JPH08322570A - 骨形成デバイス - Google Patents

骨形成デバイス

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JPH08322570A
JPH08322570A JP8084325A JP8432596A JPH08322570A JP H08322570 A JPH08322570 A JP H08322570A JP 8084325 A JP8084325 A JP 8084325A JP 8432596 A JP8432596 A JP 8432596A JP H08322570 A JPH08322570 A JP H08322570A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 軟骨内骨形成タンパク質を提供すること 【解決手段】ほ乳動物で軟骨および軟骨内骨形成を誘導
し得るダイマー蛋白質を生産する方法であって、一対の
ポリペプチド鎖を有し、それぞれの鎖は２００より少な
いアミノ酸を有しており、以下の工程 （ａ）一対のポリペプチド鎖の少なくとも一方をコード
し、そして、OP-1, CBMP-2a, CBMP-2b,およびCBMP-3配
列からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸
配列を有する遺伝物質を提供する工程； （ｂ）該遺伝物質を宿主細胞に導入する工程； （ｃ）該ポリペプチドを生産するのに充分な条件下で該
遺伝物質を発現させる工程； （ｄ）工程（ｃ）のポリペプチド鎖を有する、正しく折
り畳まれた骨形成活性を有するダイマー蛋白質を生産す
る工程；および、 （ｅ）工程（ｄ）の該ダイマーの骨形成活性蛋白質を単
離する工程；を包含する方法により、ほ乳動物で軟骨お
よび軟骨内骨形成を誘導し得るダイマー蛋白質を提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、骨形成デバイス、
哺乳動物中で骨形成を誘導可能なタンパク質をコードす
る遺伝子とその産物を組み換えＤＮＡ技術を用いて産生
するための方法、哺乳動物の骨から鼻孔タンパク質を再
現性よく精製する方法、および、骨形成デバイスを用い
た骨および軟骨修復法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】哺乳動物骨組織は、おそらく成長時およ
び通常の骨治癒の際に活性を持つ、一種以上のタンパク
性物質を含んでいることが知られており、その物質は軟
骨内の骨形成を引き起こす細胞性現象の分化カスケード
を誘導することができる。この活性因子は文献中で、骨
形態発生タンパク質、骨誘導タンパク質、骨形成タンパ
ク質、オステオゲニンまたは骨誘導タンパク質（osteoi
nductive protein）として様々に呼ばれてきた。
【０００３】骨分化の発生カスケードは、間葉細胞の補
充、前駆細胞の増殖、軟骨のカルシウム沈着、血管の侵
入、骨形成、再編成、および最後の骨髄分化からなる
（レディ（Reddi）(1981) Collagen Rel. Res. １:209-
226）。
【０００４】これらの表現型の形態転換を引き起こす詳
細な機構はいまだ明らかになっていないが、通常の骨基
質の軟骨内骨分化活性を分離抽出し、不活性な残存する
コラーゲン性基質と再構成させて完全な骨誘導活性を回
復させられることが示されている（サンパス（Sampat
h）とレディ（Reddi）、（1981）Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA78 : 7599-7603）。このことにより、タンパク質
抽出液が軟骨内の骨をｉｎ ｖｉｖｏで誘導する活性を
アッセイするための実験法が与えられる。
【０００５】骨誘導タンパク質であると予想されるこの
タンパク質は、５０キロダルトン（ｋＤ）以下の分子量
を持つことが示された。種間移植実験から示されたよう
に、数種の哺乳動物が密接に関連したタンパク質を産生
する（サンパス（Sampath）とレディ（Reddi）(1983）P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6591-6595）。
【０００６】このタンパク質の潜在的な有用性は広く認
識されている。このタンパク質が容易に入手可能となる
ことにより、整形外科医学、ある種の形成外科、および
多様な歯周および脳顔面頭蓋復元法を根本的に変えるで
あろうと予測されている。
【０００７】これらのタンパク質画分に関して観察され
た性質から、骨形成活性を担う純粋な因子（群）の分離
および同定を目的として多数の研究室で熱心な研究が行
われてきた。
【０００８】哺乳動物の骨から骨形成タンパク質を生成
する技術の現在の状態は、サンパスらによって開示され
ている（ Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 80）。
ウリスト（Urist）ら（Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (1
984) 173: 194-199）は、塩化カルシウム−尿素、無機
−有機溶媒混合物を用いて鉱物質除去された皮質性骨か
ら抽出し、グアニジン−塩酸中で分離沈殿させ調製用ゲ
ル電気泳動で回収したヒト骨形成タンパク質を開示して
いる。著者らは該タンパク質画分は酸性ポリペプチドの
アミノ酸構成を有し、分子量は１７〜１８ｋＤの範囲で
あることを報告している。
【０００９】ウリスト（Urist）ら（Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1984) 81: 371-375）は、酸性ポリペプチド
であって分子量約１８ｋＤのウシ骨形態形成タンパク質
抽出物を開示している。該タンパク質とヒドロキシアパ
タイトクロマトグラフィーで分離された画分中に存在
し、マウス後四半部筋肉中での骨形成およびラットおよ
びイヌ頭蓋のトレフィン欠陥の骨再生を誘導することを
著者らは報告している。骨から該抽出物を得る彼らの方
法では、定義の愛味な不純な調製物が得られる。
【００１０】１９８５年１０月７日に出版されたヨーロ
ッパ特許出願連続番号第１４８，１５５号は、ウシ、ブ
タ、およびヒト由来の骨形成タンパク質を開示すること
を意図している。該タンパク質の一つ、発明者がＰ３タ
ンパク質と呼んでいるものは分子量が２２〜２４ｋＤで
あり、実質的に均質な状態にまで精製されたと言われて
いる。この物質は、動物に移植すると骨形成を誘導する
ことが報告されている。
【００１１】１９８８年１月１４日に出願された、国際
出願番号ＰＣＴ／０８７／０１５３７号は骨誘導活性を
有するウシ骨由来の不純な画分を開示している。上述の
出願らは、組み換えＤＮＡ技術によって産生された骨誘
導因子であると予想される因子も開示している。ヒトあ
るいはウシのゲノムあるいはｃＤＮＡライブラリーから
４種のＤＮＡ配列（ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２クラスＩ
（またはＢＭＰ−２）、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−２クラス
ＩＩ（またはＢＭＰ−４））が回収され、組み換え宿主
細胞中で明らかに発現された。発現されたタンパク質は
骨形態形成タンパク質であろうと出願人らは述べている
が、骨誘導は示されなかった。骨形態形成剤と題された
ウリスト（Urist）ら、EP 0,212,474も参照のこと。ワ
ン（Wang）ら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 8
5: 9484-9488）は、ウシの鉱物質除去した骨のグアニジ
ン抽出物から、ゲル溶出から分子量３０ｋＤと決定され
た塩基性タンパク質として軟骨・骨形成活性を有するウ
シ骨形態形成タンパク質の精製を開示している。該タン
パク質の精製により、３０、１８、および１６ｋＤのタ
ンパク質が得られ、これらは分離されると不活性であっ
た。この結果から見て、活性を持つ物質の正確な性質は
決定されなかったと著者らは認めている。
【００１２】ウォズニー（Wozney）ら（Science（198
8）242: 1528-1534）は、ウシ骨からまず精製された３
つのポリペプチドに対応するヒトのポリペプチドをコー
ドする完全長のｃＤＮＡの単離を開示している。組み換
え技術で発現された３つのヒトタンパク質はそれぞれ単
独で、あるいは組み合わせて軟骨形成を誘導できると著
者らは報告している。骨形成の証拠は報告されていな
い。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の一つの目的
は、同種移植および異種移植で骨誘導可能な骨形成タン
パク質が分散して含まれている基質からなる骨形成装置
を与えることである。別の目的は、哺乳動物骨組織から
骨形成タンパク質を単離する再現性のある方法を与える
ことである。また別の目的は、骨形成を担うタンパク質
の解析を行うことである。さらに別の目的は、ヒトを含
む哺乳動物中で軟骨内の骨形成を誘導可能な天然あるい
は組み換え骨形成タンパク質をコードする遺伝子および
組みえＤＮＡ秘術を用いてそれらを産生させる方法を与
えることである。また別の目的は、軟骨形成を誘導する
方法を与えることである。
【００１４】本発明の上述の、またそれ以外の目的およ
び特徴は、以下の説明、図、および請求の範囲から明ら
かとなるであろう。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、哺乳動物体に
移植されるとその部位で軟骨内骨形成および骨髄分化の
完全な分化カスケードが誘導される骨形成デバイスに関
するものである。ここで開示するように適切に修飾する
と、該デバイスは軟骨形成の誘導にも使用することがで
きる。このデバイスはここではマトリックスと呼ぶ担体
基質からなり、該マトリックスは以下に述べるような性
質を有しており、該マトリックスには天然材料から精製
された元来の形態の骨形成タンパク質、あるいは組み換
えＤＮＡ技術で産生したもののどちらかが分散して含ま
れている。
【００１６】これらの開発の鍵は、哺乳動物の骨から活
性のある、実質的に純粋な骨形成タンパク質を回収する
方法、およびそれに続く天然の骨形成タンパク質のアミ
ノ酸配列および構造データの解析の発展が成功すること
である。該タンパク質は１ｍｇの移植片あたり約０．８
〜１．０ｎｇの２分の１最大値骨形成活性を有する。該
タンパク質は二量体であると考えられている。それは解
離すると活性がなくなるようである。該タンパク質の複
数の種の多様な組み合わせがへテロ二量体あるいはホモ
二量体として存在しているらしい。
【００１７】本発明は、骨から抽出された、または組み
換えＤＮＡ技術で産生された天然の型の骨形成タンパク
質を与える。実質的に純粋な骨形成タンパク質として
は、どのような由来かには関わらず、多様なグリコシル
化パターン、多様なＮ末端を有する型、アミノ酸配列の
相同性がある領域を持つ関連したタンパク質のファミリ
ー、および天然のタンパク質の活性を持つ短縮型あるい
は変異型タンパク質が含まれる。天然の材料から得た骨
形成タンパク質はその元来の型では、グリコシル化され
ており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定されたところでは約３
０ｋＤの見かけの分子量を持つ。
【００１８】還元されると、その３０ｋＤのタンパク質
は約１６ｋＤおよび１８ｋＤの見かけの分子量を持つ二
つのグリコシル化されたポリペプチド鎖が生じる。還元
された状態では、３０ｋＤタンパク質は検出可能な骨形
成活性を示さない。脱グリコシル化されたタンパク質は
骨形成活性を持っており、約２７ｋＤの見かけの分子量
を持っている。還元されると、２７ｋＤタンパク質は約
１４ｋＤと１６ｋＤの見かけの分子量を持つ二つの脱グ
リコシル化されたポリペプチドを生じる。完全な分子お
よび消化断片の解析から、天然の３０ｋＤ骨形成タンパ
ク質は以下のアミノ酸配列を含むことが示唆された（疑
問符は決定されていない残基を示す）： （１）S-F-D-A-Y-Y-C-S-G-A-C-Q-F-P-M-P-K; （２）S-L-K-P-S-N-Y-A-T-I-Q-S-I-V; （３）A-C-C-V-P-T-E-L-S-A-I-S-M-L-Y-L-D-E-N-E-K; (4)M-S-S-L-S-I-L-F-F-D-E-N-K; （５）S-Q-E-L-Y-V-D-F-Q-R; （６）F-L-H-C-Q-F-A-E-R-N-S; （７）T-V-G-Q-L-N-E-Q-S-S-E-P-N-I-Y; （８）L-Y-D-P-M-V-V; （９）V-G-V-V-P-G-I-P-E-P-C-C-V-P-E; （１０）V-D-F-A-D-I-G; （１１）V-P-K-P-C-C-A-P-T; （１２）I-N-I-A-N-Y-L; （１３）D-N-H-V-L-T-M-F-P-I-A-I-N; （１４）D-E-Q-T-L-K-K-A-R-R-K-Q-W-I-?-P; （１５）D-I-G-?-S-E-W-I-I-?-P; （１６）S-I-V-R-A-V-G-V-P-G-I-P-E-P-?-?-V; （１７）D-?-I-V-A-P-P-Q-Y-H-A-F-Y; （１８）D-E-N-K-N-V-V-L-K-V-Y-P-N-M-T-V-E; （１９）S-Q-T-L-Q-F-D-E-Q-T-L-K-?-A-R-?-K-Q; （２０）D-E-Q-T-L-K-K-A-R-R-K-Q-W-I-E-P-R-N-?-A-R-
R-Y-L; （２１）A-R-R-K-Q-W-I-E-P-R-N-?-A-?-R-Y-?-?-V-D; （２２）R-?-Q-W-I-E-P-?-N-?-A-?-?-Y-L-K-V-D-?-A-?-
?-G． 実質的に純粋な形で該タンパク質を入手できること、そ
のアミノ酸配列などの構造的な特徴を知ることにより、
骨形成タンパク質をコードする元の遺伝子の同定、クロ
ーニング、および発現が可能となる。翻訳後に適切に修
飾し、適当なマトリックスに混合し、ここで述べるよう
に移植すると、これらのタンパク質は軟骨および軟骨内
骨の形成を誘導することができる。
【００１９】部分的な配列データを基にしてここでデザ
インしたコンセンサスＤＮＡ配列、および文献で開示さ
れている調節タンパク質との間に見いだされた相同性
は、ゲノムライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーか
ら骨形成タンパク質をコードする遺伝子を抽出するため
のプローブとして有用である。
【００２０】コンセンサス配列の一つはこれまで同定さ
れていなかったゲノムＤＮＡ配列の単離に使用され、そ
れらの一部は連結されると軟骨内骨形成を誘導できる領
域を持つタンパク質をコードしているものであった。Ｏ
Ｐ１と呼ぶこのタンパク質は以下に示す配列を持つ活性
領域を有する。
【００２１】
【化６】
【００２２】より長い活性配列は以下のものである。
【００２３】
【化７】
【００２４】第１図はＯＰ１のゲノムＤＮＡ配列を示し
ている。
【００２５】上記プローブはさらに、上述のＰＣＴ／０
８７／０１５３７において同定されたいくつかのＤＮＡ
配列（文献中、ＢＭＰ−２クラスＩＩおよびＢＭＰ−３
と呼ばれている）を回収した。本発明者らは、正しい構
造をとらせると真の骨形成活性を有する、すなわち、哺
乳動物に正しく移植した場合に軟骨内骨形成に至る完全
なカスケードを誘導するタンパク質群（ＣＢＭＰ−２
ａ、ＣＢＭＰ−２ｂ、ＣＢＭＰ−３）を、上記ＤＮＡ配
列ならびに上記出版物に記載されているＢＭＰ−２クラ
スＩのある一部分がコードしていることを発見した。こ
れらの配列を以下に示す：
【００２６】
【化８】
【００２７】以上のように、本開示の観点から、熟練し
た遺伝学技術者はｃＤＮＡライブラリーあるいはゲノム
ライブラリーから適当なアミノ酸配列をコードする遺伝
子を単離し、それらを原核生物および真核生物を含む様
々な型の宿主細胞中で発現させ、ヒトを含む哺乳動物中
で骨形成を誘導可能な活性タンパク質を大量に産生させ
ることができる。
【００２８】実質的に純粋な骨形成タンパク質（すなわ
ち、骨誘導活性を持たないタンパク質の混入がない、天
然由来のタンパク質あるいは組み換えタンパク質）は、
適当な輸送系あるいは補助系（マトリックス）と組み合
わせて臨床での応用に有用である。マトリックスは粒子
状物質あるいは多孔性物質から作られる。孔は前躯体細
胞の移動およびそれに続く分化と増殖が可能な大きさで
なければならない。粒子のサイズは７０−８５０μｍ、
望ましくは７０−４２０μｍの範囲内でなければならな
い。該マトリックスは粒子性物質を密にパッキングして
骨の欠損をつなぐような形にすること、あるいは生体適
合性（炎症を起こさない）であってｉｎｖｉｖｏで生物
分解可能な物質を望みの形に構築して“一時的補助材”
および移動性前躯体細胞の補充のためのマトリックスと
して、およびそそれに続く固定化と増殖のための基盤と
して働くように、作成される。目下のところ推奨される
担体としては、顆粒状、鉱物質除去され、グアニジン抽
出された、種特異的（同種）骨組織、および穎粒状で脱
グリコシル化され（あるいはＨＦ処理した）、タンパク
抽出され、鉱物質除去された異種骨組織が含まれる。任
意に、このような異種骨組織顆粒状マトリックスはトリ
プシンなどのプロテアーゼで処理してもよい。そのほか
の有用なマトリックス物質としては、コラーゲン、グリ
コリン酸と乳酸のホモポリマーおよびコポリマー、ヒド
ロキシアパタイト、リン酸３カルシウム、およびそのほ
かのカルシウムリン酸塩が含まれる。
【００２９】ここで可能となり開示された骨形成タンパ
ク質および移植可能な骨形成デバイスにより、例えば後
天的および先天的脳顔面頭蓋およびその他の骨あるいは
歯の異常を矯正するための、予想可能な最適の骨形成を
外科医が得られるようになる（グロワッキ（Glowacki）
ほか、（1981）Lancet 1 : 959-963）動物実験で示され
たように、該デバイスは不連続骨折において、および骨
形成が必要とされる歯周での応用を含むそのほかの臨床
的応用においての局所的な軟骨内骨形成を誘導するため
に使用される。もう一つの潜在的な臨床的応用は、例え
ば骨関節炎の治療での、軟骨修復である。
【００３０】
【発明の実施の形態】哺乳動物の骨由来の粗抽出液中に
存在する骨形成タンパク質の単離を可能にする精製法が
開発された。各分離過程は既知の分離技術から構成され
ているが、尿素などの変性剤の存在下でヘパリンおよび
ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）に対するタンパク質の
親和性を利用した一連の分離の組み合わせが粗抽出液か
ら純粋なタンパク質を単離するための鍵であることが発
見された。これらの重要な分離過程は疎水性溶媒、ゲル
排除クロマトグラフィー、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥから
の溶出と組合わされる。
【００３１】この単離法により、あらゆる哺乳動物種か
ら、十分量の新鮮な骨が入手可能であれば、実質的に純
粋な骨形成タンパク質の大量産生か可能となる。新鮮な
ウシの骨が入手可能であることと合わせて、この方法の
実験に基づいた発展により、実質的に純粋なウシ骨形成
タンパク質（ＢＯＰ）の単離が可能となった．ＢＯＰ
は、以下に述べるように重要なものとして解析されて来
たネコ、ウサギ、ラット中で軟骨および最終的には軟骨
内骨の成長を誘導する能力が研究されて来た；不均質な
骨抽出物中に存在する未知のタンパク質（群）によるも
のだとそれまで考えられてきた骨形成の完全な分化カス
ケードをＢＯＰが誘導できることが示された；また、Ｂ
ＯＰは、不連続骨折を含む整形外科系欠陥における軟骨
内骨の形成を誘導するために用いられる。天然の形で
は、ＢＯＰはグリコシル化されている二量体タンパク質
である。しかし、ＢＯＰは、脱グリコシル化された形で
活性を持つ。部分的に塩基配列決定が行われていた。そ
の一次構造はここで示すアミノ酸配列を含んでいる。
【００３２】ＢＯＰのアミノ酸配列の解明により、ペプ
チド断片をコードする核酸プローブのプールの構築が可
能となる。また、アミノ酸配列データ、配列に関して推
定したコドン、および既知の遺伝子との部分的相同性の
観察を基にしてここで述べるようにデザインしたコンセ
ンサス核酸配列もプローブとして使用された。プローブ
は、以下で述べるように標準的なハイブリダイゼーショ
ン技術を用いて活性のある哺乳動物骨形成タンパク質
（ＯＰ）をコードしている、通常生じるｃＤＮＡの単離
に使用することもできる。そのｍＲＮＡは骨形成タンパ
ク質を合成することが知られている多様な種の細胞の細
胞質中に存在している。核ｍＲＮＡを有する有用な細胞
としては、例えば、骨あるいは骨肉腫由来の骨芽細胞、
肥大性軟骨細胞、および幹細胞がある。該ｍＲＮＡはｃ
ＲＮＡライブラリーの産生に使用可能である。あるい
は、骨形成タンパク質をコードする適切なＤＮＡは、多
様な哺乳動物種由来のクローン化されたゲノムＤＮＡラ
イブラリーから回収することができる。
【００３３】これらの発見により、単独あるいは組み合
わせることによって真の軟骨内骨を産生可能な完全に新
しく、非天然のタンパク質構造物をコードするＤＮＡの
構築が可能となる。また、それらにより、天然の材料か
ら回収したｃＤＮＡ、あるいは市販の自動化された装置
を用いてここで開示する技術によって合成したｃＤＮＡ
から、元来の物質、短縮化された型、変異タンパク質、
類似体、融合タンパク質、および多様なそのほかの改変
体および構造物を発現させることができる。これらのＤ
ＮＡは、確立されている組み換えＤＮＡ技術を用いて原
核生物あるいは真核生物宿主細胞中で発現させることが
可能であり、生物活性が必要ならば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
で酸化して再度形作らせることができる。
【００３４】骨からタンパク質を得るための単離方法、
骨形成タンパク質遺伝子の回収、組み換えタンパク質の
デザインおよび産生、基剤の性質、およびここで請求す
る目的物質の性質、用途、作成法および使用法に関する
そのほかの重要な局面は、本発明の多様な局面を実施す
るために現在知られている最適の方法を示している以下
の記述からさらに理解されるであろう。
【００３５】Ａ ＢＯＰの精製 Ａ１．脱鉱物化したウシ骨基質の調製 脱鉱物化したウシ骨基質は、すでに出版されている方法
によって調製した（サンパス（Sampath）とレディ（Red
di）(1983）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 :6591-659
5）。ウシ骨幹性骨（１〜１０日令）を地域の屠殺場か
ら入手し、新鮮なうちに使用する。骨から筋肉および脂
肪を剥がし、骨膜を取り除き、冷水圧によって髄を除
き、冷たい純粋エタノールに短時間さらし、−２０℃で
保存する。次にそれらを乾燥させ、大きな挽き器の中で
砕き、粉砕することによって顆粒化した。液体窒素を用
いることにより、過熱しないように注意する。粉砕した
骨を７０〜４２０μｍの間の粒子サイズまで粉砕し、３
倍体積のクロロホルム／エタノール（３：１）を用いて
約２時間の洗浄を２回行うことにより、脂肪を除く。顆
粒状の骨を次に１倍体積の純粋エタノールで洗浄し、１
倍体積の無水エーテル上で乾燥させた。脱脂肪化骨パウ
ダー（別の方法としては、アメリカン・バイオマテリア
ルズ社からウシ皮質骨パウダー（７５〜４２５μｍ）を
入手する）を次に、１０倍体積の０．５Ｎ ＨＣｌを用
いて４℃で４０分間、４回鉱物質除去する。最後に、多
量の水で鉱物質除去した骨パウダーを洗浄して中和させ
る。
【００３６】Ａ２．分離抽出とエタノール沈澱 上述のように調製した、脱鉱物化骨基質を、５倍体積の
プロテアーゼ阻害剤（５ｍＭ ベンザミジン、４４ｍＭ
６−アミノヘキサノン酸、４．３ｍＭ Ｎ−エチルマ
レイミド、０．４４ｍＭ フェニルメチルスルホニルフ
ルオライド）を含む４Ｍ グアニジン−ＨＣｌ（Ｇｕ−
ＨＣｌ）、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０を用
いて、４℃で１６時間、分離用の抽出を行う。その懸濁
液を濾過する。上清を集め、限外濾過ハローファイバー
メンブレン（アミコン社、ＹＭ−１０）を用いて１体積
まで濃縮する。濃縮液を遠心し（８，０００×ｇで１０
分間、４℃）、上清のエタノール沈澱を行う。１体積の
濃縮液に５倍体積の冷（−７０℃）純粋エタノール（１
００％）を加え、−７０℃で１６時間保持する。沈澱物
を１０，０００×ｇで１０分間４℃で遠心して回収す
る。得られたペレットを４１の８５％冷エタノールに再
懸濁し、−７０℃で６０分間インキュベートし、再度遠
心する。沈澱物をもう一度８５％冷エタノールに懸濁し
（２１）、−７０℃で６０分間インキュベートし、遠心
する。次に、沈澱物を凍結乾燥する。
【００３７】Ａ３．ヘパリン−セファロース クロマト
グラフィーＩ エタノール沈澱し、凍結乾燥して抽出した粗タンパク質
を２５体積の０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む６Ｍ 尿素、
５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．０（緩衝液Ａ）に
溶解し、８，０００×ｇで１０分間遠心して清浄にし
た。へパリン−セファロースは緩衝液Ａを用いてカラム
平衡化を行う。タンパク質をカラムの上に載せ、３カラ
ム体積の開始緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む援衝
液Ａ）で洗浄した後に、タンパク質を０．５Ｍ ＮａＣ
ｌを含む緩衝液Ａで溶出する。溶出液の吸光度を連続的
に２８０ｎｍで追跡する。０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出さ
れたタンパク質のプール（約１カラム体積）を集め、４
℃で保存する。
【００３８】第８Ａ図で示すように、ほとんどのタンパ
ク質（約９５％）は結合せずに残る。約５％のタンパク
質がカラムに結合する。結合しなかった画分は、全体と
してバイオアッセイを行っても、あるいはセファロース
ＣＬ−６Ｂで部分精製した後も骨誘導活性を示さない。
【００３９】Ａ４．ヒドロキシアパタイト−ウルトロゲ
ルクロマトグラフィー へパリン−セファロースから０．５Ｍ ＮａＣｌを含む
緩衝液Ａで溶出したタンパク質の全体積を、０．５Ｍ
ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで平衡化したヒドロキシアパタ
イト−ウルトロゲル（ＨＡＰ−ウルトロゲル）（ＬＫＢ
イシスツルメント社）のカラムに直接アプライする。Ｈ
ＡＰ−ウルトロゲルは平衡化に先立ち、５００ｍＭ リ
ン酸ナトリウムを含む緩衝液Ａで処理する。吸着されな
いタンパク質を未結合画分として集め、カラムを３体積
の０．５Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで洗浄する。続い
てカラムを１００ｍＭ リン酸ナトリウムを含む緩衝液
Ａで溶出させた（第８Ｂ図）。
【００４０】溶出する化合物は、アルカリホスファター
ゼ活性および組織学的に調べると、軟骨内骨誘導を行え
る。生物学的に活性のあるタンパク質は６Ｍ 尿素およ
び０．５Ｍ ＮａＣｌの存在下でＨＡＰに結合するの
で、該タンパク質は骨鉱物質に親和性を有し、リン酸イ
オンによってのみ置き換えられる。
【００４１】Ａ５．セファクリルＳ−３００ゲル濾過ク
ロマトグラフィー セファクリルＳ−３００ＨＲ（高分解能、５ｃｍ×１０
０ｃｍカラム）はファルマシア社から入手し、４Ｍ グ
アニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ
７．０で平衡化する。ＨＡ−ウルトロゲルから結合した
タンパク質画分を濃縮し、尿素から４Ｍ グアニジン−
ＨＣｌ、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０へ、ア
ミコン限外濾過ＹＭ−１０メンブレンを介して交換す
る。次に、この溶液をシュライヒャー・アンド・シュエ
ル社ＣＥＮＴＲＥＸ使い捨てマイクロフィルターで濾過
する。約４００ｍｇのタンパク質を含む約１５ｍｌの試
料アリコートをカラムに載せ、４Ｍ グアニジン−ＨＣ
ｌ、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０で、流速３
ｍｌ／ｍｉｎで溶出する；１２ｍｌの画分を８時間以上
集め、タンパク質濃度をＡ280ｎｍで測定する（第８Ｃ
図）。各画分のアリコートを骨形成に関してバイオアッ
セイを行う。骨形成を示し、見かけ分子量が３５ｋＤ以
下として泳動されるこれらの画分をプールし、ＹＭ−１
０メンブレンを持つアミコン限外濾過システムで濃縮す
る。
【００４２】Ａ６．ヘパリン−セファロースクロマトグ
ラフィー−ＩＩ ゲル濾過クロマトグラフィーから得られた、プールした
骨誘導画分を蒸留水（ｄＨ2Ｏ）に対して、次に０．１
Ｍ ＮａＣｌを含む６Ｍ 尿素、５０ｍＭ トリス−Ｈ
Ｃｌ，ｐＨ７．０（緩衝液Ａ）に対して十分に透析す
る。透析後の溶液を遠心で清浄する。試料をヘパリン−
セファロースカラム（試料緩衝液で平衡化したもの）に
アプライする。３カラム体積の開始緩衝液で洗浄した
後、カラムを０．１５Ｍ ＮａＣｌ、および０．５Ｍ
ＮａＣｌを含む綬衝液Ｂで連続的に展開する（第８Ｄ
図）。０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出されたタンパク質を集
め、蒸留水に対して十分に透析した。次に、３０％アセ
トニトリル、０．１％ＴＦＡに対して４℃で透折を行っ
た。
【００４３】Ａ７．逆相ＨＰＬＣ タンパク質をＣ−１８バイダック（Vydac）シリカをベ
ースとしたＨＰＬＣカラムクロマトグラフィー（粒子サ
イズ５μｍ；孔サイズ３００Ａ）によってさらに精製し
た。へパリン−セファロース−ＩＩクロマトグラフで得
られた骨誘導画分をカラムに載せ、０．１％ＴＦＡ、１
０％アセトニトリルで５分間洗浄する。第１４図に示す
ように、結合したタンパク質を１０−３０％アセトニト
リルの直線勾配で１５分間にわたり、３０−５０％アセ
トニトリルで６０分間にわたり、および５０−７０％ア
セトニトリルで１０分間にわたり、２２℃で流速１．５
ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、１．４ｍｌ試料をポリカーボネ
ートチューブに集める。タンパク質をＡ214ｎｍでの吸
光度で追跡する。カラム画分を骨誘導活性の存在、およ
びコンカナバリンＡでブロット可能なタンパク質の存在
に関して試験する。これらの画分をプールし、オートラ
ジオグラフィー、コンカナバリンＡブロッティング、お
よびクマジーブルー染色によって３０ｋＤタンパク質の
存在を生化学的に解析する。次にそれらをｉｎ ｖｉｖ
ｏ骨形成活性に関してアッセイを行う。３０ｋＤタンパ
ク質が存在しないと生物学的活性は見いだされない。
【００４４】Ａ８．ゲル溶出 グリコシル化された、あるいは脱グリコシル化されたタ
ンパク質をさらに解析するためにＳＤＳゲル（厚さ０．
５ｍｍ）から溶出する。125Ｉで標識した３０ｋＤタン
パク質を、収量を追跡するために各調製液に定常的に添
加する。表１は、試した多様な溶出緩衝液と125Ｉで標
識したタンパク質の収量を示している。
【００４５】
【表１】
【００４６】表２は３０ｋＤあるいは脱グリコシル化さ
れた２７ｋＤゲル結合タンパク質の単離に使用される過
程を列挙したものである。標準的な方法では、トリス−
ＨＣｌ緩衝液中に０．５％トリトンｘ １００を含む４
Ｍ グアニジン−ＨＣｌ、あるいは０．１％ＳＤＳを含
むトリス−ＨＣｌ緩衝液を用いた拡散溶出を用い、以下
の部分で述べるようにｉｎ ｖｉｖｏ骨形成活性を示す
ためにゲルの２７あるいは３０ｋＤ領域からのタンパク
質の９５％以上の溶出を行った。
【００４７】
【表２】
【００４８】ゲル溶出法による標識した３０ｋＤタンパ
ク質の総収量は載せた試料の５０〜６０％である。損失
の殆どは、タンパク質の重合および／またはスメアによ
る電気泳動過程で起きている。
【００４９】収量は、骨１ｋｇあたり０．５から１．０
μｇの実質的に純粋な骨形成タンパク質が得られるもの
である。
【００５０】Ａ９．１６ｋＤ及び１８ｋＤ種の単離 表３は、サブユニットの調製に関する方法を要約したも
のである。約１０μｇのゲルから溶出した３０ｋＤタン
パク質（第１９図）をカルボキシメチル化し、ＳＤＳゲ
ル上で電気泳動する。試料は、収量の追跡と、ゲルから
１６ｋＤおよび１８ｋＤ領域を切り出すためのインディ
ケーターとして用いるために、125Ｉ標識を含んでい
る。第２１図はゲルから精製した１６ｋＤおよび１８ｋ
Ｄタンパク質のクマジーブルー染色したゲルを示してい
る。
【００５１】
【表３】
【００５２】Ｂ．ＢＯＰの生物学的解析 Ｂ１．ゲルスライス ゲルスライス実験により、単離された３０ｋＤタンパク
質が骨形成活性を但うタンパク質であることが確認され
る。
【００５３】精製の最後の過程由来のゲルをスライスす
る。各画分のタンパク質を、０．１％ ＳＤＳを含む１
５ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、あるいは４Ｍ
グアニジン−ＨＣｌ、０．５％ 非イオン性界面活性剤
（トリトンｘ−１００）、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌを
含む緩衝液中で抽出する。抽出したタンパク質を脱塩
し、濃縮し、軟骨内骨形成活性に関してアッセイを行
う。結果を第２０図に示す。この図から、骨形成活性の
大部分がゲルの３０ｋＤ領域のタンパク質によるものだ
ということが明らかである。高分子量領域中の活性は明
らかにタンパク質の重合によるものである。これらのタ
ンパク質重合体は、還元されると上述の１６ｋＤおよび
１８ｋＤ種を与える。
【００５４】Ｂ２．Ｃｏｎ−Ａ−セファロースクロマト
グラフィー ３０ｋＤタンパク質を含む試料を０．１％ＳＤＳ、５０
ｍＭ トリス−ＨＣｌを用いて可溶化し、同じ緩衝液で
平衡化したコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ−Ａ）のカラムに
アプライする。結合した物質を、０．５ｍＭ アルファ
ーメチルマンノシドを含むＳＤＳトリス−ＨＣｌ緩衝液
で溶出する。結合画分および非結合画分の双方の逆相ク
ロマトグラフィーを行った後に、Ｃｏｎ−Ａ結合性物質
は移植すると顕著な骨形成を引き起こす。結合性物質の
さらなる解析から、Ｃｏｎ−Ａでブロット可能な３０ｋ
Ｄタンパク質が示された。さらに、グリコシル化された
３０ｋＤタンパク質は骨形成活性を担っている。
【００５５】Ｂ３．ゲル浸透クロマトグラフィー グアニジン−ＨＣｌ中のＴＳＫ−３０００／２０００の
どちらかを用いてゲル浸透クロマトグラフィーによっ
て、Ｃ−１８クロマトグラフィーで得られた高比活性画
分の分離を行った（第１５図）。その結果、骨誘導活性
のピークはクマジーブルー染色で実質的に純粋な３０ｋ
Ｄタンパク質を含む画分に溶出することが示されてい
る。この画分をヨウ素化し、オートラジオグラフィーに
かけると３０ｋＤの強いバンドがヨウ素化されているタ
ンパク質の９０％を占めている。該画分はｉｎ ｖｉｖ
ｏで、移植当たり５０から１００ｎｇの投与量で骨形成
を誘導する。
【００５６】Ｂ４ 生物学的活性のための構造的な必要
条件 Ｂ４−１ 消化後の活性 ３０ｋＤ骨形成タンパク質の骨誘導における役割は明確
に確立されたが、タンパク質分解産物の解析から我々
は、ｉｎ ｖｉｖｏでの活性に必要な最小構造を探し始
めた。切断実験の結果から、ペプシンあるいはＣＮＢｒ
では活性が完全になくなる。
【００５７】生物学的活性に必要なペプシン消化産物を
単離し、同定するための実験が行われる。ペプシン消化
に用いられる試料は２０％〜３０％の純度であった。用
いた緩衝液は、０．１％ＴＦＡ水溶液である。酵素の基
質に対する割合は、１：１０である。コントロール試料
は酵素を加えないで作製した。分解混合液は室温で１６
時間インキュベートする。次に、分解産物をゲル浸透ク
ロマトグラフィーを用いて４Ｍ グアニジン−ＨＣｌ中
で分離され、その画分をｉｎ ｖｉｖｏアッセイのため
に調製する。その結果、ペプシン消化産物のゲル浸透ク
ロマトグラフィー由来の活性画分は８ｋＤ〜１０ｋＤの
範囲の見かけの分子量を有するペプチドに対応すること
が示されている。
【００５８】Ｂ４−２ グリコシル化されていないタン
パク質は活性を持つ 骨形成活性に関しての炭水化物部分の重要性を理解する
ために、３０ｋＤタンパク質をＨＦを用いて科学的に脱
グリコシル化させた（以下参照）。炭水化物がないこと
を確実にするためにＣｏｎＡブロットによる反応産物の
アリコートを解析した後、その物質のｉｎ ｖｉｖｏで
の活性をアッセイした。そのバイオアッセイは陽性であ
り（すなわち、第２３Ｃ図で示されているように、組織
学的な試験によって決定されたように、脱グリコシル化
されているタンパク質は骨形成反応を引き起こす）、Ｈ
Ｆにさらすことによりタンパク質の生物学的機能は破壊
されず、したがってＯＰ投与量は生物学的活性に炭水化
物を必要としないことが示された。さらに、脱グリコシ
ル化されたタンパク質の比活性は、グリコシル化されて
いる天然のタンパク質とほぼ同じである。
【００５９】Ｂ５．ＢＯＰの比活性 １）移植物のカルシウム含量を基にした２分の１最大骨
誘導活性を決定するため；２）ケルスキャニング法を用
いナノグラムレベルでタンパク質を見積もるため；およ
び３）ゲルから溶出した３０ｋＤ ＢＯＰの２分の１最
大値骨誘導活性にあたる投与量を確立するために、実験
が行われた。その結果、ゲルから溶出した実験的に純粋
な３０ｋＤ骨形成タンパク質は移植当たり５ｎｇ以下で
骨を誘導し、移植あたり２０ｎｇ（約２５ｍｇ）で２分
の１最大値骨分化活性を示すことが明らかになった。精
製データから、骨形成タンパク質は、ウシ骨からタンパ
ク質１ｍｇあたり４７．７５０骨形成ユニットであった
最後のゲル溶出過程後に、３６７，３０７倍まで精製さ
れたことが示唆されている。
【００６０】Ｂ５（Ａ） ２分の１最大骨分化活性 骨誘導活性は、アルカリホスファターゼの比活性、およ
び１２日目の移植物中のカルシウム含量によって生化学
的に決定した。アルカリホスファターゼの比活性の増加
は、骨形成の開始を示唆する。一方、カルシウム含量
は、移植物中で形成された骨の量に比例する。したがっ
て、骨形成は、ラットの１２日目の移植物のカルシウム
含量を決定することによって計算され、骨形成ユニット
として表され、これはラットの鉱物質除去した骨基質と
比較して２分１の最大値骨誘導活性を示す量を表す。元
来の鉱物質除去したラット骨基質によって示される骨誘
導は、比較する際の最大骨分化活性であると考えられ
る。
【００６１】Ｂ５（ｂ） ゲルスキャニング法を用いる
タンパク質の見積もり 標準曲線は、既知の量の標準タンパク質、ウシ血清アル
ブミンを用いた。該タンパク質の濃度をさまざまに変え
て（５０〜３００ｎｇ）１５％ ＳＤＳゲルに載せ、電
気泳動し、クマジーで染色し、脱染する。ゲルは５８０
ｎｍのゲルスキャナーを用いて、あらかじめ決定された
装置のところでスキャンされた。タンパク質のバンドに
よって覆われた領域は計算され、タンパク質の濃度に対
して標準曲線が構築される。未知のタンパク質濃度の試
料を、ＢＳＡを標準として電気泳動する。未知の試料を
含むレーンがスキャンされ、タンパク質の濃度が曲線の
下の領域から決定される。
【００６２】Ｂ５（ｃ） ゲル溶出および比活性 高度に精製され活性のあるＣ−１８画分のアリコートを
ＳＤＳゲルに流し、第２０図に示されているように分子
量によってスライスする。タンパク質をスライスから
０．５％ トリトンｘ−１００を含む４Ｍ グアニジン
−ＨＣｌ中に溶出し、脱塩し、濃縮し、カルシウム含量
によって決定されるように軟骨内骨形成活性に関してア
ッセイする。Ｃ18の高度に活性なフラクションおよび実
質的に純粋な３０ｋＤの骨形成タンパク質からのゲル溶
出物を、２分の１の最大骨誘導活性を決定するために濃
度を変えて移植する。
【００６３】第２０図は２８−３４ｋＤに溶出されるタ
ンパク質に依存する骨誘導活性を示している。ゲル溶出
過程後の活性の回復はカルシウム含量によって決定され
た。第２５Ａ図および第２５Ｂ図は、ゲル溶出の前後に
カルシウム含量で見積もって、３０ｋＤタンパク質の多
様な濃度に対する骨形成活性を示している。ゲル溶出前
は３０ｋＤタンパク質の２分の１最大値活性が６９ｎｇ
毎２５ｍｇ移植で、溶出後は２１ｎｇ毎２５ｍｇ移植あ
ることを示唆している。表４は、精製の各過程における
骨形成タンパク質の収量、総比活性、および精製倍率を
示している。約５００μｇのへパリン−セファロースＩ
画分、１３０−１５０μｇのＨＡ−ウルトロゲル画分、
１０−１２μｇのゲル濾過画分、４−５μｇのへパリン
−セファロースＩＩ画分、０．４−０．５μｇのＣ−１
８高度精製画分、および、２０−２５ｎｇのゲル溶出さ
れた実質的な精製画分が２５ｍｇの移植当たりの２分の
１最大値活性を示す明確な骨形成に必要とされる。以上
のように、ｍｇ移植当たり０．８−１．０ｎｇの精製骨
形成タンパク質がｉｎ ｖｉｖｏで２分の１最大値骨分
化活性を示すのに必要である。
【００６４】
【表４】
【００６５】値は４ｋｇのウシ骨基質（８００ｇの鉱物
質除去した基質）から計算している。
【００６６】＊ １ユニットの骨形成活性は、ラットへ
の移植１２日目のカルシウム含量によって決定される、
ラット鉱物質除去骨基質に比較した場合の２分の１最大
値骨分化活性を表している。
【００６７】＃ タンパク質は２８０ｎｍでの吸光度に
よって測定された。
【００６８】＠ タンパク質は既知の標準タンパク質、
ウシ血清アルブミンと比較するケルスキャニング法によ
って測定された。
【００６９】＊＊ ウシ骨のエタノール沈澱したグアニ
ジン抽出は、おそらく内在性の阻害因子の存在のため、
ラットの中では弱い誘導因子である。この沈澱をゲル濾
過にかけ、５０ｋＤ以下のタンパク質を分離し、バイオ
アッセイに用いた。
【００７０】Ｃ．ＢＯＰの化学的解析 Ｃ１．分子量と構造 最後の精製過程後のタンパク質を非還元ＳＤＳポリアク
リルアミドデルで電気泳動を行うことにより、クマジー
プルー染色（第９Ａ図）およびオートラジオグラフィー
の双方で検出されたように約３０ｋＤの位置に拡散した
バンドが見られた。
【００７１】ＢＯＰの解析をさらに広げるために、該タ
ンパク質を還元条件下で調べた。第９図はジチオスレイ
トール存在下でのＢＯＰのＳＤＳゲルを表す。還元によ
り、３０ｋＤ ＢＯＰはクマジーブルーで染色される二
つの種：１６ｋＤ種および１８ｋＤ種を産生する。還元
により、生物学的活性は失われる。二つの還元されたＢ
ＯＰ種を解析して構造的に関連があるかどうかを決定し
た。二つの種のアミノ酸構造およびペプチドマッピング
の比較（以下に示す）では、殆ど差異が認められず、天
然のタンパク質は顕著な相同性を有する二つの鎖からな
っていることが示唆された。
【００７２】Ｃ２．炭水化物の存在 ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびニトロセルロース紙への転移の
後、ＣＯＮ−Ａブロッティングによって炭水化物の存在
を調べた。結果から、３０ｋＤタンパク質はＣｏｎ−Ａ
によって対して高い親和性を持っており、タンパク質が
グタコシル化されていることが示唆された（第１０Ａ
図）。さらに、Ｃｏｎ−Ａブロットの結果から、３０ｋ
Ｄ領域中にサブ構造がある証拠が示され、グリニシル化
の程度が多様であるための不均質性が示される。還元後
（第１０Ｂ図）、Ｃｏｎ−Ａブロットにより二つの主要
な構成物質が１６ｋＤと１８ｋＤにある証拠が示され
た。さらに、還元後は３０ｋＤ領域にはグリコシル化さ
れている物質はなかった。
【００７３】炭水化物の存在を確実にし、結合している
炭水化物の量を見積もるために、３０ｋＤタンパク質を
Ｎ−グリカナーゼ、広い特異性を持つ脱グリコシル化酵
素で処理した。125Ｉ標識した３０ｋＤタンパク質を該
酵素と共にＳＤＳの存在下で３７℃で２４時間インキュ
ベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから観察されたように、
処理した試料ははく２７ｋＤの位置に主要な種として見
られる（第１１Ａ図）。還元により、２７ｋＤ種は分子
量が約１４ｋＤ−１６ｋＤである種に還元される（第１
１Ｂ図）。
【００７４】３０ｋＤタンパク質の完全な脱グリコシル
化を確実にするために、フッ化水素（ＨＦ）を用いた炭
水化物の化学的切断法を行った。Ｃ−１８クロマトグラ
フィー過程からプールした活性のある骨形成タンパク質
をＰ2Ｏ5上で真空下でポリプロピレンチーブ内で乾燥さ
せ、新しく蒸留した無水ＨＦ５０μｌを−７０℃で加え
る。チューブの蓋を堅く閉めた後、混合液をアイスバス
中でときどき撹拌しながら１時間０℃においた。乾燥し
た窒素ガスを連続的に吹き付けて、ＨＦを蒸発させる。
チューブをアィスバスから取り出し、残滓をＰ2Ｏ5とＫ
ＯＨペレット上で真空下で乾燥させる。
【００７５】乾燥した後、試料を１００μｌの５０％ア
セトニトリル／０．１％ ＴＦＡに溶解し、ＳＤＳゲル
分析、Ｃｏｎ Ａ結合および生物学的アッセイのために
分注する。分取した試料は、乾燥させ、ＳＤＳゲル分析
およびＣｏｎ Ａブロッティングのための調製では、Ｓ
ＤＳゲルサンプルバッファーに溶解するか、生物学的ア
ッセイのためには、４Ｍ グアニジン−ＨＣｌ，５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０に溶解する。
【００７６】この結果は、ＨＦ処理により試料から完全
に糖鎖が除去されることを示している：ＳＤＳゲル電気
泳動を行いイモビロン膜に転写した後Ｃｏｎ Ａブロッ
ティングを行なうと、この処理をした試料にはＣｏｎ
Ａが結合しないが、一方、未処理の対照は、３０ｋＤの
位置で強く陽性を示す。処理した試料のクマシーゲル
は、未処理の対照に存在する３０ｋＤのバンドの代わり
に２７ｋＤのバンドが存在することを示している。
【００７７】Ｃ３．化学的ならびに酵素的切断 ＣＮＢｒによる切断反応物は、炭水化物と結合した断片
を検出するためにＣｏｎ Ａの結合を用いて分析する。
切断反応は、ＣＮＢｒ存在、非存在下でトリフルオロ酢
酸（ＴＦＡ）を用いて行なう。反応は、３７℃で１８時
間行い、試料は真空乾燥する。この試料を水で洗い、還
元試薬を含むＳＤＳゲルサンプルバッファーに溶解し、
煮て、これをＳＤＳゲルにアプライする。電気泳動後、
タンパクをイモビロン膜に転写し、Ｃｏｎ Ａの結合に
よって視覚化する。低濃度の酸（１％）の中では、ＣＮ
Ｂｒは１６ｋＤと１８ｋＤの分子種の大半を１つの産
物、つまり約１４ｋＤの分子種に分解してしまう。１０
％ ＴＦＡを用いた反応では、１４ｋＤの分子種は、Ｃ
ＮＢｒ存在下、非存在下の両者において観察される。
【００７８】これらの実験において、３０ｋＤタンパク
質の分解産物を検定するために、４種のタンパク質分解
酵素：１）Ｖ−８プロテアーゼ；２）エンドＬｙｓ Ｃ
プロテアーゼ；３）ペプシン；および４）トリプシンが
用いられる。ペプシンを除いて、酵素のための分解バッ
ファーは０．１Ｍ 炭酸アンモニウム，ｐＨ８．３であ
る。ペプシンの反応は、０．１％ ＴＦＡ中で行なう。
分解容量は１００μｌで、酵素と基質の比は、１：１０
である。１２５Ｉ−標識３０ｋＤ骨形成タンパク質を検
出のために添加する。３７℃で１６時間インキュベート
した後、分解混合液を乾燥し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行な
うためにジチオスレイトールを含むゲルサンプルバッフ
ァーに懸濁する。第２４図は、分解産物のＳＤＳゲルの
オートラジオグラフを示している。この結果は、これら
の条件では、トリプシンによる切断のみが１６ＫＤ／１
８ｋＤの分子種を完全に分解し、１２ｋＤ周辺に主な分
子種を生ずることを示している。ペプシンによる分解に
より、より明確な、低分子量の分子種が得られる。しか
し、１６ｋＤ／１８ｋＤＳ断片は、完全には切断されな
かった。Ｖ−８による切断は、１つの優性な分子種を１
６ｋＤに持つ限定分解を示す。
【００７９】Ｃ４．タンパク質の配列決定 アミノ酸配列データを得るために、タンパク質をトリプ
シンあるいはエンドプロティナーゼＡｓｐ−Ｎ（Ｅｎｄ
ｏＡｓｐ−Ｎ）で切断する。還元した３０ｋＤのタンパ
ク質およびカルボキシメチル化したタンパク質（約１０
μｇ）のトリプシンによる分解物は、ＴＦＡ／アセトニ
トリル勾配により、１５０μｌ／分の流速で、Ｃ−８ナ
ロウボアカラム（１３ｃｍ×２．１ｍｍ ＩＤ）を用い
た逆相ＨＰＬＣによって分画した。勾配は、（Ａ）０．
０６％ ＴＦＡ水溶液ならびに（Ｂ）水およびアセトニ
トリル（１：４；ｖ：ｖ）に溶解した０．０４％ ＴＦ
Ａを用いた。方法は、１０％ Ｂを５分間、それに続き
８０％ Ｂまでの直線勾配を７０分間、次に１００ Ｂ
までの直線勾配を１０分間である。ＨＰＬＣプロフィー
ル（第１３Ａ図）中のピークから決定される断片を含む
画分は、配列分析を行なうのに足るだけの単一の成分を
単離するために、同じ条件で少なくとも１回は再クロマ
トグラフィーを行なう。
【００８０】同様に切断された１６ｋＤおよび１８ｋＤ
サブユニットのＨＰＬＣプロフィールは、第１３Ｂ図と
第１３Ｃ図にそれぞれ示されている。これらのペプチド
マップが似ているということは、このサブユニットが同
一であるかまたは密接に関連していることを示唆してい
る。
【００８１】１６ｋＤおよび１８ｋＤのサブユニット
は、ＥｎｄＡｓｐ−Ｎプロテイナーゼによって切断され
る。このタンパク質を、５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩
衝液、ｐＨ７．８中で、０．５μｇのＥｎｄｏＡｓｐ−
Ｎにより３６℃、２０時間処理する。分画の条件は３０
ｋＤ，１６ｋＤおよび１８ｋＤ分解物について既に述べ
た条件と同じである。このプロフィールは第２２Ａ図お
よび第２２Ｂ図に示されている。
【００８２】前述の方法を用いて作られた種々のペプチ
ド断片は、自動アミノ酸配列分析機（１２０Ａオンライ
ンＰＴＨ分析機を付属したアプライド・バイオシステム
４７０Ａ）で分析された。以下の配列データが得られ
た： （１）S-F-D-A-Y-Y-C-S-G-A-C-Q-F-P-M-P-K; (2)S-L-K-P-S-N-Y-A-T-I-Q-S-I-V; （３）A-C-C-V-P-T-E-L-S-A-I-S-M-L-Y-L-D-E-N-E-K; （４）M-S-S-L-S-I-L-F-F-D-E-N-K; （５）S-Q-E-L-Y-V-D-F-Q-R; （６）F-L-H-C-Q-F-A-E-R-N-S; （７）T-V-G-Q-L-N-E-Q-S-S-E-P-N-I-Y; （８）L-Y-D-P-M-V-V; （９）V-G-V-V-P-G-I-P-E-P-C-C-V-P-E; （１０）V-D-F-A-D-I-G; （１１）V-P-K-P-C-C-A-P-T; （１２）I-N-I-A-N-Y-L; （１３）D-N-H-V-L-T-M-F-P-I-A-I-N; （１４）D-E-Q-T-L-K-K-A-R-R-K-Q-W-I-?-P; （１５）D-I-G-?-S-E-W-I-I-?-P; （１６）S-I-V-R-A-V-G-V-P-G-I-P-E-P-?-?-V; （１７）D-?-I-V-A-P-P-Q-Y-H-A-F-Y; （１８）D-E-N-K-N-V-V-L-K-V-Y-P-N-M-T-V-E; （１９）S-Q-T-L-Q-F-D-E-Q-T-L-K-?-A-R-?-K-Q; （２０）D-E-Q-T-L-K-K-A-R-R-K-Q-W-I-E-P-R-N-?-A-R-
R-Y-L; （２１）A-R-R-K-Q-W-I-E-P-R-N-?-A-?-R-Y-?-?-V-D; （２２）R-?-Q-W-I-E-P-?-N-?-A-?-?-Y-L-K-V-D-?-A-?-
?-G Ｃ５．アミノ酸分析 酸化型（３０ｋＤ）および還元型（１６ｋＤと１８ｋ
Ｄ）ＢＯＰの試料はゲル電気泳動し、加水分解および試
料を誘導化するための従来の、市販されている試薬を用
いたアミノ酸分析、ならびにＰｉｃＯ Ｔａｇ（ミリポ
ア社）システムを用いたＨＰＬＣを行なうためにイモビ
ロンに転写した。いくつかのアミノ酸、特にシステイン
およびイソロイシンの残基数にいくらか変動があるもの
の、再現性がみられる。
【００８３】得られた組成データは第５表に示されてい
る。
【００８４】＊ この結果は、ヒスチジンが低濃度で存
在するため取り入れられていない。
【００８５】＊＊ システインは、標準タンパク質の過
ギ酸加水分解から通常得られる割合によって補正した。
【００８６】１６ｋＤおよ１８ｋＤサブユニットから得
られた結果は、これらを合わせると無傷の３０ｋＤタン
パク質から得られた数に良く似ている。グリシンおよび
セリンに対して得られた高い数値は、ゲルから溶出した
結果によくあっている。
【００８７】
【表５】
【００８８】Ｄ．ヒト骨形成タンパク質の精製 ヒト骨は、ボーン・バンク、（マサチューセッツ・ゼネ
ラル・ホスピタル、ボストン、マサチューセッツ州）か
ら入手し、上で開示された方法により細粉化、脱脂、骨
髄の除去および脱塩を行なった。３２０ｇの食塩骨基質
から７０から８０ｇの脱塩された骨基質か得られる。基
質からの拡散による抽出とエタノール沈澱により、１
２．５ｇのグアニジン−ＨＣｌ抽出物が得られる。
【００８９】エタノール沈澱物の３分の１（０．５ｇ）
が、４Ｍ グアニジン−ＨＣ１中でのゲル濾過に用いら
れる。（第１６Ａ図）。１画の濾過当り、約７０−８０
ｇのエタノール沈澱物を用いる。ｉｎ ｖｉｖｏ骨誘導
活性は３０ｋＤの領域にあるタンパク質を含む画分に局
在する。これを保存し、６Ｍ 尿素，０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ緩衝液で平衡化し、直接ＨＡＰカラムにかける；これ
に結合したタンパク質は、１００ｍＭおよび５００ｍＭ
のリン酸を含む同緩衝液を用いて段階的に溶出する（第
１６Ｂ図）。ＨＡＰ結合、非結合画分をバイオアッセイ
したところ、１００ｍＭ リン酸で溶出された画分のみ
がｉｎ ｖｉｖｏでの骨誘導活性を有することが示され
た。ＨＡＰクロマトグラフィーで得られた生物学的に活
性な画分は、低濃度の塩を含む緩衝液を用いたへバリン
−セファロース・アフィニティー・クロマトグラフィー
にかける；結合したタンパク質は０．５Ｍ ＮａＣｌで
溶出する（第１６Ｃ図）。へパリンセファロース画分を
アッセイしたところ、０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出された
画分が骨−誘導活性を有することが示された。次に、こ
の活性画分をＣ−１８逆相クロマトグラフィーにかけた
（第１６Ｄ図）。
【００９０】その後、この活性画分は上述したようにＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥを行い、実質的に純粋なヒト骨形成タン
パク質からなる約３０ｋＤのバンドを与える。
【００９１】Ｅ．無傷の骨形成タンパク質をコードする
遺伝子単離のための生合成されたプローブ Ｅ−１ プローブのデザイン 第２５図に示されている合成されたコンセンサス遺伝子
は、ＴＧＦ−β遺伝子族との相同性から予想されるアミ
ノ酸に基づき、また、ヒトＴＧＦ−βで見つかっている
ヒトコドン利用における偏りを用いて、ハイブリダイゼ
ーション・プローブとしてデザインされた。そして、こ
のデザインされたコンセンサス配列は、ＤＮＡ合成機で
つくられたオリゴヌクレオチドを集合させることからな
る、既存の技術を用いて構築された。
【００９２】ＢＯＰから由来し、エドマン分解により配
列決定されたトリプシン分解ペプチドは、以下の第６表
に示されるように、ショウジョウバエＤＰＰタンパク質
の（遺伝子から推定された）配列、アフリカツメガエル
のＶＧ１タンパク質と高い相同性を示し、またインヒビ
ンおよびＴＧＦ−βとやや低い相同性を示すアミノ酸配
列を与えた。
【００９３】
【表６】
【００９４】＊一致したアミノ酸 骨形成タンパク質のアミノ酸配列を決定する際に（これ
から核酸配列を決定することが出来る）、以下の点を考
慮した： （１）骨形成タンパク質のトリプシン分解断片のエドマ
ン分解によって決められたアミノ酸配列は、それが強い
シグナルを持ち、この遺伝子族のその他のものと整列さ
せたときに相同性あるいは保存的置換を示す限りにおい
て最も上位に置かれる； （２）配列が４種全てのタンパク質と一致する場合、こ
れは合成遺伝子配列に用いられる； （３）ＤＰＰおよびＶｇ１で一致するアミノ酸配列を用
いる； （４）Ｖｇ１あるいはＤＰＰが相違しても、いずれか一
方がインヒビンあるいはＴＣＦ−βと一致する場合、こ
の一致したアミノ酸を選択する； （５）全ての配列が相違する場合は、ＤＰＰの配列を第
一に選択するが、その場合、可能性としては変異を起こ
すことによりＶｇ１配列を作製することも後の計画に含
まれている。
【００９５】これに加え、このコンセンサス配列は、ジ
スルフィド結合および見かけ上の構造的相同性を保つよ
うにデザインされている。
【００９６】ＣＯＰＯという、はじめにデザインされた
合成コンセンサス遺伝子配列のひとつの目的は（第１９
図）、天然の遺伝子を単離するプローブとして用いるた
めのものだった。このため、このＤＮＡは、ヒトコドン
利用の偏りを用いてデザインされた。これに代わるもの
として、従来の技術を用いて、前述の単離法にしたがっ
て産生された骨形成タンパク質の、アミノ酸配列のある
部分をコードするような、一群のヌクレオチド配列から
なるプローブが構築されるかも知れない。こうしたプロ
ーブの集まりを用いることにより、無傷のタンパク質を
コードするＤＮＡを単離することも可能であろう。
【００９７】Ｅ−２ ゲノム・ライブラリーからの、骨
形成タンパク質をコードする遺伝子の検索 ラムダ・ファージ（Ｃｈａｒｏｎ ４Ａ）に組み込まれ
たヒト・ゲノム・ライブラリー（マニアティス−ライブ
ラリー）を、ＣＯＰＯコンセンサス遺伝子をプローブと
して用い、検索した。はじめの検索は、５００，０００
プラークについて行なった（それぞれ５０，０００プラ
ークを１０プレート）。ハイブリダイゼーションシグナ
ルを与える領域をプレートから抜き出し、ファージ粒子
を溶出し、これを再びプレート当り２０００−３０００
プラークの濃度で塗布した。２回目のハイブリダイゼー
ションによりプラークを得、これをもう一度、今度は純
粋なクローンが単離できるように、プレート当り約１０
０プラークの濃度で塗布した。プローブ（ＣＯＰＯ）
は、増幅プラスミドからＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ切断して
得た３００塩基対の断片であり、これは、ファインバー
グ（Feinberg）とフォーゲルシュタイン（Vogelstein）
(1894）Anal. Biochem. 137: 266-267のランダム・プラ
イミング法にしたがって、α３２ ｄＣＴＰを用いて標
識した。プレハイブリダイゼーションは５×ＳＳＰＢ，
１０×デンハルト混合液，０．５％ ＳＤＳ中で５０
℃、１時間行なった。ハイブリダイゼーションは上と同
じ溶液にプローブを加えて一夜行なった。ニトロセルロ
ース膜の洗いは、１×ＳＳＰＥ，０．１％ ＳＤＳ中、
低温で５分を１回行い、次に同溶液中で５０℃、２×３
０分間を２回行なった。この方法を用いて、２４個の陽
性クローンが見いだされた。これまでに全く報告のない
遺伝子を含む２つはＯＰ１、すなわち以下に述べる骨形
成タンパク質−１と称された。そのほかの２つは従来Ｂ
ＭＰ−２ｂまたはＢＭＰ−２クラスＩＩとして知られて
いる遺伝子を、１つは従来ＢＭＰ−３として知られる遺
伝子を単離した（米国特許明細書 第ＰＣＴ ＵＳ８７
／０１５３７号参照）。上記ハイブリダイズ条件は、本
願骨形成蛋白質をコードする遺伝子を単離するのに十分
なストリンジェンシーを有している。従って、本願にお
ける「ハイブリダイゼーション」とは、２４個の陽性ク
ローンを見いだすために用いられた上記に記載の条件の
すべて、またはこれと実質的に同一条件のすべてを満た
すハイブリダイゼーションをいう。
【００９８】ラムダ＃１３ ＤＮＡのサザン・ブロット
分析により、約３ｋｂのＢａｍＨＩ断片がプローブにハ
イブリダイゼーションすることが示された（第１図参
照）。この断片は、分離され、ブルースクリプト・ベク
ター（のＢａｍＨＩサイト）にサブクローニングされ
た。このクローンは、サザンブロットおよびＣＯＰＯプ
ローブへのハイブリダイゼーションによってさらに分析
された。これにより、（約）１ｋｂのＥｃｏＲＩ断片が
このプローブに強くハイブリダイゼーションすることが
示された。この断片は、ブルースクリプト・ベクターの
ＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングされ、配列が決定
された。この配列の分析により、この断片があるタンパ
ク質、すなわち骨形成タンパク質−１（ＯＰ１）のカル
ボキシル末端をコードする事が示された。このタンパク
質は、ＴＧＦ−β族とのアミノ酸の相同性によって同定
された。この比較のために、システインパターンが用い
られ、次に隣接アミノ酸が比較された。コンセンサス・
スプライスシグナルはアミノ酸の相同性が終わったとこ
ろに見つかり、エクソンイントロン境界と名付けられ
た。３つの工クソンが組み合わされて、７個のシステイ
ンを含む機能を有するＴＣＦ−β−様ドメインを与えて
いる。２つのイントロンは、クンケル（Kunkel）の一本
鎖変異法を用いることにより、エクソンをまたいで、プ
ライマーを介してループ・アウトすることにより除去さ
れた。また、最初のシステインの上流に、ＥｃｏＲＩサ
イトと酸切断のためのＡｓｐ−Ｐｒｏ連結部位を導入
し、３’末端には、同じ方法でＰｓｔＩサイトが加えら
れた。より進んだ配列に関する情報（後ろから２番目の
エクソン）は、挿入断片の全長の配列を決定することに
よって得られた。塩基配列決定は、一揃えの片方向から
の欠失クローンを作製して行なった（オズカイナック
（Ozkaynak), E., プトニィ（Putney), S. (1987）Biot
echniques, 5：770-773）。この得られた配列は、ＯＰ
１のＴＧＦ−β様領域の約８０％を含んでおり、第２５
図に示されている。ＴＧＦ−β様領域の完全な配列は、
はじめに、ラムダクローン＃１３ ＤＮＡのＥｃｏＲＩ
切断により生ずる断片をサブクローニングし、以前に明
かとされていた配列と同様にして、ＴＧＦ−β様領域の
はじめの部分（後ろから数えて３番目のエクソン）を含
む４ｋＢの断片を配列決定することにより得られた。Ｅ
ｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片上の遺伝子は、酸切断部位を持
つ修飾型ｔｒｐ ＬＥ融合タンパク質を産生するため
に、ｔｒｐプロモーター−オペレーターによって調節さ
れる大腸菌の発現べクターに挿入された。ＯＰ１遺伝子
は、天然材料の配列中に見いだされるペプチドに実質的
に一致するアミノ酸をコードしている。その活性領域と
信じられる部分の配列は、以下に示されている。
【００９９】
【化９】
【０１００】更に長い活性を有する配列は：
【０１０１】
【化１０】
【０１０２】コンセンサスプローブを用いて検索されて
きた、その他の３種の無傷の遺伝子がコードする、活性
領域と信じられる部分のアミノ酸配列は：
【０１０３】
【化１１】
【０１０４】Ｅ−３ ｃＤＮＡライブラリーの探査 無傷のタンパク質をコードするＤＮＡの単離が可能なプ
ローブ群を利用するもう１つの例は、以下に示されてい
る。タンパク質を発現することが知られている細胞（例
えば、骨芽細胞あるいは骨肉腫）は、全細胞質ＲＮＡを
単離するために抽出された。ｍＲＮＡを単離するため
に、オリゴ−ｄＴカラムを用いることが出来る。このｍ
ＲＮＡは例えばゲル電気泳動によってサイズ分画するこ
とが出来る。目的のｍＲＮＡを含む画分は、適当な宿主
細胞中で一時的に発現を誘導し、例えばイムノアッセイ
においては、骨形成タンパク質のトリプシン分解断片由
来のペプチドに対する抗体を用いて、骨形成タンパク質
の存在を検定することによって決定できるだろう。次
に、ｍＲＮＡ画分は、逆転写酵素を用いて、単鎖ｃＤＮ
Ａへと逆転写される；そして、もう一方の相補的ＤＮＡ
鎖は、ｃＤＮＡを鋳型として合成することが出来る。そ
の後、２本鎖ＤＮＡは、細菌を形質転換して。ＤＮＡラ
イブラリーを生産するために用いるベクターにライゲー
ションされる。
【０１０５】骨形成タンパク質の既知のアミノ酸配列に
対するコドンに相補的な、放射性標識をしたコンセンサ
ス配列、その一部、あるいは合成デオキシオリゴヌクレ
オチドは、標準的なＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーシ
ョン法を用いて、ｃＤＮＡライブラリーのどのＤＮＡが
全長の骨形成タンパク質をコードしているかを固定する
ために用いられるだろう。
【０１０６】このｃＤＮＡは、次に、発現ベクターに組
み込まれ、タンパク質発現のために適当な宿主細胞に導
入されるだろう。原核細胞が骨形成タンパク質に糖鎖を
修飾することが出来ないことにより、このタンパク質の
酵素活性が影響を受けないため、宿主は、原核細胞でも
真核細胞でも可能である。有用な宿主細胞には、サッカ
ロミセス、大腸菌、および種々の哺乳動物培養細胞が含
まれる。ベクターは、そのうえにタンパク質の分泌のた
めの種々のシグナル配列をコードしたり、また、骨形成
タンパク質を融合タンパク質としてコードする事もでき
る。翻訳後、タンパク質は細胞から精製あるいは培養液
から回収することが出来る。
【０１０７】Ｅ４．遺伝子の調製 上述のようにして回収された天然の遺伝子の配列および
ｃＤＮＡは、発現に用いることができる。上述の遺伝子
は、また、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを集
合させることにより生産され得る。１５−１００ｍｅｒ
のオリゴヌクレオチドは、バイオサーチＤＮＡモデル８
６００合成機で合成され、トリス−ほう酸−ＥＤＴＡ緩
衝液（ＴＢＥ）中でのポリアクリルアミトゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）により精製できる。つぎに、このＤＮＡ
は、ゲルから電気溶出する。重複するオリゴマーは、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化し、ＰＡＧ
Ｅにより生成可能なより大きな断片にライゲーションさ
れることが出来る。
【０１０８】Ｅ５．発現 この遺伝子は、大腸菌の種々の株といった適当な原核細
胞宿主あるいは、枯草菌、酵母、およびＣＨＯや骨髄腫
などの様々な動物細胞において発現可能である。一般
に、発現は多くの細胞型および当業者によく知られた発
現系を用いて行なわれる。例えば、この遺伝子が大腸菌
中で発現される場合、ｐＢＲ３２２に基づき、合成のｔ
ｒｐプロモーター−オペレーター、および修飾型ｔｒｐ
ＬＥリーダーを含む発現ベクターを用いることができ
る。このベクターは、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ制限酵
素切断部位で開裂する事ができ、また、例えばＯＰ遺伝
子断片をこの２つの部位の間に挿入することが出来る。
このＯＰタンパク質は、Ａｓｐ−Ｐｒｏという配列を持
つヒンジ部位を介してリーダータンパク質に連結され
る。このヒンジにより、融合タンパク質をＡｓｐ−Ｐｒ
ｏ部位で希酸により化学的に開裂する事が可能となる。
【０１０９】Ｅ６．活性タンパク質の生産 以下の方法は、活性型の組換え体タンパク質を生産する
ために用いられるだろう。融合タンパク質を含む大腸菌
細胞を溶菌する。融合タンパク質は、分画溶解法によっ
て精製される。切断は希酸によって行い、その結果生じ
た切断産物は、切断されたタンパク質を分離するため
に、セファクリル−２００ＨＲあるいはＳＰトリスアシ
ルカラムに通す。還元されたＯＰ画分を次にセミ−プレ
ップＣ−１８カラムを用いてＨＰＬＣにかける。
【０１１０】ＯＰに再び折りたたみ構造をとらせる条件
は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび６Ｍ Ｇｕ−Ｈ
Ｃｌを用いた、ｐＨ８．０におけるものである。試料
は、４℃に１８時間おくことにより、再び織りたたみ構
造をとらせた。
【０１１１】これらの方法は、前述したアミノ酸配列
（長い方の分子種）を持つＯＰ１と呼ばれる活性型タン
パク質を大腸菌中で発現するために用いられてきた。
【０１１２】もし、タンパク質が動物細胞中で発現され
る場合、再折りたたみ化は必要とされないだろう。
【０１１３】マトリックスの調製 Ａ．マトリックスの性質に関する一般的な考察 後にバイオアッセイの節でのべられるキャリアーは、生
物学的に分解可能な合成のマトリックスあるいは、合成
した無機のマトリックス（例えば、ＨＡＰ、コラーゲ
ン、リン酸三カルシウムあるいはポリ乳酸、ポリグリコ
ール酸、ならびに種々の共重合物）いずれかに置き換え
ることができる。もし、以下に述べられるように前処理
を行なえば、異種移植骨も用いることができる。
【０１１４】表面の電荷、粒子サイズ、無機塩の存在お
よびマトリックスと骨形成タンパク質を組み合わせるた
めの方法論など全てが、骨誘導をうまく行なうために、
ある役割を果たしていることが、研究により示されてい
る。化学的修飾により電荷を乱してやると、誘導応答が
失われる。粒子のサイズは、新しい骨の定量的応答に影
響を与える；７５から４２０μｍの間の粒子は、最大の
応答を引き出す。マトリックスが骨の無機塩で汚染され
ると、骨形成が阻害されるだろう。最も大事なことは、
マトリックス上に骨形成タンパク質を配列するために用
いられる方法が、骨形成タンパク質およびマトリックス
両者の物理的、化学的状態に極めて感受性であることで
ある。
【０１１５】骨マトリックス／ＯＰ移植の接触面におけ
る逐次的な細胞反応は複雑である。多段階カスケード
は、以下のものを含む：移植されたマトリックスヘのフ
ィブリンおよびフィブロネクチンの結合、細胞の化学走
性、繊維芽細胞の増殖、軟骨芽細胞への分化、軟骨形
成、血管の侵入、骨形成、再編成および骨髄の分化。
【０１１６】骨形成タンパク質に対しうまく作用するキ
ャリアーは、いくつかの重要な機能を果たさなければな
らない。キャリアーは、骨形成タンパク質に結合し、ス
ロー・リリース・デリバリー・システム（slow release
delivery system）として働き、骨の発達途上での各段
階の細胞応答を調節し、骨形成タンパク質を非特異的分
解から保護しなくてはならない。それに加え、選択され
た材料は、ｉｎ ｖｉｖｏで生物学的に適合可能でかつ
生物学的に分解されることができなければならない；キ
ャリアーは、新しい骨によって完全に置換されるまで、
一時的な骨格として機能しなければならない。生物学的
な適合性は、マトリックスが移植された際に顕著な炎症
を誘起せず、宿主動物に拒絶されないことが求められ
る。生物学的に分解されるためには、マトリックスが新
しい骨または軟骨の発達途上で、宿主の体によって緩や
かに吸収されることが必要である。ポリ乳酸（ＰＬ
Ａ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）および種々の組合せ
は、ｉｎ ｖｉｖｏで様々な溶解速度を有している。骨
の場合、溶解速度は移植が、皮膚骨あるいは結締組織繊
維骨で行なわれたかに大きく依存している。
【０１１７】マトリックスの結合構造、粒子のサイズ、
表面荷電の存在、細胞の侵入を許すのに充分なサイズの
粒子間の孔および間隙の存在などは、全て有効なマトリ
ックスとして機能するために重要でアる。マトリックス
を新たな骨に望まれる形に整形し、癒合不能を補う容積
を持つことが好ましい。ラットにおける研究により、新
しい骨は、本質的には移植されたデバイスの容積を有し
たまま形成されることが示されている。
【０１１８】マトリックスは、ゆるく付着する微粒子状
の材料、例えばコラーゲンから作られた、形状の維持す
る固体からなるだろう。マトリックスはまた、鋳造され
た多孔性の固体、あるいは単に、周囲の組織によって適
切に保持された密に詰められた粒子の凝固物から成るか
もしれない。粉砕した筋肉あるいはその他の組織も用い
られるだろう。大きな同種骨の移植は、その骨髄腔が浄
化され、粒子が充填され、骨形成タンパク質を散布して
おけば、マトリックスの担体として働き得る。
【０１１９】Ｂ．生物学的に活性のある同種マトリック
スの調製 無機塩を除いた骨マトリクスは、ここで述べるように４
２０μの濾過膜を通る骨粒子を生産するために、ラット
大腿骨あるいは頸骨の脱水した骨幹から調製された。こ
の骨粒子を４Ｍのグアニジン−ＨＣｌを用いた分離抽出
にかける。こうした処理により、骨マトリックスが軟骨
分化を誘導するもともとの能力が完全に失われる。残っ
た不溶性の物質がマトリックスを作り上げるために用い
られる。この物質は、ほとんどがコラーゲンそのもので
あり、移植した際に、軟骨および骨を誘導することはな
い。全ての新しい標品は、使用前にその無機塩の含量と
偽陽性について検定される。骨マトリックスの生物活性
の全体的損失は、活性のある骨形成タンパク質画分ある
いは純粋なタンパク質を生物学的に不活性な不溶性のコ
ラーゲンマトリックスとともに再構成した際に回復す
る。骨形成タンパク質はいかなる脊椎動物、例えば、ウ
シ、ブタ、サルあるいはヒトから得ることができ、また
あるいは、組換え体ＤＮＡ技術を用いて生産することも
できる。
【０１２０】Ｃ．異種移植において用いる、糖鎖を除い
た骨マトリックスの調製 骨形成タンパク質が他の種由来のコラーゲン性骨マトッ
クスと再構成され、ラットに移植されると、骨は全く形
成されない。このことは、骨形成タンパク質が異種性で
ある（種特異的でない）が、一方マトリックスは種特異
的であり、おそらく本来の免疫原あるいは阻害成分のた
めに、種間の移植はできないことを示唆している。した
がって、これまで、骨に起因するマトリックスに対して
は、骨形成タンパク質かその骨誘導活性を完全に発揮す
るために種特異的なコラーゲン性骨マトリックスが必要
とされた。
【０１２１】全ての骨マトリックスの主成分は、Ｉ型コ
ラーゲンである。コラーゲンに加え、抽出された骨は、
その容積の５％をしめる非コラーゲンタンパク質を含ん
でいる。骨マトリックスの多くの非コラーゲン成分は糖
タンパク質である。骨形成における糖タンパク質の生物
学的な特徴は知られていないが、その炭水化物含量のた
めにそれ自身が強力な抗原性を示し、異種マトリックス
中に存在する免疫原あるいは阻害成分を構成するだろ
う。
【０１２２】現在、もしはじめにマトリックスから免疫
原および阻害成分を除いてやれば、コラーゲン性骨マト
リックスは、異種移植において骨誘導活性に効果を及ぼ
すためのキャリアーとして用い得ることが見つかってい
る。このマトリックスは、この目的を果たすために、例
えばフッ化水素を用いて化学的に糖鎖を除いてある。
【０１２３】上述のようにして調製されたウシ骨の残さ
をふるい分けし、７４−４２０μｍの粒子を回収する。
この試料をＰ2Ｏ5にのせ真空中で乾燥し、反応容器に移
し、次に無水フッ化水素（ＨＦ）（マトリックス１ｇ当
り１０−２０ｍｌ）を−７０℃でこの試料上にしたたら
せる。反応容器の温度を０℃まで上昇させ、反応混合液
をこの温度で１２０分間撹拌する。真空でＨＦを蒸発さ
せた後、残留した酸を除くために、浅さをＫＯＨのペレ
ット上において真空で完全に乾燥させる。
【０１２４】どの程度糖鎖が除けたかは、共有結合して
いない炭水化物を除去するために、試料を適当に洗った
後、ＨＦ処理の前と後で分取したマトリックス試料の炭
水化物を分析することから決定できる。
【０１２５】次に、糖鎖を除去した骨マトリックスにつ
いて、以下に示した処理を行なう。
【０１２６】１）１ｇ／２００ｍｌとなるようにＴＢＳ
（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水）中に懸濁し、４℃で２時間
撹拌する、あるいは６Ｍ尿素，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０（ＵＴＢＳ）
に懸濁し、室温で３０分間撹拌する； ２）遠心し、段階１）と同様に、ＴＢＳあるいはＵＴＢ
Ｓで洗う；そして、 ３）遠心；上清を棄却；残さを水で洗い；凍結乾燥す
る。
【０１２７】骨形成デバイスの組み立て 前に示したマトリックスと上述の骨形成タンパク質のい
ずれかを用いた骨形成デバイスの組み立ては、以下のよ
うに行なうことができる。
【０１２８】Ａ．エタノール沈澱 本方法において、マトリック、グアニジン−ＨＣｌ中の
骨形成タンパク質に添加された。試料は低温でボルテッ
クスにかけインキュベートした。次に、試料を鎖らにボ
ルテックスにかけた。冷エタノールをこの混合液に加
え、これを撹拌してインキュベートした。遠心後（高速
遠心）、上清を棄却した。再構成されたマトリックス
は、水を加えた冷した濃エタノールで洗い、凍結乾燥し
た。
【０１２９】５Ｂ．アセトニトリル・トリフルオロ酢酸
凍結乾燥 本法において、アセトニトリル・トリフルオロ酢酸（Ａ
ＣＮ／ＴＦＡ）溶液中の骨形成タンパク質は、キャリア
ーに添加された。試料は、数回激しくボルテックスにか
け、凍結乾燥した。
【０１３０】Ｃ．尿素凍結乾燥 尿素緩衝液で調製されたこれらのタンパク質について
は、タンパク質をマトリックスと混合し、数回ボルテッ
クスし、次に凍結乾燥した。この凍拮乾燥した材料は、
移植に「そのままで」用いることができる。
【０１３１】ＩＮ ＶＩＶＯラット・バイオアッセイ 実質的に純粋なＢＯＰ、前出の性質を有するタンパク質
を含むＢＯＰの豊富な抽出物および、組換え体タンパク
質のいくつかは、骨形成デバイスを生産するためにマト
リックスに取り込まれ、ラット内で軟骨についてアッセ
イされた。ラットにおける研究は、骨形成効果は、骨形
成デバイス中に散布された骨形成タンパク質の投与量に
依存していることを示している。マトリックスのみが移
植されると、活性は全く観察されない。以下は、ここで
開示される骨形成デバイスが本発明の単離法に用いられ
たとき、骨形成タンパク質の活性画分を決定するために
アッセイする方法、またタンパク質の構成および、生物
学的活性についてマトリックスを評価する方法について
指針を示している。
【０１３２】Ａ．皮下移植 サンパス（Sampath）とレディ（Raddi）(Proc. Natl. A
cad. Sci. USA（1983）80：6591-6595）によって述べら
れている骨誘導のバイオアッセイは、参考文献に加えら
れているが、軟骨の分化活性の精製プロトコルを監視す
るために用いる。このアッセイは、エーテル麻酔をした
同種の受容体ラットの皮下部位に検定試料を移植するこ
とから成っている。２８−３２日齢の雄のロング−エバ
ンスラットが用いられた。胸郭域上の皮膚に無菌状態で
縦方面の切開（１ｃｍ）を行ない、切開腔をブラントな
切開によって作製した。約２５ｍｇの検定試料をこの切
開腔深くに移植し、切開腔を金属のスキンクリップで閉
じた。移植を行なった日を実験日とした。移植片は１２
日目に除去した。異型部位は、同型部位を用いて得られ
る結果で予想される不明瞭さなしに骨誘導の研究を可能
とする。
【０１３３】Ｂ．細胞における事象 ラットにおける移植のモデルは、以下の点を含むマトリ
ックスによって誘導される軟骨発達段階を通して、調節
された進行の様子を示している：（１）第１日目では、
多形核白血球による一次的な侵入が起き；（２）第２、
第３日目では、間葉細胞の移値と増殖が起き；（３）第
５、第６日目は、軟骨細胞が出現し；（４）第７日目に
は軟骨組織マトリックス形成が起き；（５）第８日に
は、カルシウムの沈着が起き；（６）第９、１０日目に
は、血管の侵入、骨芽細胞が出現し、新骨が形成され；
（７）第１２日から第１８日では、骨芽細胞と骨の再構
成と、移植されたマトリックスの溶解が起き；（８）第
２１日には、小骨において造血性骨髄の分化が起きる。
この結果は、新たな骨の形は、移植したマトリックスの
形に準ずることを示している。
【０１３４】Ｃ．組織学的評価 組織切片および染色は、移植片において骨形成の程度を
決めるために好ましいものである。移植片はボインス
（Bouins）液で固定し、パラフイルムに包埋し、６−８
ｍｍの切片に切る。トルイジン・ブルーあるいはへモド
キシリン／エオシンを用いた染色により、軟骨の最終的
な発達が明確にされる。通常、２０日経た移植片であれ
ば、移植片が骨誘導活性を示すか否かを決めるには充分
である。
【０１３５】Ｄ．生物学的マーカー 骨形成のマーカーとしては、アルカリ性ホスファターゼ
活性を用いることができる。この酵素の活性は、移植片
をホモジナイズした後、分光学的に決定することができ
る。活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、第９−１０日において
ピークを示し、その後緩やかに減少する。組織学的に全
く骨の発達を示さない移植片は、これらのアッセイ条件
下で殆どあるいは全くアルカリ性ホスファターゼ活性を
持たない。このアッセイは定量化ならびに、ラットから
移植片を除去した後、非常に速やかに骨形成の推定値を
得るために有用である。もう１つの方法として、骨形成
の量は、移植片のカルシウム含量を測定することによっ
て決めることができる。
【０１３６】商業規模で生産することができる系統化を
求めて、最も有効な投与量／純度レベルを決定するため
に、いくつかの程度の純度を持った骨形成タンパク質を
含む移植片を用いて試験を行なった。結果は、アルカリ
性ホスファターゼの比活性、カルシウム含量および組織
学的検定によって測定する。前述したように、アルカリ
性ホスファターゼの比活性は骨形成のはじめに上昇し、
次いで減少する。一方、カルシウム含量は、形成された
骨の総量に直接比例している。骨形成タンパク質による
骨形成活性は、「骨形成単位」によって表わされる。例
えば、１骨形成単位は、ラットの無機塩を除いた骨マト
リックスを対照とし、第１２日の移植片のカルシウム含
量によって決定される値と比較したとき、その最大値の
半分の骨形成活性に必要とされるタンパク質量を表わし
ている。
【０１３７】Ｅ．結果 投与量曲線は、種々のタンパク質の濃度をアッセイする
ことにより、精製系の多段階におけるｉｎ ｖｉｖｏで
の骨誘導活性について構築されている。第１７図は、ア
ルカリ性ホスファターゼによって決められた場合の、ラ
ットにおける代表的な投与量曲線を示している。同様な
結果は、骨形成単位として表わした場合にも得られる。
約１０−１２μｇのＴＳＫ−画分、３−４μｇのヘパリ
ン−セファロース−ＩＩ画分、０．４−０．５μｇのＣ
−１８カラム生成画分および２０−２５ｎｇのゲルから
溶出された高度に精製された３０ｋＤタンパク質が、明
確な骨形成（最大活性の半分）のために必要とされる。
通常、移植片２５ｍｇ当り２０−２５ｎｇの実質的に純
粋なタンパク質があれば、軟骨内骨を生産するためには
充分である。したがって、さらに多くの投与量を用いる
こともあるが、移植片１ｍｇあたり１−２ｎｇの骨形成
タンパク質を用いるのが妥当な投与量である。（骨形成
タンパク質の比活性に関するＩＢ５の節を参照のこ
と。）上に示したようにして発現されたＯＰ１（長い方
のもの）は、組織学的に活性をアッセイした場合、移植
片の多くの領域において無数の軟骨細胞が存在するこ
と、ならびに、新たなマトリックスを形成している血管
上皮を囲んで骨芽細胞が存在することによって示される
ように、軟骨および骨形成を誘導した。
【０１３８】糖鎖を除去した異種コラーゲン性骨マトリ
ックス（例＝ウシ）は、骨形成装置を調製するために同
種異型コラーゲン性骨マトリックスの代わりに用いら
れ、ｉｎ ｖｉｖｏにおける骨誘導活性について、ラッ
ト内でバイオアッセイされている。この結果は、化学的
に糖鎖を除いた異種のコラーゲン性骨マトリックスが、
軟骨形成をよく誘導することを示している（第２５
図）。アルカリ性ホスファターゼの比活性によって示さ
れるように、糖鎖を除去した異種マトリックスは骨を誘
導するが、一方、未処理のウシ・マトリックスは誘導し
ないことは明かである。
【０１３９】移植片の組織学的評価は、糖鎖を除いたウ
シ・マトリックスは、ラットの残さマトリックスと一致
した方法で骨を誘導するだけでなく、軟骨の分化に関わ
る発達段階を推進することも示唆している。ラットの残
さを対照として比較すると、ＨＦ処理したウシ・マトリ
ックスは、広範囲に再構成した骨を含んでいる。骨髄成
分で既に満たされた小骨は、第１２日までに形成され
る。この、支持骨誘導において、糖鎖を除いたウシ・マ
トリックスによって刺激されるような深部の働きは、再
現性があり、また骨形成タンパク質の様々な濃度につい
て投与量依存性がある。
【０１４０】動物に対する効能に関する研究 ウシ骨（ＢＯＰ）由来の、実質的に純粋な骨形成タンパ
ク質や、上述の性質を持つＢＯＰが多く含まれる骨形成
画分、ならびにいくつかの組換え体タンパク質は、マト
リックスに取り込まれ、骨形成デバイスを産している。
これらのデバイスの骨誘導能の効果は、ネコおよびウサ
ギ標本で試験され、強力な骨形成誘導物であり、最終的
に無機塩を含んだ骨を形成する事がわかっている。以下
は、ここで開示された骨形成デバイスが臨床的なデバイ
スにおいてどの様に用いられるかに関する指針を示して
いる。
【０１４１】Ａ．ネコを用いたモデル この研究の目的は、本発明の骨形成デバイスを試験する
ために、大動物への効果を見るモデルを確立し、大きな
骨の欠損の修復を明らかにし、整形外科手術患者でしば
しば遭遇する骨折の非癒合を模擬実験するためのもので
ある。この研究は、大哺乳動物モデルを用いることによ
り、キャリアーを持つ骨形成タンパク質の移植が、損傷
あるいは再構成を行なう手術に続く骨の再生を、促進で
きるか否かを評価するためにデザインされている。この
研究デザインの第一段階は、それ以上の介在物なしに、
刺激された骨折の非癒合に着実に進んでいくであろう大
腿骨の骨手術による欠損を外科的に準備することからな
る。創生された骨への骨形成デバイスの移植の効果は、
以下の研究プロトコルによって評価された。
【０１４２】Ａ−１．方法 １ｂｓ以下の１６匹の成長したネコに対し、側部の外科
的アプローチを通して、右の大腿骨において１ｃｍの骨
を片側だけ欠損させた。他の実験では、２ｃｍの骨欠損
が作製された。大腿は、欠損の正確な広がりを維持する
ために、８−穴のプレートを側面におくことにより、即
座にその内部が満たされた。外科的に作られたネコの大
腿骨の欠損部に移植された物質には３つの種類があり：
グループＩ（ｎ＝３）は、４Ｍグアニジン−ＨＣｌ処理
した（不活性型の）ネコ脱無機塩型骨マトリックス粉
（Ｇｕ−ＨＣｌ−ＤＢＭ）（３６０ｍｇ）の移植と同じ
プレート固定を受ける対照グループで；グループＩＩ
（ｎ＝３）は、生物学的に活性のあるネコ脱無機塩型骨
マトリックス粉（ＤＢＭ）（３６０ｍｇ）を移植した陽
性対照グループであり；グループＩＩＩ（ｎ＝１０）
は、Ｇｕ−ＨＣｌ−ＤＢＭキャリアー試料の各々に骨形
成タンパク質を添加して、グループＩ−ＩＩと同様な方
法を行なったものである。要約すると、グループＩＩＩ
の骨形成タンパク質で処理した動物は、グループ１の動
物と厳密に同じだが、骨形成タンパク質のみをただ１つ
よけいに加えた物質を移植された。
【０１４３】全ての動物は、術後カゴの中を任意に移動
することが許されている。いずれのネコも骨を標識する
ために、テトラサイクリンを注射されている（各週２５
ｍｇ／ｋｇ ＳＱずつ４週間）。グループＩＩＩの４匹
以外、全ての動物は大腿骨の骨切除後４ケ月後に屠殺さ
れた。
【０１４４】Ａ−２．放射体型測定ｉｎ ｖｉｖｏの放射体型測定は、大腿および骨切除部
位の正しい前部−後部像を一定に生ずるようにデザイン
された軟Ｘ線ジグに置かれた、軽く麻酔をかけた動物の
標準化したＸ線像を手術直後、４、８、１２および１６
週目にとることにより行なわれる。全てのＸ線像は、厳
密に同じ様式で、また厳密に各々の動物の同じ位置につ
いでとられている。骨修復は、任意の点における分析に
より、無機塩の蓄積量の関数として計算される。切り出
された骨に関する最終標本のラジオグラフィー分析は、
屠殺後、２断面について行なわれる。Ｘ線分析の結果は
第１８図に示されており、骨損失の修復率として置換さ
れている。要約すると、第１６週では、グループＩＩＩ
の大腿骨の６０％が平均８６％の骨欠損再生率で癒合し
ている。これとは対照的に、グループＩのＧＵ−ＨＣｌ
−ＤＭＢを用いた陰性−対照移植は、第４週で全く骨の
成育がみられず、第８週および第１２週でも１０％以下
で、第１６週でも１６％（±１０％）で、５匹のうち１
匹が少量の架橋された骨を示しているだけであった。グ
ループＩＩのＤＭＢ陽性−対照移植は、第４週で１８％
（±３％）の修復を示し、第８週では３５％、第８週で
は３５％、第１２週では５０％（±１０％）、第１６週
では７０％（±１２％）を示し、全ての月における骨形
成タンパク質に対しｐ＜０．０１の統計的差異を示し
た。３匹のうち１匹（３３％）は第１６週で癒合してい
る。
【０１４５】Ａ−３．生体力学 切り出された検定試料および正常型の大腿骨は、直ちに
骨密度計による研究を行ない、整理食塩水で湿らせた２
枚のタオルに包み、２枚の密封したプラスチック・バッ
グに入れ、後に研究するまで−２０℃で保存した。骨修
復強度および破断実験は、骨強度、硬度および破断する
ためのエネルギー吸収および変形を定量化するためのイ
ンストロン（Instron）試験機に連結した、特別にデザ
インした金属性の４−ポイントの屈折ジグ上で破断させ
ることによって行なった。検定試料の大腿骨および正常
型の大腿骨に関する研究では、骨強度（ロード）はポン
ドで、破断力はジュールで得られる。正常型の大腿骨は
９６（±１２％）ポンドの強度を示す。骨形成タンパク
質−移植を行なった大腿骨は３５（±４）ポンドだが、
骨折部位の表面域（骨欠損修復でみられる「砂時計」型
による）に対する補正を行なうと、この値は正常骨の強
度と密接に相関した。一次元的な骨標本のみが２５ポン
ドの強度検定に使用できたが、この場合も、骨折表面域
について補正をすると正常型骨と密接な相関を示した。
【０１４６】Ａ−４．組織体型測定／組織学 生体力学的検定に続いて、骨は、直ちに骨折部位におい
て縦方向に２枚の切片を切り、重量測定および体積測定
を行った。半分を蛍光染料の取り込み評価による、標準
的なカルシウム沈着骨の組織体型測定のために固定し、
もう半分を脱カルシウム化したへモドキシリン／エオシ
ン染料を用いた組織学的調製のために固定した。
【０１４７】Ａ−５．生化学 骨修復部位（ｎ＝６）から選ばれた標本を、冷却した
０．１５Ｍ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＮａＨＣＯ3，ｐＨ
９．０中で、スペックス・フリーザー・ミル（Spexfrez
eer mill）を用いてホモジナイズした。つぎに、上清の
アルカリ性ホスファターゼ活性および、沈澱物の酸可溶
性画分の全カルシウム含量を測定した。
【０１４８】Ａ−６．組織病理学 研究されたすべての動物の検死において書き留められた
最終的な検死報告は、何ら異常あるいは病理学的な発見
も明らかにしていない。全ての主要な臓器の一部は、今
後の研究のために保存されている。組織病理学的評価
は、以下の臓器の試料について行なった：心臓、肺、肝
臓、両方の腎臓、すい臓、両方の副腎、リンパ節、（実
験で用いた大腿骨の欠損部位に隣接した）左右の大腿骨
中部の大腿四頭筋。異常な病変あるいは病理学的な病変
はいずれの組織においても見られなかった。大腿四頭筋
で見られた軽い病変は、欠損部位における外科的操作に
対する治癒反応にあたる。肺浮腫は、安楽死に起因する
ものである。なんらかの一般的な全身性の効果あるい
は、検定した特定の臓器についてなんらかの影響を与え
ているという証拠は一切ない。
【０１４９】Ａ−７．ネコにおける研究の要約 １ｃｍおよび２ｃｍの大腿骨を欠損したネコについての
研究から、配置された骨形成タンパク質を含むマトリッ
クスからなるデバイスが： （１）大動物において体重を支える骨の欠損を修復でき
る； （２）移植後短時間で（２週間以内）一貫して骨形成を
誘導できる； （３）軟骨の骨化により、体積当り正常骨に等しい強度
を持つ骨を誘導できることを示している。
【０１５０】さらに、全ての動物は、実験期間中健康で
あり、移植されたデバイスに対し、臨床的あるいは組織
学的反応を起こした証拠を示さなかった。この骨欠損モ
デルにおいて、対照骨を移植した部位においては殆ど治
癒がみられなかったかあるいは全く治癒がみられなかっ
た。この結果は、骨形成デバイスを大きな、非癒合骨欠
損の修復にうまく利用することができるという証拠を与
えている。
【０１５１】Ｂ．ウサギを用いたモデル Ｂ１．方法と結果 本研究の目的は、対照動物において僅かなあるいは全く
骨の成長がなく、その結果、骨誘導が検定される場合、
強力に誘導できる物質しか陽性の結果を得ることができ
ないというモデルを確立するためである。骨形成デバイ
スを移植したあるいは移植しない、１．５ｃｍの欠損を
ウサギの尺骨に作製する。
【０１５２】Ｘ線分析により報告されている骨端閉鎖を
有する、８羽（１０１ｂｓ以上）のニュージランド白ウ
サギが研究された。これら８羽の動物（１週および２週
で１羽ずつ屠殺された）のうち、１１の尺骨欠損体につ
いて８週間の研究全工程を行なった。いずれの場合（ｎ
＝７）も、骨膜の切除に続いて移植を受けない動物は、
８週間の間はＸ線写真上で癒合は形成されない。移植を
受けない動物はいずれも、第４週にみられる周辺の骨か
ら成育してくる骨の薄い「殻」を発達させ、第８週まで
には、僅かながらさらに発達する。全ての場合（ｎ＝
４）において、第８週までには、骨形成タンパク質を移
植した動物において顕著な骨誘導をともなうＸ線写真上
の癒合が確立されている。移植していない場合の修復と
は反対に、この骨修復は、除去された骨の部位で起きて
いる。
【０１５３】放射体型測定分析により、第８週で屠殺し
た、９０％の骨形成タンパク質移植骨が修復され、１８
％の非移植骨が修復されたことを明らかにしている。検
死では、骨形成タンパク質骨は正常に見えるが、一方
「移植していない」骨部位には軟骨の繊維状組織がみら
れ、欠損部位における軟骨あるいは骨修復の証拠はな
い。
【０１５４】Ｂ−２．同種異型移植デバイス もう１つの実験において、１．５ｃｍの尺骨欠損の骨髄
孔は、活性化された骨形成タンパク質ウサギ骨粉で埋め
られており、この骨は、挿入の様式をとって同種異型移
植される。２つの対照尺骨は、第８週までは治癒され
ず、古典的な「ぞうげ質」が出現する。これとは対照的
に、骨形成タンパク質処理した移植片は第４週までには
Ｘ線写真上で「消失」し、第６週から第８週までの再度
の無機塩の蓄積が開始する。この同種異型移植片は、第
８週までにその各々の末端に弱い増殖性の骨形成をとも
なう治癒を受ける。
【０１５５】このタイプのデバイスは、同種異型移植片
の修復を促進するために役立つ。
【図面の簡単な説明】
本発明の上述およびその他の目的、その多様な特徴、お
よび本発明そのものは、添付した図と共に以下の説明を
読むことにより、より完全に理解されるであろう。
【図１】 第１図は、骨形成タンパク質“ＯＰ１”のゲ
ノムコピーのヌクレオチド配列を示したものである。１
８８０および１９２９の間の満ち領域は実際には約１０
００ヌクレオチドを表している；
【図２】 第１図の続き。
【図３】 第２図の続き。
【図４】 第３図の続き。
【図５】 第４図の続き。
【図６】 第５図の続き。
【図７】 第７図は骨形成タンパク質“ＯＰ１”遺伝子
へのコンセンサス遺伝子／プローブのハイブリダイゼー
ションの模式図である；
【図８】 第８図は、へパリン−セファロース−Ｉ；Ｈ
ＡＰ−ウルトロゲル；シービング−ゲル（セファクリル
３００）；およびへパリン−セファロース−ＩＩ上での
精製の際のウシ骨形成タンパク質（ＢＯＰ）分画の結果
を示す、溶出体積に対するタンパク質濃度（吸光度で示
される）のプロットの集合である；
【図９】 第９図は、非還元条件下（Ａ）および還元条
件下（Ｂ）での骨形成タンパク質のクマジーブルーで染
色したＳＤＳポリアクリルアミドゲルを写真で再現した
ものである；
【図１０】 第１０図は、酸化した（Ａ）、および還元
した（Ｂ）３０ｋＤタンパク質の炭水化物成分を示すＳ
ＤＳポリアクリルアミトゲルのＣｏｎＡブロットを写真
で再現したものである；
【図１１】 第１１図は、125Ｉ標識グリコシル化され
た（Ａ）、および脱グリコシル化された非還元条件下
（１）および還元条件下（２）での骨形成タンパク質の
ＳＤＳポリアクリルアミトゲルのオートラジオグラムを
写真で再現したものである；
【図１２】 第１２図は、Ｖ−８プロテアーゼ（Ｂ）、
エンドＬｙｓ Ｃプロテアーゼ（Ｃ）、ペプシン
（Ｄ）、およびトリプシン（Ｅ）で３０ｋＤ骨形成タン
パク質を消化して得られたペプチドのＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲルのオートラジオグラムを写真で再現したも
のである。
【図１３】 第１３図は、３０ｋＤ ＢＯＰ（Ａ）、１
６ｋＤサブユニット（Ｂ）、および１８ｋＤサブユニッ
ト（Ｃ）のトリプシンペプチド消化産物のＨＰＬＣクロ
マトグラムを集めたものである。
【図１４】 第１４図は、２回目のへパリン−セファロ
ースクロマトグラフィー過程（第８Ｄ図参照）から回収
された試料の逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣでの溶出プロファイ
ルのＨＰＬＣクロマトグラムである。重ね書きされてい
るものは、各画分中の骨形成率パーセントである；
【図１５】 第１５図は、Ｃ−１８で精製した骨形成ピ
ーク画分のＴＳＫ３０００／２０００ゲルでの溶出プロ
ファイルのゲル浸透クロマトグラムである。重ね書きし
てあるのは各画分中の骨形成率パーセントである；
【図１６】 第１６図は、へパリン−セファロースＩ
（Ａ）、ＨＡＰ−ウルトロゲル（Ｂ）、ＴＳＫ３０００
／２０００（Ｃ）、およびへパリン−セファロースＩＩ
（Ｄ）でのヒトタンパク質分画化の結果を示す、溶出体
積に対するタンパク質濃度（吸光度で示されている）の
グラフを集めたものである。矢印は緩衝液の変化を示し
ている；
【図１７】 第１７図は、Ｃ−１８での逆相ＨＰＬＣ
（Ａ）、へパリン−セファロースＩＩ（Ｂ）、ＴＳＫ３
０００（Ｃ）、ＨＡＰ−ウルドロゲル（Ｄ）、およびヘ
パリン−セファロースＩ（Ｅ）を含む多様な精製過程由
来の試料の骨誘導活性に関する典型的な投与量反応を示
すグラフである；
【図１８】 第１８図は、骨形成デバイス（Ａ）、担体
コントロール（Ｂ）、および鉱物質除去した骨（Ｃ）で
処理した後のネコ骨欠損修復の放射線形態学的解析の棒
グラフである；
【図１９】 第１９図は、骨形成タンパク質（ＣＯＰ
Ｏ）に関するコンセンサス遺伝子／プローブのＤＮＡ配
列および対応するアミノ酸配列を模式的に表したもので
ある；
【図２０】 第２０図は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ルの３０ｋＤ領域中のピーク骨形成活性を示す、増加す
る分子量に対する骨形成活性のグラフである；
【図２１】 第２１図は、３０ｋＤタンパク質のゲルで
精製されたサブユニットを示すクマシーブルーで染色し
たＳＤＳゲルを写真で示したものである；
【図２２】 第２２図は、１８ｋＤサブユニット（Ａ）
および１６ｋＤサブユニット（Ｂ）のエンドＡｓｐ Ｎ
プロテイナーゼ消化産物の二つのＨＰＬＣクロマトグラ
ムである；
【図２３】 第２３図は、ラットモデルでの骨移植の組
織学的検査を写真で示したものである：担体のみ
（Ａ）；担体とグリコシル化した骨形成タンパク質
（Ｂ）；および担体と脱グリコシル化した骨形成タンパ
ク質（Ｃ）。矢印は造骨細胞を示す；
【図２４】 第２４図は異種マトリックス（脱グリコシ
ル化されたウシマトリックス）の活性を示すグラフであ
る；および、
【図２５】 第２５Ａ図および第２５Ｂ図は、増加する
タンパク質濃度（投与量曲線、ｎｇ）に対して、カルシ
ウム含量で測定されるゲル溶出前後の天然材料から得ら
れたＯＰの比活性を示す棒グラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年６月２１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１１】 第１１図は、125Ｉ標識グリコシル化され
た、および脱グリコシル化された非還元条件下（Ａ）お
よび還元条件下（Ｂ）、での骨形成タンパク質のＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムを写真で
再現したものである；
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１２】 第１２図は、Ｖ−８プロテアーゼ（Ｂ）、
エンドＬｙｓ Ｃプロテアーゼ（Ｃ）、ペプシン
（Ｄ）、およびトリプシン（Ｅ）で３０ｋＤ骨形成タン
パク質を消化して得られたペプチドのＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲルのオートラジオグラムを写真で再現したも
のである。（Ａ）はコントロールを示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１６】 第１６図は、ヘパリン−セファロースＩ、
ＨＡＰ−ウルトラゲル、ＴＳＫ３０００／２０００、お
よびヘパリン−セファロースＩＩでのヒトタンパク質分
画化の結果を示す、溶出体積に対するタンパク質濃度
（吸光度で示されている）のグラフを集めたものであ
る。矢印は緩衝液の変化を示している；
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１７】 第１７図は、Ｃ−１８での逆相ＨＰＬＣ、
ヘパリン−セファロースＩＩ、 ＴＳＫ３０００、ＨＡ
Ｐ−ウルトラゲル、およびヘパリン−セファロースＩを
含む多様な精製過程由来の試料の骨誘導活性に関する典
型的な投与量反応を示すグラフである；
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＪ 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ ＡＣＫ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＪ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＣＫ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 595148888 2725 Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ Ｒｏａｄ，Ｋ ａｌａｍａｚｏｏ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｕ ｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅ ｒｉｃａ (72)発明者 デーヴィッド・シー ルエガー アメリカ合衆国マサチューセッツ州02132, ウエスト・ロックスバリー，エッジミア・ ロード 150，アパートメント ４ (72)発明者 エンジン オズカイナク アメリカ合衆国マサチューセッツ州01757, ミルフォード，パーデュー・ドライブ 44

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ほ乳動物で軟骨および軟骨内骨形成を誘導
    し得るダイマー蛋白質を生産する方法であって、該蛋白
    質は一対のポリペプチド鎖を有し、それぞれの鎖は２０
    ０より少ないアミノ酸を有しており、以下の工程： （ａ）該一対のポリペプチド鎖の少なくとも一方をコー
    ドし、そして、以下の配列： （１）以下の配列からなる群から選択される少なくとも
    一つのアミノ酸配列； 【化１】 【化２】 （２）以下のＤＮＡ配列でコードされるアミノ酸配列；
    または 【化３】 （３）上記（１）または（２）のいずれかの変異配列で
    あって、OP-1の類似体あるいは機能的な複製物の変異配
    列；を有する遺伝物質を提供する工程； （ｂ）該遺伝物質を宿主細胞に導入する工程； （ｃ）該ポリペプチドを生産するのに充分な条件下で該
    遺伝物質を発現させる工程； （ｄ）工程（ｃ）のポリペプチド鎖を有する、正しく折
    り畳まれた骨形成活性を有するダイマー蛋白質を生産す
    る工程；および、 （ｅ）工程（ｄ）の該ダイマーの骨形成活性蛋白質を単
    離する工程；を包含する、方法。
  2. 【請求項２】前記遺伝物質がｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよ
    びゲノミックＤＮＡからなる群から選択される、請求項
    １に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記工程（ｅ）が培地からダイマー蛋白質
    を単離する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記工程（ｄ）が、発現している宿主細胞
    で行われる、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記工程（ｄ）が、前記工程（ｃ）で生産
    されたポリペプチド鎖をインビトロで折り畳み、ダイマ
    ーとする工程を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記工程（ａ）で提供される遺伝物質が以
    下の配列； 【化４】 とハイブリダイズ可能であり、アミノ酸配列ＶＰＫＰＣ
    ＣＡＰＴを含むＤＮＡによってコードされる、請求項１
    に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記宿主細胞が原核細胞である、請求項１
    ないし６いずれかの項に記載の方法。
  8. 【請求項８】前記細胞が、E.coliあるいはBacillusであ
    る、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記宿主細胞が真核細胞である、請求項１
    ないし６いずれかの項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記細胞が、酵母、ＣＨＯ細胞あるいは
    ミエローマ細胞である、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】請求項１に記載の方法で生産される骨形
    成蛋白質。
  12. 【請求項１２】前記蛋白質がｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよ
    びゲノミックＤＮＡからなる群から選択される遺伝物質
    を用いて生産される、請求項１０に記載の骨形成蛋白
    質。
  13. 【請求項１３】請求項１０に記載の方法で生産される骨
    形成蛋白質。
  14. 【請求項１４】前記蛋白質がｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよ
    びゲノミックＤＮＡからなる群から選択される遺伝物質
    を用いて生産される、請求項１３に記載の骨形成蛋白
    質。
  15. 【請求項１５】非還元状態で結合してダイマーを形成す
    る一対のポリペプチド鎖を有する骨形成蛋白質であっ
    て、該一対のポリペプチド鎖はマトリックス内に配置さ
    れ、哺乳動物に移植されたときに軟骨内骨形成活性を誘
    導し得る、蛋白質：ここで、該ポリペプチド鎖は以下の
    アミノ酸配列を含む。 【化５】
  16. 【請求項１６】 請求項１ないし１０のいずれかの項に
    記載の方法で製造される骨形成蛋白質であって、ほ乳類
    での局所的な軟骨形成および軟骨内骨形成、歯周の治
    療、軟骨の修復、変形性関節炎の治療、正常に治癒して
    いない骨折の矯正、および、後天的または先天的な頭蓋
    顔面、他の骨格または歯の異常の治療からなる群から選
    択される治療に用いられる、蛋白質。
  17. 【請求項１７】請求項１ないし１０のいずれかの項に記
    載の方法で製造される骨形成蛋白質を含有する組成物で
    あって、ほ乳類での局所的な軟骨形成および軟骨内骨形
    成、歯周の治療、軟骨の修復、変形性関節炎の治療、正
    常に治癒していない骨折の矯正、および、後天的または
    先天的な頭蓋顔面、他の骨格または歯の異常の治療から
    なる群から選択される治療に用いられる、組成物。
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