JP5900691B1

JP5900691B1 - 多孔質複合体および骨再生材料

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Publication number: JP5900691B1
Application number: JP2015176454A
Authority: JP
Inventors: 敦史岩井
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2015-09-08
Filing date: 2015-09-08
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2035-09-08
Also published as: JP2017051326A

Abstract

【課題】優れたＯＣＰの均一分散性を有し、かつＯＣＰとコラーゲンが十分に混合されている多孔質複合体を提供することを目的とする。【解決手段】第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含む多孔質複合体であって、多孔質複合体の平面である５．０ｍｍ?５．０ｍｍの範囲を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で１５倍に拡大して得られた画像において、第８リン酸カルシウムの凝集粒子のフラクタル次元（Ｄ）が０．６０以上であり、ａ）第８リン酸カルシウムの凝集粒子からなる部分、ｂ）第８リン酸カルシウムの微粒子及びコラーゲンからなる部分、並びにｃ）コラーゲンからなる部分のうち、ｃ）コラーゲンからなる部分の面積割合が５％以下であることを特徴とする、多孔質複合体。【選択図】なし

Description

本発明は、多孔質複合体および多孔質複合体を含む骨再生材料に関する。

従来使用されている骨再生材料としては、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）などのリン酸カルシウムが知られている（例えば、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５参照）。

近年、ＨＡの前駆物質である第８リン酸カルシウム（Octacalcium phosphate、以下、「ＯＣＰ」という）は、ＨＡやβ−第３リン酸カルシウム（β−ＴＣＰ）等の他のリン酸カルシウムに比して、骨再生の促進作用が高く、生体内での吸収性も高いことが分かってきた（例えば、特許文献１参照）。このようにＯＣＰは、リン酸カルシウムの中でも骨再生材料として特に優れた特性を有している。

しかし、ＯＣＰは無機物であるために形状付与性に乏しい。このため、ＯＣＰ単独では、広範囲の骨欠損部の再生等への適用は難しい。そこで、ＯＣＰとコラーゲンとの複合体を骨再生材料として用いることが提案されている（例えば、特許文献１参照）。生体内に埋入されたＯＣＰによる骨再生過程では、ＯＣＰ顆粒を核（起点）として骨再生が起こることが知られている。

また、非特許文献１には、生体内に埋入したＯＣＰとコラーゲンとの複合体とコラーゲンのみの多孔質体との骨再生についての比較がなされており、コラーゲンのみの多孔質体では十分な骨再生が起こらないことが開示されている。

特開２００６−１６７４４５号公報特開２０１０−２７３８４７号公報特開２００３−２６０１２４号公報特開２００９−１３２６０１号公報特開２００５−２７９０７８号公報特開平５−０７０１１３号公報

ＴＩＳＳＵＥＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧＰａｒｔＡ誌１５巻１号２３〜３２ページ２００９年

ＯＣＰは生体内に埋入されると生体類似アパタイトに変換し、優れた骨伝導能（Osteoconduction）、すなわち骨組織に存在する骨芽細胞を活性化し骨形成を促すことが知られている。実際に体内において、埋入されたＯＣＰ自身が生体内吸収性を示して骨再生を促進することが報告されており、さらにはＯＣＰがＨＡと比較して前骨芽細胞から骨芽細胞への分化促進能を有することも報告されている。ＯＣＰとコラーゲンとの複合体からなる骨再生材料においても、ＯＣＰは前記同様、生体内吸収性を示した優れた骨再生促進及び骨芽細胞分化促進能を有する。

これまでＯＣＰとコラーゲンとを含む多孔質複合体において、ＯＣＰ凝集粒子の均一分散に着目した検討は行われていなかった。そこで本発明は、ＯＣＰとコラーゲンとを含む多孔質複合体において、ＯＣＰが大きな凝集を保持しつつ、均一分散している多孔質複合体及びそれを含む骨再生材料を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を鑑み鋭意検討したところ、ＯＣＰとコラーゲンとを含む多孔質複合体の製造工程におけるＯＣＰとコラーゲンの混合工程において、撹拌を所定の範囲に制御することにより、優れたＯＣＰの均一分散性を有し、かつＯＣＰとコラーゲンが十分に混合されている多孔質複合体を見出した。更なる検討と改良を重ね、以下に代表される発明を提供する。

［１］第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含む多孔質複合体であって、
多孔質複合体の平面である５．０ｍｍ×５．０ｍｍの範囲を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で１５倍に拡大して得られた画像において、第８リン酸カルシウムの凝集粒子のフラクタル次元（Ｄ）が０．６０以上であり、ａ）第８リン酸カルシウムの凝集粒子からなる部分、ｂ）第８リン酸カルシウムの微粒子及びコラーゲンからなる部分、並びにｃ）コラーゲンからなる部分のうち、ｃ）コラーゲンからなる部分の面積割合が５％以下であることを特徴とする、多孔質複合体。
［２］［１］に記載の多孔質複合体を含む骨再生材料。

本発明によれば、大きな粒径のＯＣＰの凝集粒子及びＯＣＰ微粒子が均一分散していることにより、多孔質複合体の不均一性に由来する骨伝導能のばらつきを抑制することができるとともに、長期にわたる優れたＯＣＰの骨再生促進の効果の持続を期待することができる。さらに、ＯＣＰが均一分散していることにより、多孔質複合体により高い圧縮弾性率（ヤング率）を付与することができ、加工性に優れ、かつ破損しにくい特性を持つ多孔質複合体、及びそれを含む骨再生材料を提供することができる。

実施例１における多孔質複合体のＳＥＭ観察画像である。比較例３における多孔質複合体のＳＥＭ観察画像である。実施例１におけるフラクタル次元および粒子割合の算出に用いた解析画像である。比較例３におけるフラクタル次元および粒子割合の算出に用いた解析画像である。実施例１についての圧縮弾性率測定における応力−ひずみ曲線を示すグラフである。

［多孔質複合体］
本発明の多孔質複合体は、第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含む多孔質の複合体（ＯＣＰ／コラーゲン複合体）である。本発明の多孔質複合体の好ましい態様は、コラーゲンが３次元のスポンジ状構造を形成しており、ＯＣＰの微小粒子が該スポンジ状構造中に存在するとともに、少なくとも１００μｍ以上の大きさのＯＣＰの凝集粒子が存在している多孔質複合体である。本発明の多孔質複合体からなる骨再生材料は、多孔質体構造によって、多孔質内部に骨芽細胞が進入し、新生骨の形成を促進する内部骨形成を実現している。

ＯＣＰ（Ｃａ_８Ｈ_２（ＰＯ_４）_６・５Ｈ_２Ｏ）は、種々公知の方法によって調製することができ、例えば、LeGerosの滴下法（LeGeros RZ，Calcif Tissue Int 37：194-197，1985）や特許文献６に開示される合成装置（三流管）を使用した方法などによって調製することができる。また、混合法によって調製することができ、具体的には、例えば、リン酸二水素ナトリウム水溶液と、酢酸カルシウム水溶液を適切な条件下で混合し、生成した沈殿物を回収することにより、ＯＣＰを得ることができる。沈殿物から得られたＯＣＰは、乾燥させ、電動ミル等を用い粉砕し、粒子状の粉体にして用いることが好ましい。粒径は１０〜１０００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは１００〜５００μｍに調製することが好ましく、さらに好ましくは３００〜５００μｍに調製することが好ましい。粒径は、ふるい分け法によりふるいの目開きのサイズによって分級することができる。

コラーゲンとしては、その由来、性状などは特に限定されず、種々のコラーゲンを使用することができる。好ましくは、蛋白分解酵素（例えばペプシン、プロナーゼ等）で可溶化することにより得られ、テロペプチドが除去されている酵素可溶化コラーゲンが使用される。コラーゲンのタイプとしては、繊維性コラーゲンであるＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型及びＩＶ型コラーゲンが好ましく、生体内に大量に含まれるＩ型コラーゲン、又はＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンの混合物が特に好ましい。原料としては、特に限定されないが、豚、牛などの皮膚、骨、腱等や魚のうろこなどに由来するコラーゲンを好ましく用いることができる。コラーゲンは生体由来成分であるので、安全性が高いという特長を有し、特に酵素可溶化コラーゲンはアレルゲン性も低く好ましい。上記のコラーゲンとしては、市販の製品を使用してもよい。

本発明の多孔質複合体において、ＯＣＰとコラーゲンの配合比は、所望する形状付与性、操作性、生体親和性などに応じて適宜調整することができる。コラーゲン１重量部に対するＯＣＰの配合比は、好ましくは０．５〜３５重量部、より好ましくは１〜２０重量部、更に好ましくは２〜１０重量部である。コラーゲン１に対してＯＣＰが０．５重量部未満であると、得られた複合体の骨再生機能が劣るおそれがあり、また３５重量部を超えると形状付与性が低下するおそれがある。

本発明は、多孔質複合体の平面である５．０ｍｍ×５．０ｍｍの範囲を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で１５倍に拡大して得られた画像において、ＯＣＰの凝集粒子のフラクタル次元（Ｄ）が０．７０以上であることを特徴とする。フラクタル次元（Ｄ）は０．７５以上であることがより好ましく、０．８０以上であることがさらに好ましい。フラクタル次元（Ｄ）が大きいほどＯＣＰ凝集粒子の分散状態が良好であることを示す。具体的には以下のように算出する。

（多孔質複合体のＳＥＭ画像）
多孔質複合体の平面である少なくとも５．０ｍｍ×５．０ｍｍの正方形の範囲が含まれるよう、多孔質複合体の断面写真を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮影する。この際の撮影条件は、加速電圧１５．０ｋＶ、低真空（３０Ｐａ）、後方散乱電子検出、ＷｏｒｋｉｎｇＤｉｓｔａｎｃｅ（ＷＤ）４０ｍｍ、倍率１５倍である。多孔質複合体が外表面に少なくとも５．０ｍｍ×５．０ｍｍの平面を有する場合、その表面を撮影することができる。撮影する５．０ｍｍ×５．０ｍｍの平面は多孔質複合体の断面であってもよく、その場合は多孔質複合体の平滑切断面の表面を撮影することができる。撮影面にはコーティング等が施されていないことが望ましく、例えば多孔質複合体の外表面にコーティングがある場合には、撮影面にコーティング層が含まれないよう切断した断面を撮影する。サンプルの厚みは一定であることが好ましく、サンプルの破れが生じたりしないよう、少なくとも０．５ｍｍ以上であることが好ましい。サンプルは、多孔質複合体を５．０ｍｍ×５．０ｍｍにカットしてから撮影に供することもできるが、好ましくは、少なくとも５．０ｍｍ×５．０ｍｍの正方形の範囲を含む大きさのサンプルを作製してＳＥＭで撮影し、その後撮影画像において５．０ｍｍ×５．０ｍｍの範囲を指定することができる。

（フラクタル次元（Ｄ））
フラクタル次元（Ｄ）は下記の方法により算出する。下に示すすべての画像処理は画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪ（Ｖｅｒ．１．４８以降）を用いて行う。
（１）５．０ｍｍ×５．０ｍｍの正方形の範囲を指定したＳＥＭ画像（以下、本段落において「解析画像」という。）をＩｍａｇｅＪに取り込む。
（２）解析画像を二値化（閾値：９０ｐｉｘｅｌ）する。
（３）色調を反転させる。
（４）解析画像をそれぞれｎ^２分割（ｎ＝２、３、４、５）する。
（５）ｎ^２分割した解析画像の各区画について、各区画の面積に対するＯＣＰ凝集粒子の占める面積分率を算出する。
（６）ｎ^２分割した解析画像について、各区画すべての面積分率の平均値（μ_ｎ）および標準偏差（σ_ｎ）を算出する。
（７）Ｄ（ｎ）を下式により算出する。
Ｄ（ｎ）＝σ_ｎ／μ_ｎ
（８）Ｄ（ｎ）と１／ｎを両対数グラフにプロットし、近似直線（累乗近似）の傾きを求める。
（９）近似直線の傾きに−１を乗じ、フラクタル次元（Ｄ）を算出する。

なお、（４）の作業は（２）の前に行ってもよい。（４）の作業はWindows（登録商標）PaintなどＩｍａｇｅＪ以外の画像処理ソフトにより行うことができる。また、ＳＥＭ画像の色調の具合により（２）の二値化ができない場合、もしくはＯＣＰ凝集粒子以外の部分がＯＣＰ凝集粒子の部分と混同されてしまう場合、まず、ＳＥＭ画像においてＯＣＰ凝集粒子の部分のみを黒色で塗りつぶし、その他の部分を白色とするか、もしくはＯＣＰ凝集粒子の部分のみを白色と塗りつぶし、その他の部分を黒色とすることができる。その後ＩｍａｇｅＪに取り込み、（２）以降の作業を行う。予めＯＣＰ凝集粒子の部分のみを黒色で塗りつぶし、その他の部分を白色とした場合、（３）の色調を反転させる作業は不要である。

フラクタル次元（Ｄ）が０．７０未満であると、多孔質複合体を適用した部位における均一な骨伝導能が成されない恐れがあり、さらにＯＣＰの緩効性が期待できない可能性がある。特に数週間から数か月の骨再生に有する期間の間、骨伝導能を継続的に促すためにも、ＯＣＰがすぐに消失しない大きな凝集粒子が均一に存在することが重要であると考えられる。ＯＣＰはまた、多孔質複合体におけるコラーゲンの骨格構造において強度を補強する役目を担っており、後述するとおり、ＯＣＰ凝集粒子のフラクタル次元が低くなると、圧縮弾性率が低下する。圧縮弾性率が低いと、骨欠損部への充填の際の操作容易性が劣る結果となり、さらに本発明の多孔質複合体を骨欠損部に充填する際に、前記複合体が崩壊してしまったり、気孔が潰れてしまったりすると、その後の骨再生に悪影響を与えることになる。

（コラーゲンからなる部分の面積割合）
本発明の多孔質複合体は、平面である５．０ｍｍ×５．０ｍｍの範囲を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で１５倍に拡大して得られた画像において、ａ）ＯＣＰの凝集粒子からなる部分、ｂ）ＯＣＰの微粒子及びコラーゲンからなる部分、並びにｃ）コラーゲンからなる部分のうち、ｃ）コラーゲンからなる部分の面積割合が５％以下であることを特徴とする。

本発明の多孔質複合体の好ましい態様は、ａ）ＯＣＰの凝集粒子からなる部分、ｂ）ＯＣＰ及びコラーゲンからなる部分、並びにｃ）コラーゲンからなる部分から構成される。このうち、ａ）ＯＣＰの凝集粒子からなる部分とは、リン酸カルシウムが凝集しており、１５倍に拡大したＳＥＭ画像において目視で粒子状物が確認できる部分である。通常ＳＥＭ画像においては、白色に近い色で表現される。元素分析を行った場合、カルシウムＣａとリンＰが多く検出される。ｂ）ＯＣＰの微粒子及びコラーゲンからなる部分とは、コラーゲンのスポンジ状構造の中に、ＯＣＰの１００μｍ未満のような微小粒子が混在している状態の部分であり、ＯＣＰの微粒子は１５倍に拡大したＳＥＭ画像において目視で確認することが困難である。通常ＳＥＭ画像においては、ａ）ＯＣＰの凝集粒子からなる部分よりは明度が下がり、灰色〜白色で表現される。元素分析を行った場合、炭素Ｃ、カルシウムＣａ及びリンＰが検出される。ｃ）コラーゲンからなる部分とは、コラーゲンのスポンジ状構造の中に、ＯＣＰの微粒子がわずかしか存在しないか、あるいは全く存在しない状態の部分をいう。通常ＳＥＭ画像においては、黒色に近い暗色で表現される。元素分析を行った場合、炭素Ｃが検出されるが、カルシウムＣａとリンＰはほとんど検出されない。

コラーゲンからなる部分の面積割合は下記の方法により求める。
（１）５．０ｍｍ×５．０ｍｍの正方形の範囲を指定したＳＥＭ画像（以下、本段落において「解析画像」という。）をＩｍａｇｅＪに取り込む。
（２）解析画像を二値化（閾値：９０ｐｉｘｅｌ）する。
（３）コラーゲンからなる部分を抽出する。
（４）コラーゲン部分面積（Ｓ_ｃ）を算出する。
（５）解析画像の面積（Ｓ_Ａ）を算出する。
（６）コラーゲンからなる部分の面積割合（Ｒ_ｃ）を下式により算出する。
Ｒ_ｃ＝Ｓ_ｃ／Ｓ_Ａ×１００

なお、ＳＥＭ画像の色調の具合により（２）の二値化ができない場合、もしくはコラーゲンからなる部分がコラーゲンからなる部分以外と混同されてしまう場合、まず、ＳＥＭ画像においてコラーゲンからなる部分のみを黒色で塗りつぶし、その他の部分を白色とするか、もしくはコラーゲンからなる部分のみを白色と塗りつぶし、その他の部分を黒色とすることができる。その後ＩｍａｇｅＪに取り込み、（２）以降の作業を行う。予めコラーゲンからなる部分のみを白色で塗りつぶし、その他の部分を黒色とした場合、（２）と（３）のプロセスの間に色調を反転させる作業が必要である。

解析画像全体において、コラーゲンからなる部分の面積は５％以下が好ましく、４％以下がより好ましく、３％以下がさらに好ましい。コラーゲンからなる部分が５％より大きくなると、多孔質複合体の構造が不均一となり、骨伝導能が低下する可能性がある。さらに、コラーゲンからなる部分が５％より大きくなると圧縮弾性率が大きく低下する。

さらに、本発明において、ＯＣＰの凝集粒子全体における３００μｍ以上の長さを有する凝集粒子の面積割合が７５％以上であることが好ましい。好ましくは８５％以上であり、より好ましくは９５％以上である。ここで、ＯＣＰの凝集粒子全体とは、上述のＳＥＭ画像において、目視で確認できるすべての粒子状物が占める面積の合計をいう。３００μｍ以上の長さを有するとは、前記ＳＥＭ画像において、各凝集粒子の輪郭に接する最長間隔の平行線間の距離が３００μｍ以上であることをいう。

具体的には下記の方法により算出する。
（１）５．０ｍｍ×５．０ｍｍの正方形の範囲を指定したＳＥＭ画像（以下、本段落において「解析画像」という。）をＩｍａｇｅＪに取り込む。
（２）解析画像を二値化（閾値：９０ｐｉｘｅｌ）する。
（３）色調を反転させる。
（４）ＯＣＰ凝集粒子全体の面積を求める。
（５）３００μｍ以上の長さを有するＯＣＰ凝集粒子を抽出する。
（６）ＯＣＰ凝集粒子全体の面積（Ｓ_ｗ）および３００μｍ以上のＯＣＰ凝集粒子の面積（Ｓ_ｄ）から、３００μｍ以上のＯＣＰ凝集粒子の割合（Ｒ_ｄ）を下式により算出する
Ｒ_ｄ＝Ｓ_ｄ／Ｓ_ｗ×１００

なお、ＳＥＭ画像の色調の具合により（２）の二値化ができない場合、もしくはＯＣＰ凝集粒子以外の部分がＯＣＰ凝集粒子の部分と混同されてしまう場合、まず、ＳＥＭ画像においてＯＣＰ凝集粒子の部分のみを黒色で塗りつぶし、その他の部分を白色とするか、もしくはＯＣＰ凝集粒子の部分のみを白色と塗りつぶし、その他の部分を黒色とすることができる。その後ＩｍａｇｅＪに取り込み、（２）以降の作業を行う。予めＯＣＰ凝集粒子の部分のみを黒色で塗りつぶし、その他の部分を白色とした場合、（３）の色調を反転させる作業は不要である。

本発明の多孔質複合体は、圧縮弾性率が好ましくは０．０５ＭＰａ以上であり、より好ましくは０．０８〜０．３０ＭＰａ、更に好ましくは０．１０〜０．２０ＭＰａである。圧縮強度が０．０５ＭＰａ未満である場合、多孔質複合体の操作性が低下する傾向がある。すなわち、本発明の多孔質複合体を骨欠損部に充填する際に、前記複合体が崩壊してしまったり、気孔が潰れてしまったりすると、その後の骨再生に悪影響を与えることになる。上限は特に定められるものではないが、骨欠損部への充填の際の操作容易性の観点から、０．３０ＭＰａ以下であることが好ましい。

本発明における圧縮弾性率は下記の方法により測定される。
（圧縮弾性率測定）
温度：２５℃、湿度：６５％の環境下、直径８．５ｍｍ、長さ１５ｍｍの円柱状試料をリン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１４Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に３０分間浸漬する。その後、試料表面の水気を軽く拭い、精密万能試験機（オートグラフＡＧＳ−Ｊ、株式会社島津製作所製、ロードセル容量：１ｋＮ）を用いて、単軸荷重を負荷する。具体的には、サンプルを長辺が下方圧盤（材質：ステンレス、内径：１００ｍｍ、厚さ：２５ｍｍ）に対し垂直となるようにセットした後、上方圧盤（材質：ステンレス、内径：１００ｍｍ、厚さ：２５ｍｍ）を１０ｍｍ／ｍｉｎの速度で下げ、サンプルが８０％歪んだところで試験機を止める。そして、得られた応力−ひずみ曲線の初期直線部分の傾きから圧縮弾性率を求める。

本発明の多孔質複合体は、多孔質複合体の気孔径が３〜４０μｍであることが好ましい。気孔径が４０μｍを超える場合、多孔質複合体の強度が低下する傾向がある。一方、気孔径が３μｍ未満である場合、骨芽細胞等の骨代謝系細胞の侵入が起こり難くなり、骨再生の促進作用が低下する恐れがある。本発明の多孔質複合体のより好ましい気孔径は５〜２０μｍである。

気孔径は水銀ポロシメーター（Mercury porosimeter)による細孔分布測定を用いて測定し、具体的には以下の方法により測定される。
（気孔径測定）
前処理として、サンプルを１２０℃で４時間恒温乾燥する。前処理後の各サンプルについて、以下の測定装置を用いた水銀圧入法により、以下の条件で細孔径０．００１８〜２００μｍの細孔分布を求める。
測定装置：オートポアＩＶ９５２０（ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）
測定条件：サンプルと水銀の接触角：１４０ｄｅｇ
水銀の表面張力０．４８Ｎ／ｍ（１ｄｙｎｅ＝１０^−５Ｎで換算）。
発明における気孔径とは、水銀圧入法による測定圧力から得られた細孔分布曲線において、最も大きな面積を有するピークの極大値を示す細孔径の値である。

多孔質複合体の気孔率（空隙率）は８０〜９９％であることが好ましく、より好ましくは８５〜９８％である。気孔率は水銀圧入法による全細孔容積と見かけ密度を用いて下記の式により求められる。
気孔率(％)= 全細孔容積／｛（１／見かけ密度）＋全細孔容積｝×１００

本発明の多孔質複合体の形状は、直方体（ブロック体）、円筒体もしくはタブレット状、又は顆粒であることが好ましい。直方体である場合の大きさは５ｍｍ×５ｍｍ×５ｍｍ以上の大きさが好ましく、一般に上限は１００ｍｍ×１００ｍｍ×１００ｍｍ以内の範囲であることが好ましい。直方体は立方体に限られない。円筒状である場合の大きさは、直径が５〜５０ｍｍであることが好ましく、高さは１〜５０ｍｍの範囲であることが好ましい。顆粒状である場合、形状は球体に限られず不定形でもよいが、直径が０．１〜１０ｍｍであることが好ましい。

本発明の多孔質複合体は骨欠損部に補填することにより使用されるが、骨欠損部に十分な血液もしくは体液が認められる場合には、多孔質複合体をそのまま、もしくは適当な形状に切断し補填することができる。骨欠損部に十分な血液等が認められない、又は多孔質複合体を元の形状で補填できない場合は、多孔質複合体を血液もしくは生理食塩水等に浸漬し、多孔質複合体がスポンジ状の弾力性を示すことを確認した上で骨欠損部に補填することができる。

［多孔質複合体の製造方法］
本発明の多孔質複合体の製造方法は、ＯＣＰとコラーゲンを混合する製造方法が好ましく、下記のような製造方法を用いることができる。

（１）まず、濃度を０．１〜５重量％、ｐＨを７〜８に調整し、ゲル化したコラーゲン溶液にＯＣＰを添加し、混練してＯＣＰとコラーゲンの混合物を作製する。（２）次いで、当該混合物を適当な型に加えて成型し、凍結し、凍結乾燥することにより複合体を得る。（３）得られた当該複合体は、必要に応じて、熱脱水架橋処理を施し、更に、慣用の滅菌法（例えば、γ線照射、電子線照射、エチレンオキサイドガス等）により滅菌する。

ここで、コラーゲンとＯＣＰを混練する工程において、従来十分に混練することが必要であることが当業者の一致する認識であったところ、驚くべきことに本発明者は、混練を十分に行うことが、逆にフラクタル次元や３００μｍ以上の粒子割合を低下させる原因になることを見出した。混練する工程は、２〜４枚のプロペラ型やパドル型等の撹拌翼（impeller）を有する攪拌機や自転・公転ミキサーを用いることができるが、撹拌翼を有する攪拌機の場合、１００〜３００ｒｐｍで１５〜３００秒間撹拌することが好ましく、１００〜３００ｒｐｍで３０〜１２０秒間撹拌することがより好ましい。自転・公転ミキサーを用いる場合、５００〜１５００ｒｐｍで３０〜３００秒撹拌することが好ましく、５００〜１５００ｒｐｍで４５〜１２０秒撹拌することがより好ましい。コラーゲンとＯＣＰを混練する工程は薬さじ等をもちいて手作業で行うこともできるが、この場合も、一定速度で３０〜１２０秒間撹拌することが好ましく、速度に応じて適宜撹拌時間を調整することが好ましい。

本発明の多孔質複合体の製造方法は、ＯＣＰとコラーゲンとを含むゲル、ゾルまたは液体を液体冷媒に浸漬し急速凍結した後、凍結乾燥する工程を含むことが好ましい。液体冷媒は、第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含むゲル、ゾルまたは液体の凍結温度より低い温度の液体であり、例えば、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、液体窒素が挙げられる。該液体冷媒の温度は、好ましくは−２０℃以下であり、より好ましくは−４０℃以下であり、さらに好ましくは−８０℃以下である。

第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含むゲル、ゾルまたは液体を液体冷媒浸漬によって急速に凍結させることにより、得られる多孔質複合体の気孔径を小さくすることができると考えられる。

本発明の多孔質複合体は、熱処理もしくは熱脱水架橋処理が施されていることが好ましい。熱処理により、ＯＣＰ分子構造の一部が崩れて骨形成系細胞の侵入が起こり易くなり、骨再生が促進されると共に、コラーゲンが架橋して形状保持力が向上する。

熱処理の温度は、好ましくは５０〜２００℃、より好ましくは６０〜１８０℃である。また、熱処理は、減圧条件下で行うことが好ましい。圧力は、好ましくは０〜３０００Ｐａ、より好ましくは０〜３００Ｐａである。熱処理の処理時間は、好ましくは２時間〜１０日間、より好ましくは１２時間〜５日間である。

本発明の多孔質複合体は、ＯＣＰおよびコラーゲンの他に、例えば、骨形成能を有するサイトカイン(bone morphogenetic protein-2、transforming growth factor β１など)を含有していてもよく、係るサイトカインを含有させることにより、骨再生速度を速めることができる。

本発明の多孔質複合体は、それ以外にも、この分野で慣用の配合成分を含ませることができる。かかる配合成分としては、例えば、生体吸収性高分子（ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリエチレングリコール共重合体等）、ＯＣＰ以外の生体吸収性リン酸カルシウム（β−ＴＣＰ等）や非吸収性リン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイト等）を挙げることができる。

［骨再生材料］
本発明は、さらに上記の多孔質複合体を含む骨再生材料に関する。骨再生材料は歯科口腔外科領域、整形外科領域における骨欠損修復、開頭、開胸術後の骨欠損修復などに用いることができる。例えば、歯科口腔外科領域においては、歯周病、嚢胞腔、萎縮歯槽堤、顎裂部、抜歯窩等により生じた骨欠損に対し、多孔質複合体からなる骨再生材料を補填することにより、数週間から数ヶ月には優れた骨再生効果が確認できる。整形外科領域においては、例えば骨腫瘍切除後の骨欠損、骨折等外傷により生じた骨欠損に対し、本骨再生材料を骨欠損部に補填し、骨再生を促進することができる。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（実施例１）
（１）ＯＣＰの調製
まず、ＯＣＰ調製用の１液および２液を次の通り調製した。
［１液］リン酸二水素ナトリウム二水和物３１．２ｇを蒸留水２５００ｇに溶解し、１液を調製した。
［２液］酢酸カルシウム一水和物３５．２ｇを蒸留水２５００ｇに溶解し、２液を調製した。

次に、１液をセパラブルフラスコに入れ、マントルヒーターにて７０℃に昇温した。次に、撹拌機（東京理化器械社製、ＭＡＺＥＬＡＺ）に撹拌翼（羽径１２ｃｍ）を取り付け、２５０ｒｐｍの速度で撹拌しながら、１液に対して２液を約２８ｍＬ／ｍｉｎの速度で滴下した。滴下終了後、１液と２液の混合液を７０℃、２５０ｒｐｍでさらに２時間撹拌した。

次に、上記混合液中に生成した沈殿物をメンブレンフィルター（孔径３μｍ、アドバンテック東洋社製、Ａ３００Ａ２９３Ｃ）を用いてろ過し、回収した。回収した沈殿物を蒸留水１５００ｍＬに分散させ、１５分間撹拌し洗浄した。同様のろ過、洗浄の工程をさらに３回繰り返した。

次に、洗浄後の沈殿物を、恒温乾燥機を用いて３０℃で２４時間乾燥した。乾燥後の沈殿物を電動ミルにて粉砕した後、ふるいを用いて粒径を３００〜５００μｍに分級し、粉体を得た。最後に、得られた粉体に対して１２０℃で２時間の乾熱滅菌を行った。

（２）ＯＣＰ／コラーゲン複合体（多孔質複合体）の調製
Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンを含むブタ真皮由来コラーゲン（日本ハム社製、ＮＭＰコラーゲンＰＳ）１重量部を４℃に冷却した蒸留水２００重量部に溶解し、約０．５重量％のコラーゲン溶液を得た。液温を４℃に保ちながらコラーゲン水溶液に水酸化ナトリウム水溶液を加え、ｐＨを約７．４に調整しコラーゲン懸濁液を得た。次いで、得られたコラーゲン懸濁液を遠心瓶に入れ、遠心分離機（トミー精工社製、ＧＲＸ−２５０）を用い７０００×ｇの遠心力で２０分間遠心した後、コラーゲン懸濁液中のコラーゲンが３重量％となるように上清を廃棄しコラーゲンゲルを得た。

次に、コラーゲンゲルにＯＣＰ（粒径３００〜５００μｍ）をＯＣＰとコラーゲンが重量比で７７：２３となるように加えた後、撹拌翼（相互理化学硝子製作所社製、４枚羽根、羽径７ｃｍ）を取り付けた撹拌機（東京理化器械社製、ＭＡＺＥＬＡＺ）を用いて、３００ｒｐｍの回転速度で６０秒混合し、ＯＣＰ／コラーゲン複合ゲルを得た。これを円柱状の内部空間を有するプラスチック容器（内径８．５ｍｍ、容積約３．０ｃｍ^３）に入れて、２３０×ｇの遠心力で１分間遠心して脱泡した。

容器を密閉し、被凍結体の容積に対して大過剰の−８０℃に冷却したメタノールに浸漬して急速に凍結した。容器を開栓した後、凍結体を凍結乾燥機により乾燥（−１０℃、４８時間）させ成形した。次いで、これを減圧下、１５０℃で２４時間加熱し熱脱水架橋を行った。得られた円柱体はメスで厚さ１．５ｍｍまたは１５ｍｍにカットした。最後に、電子線を照射（１５ｋＧｙ）し、滅菌を行った。このようにして、実施例１の多孔質複合体を得た。

（実施例２）
実施例２では、コラーゲンゲルとＯＣＰの混合の際に、撹拌翼を取り付けた撹拌機を用い、３００ｒｐｍの回転速度で３００秒混合した。それ以外は実施例１と同じ方法により多孔質複合体を得た。

（実施例３）
実施例３では、コラーゲンゲルとＯＣＰの混合の際に、自転公転ミキサー（シンキー社製、あわとり練太郎ＡＲＥ−３１０）を用い、１０００ｒｐｍの回転速度で６０秒混合した。それ以外は実施例１と同じ方法により多孔質複合体を得た。

（比較例１）
比較例１では、コラーゲンゲルとＯＣＰの混合の際に、撹拌翼を取り付けた撹拌機を用い、１００ｒｐｍの回転速度で１５秒混合した。それ以外は実施例１と同じ方法により多孔質複合体を得た。

（比較例２）
比較例２では、コラーゲンゲルとＯＣＰの混合の際に、撹拌翼を取り付けた撹拌機を用い、３００ｒｐｍの回転速度で９００秒混合した。それ以外は実施例１と同じ方法により多孔質複合体を得た。

（比較例３）
コラーゲンゲルとＯＣＰの混合の際に、自転公転ミキサーを用い、３００ｒｐｍの回転速度で１５秒混合した。それ以外は実施例１と同じ方法により多孔質複合体を得た。

（比較例４）
コラーゲンゲルとＯＣＰの混合の際に、自転公転ミキサーを用い、２０００ｒｐｍの回転速度で９００秒混合した。それ以外は実施例１と同じ方法により多孔質複合体を得た。

（画像解析）
画像解析は、１．５ｍｍ厚にカットした試料の断面を以下の条件にて観察したＳＥＭ画像について行った。解析範囲は試料の断面上任意の１辺約５ｍｍの正方形内（以下、解析画像）を解析に用いた。
測定装置：ＳＵ１５１０、日立製作所社製
測定条件：加速電圧１５ｋＶ
低真空（３０Ｐａ）
反射電子観察
ＷＤ４０ｍｍ
倍率１５倍

（フラクタル次元）
ＯＣＰ粒子のコラーゲンマトリックス上への分散度合を定量化するために、フラクタル次元（Ｄ）を用いた。フラクタル次元（Ｄ）の算出は以下の手順で行った。なお、下に示すすべての画像処理は画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪを用いて行った。
１．解析画像の取得
２．解析画像を二値化（閾値：９０ｐｉｘｅｌ）
３．色調の反転
４．解析画像をｎ^２分割（ｎ＝２、３、４、５）
５．各区画について、ＯＣＰ粒子を示す画像の面積分率を算出
６．各分割水準毎の面積分率の平均値（μ_ｎ）および標準偏差（σ_ｎ）を算出
７．Ｄ（ｎ）を下式により算出
Ｄ（ｎ）＝σ_ｎ／μ_ｎ
８．Ｄ（ｎ）と１／ｎを両対数グラフにプロットし、近似直線の傾きを求める
９．近似直線の傾きに−１を乗じ、フラクタル次元（Ｄ）を算出

（コラーゲン部分割合）
ＯＣＰとコラーゲンゲルの混合が十分かを評価する指標として、コラーゲン部分割合を解析画像から算出した。コラーゲン部分割合の算出は、以下の手順で行った。
１．解析画像の取得
２．解析画像を二値化（閾値：９０ｐｉｘｅｌ）
３．コラーゲン部分の抽出
４．コラーゲン部分面積（Ｓ_ｃ）の算出
５．解析画像面積（Ｓ_Ａ）の算出
６．コラーゲン部分面積割合（Ｒ_ｃ）を下式により算出
Ｒ_ｃ＝Ｓ_ｃ／Ｓ_Ａ×１００

（３００μｍ以上のＯＣＰ粒子割合）
３００μｍ以上のＯＣＰ粒子割合を以下の手順にて算出した。
１．解析画像の取得
２．解析画像を二値化（閾値：９０ｐｉｘｅｌ）
３．色調の反転
４．粒子径の計測
５．３００μｍ以上のＯＣＰ粒子の抽出
６．全粒子面積（Ｓ_ｗ）および３００μｍ以上のＯＣＰ粒子面積（Ｓ_ｄ）の算出
７．３００μｍ以上のＯＣＰ粒子割合（Ｒ_ｄ）を下式により算出
Ｒ_ｄ＝Ｓ_ｄ／Ｓ_ｗ×１００
なお、本測定における粒子径とは、各凝集粒子の輪郭に接する最長間隔の平行線間の距離が３００μｍ以上として定義した。

（圧縮弾性率測定）
温度：２５℃、湿度：６５％の環境下、直径８．５ｍｍ、長さ１５ｍｍの円柱状試料をリン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１４Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に３０分間浸漬した。その後、試料表面の水気を軽く拭い、精密万能試験機（オートグラフＡＧＳ−Ｊ、株式会社島津製作所製、ロードセル容量：１ｋＮ）を用いて、単軸荷重を負荷した。具体的には、サンプルを長辺が下方圧盤（材質：ステンレス、内径：１００ｍｍ、厚さ：２５ｍｍ）に対し垂直となるようにセットした後、上方圧盤（材質：ステンレス、内径：１００ｍｍ、厚さ：２５ｍｍ）を１０ｍｍ／ｍｉｎの速度で下げ、サンプルが８０％歪んだところで試験機を止めた。そして、得られた応力−ひずみ曲線の初期直線部分の傾きから圧縮弾性率を求めた。

（気孔率測定）
上記実施例１〜３並びに比較例１〜４で得られた直径８．５ｍｍ、厚さ１．５ｍｍの円柱状（タブレット状）のサンプルについて、気孔率を以下のようにして測定した。

前処理として、サンプルを１２０℃で４時間恒温乾燥した。前処理後の各サンプルについて、以下の測定装置を用いた水銀圧入法により、以下の条件で細孔直径０．００３６〜２００μｍの細孔分布を求めた。
測定装置：オートポアＩＶ９５２０（ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）
測定条件：サンプルと水銀の接触角：１４０ｄｅｇ
水銀の表面張力０．４８Ｎ／ｍ（１ｄｙｎｅ＝１０^−５Ｎで換算）。

気孔率は水銀圧入法による全細孔容積と見かけ密度を用いて下記の式により求められる。
気孔率(％)= 全細孔容積／｛（１／見かけ密度）＋全細孔容積｝×１００

上記実施例および比較例についてのフラクタル次元、コラーゲン部分割合、気孔率および圧縮弾性率の測定結果を表１に示す。

表１に示される結果から、実施例１〜３のサンプル（多孔質複合体）は、フラクタル次元が０．７以上かつコラーゲン部分割合が３％以下であり、ＯＣＰ粒子が均一分散し、かつ十分な混合が達成されていた。
比較例１のサンプルは、フラクタル次元が０．７以上でＯＣＰ粒子の均一分散性は良好であるが、やや撹拌が不足していたため、コラーゲン部分割合が１１％と十分な混合が達成されていなかった。
比較例２および比較例４のサンプルは、コラーゲンのみの部分は存在しておらず、十分な混合が達成されていたが、意外なことに過度の撹拌によりＯＣＰ粒子はディスク外周部に偏在しており、フラクタル次元は０．７以下と低い値であった。
比較例３のサンプルは、フラクタル次元が０．５３と低く、かつコラーゲン部分割合が４５％と非常に高い結果となった。これらの結果から、この撹拌条件では明らかに撹拌不足であると考えられた。

また、実施例１〜３のサンプルの圧縮弾性率は約０．１ＭＰａと比較例１〜４のサンプルの１．６〜３．１倍高い値となった。これは、実施例１〜３においてＯＣＰ粒子が複合体全体に均一分散し、かつＯＣＰとコラーゲンが十分に混合されていない部分が少ないため、ＯＣＰ粒子が複合体中で補強材として効率的に機能したためと考えられる。

今回開示された実施形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

本発明の多孔質複合体及びそれを含む骨再生材料は、高い骨再生能を有し、かつ適度な機械的強度を有することから、主に歯科口腔外科領域、整形外科領域における骨欠損修復に有用である。

Claims

第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含む多孔質複合体であって、
多孔質複合体の平面である５．０ｍｍ×５．０ｍｍの範囲を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で１５倍に拡大して得られた画像において、第８リン酸カルシウムの凝集粒子のフラクタル次元（Ｄ）が０．７０以上であり、ａ）第８リン酸カルシウムの凝集粒子からなる部分、ｂ）第８リン酸カルシウムの微粒子及びコラーゲンからなる部分、並びにｃ）コラーゲンからなる部分のうち、ｃ）コラーゲンからなる部分の面積割合が５％以下であることを特徴とする、多孔質複合体。
請求項１に記載の多孔質複合体を含む骨再生材料。