JP2001501934A - 標的組織にリモデリングするよう有機マトリックスをプログラムするための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 標的の組織内ヘリモデリングするための非免疫原性マトリックスをプログラムする方法を開示する。さらに、被験者の所定の組織種の成長を促進することのできる組成物も開示する。当該組成物を調製する方法も開示する。本方法及び組成物は、例えば硬骨、軟骨、及び筋肉などの組織における組織欠陥の治療にとって有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 標的組織にリモデリングするよう有機マトリックスをプログラムするための方法 及び組成物 発明の背景 生体内における組織の再成長を選択的に促進できれば、事故又は疾病による組 織損傷又は破壊を被った患者の治癒及び術後の回復に大きく資するであろう。最 近の研究では、特定のマトリックス組成物を損傷した骨に移植すると、骨の成長 が促進され、損傷した骨が安定し、治癒を早めるということが分かった。しかし ながら、多種の組織の再成長及び修復を促進する普遍的な方法は分かりにくいも のであった。 発明の概要 本発明は多種の組織の再成長及び修復を促進するための方法及び組成物を提供 するものである。 ある態様では、本発明は、標的の有機的形態型内にリモデリングするための、 すなわち標的の有機的形態型を調製するための非免疫原性マトリックスをプログ ラムする方法を提供する。本方法は、例えばコラーゲン供与源を脱灰して脱灰さ れた有機マトリックスを形成するなどして、非免疫原性のマトリックスを提供す るステップと、前記非免疫原性マトリックスを標的の有機的形態型にリモデリン グすべくプログラムするための処理ステップを選択するステップと、標的の有機 的形態型へのリモデリングが起きるように前記非免疫原性のマトリックスを処理 するステップとを含む。 好適な実施例では、前記処理ステップは、標的の有機的形態型が軟骨形成組成 物、硬骨形成組成物又は筋肉形成組成物であるように、選択される。 別の態様では、本発明は組織の成長又は修復を促進する有機材料を調製する方 法を提供するものである。本方法は、粉砕された骨を脱灰して、脱灰された有機 マトリックスを提供するステップと、前記脱灰された有機マトリックスをヒアル ロン酸（ＨＡ）又はグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）で処理して、組織の成長又 は修復を促進する有機材料を調製するステップとを含む。 好適な実施例では、本方法はさらに、前記脱灰された硬骨マトリックスを、組 織の成長を促進するのに有効な量の成長因子に接触させるステップも含む。いく つかの実施例では、この脱灰された有機マトリックスを約１−５重量パーセント のＨＡ又はグリコサミノグリカンで処理する。いくつかの実施例では、前記成長 因子はオステオポンチン、骨形態発生たんぱく質、及び骨シャロたんぱく質のう ちのいずれかから選択される。いくつかの実施例では、粉砕骨を脱灰する前記の ステップは、この粉砕骨を少なくとも一つのキレート剤に接触させるステップを 含む。別の態様では、本発明は。この方法により調製された、組織の成長又は修 復を促進するための注射可能で非免疫原性の組成物を提供するものである。 別の態様では、本発明は組織成長又は修復を促進するための有機材料を調製す る方法を提供する。本方法は、粉砕骨を脱灰して、脱灰された有機マトリックス を提供するステップと、この脱灰された有機マトリックスを、筋肉成長促進因子 が活性化されるような条件下で鉱酸で処理するステップとを含む。 別の態様では、本発明は組織成長又は修復を促進するための注射可能で非免疫 原性組成物を提供する。当該組成物は、少なくとも約８０重量パーセントのコラ ーゲンマトリックスと、組織成長を促進するのに有効な量の成長因子とを含む。 当該組成物は好ましくは内生の成長因子を概ね含まないと良い。 いくつかの実施例では、当該組成物はさらにヒアルロン酸又は薬学上有効なそ の塩を含む。いくつかの実施例では、当該成長因子はオステオポンチン又は骨シ ャロたんぱく質である。いくつかの実施例では、当該組成物はさらにグリコサミ ノグリカンを含む。いくつかの実施例では、前記のコラーゲンマトリックスは概 ね純粋なタイプＩコラーゲンである。いくつかの実施例では、当該マトリックス は、生きた被験者に注射したときに概ね非移動性である。いくつかの実施例では 、当該組成物は大きさ約７５ミクロンから約２００ミクロンの粒子を含む。いく つかの実施例では、当該組成物は少なくとも約８５重量パーセントのコラーゲン を含む。いくつかの実施例では、当該組成物は少なくとも約９０重量パーセント のコラーゲンを含む。 さらに別の態様では、本発明は、生きた被験者において、その被験者に対して 炎症を起こすことなく組織成長を促進する方法を提供するものである。本方法は 、被験者に対し、注射可能で非免疫原性の組成物を注射するステップを含み、当 該組成物は、少なくとも約８０％のコラーゲンマトリックスと、組織成長を促進 するのに有効な量の成長因子とを含み、その結果、生きた被験者の組織成長が、 その被験者において炎症が起きることなく促進されるようなものである。いくつ かの実施例では、筋肉成長、硬骨成長又は軟骨成長が促進される。 さらにまた別の態様では、本発明は、間葉細胞の分化を促進する方法を提供す る。本方法は間葉細胞をあるマトリックスに接触させるステップを含むが、前記 マトリックスは、少なくとも約８０重量パーセントのコラーゲンマトリックスと 、組織成長を促進するのに有効な量の成長因子とを含む、注射可能で非免疫原性 の組成物を含むものである。前記マトリックスは、間葉細胞が分化するような条 件下で間葉細胞と接触する。 さらに別の態様では、本発明は、組織成長又は修復を促進する注射可能で非免 疫原性の組成物と、薬学上容認可能な担体とを含む製剤を提供する。この注射可 能で非免疫原性の組成物は、少なくとも約８０重量パーセントのコラーゲンマト リックスと、組織成長を促進するのに有効な量の成長因子とを含み、好ましくは 内生の成長因子を概ね含まないとよい。 別の態様では、本発明は、間葉細胞の付着及び融合を促進する方法を提供する 。本方法は、間葉細胞がマトリックスに付着して融合するような条件下で、間葉 細胞を含む組織内にマトリックスを移植するステップを含む。当該マトリックス は、間葉細胞をマトリックスに誘引する手段と、間葉細胞をマトリックスに付着 させる手段と、間葉細胞の融合を促進する手段とを含む。 好適な実施例では、間葉細胞をマトリックスに誘引する手段は走化性ペプチド を含む。好適な実施例では、間葉細胞をマトリックスに付着させる手段は成長因 子の伸展ドメインを含む。好適な実施例では、間葉細胞の融合を促進する手段は ヒアルロン酸又はグリコサミノグリカンを含む。 発明の詳細な説明 本発明は、組織の成長を生体内で選択的に促進する組成物及び方法を提供する ものである。 概略的には、本発明の組成物は、組織欠陥部位を安定させる働きをする粒子状 の「足場」であって、細胞により浸潤されて標的組織にリモデリングを行うこと が可能なものを含む。いくつかの好適な実施例では、当該足場は軟骨又は硬骨を 由来とする脱灰されたマトリックスを含む。あるいは選択に応じ、当該足場は細 胞の成長を支持するのに適した（合成）ポリママトリックスを含んでいてもよい 。当該足場には、その足場を被験者に移植したときに所望の組織種の形成を促進 するような成長因子又はその他の物質が含まれていてもよい。本発明の組成物を 調製する方法を以下により詳細に述べる。コラーゲンを基にしたマトリックス製 剤に関する更なる情報は、ここに参考文献として編入することとする、１９９６ 年５月１４日に発行の米国特許第５，５１６，５３２号に見ることができる。 ここで用いられる「有機的形態の（原語：biomorphic）組成物」という術語は 、生きた被験者の体内に移植されたときに、所定の組織種の非炎症組織の成長を 促進する組成物を言う。本発明による有機的形態の組成物を注射又は移植するこ とで形成が可能な組織の例には、硬骨、筋肉、軟骨、皮膚、脂肪、腱、等々が含 まれる。好適な実施例では、間葉細胞を由来とする組織の形成を促進するために 、本発明の有機的形態の組成物を用いることができる。 ここで用いられる場合の「標的の有機的形態型」という術語は、例えば硬骨、 筋肉、軟骨、等々といった標的組織の成長を選択的に促進することのできる組成 物を言う。 ここで用いられる場合の「内生の」成長因子とは、別の成長因子を外部源から さらに加えることなく、自然発生したマトリックスに存在する成長因子を言う。 例えば天然の硬骨全体には内生の成長因子が含まれている場合があるが、この内 生の成長因子は抽出、たんぱく質分解、等々により取り除くことができる。 「被験者」という術語は、脊椎動物、より好ましくは温血動物、好ましくはネ コ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、及びヒトを含むほ乳類を含むものとして意図され ている。 以下の議論では、本発明による、生きた被験者の体内で組織形成を促進するの に用いられる有機的形態の組成物を説明する。しかしながら、本組成物は、例え ば細胞培養株など、試験管内で組織成長を促進するために用いることができるこ とは理解されよう。従って、ホスト動物への、例えばインプランテーション又は トランスプランテーション、例えば移植、などに適した組織など、組織を成長さ せるために本発明の組成物を用いることができる。有機的形態の組成物 本発明は、生きた被験者の体内に移植したときに所定の組織種の形成を促進す る有機的形態の組成物を提供する。ある特定の有機的形態の組成物により促進さ れる組織種は、少なくとも部分的に、その有機的形態の組成物が提供される、細 胞成長にとっての環境に関連するものとなろう。理論に縛られることを望む訳で はないが、本発明による有機的形態の組成物は、移植体の周囲の組織からの多能 性（未分化の）細胞のレクルートメントを促進することにより、移植体内で成長 かつ分化して標的組織を形成することの可能な細胞を提供することができると考 えられる。従って、適した種類の細胞を誘引することのできる化学的誘因剤を本 発明による有機的形態の組成物に用いることで、以下に詳述するように、周囲組 織から移植体へと正しい細胞種を誘引することができる。本有機的形態の組成物 のマトリックスは、分化した細胞による移植体への侵入を防ぐように選択しても よい。 本発明による有機的形態の組成物は、好ましくは、移植体に浸潤した多能性細 胞の分化に結びつくような環境を提供するものであるとよい。ある好適な実施例 では、当該細胞は間葉細胞である。しかしながら当業者であれば、新しい組織を 提供しようとするには、細胞の分化を樹立細胞の成長及び増殖と概ね均衡させね ばならないことは理解されよう。このように、本発明による有機的形態の組成物 は、生きた被験者に移植したときに、その移植体内で秩序ある細胞分化が可能な 、構築された環境を提供するものであるとよい。例えば、理論に縛られるのを望 む訳ではないが、いくつかの実施例では、多能性細胞は移植体内で集合を形成す ることができ、この集合において集合の中心近傍の細胞は未分化のままでありな がら、移植体の周辺にある細胞の分化を促進させる成長因子を分泌して標的組織 を生じさせるものであってもよい。 その他の考慮点には、マトリックス粒子の大きさ（以下に詳述）及びその粒子 の間隔がある。マトリックス粒子同士の間の間質性間隙は、特定の大型の細胞（ 例えば表皮細胞又はリンパ球）が移植体に侵入するのを防ぐには重要であろうと 考えられる。加えて、移植体の血管新生が望まれるようないくつかの実施例（例 えば標的組織種が硬骨又は筋肉である場合）では、移植体で血管新生形成が可能 なような充分な間質性間隙を提供するマトリックスを利用するのが好ましい（例 えば粒子間で７０−１００ミクロン）。反対に、血管新生は大きさ約７０ミクロ ン未満の間質性間隙では妨げられるために、血管新生が好ましくない、例えば軟 骨などの組織の形成には、より小型のマトリックス粒子及び／又はより密度の高 いマトリックスを使用することでより小型の間質性間隙の利用が可能となる。不活性マトリックスの形成 本発明の組成物には、本有機的形態の組成物にとって「足場」として機能する 不活性マトリックスが含まれる。本発明において利用するのに適した不活性マト リックスは概ね非免疫原性である、即ち、その不活性マトリックスが生きた被験 者に注射又は移植されたときに、炎症などの大きな免疫原性反応を引き起こさな いものである。適した不活性マトリックスは当業において公知であるが、例えば 不活性かつ非免疫原性の物質、例えばシリコン、テフロンや、脱灰された骨粉末 から得られたコラーゲン、の粒子がこれに含まれる。不活性マトリックスの製剤 は、好ましくは、以下に詳述するように（例えば注射による）操作が簡単であり ながら、生体内の標的部位に配置した後に移動に対して耐性があるような大きさ であるとよい。不活性マトリックスは好ましくは、細胞が成長してその移植体に 付着することが可能であるように充分柔軟なものであるとよい。 特に好適な不活性マトリックスは、硬骨粉末の脱灰による、硬骨を由来とする ものである。このような不活性マトリックスは数々の方法で調製が可能である。 不活性マトリックスを作成する二つの方法を下記の実施例１及び２に説明する。 概略的には、本方法は、キレート剤又は脱灰剤で硬骨を処理することで、好まし くはその硬骨中にあるコラーゲン繊維の三重らせん性を大きく破壊することなく 、硬骨から無機物を除去するステップを含む。三重らせんタイプＩコラーゲンの そ の他の供与体を本発明の組成物及び方法に利用することもできることは理解され よう。 ここで説明する方法で調製された、そして以下に説明する硬骨形成マトリック ス及び筋肉形成マトリックスの製剤にとって有用な不活性マトリックスはいくつ かの方法で特徴付けが可能である。好適な実施例では、この不活性マトリックス は脱灰された硬骨から調製され、マトリックス（ｗ／ｗ）の約１００ｍｇ／ｇｍ 未満、好ましくは約５０ｍｇ／ｇｍ未満、約２０ｍｇ／ｇｍ未満、約１０ｍｇ／ ｇｍ未満、又は約１ｍｇ／ｇｍ未満のカルシウム濃度を有する。 硬骨を脱灰するのに便利なキレート剤は当業において公知である。キレート剤 の例には、例えばＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、シトラート、等々を含む、Ｃａ（II）の キレート剤がある。硬骨、好ましくは粉砕された硬骨は、その硬骨からカルシウ ムを取り除くのに充分な量のキレート試薬で充分な時間、処理される。不活性マ トリックスに残留したカルシウムは、好ましくは、マトリックスに対し（ｗ／ｗ ）約１００ｍｇ／ｇｍ以下、より好ましくは約５０ｍｇ／ｇｍ未満、約２０ｍｇ ／ｇｍ未満、約１０ｍｇ／ｇｍ未満、又は約１ｍｇ／ｇｍ未満の量、存在すると よい。 希望に応じ、ホスファターゼや、その他当業者に公知の薬剤で処理することで 硬骨のリン酸塩濃度をさらに低下させてもよい。 粉砕されたマトリックスの抽出及び洗浄を繰り返し行うことで、カルシウム、 リン酸塩、及びその他の無機物の量を容認可能なレベルまで減らし、そして炎症 反応を起こしかねない何らかのマトリックス成分を除去することが有利である場 合が多い。下記の実施例で説明するように、マトリックスを繰返し及び／又は長 時間洗浄すると、低レベルの無機物を有する不活性で非免疫原性のマトリックス を作成する上で効果的である。 洗浄又は脱灰溶液には、必要に応じてマトリックス成分のたんぱく質分解を防 ぐためにプロテアーゼ阻害物質を含めてもよい。しかしながら、このようなプロ テアーゼ阻害物質は必要ではなく、プロテアーゼ阻害物質を使用せずとも充分に 活性な有機的形態の組成物を調製可能である。プロテアーゼ阻害物質のある実施 例では、このような阻害物質は一般的には、例えばメタロプロテアーゼ、セリン プロテアーゼ、システィンプロテアーゼ、カテプシン、及びホスファターゼなど の酵素を阻害するように選択されるであろう。酵素阻害物質の例には以下のもの がある。即ち、フェニルメチルスルホニルフッ化物、ベンザミジン（原語：benz amidine）、εアミノカプロン酸、β−安息香酸第二水銀、ピロリン酸塩、フッ 化ナトリウム、オルトバナジン酸ナトリウム、レバミゾール、及びペプスタチン Ａ（すべてミズーリ州セントルイス、シグマ・ケミカル社から入手可能）である 。 好適な実施例では、不活性マトリックスは少なくとも約８０重量パーセントの たんぱく質、より好ましくは少なくとも約８５重量パーセントのたんぱく質、よ り好ましくは少なくとも約９０重量パーセントのたんぱく質、そして最も好まし くは少なくとも約９５重量パーセントのたんぱく質を含む。 いくつかの好適な実施例では、マトリックスのうちの総たんぱく量は少なくと も約８０重量パーセントのコラーゲン、より好ましくは少なくとも約８５重量パ ーセントのコラーゲン、より好ましくは少なくとも約９０重量パーセントのコラ ーゲン、そして最も好ましくは少なくとも約９５重量パーセントのコラーゲンを 含む。 タイプＩ三重らせんコラーゲンの存在は、偏光顕微鏡下でコラーゲン試料を調 べることで検出が可能である。三重らせんコラーゲンはその不飽和状態を判断で きる顕著な複屈折を有する。従ってここで説明した方法に基づいて調製された不 活性マトリックス（又は有機的形態のマトリックス）は、この物質を偏光下で調 べれば、三重らせんコラーゲンの存在について検定が可能である。さらに、三重 らせんコラーゲンはゼラチナーゼにも耐性が高い。 好適な実施例では、本コラーゲンは概ね純粋なタイプＩコラーゲンである。純 粋なタイプＩコラーゲンのヒドロキシプロリン／プロリン比は約０．６である。 従って、この不活性マトリックスのたんぱく質のヒドロキシプロリン／プロリン 比は少なくとも約０．４、より好ましくは少なくとも約０．５０、そして最も好 ましくは少なくとも約０．５５である。 当該不活性マトリックスは好ましくは粒子状に調製されるとよい。好適な実施 例では、この粒子の大きさは、この不活性マトリックス粒子を針、例えば皮下針 、 例えば２８ゲージ針などを通じて注射できるような大きさとされる。このように 、好適な実施例では、当該粒子は平均直径で約２００ミクロン以下の大きさであ る。当該粒子は好ましくは被験者の体内における大幅な移動を防ぐような大きさ とされる。移動は、細胞が粒子を浸潤又は抱き込む能力を含め、いくつかの因子 の働きによる。細胞が粒子を抱き込めるかどうかは、粒子の「実質的大きさ」、 即ちその粒子が細胞又は組織細孔（例えば間質性間隙）を通過できるかどうかの 能力、に依存していることがある。このような細孔は帯電している可能性があり 、同じ電荷の粒子はこの細孔に反発されてしまうため、実質的大きさが大きくな る、即ち細孔（細胞又は組織細孔（間質性間隙）を通過する能力という点で障害 があることになろう。一般的には、約７５ミクロンより大きな粒子は移植後に移 動性とはならない。より小型の粒子、例えば約５０ミクロンから約７５ミクロン までの間の粒子は、その粒子が帯電している場合、特にその電荷が細胞又は組織 細孔の電荷と同じである場合には、移動性とはならないかも知れない。 あらゆる所望の大きさのマトリックス粒子をここで説明する方法に基づき、又 は当業において公知の方法に基づいて調製することができる。例えば、マトリッ クスの粉砕された粒子を、適した粒子寸になるまでどんどん目の細かくなるふる いにかけていってもよい。マトリックス材料は、不活性マトリックスの調製時の いかなる時点でもその大きさを調節することができる。便利なのは、キレート剤 による処理前に粒子をふるいにかけることである。硬骨からカルシウム及びその 他の無機物を取り除く工程は、全骨に比較して、硬骨をまず粒子に粉砕すればか なり高速に行える。 不活性マトリックスは好ましくは概ね非免疫原性であること、即ち、移植され たときに大きな炎症反応を起こさず、ホストの動物に拒絶されないものであると よい。重要なのは、本マトリックスをホストの動物とは異なる種から得られた硬 骨から調製した場合に、そのマトリックスが不活性かつ非免疫原性であることで ある。このように、不活性マトリックスは、例えばウシ硬骨など、被験者の種に 関係なく硬骨を容易に得られる供与体から調製することができる。当該不活性マ トリックスはさらに、そのマトリックスを単体で移植した場合（例えば成長因子 を何ら加えないマトリックス）には、移植後に何らかのきょう膜形成が見られる かも知れないが、何らかの組織の形成を大きく促進しない。当該不活性マトリッ クスはさらに好ましくは、テスト被験者において不活性マトリックス移植１年後 に大きさ及び質量が安定していることに証左されるように、長期間後も安定して いる（例えば再吸収されない）とよい。有機的形態の組成物の形成 有機的形態の組成物は好ましくは、不活性マトリックス、例えばここで説明し たような不活性マトリックス、を所定の標的組織の形成にとって適した細胞のレ クルートメント、成長、又は分化を促進する成長因子又はその他の物質で処理す ることで形成されるとよい。 このような因子は当業者にとって通常の技術であろう方法により不活性マトリ ックスに添加されてよい。例えば、以下に説明するように、本不活性マトリック スを成長因子の溶液又は懸濁液と攪拌して凍結乾燥させることで、成長因子を含 む乾燥マトリックスを提供してもよい。好適な実施例では、不活性マトリックス の基質に加えられる成長因子及びその他の物質をマトリックス内に物理的に捉え させるか、又はマトリックス内又はマトリックス上に吸収させるが、しかしマト リックスに共有結合はさせない。このように、例えば、共有結合ではなくイオン 及び疎水性相互作用などの相互作用を通じて成長因子をマトリックス内に固定す ることができる。硬骨形成組成物 ある一つの実施例では、被験者において硬骨の成長を促進するのに有用なマト リックスを、脱灰された硬骨、例えば上述した不活性マトリックスから調製する ことができる。例えば、硬骨（例えばほ乳類の硬骨、例えばウシ又はヒト硬骨） を試薬で処理することで、その硬骨中に存在するコラーゲン・マトリックスを大 きく変性させることなく硬骨を脱灰することができる。適切な抽出ステップ及び 洗浄ステップを選択すれば、以下に説明する検定法を利用して判定が可能である ように、被験者において新しい硬骨の形成にとって必要な成長因子を含んだマト リックスを提供することができる。あるいはその代わりに、硬骨形成マトリック スは、不活性の脱灰されたマトリックスに適した成長及び付着因子を加えること で、上記及び下記の実施例４に説明するように、不活性の脱灰されたマトリック スから調製することができる。 このように、以下に詳述するように、（例えばここで説明したようにキレート 剤で処理した後洗浄して不要な不純物を取り除くことで硬骨から調製された）不 活性マトリックスは例えばオステオポンチン、硬骨シャロたんぱく（ＢＳＰ）及 びヒアルロン酸（例えばターミン氏らの米国特許第５，３４０，９３４号及びそ こで引用された文献を参照されたい）などの硬骨成長因子で処理される。好適な 硬骨成長因子はオステオポンチンである。オステオポンチン（ＯＰＮ）はもとは 硬骨中で同定された細胞接着たんぱく質であるが、今ではその他の組織でも同様 に関連付けられている。オステオポンチンはＲＧＤ細胞結合配列を含んだリン酸 化グリコプロテインである。石灰化組織では、ＯＰＮは石灰化前に発現し、骨栄 養ホルモンの調節を受け、ヒドロキシアパタイトに結合し、破骨細胞及び骨芽細 胞の接着を高める。ＯＰＮの働きは正確には分かっていないが、骨前駆細胞を石 灰化部位へレクルートする際の関与と、バクテリア感染への防御への関与とがこ れに含まれる可能性がある（Butler WT,Connect.Tissue Res.23,123-136,1989） 。 その結果得られるマトリックスは硬骨の成長を生体内で促進することができる 。例えば骨形態発生たんぱく（ＢＭＰ）などのその他の骨成長因子も、硬骨の成 長を促進するために提供してもよい(例えばオッパーマン氏らの米国特許第５， ６７０，３３６号及びそこで引用された文献を参照されたい）。デコリン（原語 :decorin（ビグリカン（原語biglycan））などの更なる化合物も、新たに形成さ れた硬骨中の無機物の成長速度を調節するために本有機的形態の組成物に提供し てもよい。本有機的形態の組成物にトロンボスポンジンを加えると、希望に応じ て血管新生の速度を遅くすることができる。本発明において有用かも知れない成 長因子（例えばサイトカイン）に関するその他の文献としては、例えばレビン氏 の米国特許第５，６６７，８１０号及びそこで引用された文献を参照されたい。 理論に縛られるのを望むわけではないが、本発明の組成物による硬骨の形成は 、細胞が移植された組成物へ浸潤すること、その細胞が移植体のマトリックスに 付着すること、及びその細胞が融合（又は集合）して硬骨を形成することにより 、 進行するのではないかと考えられる。間葉細胞などの細胞の浸潤は、例えばここ で説明したように、硬骨成長を促進することが知られている因子が本組成物中に 存在することで促進可能である。このような細胞のマトリックスへの付着はまた 、適した因子の追加によっても促進が可能である。タイプＩコラーゲンは細胞の 付着にとって適した環境を提供し、従ってタイプＩコラーゲン（好ましくは概ね 精製された、非免疫原性のタイプＩコラーゲン）は硬骨形成有機的形態組成物に とって好適なマトリックスであると考えられる。細胞の融合は、以下に説明する ように、組成物中に適した因子（例えばヒアルロン酸（ＨＡ）又はグリコサミノ グリカン（ＧＡＧ）を利用すると促進することができる。ＨＡはまた、例えばマ トリックス粒子がＨＡの層で被膜された場合など、マトリックスの粒子同士の間 の間隙をさらに増加させるものと考えられる。またそれぞれのステップはそのス テップに特定の因子を加えることで促進してもよく、あるいは選択に応じ、ある 一つの因子に二つ以上の機能を提供させてもよいことは理解されよう。例えばオ ステオポンチンは細胞の移植体への誘因（浸潤）と、細胞のマトリックスへの付 着の両方を促進すると考えられる。好適な実施例では、本発明の硬骨形成組成物 は、細胞の浸潤、細胞のマトリックスへの付着、及び細胞融合を促進する一つ又 はそれ以上の因子を含む。硬骨の形成にはマクロファージが移植体に浸潤する必 要があると考えられるため、マクロファージの浸潤を許す移植体が好ましい。オ ステオポンチンはマクロファージの特異的レクルート物質であるため、硬骨形成 組成物は好ましくは、周囲の組織から移植体へマクロファージをレクルートする のに有効な量のオステオポンチンを含むとよい。 ある一つの実施例では、本不活性マトリックスはオステオポンチン、ＢＳＰ、 及びヒアルロン酸又はグリコサミノグリカンで処理される。マトリックスを緩衝 液中に懸濁させ、次に成長因子をこの緩衝液に加え、この懸濁液を凍結乾燥させ て乾燥マトリックスを生じさせてもよい。好適な実施例では、約０．０５％から 約０．５％（乾燥時ｗ／ｗ）の範囲、より好ましくは約０．１％ｗ／ｗのオステ オポンチンをマトリックスに加える。ＢＳＰをマトリックス懸濁液に加える場合 には、ＢＳＰは好ましくはマトリックスに約０．００１％から約０．１％（乾燥 時ｗ／ｗ）の範囲で、より好ましくは約０．０１％ｗ／ｗ、加えられるとよい。 興味深いことに、本組成物をオステオポンチンなしで作成した場合、硬骨の形成 はほとんど又は全く起きない。従って、オステオポンチンは好適な硬骨成長因子 である。ＢＳＰは好適ではあるが硬骨形成には必要ではない。しかしながら、Ｂ ＳＰ存在下では石灰化が速く行われる。 ヒアルロン酸（ＨＡ）又はグリコサミノグリカン（ＧＡＧ、例えばデルマタン 又はコンドロイチン硫酸）を用いると、組織形成につながるように表面を改質す ることができる。従って、本硬骨形成組成物は好ましくはＨＡを含むとよい。好 適な実施例では、ＨＡをマトリックスに約０．０５％から約０．５％（乾燥時ｗ ／ｗ）の範囲で、より好ましくは約０．１％ｗ／ｗ加える。同様に、ヒアルロン 酸に加えて、又はヒアルロン酸に替えてＧＡＧを用いる場合は、ＧＡＧ（又はＧ ＡＧｓ）をマトリックスに約０．０５％から約０．５％（乾燥時ｗ／ｗ）の範囲 で、より好ましくは約０．１％ｗ／ｗ、加えることができる。 本不活性マトリックスは被験者の体内に導入可能であり、そして上述の因子（ 即ちオステオポンチン、ＢＳＰ、及びＨＡ又はＧＡＧ）をその移植されたマトリ ックス内に導入（例えば注射により）することができることは理解されよう。有 機的形態の装置のこのような当該部位での形成は、例えば移植後の移植体の働き を最適にするなどして、その有機的形態の組成物を何らかの用途に適応させるの に適切である。さらに、下記の実施例は溶媒中に再懸濁させるのに適した材料を 生じるよう乾燥させた有機的形態のマトリックスの形成を説いたものであるが、 懸濁液としてのこの不活性マトリックスを、本有機的形態の組成物の機能にとっ て必要ないかなる因子とも、例えば生体外で組み合わせてもよく、また当該部位 で構築された組成物はここで述べたように注射又は移植されてもよい。 一般的には、本発明による硬骨形成組成物は移植後一日以内にマクロファージ により浸潤される。移植体の脈管形成は多くの場合約一週間で起き、その後浸潤 された移植体の石灰化が起きる。石灰化は約３週間後に起きてもよいが、石灰化 の時間的経過は移植体の組成に応じて様々に異なるかも知れない。例えば、オス テオポンチン、ＢＳＰ、及びＨＡを含む組成物は移植後、ＢＳＰを含まない同様 の組成物よりも速く石灰化することができる。軟骨形成組成物 軟骨組織の成長を促進する組成物は、硬骨形成組成物について上述した方法と 同様な方法により調製が可能であるが、その違いは、何ら硬骨形成因子を組成物 に加えない（又は概ね存在している）ことである。軟骨形成組成物は好ましくは 軟骨細胞の成長を促進するように調製されるとよい。軟骨形成移植体に好適なマ トリックスはタイプＩ又は、より好ましくはタイプIIコラーゲンである。上述し たように不活性マトリックスにＨＡ又はＧＡＧを加えると、被験者に移植したと きに軟骨の形成が促進されるような組成物が提供される。例えばＨＡを約０．５ から５．０ｍｇ／ｍｌの濃度で、又はＧＡＧを約０．１から１ｍｇ／ｍｌの濃度 で加えれば、軟骨形成を促進することができる。好適なＧＡＧはコンドロイチン 硫酸である。 概略的には、軟骨形成組成物は移植体中の脈管形成を避ける又は防ぐように調 製されることであろう。脈管形成が大きく行われると、最初に形成された軟骨組 織が硬骨に転化することがあるが、これは特定の用途で不利となる場合がある。 上述したように、脈管形成の阻害物質を加えたり、あるいは適当な大きさのマト リックス粒子を選択すると、脈管形成を遅くしたり又は阻害することが可能であ る。 本発明の組成物により形成される軟骨は繊維状軟骨でもよいが、より好ましく は硝子質の軟骨であるとよい。 上述の検定方法を用いると、特定の組成物が、移植したときに軟骨を形成する 働きを持つものかどうかを判定することができる。例えば、移植後一定期間、例 えば７日後に移植体の組織学的検査を行えば、軟骨質の組織の存在又は不存在が 明らかになるであろう。筋肉形成組成物 筋肉形成組成物は好ましくはタイプＩコラーゲンを不活性マトリックスとして 含むとよい。筋肉形成組成物は粉砕され脱灰された硬骨から調製が可能であるが 、このような硬骨は不活性マトリックスについて上述したように、かつ実施例１ 及び２で説明するように作成することができる。しかしながら、実施例１の手法 に 従う場合は、好適な調製法は最後の高い塩濃度（１ＭのＮａＣｌ）洗浄ステップ を省略したものである。マトリックスを下記のように処理して被験者に移植する 場合、高い塩濃度による洗浄を省略すると筋肉形成の働きが高いことが判明して いる。 今説明したように形成された不活性マトリックスを次に、例えば約０．１Ｎ から約２Ｎの濃度の鉱酸、例えばＨＣｌで約１時間から約４８時間の間、処理す る。ＨＣｌ以外の酸は筋肉形成組成物を生成するという点では効率がかなり低い ことが分かっている。当業者であれば、ここで提供する教示を参考にすればマト リックスのコラーゲンの三重らせん性を大きく劣化させることなく、本組成物の 筋肉形成作用につながるような適した条件を選択できることであろう。 酸処理ステップ後、結果得られた組成物を、例えば繰返し洗浄又は炭酸アンモ ニウムなどの塩基で中和して処理し、極微量の酸を取り除く。この材料をこうし て凍結乾燥させ、移植まで保管するか、又は中和後直接移植することができる。 理論に縛られるのを望むわけではないが、本不活性マトリックスを酸で処理す ることで、不活性マトリックス中に存在はするが活性を持たない内生の筋肉形成 因子が放出又は活性化されるであろうと考えられる。いくつかの実施例では筋肉 形成組成物には筋肉形態発生たんぱく質（例えばルーカス氏らの米国特許第５， ３２８，６９５号を参照されたい）などの成長因子を含めてもよいが、好適な実 施例では、筋肉形成組成物は外生の成長因子をまったく含まない。有機的形態の組成物の調製 有機的形態の組成物は、マトリックス粒子を薬学上容認可能な賦形剤中に懸濁 させた懸濁液として調製することができる。この賦形剤は、例えば水、エタノー ル、ポリオル（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチ レングリコール、等々）、適したその混合物、及び植物油を含んだ溶媒又は分散 媒質であってよい。適切な流動性は、例えばレシチンなどの被膜を用いる、懸濁 液の場合には必要となる粒子の大きさを維持する、及び界面活性剤を利用するな どして、維持することができる。微生物の活動を妨げるには、例えばパラベン、 クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、等々など、様 々 な抗菌及び抗真菌剤により行うことができる。多くの場合、例えば、糖、塩化ナ トリウム、又はマンニトール及びソルビトールなどの多価アルコールなどの等張 剤を組成物中に含めることが好ましいであろう。 あるいは選択に応じ、有機的形態の組成物をゲル、ペースト、バテ、準固形又 は固形として調製し、それを移植前に成形、形成、押し出し成形、又は加工して も、あるいは移植後に成形又は形成して、例えば組織欠陥部の所望の形状又は大 きさに合うようにしてもよい。 従って、有機的形態の組成物は標的部位で注射又は外科的移植術を行うことで 被験者の体内に導入可能である。本組成物は、体内の規定された空間又は空洞を 占めるよう（例えば組織を外科的に除去した後の空洞を満たすよう）に構築して もよく、あるいは定形又は不定型に関係なく、本組成物を配置しようとする空間 を満たすのに充分流動性のものにしてもよい。有機的形態の組成物の用途 本発明の有機的形態の組成物を、多種の組織の成長を促進すべく、被験者の体 内に移植又は注射することができる。このように、有機的形態の組成物は身体の 組織を修復、置換、又は増強する様々な手法において有用である。 例えば、硬骨形成用の有機的形態の組成物を用いて、外科的に変化させた硬骨 （例えば骨格の腫瘍除去後や抜歯後）の治癒を促進するため、又は、例えばペリ ドンテイテイス（原語：peridontitis）又は骨折（例えば非癒合骨折）の治癒を 促進したり、あるいは新しい骨格構造を形成させることができる。硬骨形成移植 体はこのように、現在自家硬骨移植が行われている数多くの用途において有用で ある。 同様に、筋肉形成用の有機的形態の組成物は、筋肉、例えば外科手術で除去さ れた又は事故で損傷した筋肉組織を置換するために用いることができる。軟骨を 形成する有機的形態の組成物は、外科的手法（例えば裂傷した軟骨の関節鏡によ る除去術）で取り除かれた軟骨や、例えば裂傷により損傷した軟骨など、軟骨の 置換又は修復に用いることができる。皮膚を形成する有機的形態の組成物は、外 傷の治癒や、例えば火傷の治癒を助けるためなどの皮膚の移植片への用途がある 。 有機的形態の組成物はさらに、例えば口唇の増大などの形成外科用途や、又は 例えば耳又は鼻などの軟骨質構造などの外科的再建にも有用であるかも知れない 。組成物の有機的形態的機能の検定 ある任意の組成物が、例えば有機的形態材料の調製における品質管理という点 で、有機的形態の組成物として機能を有しているかを判定できることは重要であ る。ある任意の組成物の機能は、当業者にとって通常の技術であろう検定法によ り容易に判定が可能である。 このように、例えば、有機的形態の組成物を実験動物に移植し、その移植され た組成物の効果を一回の時点又はそれ以上の時点で検定することで、その組成物 の生体内での効験を判定することができる。検定は、ここで述べたように、又は 公知の診断法、免疫学又は病理学に基づいて、生体内又は生体外で行ってよい。 例えば、硬骨形成用の有機的形態の組成物の検定は、マウスなどの実験動物に 皮下移植をすることで行うことができる。例えば２４時間又は１週間後など所定 の期間後にこの移植体を取り出して検定し、細胞の移植体への浸潤を調べてもよ い。例えば、移植体を中性のプロテアーゼ又はコラゲナーゼで分解させてコラー ゲン性マトリックスを崩壊させ、移植体に浸潤した細胞を放出させることができ る。放出された細胞を次に分類し、例えばＦＡＣを用いて計数すれば、移植体中 に存在する細胞の種類及び数を判定することができる。 あるいはその代わりに、病理学の研究室で通常行われるように、移植体を実験 動物から解剖により取り出し、切片に切断して顕微鏡による評価用に染色しても よい。 硬骨形成組成物は、一般にはマウスへの移植後一日以内にマクロファージによ る浸潤を受けるであろう。このように、硬骨形成組成物の機能を知るための適し たスクリーニング検定法は、本組成物をマウスに移植し、２４時間後にマクロフ ァージの浸潤についてこの移植体を調べることである。さらに、多くの場合欠陥 が約３週間後に移植体中に存在するので、この過程も顕微鏡下で容易に調べられ る。 実験動物における有機的形態の組成物の機能はまた、移植体を取り除くことな くその動物を調べても、検定が可能である。例えば、皮下移植体を単に触診して も、例えば硬骨形成用移植体の石灰化が起きたかどうかを判定するには充分なこ ともある。さらに、磁気共鳴画像法、骨格スキャン、又はＣＡＴスキャンなどの 技術を利用しても、本有機的形態の組成物の生体内における効果を調べることが できる。硬骨形成は、移植体の石灰化が起きさえすればＸ画像法で容易に観察で きる。 次に本発明をいくつかの非限定的な実施例と関連させて説明することとする。 実施例１：不活性マトリックスの調製：手法Ａ 軟骨及び／又は硬骨を洗浄し、液体窒素で冷却した粉砕機中で粉砕し、呼び寸 法２００ミクロンのふるいに通した後、呼び寸法１００ミクロンのふるいで採集 した。次にこの粒子を０．５ＭのＫＣｌを含むｐＨは８．２の氷温（０から４℃ ）のＨＥＰＥＳ緩衝液で４回、洗浄した（緩衝液Ａ）。１００ｇｍ（湿量）の硬 骨を、カルシウム濃度が約１００ｍｇ／ｇｍ硬骨未満となるまで、０．５ＭのＥ ＧＴＡを含むｐＨ８．２の予冷した（０から４℃）２０ｍＭの２℃の温度のＨＥ ＰＥＳ緩衝液４０００ｍｌを三回取り換えて脱灰した（緩衝液Ｂ）。次にこの硬 骨粒子を濾過、又は例えばＧＳＡロータなどで４０００×ｇで３０分間遠心分離 して採集した。次にこのペレットを、１ＭのＮａＣｌを含むｐＨ８．２のＨＥＰ ＥＳ緩衝液で三回洗浄し（緩衝液Ｃ）た後、緩衝液Ｃ中に再懸濁させ、４℃で一 晩攪拌した。このマトリックスを濾過により採集し、抽出し、緩衝液Ｃと共にも う２回、攪拌した。このマトリックスを採集して洗浄し、１Ｍの重炭酸アンモニ ウムを含むｐＨ８．２の２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（緩衝液Ｄ）中に懸濁させ 、４℃で一晩攪拌した。マトリックスを採集し、ｐＨ７．４の０．１Ｍの重炭酸 ナトリウム溶液で３回洗浄した。最後に、この湿性マトリックスを真空下で乾燥 させ、使用時まで−２０℃で保存した。 その結果得られた材料は概ね非免疫原性であり、分析すると以下の性質を有し ていた。 総たんぱく：８４重量パーセント 総コラーゲン：８０重量パーセント 総たんぱくのうちのパーセンテージで示したコラーゲン：９５．２パーセント 無機物：１２重量パーセント実施例２：不活性マトリックスの調製：手法Ｂ 不活性マトリックスを以下の手法により作成した。 実施例１のように調製した１００ｇｍの粉砕された硬骨を、０．２ＭのＥＤＴＡ を含む、２℃、ｐＨ８．２の５００ｍｌの冷却した緩衝液で９日間脱灰した。こ の緩衝液は３日毎に取り換えた。９日後、残ったマトリックスを採集し、カルシ ウム濃度が約２０ｍｇ／ｇｍマトリックス未満になるまで、ｐＨ５．２の０．２ Ｍのクエン酸ナトリウム５００ｍｌで抽出した。次に粒子を濾過により採集し、 １リットルの氷温の水で三回洗浄した。この湿性マトリックスを真空下で乾燥さ せ、−２０℃で保存した。 その結果得られた材料は概ね非免疫原性であり、分析すると以下の性質を有し ていた。 総たんぱく：９４重量パーセント 総コラーゲン：９６重量パーセント 総たんぱくのうちのパーセンテージで示したコラーゲン：１００パーセント 無機物：４重量パーセント実施例３：筋肉形成マトリックスの調製 脱灰されたマトリックスを、最後の高塩（１ＭのＮａＣｌ）による洗浄ステッ プまで、上述した実施例１に述べた方法により調製した。この時点で、マトリッ クスを１ＮのＨＣｌで４℃で一晩かけて抽出した。次にマトリックスを採集し、 残った酸を重炭酸アンモニウムで中和した。凍結乾燥の結果、乾燥マトリックス が得られたが、このマトリックスを使用時まで−２０℃で保存した。実施例４：硬骨形成マトリックスの調製 上述した実施例１で調製した不活性マトリックスを、０．１％（ｗ／ｗ）のオ ステオポンチン、０．０１％（ｗ／ｗ）の骨シャロたんぱく質及び０．１％（ｗ ／ｗ）の高分子量ヒアルロン酸を含んだ生理食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁させた。 この懸濁液を完全に乾燥させて乾燥マトリックスを生成し、この乾燥マトリック スを使用時まで−２０℃で保存した。 実施例２で調製した不活性マトリックスを同じ方法で処理し、同様の材料を得 た。実施例５：硬骨形成マトリックスによる生体内での硬骨の形成 実施例４の硬骨形成マトリックス（食塩水（ＰＢＳ）中に濃度２００ｍｇ／ｍ ｌになるように懸濁させた５０ｍｇのもの）を、生後４週のｃ５７ｂｌｋマウス の肩甲骨に皮下注射した。移植後１週、４週、又は６週でこの移植体を取り出し た。取り出された移植体を１％のホルムアルデヒドを含んだＰＢＳ中に固定し、 パラフィンに埋め込み、薄く切片にスライスした。この切片にヘマトキシリン及 びエオシンで染色をし、顕微鏡で４０倍、２００倍又は４００倍にして調べた。 対照のマウスには実施例２の不活性マトリックスを注射した。 移植された不活性マトリックスは、移植体の周りに薄いきょう膜を呈していた が、６カ月後の時点でも移植体への細胞の浸潤はほとんど見られなかった。この 不活性の移植体の大きさ及び質量はこの実験の過程全体を通じて大きな変化を見 せなかった。 対照的に、硬骨形成マトリックスの移植体では僅かに１週間後で間葉細胞及び マクロファージの急速な浸潤が見られた。硬骨形成マトリックスの移植体はさら に、移植体中で急速な脈管形成のあることが見られた（１週間後に可視となる） 。いくつか炎症性の小結節が見られたが、移植体は全身に及ぶ炎症反応を起こさ なかった。 注射後４週の時点での移植体を分析するために、硬骨形成マトリックスの移植 体を取り出し、スライス前にＪＢ４に移植し、フォン−コッサ（又はファストグ リーンカウンタ染色を用いたサフラニンＯ）で染色した。いくつかの移植体を、 パラフィンに埋め込む前３日間かけて１％のギ酸で脱灰した。４週目で移植体を フォン−コッサ染色したところ、移植体全体にわたって豊富に無機物が付着して いることが分かった。サフラニンＯ／ファストグリーンで染色された脱灰された 試料では、新たに形成された硬骨周辺に骨細胞が埋め込まれ、新たに形成された 硬骨内に骨芽細胞が存在することが見受けられた。高度に秩序だったコラーゲン 繊維が、未成熟な、発達の浅い新しい硬骨周辺に骨膜環を形成しているのが見ら れたかも知れない。実施例６：筋肉形成マトリックスによる生体内での筋肉の形成 実施例３の筋肉形成マトリックス（食塩水（ＰＢＳ）中に濃度２００ｍｇ／ｍ ｌに懸濁させたもの、５０ｍｇ）を生後４週のｃ５７ｂｌｋマウスの肩甲骨に皮 下注射した。移植後１週、２週、又は４週でこの移植体を取り出した。取り出さ れた移植体を１％のホルムアルデヒドを含んだＰＢＳ中に固定し、パラフィンに 埋め込み、薄く切片にスライスした。この切片にヘマトキシリン及びエオシンで 染色をし、顕微鏡で４０倍又は４００倍の倍率で調べた。 １週間後、筋細胞が移植体内に見られた。移植体全体にわたって未分化の間 葉細胞が多数含まれていた。２週間後、移植体の大部分が筋肉組織に置き換わっ ていた。Ｚバンドが数多くの細胞で可視であった。４週間後、筋肉組織は移植体 のマトリックス材料に完全に置き換わっていた。実施例７：硬骨形成マトリックスによる硬骨欠損の修復 本発明の硬骨形成組成物が、硬骨欠損を修復できるかどうかを、動物モデルを 用いて評価した。 硬骨欠損は、オスのスプレーグードーリー・ラットのあごに作られた。各動物 において、二カ所の１．０ｃｍの顎外下顎下切開を左右に行い、筋肉を含むムコ ペロテアル（原語：mucoperoteal）弁を持ち上げた。直径６．０ｍｍの二カ所の 円形の欠損を、円形バール及び低速の６．０ｍｍレフィン（原語：rephine）を 用い、無菌の食塩水で入念に潅注しながら作った。欠損はラムスの幅全体に延び ていた。 この欠損を四つの処理のうちの一つで無作為に処理した。第一群（対照）では 、外科的切開部分を硬骨欠損の処理をさらに施すことなく閉じた。第二群では、 硬 骨欠損部を、上述の実施例２で説明したように調製された不活性の非免疫原性硬 骨組成物で充填した。第三群では、ラットの自家移植片／同種異系移植片の硬骨 （遺伝子的に同一の同腹子から得られた）で硬骨欠損部を充填した。第四群では 、硬骨欠損部は上述した実施例４で調製された硬骨形成マトリックスで充填され た。すべての動物において、（あれば何らかの）処理後、筋肉片を再配置してク ロム性腸管縫合糸で縫合し、その上の皮膚をビクリルで縫合した。動物を犠牲に した後、下顎骨を取り除き、各欠損部について別々に分析するために切り分けた 。 処理後２週間の時点で犠牲にした動物の結果は以下の通りである。 未処理の対照下顎骨に大きな血腫があることが見られ、組織スライドで見る限 り、硬骨又は軟骨形成の証拠はまったくなかった。瘢痕組織及び／又は結合組織 の治癒が開始しているようであり、線維芽細胞の侵入も始まっていた。 不活性の非免疫原性硬骨組成物で処置した硬骨欠損部ではほとんど硬骨形成が なかった。移植体は細胞様であり、硬骨形成は移植体周辺部で開始していた。瘢 痕又は線維の治癒の証拠はなく、線維芽又は筋細胞の侵入もほとんど見受けられ なかった。 同種異系移植片の硬骨で処置した硬骨欠損部では、未成熟な硬骨形成が起きて いたことが分かり、移植体は高度に細胞様であった。新しい硬骨の形成が移植さ れた移植材料の周囲にあった。軟骨形成又は線維芽の侵入は見られなかった。 本発明による硬骨形成マトリックスで処置した硬骨欠損部では、硬骨の付加成 長を通じて広範な骨梁の形成が見られた。新しい硬骨を形成する細胞（骨芽細胞 ）が移植されたマトリックスに付着すると共に、マトリックス周囲の新しい硬骨 に滞積していた。さらに移植体の周辺から内部に向かって新しい硬骨の形成があ る証左もあった。この移植体は、対照処置の欠損部ほど細胞様でなかった。軟骨 形成の証拠は見られなかった。骨梁骨のいくつかの領域に、血管及び顕著な骨髄 空間のあることが見られた。 処置後４週で動物を犠牲にして更なる結果を得た。４週という時点では、本発 明による硬骨形成マトリックスで充填した欠損部は周りの硬骨からはさほど区別 がつかなかった。同種異系移植硬骨で処置した硬骨欠損部は、欠損の境界はまだ はっきりとは分かるがかなり成熟した硬骨形成を呈していた。不活性の非免疫原 性硬骨組成物で処置した硬骨欠損部には何らかの硬骨形成があったが、本発明の 硬骨形成マトリックスで見られたものより少なかった。未充填の欠損部では、ほ とんど又は全く硬骨形成が見られなかったが、結合組織により充填されていた。 この実験の結果から、本発明の硬骨形成組成物は硬骨欠損部において新たな硬 骨形成を提供できることが分かる。本発明による硬骨形成組成物は同種異系の硬 骨処置で見られる結果に等しい、又はそれより優れた結果をもたらしたと考えら れる。 本出願全体を通じて引用された全文献の内容を参考文献としてここに編入する 。 当業者であれば、ここで述べられた特定の手法に対する数多くの等価物を、ご く通常の実験を用いるのみで認識され、又は確認できることであろう。このよう な等価物は本発明の範囲内にあると見なされ、また以下の請求の範囲の包含する ところである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１２月３日（１９９８．１２．３） 【補正内容】 請求の範囲（翻訳文） １． 生きた被験者において、炎症を起こすことなく前記被験者の組織成長又は 修復を促進するための、注射可能で非免疫原性の組成物であって、 少なくとも約８０％のコラーゲンマトリックスと、 組織成長を促進するのに有効な量のオステオポンチン又は骨シャロたんぱくと を含む、組成物。 ２． ヒアルロン酸又は薬学上有効なその塩をさらに含む、請求項１に記載の組 成物。 ３． グリコサミノグリカンをさらに含む、請求項１に記載の組成物。 ４． 前記コラーゲンマトリックスが概ね純粋なタイプＩコラーゲンである、請 求項１、２、又は３に記載の組成物。 ５． 前記マトリックスが、生きた被験者に注射されたときに概ね非移動性であ る、請求項１、２、又は３に記載の組成物。 ６． 前記組成物が約７５ミクロンから約２００ミクロンまでの間の大きさの粒 子を含む、請求項１、２、又は３に記載の組成物。 ７． 前記組成物が少なくとも約８５重量パーセントのコラーゲンを含む、請求 項１、２、又は３に記載の組成物。 ８． 前記組成物が少なくとも約９０重量パーセントのコラーゲンを含む、請求 項１、２、又は３に記載の組成物。 ９． 走化性ペプチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。 １０． 成長因子の伸展ドメインをさらに含む、請求項１に記載の組成物。 １１． 薬学上容認可能な担体をさらに含む、請求項１、２、又は３に記載の組 成物。 １２． 組織成長又は修復を促進するための有機材料を調製する方法であって、 粉砕された硬骨を脱灰して、脱灰された有機マトリックスを提供するステップ と、 前記脱灰された有機マトリックスをヒアルロン酸又はグリコサミノグリカンで 処理して、組織成長又は修復を促進する有機材料を調製するステップと を含む、方法。 １３． 前記脱灰された硬骨マトリックスを、組織成長を促進するのに有効な量 の成長因子に接触させるステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。 １４． 前記脱灰された有機マトリックスが、約１から５重量パーセントのヒア ルロン酸又はグリコサミノグリカンで処理される、請求項１２に記載の方法。 １５． 前記成長因子が、オステオポンチン、骨形態発生たんぱく、及び骨シャ ロたんぱくのうちのいずれかから選択される、請求項１３に記載の方法。 １６． 粉砕された硬骨を脱灰する前記ステップが、前記粉砕された硬骨を少な くとも一つのキレート剤に接触させるステップを含む、請求項１２に記載の方法 。 １７． 請求項１２の方法により調製された、組織の成長又は修復を促進するた めの注射可能で非免疫原性の組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 アタラ アンソニー アメリカ合衆国 02193 マサチューセッ ツ州 ウェストン、ウェスタリーロード 74

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 標的の有機的形態型を調製するための非免疫原性マトリックスをプログラ ムする方法であって、 非免疫原性マトリックスを提供するステップと、 前記非免疫原性マトリックスを標的の有機的形態型にプログラムするための処 理ステップを選択するステップと、 前記標的の有機的形態型が調製されるよう、前記非免疫原性マトリックスを処 理するステップと を含む方法。 ２． 前記処理ステップが、前記標的の有機的形態型が軟骨形成組成物であるよ うに選択される、請求項１に記載の方法。 ３． 前記処理ステップが、前記標的の有機的形態型が硬骨形成組成物であるよ うに選択される、請求項１に記載の方法。 ４． 前記処理ステップが、前記標的の有機的形態型が筋肉形成組成物であるよ うに選択される、請求項１に記載の方法。 ５． 前記非免疫原性マトリックスが有機マトリックスである、請求項１に記載 の方法。 ６． 前記非免疫原性マトリックスを提供する前記ステップが、コラーゲン源を 脱灰することで、非免疫原性の脱灰された有機マトリックスを形成させるステッ プを含む、請求項５に記載の方法。 ７． 前記非免疫原性マトリックスを処理する前記ステップが、成長因子を前記 非免疫原性マトリックスに加えるステップを含む、請求項１に記載の方法。 ８． 組織の成長又は修復を促進するための有機材料を調製する方法であって、 粉砕された硬骨を脱灰して、脱灰された有機マトリックスを提供するステップ と、 前記脱灰された有機マトリックスをヒアルロン酸又はグリコサミノグリカンで 処理して、組織の成長又は修復を促進するための有機材料を調製するステップと を含む方法。 ９． 組織の成長又は修復を促進するための有機材料を調製する方法であって、 粉砕された硬骨を脱灰して、脱灰された有機マトリックスを提供するステップ と、 前記脱灰された有機マトリックスを、筋肉成長促進因子が活性化されるような 条件下で鉱酸で処理するステップと を含む方法。 １０． 前記脱灰された硬骨マトリックスを、組織の成長を促進するのに有効な 量の成長因子に接触させるステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。 １１． 前記脱灰された有機マトリックスが約１から５重量パーセントのヒアル ロン酸又はグリコサミノグリカンで処理される、請求項８に記載の方法。 １２． 前記成長因子が、オステオポンチン、硬骨形態発生たんぱく、及び骨シ ャロたんぱくのうちのいずれかから選択される、請求項１０に記載の方法。 １３． 粉砕された硬骨を脱灰する前記ステップが、前記粉砕された硬骨を少な くとも一つのキレート剤に接触させるステップを含む、請求項８に記載の方法。 １４． 組織の成長又は修復を促進するための注射可能な非免疫原性組成物であ って、 少なくとも約８０重量パーセントのコラーゲンマトリックスと、 組織の成長を促進するのに有効な量の成長因子と を含み、前記組成物が内生の成長因子を概ね含まない、組成物。 １５． ヒアルロン酸又は薬学上有効なその塩をさらに含む、請求項１３に記載 の組成物。 １６． 前記成長因子がオステオポンチンである、請求項１４に記載の組成物。 １７． 前記成長因子が骨シャロたんぱくである、請求項１４に記載の組成物。 １８． グリコサミノグリカンをさらに含む、請求項１４に記載の組成物。 １９． 前記コラーゲンマトリックスが概ね純粋なタイプＩコラーゲンである、 請求項１４に記載の組成物。 ２０． 前記マトリックスが、生きた被験者に注射されたときに概ね非移動性で ある、請求項１４に記載の組成物。 ２１． 前記組成物が、約７５ミクロンから約２００ミクロンの間の大きさの粒 子を含む、請求項１４に記載の組成物。 ２２． 前記組成物が少なくとも約８５重量パーセントのコラーゲンを含む、請 求項１４に記載の組成物。 ２３． 前記組成物が少なくとも約９０重量パーセントのコラーゲンを含む、請 求項２２に記載の組成物。 ２４． 生きた被験者において炎症を起こすことなく前記被験者の組織成長を促 進する方法であって、 前記被験者に、少なくとも約８０パーセントのコラーゲンマトリックスを含む 注射可能で非免疫原性の組成物と、 組織成長を促進するのに有効な量の成長因子とを 前記被験者において炎症を起こすことなく前記生きた被験者において組織成長 が促進されるように、注射するステップ を含む方法。 ２５． 筋肉の成長が促進される、請求項２４に記載の方法。 ２６． 硬骨の成長が促進される、請求項２４に記載の方法。 ２７． 軟骨の成長が促進される、請求項２４に記載の方法。 ２８． 間葉細胞の分化を促進する方法であって、 少なくとも約８０パーセントのコラーゲンマトリックスと、 組織成長を促進するのに有効な量の成長因子と を含む注射可能な非免疫原性組成物を含むマトリックスに、 前記間葉細胞が分化するような条件下で前記間葉細胞を 接触させるステップを含む、方法。 ２９． 請求項８の方法により調製された、組織の成長又は修復を促進するため の注射可能で非免疫原性の組成物。 ３０． 組織の成長又は修復を促進するための注射可能で非免疫原性の組成物と 、薬学上容認可能な担体とを含む製剤であって、前記注射可能で非免疫原性の組 成物が、 少なくとも約８０重量パーセントのコラーゲンマトリックスと、 組織の成長を促進するのに有効な量の成長因子と を含み、前記組成物が外生の成長因子を概ね含まない、製剤。 ３１． 間葉細胞の付着及び融合を促進するための方法であって、 間葉細胞を含む組織内に、マトリックスを、前記間葉細胞が前記マトリックス に付着して融合されるような条件下で移植するステップを含み、 前記マトリックスが、 間葉細胞を前記マトリックスに誘引する手段と、 間葉細胞を前記マトリックスに付着させる手段と、 問葉細胞の融合を促進する手段と を含む、方法。 ３２． 間葉細胞を前記マトリックスに誘引する前記手段が走化性ペプチドを含 む、請求項３１に記載の方法。 ３３． 間葉細胞を前記マトリックスに付着させる前記手段が成長因子の伸展ド メインを含む、請求項３１に記載の方法。 ３４． 間葉細胞の融合を促進する前記手段がヒアルロン酸又はグリコサミノグ リカンを含む、請求項３１に記載の方法。