JPH01265968A - 骨誘導性修復用の注入可能な組成物 - Google Patents
骨誘導性修復用の注入可能な組成物Info
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-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、タンパク化学および骨形成術の分野に属する
もので、特に、骨の再生に有効な、原繊維コラーゲンと
骨形成因子とを含有する注入可能な調製物に関する。
もので、特に、骨の再生に有効な、原繊維コラーゲンと
骨形成因子とを含有する注入可能な調製物に関する。
(従来の技術)
歴史的に見て、骨の修復のための方法は進歩しており、
現在では、失われた管材料にとって代わると共に、適切
な修復を行う骨細胞の能力を助ける。様々な組成物の供
給が可能となっている。これまでの研究者は、骨始原細
胞を骨組織へ成ア)させるのは骨組織内に存在するタン
パク因子であることを認識していた。これらの因子は、
これまですべてが特定されているわけではなく、また特
徴も完全に明らかになっているわけではない。しかし、
これらの因子が存在するか否かに基づき、これらの調製
物自体がこれらの因子を供給するか否かによって、調製
物を「伝導性」調製物と「誘導性」調製物とに分類する
ことが可能となっている。
現在では、失われた管材料にとって代わると共に、適切
な修復を行う骨細胞の能力を助ける。様々な組成物の供
給が可能となっている。これまでの研究者は、骨始原細
胞を骨組織へ成ア)させるのは骨組織内に存在するタン
パク因子であることを認識していた。これらの因子は、
これまですべてが特定されているわけではなく、また特
徴も完全に明らかになっているわけではない。しかし、
これらの因子が存在するか否かに基づき、これらの調製
物自体がこれらの因子を供給するか否かによって、調製
物を「伝導性」調製物と「誘導性」調製物とに分類する
ことが可能となっている。
「伝導性」調製物には、骨形成因子(OF)は含まれて
いない。これらは、新たな成長のマトリックスを提供す
ることによって、いわば「受動的」な方法で骨の修復を
行う。これら組成物には多くの種類がある。本発明の調
製物に特に関連するものは、主としである種のコラーゲ
ン、ずなわら骨の有機構造材料から成る骨修復組成物で
ある。コラーゲンマトリックスは、欠損部への新しい骨
の内方向成長のための所望の構造を提供することができ
ると考えられる。実際に、このマトリックスは、成熟し
た骨細胞と接触させると、その中に入り込み、無機質網
状組織を作って骨の成長を完成させることができる。つ
まり、このマトリックスと接触している生きた組織は、
叶の必要条件を全て提供する。実際に、これを目的とし
て、コラーゲン自体、またはヒドロキシアパタイトを混
合したコラーゲンを使用した例が、ここ数年5方々で報
告されている。
いない。これらは、新たな成長のマトリックスを提供す
ることによって、いわば「受動的」な方法で骨の修復を
行う。これら組成物には多くの種類がある。本発明の調
製物に特に関連するものは、主としである種のコラーゲ
ン、ずなわら骨の有機構造材料から成る骨修復組成物で
ある。コラーゲンマトリックスは、欠損部への新しい骨
の内方向成長のための所望の構造を提供することができ
ると考えられる。実際に、このマトリックスは、成熟し
た骨細胞と接触させると、その中に入り込み、無機質網
状組織を作って骨の成長を完成させることができる。つ
まり、このマトリックスと接触している生きた組織は、
叶の必要条件を全て提供する。実際に、これを目的とし
て、コラーゲン自体、またはヒドロキシアパタイトを混
合したコラーゲンを使用した例が、ここ数年5方々で報
告されている。
このように単に受動的に新しい骨組織の侵入成長と、そ
の後の無機質化とをもたらすだけでなく。
の後の無機質化とをもたらすだけでなく。
骨原細胞が骨細胞へ変化するよう能動的に誘導して骨の
修復を行うことができる。すなわち「誘導性」修復作用
を持った骨修復マトリックスを作り出すことが望ましい
のは、いうまでもないであろう。インビボでの骨形成プ
ロセスは複雑であり。
修復を行うことができる。すなわち「誘導性」修復作用
を持った骨修復マトリックスを作り出すことが望ましい
のは、いうまでもないであろう。インビボでの骨形成プ
ロセスは複雑であり。
部分的にしか解明されていない。しかし、これには、軟
骨細胞または軟骨を作ることのできる細胞の中間形成が
関係しており、これら軟骨細胞が。
骨細胞または軟骨を作ることのできる細胞の中間形成が
関係しており、これら軟骨細胞が。
無機質化をもたらすことのできる細胞に置き換わると考
えられる。最近では、このような分化をもたらしうる材
料の研究が行われている。
えられる。最近では、このような分化をもたらしうる材
料の研究が行われている。
骨白体に、その形成プロセスに関与する1つ以上の因子
が含まれていることは確かである。そこでいかなる因子
がこの様な作用をもたらすのかを明らかにすべく、努力
が重ねられている。IJristの米国特許第4,29
4,753号および第4,455,256号の開示によ
ると、尿素またはグアニジン塩酸塩を用いて脱無機質化
された骨から「骨形皿形成タンパクJ (BMP )
を抽出し、再沈澱させた。Uristは、その後、 p
H4,8でカルボキシルメチルセルロース樹脂(CMC
)に吸収されない、この粗製タンパク混合物をイオン交
換法で精製することによって、活性が生じたと報告して
いる(Urist 、 M、Ro。
が含まれていることは確かである。そこでいかなる因子
がこの様な作用をもたらすのかを明らかにすべく、努力
が重ねられている。IJristの米国特許第4,29
4,753号および第4,455,256号の開示によ
ると、尿素またはグアニジン塩酸塩を用いて脱無機質化
された骨から「骨形皿形成タンパクJ (BMP )
を抽出し、再沈澱させた。Uristは、その後、 p
H4,8でカルボキシルメチルセルロース樹脂(CMC
)に吸収されない、この粗製タンパク混合物をイオン交
換法で精製することによって、活性が生じたと報告して
いる(Urist 、 M、Ro。
Cl1n 0rtho Rel Re5(19
82)162:219) 、 Uristの報告(
5cience (1983) 220: 680−6
85およびProcNatl Acad 5cienc
e ([l5A) (1984) 81:371−37
5)には、 17,500ダルトンおよび18.500
ダルトンの分子量を有するBMPが記載されている。I
Jristの極く最近の欧州特許出願公開第02124
74号によれば。
82)162:219) 、 Uristの報告(
5cience (1983) 220: 680−6
85およびProcNatl Acad 5cienc
e ([l5A) (1984) 81:371−37
5)には、 17,500ダルトンおよび18.500
ダルトンの分子量を有するBMPが記載されている。I
Jristの極く最近の欧州特許出願公開第02124
74号によれば。
BMPの制限タンパク分解によって、 4,000から
7,000ダルトンのBMP画分が得られる。
7,000ダルトンのBMP画分が得られる。
5eydinSおよびThomasの米国特許第4,4
34,094号には、カオトロピック試薬を用いた抽出
、アニオンおよびカチオン交換カラムでの分画、および
pH4,8でCMCに吸着される両分からの活性の回復
による。骨の生成を促す骨タンパクの部分的精製につい
て報告している。この新しいタンパク画分は「骨形成因
子J (OF)と呼ばれ1分子量が約30,000ダ
ルトン以下という特徴を有している。
34,094号には、カオトロピック試薬を用いた抽出
、アニオンおよびカチオン交換カラムでの分画、および
pH4,8でCMCに吸着される両分からの活性の回復
による。骨の生成を促す骨タンパクの部分的精製につい
て報告している。この新しいタンパク画分は「骨形成因
子J (OF)と呼ばれ1分子量が約30,000ダ
ルトン以下という特徴を有している。
共有される米国特許第4.774.322号には、米国
特許第4 、434 、094号に開示された精製法と
部分的に類似した精製法を用いて均質に精製された2種
類のタンパクが記載されている。これら2種類のタンパ
クは、約150〜200 mMのNaC1濃度勾配でC
MCから溶離された。これら2種類のタンパクは元来。
特許第4 、434 、094号に開示された精製法と
部分的に類似した精製法を用いて均質に精製された2種
類のタンパクが記載されている。これら2種類のタンパ
クは、約150〜200 mMのNaC1濃度勾配でC
MCから溶離された。これら2種類のタンパクは元来。
軟骨誘導性因子(CIF ) AおよびCIF Bと呼
ばれていた。その後CIF Aは、以前に確認されたタ
ンパクで、形質転換成長因子ベータ(TGF−b )と
呼ばれているものと同一であることが判明した。またC
IF Bは、 TGF−bの新種であることが判明し。
ばれていた。その後CIF Aは、以前に確認されたタ
ンパクで、形質転換成長因子ベータ(TGF−b )と
呼ばれているものと同一であることが判明した。またC
IF Bは、 TGF−bの新種であることが判明し。
現在ではTGF−b2として知られている。これらの両
方とも、それら自体は、インビボでの骨形成活性を有し
ていない。
方とも、それら自体は、インビボでの骨形成活性を有し
ていない。
共有される米国特許第4,627.982号は、 TG
F−bおよびTGF−b2の主要部分が溶離されるNa
C1濃度勾配よりも低いNaC1濃度勾配部分(すなわ
ち約150 mMNaClより低い濃度勾配部分)に溶
離される米国特許第4,434,094号のCMC結合
画分内に存在する。
F−bおよびTGF−b2の主要部分が溶離されるNa
C1濃度勾配よりも低いNaC1濃度勾配部分(すなわ
ち約150 mMNaClより低い濃度勾配部分)に溶
離される米国特許第4,434,094号のCMC結合
画分内に存在する。
部分的に精製された骨誘導性因子に関するものである。
これら特定の誘導性修復因子が、未精製の、あるいは純
粋な形で入手し得るようになった結果。
粋な形で入手し得るようになった結果。
骨欠損部へ移植するための調製物を処方する試みが行わ
れることとなった。米国特許第4,440,750号に
は、再構成されたコラーゲン繊維と、脱無機質化された
骨粉束とを含む骨形成組成物が開示されている。この特
許は、該混合物を注入可能な形で処方する方法を示唆し
ている。しかし、該混合物は、骨粉束の粒子が針に詰ま
ることから、実用的な濃度の該混合物を注入器によって
供給することは、不可能でないにしても、実用的ではな
い。米国特許第4,394,370号(Jef fer
ies)には、性質が特定されていないコラーゲンと、
脱無機質化された骨粒子または溶解した骨形態形成タン
パク(おそら(Uristの骨形態形成タンパク)とを
含有する組成物が開示されている。このJefferi
esの材料は、骨欠損部への移植に適したスポンジだと
説明されている。この移植物の誘導性作用を評価する方
法は示されていなかった。米国特許第4.563.35
0号には、 CMCからの吸着と脱離、またはp)17
でアニオン交換樹脂による抽出物の低分子量画分の処理
と非結合画分の回収によって部分的に精製された移植組
成物について記載されている。
れることとなった。米国特許第4,440,750号に
は、再構成されたコラーゲン繊維と、脱無機質化された
骨粉束とを含む骨形成組成物が開示されている。この特
許は、該混合物を注入可能な形で処方する方法を示唆し
ている。しかし、該混合物は、骨粉束の粒子が針に詰ま
ることから、実用的な濃度の該混合物を注入器によって
供給することは、不可能でないにしても、実用的ではな
い。米国特許第4,394,370号(Jef fer
ies)には、性質が特定されていないコラーゲンと、
脱無機質化された骨粒子または溶解した骨形態形成タン
パク(おそら(Uristの骨形態形成タンパク)とを
含有する組成物が開示されている。このJefferi
esの材料は、骨欠損部への移植に適したスポンジだと
説明されている。この移植物の誘導性作用を評価する方
法は示されていなかった。米国特許第4.563.35
0号には、 CMCからの吸着と脱離、またはp)17
でアニオン交換樹脂による抽出物の低分子量画分の処理
と非結合画分の回収によって部分的に精製された移植組
成物について記載されている。
これらの因子は、少なくとも5重量%の非繊維形態のコ
ラーゲンぞを含有するコラーゲン担体と共に投与される
。これらの処方物は、固体骨移植物として構成された。
ラーゲンぞを含有するコラーゲン担体と共に投与される
。これらの処方物は、固体骨移植物として構成された。
米国特許第4,687,763号には、脱無機質化され
た前抽出物を、柔軟なコラーゲン支持体上に沈澱させる
ことによって調製される。骨の成長を促す固体移植物に
ついて記載されている。この調製は。
た前抽出物を、柔軟なコラーゲン支持体上に沈澱させる
ことによって調製される。骨の成長を促す固体移植物に
ついて記載されている。この調製は。
抽出剤溶媒用の溶媒を抽出物溶液へ添加することによっ
て行われる。
て行われる。
上述の組成物はどれも、実用的な注入可能誘導性調製物
ではない。このような注入可能調製物の利点は、注入不
能誘導性調製物を用いる場合に共通して必要となる外科
手術を避けることができることにある。本発明は、原繊
維コラーゲンと、少なくとも部分的に精製されたOFと
を含有する注入可能な調製物に関するものである。
ではない。このような注入可能調製物の利点は、注入不
能誘導性調製物を用いる場合に共通して必要となる外科
手術を避けることができることにある。本発明は、原繊
維コラーゲンと、少なくとも部分的に精製されたOFと
を含有する注入可能な調製物に関するものである。
(発明の要旨)
本発明は1人間および他の哺乳類における骨の修復に使
用され得る。新規な注入可能調製物を目的としている。
用され得る。新規な注入可能調製物を目的としている。
この調製物は、その最も単純な形では、原繊維状アテロ
ペプチドコラーゲンと、少なくとも部分的に精製された
骨形成因子との水性懸濁液を含有している。この調製物
には2骨成長促進剤(例えば、 TGF−b )や骨形
成を促進し得る走化性因子などの他の活性成分を添加す
ることができる。これら添加された物質は1組成物の注
入可能性を損なわないものでなければならない。
ペプチドコラーゲンと、少なくとも部分的に精製された
骨形成因子との水性懸濁液を含有している。この調製物
には2骨成長促進剤(例えば、 TGF−b )や骨形
成を促進し得る走化性因子などの他の活性成分を添加す
ることができる。これら添加された物質は1組成物の注
入可能性を損なわないものでなければならない。
生きている哺乳類個体の体内における所定部位の骨成長
を、該部位に該調製物を注入して誘導する方法も2本発
明の一部を成している。
を、該部位に該調製物を注入して誘導する方法も2本発
明の一部を成している。
また、桝裂鋼功好ましい実施態様の調製物を製造する方
法も1本発明のさらに他の側面である。
法も1本発明のさらに他の側面である。
該製法は、以下の工程を包含する:
(a)アテロペプチドコラーゲンと骨形成因子との酸性
水溶液を調製すること; (b)該溶液のpl+を高めることによって、アテロペ
プチドコラーゲンと骨形成因子とを共沈させること:及
び。
水溶液を調製すること; (b)該溶液のpl+を高めることによって、アテロペ
プチドコラーゲンと骨形成因子とを共沈させること:及
び。
(C)必要に応じて、得られた懸濁液中の共沈物の濃度
を、アテロペプチドコラーゲンに基づいて約5〜約65
mg/dに調節すること。
を、アテロペプチドコラーゲンに基づいて約5〜約65
mg/dに調節すること。
(発明の構成)
Ao、fflン一のコラーゲン1 \の工彫殻本発明の
注入可能組成物を製造するのに適したコラーゲンは、ア
テロペプチドコラーゲンの酸性水溶液である。この溶液
の調製は当該分野で周知であり、 VITROGEN
100:] ラーゲン溶液(CIS ) (Coll
agen Corporation、Pa1o Alt
o 、CA)などの調製物が市販されている。本発明の
注入可能調製物の製造に適した他のコラーゲンとして、
再構成された原繊維コラーゲンがあり、これは出発物質
としてCISを使用するか、またはZyderm @コ
ラーゲン移植物(ZCI ) (Collagen
Corporation、 Pal。
注入可能組成物を製造するのに適したコラーゲンは、ア
テロペプチドコラーゲンの酸性水溶液である。この溶液
の調製は当該分野で周知であり、 VITROGEN
100:] ラーゲン溶液(CIS ) (Coll
agen Corporation、Pa1o Alt
o 、CA)などの調製物が市販されている。本発明の
注入可能調製物の製造に適した他のコラーゲンとして、
再構成された原繊維コラーゲンがあり、これは出発物質
としてCISを使用するか、またはZyderm @コ
ラーゲン移植物(ZCI ) (Collagen
Corporation、 Pal。
Alto、 CA)といった市販の調製物を用いて調製
することができる。しかし、コラーゲン成分の調製法は
特に限定されるものではなく、適切な材料を得るための
方法の概要を以下に示す。得られたコラーゲンの精製度
が高く、免疫原性の少なくとも部分的要因であると考え
られるアテロペプチドが含まれていない限り、任意の哺
乳類を起源とするコラーゲン成分を用いることができる
。可溶化することにより、免疫原性を低下させる精製さ
れた形態のコラーゲンが作り出される。
することができる。しかし、コラーゲン成分の調製法は
特に限定されるものではなく、適切な材料を得るための
方法の概要を以下に示す。得られたコラーゲンの精製度
が高く、免疫原性の少なくとも部分的要因であると考え
られるアテロペプチドが含まれていない限り、任意の哺
乳類を起源とするコラーゲン成分を用いることができる
。可溶化することにより、免疫原性を低下させる精製さ
れた形態のコラーゲンが作り出される。
適切な製造方法においては、@乳類の革調製物。
好ましくはウシの革を1弱酸の中に浸け1次いで毛1表
皮、および脂肪を掻き落とすことによって柔らかくする
。このようにして毛抜きした革を再び弱酸の中に浸け、
すりつぶすか刻むかして、細分化された調製物を作り、
これを水性媒体中に分散させ、さらにコラゲナーゼ以外
のタンパク分解酵素、好ましくは低pHでも活性な酵素
によって分解させることによって、非変性条件下で可溶
化させる。酸溶液としては1例えばllClまたはカル
ボン酸(例えば、酢酸、マロン酸、乳酸など)の希釈さ
れた酸溶液を低温にて、使用酵素に応じて通常pn1.
s〜5で使用する。好ましい方法は、細分化された組織
を、 HCl中に、20°Cで約pH2にて、1〜5
g / lの濃度に分散させることである。組織に分散
させた後、酵素を添加し、テロペプチド、および組織の
他の可溶性成分を酵素によって分解するためにこの混合
物をインキュベートする。コラーゲンの三重螺旋部分を
攻撃しない、テロペプチドの分解に適した酵素としては
、ペプシン、パパイン、及びトリプシン(好ましくは、
トリプシン)が挙げられ、これらの酵素濃度は2組織の
コラーゲン含量に基づいて、0.1〜10重量%の範囲
である。インキュベーション期間は、約2日から2週間
程度であり、可溶化の過程は溶液の粘度を測定すること
により監視することができる。この粘度が実質的に定常
レベルに達すれば、可溶化は完了しているので、酵素を
不活性化して取り除く。
皮、および脂肪を掻き落とすことによって柔らかくする
。このようにして毛抜きした革を再び弱酸の中に浸け、
すりつぶすか刻むかして、細分化された調製物を作り、
これを水性媒体中に分散させ、さらにコラゲナーゼ以外
のタンパク分解酵素、好ましくは低pHでも活性な酵素
によって分解させることによって、非変性条件下で可溶
化させる。酸溶液としては1例えばllClまたはカル
ボン酸(例えば、酢酸、マロン酸、乳酸など)の希釈さ
れた酸溶液を低温にて、使用酵素に応じて通常pn1.
s〜5で使用する。好ましい方法は、細分化された組織
を、 HCl中に、20°Cで約pH2にて、1〜5
g / lの濃度に分散させることである。組織に分散
させた後、酵素を添加し、テロペプチド、および組織の
他の可溶性成分を酵素によって分解するためにこの混合
物をインキュベートする。コラーゲンの三重螺旋部分を
攻撃しない、テロペプチドの分解に適した酵素としては
、ペプシン、パパイン、及びトリプシン(好ましくは、
トリプシン)が挙げられ、これらの酵素濃度は2組織の
コラーゲン含量に基づいて、0.1〜10重量%の範囲
である。インキュベーション期間は、約2日から2週間
程度であり、可溶化の過程は溶液の粘度を測定すること
により監視することができる。この粘度が実質的に定常
レベルに達すれば、可溶化は完了しているので、酵素を
不活性化して取り除く。
酵素を変性させた後、変性した酵素と9組織の分解した
部分とを、様々な方法(例えば、透析。
部分とを、様々な方法(例えば、透析。
沈降、または濾過)、あるいはこれら方法の組み合わせ
によって取り除(ように溶液を処理する。
によって取り除(ように溶液を処理する。
コラーゲンを含む可溶性成分は、沈降または濾過された
固体から分離して濃縮し、必要に応じてイオン交換クロ
マトグラフィーで分画してから、さらに濃縮して、実質
的に純粋なアテロペプチドコラーゲン溶液を調製する。
固体から分離して濃縮し、必要に応じてイオン交換クロ
マトグラフィーで分画してから、さらに濃縮して、実質
的に純粋なアテロペプチドコラーゲン溶液を調製する。
溶液中のコラーゲン(crs )の典型的な濃度レベル
は、3〜25■/m1.テある。二〇CISは、低温、
好ましくは約10〜25°Cで、好ましくは生理学的イ
オン強度に対して低張条件下で、溶液を中和することに
より、原繊維状に再構成することができる。中和相溶液
は、直接。
は、3〜25■/m1.テある。二〇CISは、低温、
好ましくは約10〜25°Cで、好ましくは生理学的イ
オン強度に対して低張条件下で、溶液を中和することに
より、原繊維状に再構成することができる。中和相溶液
は、直接。
または好ましくは可溶化されたコラーゲンを透析するこ
とにより添加することができる。イオン強度は約0.0
3〜0.1Mを使用する。pHは、適当な塩基または緩
衝液(例えば、リン酸二ナトリウムまたは水酸化ナトリ
ウム)を加えることにより、溶液中のコラーゲンが再凝
集して原繊維となるレベルまで高めることができる。こ
れらの条件下で原繊維は、pHが約5〜10の範囲にあ
るときに形成されるが、最終pHは、5〜8の範囲であ
ることが好ましい。原繊維形成の持続時間は1通常、約
30分から18時間の範囲である。
とにより添加することができる。イオン強度は約0.0
3〜0.1Mを使用する。pHは、適当な塩基または緩
衝液(例えば、リン酸二ナトリウムまたは水酸化ナトリ
ウム)を加えることにより、溶液中のコラーゲンが再凝
集して原繊維となるレベルまで高めることができる。こ
れらの条件下で原繊維は、pHが約5〜10の範囲にあ
るときに形成されるが、最終pHは、5〜8の範囲であ
ることが好ましい。原繊維形成の持続時間は1通常、約
30分から18時間の範囲である。
B−’!jlU の夙ヅ への言。−1骨形成
因子または精製された形態のこの因子を含む部分的に純
粋な脱無機質化された前抽出物を使用することができる
。例えば、米国特許第4.627,982号に記載され
た部分的に精製された因子を使用することができる。こ
のことに関し、 「少なくとも部分的に純粋な」という
用語は、以下に述べるような非繊維状タンパクの脱無機
質化骨抽出物、好ましくは少なくとも米国特許第4,6
27,982号に記。
因子または精製された形態のこの因子を含む部分的に純
粋な脱無機質化された前抽出物を使用することができる
。例えば、米国特許第4.627,982号に記載され
た部分的に精製された因子を使用することができる。こ
のことに関し、 「少なくとも部分的に純粋な」という
用語は、以下に述べるような非繊維状タンパクの脱無機
質化骨抽出物、好ましくは少なくとも米国特許第4,6
27,982号に記。
載されたレベルまで精製されたものを意味する。
部分的に精製された因子は、 0.01〜0.1Mのリ
ン酸ナトリウムを添加して、pH6〜8のリン酸塩緩衝
液中で沈澱させることにより、さらに精製することがで
きる。この沈澱物は次いで、非イオン性カオトロピック
試薬に再溶解され、ハイドロキシアパタイトカラムを用
いてHPLCによりクロマトグラフィー分析される。い
ずれにせよ、この因子を骨から得る方法は、以下の通り
である。
ン酸ナトリウムを添加して、pH6〜8のリン酸塩緩衝
液中で沈澱させることにより、さらに精製することがで
きる。この沈澱物は次いで、非イオン性カオトロピック
試薬に再溶解され、ハイドロキシアパタイトカラムを用
いてHPLCによりクロマトグラフィー分析される。い
ずれにせよ、この因子を骨から得る方法は、以下の通り
である。
まず骨を2機械的方法または摩擦により汚れを取り除き
、粉砕し、さらに例えば希釈された酸水溶液を用いて、
好ましくは低温で洗い、そして親油性の溶媒(例えば、
エーテルまたはエチルアセテ−ゆで抽出し脱脂する。次
いで、この骨を9通常、より強い酸で抽出して、様々な
形態のリン酸カルシウムを除去することにより脱無機質
化する。
、粉砕し、さらに例えば希釈された酸水溶液を用いて、
好ましくは低温で洗い、そして親油性の溶媒(例えば、
エーテルまたはエチルアセテ−ゆで抽出し脱脂する。次
いで、この骨を9通常、より強い酸で抽出して、様々な
形態のリン酸カルシウムを除去することにより脱無機質
化する。
これらの技術は当該分野で周知であり1例えば米国特許
第4,434,094号に開示されている。得られた調
製物、すなわち脱無機質化された骨が1本発明の骨形成
タンパク調製物の出発物質となる。
第4,434,094号に開示されている。得られた調
製物、すなわち脱無機質化された骨が1本発明の骨形成
タンパク調製物の出発物質となる。
最初の抽出は、非繊維状(例えば、非コラーゲン)タン
パクを脱無機質化された骨から除去することが目的であ
る。これは、グアニジン塩酸塩(少な(とも約4モル)
、尿素(8モル)と塩類。
パクを脱無機質化された骨から除去することが目的であ
る。これは、グアニジン塩酸塩(少な(とも約4モル)
、尿素(8モル)と塩類。
またはドデシル硫酸ナトリウム(少な(とも約1容量%
)などのカオトロピック試薬、あるいは当該分野で周知
の他のカオトロピック試薬(Termineら、 J
Biol Chem(1980)255:9760−0
772 ;そして5ajeraおよびHascall、
J Biol Chem(1969)244 : 7
7−87および2384−2396 )を用いて行うこ
とができる。抽出は、好ましくは低温にてタンパク分解
酵素阻害剤の存在下で行うことにより、抽出されたタン
パクが分解されたり変性したりする可能性を低減させる
。使用し得るタンパク分解酵素阻害剤の例としては、フ
ッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF) 。
)などのカオトロピック試薬、あるいは当該分野で周知
の他のカオトロピック試薬(Termineら、 J
Biol Chem(1980)255:9760−0
772 ;そして5ajeraおよびHascall、
J Biol Chem(1969)244 : 7
7−87および2384−2396 )を用いて行うこ
とができる。抽出は、好ましくは低温にてタンパク分解
酵素阻害剤の存在下で行うことにより、抽出されたタン
パクが分解されたり変性したりする可能性を低減させる
。使用し得るタンパク分解酵素阻害剤の例としては、フ
ッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF) 。
(アジ化ナトリウム)、N−エチルマレイミド(NEM
) 。
) 。
ヘンズアミジン、および6−アミノヘキサン酸が挙げら
れる。媒体のpHは1選択された抽出剤に応じて定めら
れる。抽出に要する時間は、一般に。
れる。媒体のpHは1選択された抽出剤に応じて定めら
れる。抽出に要する時間は、一般に。
約4時間から1日程度である。
(以下余白)
抽出後、抽出剤は、必要なら先に限外濾過により濃縮を
行ってから水に対して透析を行うなどの適当な手段によ
り排除することができる。塩類もまた。制御された電気
泳動または分子ふるい5あるいは当該分野で周知の他の
手段によって除去することができる。タンパクの変性を
最小限に抑えるために、この工程の間は低温を維持する
ことが好ましい。また、抽出剤カオトロピック試薬は必
ずしも除去する必要はなく、溶液を1例えば限外濾過に
よって濃縮するだけでよい。
行ってから水に対して透析を行うなどの適当な手段によ
り排除することができる。塩類もまた。制御された電気
泳動または分子ふるい5あるいは当該分野で周知の他の
手段によって除去することができる。タンパクの変性を
最小限に抑えるために、この工程の間は低温を維持する
ことが好ましい。また、抽出剤カオトロピック試薬は必
ずしも除去する必要はなく、溶液を1例えば限外濾過に
よって濃縮するだけでよい。
カオトロピック試薬に溶解または再溶解した抽出物を、
ゲル濾過に供し2分子量が約20,000から35.0
00ダルトンの範囲の両分を得る。ゲルによるサイズ分
類は、標準的な方法で行われる。これは。
ゲル濾過に供し2分子量が約20,000から35.0
00ダルトンの範囲の両分を得る。ゲルによるサイズ分
類は、標準的な方法で行われる。これは。
5ephacryl S−200カラムを用いて常温(
10°c〜25’C)で行うことが好ましい。
10°c〜25’C)で行うことが好ましい。
次いで、サイズ分類された両分は、非イオン性カオトロ
ピック試薬(例えば、6Mの尿素)の存在下で、約pH
4,5〜5.2 (好まくは約pH4,8) (7)
CMCを用いて、イオン交換クロマトグラフィーに供さ
れる。他のカチオン交換体(ポリアクリルアミドおよび
架橋デキストランから誘導されたものを含む)を用いる
こともできるが、好ましいのはセルロースカチオン交換
体である。もちろん、どのイオン交換法においても、溶
液は、カラムにかける前に競合イオンを含んでいてはな
らない。上記因子は、カラムに吸着させ、そして約10
〜約150 mMの範囲で塩の濃度勾配を増大させて溶
離される。
ピック試薬(例えば、6Mの尿素)の存在下で、約pH
4,5〜5.2 (好まくは約pH4,8) (7)
CMCを用いて、イオン交換クロマトグラフィーに供さ
れる。他のカチオン交換体(ポリアクリルアミドおよび
架橋デキストランから誘導されたものを含む)を用いる
こともできるが、好ましいのはセルロースカチオン交換
体である。もちろん、どのイオン交換法においても、溶
液は、カラムにかける前に競合イオンを含んでいてはな
らない。上記因子は、カラムに吸着させ、そして約10
〜約150 mMの範囲で塩の濃度勾配を増大させて溶
離される。
この両分は2便宜上、 rCMB−bと称されている
。
。
CMB−1は、透析により、またはCl1l逆相カラム
を用いて脱塩される。
を用いて脱塩される。
C−0の J のg、−11
本発明の組成物は、 crsをOFと共沈させることに
より、または再構成された原繊維コラーゲンをOFと単
に混合することにより、調製することができる。
より、または再構成された原繊維コラーゲンをOFと単
に混合することにより、調製することができる。
■、共丈
原繊維コラーゲンとOFとを混合する好ましい方法は、
共沈による方法である。あるいは1機械的ミキサーまた
はホモジナイザを用いて2つの成分を混合する方法があ
るが、それほど望ましくない。
共沈による方法である。あるいは1機械的ミキサーまた
はホモジナイザを用いて2つの成分を混合する方法があ
るが、それほど望ましくない。
好ましい共沈法とは、以下のような方法である。
まずOFを、必要に応じて、酸(例えば、 0.0IN
llCl。
llCl。
pH2,0)に、約a u g / m1〜3 mg/
mll範囲の濃度で、可溶化する。CIF 10F混
合物は、溶液のpHを。
mll範囲の濃度で、可溶化する。CIF 10F混
合物は、溶液のpHを。
約6.5〜8.5.好ましくは約7〜7.5まで高める
ことによって共沈させる。これは、塩基、好ましくは0
.2Mリン酸緩衝液(pH11,2)を添加することに
よって行う。得られた沈澱物は、遠心分離器で分離し、
注入可能な媒体中に所望の濃度で再懸濁させる。懸濁液
中の共沈物の濃度は1通常、5〜65mg/m、好まし
くは10〜25■/mlの範囲である。少なくとも部分
的に精製されたOFに対するコラーゲンの重量比は2通
常、5:1から300 : 1である。
ことによって共沈させる。これは、塩基、好ましくは0
.2Mリン酸緩衝液(pH11,2)を添加することに
よって行う。得られた沈澱物は、遠心分離器で分離し、
注入可能な媒体中に所望の濃度で再懸濁させる。懸濁液
中の共沈物の濃度は1通常、5〜65mg/m、好まし
くは10〜25■/mlの範囲である。少なくとも部分
的に精製されたOFに対するコラーゲンの重量比は2通
常、5:1から300 : 1である。
2.1金
注入可能なコラーゲンとOFとの混合物の適当な調製方
法は9一方の濃度が他方の濃度の許容範囲を左右するた
め、様々である。従って、最終組成物に必要なパラメー
タを考慮することが好まし、い。
法は9一方の濃度が他方の濃度の許容範囲を左右するた
め、様々である。従って、最終組成物に必要なパラメー
タを考慮することが好まし、い。
注入による投与を可能とするためには、再構成された原
繊維コラーゲンの濃度は、5〜65■/成、好ましくは
10〜20■/dであり得る。コラーゲン濃度がより高
い再構成コラーゲン懸濁液は、 OF溶液と混合し、コ
ラーゲン濃度を低くする場合には。
繊維コラーゲンの濃度は、5〜65■/成、好ましくは
10〜20■/dであり得る。コラーゲン濃度がより高
い再構成コラーゲン懸濁液は、 OF溶液と混合し、コ
ラーゲン濃度を低くする場合には。
使用することができる。混合物における1部分的に純粋
なOFに対するコラーゲンの重量比は、上記と同様であ
る。
なOFに対するコラーゲンの重量比は、上記と同様であ
る。
上に示した通り、この調製物には不活性物質または生理
活性物質をさらに添加することができる。
活性物質をさらに添加することができる。
これらの添加物質は1組成物の注入可能性を損なわない
ものでなければならない。
ものでなければならない。
E、股五筋胆
本発明の組成物は、注入可能なものとして調製される。
これら組成物は、医師に周知の従来の注入法によって欠
損部へ投与される。この点に関し8これら組成物は、適
切な無菌投与用注入器に菜填すると便利である。これら
の組成物は、使用前は。
損部へ投与される。この点に関し8これら組成物は、適
切な無菌投与用注入器に菜填すると便利である。これら
の組成物は、使用前は。
低温(例えば、約4°C)で保管し、欠損部の大きさと
、欠損部治療に際して意図された組成物の役割とに応じ
た量を投与すべきである。
、欠損部治療に際して意図された組成物の役割とに応じ
た量を投与すべきである。
(実施例)
以下の実施例は2本発明をさらに説明をするものであっ
て2本発明を限定するものではない。
て2本発明を限定するものではない。
尖施拠上
部分的に精製されたCMB−1画分は、米国特許第4.
563,350号に従ってウシの骨粉末から調製した。
563,350号に従ってウシの骨粉末から調製した。
簡潔に述べると、ウシの中足骨を、 0.5 N HC
I中で脱無機質化し、4Mのグアニジン塩酸塩(GU、
HCI)で解離的に抽出処理した。GU、HC1抽出物
は、濃縮後、ゲル濾過カラム(S−200)にかけて、
低分子量タンパク(F35 Kダルトン)を得た。この
低分子量タンパクは、ざらに′a縮し、 G)l−25
カラムで脱塩し、そしてカチオン交換カラム(CM−5
2)にかけて、 CMB−1画分を得た。C?IB−1
タンパクは。
I中で脱無機質化し、4Mのグアニジン塩酸塩(GU、
HCI)で解離的に抽出処理した。GU、HC1抽出物
は、濃縮後、ゲル濾過カラム(S−200)にかけて、
低分子量タンパク(F35 Kダルトン)を得た。この
低分子量タンパクは、ざらに′a縮し、 G)l−25
カラムで脱塩し、そしてカチオン交換カラム(CM−5
2)にかけて、 CMB−1画分を得た。C?IB−1
タンパクは。
逆相HPLCカラム(C18)にかけて最終的に脱塩し
。
。
直接凍結乾燥した。
CMB−1タンパクは、以下のようにしてコラーゲンと
共沈させた。すべての工程は3層流フード内で行った。
共沈させた。すべての工程は3層流フード内で行った。
凍結乾燥されたCMB−1を、 0.01NHCI(p
H2,0)に、約2.5 mg/戒のタンパク濃度で溶
解した。この溶液を0.22mmフィルターで無菌濾過
し。
H2,0)に、約2.5 mg/戒のタンパク濃度で溶
解した。この溶液を0.22mmフィルターで無菌濾過
し。
VITROGEN’lOOcrs(3mg/Id)と混
合した。この混合物は、約5分間撹拌して完全に混合さ
せた。
合した。この混合物は、約5分間撹拌して完全に混合さ
せた。
CMB−1タンパクとコラーゲンとの共沈は、溶液9部
に対して、1部の0.2Mリン酸緩衝液(pH11,2
)を添加することにより行った。この混合物を約5分間
撹拌し、そのまま約18時間、フードに入れたまま放置
した。得られた沈澱物、すなわちCMB−1タンパクと
原繊維コラーゲン(FC)との混合物を。
に対して、1部の0.2Mリン酸緩衝液(pH11,2
)を添加することにより行った。この混合物を約5分間
撹拌し、そのまま約18時間、フードに入れたまま放置
した。得られた沈澱物、すなわちCMB−1タンパクと
原繊維コラーゲン(FC)との混合物を。
12、OOORPMで20分間遠心分離し、上清から分
離した。この上清は、タンパク測定のため保存した。
離した。この上清は、タンパク測定のため保存した。
沈澱物を回収し、その湿重量を測定した。これまでの測
定結果から、コラーゲンタンパク全体の約85%が、
CISからFCの形で沈澱すると予想される。
定結果から、コラーゲンタンパク全体の約85%が、
CISからFCの形で沈澱すると予想される。
FC濃度は、上記の上清と、 1.3 M NaC1
,0,02Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7,2)と
を沈澱物希釈の媒体として用いて、 0.13M Na
C1、0,02Mリン酸ナトリウム緩衝液中で15■/
mlとなるように調節した。このFC/CMB−1複合
体は、注入器間で均質化することにより、完全に混合さ
せた。均質化したサンプルは1次いで、lccの注入器
に装填し。
,0,02Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7,2)と
を沈澱物希釈の媒体として用いて、 0.13M Na
C1、0,02Mリン酸ナトリウム緩衝液中で15■/
mlとなるように調節した。このFC/CMB−1複合
体は、注入器間で均質化することにより、完全に混合さ
せた。均質化したサンプルは1次いで、lccの注入器
に装填し。
使用時まで冷凍状態(4°C)で保存した。
FC/CMB−1共沈物が哺乳類の軟骨組織形成を誘導
する能力は、以下のようにして確認した。Spragu
e−Dawleyラット(生後34〜40日のm)の腹
胸部の片側に、 0.2 ccのFC/CMB−1部合
物を皮下注射した。
する能力は、以下のようにして確認した。Spragu
e−Dawleyラット(生後34〜40日のm)の腹
胸部の片側に、 0.2 ccのFC/CMB−1部合
物を皮下注射した。
CMB−1を含まないFCだけのサンプルも、陰性の対
照として注射した。移植物を7日後および14日後に取
り出し、軟骨および骨の形成状態を生化学的および組織
学的に調べた。
照として注射した。移植物を7日後および14日後に取
り出し、軟骨および骨の形成状態を生化学的および組織
学的に調べた。
以下の表1は組織学的検査の結果をまとめたものである
。
。
紅
グループ 移植後7日 移植後14日軟骨
骨 軟骨 骨 FCloF 4+ 2+ 2+ 4
+pc対照、 oo o。
骨 軟骨 骨 FCloF 4+ 2+ 2+ 4
+pc対照、 oo o。
組織学的に見て、共沈物を含有する処方物は。
移植後7日間で軟骨の形成を大幅に誘導していることが
示された。また、この時点で、移植物の周辺に早期骨形
成の徴候が見られた。この観察結果を裏付けるように、
これら移植物におけるアルカリホスファターゼ(AP)
の活性が高まっている(移植物1部当たり約35ユニツ
トのAP)。FCだけのサンプルを注射した対照試験グ
ループでは、生化学的活性は認められなかった。注射後
14日では。
示された。また、この時点で、移植物の周辺に早期骨形
成の徴候が見られた。この観察結果を裏付けるように、
これら移植物におけるアルカリホスファターゼ(AP)
の活性が高まっている(移植物1部当たり約35ユニツ
トのAP)。FCだけのサンプルを注射した対照試験グ
ループでは、生化学的活性は認められなかった。注射後
14日では。
FC/CMB−1移植物のすべてにおいて、骨の形成の
増大が見られ、骨髄をほぼ識別することができた。
増大が見られ、骨髄をほぼ識別することができた。
軟骨の活性化は、認められないか、または極めて低いレ
ベルで移植物の中心部で確認できた。組織学的に見て、
移植物による炎症の徴候は見られなかった。これは、該
移植物が宿主組織と適合していることを示している。
ベルで移植物の中心部で確認できた。組織学的に見て、
移植物による炎症の徴候は見られなかった。これは、該
移植物が宿主組織と適合していることを示している。
裏旌尉l
共沈物は、 CMB−1タンパクの代わりに、より高度
に精製した(上記のように、 ConAアフィニティー
クロマトグラフィーにより精製した)骨形成タンパクを
用いたこと以外は、実施例1と同様にして調製し、試験
した。
に精製した(上記のように、 ConAアフィニティー
クロマトグラフィーにより精製した)骨形成タンパクを
用いたこと以外は、実施例1と同様にして調製し、試験
した。
得られた結果は、実施例1で得られた結果と同様であり
、共沈物を含んだ移植物には極めて高い骨誘導性活性が
認められた。
、共沈物を含んだ移植物には極めて高い骨誘導性活性が
認められた。
実星±1
65mg/mlのZydermコラーゲン移植物(ZC
I)材料を、 0.13MのNaC1を含む20mMの
リン酸緩衝液(pH7,4)を用いて、C1度が35■
/dとなるまで希釈した。希釈したコラーゲンは、実施
例1のCMB−1タンパクと充分に混合し、1.2■/
雁のCMB−1タンパクに対し、コラーゲンの最終濃度
を30mg/m1とした。この組成物のOFの割合は、
約3.8%である。
I)材料を、 0.13MのNaC1を含む20mMの
リン酸緩衝液(pH7,4)を用いて、C1度が35■
/dとなるまで希釈した。希釈したコラーゲンは、実施
例1のCMB−1タンパクと充分に混合し、1.2■/
雁のCMB−1タンパクに対し、コラーゲンの最終濃度
を30mg/m1とした。この組成物のOFの割合は、
約3.8%である。
次いでこの混合物を1 cc注入器に果填併し、注入ま
で4°Cで保存した。
で4°Cで保存した。
哺乳類の軟骨組織形成を誘導するZCI/CMB−1部
合物の能力は、以下のようにして確認された。4匹の若
い雄のSprague−Dawleyラットの腹胸部の
片側に、 0.5 ccのZCI/CMB−1を皮下注
射した。米国特許第4,563.350号に記載されて
いる。再構成され、脱無機質化された骨(R−DBP)
、およびZCIだけを用いた。ZCIの対照注射は0
.5ccのZCIを用いて行い、対照サンプルR−DB
P (40mg)は外科手術で移植した。
合物の能力は、以下のようにして確認された。4匹の若
い雄のSprague−Dawleyラットの腹胸部の
片側に、 0.5 ccのZCI/CMB−1を皮下注
射した。米国特許第4,563.350号に記載されて
いる。再構成され、脱無機質化された骨(R−DBP)
、およびZCIだけを用いた。ZCIの対照注射は0
.5ccのZCIを用いて行い、対照サンプルR−DB
P (40mg)は外科手術で移植した。
移植物は、14日後と28日後に取り出して、軟骨と骨
の形成状態を生化学的および組織学的に調べた。組織学
的判定は、標準的な手順により固ンヒ切片化し、そして
染色した後に行った。生化学的判定は、軟骨のプロテオ
グリカン含有量およびアルカリホスファターゼの比活性
を分析することにより行った。
の形成状態を生化学的および組織学的に調べた。組織学
的判定は、標準的な手順により固ンヒ切片化し、そして
染色した後に行った。生化学的判定は、軟骨のプロテオ
グリカン含有量およびアルカリホスファターゼの比活性
を分析することにより行った。
組織学的判定の基準となったのは、軟骨誘導性。
骨形成、導管化、および繊維芽細胞の侵入である。
これらの基準から、コラーゲンの対照注射は、28日後
にわずかの導管化および繊維芽細胞の侵入が認められた
こと以外は活性が認められず、14日後ではこれらもみ
とめられなかった。ZCT/CMB−I Ml成吻およ
びR−DBP組成物は両方とも、これら4つの基準すべ
てについて活性を示したが、ただし。
にわずかの導管化および繊維芽細胞の侵入が認められた
こと以外は活性が認められず、14日後ではこれらもみ
とめられなかった。ZCT/CMB−I Ml成吻およ
びR−DBP組成物は両方とも、これら4つの基準すべ
てについて活性を示したが、ただし。
R−DBP組成物の方がZCI/CMB−1組成物より
も、ゎずかながら均等かつ大きな活性を示した。
も、ゎずかながら均等かつ大きな活性を示した。
14日後に分析したプロテオグリカンの活性は。
zcrのみを用いた場合は全く認められず、 ZCI/
CMB−1を用いた場合は湿潤組ta1g当たり550
■のC−PG。
CMB−1を用いた場合は湿潤組ta1g当たり550
■のC−PG。
R−DBPを用いた場合は湿潤組織1g当たり1300
■のC−PGであった。
■のC−PGであった。
アルカリホスファターゼ活性は、14日後と28日後に
分析したが、この場合もZCIだけを注射した動物から
取り出した移植物には、アルカリホスファターゼ活性は
実質的に認められなかったのに対し、 ZCI/CMB
−1を注射したラットから取り出した移植物には、湿潤
組織1g当たり、14日後で8.50゜28日後で14
.51JのAPが認められた。R−DBPを注射したラ
ットから取り出した移植物のアルカリホスファターゼ活
性は同じ<、14日後で1207.y、 28日後で2
0U/ gであった。
分析したが、この場合もZCIだけを注射した動物から
取り出した移植物には、アルカリホスファターゼ活性は
実質的に認められなかったのに対し、 ZCI/CMB
−1を注射したラットから取り出した移植物には、湿潤
組織1g当たり、14日後で8.50゜28日後で14
.51JのAPが認められた。R−DBPを注射したラ
ットから取り出した移植物のアルカリホスファターゼ活
性は同じ<、14日後で1207.y、 28日後で2
0U/ gであった。
以上のことから、注入可能な混合ZCI/CMB−1組
成物は、 R−DBP調製物と同等の骨形成促進活性を
有し得ると結論づけることができる。
成物は、 R−DBP調製物と同等の骨形成促進活性を
有し得ると結論づけることができる。
タンパク化学および骨形成術の分野における当業者に明
白な本発明実施の上記様式の変更も特許請求の範囲に包
含される。
白な本発明実施の上記様式の変更も特許請求の範囲に包
含される。
(発明の要約)
原繊維アテロペプチドコラーゲンと、骨形成因子との水
性懸濁液は、骨欠損部を修復するために有効な注入可能
調製物である。
性懸濁液は、骨欠損部を修復するために有効な注入可能
調製物である。
以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、原繊維アテロペプチドコラーゲンと、少なくとも部
分的に精製された骨形成因子との水性懸濁液を含有する
、注入可能な骨成長誘導性組成物。 2、前記コラーゲンの濃度が約5〜約65mg/mlの
範囲である、請求項1に記載の組成物。 3、前記原繊維アテロペプチドコラーゲンと、少なくと
も部分的に精製された前記骨形成因子とが、共沈物の形
態である、請求項1に記載の組成物。 4、前記共沈物の骨形成因子に対するコラーゲンの重量
比が約5:1〜300:1の範囲である、請求項2に記
載の組成物。 5、前記骨形成因子が、脱無機質化された酸性の骨抽出
物から共沈する、請求項4に記載の組成物。 6、請求項4に記載の組成物の製造方法であって、 (a)アテロペプチドコラーゲンと骨形成因子との酸性
水溶液を調製すること; (b)該溶液のpHを高めることによって、該アテロペ
プチドコラーゲンと該骨形成因子とを共沈させること;
及び、 (c)必要に応じて、得られた懸濁液中の該共沈物の濃
度を、アテロペプチドコラーゲンに基づいて約5〜約6
5mg/mlに調節すること、 を包含する、製造方法。 7、前記骨形成因子が、脱無機質化された骨抽出物とし
て存在する、請求項6に記載の製造方法。 8、前記溶液中の脱無機質化された骨抽出物に対するア
テロペプチドコラーゲンの重量比が約5:1〜300:
1である、請求項7に記載の製造方法。 9、前記溶液のpHが約6.5〜約8.5に高めれる、
請求項6に記載の製造方法。
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Publication Number | Publication Date |
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JPH0553140B2 JPH0553140B2 (ja) | 1993-08-09 |
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JP (1) | JPH01265968A (ja) |
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