eine Spezifität für die reife oder "gereinigte" Form und die lösliche oder "Medium"-Form oder für beide Formen von Proteinen besitzen. Bei einer besonders beovrzugten Ausführungsform erkennen Antikörper oder andere Bindungsproteine, die die lösliche Form des Proteins erkennen, nicht auch die Vorläuferform des Pro-Domänenpeptids allein. Wie für den Durchschnittsfachmann ersichtlich, ist es mit dieser Angabe möglich, die Menge einer gegebenen bevorzugten Form eines rekombinant erzeugten im Kulturmedium vorhandenen osteogenen Proteins genauer zu identifizieren und/oder zu quantifizieren als durch die früher zur Verfügung stehenden Verfahren, z.B. Verfahren, die auf Antikörpern beruhten, die spezifisch für nur bei der reifen Form oder löslichen Form des Proteins vorhandene Epitope sind. Es ist jetzt auch möglich, eine gewünschte Form des Proteins genau zu isolieren. Zum Beispiel kann man die lösliche Komplexform vorzugsweise isolieren, indem man das Kulturmedium über eine Affinitätssäule laufen läßt, die gebundene Antikörper mit einer Bindungsspezifität nur für die Pro-Domänenform aufweist, und dann das gebundene Protein unter Verwendung von Standardverfahren zur Modifizierung der Bindungsbedingungen selektiv desorbiert, wodurch die selektive Isolierung des Komplexes ermöglicht wird. Zum Beispiel kann man die Bindungsbedingungen durch Anwendung eines niedrigeren pH-Wertes, von Denaturationsmitteln oder durch die Konkurrenz mit einem für die Antikörperbindungsstelle spezifischen Peptid verändern. Es wird auch angenommen, daß die Antikörper und Protokolle zur Identifizierung beider Formen des Proteins in einer Lösung verwendet werden können. Eine besonders nützliche Anwendung der Erfindung ist als Teil eines Protokolls zur Kontrolle der pharmakologischen Reinheit einer Zusammensetzung osteogenen Proteins, die für klinische Anwendungen verwendet wird.
Obwohl die Beispiele die Nutzanwendung der Erfindung mittels eines der Veranschaulichung dienenden Proteins, OP1, darlegen, ist zu erkennen, daß die hier vermittelten Verfahren und Zusammensetzsungen ohne unzumutbares Experimentieren auf andere Mitglieder der Familie osteogener Proteine ausgedehnt werden können. In gleicher Weise ist, während die Beispiele auf Antikörper als Bindungspartner mit Spezifität für ein Epitop bei einem osteogenen Protein und Immunoassays als Erkennungsprotokolle gerichtet sind, jeder Bindungspartner, insbesondere jedes Bindungsprotein hier einbezogen, das in der Lage ist, die gleiche Unterscheidungskraft wie die hier beschriebenen Antikörper zu liefern. Außerdem sind, während nur monoklonale und polyklonale Antikörper im einzelnen beschrieben sind, andere Antikörperformen einschließlich biosynthetischer Formen wie etwa Einfachkettenkonstrukte, die vom Fachmann als "sFv's" bezeichnet werden, ebenfalls in den Rahmen der Erfindung einbezogen.
OP1 – Bezieht sich generisch auf die Familie von osteogen aktiven Proteinen, die durch Ausprägung eines Teils oder der Gesamtheit des hOP1-Gens hergestellt werden. Auch in verwandten Anmeldungen als "OPI" und "OP-1" bezeichnet.
hOP1-PP – Aminosäurensequenz des Humanproteins OP1 (prepro Form), Seq. ID Nr. 1, Reste 1-431. Auch in verwandten Anmeldungen als "OP1-PP" und "OPP" bezeichnet.
OP1-18Ser – Aminosäurensequenz des reifen Humanproteins OP1, Seq. ID Nr. 1, Reste 293-431. Die N-terminale Aminosäure ist Serin. Ursprünglich identifiziert als migrierend bei 18 kDa bei SDS-PAGE in COS-Zellen. Migriert auch, abhängig von den Proteinglycosilierungsmustern in verschiedenen Wirtszellen, bei 23kDa, 19kDa und 17kDa bei SDS-PAGE. In verwandten Anmeldungen auch als "OP1-18" bezeichnet.
OPS – Aminosäurensequenz, die den C-terminalen Sechs-Cysteinbereich, Reste 335-431 von Seq. ID Nr. 1, definiert.
OP7 – Aminosäurensequenz, die den C-terminalen Sieben-Cysteinbereich, Reste 330-431 von Seq. ID Nr. 1, definiert.
I Physikalische und antige Struktur von löslichem OP-1 und reifem dimerem OP-1
1a. Löslichkeit von reifem, dimerem OP-1
Die Löslichkeitseigenschaften der gereinigten reifen OP-1-Dimere (hier auch als "reines OP-1" oder "gereinigtes OP-1" bezeichnet, im Gegensatz zu OP-1, wie im Medium vorgefunden, hier auch als lösliches oder "Medium"-OP-1 bezeichnet) sind ausgiebig untersucht worden. Die Schlußfolgerung dieser Untersuchungen hat ergeben, daß reifes OP-1 tyischerweise nur unter Denaturierungsbedingungen löslich ist. Im Gegensatz dazu bleibt das rekombinant hergestellte OP-1, das ursprünglich in mit Säugerzellen (CHO-Zelle) konditioniertem Medium abgesondert wurde, in Abwesenheit von Denaturationsmitteln löslich. Es zeigte sich, daß reifes OP-1 löslich ist in niedrigen Konzentrationen von Detergentien einschließlich 0,1% SDS und CHAPS und unter milden Denaturationsbedingungen wie etwa geringer Ionenstärke bei niedrigem pH-Wert oder in Gegenwart von Denaturationsmitteln mit nicht-ionischen De tergentien, z.B. 6 M Harnstoff + 0,3% Tween-80 und in Gegenwart eines gesäuerten organischen Lösemittels wie 50% Acetonitril mit 0,1% TFA. Es wurde nun gefunden, daß denaturierende Lösemittelbedingungen den Pro-Domäne vom reifen Bereich trennen und daß die früher entwickelten Reinigungsprotokolle mit Denaturationsmitteln die Isolierung der komplexierten, hoch löslichen Form verhindern. Wie nachstehend beschrieben, muß die Reinigung der löslichen Komplexe in Abwesenheit von Denaturationsbedingungen erfolgen.
1.b Herstellung von abgesondertem OP-1 durch CHO-Zellen
Von Säugerzellen hergestelltes OP-1 wird synthetisiert und in einer löslichen dimeren Form abgesondert als Ergebnis mehrerer Posttranslationsänderungen einschließlich entsprechender Faltung, Dimerisierung, Glycosylierung und Abspaltung an der Verbindung des Pro-Domänes und des reifen Bereichs. Einiges Pro-OP-1 wird auch ohne Abspaltung abgesondert, was zu abgesondertem Pro-OP-1 führt.
1.c Identifizierung von löslichem OP-1 (komplexiert)
Rekombinates OP-1 in Ausprägung durch CHO (Ovariumzellen von chinesischen Hamstern, vgl. US-Patent Nr. 5266638 zum Beispielsprotokoll) wird in serumhaltiges Medium abgesondert und existiert wie in einer löslichen Form. Diese scheinbare Löslichkeit von OP-1 könnte durch die Verbindung von OP-1 mit einer Komponente des Serums oder durch die Absonderung von OP-1 von CHO-Zellen in einer löslicheren Form als in seinem endgültigen gereinigten Zustand hervorgerufen sein.
1.d Cleveland Mapping des 39-kDa-Proteins
Unter Verwendung eines metabolisch markierten Proteins wird ein Methioninmarkiertes 39-kDa-Protein aus Kulturmedium in OP-1-abhängiger Weise zusammen mit OP-1 ausgefällt. Das Protein wurde weiter durch Cleveland Mapping unter Verwendung von Standardmethoden gekennzeichnet (vgl. z.B. Cleveland, D.W. (1977) J. Biol. Chem. 252: 1102). Bänder mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 50, 39 und 19/17 auf kDa-Basis im Vergleich mit Standard-Molekulargewichtsmarkierern wurden von einem PAGE-Gel isoliert, wobei die Gelscheiben in Mulden eines 20% Acrylamidgels zusammen mit verschiedenen Mengen von Endoproteinase lys-C gelegt, zur Elektrophorese im Schichtgel und zum Digerieren für 30 Minuten gebracht wurden, gefolgt durch Auflösung der erzeugten Fragmente auf dem 20% Gel. Das 50-kDa-Protein wurde aufgespalten, so daß zwei Fragmente erbracht wurden. Das größere von diesen wurde ebenfalls durch das 39-kDa-Protein erzeugt, während das kleinere von den 19/17-kDa-Proteinen erzeugt wurde. Diese Tatsachen lassen in starkem Maße vermuten, daß das 39-kDa-Protein die Pro-Domäne von OP-1 war. Eine weitere Analyse der abgesonderten Form von OP-1 wurde durch die Isolierung von reifem OP-1 als ein löslicher Komplex von CHO-konditioniertem Medium möglich gemacht.
2. Reinigungsprotokoll für lösliches osteogenes Protein
Lösliche Komplexe, die osteogenes Protein umfassen, können von konditioniertem Medium unter Verwendung eines einfachen dreistufigen chromatografischem Protokolls isoliert werden, das in Abwesenheit von Denaturationsmitteln durchgeführt wird. Das Protokoll beinhaltet, daß man das Medium (oder Körperfluid) über eine Affinitätssäule laufen läßt, gefolgt von Ionenaustausch- und Gelfiltrationschromatografie. Die nachstehend beschriebene Affinitätssäule ist eine Zn-IMAC-Säule. Ein alternatives Protokoll, das auch für brauchbar angesehen wird, ist eine Immunoaffinitätssäule, die unter Verwendung von Standardverfahren und z.B. unter Verwendung eines für eine gegebene Pro-Domäne eines osteogenen Proteins spezifischen Antikörpers (komplexiert zum Beispiel mit einer Protein-A-konjugierten Sepharosesäule) geschaffen wird. Protokolle zum Entwickeln von Immunoaffinitätssäulen sind im Stand der Technik weithin beschrieben, vgl. zum Beispiel Guide to Protein Purification, M. Deutscher, Herausgeber, Academic Press, San Diego, 1990, insbesondere Abschnitte VII und XI).
Bei diesem Experiment wurde OP-1 in CHO-Zellen ausgeprägt, wie oben beschrieben. Das mit CHO-Zellen konditionierte Medium, das 0,5% FBS enthält, wurde anfangs unter Anwendung der immobilisierten Metallionen-Affinitätschromatografie (IMAC) gereinigt. Der lösliche OP-1-Komplex aus dem konditionierten Medium geht sehr selektiv eine Bindung mit dem Zn-IMAC-Harz ein, vermutlich durch Assoziation mit der Pro-Domäne, und es wird eine hohe Konzentration von Imidazol (50 mM Imidazol, pH-Wert 8,0) für die effektive Elution des gebundenen Komplexes benötigt. Das Zn-IMAC-gereinigte lösliche OP-1 wird als nächstes auf eine S-Sepharosekationenaustauschsäule gegeben, äquilibriert in 20 mM NaPO₄ (pH-Wert 7,0) mit 50 mM NaCl. Dieser S-Sepharoseschritt dient zur weiteren Reinigung und Konzentrierung des löslichen OP-1-Komplexes als Vorbereitung für den folgenden Gelfiltrationsschritt. Das Protein wurde auf eine Sephacryl-S-200HR-Säule, äquilibriert in TBS, gegeben. Unter Verwendung im wesentlichen des gleichen Protokolls können lösliche osteogene Proteine auch von einem oder mehreren Körperfluids einschließlich Serum, Cerebro-Spinalfluid oder Peritonealfluid isoliert werden.
IMAC wurde durchgeführt unter Verwendung von Chelatbildungssepharose (Pharmacia), die mit drei Säulenvolumen von 0,2 M ZnSO₄ beladen wurde. Das konditionierte Medium wurde auf einen pH-Wert 7,0 titriert und direkt auf das Zn-IMAC-Harz gegeben, äquilibriert in 20 mM HEPES (pH-Wert 7,0) mit 500 mM NaCl. Das Zn-IMAC-Harz wurde mit 80 mL konditioniertem Startermedium pro mL Harz geladen. Nach der Ladung wurde die Säule mit einem Äquilibrierungspuffer gewaschen, und der größte Teil der Verunreinigungsproteine wurde mit 35 mM Imidazol (pH-Wert 7,0) im Äquilibrierungspuffer eluiert. Der lösliche OP-1-Komplex wird dann mit 50 mM Imidazol (pH-Wert 8,0) in 20 mM HEPES und 500 mM NaCl eluiert.
Das den löslichen OP-1-Komplex enthaltende 50 mM Imidazoleluat wurde mit neun Volumen von 20 mM NaPO₄ (pH-Wert 7,0) verdünnt und auf eine S-Sepharose(Pharmacia)-Säule gegeben, äquilibriert in 20 mM NaPO₄ (pH-Wert 7,0) mit 50 mM NaCl. Das S-Sepharose-Harz wurde mit einem Äquivalent von 800 mL des konditionierten Startermediums pro mL Harz beladen. Nach der Beladung wurde die S-Sepharosesäule mit Äquilibrierungspuffer gewaschen und mit 100 mM NaCl eluiert, gefolgt von 300 mM und 500 mM NaCl in 20 mM NaPO₄ (pH-Wert 7,0). Der Pool von 300 mM NaCl wurde unter Verwendung der Gelfiltrationschromatografie weiter gereinigt. Fünfzig ml des Eluats von 300 mm NaCl wurden auf 5,0 × 90 cm Sephacryl-S-200 Hr (Pharmacia) gegeben, äquilibriert in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS), 50 mM Tris, 150 mM NaCl (pH-Wert 7,4). Die Säule wurde mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 5 ml/Minute unter Einsammlung von 10 mL Fraktionen eluiert. Das scheinbare Molekulargewicht des löslichen OP-1 wurde durch Vergleich mit Proteinmolekulargewichtsstandards (Alkoholdehydrogenase (ADH, 150 kDa), Rinderserumalbumin (BSA, 68 kDa), Karbonatdehydrase (CA, 30 kDa) und Cytochrom C (cyt C, 12,5 kDa) bestimmt (vgl. 3). Die Reinheit der S-200-Säulenfraktionen wurde durch Trennung auf üblichen 15% Polyacrylamid-SDS-Gels bestimmt, die mit Algalmablau gefärbt waren. Die Identität des reifen OP-1 und der Pro-Domäne wurde durch N-Terminalsequenzanalyse nach Trennung des reifen OP-1 von der Pro-Domäne unter Anwendung der Standardumkehrphase C18 HPLC bestimmt.
3 zeigt das Absorptionsprofil bei 280 nm. Der lösliche OP-1-Komplex eluiert mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 110 kDa. Dieses stimmt voll überein mit der vorausgesagten Zusammensetzung des löslichen OP-1-Komplexes mit einem reifen OP-1-Dimer (35-36 kDa), assoziiert mit zwei Pro-Domänen (jeweils 39 kDa). Die Reinheit des Endkomplexes kann dadurch überprüft werden, daß man die entsprechende Fraktion in ein reduziertes 15% Polyacrylamidgel einlaufen läßt.
Die Komplexkomponenten können dadurch überprüft werden, daß man die den Komplex enthaltende Fraktion aus der S-200- oder S-200HR-Säule über eine Umkehrphasensäule C18 HPLC laufen läßt und in einem Acetonitrilgradienten (in 0,1% TFA) unter Verwendung von Standardverfahren eluiert. Der Komplex wird durch diesen Schritt dissoziiert, und die Pro-Domäne und die reife Spezies eluieren als gesonderte Spezies. Diese getrennten Spezies können dann einer N-Terminalsequenzierung unter Anwendung von Standard-Verfahren (vgl. zum Beispiel Guide to Protein Purification, M. Deutscher, Herausgeber, Academic Press, San Diego, 1990, insbesondere Seiten 602-613) unterzogen, und die Identität der isolierten Proteine 36kD, 39kDa als reifes osteogenes Protein bzw. isolierte abgespaltene Pro-Domäne kann bestätigt werden. Die N-Terminalsequenzierung der isolierten Pro-Domäne von aus Säugerzellen hergestelltem OP-1 zeigt zwei Formen der Pro-Domäne, wobei die vorherrschende Form die intakte Form (beginnend mit Rest 30 von Seq. ID Nr. 1) ist, und, als geringere Spezies, eine abgeschnittene Form (beginnend mit Rest 48 von Seq. ID Nr. 1) vorliegt. Die N-Terminalsequenzierung der Polypeptiduntereinheit der isolierten reifen Spezies zeigt einen Bereich von N-Termini für die reife Sequenz, beginnend bei den Resten 293, 300, 313, 315, 316 und 318 von Seq. ID Nr. 1, die sämtlich aktiv sind, wie es durch den Standard-Knocheninduktionsversuch nachgewiesen wurde. (vgl. z.B. US-Patente Nr. 5011691 und Nr. 5266683 hinsichtlich Beschreibungen des Standard-Rattenknocheninduktionsversuchs.)
II. Feststellung von osteogenem Protein
Wie oben ausgeführt, sind das Verfahren und die Zusammensetzung nach der Erfindung darauf gerichtet, bevorzugte Formen von osteogenem Protein in einer Lösung, wie etwa einem Kulturmedium oder Körperfluid, zu identifizieren und/oder zu quantifizieren. Wie für den Fachmann einsehbar, ist jedes Mittel zur spezifischen Identifizierung und Quantifizierung des Proteins ins Auge gefaßt. Der gegenwärtige Stand der Technik zur Identifizierung von Proteinen in Lösung verwendet als Mittel einen Immunoassay, bei dem ein zur spezifischen Bindung mit dem Protein von Interesse befähigter Antikörper verwendet wird, um das Protein in Lösung zu identifizieren, und dann Menge des gebildeten verbundenen Komplexes bestimmt wird.
Die Antikörpermethodik ist allgemein gebräuchlich und in der Literatur beschrieben. Eine detailliertere Beschreibung ihrer Aufbereitung findet sich zum Beispiel in Practical Immunology, Butt, W.R., Herausgeber, Marcel Dekker, New York, 1984. Allgemein gesprochen können Antikörper gegen eine oder mehrere bevorzugte Formen eines osteogenen Proteins gezüchtet werden, indem ein geeignetes Tier mit einer immunogenen Zubereitung unter Bedingungen immunisiert wird, die eine Antikörperproduktion in diesem Tier induzieren. Monoklonale Antikörper kann man dann dadurch erhalten, daß geeignete Antikörper produzierende Zellen, wie etwa Milz- oder Lymphknotenzellen, mit Myelomzellen verschmolzen und die Schmelzprodukte auf nukleare Reaktivität gegen die Immunogenquelle (z.B. Zellinie oder bestimmte Zelltypdeterminante) unter Verwendung von Standardtechniken einem Screening unterzogen werden.
Das gegenwärtig bevorzugte Verfahren zum Nachweis osteogener Proteine in einer Lösung und/oder zu ihrer Quantifizierung arbeitet mit Feststellung der Proteine mit gegenüber osteogenem Protein spezifischen Antikörpern. Die Antikörper können monoklonal oder polyklonal im Ursprung sein und nach Standard-Methodiken hergestellt werden. Die als Immunogene verwendeten osteogenen Proteine können wie oben beschrieben hergestellt werden. Dies bedeutet, daß eine intakte dimere Spezies oder ein löslicher Komplex als Antigen (Immunogen) verwendet werden kann. Statt dessen kann ein Pro-Domänenpeptid mit Vorteil verwendet werden, das man z.B. durch Dissoziierung eines löslichen Komplexes und Isolieren des Peptids oder durch enzymatisches Aufschließen einer Vorläuferform erhalten kann. Alternativ kann die gesamte Vorläuferform als Immunogen verwendet werden.
Antikörper zu einem oder mehreren dieser Proteine werden dann unter Verwendung von Standardmethoden aufgezogen. Die Antikörper werden dann der Fluidprobe unter solchen Bedingungen ausgesetzt, daß eine spezifische Bindung des Antikörpers an sein spezifisches Epitop möglich wird, und dann wird der gebildete Komplex Bindungspartner – osteogenes Protein (hier der Komplex Antikörper-Osteogenes Protein) festgestellt.
Die Überlegungen zur Auslegung des Immunoassays beinhalten die Herstellung von Antikörpern (monoklonal oder polyklonal) mit einer so hohen Bindungsspezifität für ihr Antigen, daß der spezifisch gebundene Antikörper-Antigen-Komplex zuverlässig von nicht spezifischen Interaktionen unterschieden werden kann. Je höher die Antikörperbindungsspezifität ist, desto geringer ist die Antigenkonzentration, die festgestellt werden kann. Die Wahl einer Markierungskennzeichnung zum Feststellen der Komplexbildung von osteogenem Protein-Antikörper ist auch von den gewünschten Nachweisbegrenzungen abhängig. Enzymassays (ELISAs) ermöglichen typischerweise die Feststellung eines gefärbten Produkts, das durch die Wechselwirkung des enzymmarkierten Komplexes mit einem Enzymsubstrat gebildet wird. Alternative Markierungen beinhalten radioaktive oder fluoreszente Markierungen. Die empfindlichste Markierung, die bis heute bekannt ist, ist eine chemilumineszente Markierung, wobei die Wechselwirkung mit einem Reaktionspartner zur Erzeugung von Licht führt. Brauchbare Markierungen beinhalten chemilumineszente Moleküle wie etwa Acridiumester oder chemilunineszente Enzyme, wobei der Reaktionspartner ein Enzymsubstrat ist. Wenn zum Beispiel Acridiumester mit einer Alkaliperoxidlösung reagieren, wird ein intensiver Lichtblitz ausgesandt, was es ermöglicht, die Feststellungsgrenze 100 bis 10.000 mal gegenüber derjenigen zu erhöhen, die durch andere Markierungen bereitgestellt wird. Zusätzlich ist die Reaktion schnell. Eine detaillierte Übersicht über Chemilumineszenz und Immunoassays findet sich in Weeks, u.a. (1983) Methods in Enzymology 133: 366-387. Andere Überlegungen beinhalten die Verwendung von Microtitermulden oder Säulenimmunoassays. Säulenassays können besonders vorteilhaft in den Fällen sein, in denen schnell reagierende Markierer, wie chemiluminescente Markierer, verwendet werden. Der markierte Komplex kann zu einem Nachsäulendetekor eluiert werden, der auch den Reaktionspartner oder das Enzymsubstrat enthält, der es ermöglicht, daß das nachfolgend gebildete Produkt unmittelbar festgestellt wird.
Eine detaillierte Übersicht über die Auslegung immunologischer Assays, Theorie und Protokolle läßt sich in zahlreichen Texten im Stand der Technik finden, einschließlich Practical Immunology, Butt, W.R., Herausgeber, Marcel Dekker, New York, 1984. Unter den verschiedenartigen zur Verfügung stehenden Immunoassayformaten ist eines der empfindlichsten die Sandwichtechnik. Bei diesem Verfahren werden zwei Antikörper verwendet, die mit dem Analyt von Interesse bindungsfähig sind: Einer immobilisiert auf einem festen Träger, und einer frei in Lösung, jedoch markiert mit einer leicht feststellbaren chemischen Verbindung. Wie oben beschrieben, umfassen chemische Markierer, die für den zweiten Antikörper verwendet werden können, Radioisotope, fluoreszierende Verbindungen und Enzyme oder andere Moleküle, die gefärbte oder elektrochemische aktive Produkte erzeugen, wenn sie einem Reaktionspartner oder Enzymsubstrat ausgesetzt werden. Wenn Proben, die den Analyt (z.B. osteogenisches Protein in einer gegebenen Form) enthalten, in dieses System eingebracht werden, verbindet sich der Analyt sowohl mit dem immobilisierten Antikörper als auch mit dem markierten Antikörper. Dieses Ergebnis ist ein "Sandwich"-Immunkomplex auf der Oberfläche des Trägers. Der Analyt wird durch Wegwaschen nicht gebundener Probenkomponenten und überschüssigen markierten Antikörpers und Messen der Menge des mit dem Analyt auf der Trägeroberfläche komplexierten markierten Antikörpers festgestellt. Der Sandwich-Immunoassay ist in hohem Maße spezifisch und sehr empfindlich, vorausgesetzt, daß Markierer mit guten Nachweisgrenzen verwendet werden.
Eine weitere brauchbare Form eines Immunoassays, der insbesondere für Screening-Untersuchungen anwendbar ist, ist der Western Blot. Hier werden Proteine von Interesse durch Gelelektrophorese dispergiert und auf einer Nitrozellulosemembran immobilisiert. Es werden dann Prüfungsantikörper zugegeben, typischerweise mit einem Nachweismittel, z.B. einem radioaktiven Markierer oder Enzym, wie oben beschrieben, komplexiert, wobei man dann die Komplexbildung eintreten läßt. Die Membran wird dann zur Entfernung von Proteinen gewaschen, die nur durch nicht spezifische Bindungsinteraktionen wirken, und die Komplexe, die gebunden bleiben, werden nachgewiesen. Ein detailliertes Standardprotokoll wird gegeben in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook u.a., Herausgeber, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1989. Wie hier verwendet, werden die osteogenen Proteine typischerweise elektrophoretisch sowohl unter Reduktions- als auch Oxidationsbedingungen behandelt.
2.a Antikörper-Herstellung
Nachstehend sind Standardprotokolle für die Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern angegeben. Für Antikörper, die nur die lösliche Komplexform erkennen, wird vorzugsweise der isolierte Komplex selbst als Antigen benutzt. Alternativ kann das Antigen die isolierte Pro-Domäne oder ein Peptidfragment von dieser umfassen. In den Fällen, in denen für das reife Protein spezifische Antikörper gewünscht sind, umfaßt das Antigen vorzugsweise die reife dimere Form (z.B. die "gereinigte" Form) oder eine Untereinheit des Dimers, die zumindest den C-terminalen Bereich oder ein Peptidfragment von diesem umfaßt.
2a. Polyklonale Antikörper
Es werden sodann Antikörper synthetisiert, wie hier nachstehend beschrieben, und in vitro auf Querreaktivität mit den verschiedenen Formen des Proteins von Interesse getestet.
Ein polyklonaler Antikörper kann wie folgt hergestellt werden. Jedes Kaninchen erhält eine primäre Immunisierung von 100 ug/500 μl Antigen, 500 μl Complete Freund's Adjuvant. Die Löslichkeit eines gegebenen Antigens kann gegebenenfalls verstärkt werden durch Kombinieren des Antigens in einem Lösungsvermittler, z.B. 0,1% SDS, vor der Kombination mit dem Adjuvans. Das Antigen wird subkutan an mehreren Stellen am Rücken und an den Lenden des Tieres injiziert. Das Kaninchen wird nach einem Monat in der gleichen Weise unter Verwendung von unvollständigem Freund's Adjuvans geboostet. Sieben Tage später werden Testblutentnahmen aus der Ohrvene genommen. Zwei zusätzliche Boost-Vorgänge und Testblutentnahmen werden in monatlichen Intervallen durchgeführt, bis Antikörper gegen das Antigen des osteogenen Proteins im Serum unter Verwendung eines ELISA-Tests nachgewiesen werden. Sodann wird das Kaninchen monatlich mit 100 μg Antigen geboostet und an den Tagen sieben und zehn nach dem Boosten zur Ader gelasen (15 ml pro Blutentnahme).
2b. Monoklonale Antikörper
Monoklonale Antikörper, die für ein gegebenes osteogenes Protein spezifisch sind, können wie folgt hergestellt werden. Eine Maus erhält zwei Injektionen des Osteogenprotein-Antigens. Das Protein oder Proteinfragment wird vorzugsweise rekombinant hergestellt. Die erste Injektion enthält 100 μg Antigen in vollständigem Freund's Adjuvans und wird subkutan verabreicht. Die zweite Injektion enthält 50μg Antigen in unvollständigem Adjuvans und wird intraperitonäal verabreicht. Die Maus erhält dann eine Gesamtmenge von 230 μg OP-1 in vier intraperitonäalen Injektionen zu verschiedenen Zeiten über einen längeren Zeitraum (z.B. eine Periode von einem bis acht Monaten). Eine Woche vor der Verschmelzung wird die Maus intraperitonäal mit Antigen (z.B. 100 μg) geboostet und kann zusätzlich mit einem Peptidfragment geboostet werden, das mit Rinderserumalbumin mit einem geeigneten Vernetzungsmittel konjugiert ist. Dieses Boosten kann fünf Tage (IP), vier Tage (IP), drei Tage (IP) und einen Tag (IV) vor der Verschmelzung wiederholt werden. Die Milzzellen der Maus werden dann mit im Handel erhältlichen Myelomzellen in einem Verhältnis von 1:1 unter Verwendung von PEG 1500 (Boehringer Mannheim, Deutschland) verschmolzen und die geschmolzenen Zellen werden plattiert und gescreent auf reife oder lösliche osteogenproteinspezifische Antikörper unter Verwendung des entsprechenden Teils der Osteogenproteinsequenz als Antigen. Die Schritte der Zellverschmelzung und des monoklonalen Screenings werden ohne weiteres nach Standardverfahren durchgeführt, die in weithin im Stand der Technik erhältlichen Standardtexten ausführlich beschrieben sind.
2c. Antikörper-Spezifität
Unter Verwendung dieser Standardverfahren wurden Anti-Pro-Domänenantisera von Kaninchen unter Verwendung der isolierten Pro-Domäne von OP-1 als Antigen hergestellt, und monoklonale Antikörper ("mAb") zum reifen Bereich wurden in Mäusen unter Verwendung einer von E. coli-hergestellten abgeschnittenen Form von OP-1 als Antigen hergestellt.
Eine Standard-Western-Blot-Analyse, die, wie hier vorstehend beschrieben unter Reduktionsbedingungen durchgeführt wurde, zeigt, daß die Anti-Pro-Domänenantisera ("Anti-Pro") nur für die Pro-Domäne spezifisch sind, während der mAb zu reifem OP-1 ("Anti-reifes-OP-1") spezifisch für die dimeren Untereinheiten ist, daß die beiden Antikörper nicht quer reagieren und daß die Antikörper dazu benutzt werden können, zwischen löslichen und reifen Proteinformen in einer Probe, z.B. von konditioniertem Medium oder Serum, zu unterscheiden. Eine tabellarische Darstellung der Western-Blot-Ergebnisse ist die nachstehende Tabelle I, in der die Reaktivität von mAb auf reifes OP-1 mit "yy" und die Reaktivität des Anti-Pro-Serums mit "xx" angegeben ist.
Tabelle 1
In einer zweiten Serie wurden monoklonale Antikörper gegen jedes der folgenden Antigene gezüchtet: Löslicher Komplex und unkomplexierte, reife dimere Spezies.
Es wurden dann Klone auf Reaktivität gegenüber den verschiedenen Formen von OP-1 in einem ELISA-Test, wie oben beschrieben, gescreent. Hier wurden die verschiedenartigen Formen des getesteten OP-1 auf einer Oberfläche immobilisiert, dann der zu screenende Antikörper zugegeben und gebundener Antikörper unter Verwendung eines Ziegen-Antimaus-Antikörpers nachgewiesen. Es wurden fünf verschiedene Phenotypen oder Bindungskategorien identifiziert, die nachstehend beschrieben werden. In der Tabelle bedeutet "s" löslicher Komplex, "M" bedeutet reife, dimere Spezies und "P" bedeutet isolierte Pro-Domäne.
Tabelle II
Antikörper mit dem Bindungscharakter der Kategorie #1 erkennen ein sowohl bei der unkomplexierten dimeren Spezies als auch bei der löslichen Form vorhandens Epitop.
Antikörper mit dem Bindungscharakter der Kategorie #2 erkennen ein sowohl bei dem löslichen Komplex als auch bei der Pro-Domäne vorhandenes Epitop. Antikörper mit dem Bindungscharakter der Kategorie #3 erkennen nur die Form des löslichen Komplexes, was beweist, daß eine Konformationsänderung bei der Komplex bildung in solchem Maße eintritt, daß ein Epitop erzeugt wird, das bei anderen Formen des Proteins nicht vorhanden ist. Antikörper mit diesem Bindungscharakter sind besonders nützlich zur Überprüfung des Vorhandenseins eines Komplexes, einschließlich der Bildung des löslichen Komplexes in vitro von seinen Komponenten (z.B. unkomplexiertes Dimer und isoliertes Pro-Domänenpeptid).
Antikörper mit dem Bindungscharakter der Kategorie #4 erkennen nur ein Epitop an der Pro-Domäne, was beweist, daß die Komplexbildung dazu ausreicht, ein am löslichen Komplex vorhandenes Epitop zu maskieren oder zu zerstören. In gleicher Weise erkennen Antikörper mit dem Bindungscharakter der Kategorie #5 nur ein Epitop bei der reifen, dimeren nicht komplexierten Proteinform, jedoch nicht bei dem löslichen Komplex.
Selbstverständlich können einzelne Mitglieder innerhalb einer gegebenen Kategorie verschiedene Epitopen binden. Demgemäß kann ihr Bindungscharakter in bezug auf die verschiedenen Proteinformen in Abhängigkeit von den Testbedingungen varieren. Zum Beispiel zeigen einzelne Mitglieder der Kategorie #1, obwohl sie noch die reifen und löslichen Formen erkennen, vorzugsweise eine Bindungsaffinität für die lösliche Form gegenüber der reifen Form unter Sandwich-ELISA-Bedingungen, bei denen das Mitglied der Kategorie #1 den Einfangantikörper bildete. In gleicher Weise zeigen einzelne Mitglieder der Kategorie #2 veränderliche Bindung für die Pro-Domäne unter Western-Blot-Bedingungen.
III. Immunoassays
Die Fähigkeit, osteogene Proteine in Lösung festzustellen und zwischen löslichen und reifen dimeren Formen zu unterscheiden, bildet ein wertvolles Mittel für Proteinherstellungssysteme. In Ansehung der Qualitätskontrolle werden Mittel verlangt, die in der Lage sind, sowohl die Form des Proteins in Lösung als auch dessen Menge festzustellen. Dieses gilt insbesondere für biologische Therapeutika, bei denen pharmakologisch bestimmte Formen für den klinischen Gebrauch zur Verfügung gestellt werden müssen. Das Verfahren liefert auch ein nützliches Mittel für Diagnoseassays, das es einem ermöglicht, den Grad und den Typ von im Körper, z.B. in Serum und anderen Körperfluids, freiem osteogenem Protein zu kontrollieren.
Ein gegenwärtig bevorzugtes Nachweismittel zur Beurteilung des Grades von osteogenem Protein in einem Fluid, einschließlich Kultur oder Körperfluid, beinhaltet einen Immunoassay, der einen Antikörper oder ein anderes geeignetes Bindungsprotein verwendet, das in der Lage ist, spezifisch mit einem osteogenen Protein zu reagieren, und das als Teil eines Komplexes mit dem Protein nachgewiesen wird. Immunoassays können unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt werden, die im Stand der Technik bekannt sind und Antikörper verwenden, die gegen das Protein und spezifisch für dieses Protein hergestellt worden sind.
Antikörper, die eine Form eines osteogenen Proteins von Interesse erkennen, können wie hier beschrieben erzeugt werden, und diese Antikörper können dann zur Kontrolle der Werte von Protein in einem Fluid einschließlich eines Körperfluids, wie etwa Serum, Vollblut oder Peritonäalfluid, verwendet werden.
Zur Überwachung endogener Konzentrationen der löslichen Form des Proteins hat der gewählte Antikörper vorzugsweise eine Bindungsspezifität für die lösliche Form. Für endogene Proteine können diese Antikörper Spezifität für die Pro-Domäne und/oder den löslichen Komplex aufweisen (z.B. die obigen Bindungskategorien 1-3). Solche Antikörper können erzeugt werden, indem man die Pro-Domäne oder einen Teil von dieser als Antigen oder den löslichen Komplex selbst verwendet, im wesentlichen wie beschrieben. Eine lösliche Pro-Domäne für die Verwendung als Antigen kann erreicht werden, indem man den löslichen Komplex isoliert und dann die nicht kovalent assoziierte Pro-Domäne von der reifen Domäne unter Verwendung von Standardverfahren trennt, z.B. durch chromatografische Mittel (vorzugsweise unter Verwendung einer Ionenaustauschsäule unter Denaturationsbedingungen, z.B. 6M Harnstoff), wie oben beschrieben, oder durch Trennung mittels Gelelektrophorese. Statt dessen kann die Pro-Form des Proteins in ihrer monomeren Form als Antigen verwendet werden, und die Testantikörper können durch Western Blot oder einen anderen Standard-Immunoassay auf diejenigen gescreent werden, die die Pro-Domäne der löslichen Form des Proteins von Interesse erkennen, nicht jedoch die reife Form, wie ebenfalls oben beschrieben.
Monomere Pro-Formen kann man aus Zelllysaten von CHO-produzierten Zellen oder aus prokaryotischer Ausprägung einer die Pro-Form kodierenden DNA in beispielsweise E.coli oder von einem im Handel erhältlichen Bacculovirusausprägungssystem in Insektenzellen erhalten. Die Pro-Form, die ein scheinbares Molekularge wicht von etwa 50 kDa in Säugerzellen besitzt, kann dann, wie oben beschrieben, isoliert werden.
Um die Menge von in einer Lösung vorhandenem osteogenem Protein festzustellen und/oder zu quantifizieren, kann ein Immunoassay zur Feststellung des osteogenen Proteins unter Verwendung eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers, der für dieses Protein spezifisch ist, durchgeführt werden. Hier können auch lösliche und reife Formen des osteogenen Proteins unter Verwendung von Antikörpern unterschieden werden, die zwischen den beiden Formen der Proteine unterscheiden, wie oben beschrieben. Die gegenwärtig bevorzugten Assays umfassen ELISA und Radioimmunoassays einschließlich kompetetiver Standardassays zum Quantifizieren des osteogenen Proteins in einer Probe, wobei man eine unbekannte Menge eines Probenproteins mit einem Anti-Osteogenproteinantikörper reagieren läßt und diese Interaktion mit einer bekannten Menge eines markierten Antigens in Konkurrenz treten läßt. Der Wert gebundenen oder freien markierten Antigens bei Gleichgewicht wird dann zum Quantifizieren der Menge von nicht markiertem Antigen in Lösung zu messen, wobei die Menge des Probenantigens proportional zur Menge freien markierten Antigens ist. Beispielprotokolle für die Assays sind nachstehend angegeben. Jedoch sind, wie der Fachmann erkennt, Abänderungen dieser Protokolle sowie andere Immunoassays, einschließlich Western Blots, in der Literatur allgemein bekannt und liegen im Bereich fachmännischen Könnens. Zum Beispiel wird in dem nachstehend angegebenen ELISA-Protokoll lösliches OP-1 in einer Probe unter Verwendung eines biotinylierten Anti-Proantiserums identifiziert. Biotinylierte Antikörper können in einem colormetrischen Assay oder in einem chemilumineszenten Assay, wie oben beschrieben, sichtbar gemacht werden. Statt dessen kann der Antikörper mit einem geeigneten Molekül, wie etwa ¹²⁵I, radiomarkiert werden. Noch ein weiteres Protokoll, das verwendet werden kann, ist ein Festphasenimmunoassay, der vorzugsweise eine Affinitätssäule mit einem Anti-Osteogenproteinantikörper, komplexiert mit der Matrixoberfläche, verwendet, über die eine Serumprobe geleitet werden kann. Eine detaillierte Beschreibung brauchbarer Immunoassays einschließlich Protokollen und allgemeinen Erwägungen ist zum Beispiel in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook u.a., Herausgeber Cold Spring Harbor Press, New York, 1989, insbesondere Abschnitt 18, enthalten.
Bei Serumassays wird das Serum vorzugsweise zuerst teilweise gereinigt, um einige der überschüssigen, kontaminierenden Serumproteine wie etwa Serumalbumin zu entfernen. Vorzugsweise wird das Serum durch Ausfällung in Ammoniumsulfat (z.B. 45%) extrahiert, derart, daß der Komplex ausgefällt wird. Eine weitere Reinigung kann unter Verwendung von Reinigungsstrategien erreicht werden, die den Vorteil der unterschiedlichen Löslichkeit des löslichen Osteogenproteinkomplexes oder der reifen osteogenen Proteine in bezug auf diejenige der anderen im Serum vorhandenen Proteine nutzen. Eine weitere Reinigung kann auch durch chromatografische Techniken, die im Stand der Technik allgemein bekannt sind, erreicht werden.
3a. Assays
Lösliches OP-1 kann unter Verwendung eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers in einem ELISA nachgewiesen werden, wie nachstehend in diesem Experi ment beschrieben. Ein für den OP-1-Pro-Domäne spezifischer polyklonaler Antikörper wird omalysiert, 1 μg/100 μl affinitätsgereinigtes polyklonales Kaninchen-IgG, spezifisch für OP-1-pro, jeder Mulde einer 96-Mulden-Platte zugegeben und bei 37° für eine Stunde inkubiert. Die Mulden werden viermal gewaschen mit 0,167M Natriumboratpuffer mit 0,15 M NaCl (BSB), pH-Wert 8,2, enthaltend 0,1% Tween 20. Zur Minimierung einer nicht spezifischen Bindung werden die Mulden durch vollständige Befüllung mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in BSB blockiert und für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Mulden werden dann viermal mit BSB, enthaltend 0,1% Tween 20, gewaschen. Eine Aliquote von 100 μl einer entsprechenden Verdünnung einer jeder der Testproben von Zellkulturüberstand oder Serumprobe wird jeder Mulde dreifach zugegeben und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wird 100 μl biotinylierter Antikörper von Kaninchen-Anti-Pro-Anti-Serum (die Vorratslösung beträgt etwa 1 mg/ml und verdünnt 1:400 in BSB, enthaltend 1 % BSA, vor Gebrauch) wird jeder Mulde zugegeben und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die Mulden werden dann viermal mit 0,1% Tween 20 enthaltendem BSB gewaschen. 100 μl Strepavidin-alkalisch (Southern Biotechnology Associates, Inc. Birmingham, Alabama, verdünnt 1:2000 in 0,1 % Tween 20 enthaltendem BSB vor Gebrauch) wird jeder Mulde zugegeben und 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die Platten werden viermal mit 0,5M Tris-gepufferter Salzlösung (TBS), pH-Wert 7,2, gewaschen. 50μl Substrat (ELISA Amplification System Kit, Life Technologies, Inc., Bethesda, MD) wird jeder Mulde zugegeben bei Inkubation bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Sodann wird 50μl Verstärker (aus dem gleichen Verstärkungssystemsatz) zugegeben und für weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 50μl 0,3M Schwefelsäure gestoppt. Die OD bei 490 nm der Lösung in jeder Mulde wird aufgezeichnet. Zur Quantifizierung des Maßes von löslichem OP-1 in der Probe wird eine Standardkurve parallel mit den Testproben vorgenommen. In die Standardkurve werden bekannte Anstiegsmengen von gereinigtem OP-1-pro eingegeben. Statt dessen können unter Verwendung von zum Beispiel Lumi-phos 530 (Analytical Luminescence Laboratories) als Substrat und Nachweis bei 300-650 nm in einem Standardluminometer Komplexe durch Chemilumineszenz nachgewiesen werden, die typischerweise eine empfindlichere Analyse als der Nachweis mittels eines sichtbaren Farbwechsels liefert.
3b. Radioimmunoassay auf Plattenbasis
Osteogenes Protein (lösliche oder reife Form) kann wie folgt in einem Standard-Radioimmunoassay auf Plattenbasis nachgewiesen werden. Empirisch bestimmte Grenzwerte eines Anti-Osteogenprotein-Antikörpers (z.B. Anti-OP-1, typischerweise 50-80 ng/Mulde) werden an Mulden einer PVC-Platte, z.B. in 50 μl PBS, Phospatpuffersalzlösung gebunden. Nach einer ausreichenden Inkubation zur Ermöglichung einer Bindung bei Raumtemperatur, typischerweise einer Stunde, wird die Platte in einer Boratpuffersalzlösung/Tween 20-Lösung gewaschen ("Waschpuffer"), und 200 μl Blockierung (3% BSA, 0,1 M Lysin in 1 × BSB) wird jeder Mulde zugegeben und eine Stunde zur Inkubation gebracht, wonach die Mulden wieder in Waschpuffer gewaschen werden. 40 μl einer Probe aus seriell verdünntem Plasma (vorzugsweise teilweise gereinigt wie oben beschrieben) oder ein osteogenes Standardprotein (z.B. OP-1) wird den Mulden dreifach zugegeben. Die Proben werden vorzugsweise verdünnt in PTTH (15 mM KH₂PO₄, 8 mM Na₂PO₄, 27 mM KCl, 137 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 1 mg/ml HSA, 0,05% NaN₃, pH-Wert 7,2). 10 μl eines markierten kompetitiven Antigens, vorzugsweise 100.000 – 500.000 cpm/Probe wird hinzugegeben (z.B. ¹²⁵I-OP-1, radiomarkiert unter Verwendung von Standardverfahren), und die Platten werden über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platten werden dann in Waschpuffer gewaschen und zum Trocknen gebracht. Die Mulden werden auseinandergeschnitten, und gebundenes markiertes OP-1 wird in einem Standard-Gammazähler gezählt. Die Mengen von gebundenem markiertem Antigen (z.B. ¹²⁵I-OP-1), die in Probenanwesenheit und -abwesenheit gemessen werden, werden dann verglichen, wobei der Unterschied proportional zu der Menge von Proben-Antigen (osteogenes Protein) ist, das im Probenfluid vorhanden ist.
3c. Betrachtungen zur Herstellungskontrolle
Proben zum Testen der Höhe der Proteinherstellung beinhalten Kulturüberstände oder Zelllysate, die periodisch gesammelt und auf die Herstellung von OP-1 durch Immunoblot-Analyse (Sambrook u.a., Herausgeber, 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY) untersucht werden, oder einen Teil der Zellkultur selbst, der periodisch gesammelt und zur Herstellung von polyA + RNA für eine mRNA-Analyse verwendet wird. Zur Kontrolle einer OP-1-Synthese de novo werden einige Kulturen nach herkömmlichen Verfahren mit einem Gemisch von ³⁵S-Methionin/³⁵S-Cystein für 6-24 Stunden markiert und dann auf OP-1-Synthese durch herkömmliche Verfahren der Immunpräzipitation ausgewertet.
3.d Diagnosen unter Verwendung von Antikörpern zum löslichen Osteogenproteinkomplex
Die Antikörper nach der vorliegenden Erfindung können auch zur Kontrolle der Höhe löslichen Proteins im Körper verwendet werden. Fluktuationen in den Werten des osteogenen Proteins, das im Blutstrom oder Peritonäalfluid vorhanden ist, können dann zur Beurteilung der Lebensfähigkeit von Gewebe verwendet werden. Zum Beispiel werden osteogene Proteine assoziiert mit regenerierendem Gewebe festgestellt und/oder können von sterbenden Zellen in peritonäales Umgebungsfluid freigesetzt werden.
Serumproben kann man durch eine Standard-Venenpunktion erhalten, und Seru wird durch Zentrifugieren bei 3000 U/min für zehn Minuten hergestellt. In gleicher Weise kann man Peritonäalfluidproben durch eine Standard-Fluidextraktionsmethode erhalten. Das Vorhandensein von osteogenem Protein im Serium oder peritonäalen Fluid kann dann durch einen Standard-Western-Blot (Immunoblot), ELISA- oder RIA-Verfahren, untersucht werden. Kurz gesagt, können zum Beispiel ELISA-Proben in einem entsprechenden Puffer, wie etwa Phosphatpuffer-Salzlösung, verdünnt werden, und 50 μl Aliquote läßt man auf Flachbodenmulden in Mikrotiterplatten absorbieren, die mit einem löslichen Osteogenprotein-spezifischen Antikörper vorbeschichtet sind, und für 18 Stunden bei 4°C inkubieren. Die Platten können dann mit einem Standardpuffer gewaschen und mit 50 μl Aliquote eines zweiten Osteogenprotein-spezifischen Antikörpers in Konjugation mit einem Nachweismittel, z.B. Biotin, in einem entsprechenden Puffer für 90 Minuten bei Raum temperatur inkubieren. Osteogenes Protein-Antikörper-Komplexe können dann unter Anwendung von Standardverfahren nachgewiesen werden.
Statt dessen kann eine Osteogenprotein-spezifische Affinitätssäule geschaffen werden, indem man z.B. lösliche Osteogenprotein-spezifische Antikörper adsorbiert an eine Säulenmatrix verwendet und die Fluidprobe durch die Matrix leitet, um das Protein von Interesse selektiv zu extrahieren. Das Protein wird dann eluiert. Ein geeigneter Elutionspuffer kann empirisch ermittelt werden, indem man die geeigneten Bindungs- und Elutionsbedingungen zuerst mit einem Kontrollmedium (z.B. gereinigtem, rekombinant erzeugtem Protein) bestimmt. Fraktionen werden dann auf das Vorhandensein der löslichen Proteinform durch einen Standard-Immunoblot getestet. Die Proteinkonzentrationen in Serum- oder anderen Fluidproben kann dann unter Verwendung von Standard-Protein-Quantifizierungstechniken, einschließlich durch spektrofotometrische Absorption oder durch Quantifizierung durch ELISA- oder RIA-Antikörperanalysen bestimmt werden. Bei Anwendung dieses Verfahrens ist OP-1 im Serum identifiziert worden.
OP-1 wurde in Humanserum unter Verwendung der folgenden Untersuchung nachgewiesen. Ein monoklonaler Antikörper, der gegen rekombinant erzeugtes Säuger-OP-1 unter Verwendung von Standard-Immunologietechniken, wie ausführlich im Stand der Technik und hier allgemein beschrieben, gezüchtet wurde, wurde immobilisiert, indem man den Antikörper über ein aktiviertes Agarosegel (z.B. Affi-Gel^TM von Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, hergestellt unter Befolgung der Instruktionen des Herstellers) leitete und zum Reinigen von OP-1 von Serum verwendete. Das Humanserum wurde dann über die Säule geleitet und mit 3M K-Thiocyanat eluiert. K-Thiocyanat-Fraktionen wurden dann dialysiert in 6M Harnstoff, 20mM PO₄, pH-Wert 7,0, aufgebracht auf eine C8-HPLC-Säule, und eluiert mit einem 20-minütigen, 25-50%-Acetonitril/0,1%-TFA-Gradienten. Reife, rekombinant erzeugte OP-1-Homodimere eluieren zwischen 20-22 Minuten. Demgemäß wurden diese Fraktionen von der affinitätsgereinigten Humanserumprobe gesammelt und auf das Vorhandensein von OP-1 durch einen Standard-Immunoblot unter Verwendung eines OP-1-spezifischen Antikörpers getestet und die Proteinidentität durch N-terminale Sequenzierung bestätigt.
Die Erfindung kann in anderen spezifischen Formen verkörpert sein, ohne von ihrem Geist oder ihren wesentlichen Merkmalen abzuweichen. Die vorliegenden Ausführungsformen sind daher in jeder Hinsicht als Veranschaulichung und nicht als Beschränkung anzusehen, da der Umfang der Erfindung durch die beigefügten Ansprüche und nicht durch die vorstehende Beschreibung angegeben ist und daher sämtliche Veränderungen, die unter die Bedeutung und in den Bereich der Äquivalenz der Ansprüche fallen, hier umfaßt sein sollen. Sequenzliste

Claims

Isolierter Bindungspartner, der ein Epitop an einer löslichen Komplexform eines osteogenen Proteins erkennt und spezifisch bindet, wobei der Bindungspartner ausgewählt ist aus der Gruppe von monoklonalen Antikörpern, polyklonalen Antikörpern, anderen Antikörperformen und Einfachkettenkonstrukten; wobei die lösliche Komplexform gekennzeichnet ist als ein dimeres Protein mit einem Paar von Polypeptidkettenuntereinheiten in Assoziation zur Bildung einer dimeren Struktur, die in der Lage ist, eine endochondrale Knochenbildung in einem Säuger bei Inplantation in dem Säuger in Assoziation mit einer Matrix zu induzieren, und jede Untereinheit weniger als 200 Aminosäuren besitzt, zumindest eine der Untereinheiten nicht-kovalent mit einem Peptid mit einer Pro-Domäne einer Vorläuferform einer osteogenen Proteinuntereinheit oder einer Aminosäurensequenzvariante hiervon zur Bildung eines Komplexes komplexiert ist, der in wässrigen Lösemitteln löslicher ist als das unkomplexierte Paar von Untereinheiten, und wobei der Bindungspartner ferner dadurch gekennzeichnet ist, daß er im wesentlichen keine Bindungsaffinität für die reife, dimere Form des osteogenen Proteins oder für die isolierte Pro-Domäne jeder der Untereinheiten besitzt.
Bindungspartner nach Anspruch 1, wobei eine Untereinheit des dimeren osteogenen Proteins eine OP-1-Polypeptidkette einschließlich Aminosäurensequenzvarianten hiervon ist.
Bindungspartner nach Anspruch 2, wobei die andere Untereinheit des dimeren osteogenen Proteins ausgewählt ist aus OP1, BMP2, BMP3 oder BMP4, einschließlich Aminosäurensequenzvarianten hiervon, oder aus OP2, BMP5, BMP6 oder BMP9, einschließlich Aminosäurensequenzvarianten hiervon, oder aus DPP, 60A, Vgl, Vgr-1, einschließlich Aminosäurensequenzvarianten hiervon.
Bindungspartner nach Anspruch 1, Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei das Peptid zumindest die ersten 18 Aminosäuren einer die Pro-Domäne definierenden Aminosäurensequenz umfaßt.
Bindungspartner nach Anspruch 4, wobei das Peptid die volle Längenform der Pro-Domäne umfaßt.
Bindungspartner nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das nicht-kovalent mit der dimeren Proteinspezies assoziierte Pro-Bereichspeptid eine Aminosäurensequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe von OP1, OP2, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, DPP, Vgl, Vgr-1 und 60A, einschließlich Aminosäurensequenzvarianten hiervon.
Bindungspartner nach Anspruch 1, wobei das osteogene Protein ausgewählt aus COP 1, 3, 5, 7 und 16.
Verfahren zum Identifizieren einer löslichen Form eines osteogenen Proteins in Lösung, wobei das lösliche osteogene Protein gekennzeichnet ist als ein dimeres Protein mit einem Paar von Proteinuntereinheiten in Assoziation zur Bildung einer dimeren Struktur, die in der Lage ist, eine endochondrale Knochenbildung in einem Säuger bei Implantation in dem Säuger in Assoziation mit einer Matrix zu induzieren, jede Untereinheit weniger als 200 Aminosäuren aufweist und zumindest eine der Untereinheiten nicht-kovalent mit einem Peptid mit einer Pro-Domäne einer Vorläuferform einer osteogenen Proteinuntereinheit oder einer Aminosäurensequenzvariante hiervon zur Bildung eines multimeren Komplexes komplexiert ist, der in wässrigen Lösemitteln löslicher ist als das unkomplexierte Paar von Untereinheiten, und das Verfahren die Schritte umfaßt, daß (a) eine Lösung, die wahrscheinlich das lösliche osteogene Protein enthält, einem Bindungspartner ausgesetzt wird, der die lösliche osteogene Proteinform erkennt und unter Bedingungen zur Förderung einer spezifischen Bindung zwischen der löslichen Proteinform und dem Bindungspartner zur Bildung eines Proteinbindungspartnerkomplexes bindet, wobei der Bindungspartner ausgewählt ist aus der Gruppe aus monoklonalen Antikörpern, polyklonalen Antikörpern, anderen Antikörperformen und Einfachkettenkonstrukten, und (b) der gebildete Komplex nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das lösliche osteogene Protein entweder eine reife dimere Form von diesem oder eine Pro-Domäne von diesem ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8-9, bei dem der Bindungspartner ein Nachweismittel besitzt.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das Nachweismittel ein Enzym oder ein radioaktives Atom aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, bei dem der Nachweisschritt (b) mittels eines zweiten Bindungspartners erfolgt, der eine Spezifität für die lösliche osteogene Proteinform besitzt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, ferner mit dem Schritt (c) der Quantifizierung der Menge des gebildeten Komplexes.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 13, bei dem die osteogene Proteinform in einer Beimischung mit anderen Formen des Proteins vorhanden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 14, bei dem die Lösung im Schritt (a) einem ersten immobilisierten Bindungspartner ausgesetzt wird, der eine Spezifität für die lösliche osteogene Proteinform unter solchen Bedingungen aufweist, daß die spezifische gegenseitige Bindungswirkung zwischen dem ersten Bindungspart ner und dem osteogenen Protein zur Bildung eines Proteinbindungspartnerkomplexes gefördert wird, und der Nachweisschritt (b) den Schritt umfaßt, daß der Komplex einem zweiten Bindungspartner mit einer Bindungsspezifität für das Protein oder den Bindungspartner ausgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem der zweite Bindungpartner das osteogene Protein erkennt und bindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 16, bei dem zumindest eine der Untereinheiten des dimeren Proteins eine spezifische OP-1-Aminosäurensequenz einschließlich Aminosäurensequenzvarianten hiervon umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die andere Untereinheit entweder (a) eine Aminosäurensequenz, ausgewählt aus OP1, BMP2, BMP3 oder BMP4 einschließlich Aminosäurensequenzvarianten hiervon, oder (b) aus OP2, BMP5, BMP6 oder BMP9, einschließlich Aminosäurensequenzvarianten hiervon, oder aus DPP, 60A, Vgl, Vgr-1, einschließlich Aminosäurensequenzvarianten hiervon, umfaßt.
Ausrüstung zum Nachweisen einer löslichen Form eines osteogen aktiven Proteins in Lösung, bestehend aus: (a) einem Mittel zum Aufnehmen einer Flüssigprobe, die osteogenes Protein umfaßt, (b) einem Bindungspartner, der die lösliche Form des osteogenen Proteins erkennt und bindet, wobei der Bindungspartner ausgewählt ist aus der Gruppe von monoklonalen Antikörpern, polyklonalen Antikörpern, anderen Antikörperformen und Einfachkettenkonstrukten, und (c) einem Mittel zum Nachweisen des an die vorausgewählte osteogene Proteinform gebundenen Bindungspartners, wobei das Nachweismittel z.B. einen zweiten Bindungspartner umfaßt, der die lösliche Form des osteogenen Proteins erkennt und bindet.
Ausrüstung nach Anspruch 19, bei der die Flüssigprobe ein Nährmedium umfaßt.
Ausrüstung nach Anspruch 19 oder Anspruch 20, bei der das osteogen aktive Protein ein dimeres Protein mit einem Paar disulfidgebundener Untereinheiten ist, wobei zumindest eine der Untereinheiten eine spezifische OP-1-Aminosäurensequenz, einschließlich Aminosäurensequenzvarianten hiervon, umfaßt.
Ausrüstung nach Anspruch 21, bei der die andere der Untereinheiten ausgewählt ist aus OP1, BMP2, BMP3 oder BMP4, einschließlich Aminosäurensequenzvarianten hiervon, oder aus DPP, 60A, Vgl, Vgr-1, einschließlich Aminosäurensequenzvarianten hiervon, oder aus OP2, BMP5, BMP6 oder BMP9, einschließlich Aminosäurensequenzvarianten hiervon.