JPH03502579A - 生合成による骨形成蛋白質および該蛋白質を含む骨形成装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生合成による骨形成蛋白質および該蛋白質を含む骨形成装置 本発明は骨形成装置、哺乳類中で骨形成を誘発することのできる蛋白質をコード する合成遺伝子および組換えＤＮＡ技術による該蛋白質の製造方法、骨形成蛋白 質の合成形、および該合成蛋白質を含む骨形成装置を用いた骨および軟骨の修復 に関する。

哺乳類の骨組織は一種もしくはそれ以上の蛋白性物質を含むことが知られていて 、このものはおそらく成長および骨の自然治癒の間に活性であり、軟骨内の骨形 成を結果としてもたらす細胞内現象の連続過程（カスケード）の発生を誘発する ことが出来る。この活性因子（若しくは複数の活性因子）は、文献において骨形 態発生蛋白質（ｂｏｎｅ　　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃまたはｍＯｒｐｈｏｇ ｅｎｉｃ　　ｐｒｏｔｅｉｎ）、骨形成蛋白質（ｂｏｎｅ　　１ｎｄｕｃｔｉｖ ｅ　　ｐｒｏｔｅｉｎ）、骨形成蛋白質（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　　ｐｒｏｔｅ ｉｎ）、オステオゲニン（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｎ）、またはオステオインダクテ ィブ蛋白質（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ　　ｐｒｏｔｅｉｎ）という種々の 名称で呼ばれている。

骨分化の発達カスケードは、間葉細胞の補充、軟骨のカルシウム化、血管の侵入 、骨形成、修復、および最後に骨髄分化から成る（レディ　（Ｒｅｄｄｉ　　（ １９８１））、　　ＣｏｌＣｏ１１ａ　　　Ｒｅ１．　　Ｒｅｓ、、　　１：２ ０９−２２６）　　。

これらの形態変化の基礎となる詳細な機構は明確にされていないが、骨マトリッ クスの自然の軟骨内骨分化活性は、不活性な残存コラーゲンマトリックスを用い て、完全な骨誘発活性を回復するように、分離抽出及び再構成できる（Ｓａｍｐ ａｔｈおよびＲｅｄｄｉ、（１９８１）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＴＪＳＡ、７８　：　７５９９−７６０３）。この事実は、蛋白質抽出物 のｉｎ　　ｖｉｖｏでの軟骨内細胞誘発能力をアッセイする実験方法を提供する 。

骨形成蛋白質であると推定される蛋白質は、５０ｋｄより小さい分子量を有する ことが示されている。数種の哺乳類は密接に関連する蛋白質を生産し、このこと は種間移植実験で証明されている（ＳａｍｐａｔｈおよびＲｅｄｄｉ　　（１９ ８３）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８０：６５９１−６５９５）。

これらの蛋白質の可能な用途は広く認識されている。

純粋蛋白質として入手出来れば、成形外科の医療、ある種のプラスチック手術お よび種々の歯周再構成および頭蓋顔面再構成の手法に、革命をもたらすと考えら れる。

これらの蛋白質分画について観察された性質は、多くの研究施設で骨形成活性に 関与する純粋因子（もしくは複数因子）を単離同定するための、精力的研究努力 を刺激した。哺乳類の骨からの骨形成蛋白質の精製に関する現状技術は、Ｓ　ａ ｍｐ　ａ　ｔ　ｈら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　ｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、（１９８７）８０）に開示されている。Ｕｒｉｓ ｔら（Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、　　Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、　　（１９８４）１ ７３．１９４−１９９）は、ヒト骨形成蛋白質フラクションを開示しており、こ のフラクションは、脱ミネラルした皮質（ｃｏｒｔｉｃａｌ　　ｂｏｎｅ）から 、塩化カルシウム−尿素無機−有機溶媒混合物によって抽出され、そしてグアニ ジン−塩酸での分別沈澱および調製用ゲル電気泳動によって回収されたものであ る。この著者らによれば、このフラクションは酸性ポリペプチドのアミノ酸組成 を有し、分子量が１７−１８ｋｄの範囲である。

Ｕｒｉｓｔら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、（１９８４ ）８１　：３７１−３７５）は、酸性ポリペプチドの特性および約１８ｋｄの分 子量を持つウシ骨形成蛋白質抽出物を開示している。この著者らはこの蛋白質が ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより分離されたフラクション中に存 在し、そしてこの蛋白質はマウスの後部筋肉における骨形成を誘発し、そしてラ ットとイヌの頭蓋骨の穿頭器による欠損部の骨再生を誘発したと報告している。

この著者らが骨から該抽出物を得るために用いた方法は、不特定の不純な調製物 しか与えなかった。

１９８５年１０月７日に公開されたヨーロッパ特許出願第１４８，１５５号は、 ウシ、ブタおよびヒト由来の骨形成蛋白質の開示を目的としている。このヨーロ ッパ出願の蛋白質の一つは分子量２２−２４ｋｄの蛋白質で、発明者らによって Ｐ３蛋白質と命名され、実質的に純粋な状態に精製されたと記載されている。こ の物質は動物に移植した時骨の形成を誘発したと報告されている。

１９８８年１月１４日に国際公開されたＰＣＴ１０８７１０１５３７号は、ウシ の骨から得られた骨誘発の能力を有する純粋でないフラクションを開示している 。このＰＣＴの出願人はまた、組換えＤＮＡ技術で製造された骨誘発性の、推定 前誘発因子を開示している。ヒトまたはウシゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリ ーから４つのＤＮＡ配列が回収され、組換え宿主細胞で発現されたように記載さ れている。この出願人は発現された蛋白質が骨形成蛋白質であろうと記載してい るが、その骨誘発能は証明されていない。ＵｒｉｓｔらのＥＰｏ、２１２．４７ ４号（発明の名称「骨形成剤」）も参照。

Ｗ　ａ　ｎ　ｇら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９ ８８）８５　：　９４８４−９４８８）は、脱ミネラル骨のグアニジン抽出物か らの、軟骨および骨形成活性を有する、ゲル濾過で決定された分子量３０ｋｄの 塩基性蛋白質としてのウシ骨形成蛋白質の精製を開示している。この蛋白質の精 製は３０．１８および１６ｋｄの蛋白質を生じ、これらは分離すると不活性であ った。

この結果から考えて、この著者らは活性物質の正確な同定は出来ていないと認め ている。

Ｗｏｚｎｅｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９８８）２４２：１５８２−１５３４） は、最初ウシの骨から精製された三つのポリペプチドに相当するヒトポリペプチ ドをコードする、完全長のｃＤＮＡの単離を開示している。この著者らは、組み 換え法で発現された三つのヒト蛋白質の各々は、独立してもしくは共同で、軟骨 形成を誘発する能力を持つと報告している。骨形成の証拠は記載されていない。

本発明は、同種異系の移植および異種移植において、骨誘発能を持つ骨形成蛋白 質を分散して有するマトリックスからなる骨形成装置を提供することを目的とす る。

他の目的は、ヒトを含む哺乳類において軟骨形成の誘発能を有する合成骨形成蛋 白質を提供することである。さらに別の目的は、非−天然骨形成蛋白質をコード する遺伝子および組換えＤＮＡ技術を用いてそのような蛋白質を製造する方法を 提供することである。さらに別の目的は、新規生合成型の骨形成蛋白質を提供し 、そして新規機能性骨形成蛋白質の構造デザインを提供することである。さらに 別の目的は軟骨形成の方法を提供することである。

上記目的および他の目的は、明細書、図面および請求の範囲の記載から明らかで あろう。

１皿立監１ 本発明は、哺乳類の体内に移植した時、移植部位で軟骨形成および骨髄分化の完 全な発達カスケードを誘発できる骨形成装置に関する。本明細書の開示から適当 な改変を加えた装置は、軟骨形成にも使用できる。本発明の装置は、本明細書中 でマトリックスと呼ばれ、以下に説明する性質を有し、骨形成蛋白質を生合成物 として分散して含む担体材料を有する。

本発明の成功の鍵は、骨から精製された実質的に純粋な骨形成蛋白質の調製に成 功し、この天然骨形成蛋白質のアミノ酸配列および構造データを解析しおよび、 この天然源生成物のＤＮＡおよびアミノ酸配列の研究を含む考察に成功したこと であった。本出願人は一つの手順を開発し、その手順にそって活性な実質的に純 粋な哺乳類骨由来の骨形成蛋白質の回収に成功した。次いで天然型の骨形成蛋白 質の性質および構造の調査の結果、本発明者らは、非天然型（即ち天然には従来 知られていなかった型）の骨形成誘発能を持つ、合理的デザインを完成すること ができた。本出願人が知る限り、本出願によって開示された構造は、天然型ヌク レオチドまたはアミノ酸配列の活性領域の予備知識無しに、機能的な活性蛋白質 をデザインした最初の例である。活性な骨形成蛋白質を製造する目的で、一連の コンセンサスＤＮＡ配列がデザインされた。これらの配列は、天然源生成物から 得られた部分アミノ酸配列データおよび文献に報告されている無関係な遺伝子間 で観察されるホモロジーに基づき、あるいはそれらがコードし推測もしくは証明 された発生掌上の機能を持つ配列に基づくものである。こうして生合成されたコ ンセンサス配列のいくつかはプロカリオート細胞で融合蛋白質として発現され、 精製され、開裂され、再折り畳まれ、マトリックスと混合され、確立された動物 モデルに移植され、そして軟骨誘発活性を有することが証明された。現時点で好 ましい活性蛋白質はＣ０Ｐ５、Ｃ０Ｐ７．Ｃ０Ｐ１６およびＯＰｌと命名された 配列からなる。これらの蛋白質のアミノ酸配列を下に示すこれらの配列において および本明細書に開示される他の全てのアミノ酸配列において、ダッシュ記号（ −）は関連する複数蛋白質の対比すべき配列を整列させるために挿入したもので 、それ以上の意味はもっていない。即ち、例えばＣＯＦ２のアミノ酸４５−５０ はＮＨＡＶＶである。また、アミノ酸番号は、複数配列間の対比を容品にする目 的のみのために付されている。従って、例えばＣ０Ｐ５おびＣ０Ｐ７の番号９お よび１０のＤＦ残基は、本発明の骨形成蛋白質の一態様の、例えば３５および３ ６番目の残基を示しうる。蛋白質の骨形成または軟骨形成活性が損なわれない限 り、機能的に活性な領域にリーダー配列またはトレーラ−配列が結合してもよい 。

従って、−観点において、本発明は適当に折り畳まれてマトリックスと一緒に哺 乳類に移植されたときに軟骨形成誘発能力を有するのに十分な程度に、Ｃ０Ｐ５ ．Ｃ０Ｐ７．Ｃ０Ｐ１６およびＯＰＩの配列に近似したアミノ酸配列を持った蛋 白質よりなる。これらの配列のあるものは軟骨を誘発し骨は誘発しない。また、 これらの骨形成物質は、無血管部位に移植されるときまたは完全骨の発達の阻害 剤とともに移植されるときは、軟骨を形成するために使用してもよい。従って、 他の観点において、本発明は、Ｃ０Ｐ５、Ｃ０Ｐ７、Ｃ０Ｐ１６またはＯＰｌの 配列を十分に複製し、従って正しく折り畳まれてマトリックスとともに哺乳類に 移植された場合に少なくとも軟骨形成能力を持つ配列を含んだ、（各鎖について ）２００アミノ酸よりも少ない蛋白質よりなる。「十分に複製した」という用語 は、本明細書に開示された特定の配列とホモロジーを持つ程度の蛋白質、あるい は他の異なるアミノ酸をもつが然し骨形成もしくは軟骨形成活性をもつ蛋白質を 示すために用いられる。

好ましい一態様において、そのような蛋白質は、次の一般アミノ酸配列： （式中、各アルファベットは標準的１文字記号によるアミノ酸残基を表し、各Ｘ は２２種の天然アミノ酸残基の任意のものを表す。） で表される群のものである。上記一般アミノ酸配列において好ましいアミノ酸配 列は次のものである：および （式中、配列中で縦の各位置に示されている各アミノ酸は、種々の組合わせで交 互に用いられても良い）。これらの一般配列は、分子間または分子内ジスルフィ ド結合を生じ得る６個そして好ましくは７個のシスティン残基を有しており、ま た蛋白質の三次元構造に影響する他の重要アミノ酸も有している点に注目された い。これらの−膜構造は以前に発表された配列に見られるものであるが、その何 れも骨形成活性を有するとは報告されておらず、またそれらの殆どはそのような 活性と結びつけて考えられていない。

特に有用な配列には次のものが含まれる：Ｖｇｌは従来骨形成に関連ずけられな かった公知のアフリカッメガエル０（ｅｎｏ　　ｕｓ）の配列である。ＤＰＰは 背腹模様の発達に関連するショウジヨウバエ（旦ｒｏｓｏ　　ｈｉｌａ）遺伝子 によりコードされるアミノ酸配列である。○Ｐ１は本出願人らにより得られたゲ ノムＤＮＡ配列のエクソンによりコードされる天然配列の一領域である。各ＣＢ ＭＰは、本出願人らにより得られたゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡによりコードさ れる哺乳類蛋白質の一部（サブパーツ）を構成するアミノ酸配列である。ＣＯＰ はどれも、本明細書に記載した基準を用いてデザインされ、今までに天然に見つ かっていない新規コンセンサス遺伝子構造物から発現された、完全生合成蛋白質 配列である。

こらの蛋白質はダイマーであると信じられている。還元されると活性を失うよう に思われる。これら蛋白質各々の種々の組合わせは、ヘテロダイマーまたはホモ ダイマーとして存在しうる。出願人が知るかぎりＣ０Ｐ５、Ｃ０Ｐ７、Ｃ０Ｐ１ ６およびＰＯＩ構造は、天然型ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の活性領域 の予備知識なしに、生物活性蛋白質がデザインされた最初の例である。

従って、本発明は組換えＤＮＡ技術を用いて生産された合成骨形成蛋白質を提供 する。本発明の蛋白質は種々のグリコジル化パターン、種々のＮ末端、アミノ酸 配列ホモロジー領域を有する関連蛋白質の一部（ファミリー）、および天然蛋白 質の活性な短縮もしくは変異された型を包含し、これらがいかにして誘導された かは問題でない。本発明の開示により、習熟した遺伝子工学技術者は、適当なア ミノ酸配列をコードする遺伝子をデザインおよび合成することができ、次いでそ のような遺伝子を原核細胞および真核細胞を含む種々の型の宿主細胞内で発現さ せて、短縮類縁体、ミューティン、融合蛋白質、および天然型の生物活性をまね たヒトを含む哺乳類中で骨形成を誘発することのできる他の構造物から選ばれる 、活性な合成蛋白質を大量生産することができる。

本発明の合成蛋白質は、適当な配給もしくは担体システム（マトリックス）とと もに臨床使用するために有用である。そのマトリックスは、粒状または多孔性材 料がら成る。孔の寸法は、先祖細胞の遊走および引き続く分化ならびに増殖を可 能ならしめるものでなければならない。粒径は７０−８５０μｍ、好ましく　ハ フ　０−４２０μｍである。マトリックスは粒状材料を骨の欠損部を網羅する形 に密に圧縮して製造されるか、または生体適合性（非炎症性）でｉｎ　　ｖｉｖ ｏで生体分解性の、遁走先祖細胞を集合させるための「一時的足場」および基盤 としておよび引き続く細胞の接着および増殖のベースとして作用する材料を所望 の形に構成することにより製造される。現在のところ好ましい担体には、粒状の 、脱ミネラルされ、グアニジンで抽出された、種特異的（アロジェニック）な骨 、および粒状の、脱グリコジル化（またはＨＦ処理）され、蛋白質抽出され、脱 ミネラル化された、異種の骨が含まれる。場合により、そのような異種の骨粉マ トリックスはトリプシンのような蛋白質分解酵素で処理されていてもよい。他の 有用なマトリックス材料には、コラーゲン、グリコール酸のホモポリマーおよび コポリマーならびに乳酸、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウムおよび他 のリン酸カルシウムが含まれる。

ここに開示された骨形成蛋白質および移植可能骨形成器具は、医者が例えば後天 的もしくは先天的な頭蓋顔面異常および他の骨格もしくは歯の異常を矯正するた めに、期待できる最適の骨形成手段の入手を可能にするであろう（Ｇｌｏｗａｃ ｋｉら、　　（１９８１）、Ｌａｎｃｅｔ、１：９５９−９６３）。本発明の器 具は、正常に治癒していない骨折（ｎｏｎ−ｕｎｉｏｎ　　ｆｒａｃｔｕｒｅ） の局所的軟骨の誘発に使用することができ、また、歯周への適用等の骨形成が要 求される他の臨床応用に使用することができる。他の臨床応用可能分野は、軟骨 の修復、例えば変形性関節炎の治療である。

の　　　　なＷ　日 本発明の前記目的およびその他の目的、本発明の種々の態様および、本発明の本 質は以下の説明を図面とともに参照することにより、より一層十分に理解される であろう。

第１図は、種々の骨形成蛋白質のアミノ酸配列をＴＧＦ−ベータ群の配列と比較 する図である。Ｃ０ＰＩ、Ｃ０Ｐ３、Ｃ０Ｐ４、Ｃ０Ｐ５およびＣ０Ｐ７は合成 骨形成蛋白質の類縁体群（ファミリー）であって、Ｄ−Ｐ部位（酸により）また はＮ−Ｇ　（ヒドロキシルアミンにより）での化学開裂により該類縁体蛋白質の 遊離をもたらすＤ−Ｐ−Ｎ−Ｇの配列を有するヒンジ領域を介してリーダー蛋白 質に結合されたコンセンサス遺伝子から得られたものであり；ＶＧＩはアフリカ ッメガエル（Ｘｅｎｌ上）の蛋白質であり、ＤＰＰはショウジヨウバエ（Ｄｒｏ ｓｏ　　ｈｉｔａ）の蛋白質であり：ＯＰ１は天然骨形成蛋白質であり；ＣＢＭ Ｐ２ａおよびＣＢＭＰ２ｂおよびＣＢＭＰ３は夫々、ＰＣＴ出願第０８７１０１ ５３７に開示された蛋白質の一部（サブバート）であり；ＭｉｓはＭｕｌｌｅｒ ｉａｎ生物の阻害物質であり；そして、「コンセンサスの選択枝」は骨形成蛋白 質内の種々の位置で取り得る種々のアミノ置換を示す；第２Ａ図は、リーダー蛋 白質に融合した骨形成蛋白質の遺伝子を含むＥ、ｃｏｌｉ発現ベクターであり； 第２Ｂ図は、修飾ｔｒｐ−ＬＥリーダー、プロティンＡの二つのＦｂドメイン、 ＡＳＰ−ＰＲＯ開裂部位およびＣ０Ｐ５配列を含むＤＮＡ配列であり；第３Ａ図 および第３Ｂ図は、Ｃ０Ｐ５活性組換え蛋白質の組織所見（１２日）を示す移植 物の拡大写真である。Ａはコントロール（ラットのマトリックスのみ、２５■） 。ＢはラットのマトリックスおよびＣ０Ｐ５．＋＋＋は軟骨形成をそして＋＋は 骨形成を示す（後述の採点基準を参照）；そして 第４図は骨形成蛋白質（ｃｏｐｏ）のコンセンサス遺伝子のＤＮＡ配列および相 当するアミノ酸配列の図である。

翌里 本出願人は哺乳類の骨から得られた粗蛋白抽出物の中に存在する骨形成蛋白質の 単離を可能にする精製手段を開発した。この単離方法は、相当量の実質的に純粋 な骨形成蛋白質を、十分量の新鮮骨が得られる任意の哺乳類から、製造すること を可能にする。経験の積み重ねによる方法の開発および新鮮仔牛骨の入手可能性 があいまって、実質的に純粋なウシ骨形成蛋白質（ＢＯＰ）の単離が可能になっ た。ＢＯＰの特性がネコ、ウサギ、およびラットにおける軟骨誘発そして究極的 な軟骨内骨成長誘発能力によって深く研究された。ＢＯＰは、従来異種の骨の抽 出物中の単数もしくは複数の未知蛋白質によるとされていた、骨形成のカスケー ドの十分な分化を誘発することが出来ることが示されニしたがって、正常に治癒 していない骨折（ｎｏｎ−ｕｎｉｏｎ　　ｆｒａｃｔｕｒｅ）を含む整形外科的 欠損における軟骨内の骨の形成誘発に使用することができる。ＢＯＰは天然状態 ではグリコジル化された二量体蛋白質である。しかしながら、脱グリコジル化さ れた形でも活性を有する。その部分的配列決定もなされた。

ＢＯＰのアミノ酸配列の解明は、本明細書に開示されたように、配列データ、該 配列に推定されるコドン、および既知遺伝子との部分的ホモロジーの観察に基づ いてデザインされたコンセンサスヌクレオチド配列の造成を可能にした。

これらのコンセンサス配列は、ショウジヨウバエ、アフリカッメガエルおよびヒ トからのある種の調節遺伝子内に存在する配列との比較に引き続き、ポイントミ ューチージョン、発現および活性のアッセイによって改良された。この手法によ り、（少なくとも出願人が知るかぎりにおいては）天然には見出されない活性な いくつかの完全合成構造の製造に成功した。

上記の発見は、単独もしくは共同で実際に軟骨内骨を製造する能力のある、全く 新規な非天然蛋白質構造をコードするＤＮＡの造成が可能とする。これらのＤＮ Ａは、十分に確立された組換えＤＮＡ技術を用いて真核もしくは原核宿主細胞で 発現させることができ、発現した蛋白質は必要であれば酸化してｉｎ　ｖｉｔｒ ｏでの生物活性を与えるために折り畳むことができる。

そのような生合成蛋白質のデザインおよび製造、マトリックスの性質およびその 他本出願で請求されている主題の性質、用途、達成法、および使用法に関する物 質的観点は、本発明の種々の観点を実施するために現在知られている最良の態様 を成す、以下に示す記載から理解されよう。

コンセンサス配列デザイン 第４図に示す合成コンセンサス遺伝子は、ＴＧＦ−ベータ遺伝子群とのホモロジ ーから予測されたアミノ酸に基づくコンセンサス蛋白質をコードするようにデザ インされた。デザインされたこのコンセンサス配列は、次いで、ＤＮＡ合成装置 内で製造されたオリゴヌクレオチドの組み立て操作を含む、公知の技術を用いて 造成された。

本出願人により単離されてエドマン分解によって配列決定されたウシ骨形成蛋白 質から誘導されたトリプシン消化ペプチドは、次の第１表に示すとおり、ショウ ジョウバよりＰＰ蛋白質配列（遺伝子から推測された）およびアフリカッメガエ ルｖＧ１蛋白質と高度なホモロジーを示し、インヒビン（ｉｎｈｉｂｉｎ）およ びＴＧＦ−ベータとのホモロジーはそれより若干低いアミノ酸配列を与えた。

第１表 蛋白質　　　アミノ酸配列　　　　　　ホモロジ−（１狙）　　　　５ＦＤＡＹ ＹＣＳＧＡＣＱＦＰＳ＊＊＊＊＊　＊　＊　＊＊　　　　（９／　１５一致）（ ＢＯＰ）　　　　　　５ＦＤＡＹＹＣＳＧＡＣＱＦＰＳ＊＊＊＊＊　　＊　　　 　（６／１５一致）（ＶｆＬＬ）　　　　　　Ｇ　Ｙ　Ｍ　Ａ　Ｎ　Ｙ　ＣＹ　 Ｇ　Ｅ　ＣＰ　Ｙ　Ｐ　Ｌ＊＊＊＊＊　　　　　　（５／１５一致）（里）ＳＦ ＤＡＹＹＣＳＧＡＣＱＦＰＳ＊　　＊＊＊　　　　　　（４／１５一致）（ＴＧ Ｆ−ベータ）　　　ＧＹＨＡＮＦＣＬＧＰＣＰＹＩＷ（１狙）　　　　Ｋ／ＲＡ ＣＣＶＰ置ＳＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮ＊＊＊＊＊　　＊　＊＊＊＊　　＊　＊　　 （１２／　２０一致）（３ＪＬＬ）　　　　　　ＬＰＣＣＶＰＴＫＭＳＰＩＳＭ ＬＦＹＤＮＮ（ＢＯＰ）　　　　Ｋ／ＲＡＣＣＶＰ置ＳＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮ＊ 　　＊＊＊＊＊　＊　　＊＊＊＊　＊　　　（１２／２０一致）（ＢＯＰ）　　 　　Ｋ／ＲＡＣＣＶＰ置ＳＡＩＳＭＬＹＬＤＥ＊＊＊＊　　＊　　　　＊　　　 　（６／１９一致）（ＴＧＦ−べ−９）　　　　ＡＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰＬＰＩ ＶＹＹＶＧ（１狙）　　　　Ｋ／ＲＡＣＣＶＰ置ＳＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮ＊本＊ ＊＊＊＊　　＊　　　　　＊＊＊＊　　　　　　　（１２／　２　０一致）＊＊ ＊＊＊　　　　　　　　　（５／　５一致）＊＊＊＊　　　　　　　　　（４１ ５一致）（易Ｂ）　　　　　　ＬＹＶＥＦ ＊＊＊＊　　　　　　　　　（４１５一致）＊　＊　　　　　　　　　（２１５ 一致）骨形成蛋白質の適当なアミノ酸配列（これからヌクレオチド配列が決定さ れる）の決定においては、次の点が考慮された：（１）天然源の骨形成蛋白質の トリプシンフラグメントのエドマン分解で決定されたアミノ酸配列は、遺伝子群 の他のメンバーと整列させたときホモロジーまたは保存的変化を強く示唆しそし て示す限り、最高位置にランクする；（２）配列が４種全ての蛋白質にマツチす る限りその配列は合成遺伝子配列の中に利用する；　（３）　ＤＰＰおよびＶｇ ｌの中で一致するアミノ酸は使用する；（→もしＶｇｌまたはＤＰＰが相違する が然しいずれか一方がインヒビンまたはＴＧＦ−ベータと一致するときは、この 一致アミノ酸は選択する；（５）全ての配列が相違する時はＤＰＰ配列を先ず選 択するが、ミュータジェネシスによりＶｇｌ配列を造成するその後の計画の可能 性を残しておく。さらに、コンセンサス配列はジスルフィドの架橋を保存し、そ して関連蛋白質の間の明らかな構造ホモロジーを保存するように、デザインされ る。

組換え骨形成蛋白質の造成物 上記のアプローチにより、軟骨形成誘発および軟骨内骨形成誘発の能力を有する 、新規組換え蛋白質の製造が達成され、その蛋白質構造は天然源物質の機能的領 域（ドメイン）に類縁であるかまたは複製的である。コンセンサスＤＮＡ配列に よりコードされるアミノ酸配列は、組織の発達に関連する天然蛋白質の群から誘 導された。

これらの遺伝子産物／蛋白質は二量体として活性型に存在することが知られてお り、そして一般に前駆体蛋白質から該前駆体の活性Ｃ末端領域へと加工（プロセ シング）されて生じるものである。

本発明の組換え骨形成性／軟骨形成性蛋白質は、出願人が知る限り天然に存在せ ず、またもし存在するとしても従来骨もしくは軟骨の形成と関連があるとは考え られていなかったという意味で新規である。これらの蛋白質をデザインする方針 は、天然ＯＰ単離物中に見られるアミノ酸配列やポリペプチド構造物中のアミノ 酸配列を採用し、文献中で報告されているある種の蛋白質になぞらえてポリペプ チドの構造をパターン化し、あるいは文献に報告されているＤＮＡからアミノ酸 配列を推定することである。従って、前記のデザイン基準を用いて、そして更な る蛋白質配列情報が入手されるにつれてアミノ酸配列を改良することにより、下 記のバイオアッセイ系で試験した時骨形成または軟骨形成活性を有するであろう という期待および目的の下に、一連の合成蛋白質がデザインされた。

例えば、ショウジヨウバエからのＤＰＰ、アフリカッメガエルからのＶＧＩ、Ｔ ＧＦベータ群の蛋白質、および程度はやや低いがアルファインヒビンおよびベー タインヒビンは、天然源のＯＰ産物から誘導された配列の成るものと有意のホモ ロジーを示した。（第１図）。これらの蛋白質の研究により、各々の配列はその 一部に、蛋白質の三次元構造に重要な影響を持つシスティンおよび他のアミノ酸 の位置関係の解析から観察できる、構造上の類似性を有することが認識された。

これらの配列の一領域は非常に近似する同じ相対位置に一連の７個のシスティン およびある種の他のアミノ酸を、次に示す配列中に有することが認められた： （式中、各Ｘは独立にアミノ酸を表す）。

これらの構造の二つについて発現実験を行ったところ活性が証明された。この鋳 型アミノ酸配列になぞって、６個のシスティンのみを有するより短い配列を持つ 下記の構造を作って実験した場合も活性が認められた：（式中、各Ｘは独立にア ミノ酸を表す）。

これらの一般配列式中で、骨形成活性または軟骨形成活性を有する多数の具体的 配列が存在する。好ましい構造は次のアミノ酸配列を有する： （式中、各位置において一つ以上のアミノ酸が示されている場合は、その位置に は示された任意のアミノ酸が存在してよいことを意味する。） 新規活性蛋白質はまた、この配列の６番目の残基から開始する（即ちＮ末端のｃ ｘｘｘｘを除去し、またはＣＫＲＨＰ、ＣＲＲＫＱ、ＣＫＲＨＥ等の好ましい特 定Ｎ末端を除去した、６個のみのシスティン残基を有する構造の）活性領域を含 むアミノ酸配列としても特定される。

本発明の後に国際公開されたＰＣＴ８７１０１５３７号において、ＢＭＰ　ＩＩ 　ａおよびｂおよびＢＭＰＩ［［として同定された蛋白質は、この一般配列式の 態様に包含される領域を含むことがみとめられた。この国際公開において、これ らの蛋白質は骨形成であると述べられていない。

しかしながら、本発明者らはこれらの蛋白質のアミノ酸配列の一部（サブバート ）を正しく折り畳んで、本明細書に記載したように移植すると活性であることを 発見した。そのようなサブパートはここにＣＢＭＰＩＩａ、ＣＢＭＰ　ｎ　ｂ、 およびＣＢＭＰＩＩＩとして開示する。また、本出願人はヒトゲノムＤＮＡライ ブラリーをｃｏｐｏで探索（ブロービング）することにより、従来は報告されて いなかった遺伝子を回収した。この蛋白質はＯＰｌと命名された。この蛋白質は 同じ遺伝子構造を有する領域を含む。

従って、好ましい骨形成蛋白質は組換えＤＮＡから発現され、そして次の任意の 配列を含むアミノ酸配列を含む： 第１図に示すように、これらの配列はアルファおよびベータインヒビン、ＴＧＦ ベータの３つの型およびＭＩＳにかなりのホモロジーを有する。

１」ＬｉΩＪＪＬ 上記蛋白質を発現するようにデザインされた合成遺伝子は、好ましくは化学的に 合成されたオリゴヌクレオチドの組立により製造される。１５−１５−１Ｏ０の オリゴヌクレオチドは、バイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）　　ＤＮＡ　　Ｍ ｏｄｅｌ　　８６００合成装置で合成し、そしてトリスホウ酸ＥＤＴＡ緩衝液（ ＴＢＥ）を用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で精製すること ができる。このＤＮＡを次にゲルから電気的に溶離する。オーバーラツプするオ リゴマーをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化しそして連結してより大き いブロックにし、これを同様にＰＡＧＥで精製することができる。天然遺伝子配 列およびｃＤＮＡもまた発現に使用できる。

ｌ１ 上記遺伝子は適当な原核細胞、例えば種々のＥ、ｃ。

１１ストレインおよびバチルス、イーストおよび種々の動物細胞例えばＣＨＯ， ミエローマ等で発現することができる。一般に、発現は当業者に良く知られてい る多くの細胞種および発現系で達成できる。遺伝子をＥ、ｃ。

ｌｉ中で発現させる場合は、最初に発現ベクター中にクローン化しなければなら ない。ｐＢＲ３２２を基本として合成ｔｒｐプロモーターオペレーターおよび修 飾ｔｒｐＬＥリーダーを含む発現ベクター（第２Ａ図）をＥｃｏＲＩ制限部位お よびＰｓｔｌ制限部位で開裂し、ＦＢ−ＦＢ　　Ｃ０ＰＩ、Ｃ０Ｐ３、Ｃ０Ｐ５ およびＣ０Ｐ７遺伝子フラグメント（第２Ｂ図）をこれらの制限部位の間に挿入 することが可能である（ここで、ＦＢはスタフィロコッカスのプロティンＡのフ ラグメントＢである）。発現された融合ＣＯＰ類縁体は、トリス、酸化型グルタ チオンおよび低濃度のＧｕ−ＨＣＩおよびジチオスレイトールを用いたときｐＨ ８，０に存在した。別法として、ＣＯＰまたはＯＰＩ蛋白質を５０ｍＭ　　ＭＣ Ｉ、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８，０中に４℃で１８時間懸濁させる。この 蛋白質を動物細胞中で発現させる時は、折り畳みは不要であろう。

五迷立翌盈 Ｃ０Ｐ７およびＣ０Ｐ５に対する抗体はニューシーラント白色家兎で製造した。

これらの抗体はウェスタンプロット分析でＣ０Ｐ７およびＣ０Ｐ５調製物と反応 した。Ｃ０Ｐ７に対する抗体について、天然源ウシ骨形成蛋白質サンプルとの反 応性が試験された。ウェスタンプロット分析は、この３０ｋｄ蛋白質（そして還 元した時１６ｋｄの蛋白質）との明確な反応を示した。この免疫反応性の部分は ＣｏｎＡプロットの１６ｋｄ二量体（ダブレット）に見られるのと同様に、１６ ｋｄサブユニツト領域中の狭い間隔をもった二量体部分であるように思われる。

マトリックスの調製 マド１ツクスの　　に　　るー　・ 下記のバイオアッセイの項において記載する担体は、生物分解性−合成マトリッ クスまたは合成−無機マトリックス（例えば、ＨＡＰ、コラーゲン、リン酸三カ ルシウム、またはポリ乳酸、ポリグリコール酸およびそれらの種々のコポリマー ）と置き換えることが可能である。

また、下記のように予備処理した異種の骨も用いることができる。

研究によると、表面電荷、粒径、ミネラルの存在およびマトリックスと骨形成蛋 白質との混合方法の全てが、骨誘発の成功の可否に影響する。化学的修飾によっ て電荷の乱れをおこすと誘発応答が失われる。粒径は新生骨の定量的応答に影響 し、７５ないし４２０μｍの間の粒子が最大の応答を引き起こす。マトリックス が骨のミネラルで汚れると、骨の生成が阻害される。最も重要な点は、骨形成蛋 白質をマトリックス上に配置する為に使用する方法は、骨形成蛋白質およびマト リックスの両者の物理的および化学的状態に対して極度に感受性であることであ る。

骨のマトリックスとＯＰ移植物との境界での細胞の連続的反応は複雑である。こ の多段階カスケードは、移植されたマトリックスへのフィブリンおよびフィブロ ネクチンの結合、細胞の移動、繊維芽細胞の増殖、軟骨芽細胞への分化、軟骨形 成、血管の侵入、骨形成、修復、および骨髄分化、を含む。

骨形成蛋白質の効果的担体は、いくつかの重要な機能を奏するべきである。この 担体は、骨形成蛋白質を結合して徐放性の系として作用し、骨の発達の間の細胞 応答の各ステップに適合し、そして非特異的蛋白質分解から骨形成蛋白質を保護 するものでなければならない。更に、選択された材料はｉｎ　　ｖｉｖｏで生体 適合性でかつ生体分解性でなければならず；この担体は、新しい骨に完全に置換 されるまでの仮の骨組みとして作用する必要がある。生体適合性は、マトリック スが移植された時有意な炎症を誘発せずそして宿主動物に拒絶反応をひきおこさ ないことを要求する。生体分解性は、新生骨または軟骨の発達の間に、マトリッ クスが宿主の体に徐々に吸収されることを要求する。ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ グリコール酸（ＰＧＡ）および種々の組み合わせは１ｎｖｉｖｏにおける異なる 分解速度を有する。骨中においては、分解速度は移植物が皮質（ｃｏｒｔｉｃａ ｌ　　ｂｏｎｅ）中に置かれるかまたは海綿質（ｔｒａｂｅｃｕｔａｒ　　ｂｏ ｎｅ）中に置かれるかによって変化しうるマトリックスの幾何形状、粒径、表面 電荷の存在、および該粒子中の細胞の侵入を許すために十分な寸法の多孔もしく は隙間の存在、は全で効果的マトリックスの性質にとって重要である。マトリッ クスを新生骨の所望形状に加工することおよび偽関節欠陥部を覆う寸法に加工す ることが好ましい。ラットでの研究で、新生骨は実質的に移植器具の寸法に形成 されることが示された。

マトリックスは、例えばコラーゲンのような粒状材料を軽く接着してできた形状 保持固体からなっても良い。

あるいはマトリックスは型成形された多孔質の固体からなっても良く、あるいは 単に周囲の組織によってその場に保持された密に圧縮された粒子の凝集物であっ てもよい。砕いた筋肉または他の組繊も使用できるであろう。

同種異系の大きな骨からなる移植物は、その骨髄腔を洗浄して粒状物と分散され た骨形成蛋白質を充填すれば、マトリックスの担体として作用することが可能で ある。

生　“・に活　な６　　、マトリックスの−゛脱ミネラル化骨マトリックスは、 ラットの大腿および脛骨の脱水した骨幹のシャフトから、本明細書に記載のよう にして調製し、４２０μｍの篩を通過する骨粉に調製した。この骨粉を４Ｍグア ニジン−ＨＣｌによる解離的抽出に付した。この処理で、この骨形成マトリック スは本来有した軟骨内骨分化の能力を完全に消失した。残存する不溶性物質をマ トリックスの製造に使用した。この物質はその性質がほぼコラーゲン性であり、 移植によって軟骨および骨を誘発しない。全ての新規調製物は、使用前にミネラ ル含有量および縦隔性が試験された。この生物学的に不活性な不溶性のコラーゲ ン性マトリックスを、骨形成誘発蛋白質の活性フラクション（または純粋蛋白質 ）とともに再構成すると、消失した骨マトリックスの全活性が回復する。骨形成 誘発蛋白質は任意のを椎動物、例えばウシ、ブタ、サル、またはヒトから得るこ とが出来、あるいは組換えＤＮＡ技術を用いて製造できる。

に　用　る　グリコジル　　マトリックスの一盃 骨形成蛋白質を他の種のコラーゲン外骨マトリックスとともに再構成し、ラット に移植しても骨は全く形成されない。この事実は骨形成蛋白質は異種性である（ 種特異性でない）が、マトリックスは種特異性でありそして恐らく固有の免疫成 分もしくは阻害成分のために他種に移植できないことを示唆している。従って従 来、骨を主体とするマトリックスが、骨形成蛋白質の骨誘発能を完全に発揮させ るためには、種特異的コラーゲン性骨マトリックスが要求されていた。

全ての骨マトリックスの主要成分は、タイプＩコラーゲンである。コラーゲンに 加えて、抽出骨は非−コラーゲン性蛋白質をその質量の５％程度含む。骨マトリ ックスの多くの非−コラーゲン性成分はグリコプロティンである。骨形成におけ るグリコプロティンの生物学的意義は知られていないが、その含有する炭水化物 が強方な抗原となり、異種マトリックス中に存在する免疫源成分および／または 阻害成分を構成するのであろう。

本発明者らは、コラーゲン骨マトリックスが、マトリックスから免疫源性かつ阻 害性成分を最初に除去すれば、異種移植物の骨誘発能力をおこさせる担体として 使用できることを見出した。この目的を達成するために、マトリックスは例えば 弗化水素を用いて化学的に脱グリコシル化される。

上記のようにして調製されたウシ骨残渣を篩い分けし、７４−４２０μｍの粒子 を回収する。このサンプルを真空中でＰ２Ｏ５により乾燥し、反応容器に移し、 次いで無水弗化水素（ＨＦ）（１０−２０ｄ／ｇｖトリックス）を−７０℃でサ ンプル上に留出させる。容器を０℃に温め、そして反応混合物をこの温度で室温 で１２０分間撹拌する。ＨＦを真空で蒸発させたのち、残渣をＫＯＨベレット上 で真空にて完全に乾燥して残存する痕跡量の酸も除去する。

脱グリコジル化の程度は、ＨＦ処理の前後のマトリックスサンプルを、非−共有 結合的に含まれる炭水化物を除去するために適当な洗浄処理に付した後、炭水化 物を分析して知ることができる。

脱グリコジル化骨マトリックスを次に下記の如く処理する： １）　　ＴＢＳ（）＋Ｊス緩衝”ｊ’）　−ン）＋、：１ｇ／２００ｄに懸濁し 、４°Ｃで２時間撹拌する；または６Ｍ尿素、５０ｍＭトリス塩酸、５００ｍＭ ＮａＣｌ５ｐＨ７，０（ＵＴＢＳ）に懸濁しそして室温で３０分間撹拌する； ２）遠心分離しそして工程１のＴＢＳまたはＵＴＢＳで洗浄する；そして ３）遠心分離し、上清を捨て、残渣を水で洗浄し、次に凍結乾燥する。

器具の組み立て 上記の任意の骨形成蛋白質とともに上記任意のマトリックスを用いて骨形成器具 を次のように実施する。

Ａ、王久に酉迄員 この操作において、マトリックスはグアニジン−ＨＣｌ中の骨形成蛋白質に添加 される。サンプルを渦巻撹拌し、低温でインキュベートする。次にサンプルをさ らに渦巻撹拌する。冷無水エタノールをこの混合物に添加し、これを次に撹拌し インキュベートする。遠心分離（小型高速遠心機）の後上清を棄てる。再構成マ トリックスを冷水中の高濃度のエタノールで洗浄しそして凍結乾燥この操作にお いて、アセトニトリル　トリフルオロ酢酸（ＡＣＮ／ＴＦＡ）溶液中の骨形成蛋 白質を担体に添加する。サンプルを何回も激しく渦巻撹拌し、その後凍結乾燥す る。

Ｃ１，永」ｂ１詰１４ 尿素緩衝液中に調製された蛋白質については、蛋白質をマトリックスと混合し、 何回も渦巻撹拌し、そして凍結乾燥する。凍結乾燥された材料は、そのまま移植 物として使用できる。

合成蛋白質のいくつかを、マトリックスに混入させて骨形成器具とし、ラットに おいて軟骨内骨形成のアッセイを行った。ラットでの研究は、骨形成効果が骨形 成器具内に分散した骨形成蛋白質の量に依存することを示した。マトリックスを 単独で移植した場合は、活性は全く認められなかった。次に、蛋白質構造物およ びマトリックスの生物学的活性を評価するために、本発明の骨形成器具をいかに して使用するかの指針を示す。

Ａ、皮工笈巣 Ｓ　ａ　ｍ　ｐ　ａ　ｔ　ｈおよびＲｅｄｄｉ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９８３）８０：６５９１−６５９５：参照によりここ に含まれる）により記載された骨誘発のバイオアッセイを用いて軟骨内骨分化活 性を評価した。このアッセイはエーテル麻酔下の同種異系被受容ラットの皮下部 位に試験サンプルを移植することからなる。２８−３２日令の雄のＬｏｎｇ−Ｅ ｖａｎｓラットを用いた。無菌条件で胸部領域の皮膚に縦の切込み（１−）を作 製し、鈍い刃で切開してポケットを作製した。約２５■の試験サンプルをこのポ ケットに深く移植し、皮膚用金属性クリップで切込み部分を閉じた。移植の当日 を実験１日目とした。移植物は１２日目に除去した。この異所性部位を用いた試 験は、正常部位を用いて得られた結果に付随する不明瞭さを排除した骨誘発試験 を可能にする。

Ｂ−亘ｎ旦！監 ラットでの移植モデルは、マトリックスにより誘発される軟骨内骨の発達の段階 を通じて、（１）　　第１日月における多形核白血球による一過性の侵入；（２ ）第２および３日目の間葉細胞の遊走および増殖；（３）第５および６日目にお ける軟骨細胞の出現；（（１）第７日月における軟骨マトリックスの形成；（５ ）第８８目における軟骨のカルシウム化；（６）第９および１０日目における血 管の侵入、骨芽細胞の出現および新生骨の形成；（７）第１２ないし１８日目に おける骨芽細胞および骨の修復の出現および移植マトリックスの分解；および（ ８）第２１日月における小骨内での造血性骨髄分化；を含む制御された発達を示 す。この結果は新たに生じる骨の形状は移植されたマトリックスの形に一致する ことを示す。

Ｃ１■産土煎１ゑ 移植物内での骨形成の程度を評価するためには、組織切片作製およびその染色が 好ましい。移植物をブアン液で固定しパラフィンに包埋し、６−８ｍｍの切片に 切り出す。トルイジンブルーまたはへマドキシリン／エオシンでの染色は、軟骨 内骨の最終的発達を明確に証明する。

通常、この移植物が骨誘発活性を示すかどうかを判断するために１２日目の移植 物で十分である。

Ｄ、生　８・マーカー 骨形成のマーカーとしては、アルカリホスファターゼ活性を用いることができる 。この酵素活性は移植物をホモジナイズした後、分光分析で測定できる。ｉｎ　 　ｖｉＶＯでの活性は９−１０日８にピークに達し、その後徐々に低下する。組 織学的試験で骨の発達を示さない移植物は、これらのアッセイ条件でアルカリホ スファターゼ活性を殆どまたは全く示さないであろう。このアッセイは移植物を ラットから取り出して骨形成を非常に迅速に定量または評価するために有用であ る。別法として、骨形成の量は移植物のカルシウム含量の測定によっても知るこ とができる。

骨形成蛋白質による骨形成活性は、「骨形成単位」で表示される。１骨形成単位 は、ラットの脱ミネラル骨マトリックスをコントロールとして１２日口の移植物 のカルシウム含量を決定したとき、最大骨形成活性の半分に必要な蛋白質量を示 す。

ラットの担体のみを含む器具は新生骨形成を全く示さない。その場合の移植物は 、担体であるラットのマトリックスおよびその周囲の間葉細胞のみを含んでいる 。ラットの担体および正しく折り畳まれていない（もしくは生物学的に不活性な ）組換え蛋白質を含む器具もまた、骨形成を全く示さなかった。これらの移植物 は軟骨形成（−）および骨形成（−）と採点される。その軟骨内骨形成活性はゼ ロパーセント（０％）と採点される（第３Ａ図）。

これに対して、生物学的に活性な組換え蛋白質を含む移植物は、軟骨内骨形成の 証拠を示した。組織学的に、移植物は新たな軟骨および骨形成を示した。

軟骨形成は移植物の中心での異染性に染色された軟骨細胞の存在により（＋）と 採点され、移植物の多くの領域での多数の軟骨細胞の存在により（＋＋）と採点 され、そして軟骨細胞を形成する軟骨マトリックスの大量の存在および軟骨のカ ルシウム化を伴う肥大軟骨細胞の出現によって（＋＋＋）と採点される（第３Ｂ 図）。

骨形成は、新たなマトリックスを形成する血管内皮を囲む骨芽細胞の存在により （＋）と採点され、骨芽細胞によって骨が形成され（矢印で示されている）更に 、新たに形成された骨マトリックスに向かいあって破骨細胞が出現して骨の修復 がなされることによって（十＋）と採点される。これらの移植物での血管侵入は 明らかである（第３Ｂ図）。小骨の形成をもたらす十分に修復された骨の存在に より、骨形成は（＋＋＋）と採点される。

組換え蛋白質による総合的骨形成誘発活性を、軟骨内骨形成応答の百分率で示す （下記第２表を参照）。

第２表 組換え骨形成蛋白質の組織学的評価 サンプル番号　移植蛋白質　　軟骨形成　　骨形成２６０−５４　　Ｃ０Ｐ−５ ＋＋＋　　　　＋＋２７９−５　　　Ｃ０Ｐ−５＋＋　　　　　＋２８５−１３ 　　Ｃ０Ｐ−５＋＋＋　　　　＋＋２７７−７　　　　Ｃ０Ｐ−７＋＋＋　　　 　　　＋＋２７７−８　　　Ｃ０Ｐ−７＋＋＋＋ ２７７−９Ｃ０Ｐ−７＋＋　十 ２８５−１４　　　Ｃ０Ｐ−７＋＋＋　　　　　　＋＋２８５−２４　　　Ｃ０ Ｐ−７＋＋　　　　　　　＋２８５−２５　　Ｃ０Ｐ−７＋＋　　　　十＋３１ ４−６　　　　Ｃ０Ｐ−１６＋＋＋　　　　＋＋＋３１４−１５　　　Ｃ０Ｐ− １６＋＋　　　　　　　＋３１４−１６　　　Ｃ０Ｐ−１６＋＋　　　　　　　 ＋３１４−１２　　０Ｐ−１＋＋　　　　＋本発明はその精神もしくは本質的特 徴を逸脱することなく、他の特定の態様によっても実施できる。従って、本発明 中の態様は例示的なものであって、決して限定的なものではなく、本発明の範囲 は明細書ではなく請求の範囲により定められ、請求の範囲と均等の意味および範 囲内での変更は、本発明の範囲に含まれる。

Ｃ，）＜−二に）−φ〉ロー二く開国η　　　　＞ＪＭ−菌トト０く＝＞　（Ｊ 　：Ｉ：　ＣＤ　Ｃ：）　ＣＪ　（ｊ）　Ａ　：ｌ：　ＨＱａ　Ｏａ　Ｚ　Ａ　 ｗ　Ｊ　Ｑｌ　＞　ＱＩ　Ｃ：）　＜　　　Ｈａ|ヒ−＜ＯＯａ＞ ２２：（ＪＯ（ｊ＞（ＪＣ：ｌ算ｃｌ−＋０ＣＱＱＸ　　ＺＱａＣｇ＞Ｃ：）Ｚ ＊　　　＞＞Ｊａｈ２’：４１ω　　山　　　　　−眞　　　　　く　　　　　 ←　　　エ　　　　ト　　　り＜＜−（φ　　　　　０　　　工　　　　Ｘ　　 　ω２−υ−ロ山ＣＪ　Ｑｌ　％　ｌ−１ぶψ　−一ロ　トｏ　　ト　φ×〉− ＜−ン２ｚ：ｍｕ田口ωｏｏａ＜’：ｓａ＜ａ＞山口ωくφψ−工ｈ＜＞＞’ｚ 、ｏンエΣ２ＨＣ，）菌０凶０−のニーくクトψＱωクークーエωト〉−＝工； 工ΣトζＱφ口くω０−−Σ−×φ−×−ψＺ−（Ｅ−１１−１０すＨ〉匡−ζ ω＝Ｑ菌ＱＩＩＬＣｂＯ＜＋Ｊ＜ロエー２０ｈｚ　　　＝ｅ　　ｌ−＋＞Ｏｆ− ＋−＞Ｚ：ＸＨＣＪＣｄＣ）田（Ｊ＜ＬＡ＋ＪＺＣＱＮＥＺ（？Ｚ　　　：ｅ　 　（＋−１＞０１−＋−＞：ｅンζυ：ｅり×Ｑへ−−４くロー−タクト２　　 工　（＞＞ＯＳ−＋、Ｊ＞２Ｚ＞ＣＪ＞０ＱＣＪＱ−＋＞ＱａＪｈＣｄＨＪＺＯ ＶＪＺ　　　Ｚ　　＜ＨＪＯＥ−＋Ａ＞＝ｒ　Ｃｔｔ％ＣＪＷＣ）（ＣＪＱＩ： ｂＱｔｃＱ（口：ｅＣｂＺＣ／３ｈＺ　　　：ｅ　　（＞＞０Ｅ−１＋Ｊ＞Ｚφ −一　　山ｏ　　　　（ＯＱ＋（ＪＣＪ（＜Ｊ−ロトー二シー＝〉区トドφ口０ （匡口（＜−＜区　−ＱＩ（ＪＣＪ＞Ｑｔ！−＋（Ｈ（Ｌｌｋ−−Ｈψ−Φ叩囚 工←−図　　　　　リ　　　　　　　　シ　　ロ　　　　　　　ト　　−　　　 ン　　二トド−菌　　　　　φ　　　　　　　　ω　　ロ　　　　　　　ト　　 −　　　＋　　　Ｘ＋０ニー　　山Ｑくφべく　　Ｑｔ（ＪＣＪ＞ＣＬ＋Ｏ（− 關山一山一〉トド〉Ｑ区×ｇｏ−ｚ　　−クト１４＞　　Ｚφυ○Ｈ−−×−ク トΣψΣ−トーロロ菌２工Φ工φ　伽−（Ｚ＋Ｊ　　ＷＥ／１ｔＪ（Ｊ＞０ａｔ −ＩＷ−エー工ω工−ントロロじＯく〉り〉〉−０１−１山閲山ＣＪ（Ｊ＞シ閃 ×頴ωクーφＨ−ｈｈ−ロ凶ｚ×ω〉２　０　　輩１−１０ａ　ｘ　（（Ｊす〉 −トド−ωくＨりΣ−２−ロ閃２田−−２　−−　ト〉シ＊＜ＣＪＣＪ＜Ｑ、＋ ＦｓＯ）Ｚ＜Ｈψ〉−出御ロロωの２：２２１：Ｌ＋（ｊＷ＞山×くりＱ〉トド ０４０φ〉く冨−ｋＪＺ口ＯφＣＯＨ菌　　〜図　□　ｓｒ　ｌ：１−　Ｊ　Ｏ −（Ｊ　ＣＪ　＞〜ト×工ψ−一のΣ−−トロｚＺローω＜ｌ：：ｅ：！：＞　 　ＱＩ　　Ｚ頴〉＜８−○じＱ二ＥＨ＞ＸｇＱ＞ｃＡ４　Ｚ！＋＞１４ＣｄＣＪ Ｃ）ＣＪにＺ　１−Ｉ　Ｈ’ｘ：　’ｋｄ口＋ｏ　　ＺＥ＋＞ＷＣｄｕＣ）υφ ｚ＞＞ｌ−１ｘ＞′：Ｐ４ｃｂ　　　ｚｚｈ＞ｔｔ、＋ｔａｕ工０＝ｗ＞＞ａｖ ｚ＞ａ　　ロ繁〉〉菌ＱＱＱυ部Ｚ）＋、Ｊｇ％一部　２区〉〉工く○ＱＱ工ｈ ＞＞−＋ｔｚ：ｓｏ　　ｃｔ＞ｚｈ＞＞ｏｕｏｕｇＺ＞＞−瞑＝トド　２Ｅ（＞ 口閃Ｑ００区ＦＩＧ、２Ｂ−１ ■トラ１融今を白Ｖ ！１９■Ｉ ６０　　　　　　　７０　　　　　　　８１０　　　　　　　１１０　　　　　 　１ｏ。

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「１．哺乳類の体からの遊走性先祖細胞の侵入、増殖および分化を可能にするの に十分な寸法の複数孔を規定する、生体適合性でかつｉｎ　ｖｉｖ。

で生体分解性のマトリックス；および 宿主細胞内での組換えＤＮＡの発現により製造された蛋白質であって、該蛋白質 は一本もしくはそれ以上のポリペプチド鎖から成り、当該各ポリペプチド鎖は、 哺乳類への移植時に前記蛋白質が前記マトリックスと共に軟骨内骨形成を誘発す るコトカテキルヨウ、Ｃ０Ｐ５．Ｃ０Ｐ７．Ｃ０Ｐ１６またはＯＰＩの配列を十 分に複製したアミノ酸配列を持つ、上記蛋白質； からなる哺乳類における移植用骨形成器具。

２、　哺乳類の体からの遊走性先祖細胞の侵入、増殖および分化を可能にするの に十分な寸法の複数孔を規定する、生体適合性でかつｉｎ　ｖｉｖｏで生体分解 性のマトリックス；および 宿主細胞内での組換えＤＮＡの発現により製造された蛋白質であって、該蛋白質 は一本もしくはそれ以上のポリペプチド鎖から成り、当該各ポリペプチド鎖は約 ２００より少ないアミノ酸を有し、当該各アミノ酸は哺乳類への移植時に前記蛋 白質が前記マトリックスと共に軟骨形成を誘発することができるよう、Ｃ０Ｐ５ ．Ｃ０Ｐ７．Ｃ０Ｐ１６またはＯＰＩの配列を十分に複製した配列を持つ、上記 蛋白質； からなる哺乳類における移植用器具。

３、　宿主細胞内での組換えＤＮＡの発現により製造された骨形成蛋白質であっ て、該蛋白質は一本もしくはそれ以上のポリペプチド鎖から成り、当該各ポリペ プチド鎖は、哺乳類への移植時に前記蛋白質がマトリックスと共に軟骨内骨形成 を誘発することができるよう、Ｃ０Ｐ５．Ｃ０Ｐ７゜Ｃ０Ｐ１６またはＯＰＩの 配列を十分に複製した配列を持つ、上記蛋白質。

４、　宿主細胞内での組換えＤＮＡの発現により製造された蛋白質であって、該 蛋白質は約２００より長くないアミノ酸を持つ一本もしくはそれ以上のポリペプ チド鎖から成り、かつ哺乳類への移植時に前記蛋白質がマトリックスと共に軟骨 形成を誘発することができるよう、Ｃ０Ｐ５．Ｃ０Ｐ７、Ｃ０Ｐ１６またはＯＰ Ｉの配列を十分に複製した配列を持つ、上記蛋白質。

５、　前記配列が次式： （式中、各位置において一つ以上のアミノ酸が示されている場合は、その位置に は示された任意のアミノ酸が存在してよいことを意味する）からなる、請求項１ または２記載の器具。

６、　前記配列が次式： （式中、各位置において一つ以上のアミノ酸が示されている場合は、その位置に は示された任意のアミノ酸が存在してよいことを意味する）からなる、請求項３ または４記載の蛋白質。

７、　前記配列が次式： （式中、各位置において一つ以上のアミノ酸が示されている場合は、その位置に は示された任意のアミノ酸が存在してよいことを意味する）からなる、請求項１ または２記載の器具。

８、　前記配列が次式： （式中、各位置において一つ以上のアミノ酸が示されている場合は、その位置に は示された任意のアミノ酸が存在してよいことを意味する）からなる、請求項３ または４記載の蛋白質。

９、　前記配列が次式： からなる、請求項１または２記載の器具。

１０、　　前記配列が次式： からなる、請求項３または４記載の蛋白質。

１１、　　前記配列が次式： からなる、請求項１または２記載の器具。

１２、　前記配列が次式コ からなる、請求項３または４記載の蛋白質。

１３、　前記配列が次式： からなる、請求項１または２記載の器具。

１４、　　前記配列が次式： からなる、請求項３または４記載の蛋白質。

１５、　　前記配列が次式： からなる、請求項１または２記載の器具。

１６゜　前記配列が次式： からなる、請求項３または４記載の蛋白質。

１７、　　前記配列が次式： からなる、請求項１または２記載の器具。

１８６　前記配列が次式： からなる、請求項３または４記載の蛋白質。

１９、　前記配列が次式： からなる、請求項１または２記載の器具。

２０、　　前記配列が次式： からなる、請求項３または４記載の蛋白質。

２１、　前記配列が次式： からなる、請求項１または２記載の器具。

２２、　前記配列が次式： からなる、請求項３または４記載の蛋白質。

２３、　　前記配列が次式： からなる、請求項１または２記載の器具。

２４゜　前記配列が次式： からなる、請求項３または４記載の蛋白質。

２５、　　前記配列が次式： からなる、請求項１または２記載の器具。

２６、　　前記配列が次式： からなる、請求項３または４記載の蛋白質。

２７、　　前記配列が次式二 からなる、請求項１または２記載の器具。

２８、　前記配列が次式： からなる、請求項３または４記載の蛋白質。

２９、　前記配列が次式： からなる、請求項１または２記載の器具。

３０、　前記配列が次式： からなる、請求項３または４記載の蛋白質。

３１、　前記配列が次式： ％式％ からなる、請求項１または２記載の器具。

３２．　　前記配列が次式： からなる、請求項３または４記載の蛋白質。

３３、　　前記配列が次式： ％式％ からなる、請求項１または２記載の器具。

３４、　前記配列が次式： からなる、請求項３または４記載の蛋白質。

３５、　前記蛋白質が一対の別のポリペプチド鎖からなる、請求項１または２記 載の器具。

３６、′　前記蛋白質が一対の別のポリペプチド鎖からなる、請求項３または４ 記載の蛋白質。

３７、　　前記蛋白質がグリコジル化されていないことをさらに特徴とする、請 求項１または２記載の器具。

３８、　前記蛋白質がグリコジル化されていないことをさらに特徴とする、請求 項３または４記載の蛋白質。

３９、　　前記蛋白質がプロカリオート細胞でのＤＮＡの発現産物からなる、請 求項１または２記載の器具。

４０、　　前記蛋白質がプロカリオート細胞でのＤＮＡの発現産物からなる、請 求項３または４記載の蛋白質。

４１、　請求項３または４記載の蛋白質を発現するように遺伝子工学的に操作さ れた細胞ライン。

４２、　　最大骨形成活性の１／２の値が移植物２５ｍｇ当たり約２２０−２５ ｎである、請求項３記載の蛋白質。

４３、　　請求項３または４記載の蛋白質のエピトープに反応する抗体。

４４、　前記マトリックスが、脱ミネラル化され、脱グリコジル化され、蛋白質 抽出を受け、粒状化された異種動物の骨からなる、請求項１または２記載の器具 。

４５、　前記マトリックスが、脱ミネラル化され、蛋白質抽出を受け、粒状化さ れ、ＨＦ処理された異種動物の骨からなる、請求項１または２記載の器具。」 以上 国際調査報告 １１１１＠陶嘗−ＩＩ酊−ム紳儒−，，１，−−Ｎ−，ＰＣＴ／υ５８９１０１ ４６９に＋−・ｌ＋ａＭｌ　Ａｓ＋１ｋｄｌ−６例−・　　　ＰＣＴ／ＵＳ　　 ８９１０１４６９Ｗ＠＋ＡａｌＩＩＭ＠ｌ＾ｅｌ１４ｅ＊１１１１ｅｌ−喀ＬＰ Ｃ’Ｆ／てｌ５８９１０１４６９１ｍ鯉ａａ悔−ム−ｍ−””　　ＰＣＴ／ＵＳ 　８９１０１４６９国際調査報告 ＵＳ　８９０１４６９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳類の体からの遊走性先祖細胞の侵入、増殖および分化を可能にするのに 十分な寸法の複数孔を規定する、生体適合性で且つｉｎ　ｖｉｖｏで生体分解性 のマトリックス；および 宿主細胞内での組換えＤＮＡの発現により製造された蛋白質であって、該蛋白質 を構成する一本もしくはそれ以上のポリペプチドが、前記マトリックスと共に哺 乳類に移植される該蛋白質に軟骨内骨形成誘発能力を持たせるのに十分な程度に 、ＣＯＰ５，ＣＯＰ７，ＣＯＰ１６またはＯＰ１の配列を複製したアミノ酸配列 を持つ一本もしくはそれ以上のポリペプチド鎖からなる上記蛋白質；からなる哺 乳類へ移植するための骨形成器具。 ２．哺乳類の体からの遊走性先祖細胞の侵入、増殖および分化を可能にするのに 十分な寸法の複数孔を規定する、生体適合性で且つｉｎ　ｖｉｖｏで生体分解性 のマトリックス；および 宿主細胞内での組換えＤＮＡの発現により製造された蛋白質であって、該蛋白質 を構成する一本もしくはそれ以上のポリペプチドが、約２００より少ないアミノ 酸を有し、そして該ポリペプチドは、前記マトリックスと共に哺乳類に移植され る該蛋白質に軟骨形成誘発能力を持たせるのに十分な程度に、ＣＯＰ５，ＣＯＰ ７，ＣＯＰ１６またはＯＰ１の配列を複製したアミノ酸配列を持つ一本もしくは それ以上のポリペプチド鎖からなる上記蛋白質； からなる哺乳類へ移植するための器具。 ３．ポリペプチドの配列が次式： 【配列があります】 （式中、各Ｘは独立してアミノ酸を表す。）からなる請求項１記載または２項記 載の器具。 ４．ポリペプチドの配列が次式： 【配列があります】 （式中、各Ｘは独立してアミノ酸を表す。）からなる請求項１記載または２項記 載の器具。 ５．ポリペプチドの配列が次式： 【配列があります】 （式中、各位置において一つ以上のアミノ酸が示されている場合は、その位置に は示された任意のアミノ酸が存在してよいことを意味する。） からなる請求項１記載または２項記載の器具。 ６．ポリペプチドの配列が次式： 【配列があります】 （式中、各位置において一つ以上のアミノ酸が示されている場合は、その位置に は示された任意のアミノ酸が存在してよいことを意味する。） からなる請求項１記載または２項記載の器具。 ７．ポリペプチドの配列が次式： 【配列があります】 からなる請求項１記載または２項記載の器具。 ８．ポリペプチドの配列が次式： ＤＰＰ【配列があります】 からなる請求項１記載または２項記載の器具。 ９．ポリペプチドの配列が次式： ＯＰ１【配列があります】 からなる請求項１記載または２項記載の器具。 １０．ポリペプチドの配列が次式： ＯＰ１【配列があります】 からなる請求項１記載または２項記載の器具。 １１．ポリペプチドの配列が次式： ＣＢＭＰ−２ａ【配列があります】 からなる請求項１記載または２項記載の器具。 １２．ポリペプチドの配列が次式： ＣＢＭＰ−２ｂ【配列があります】 からなる請求項１記載または２項記載の器具。 １３．ポリペプチドの配列が次式： ＣＢＭＰ−３【配列があります】 からなる請求項１記載または２項記載の器具。 １４．ポリペプチドの配列が次式： ＣＯＰ１【配列があります】 からなる請求項１記載または２項記載の器具。 １５．ポリペプチドの配列が次式： ＣＯＰ３【配列があります】 からなる請求項１記載または２項記載の器具。 １６．ポリペプチドの配列が次式： ＣＯＰ４【配列があります】 からなる請求項１記載または２項記載の器具。 １７．ポリペプチドの配列が次式： ＣＯＰ５【配列があります】 からなる請求項１記載または２項記載の器具。 １８．ポリペプチドの配列が次式： ＣＯＰ７【配列があります】 からなる請求項１記載または２項記載の器具。 １９．ポリペプチドの配列が次式： ＣＯＰ１６【配列があります】 からなる請求項１記載または２項記載の器具。 ２０．骨形成蛋白質が一対の別のポリペプチド鎖からなる請求項１記載または２ 項記載の器具。 ２１．宿主細胞内での組換えＤＮＡの発現により生産された骨形成蛋白質であっ て、マトリックス物質と共に哺乳類に移植したとき、該蛋白質に軟骨内骨形成誘 発能力を持たせるのに十分な程度に、ＣＯＰ５，ＣＯＰ７，ＣＯＰ１６またはＯ Ｐ１の配列を複製したアミノ酸配列を持つ一本もしくはそれ以上のポリペプチド 鎖からなる、上記蛋白質。 ２２．宿主細胞内での組換えＤＮＡの発現により生産された蛋白質であって、哺 乳類に移植したとき、該蛋白質にマトリックス物質と一緒になって軟骨形成誘発 能力を持たせるのに十分な程度に、ＣＯＰ５，ＣＯＰ７，ＣＯＰ１６またはＯＰ １の配列を複製し、且つ２００アミノ酸より長くないアミノ酸配列を持つ一本も しくはそれ以上のポリペプチド鎖からなる、上記蛋白質。 ２３グリコシル化されていないことをさらに特徴とする、請求項２１または２２ 記載の蛋白質。 ２４．一対の別のポリペプチド鎖からなる、請求項２１または２２記載の蛋白質 。 ２５．下記のアミノ酸配列： 【配列があります】 （式中、各Ｘは独立してアミノ酸を表す。）からなる、請求項２１または２２記 載の蛋白質。 ２６．下記のアミノ酸配列： 【配列があります】 （式中、各Ｘは独立してアミノ酸を表す。）からなる、請求項２１または２２記 載の蛋白質。 ２７．下記のアミノ酸配列： 【配列があります】 （式中、各位置において一つ以上のアミノ酸が示されている場合は、その位置に は示された任意のアミノ酸が存在してよいことを意味する。） からなる、請求項２１または２２記載の蛋白質。 ２８．下記のアミノ酸配列： 【配列があります】 （式中、各位置において一つ以上のアミノ酸が示されている場合は、その位置に は示された任意のアミノ酸が存在してよいことを意味する。） からなる、請求項２１または２２記載の蛋白質。 ２９．下記のアミノ酸配列： Ｖｇ１【配列があります】 からなる、請求項２１または２２記載の蛋白質。 ３０．下記のアミノ酸配列： ＤＰＰ【配列があります】 からなる、請求項２１または２２記載の蛋白質。 ３１．下記のアミノ酸配列： ＯＰ１【配列があります】 からなる、請求項２１または２２記載の蛋白質。 ３２．下記のアミノ酸配列： ＯＰ１【配列があります】 からなる、請求項２１または２２記載の蛋白質。 ３３．下記のアミノ酸配列： ＣＢＭＰ−２ａ【配列があります】 からなる、請求項２１または２２記載の蛋白質。 ３４．下記のアミノ酸配列： ＣＢＭＰ−２ｂ【配列があります】 からなる、請求項２１または２２記載の蛋白質。 ３５．下記のアミノ酸配列： ＣＢＭＰ−３【配列があります】 からなる、請求項２１または２２記載の蛋白質。 ３６．下記のアミノ酸配列： ＣＯＰ１【配列があります】 からなる、請求項２１または２２記載の蛋白質。 ３７．下記のアミノ酸配列： ＣＯＰ３【配列があります】 からなる、請求項２１または２２記載の蛋白質。 ３８．下記のアミノ酸配列： ＣＯＰ４【配列があります】 からなる、請求項２１または２２記載の蛋白質。 ３９．下記のアミノ酸配列： ＣＯＰ５【配列があります】 からなる、請求項２１または２２記載の蛋白質。 ４０．下記のアミノ酸配列： ＣＯＰ７【配列があります】 からなる、請求項２１または２２記載の蛋白質。 ４１．下記のアミノ酸配列： ＣＯＰ１６【配列があります】 からなる、請求項２１または２２記載の蛋白質。 ４２．ブロカリオート細胞内でのＤＮＡの発現産物である、請求項２１または２ ２記載の蛋白質。 ４３．請求項２１または２２記載の蛋白質を発現するように遺伝子工学的に操作 された細胞ライン。 ４４．最大骨形成活性の１／２の値が、移植物２５ｍｇ当たり約２０−２５ｎｇ である、請求項２１記載の蛋白質。 ４５．請求項２１または２２記載の蛋白質のエピトープに反応する抗体。 ４６．マトリックスが、脱ミネラルされ、脱グリコシル化され、蛋白質抽出を受 け、粒状化された、異種動物の骨である、請求項１または２記載の器具。 ４７．マトリックスが、脱ミネラルされ、脱グリコシル化され、蛋白質抽出を受 け、粒状化された、異種動物の骨をＨＦ処理したものである、請求項１または２ 記載の器具。