TWI611804B

TWI611804B - 多孔質複合體及骨頭再生材料

Info

Publication number: TWI611804B
Application number: TW105128939A
Authority: TW
Inventors: 岩井敦史; Atsushi Iwai
Original assignee: 東洋紡股份有限公司; Toyobo Co., Ltd.
Priority date: 2015-09-08
Filing date: 2016-09-07
Publication date: 2018-01-21
Also published as: EP3348286A8; TW201716071A; EP3348286A1; US10512709B2; EP3348286A4; WO2017043498A1; US20190038801A1

Abstract

本發明的目的在於提供一種具有優異的OCP的均勻分散性且OCP與膠原蛋白被充分地混合之多孔質複合體以及含有該多孔質複合體之骨頭再生材料。

本發明的多孔質複合體係含有第八磷酸鈣與膠原蛋白；在將多孔質複合體的平面之5.0mm×5.0mm的範圍以掃描型電子顯微鏡擴大15倍所得之影像中，第八磷酸鈣的凝集粒子的分形維數為0.70以上；在由：a)第八磷酸鈣的凝集粒子所構成的部分、b)第八磷酸鈣的微粒子與膠原蛋白所構成的部分與c)膠原蛋白所構成的部分之中，c)膠原蛋白所構成的部分的面積比率為5%以下。

Description

多孔質複合體及骨頭再生材料

本發明係關於一種多孔質複合體(porous composite)以及含有多孔質複合體之骨頭再生材料。

作為以往所使用之骨頭再生材料，已知例如羥基磷灰石(hydroxyapatite；HA)等的磷酸鈣(參照專利文獻2、專利文獻3、專利文獻4、專利文獻5)。

近年來，已知HA的前驅物質即第八磷酸鈣(Octacalcium phosphate，以下稱「OCP」)相較於HA或β-磷酸三鈣(Beta-tricalcium phosphate；β-TCP)等其它的磷酸鈣而言，其骨頭再生的促進作用高，於活體內的吸收性亦高(參照專利文獻1)。如此，即便在磷酸鈣中，OCP作為骨頭再生材料亦具有特別優異的特性。

然而，由於OCP為無機物而缺乏賦形性。因此，僅有OCP的話是難以適用至廣範圍的骨缺損部的再生等。因此，提案有將OCP與膠原蛋白的複合體作為骨頭再生材料而使用(參照專利文獻1)。

非專利文獻1及非專利文獻2中，分別揭示了在狗及人中將OCP與膠原蛋白的複合體作為骨頭再生材料的有效性，作為骨頭再生材料的OCP與膠原蛋白的複合體的研究中專門使用粒子徑為300μm至500μm的OCP粒子。

另外，非專利文獻3中，對於活體內埋入了OCP與膠原蛋白的複合體與僅有膠原蛋白的多孔質體的骨頭再生作比較，揭示了僅有膠原蛋白的多孔質體無法產生充分的骨頭再生。

[先前技術文獻] [專利文獻]

專利文獻1：日本特開2006-167445號公報。

專利文獻2：日本特開2010-273847號公報。

專利文獻3：日本特開2003-260124號公報。

專利文獻4：日本特開2009-132601號公報。

專利文獻5：日本特開2005-279078號公報。

專利文獻6：日本特開平5-070113號公報。

[非專利文獻]

非專利文獻1：Clinical Implant Dentistry and Related Research誌13卷2號112至123頁2011年。

非專利文獻2：TISSUE ENGINEERING PartA誌20卷 7-8號1336至1341頁2014年。

非專利文獻3：TISSUE ENGINEERING PartA誌15卷1號23至32頁2009年。

已知若OCP埋入活體內會轉換為類似活體的磷灰石，有優異的骨傳導性(Osteoconduction)，亦即活化存在於骨組織中的成骨細胞(osteoblast)而促進骨形成。報告指出實際上在體內所埋入之OCP自身可顯示活體內吸收性而促進骨頭再生，而且報告亦指出OCP相較於HA具有將前成骨細胞(preosteoblast)分化至成骨細胞的分化促進性。即使在OCP與膠原蛋白的複合體所構成之骨頭再生材料中，如前所述，OCP顯示活體內吸收性而具有優異的骨頭再生促進以及成骨細胞分化促進性。然而，雖然取決於骨缺損部的部位、尺寸、形狀等而有不同，但骨頭再生具有由數週至數個月的相對長的期間。因此，為了長期地顯示骨傳導性，賦予OCP緩效性被認為是重要的。

至今含有OCP與膠原的多孔質複合體中，未曾著眼進行研究OCP的凝集粒子與均勻分散之間的關係。因此，本發明的目的，係在含有OCP與膠原蛋白之多孔質複合體中，提供一種多孔質複合體以及含有該多孔質複合體之骨頭再生材料，可一面保持OCP之大的凝集，一面均勻分散。

有鑑於上述課題，本發明人致力於研究的結果，發現在含有OCP與膠原蛋白之多孔質複合體的製造步驟之OCP與膠原蛋白的混合步驟中，藉由將攪拌控制於預定的範圍內，可得到具有優異之OCP的均勻分散性且OCP與膠原蛋白被充分地混合之多孔質複合體。經不斷地進一步研究與改良，可提供如以下所表示之發明。

[1]一種多孔質複合體，係含有第八磷酸鈣與膠原蛋白。

將多孔質複合體的平面之5.0mm×5.0mm的範圍以掃描型電子顯微鏡(scanning electron microscope；SEM)擴大15倍所得之影像中，第八磷酸鈣的凝集粒子的分形維數(D)為0.70以上；以及a)第八磷酸鈣的凝集粒子所構成的部分、b)第八磷酸鈣的微粒子與膠原蛋白所構成的部分與c)膠原蛋白所構成的部分之中，c)膠原蛋白所構成的部分的面積比率為5%以下。

[2]一種多孔質複合體，係含有第八磷酸鈣與膠原蛋白。

將多孔質複合體的平面之5.0mm×5.0mm的範圍以掃描型電子顯微鏡(SEM)擴大15倍所得之影像中，第八磷酸鈣的凝集粒子的分形維數(D)為0.60以上，且第八磷酸鈣的凝集粒子全體中之具有300μm以上的長度之凝集粒子的面積比率為75%以上；以及a)第八磷酸鈣的凝集粒子所構成的部分、b)第八磷酸鈣的微粒子與膠原蛋白所構成的部分與c)膠原蛋白所構成的部分之中，c)膠原蛋白所構成的部分的面積比率為5%以下。

[3]如[1]或[2]任一項所記載之多孔質複合體，其壓縮彈性模數為0.08MPa以上。

[4]一種骨頭再生材料，其含有如[1]至[3]中任一項所記載之多孔質複合體。

根據本發明，藉由將大粒徑的OCP凝集粒子以及OCP微粒進行均勻分散，可期望其抑制源自於多孔質複合體的非均勻性之骨傳導性的不均，且長期地持續優異之OCP的骨頭再生促進的效果。再者，藉由OCP之均勻分散，可賦予多孔質複合體更高的壓縮彈性模數(楊氏模數)，可提供具有優異加工性且不易破損之特性之多孔質複合體以及含有該多孔質複合體之骨頭再生材料。

圖1是實施例1中的多孔質複合體的SEM觀察影像。

圖2是比較例3中的多孔質複合體的SEM觀察影像。

圖3是用於算出實施例1中分形維數以及粒子比率的分析影像。

圖4是用於算出比較例3中分形維數以及粒子比率的分析影像。

圖5是表示實施例1中壓縮彈性模數測定中應力應變曲線(stress-strain curve)之圖表。

圖6是將實施例1中以多孔質複合體處理的骨缺損部位經染色之組織標本。上方為皮膚側，下方為腦硬膜側。

圖7是將實施例2中以多孔質複合體處理的骨缺損部位經染色之組織標本。上方為皮膚側，下方為腦硬膜側。

圖8是將比較例3中以多孔質複合體處理的骨缺損部位經染色之組織標本。上方為皮膚側，下方為腦硬膜側。

圖9是將比較例3中以多孔質複合體處理的骨缺損部位經染色之組織標本。上方為皮膚側，下方為腦硬膜側。

圖10是將比較例4中以多孔質複合體處理的骨缺損部位經染色之組織標本。上方為皮膚側，下方為腦硬膜側。

[多孔質複合體]

本發明的多孔質複合體係一種含有第八磷酸鈣與膠原蛋白之多孔質的複合體(OCP/膠原蛋白複合體)。本發明的多孔質複合體的態樣，較佳係該多孔質複合體為膠原蛋白形成3維的海綿狀結構，OCP的微小粒子存在於該海綿狀結構中且存在有至少100μm以上尺寸的OCP的凝集粒子。本發明的多孔質複合體所構成之骨頭再生材料，係藉由多孔質體結構，使成骨細胞進入多孔質內部而實現促進新生骨頭的形成之內部骨形成。

OCP(Ca₈H₂(PO₄)₆‧5H₂O)係可藉由各種習知方法而調製，例如LeGeros的滴加法(LeGeros RZ,Calcif Tissue Int 37：194-197,1985)或藉由專利文獻6所揭示之使用合成裝置(三流管)之方法等而調製。此外，可藉由混合法而調製，具體而言，例如將磷酸二氫鈉水溶液與乙酸鈣水溶液於合適的條件下混合，回收所生成的沉澱物，藉此獲得OCP。由沉澱物所獲得之OCP係較佳經乾燥並使用電動研磨機等粉碎而作成粒子狀的粉體使用。粒徑的範圍較佳為10μm至1000μm，更佳為調製至100μm至500μm，進一步更佳為調製至300μm至500μm。粒徑可藉由篩分法而由網目的尺寸來分級。

作為膠原蛋白，其來源、性質等並沒有特別的限制，可使用各種的膠原蛋白。較佳為使用酵素可溶性膠原蛋白，該酵素可溶性膠原蛋白係以蛋白分解酵素(例如胃蛋白酶、鏈蛋白酶等)溶解而獲得，且端肽被除去。膠原蛋白的類型，較佳為屬於纖維狀膠原蛋白的I型膠原蛋白、II型膠原蛋白、III型膠原蛋白以及IV型膠原蛋白，尤佳為活體內所大量含有之I型膠原蛋白、或I型膠原蛋白以及III型膠原蛋白的混合物。作為原料，雖沒有特別限制，但較佳可使用源自豬、牛等的皮膚、骨頭、筋等或源自魚鱗等的膠原蛋白。因為膠原蛋白是源自生物的成分，具有高安全性的優點，特別是酵素可溶性膠原蛋白係致敏性低而較佳。作為上述的膠原蛋白，亦可使用市售的製品。

在本發明的多孔質複合體中，可依據期望的賦形性、操作性、活體親和性等而適當調整OCP與膠原蛋白的調配比。相對於膠原蛋白1重量分，OCP的調配比較佳為0.5重量分至35重量分，更佳為1重量分至20重量分，又更佳為2重量分至10重量分。相對於膠原蛋白1重量分，當OCP的調配比小於0.5重量分時，則所得之複合體的骨頭再生機能可能劣化，此外，當OCP的調配比率超過35重量分，則所得之複合體的賦形性可能降低。

本發明的特徵在於，將多孔質複合體的平面之5.0mm×5.0mm的範圍以掃描型電子顯微鏡(SEM)擴大15倍所得之影像中，OCP的凝集粒子的分形維數(D)為0.60以上。分形維數(D)較佳為0.70以上，更佳為0.80以上。當分形維數(D)越大，所顯示之OCP凝集粒子的分散狀態越良好。

當分形維數(D)小於0.60，則多孔質複合體所適用之部位中可能不具有均勻的骨傳導性，且可能無法期待其OCP的緩效性。特別是在骨頭再生所需要的由數星期至數月的的期間之間，為了持續地促進骨傳導性，均勻地存在有OCP不會立即消失之大的凝集粒子被認為是重要的。OCP亦可發揮增強多孔質複合體中膠原蛋白的骨架結構之強度的作用，如後所述，當OCP凝集粒子的分形維數變低，則壓縮彈性模數下降。當壓縮彈性模數低的情況下，結果導致充填至骨缺損部分時的操作容易性劣化，更且，將本發明的多孔質複合體充填至骨缺損部分時，若前述複合體崩塌或氣孔發生塌陷，則對之後的骨頭再生有不利的影響。具體而言，分形維數(D)係以如下的方式所計算。

(多孔質複合體的SEM影像)

以含有多孔質複合體的平面即至少含有之5.0mm×5.0mm的正方形的範圍的方式，以掃描型電子顯微鏡(SEM)對多孔質複合體進行剖面照片的拍攝。此時的拍攝條件為加速電壓15.0kV、低真空(30Pa)、背向散射電子檢測、作業距離(Working Distance；WD)40mm、倍率為15倍。當多孔質複合體的外表面具有至少5.0mm×5.0mm的平面的情況下，可對該表面進行拍攝。拍攝的5.0mm×5.0mm的平面亦可為多孔質複合體的剖面，此情況下可以對多孔質複合體的平滑切割面進行拍攝。較佳為拍攝面未施加塗層等，例如當多孔質複合體的外表面有塗層的情況下，以拍攝面未含有塗層的方式對剖面進行拍攝。，樣品的厚度較佳為恒定以使樣品不產生破裂，較佳為至少0.5mm以上。樣品雖亦可將多孔質複合體切割為5.0mm×5.0mm再供以拍攝，較佳可為製作至少含有5.0mm×5.0mm的正方形的範圍之尺寸的樣品而以SEM作拍攝，之後在拍攝影像中指定5.0mm×5.0mm的範圍。

(分形維數(D))

分形維數(D)係藉由以下方法計算。下述所有的影像處理皆是使用影像處理軟體ImageJ(Ver.1.48以後版本)來進行。

(1)將經指定5.0mm×5.0mm的正方形的範圍之SEM影像(以下本段落中稱為「分析影像」)讀入至ImageJ。

(2)將分析影像進行二值化(閾值：90pixel)。

(3)將色調反轉。

(4)將分析影像各自進行n²分割(n=2、3、4、5)。

(5)對於經n²分割之分析影像的各分區計算相對於各分區的面積中OCP凝集粒子所佔有的面積分率。

(6)對於經n²分割之分析影像計算各分區所有的面積分率的平均值(μ_n)及標準偏差(σ_n)。

(7)藉由下式計算D(n)。

D(n)=σ_n/μ_n

(8)將D(n)及1/n繪製於雙對數圖中，求得近似直線(power approximation，冪近似)的斜率。

(9)將近似直線的斜率乘以-1而計算分形維數(D)。

另外，(4)的操作亦可於(2)之前進行。(4)的操作可藉由Windows Paint等ImageJ以外的影像處理軟體而進行。此外，若有因SEM影像的色調的程度而無法進行(2)的二值化的情況下，或是OCP凝集粒子以外的部分與OCP凝集粒子的部分混淆的情況下，首先，可僅將SEM影像中 OCP凝集粒子的部分以黑色塗滿而將其他部分作為白色，或是僅將OCP凝集粒子的部分以白色塗滿而將其他部分作為黑色。之後讀入至ImageJ，進行(2)以後的操作。若預先僅將OCP凝集粒子的部分以黑色塗滿而將其他部分作為白色的情況下，則不需要(3)的將色調反轉的操作。

(OCP的凝集粒子的比率)

本發明的多孔質複合體，係將多孔質複合體的平面之5.0mm×5.0mm的範圍以掃描型電子顯微鏡(SEM)擴大15倍所得之影像中，設總面積為1，OCP的凝集粒子所佔有的面積分率較佳為0.05以上0.40以下。更佳為0.10以上0.30以下，又更佳為0.15以上0.25以下。OCP的凝集粒子的面積分率係可從於前述分形維數(D)的計算過程中所計算出對於各分區的面積OCP凝集粒子所佔有的面積分率求得。

(300μm以上的凝集粒子的比率)

本發明係較佳於OCP的凝集粒子整體中具有300μm以上的長度之凝集粒子的面積比率為75%以上。較佳為85%以上，更佳為90%。300μm以上的相對大的OCP的凝集粒子以預定比率以上存在，藉此可持續地促進長期間的骨傳導性，且發揮多孔質複合體中膠原蛋白的骨架結構的強度的補強之重要的作用。在此，所謂OCP的凝集粒子整體係指上述SEM影像中可以目視確認之所有粒子狀物質所佔有面積的合計。所謂具有300μm以上的長度係指前述SEM影像中相切於各凝集粒子的輪廓之最長間隔的平行線間的距離為300μm以上。

具體來說，可藉由下述的方法來計算。

(2)將分析影像進行二值化(閾值：90pixel)。

(3)將色調反轉。

(4)求出OCP凝集粒子整體的面積。

(5)抽取具有300μm以上的長度之OCP凝集粒子。

(6)依據OCP凝集粒子整體的面積(S_w)及300μm以上的OCP凝集粒子的面積(S_d)，以下式計算300μm以上的OCP凝集粒子的比率(R_d)。

R_d=S_d/S_w×100

另外，在若因SEM影像的色調的程度而無法進行(2)的二值化的情況下，或是OCP凝集粒子以外的部分與OCP凝集粒子的部分混淆的情況下，首先，可僅將SEM影像中OCP凝集粒子的部分以黑色塗滿而將其他部分作為白色，或是僅將OCP凝集粒子的部分以白色塗滿而將其他部分作為黑色。之後讀入至ImageJ，進行(2)以後的操作。若預先僅將OCP凝集粒子的部分以黑色塗滿而將其他部分作為白色的情況下，則不需要(3)的將色調反轉的操作。

(由膠原蛋白構成部分的面積比率)

本發明的多孔質複合體，係較佳為將平面之5.0mm×5.0mm的範圍以掃描型電子顯微鏡(SEM)擴大15倍所得之影像中，a)OCP的凝集粒子所構成的部分、b)OCP的微粒子與膠原蛋白所構成的部分與c)膠原蛋白所構成的部分之中，c)膠原蛋白所構成的部分的面積比率為5%以下。

本發明的多孔質複合體的較佳態樣，係由：a)OCP的凝集粒子所構成的部分、b)OCP的微粒子與膠原蛋白所構成的部分與c)膠原蛋白所構成的部分所構成。其中，所謂a)OCP的凝集粒子所構成的部分，係由磷酸鈣所凝集，於擴大15倍之SEM影像中可以目視確認粒子狀物的部分。通常SEM影像中係以接近白色的顏色所表示。當進行元素分析的情況下，較多檢測出鈣(Ca)及磷(P)。所謂b)OCP的微粒子與膠原蛋白所構成的部分，係指於膠原蛋白的海綿狀結構中混合有如OCP的100μm以下的微小粒子之狀態的部分，而於擴大15倍之SEM影像中以目視確認OCP的微粒子是困難的。通常SEM影像中，由於亮度較a)OCP的凝集粒子所構成的部分下降，而以灰色至白色表示。當進行元素分析的情況下，檢測出碳(C)、鈣(Ca)及磷(P)。所謂c)膠原蛋白所構成的部分，係指於膠原蛋白的海綿狀結構中僅存在些微或是完全不存在OCP的微粒子的狀態的部分。通常SEM影像中係以接近黑色的顏色所表示。當進行元素分析的情況下，雖可檢測出碳(C)，但幾乎檢測不出鈣(Ca)及磷(P)。

由膠原蛋白構成部分的面積比率係以下述方法所求得。

(1)將經指定的5.0mm×5.0mm的正方形的範圍之SEM影像(以下本段落中稱為「分析影像」)讀入至ImageJ。

(2)將分析影像進行二值化(閾值：90pixel)。

(3)抽取由膠原蛋白構成部分。

(4)計算膠原蛋白部分面積(S_c)。

(5)計算分析影像的面積(S_A)。

(6)由膠原蛋白構成部分的面積比率(R_c)係以下式所計算。

R_c=S_c/S_A×100

另外，若有因SEM影像的色調的程度而無法進行(2)的二值化的情況下，或是膠原蛋白所構成的部分與膠原蛋白所構成的部分以外混淆的情況下，首先，可僅將SEM影像中膠原蛋白所構成的部分以黑色塗滿而將其他部分作為白色，或是僅將膠原蛋白所構成的部分以白色塗滿而將其他部分作為黑色。之後讀入至ImageJ，進行(2)以後的操作。若預先僅將膠原蛋白所構成的部分以白色塗滿而將其他部分作為黑色的情況下，則不需要於(2)和(3)的程序之間將色調反轉的操作。

分析影像整體中，膠原蛋白所構成的部分的面積較佳為5%以下，更佳為4%以下，又更佳為3%以下。當膠原蛋白所構成的部分大於5%，則多孔質複合體的結構變得不均勻，骨傳導性可能下降。此外，若膠原蛋白所構成的部分大於5%，則壓縮彈性模數大幅下降。

本發明的一個實施態樣的多孔質複合體係在以掃描型電子顯微鏡(SEM)將多孔質複合體的平面之5.0mm×5.0mm的範圍擴大15倍所得之影像中，OCP的凝集粒子的分形維數(D)為0.70以上；a)OCP的凝集粒子所構成的部分、b)OCP的微粒子與膠原蛋白所構成的部分以及c)膠原蛋白所構成的部分之中，c)膠原蛋白所構成的部分的面積比率為5%以下。分形維數(D)較佳為0.75以上，更佳為0.80以上。

本發明的另一個實施態樣的多孔質複合體係在將多孔質複合體的平面之5.0mm×5.0mm的範圍以掃描型電子顯微鏡(SEM)擴大15倍所得之影像中，OCP的凝集粒子的分形維數(D)為0.60以上，且OCP的凝集粒子全體中之具有300μm以上的長度之凝集粒子的面積比率為75%以上；以及a)OCP的凝集粒子所構成的部分、b)OCP的微粒子與膠原蛋白所構成的部分與c)膠原蛋白所構成的部分之中，c) 膠原蛋白所構成的部分的面積比率為5%以下。較佳為分形維數(D)為0.70以上，且300μm以上的凝集粒子的比率為85%以上；更佳為分形維數(D)為0.80以上，且300μm以上的凝集粒子的比率為90%以上。

(壓縮彈性模數)

多孔質複合體的壓縮彈性模數較佳為0.05MPa以上，更佳為0.08Mpa至0.30MPa，又更佳為0.10Mpa至0.20MPa。當壓縮彈性模數為0.05MPa以下的情況下，多孔質複合體的操作性有降低的傾向。亦即，當將本發明的多孔質複合體充填至骨缺損部時，若前述複合體崩塌或氣孔發生塌陷，則對之後的骨頭再生有不利的影響。然其上限沒有特別限制，由對於骨缺損部充填時的易操作性觀點來看，較佳為0.30MPa以下。

本發明中壓縮彈性模數是藉由以下方法所測定。

於溫度：25℃、濕度：65%的環境下，將直徑8.5mm、長度15mm的圓柱狀試樣浸漬於磷酸緩衝生理食鹽水(10mM磷酸鈉、0.14M氯化鈉、pH7.4)中30分鐘。然後，輕輕擦拭試樣表面的水分，使用精密萬能試驗機(Autograph AGS-J、島津製作所股份有限公司製、負荷胞容量：1kN)進行負荷單軸荷重。具體來說，將樣品之長邊以對下方壓盤(材質：不銹鋼、內徑：100mm、厚度：25mm)呈垂直的方式裝設後，將上方壓盤(材質：不銹鋼、內徑： 100mm、厚度：25mm)以10mm/min下降，於樣品應變至80%時停止試驗機。然後，由所得之應力應變曲線的初始直線部分的斜率求得壓縮彈性模數。

本發明的多孔質複合體較佳為多孔質複合體的氣孔徑為3μm至40μm。當氣孔徑大於40μm的情況下，多孔質複合體的強度有降低的傾向。另一方面，當氣孔徑小於3μm的情況下，可能導致成骨細胞等之骨代謝系統細胞的侵入難以發生，而使得骨頭再生的促進作用下降。本發明的多孔質複合體的較佳氣孔徑為5μm至20μm。

氣孔徑係使用水銀孔隙計(Mercury porosimeter)的孔隙分布測定而測定，具體來說係由以下方法所測定。

(氣孔徑測定)

將樣品於120℃進行4小時恆溫乾燥作為前處理。關於前處理後的各樣品，藉由使用以下的測定裝置之汞壓法(mercury press-in method)，以以下的條件求得孔隙徑0.0018μm至200μm的孔隙分布。

測定裝置：Autopore IV9520(Micromeritics公司製)。

測量條件：樣品和汞的接觸角：140deg。

汞的表面張力0.48N/m(以1dyne=10^-5N換算)。

在本發明中所謂的氣孔徑係指在藉由汞壓法之測定壓力所得之孔隙分佈曲線中，顯示具有最大面積之峰值的極大值之孔隙徑的值。

多孔質複合體的氣孔率(空隙率)較佳為80%至99%，更佳為85%至98%。氣孔率係使用藉由汞壓法之總孔隙容積和視密度以下述之式所求得。

氣孔率(%)=總孔隙容積/{(1/視密度)+總孔隙容積}×100。

本發明的多孔質複合體的形狀較佳為長方體(塊體)、筒狀體、薄片狀或顆粒。當為長方體的情況下，尺寸較佳為5mm×5mm×5mm以上的尺寸，一般而言上限較佳為100mm×100mm×100mm以內的範圍。長方體不限於立方體。筒狀體的情況下的尺寸較佳為直徑5mm至50mm，高較佳為1mm至50mm的範圍。若為顆粒狀的情況下，其形狀不限於球體亦可為不定形，較佳為直徑0.1mm至10mm。

本發明的多孔質複合體可用於填補骨缺損部，當於骨缺損部被認為有充分的血液或是體液的情況下，可將多孔質複合體直接或是切割為適當的形狀進行填補。當於骨缺損部不被認為有充分的血液或是無法將多孔質複合體以原本的形狀進行填補的情況下，可將多孔質複合體浸漬於血液或生理鹽水中，確認多孔質複合體顯示海綿狀的彈性後再行填補於骨缺損部。

[多孔質複合體的製造方法]

本發明的多孔質複合體的製造方法，較佳為將OCP與膠原蛋白進行混合的製造方法，可使用如下述之製造方法。

(1)首先，在濃度調整為0.1重量%至5重量%、pH7至8之經凝膠(gel)化的膠原蛋白溶液中添加OCP，經混練而製作OCP與膠原蛋白的混合物。(2)然後，將該混合物加入適當的模型中，經成型、冷凍、冷凍乾燥而得到複合體。(3)根據需要，將所得之該複合體施以熱脫水交聯處理，並進一步藉由習知的滅菌法(例如：γ射線照射、電子束照射、環氧乙烷氣體等)進行滅菌。

在此，在將膠原蛋白與OCP進行混練的步驟中，以往所屬技術領域中具有通常知識者一致認為充分地混練是必要的，然而驚人的是，發明人發現到充分地進行混練反而是使得分形維數或300μm以上的粒子比率降低的原因。混練的步驟可使用具有2枚至4枚的螺旋槳(propeller)型或槳(paddle)型等的攪拌葉片(impeller)的攪拌機或自轉、公轉混合器，當為具有攪拌葉片的攪拌機的情況下，較佳為以100rpm至300rpm攪拌15秒至300秒，更佳為以100rpm至300rpm攪拌30秒至120秒。當使用自轉、公轉混合器的情況下，較佳為以500rpm至1500rpm攪拌30秒至300秒，更佳為以500rpm至1500rpm攪拌45秒120秒。將膠原蛋白與OCP進行混練的步驟亦可使用藥勺等以手工作業進行，這種情況下，較佳為以定速攪拌30秒至120秒，較佳為依據速度而將攪拌時間適當調整。

本發明的多孔質複合體的製造方法，較佳為包含將含有OCP與膠原蛋白之凝膠、溶膠(sol)或液體浸漬於液態冷媒中經急速冷凍後，進行冷凍乾燥的步驟。液體冷媒係較含有第八磷酸鈣與膠原蛋白之凝膠、溶膠或液體的冷凍溫度更低溫度之液體，例如可例舉甲醇、乙醇、丙酮、乙腈以及液態氮。該液態冷媒的溫度較佳為-20℃以下，更佳為-40℃以下，又更佳為-80℃以下。

認為藉由將含有第八磷酸鈣與膠原蛋白之凝膠、溶膠或液體浸漬於液態冷媒而急速地冷凍，可使所得之多孔質複合體的氣孔徑變小。

本發明的多孔質複合體較佳為施予熱處理或是熱脫水交聯處理。藉由熱處理使得OCP分子結構的一部分崩潰而容易產生骨形成系細胞的侵入，可促進骨頭再生，並使膠原蛋白交聯而提高形狀保持力。

熱處理的溫度較佳為50℃至200℃，更佳為60℃至180℃。此外，熱處理較佳在減壓條件下進行。壓力較佳為0Pa至3000Pa，更佳為0Pa至300Pa。熱處理的處理時間較佳為2小時至10天，更佳為12小時至5天。

本發明的多孔質複合體，除了OCP及膠原蛋白以外，亦可含有具有骨形成能力之細胞介質(bone morphogenetic protein-2、transforming growth factor β1等)，藉由含有這樣的細胞介質，可使骨頭再生速度變快。

本發明的多孔質複合體，除此之外，亦可含有此領域中常用的配合成分。作為這樣的配合成分，例如可列舉：活體吸收性高分子(聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸-聚乙二醇共聚物等)，OCP以外的活體吸收性磷酸鈣(β-TCP等)或非吸收性磷酸鈣(羥基磷灰石等)。

[骨頭再生材料]

本發明係進一步關於含有上述的多孔質複合體的骨頭再生材料。骨頭再生材料可用於牙科口腔外科領域及整形外科領域中之骨缺損修復、開顱及開胸術後的骨缺損修復等。例如，牙科口腔外科領域中，對於牙周病(periodontal disease)、囊性空腔(cystic space)、齒槽突萎縮(atrophy of alveolar process)、顎裂部(jaw cleft)、牙槽(socket)等所產生的骨缺損，可藉由多孔質複合體所構成之骨頭再生材料進行填補，而在數週至數月中確認到骨頭再生效果。在整形外科領域中，例如可針對骨腫瘤切除後的骨缺損、骨折等外傷所產生之骨缺損，將此骨頭再生材料填補於骨缺損部而促進骨頭再生。

【實施例】

以下藉由實施例對本發明作更詳細的說明，但本發明並不限定於以下的例子。

(實施例1)

(1)OCP的調製

首先，OCP調製用的1液以及2液以如下方式進行調製。

[1液]將31.2g的磷酸二氫鈉二水合物溶解於2500g的蒸餾水中，調製1液。

[2液]將35.2g的乙酸鈣一水合物溶解至2500g的蒸餾水中，調製2液。

接著，將1液裝入分離燒瓶中，於加熱包(mantle heater)中升溫至70℃。接著，於攪拌器(東京理化器械公司製，MAZELA Z)中安裝攪拌葉片(葉片徑12cm)，一面以250rpm的速度攪拌，一面對於1液將2液以約28mL/min的速度進行滴加。在結束滴加後，將1液與2液的混合液以70℃、250rpm再攪拌2小時。

接著，將於上述混合液中所生成之沉澱物利用薄膜過濾器(孔徑3μm，ADVANTEC(TOYO)公司製，A300A293C)進行過濾而回收。將經回收的沉澱物分散於1500mL的蒸餾水中，並攪拌洗滌15分鐘。再重覆操作3次同樣的過濾、洗滌的步驟。

接著，將洗滌後的沉澱物使用恆溫乾燥機以30℃乾燥24小時。將乾燥後的沉澱物於電動研磨機經粉碎後，使用篩將粒徑分級為300μm至500μm，而獲得粉末。最後，對所獲得之粉末以120℃進行2小時的乾熱滅菌。

(2)OCP/膠原複合體的製備(多孔質複合體)

將1重量分之含有I型膠原蛋白以及III型膠原蛋白之豬真皮衍生膠原蛋白(日本火腿股份有限公司，NMP膠原PS)冷卻至4℃並溶解於200重量分的蒸餾水中，獲得大約0.5重量%的膠原蛋白溶液。一面將液溫保持於4℃，一面於膠原蛋白水溶液中加入氫氧化鈉水溶液，獲得將pH值調整至大約7.4之膠原蛋白懸浮液。接著，將所得之膠原蛋白懸浮液裝入離心瓶中，使用離心分離機(TOMY SEIKO製，GRX-250)以7000×g的離心力經20分鐘的離心後，使膠原蛋白懸浮液成為3重量%的方式將上清液廢棄而獲得膠原蛋白凝膠。

接著，於膠原蛋白凝膠中將OCP(粒徑300μm至500μm)以OCP與膠原蛋白之重量比成為77：23的方式加入後，使用安裝有攪拌葉片(SOGO LABORATORY GLASS WORKS CO.,LTD.製造，4枚葉片、葉片徑為7cm)之攪拌機(東京理化器械公司製，MAZELA Z)，以300rpm的旋轉速度混合60秒，獲得OCP/膠原蛋白複合凝膠。將該複合凝膠裝入具有圓柱狀的內部空間之塑料容器(內徑8.5mm，容積約3.0cm³)中，以230×g的離心力經1分鐘的離心而脫泡。

將容器密封，浸漬於甲醇中而急速冷凍；前述甲醇係對被冷凍體的容積而言大過量且冷卻至-80℃。將容器開封後，藉由冷凍乾燥機將冷凍體乾燥(-10℃、48小時)而成形。接著，將其以減壓狀態、150℃下經24小時的加熱而進行熱脫水交聯。將所得之圓柱體以刀切成厚度為1.5mm或15mm。最後以電子射線照射(15kGy)進行滅菌。藉此獲得實施例1的多孔質複合體。

(實施例2)

在實施例2中，混合膠原蛋白凝膠與OCP時，使用安裝有攪拌葉片之攪拌機，以300rpm的旋轉速度混合300秒。除此之外係以與實施例1相同的方法獲得多孔質複合體。

(實施例3)

在實施例3中，混合膠原蛋白凝膠與OCP時，使用自轉公轉混合器(THINKY公司製，THINKY MIXER ARE-310)，以1000rpm的旋轉速度混合60秒。除此之外係以與實施例1相同的方法獲得多孔質複合體。

(比較例1)

在比較例1中，混合膠原蛋白凝膠與OCP時，使用安裝有攪拌葉片之攪拌機，以100rpm的旋轉速度混合15秒。除此之外係以與實施例1相同的方法獲得多孔質複合體。

(比較例2)

在比較例2中，混合膠原蛋白凝膠與OCP時，使用安裝有攪拌葉片之攪拌機，以300rpm的旋轉速度混合900秒。除此之外係以與實施例1相同的方法獲得多孔質複合體。

(比較例3)

混合膠原蛋白凝膠與OCP時，使用自轉公轉混合器，以300rpm的旋轉速度混合15秒。除此之外係以與實施例1相同的方法獲得多孔質複合體。

(比較例4)

混合膠原蛋白凝膠與OCP時，使用自轉公轉混合器，以2000rpm的旋轉速度混合900秒。除此之外係以與實施例1相同的方法獲得多孔質複合體。

(影像分析)

影像分析係對被切成厚度1.5mm之試樣的剖面於以下的條件所觀察之SEM影像進行。分析範圍是將試樣的剖面上任意的一邊約5mm的正方形內(以下稱分析影像)用於分析。

測定裝置：SU1510，日立製作所公司製造。

測定條件：加速電壓15kV。

低真空(30Pa)。

觀察反射電子。

WD 40mm。

倍率15倍。

(分形維數)

利用分形維數(D)，用以定量化OCP粒子在膠原蛋白基質(collagen matrix)上的分散程度。分形維數(D)的計算係以以下的程序進行。另外，以下所示之所有的影像處理皆是使用影像處理軟體ImageJ進行。

1.分析影像的取得。

2.將分析影像二值化(閾值：90pixel)。

3.反轉色調。

4.將分析影像以n²分割(n=2、3、4、5)。

5.對於每個分區，計算影像的表示所述OCP粒子的面積分率。

6.計算各分割水準的面積分率的平均值(μ_n)及標準偏差(σ_n)。

7.藉由下式計算D(n)。

D(n)=σ_n/μ_n

8.將D(n)及1/n繪製於雙對數圖中，求得近似直線的斜率。

9.將近似直線的斜率乘以-1而計算分形維數(D)。

(300μm以上的OCP粒子比率)

300μm以上的OCP粒子比率係以以下的程序而算出。

1.分析影像的取得。

2.將分析影像二值化(閾值：90pixel)。

3.反轉色調。

4.測定粒子徑。

5.抽取300μm以上的OCP粒子。

6.計算總粒子面積(S_w)以及300μm以上的OCP粒子面積(S_d)。

7.藉由下式計算300μm以上的粒子比率(R_d)。

R_d=S_d/S_w×100

另外，本測定中所謂的粒子徑係經定義為與各凝聚粒子的輪廓相切之最長間隔的平行線之間的距離為300μm以上。

(膠原蛋白部分的比率)

作為OCP和膠原蛋白凝膠的混合是否充分的評估指標，由分析影像計算出膠原蛋白部分的比率。膠原蛋白部分的比率的計算係以以下的程序進行。

1.分析影像的取得。

2.將分析影像二值化(閾值：90pixel)。

3.抽取膠原蛋白部分。

4.計算膠原蛋白部分面積(S_c)。

5.計算分析影像面積(S_A)。

6.以下式計計算膠原蛋白部分的面積比率(R_c)。

R_c=S_c/S_A×100

(測定壓縮彈性模數)

於溫度：25℃、濕度：65%的環境下，將直徑為8.5mm、長度為15mm的圓柱狀試樣浸漬於磷酸緩衝生理食鹽水(10mM磷酸鈉、0.14M氯化鈉、pH7.4)30分鐘。然後，輕輕地擦拭試樣表面的水氣，使用精密萬能試驗機(Autograph AGS-X，島津製作所股份有限公司製，負荷胞容量：1kN)進行負荷單軸荷重。具體來說，將樣品之長邊以對下方壓盤(材質：不銹鋼、內徑：100mm、厚度：25mm)呈垂直的方式裝設後，將上方壓盤(材質：不銹鋼、內徑：100mm、厚度：25mm)以10mm/min下降，於樣品應變至80%時停止試驗機。然後，由所得之應力應變曲線的初始直線部分的斜率求得壓縮彈性模數。

(氣孔率測定)

對上述實施例1至3以及比較例1至4所得之直徑為8.5mm、厚度為1.5mm的圓柱狀(薄片狀)的樣品，其氣孔率係以如下的方式作測定。

作為前處理，將樣品於120℃下進行4小時的恆溫乾燥。對前處理後的各樣品，藉由使用以下的測定裝置之汞壓法而以以下條件求得孔隙直徑為0.0036μm至200μm的孔隙分布。

測定裝置：Autopore IV9520(Micromeritics公司製)。

測量條件：樣品和汞的接觸角：140deg。

汞的表面張力0.48N/m(以1dyne=10^-5N換算)。

氣孔率係使用藉由汞壓法之總孔隙容積和視密度以下述之式所求得。

氣孔率(%)=總孔隙容積/{(1/視密度)+總孔隙容積}×100。

上述實施例及比較例的分形維數(D)、300μm以上的OCP粒子比率、膠原蛋白部分的比率、氣孔率以及壓縮彈性模數的測定結果如表1所示。

[表1]

由表1所示的結果，實施例1至3的樣品(多孔質複合體)皆顯示分形維數為0.70以上、300μm以上粒子比率為75%以上，且達到膠原蛋白部分的比率為3%以下，維持預定的粒子徑的狀態下OCP粒子均勻分散而充分地混合。

比較例1的樣品係分形維數為0.78、300μm以上的粒子比率為96%，而維持預定的粒子徑的狀態下OCP粒子均勻分散，但由於攪拌稍微不足，僅有膠原蛋白的部分比率成為11%，無法達到充分地混合。

比較例2的樣品係分形維數為300μm以上的粒子比率為88%且不存在僅有膠原蛋白的部分，雖可達到維持預定的粒子徑的狀態下充分地混合，令入意外的是，由於過度的攪拌導致OCP粒子偏重分布於盤的外周部，分形維數為0.56以下之低值。

比較例3的樣品係分形維數為300μm以上的粒子比率為90%且維持預定的粒子徑，但結果分形維數低如0.53且膠原蛋白部分的比率為非常高之45%。由這些結果可認為是在此攪拌條件中明顯地攪拌不足。

比較例4的樣品係分形維數為0.68且不存在僅有膠原蛋白的部分，雖認為OCP粒子的均勻分散與充分地混合，但300μm以上粒子比率成為74%，難以維持預定的粒子徑。這被認為是由於以強力且長時間的攪拌使得OCP粒子被壓碎，300μm以上的粒子比率減少之故。

此外，實施例1至實施例3的樣品的壓縮彈性模數約為0.1MPa，成為高於比較例1至比較例4的樣品的1.6倍至3.1倍之值。這被認為是由於實施例1至實施例3中OCP粒子均勻分散於複合體全體中，且OCP與膠原蛋白未被充分地混合之部分較少，因此OCP粒子於複合體中作為加強材料而有效率地發揮功能。

(多孔質複合體的埋入試驗)

實驗動物係使用雄性SD(Sprague Dawley)大鼠(12週齡)。將大鼠腹膜內麻醉，在大鼠頭蓋(calvarial)部加以切開皮膚、切開骨膜，清楚地顯示頭蓋，以製作無法期望自然治癒之約9mm直徑的規格化之全層的骨缺損。在此，於各個體中皆埋入在實施例1、實施例2、比較例3或是比較例4所製作之盤上的多孔質複合體各1枚。用於在實施例1、實施例2及比較例4所製作之多孔質複合體的埋入試驗之大鼠為各1隻，用於在比較例3所製作之多孔質複合體的埋入試驗之大鼠為2隻。將各試樣埋入後進行骨膜及皮膚縫合以結束手術。術後的觀察期設定為各群10週。

術後10週後，將各大鼠於戊巴比妥(pentobarbital)中過量麻醉而殺死，採取頭蓋以及周圍組織，浸漬固定於0.1M磷酸緩衝4%三聚甲醛(pH7.4)中。以10%EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)脫鈣而作成石蠟標本後，以前額葉(forehead cut)製作6μm厚的組織切片，以蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin stain；HE)染色製作組織標本。

各群的結果如圖6至圖10所示。可確認實施例1以及實施例2中OCP凝集粒子均勻地分散。經埋入實施例1的多孔質複合體的檢體中，在骨缺損部內的許多部分確認到新生骨，其他部分亦被伴隨於骨再生的結合組織所占據。即使於經埋入實施例2的多孔質複合體的檢體中，遍佈於骨缺損部內的全體許多部分被新生骨所占據，特別是缺損部邊緣中與移植床(Transplant bed)骨的邊界不清析，顯示旺盛的骨頭再生。在任一試樣中，伴隨骨頭再生而OCP的凝集粒子的尺寸變小，且可觀察到OCP的凝集粒子內亦有新生骨組織的侵入，教示了OCP顯示緩效性而在期間中有效地作用。

另一方面，於使用了比較例3的多孔質複合體之2個檢體中，OCP的凝集粒子係偏重分布或者是幾乎不存在。如圖8所示之組織標本中，雖一部分被確認到新生骨，但於骨缺損部整體中新生骨形成並不顯眼。此外，OCP的凝集粒子幾乎殘留原來的尺寸，於內部亦確認不到新生骨組織的侵入。於圖9所示的組織標本中，新生骨無法明確地被確認。此外，衍生自膠原蛋白之材料不被分解而殘留。圖8、圖9任一者的結果，亦教示了比較例3中骨再生並不旺盛。經埋入比較例4的多孔質複合體的檢體中，OCP的凝集粒子散在地存在，幾乎無法確認新生骨形成。此外，經確認衍生自膠原蛋白之海綿結構殘留，教示了骨頭再生所必需之細胞侵入並沒有明顯進展。

【產業上利用的可能性】

本發明的多孔質複合體以及含有該多孔質複合體之骨頭再生材料，具有高的骨頭再生性且具有適度的機械性強度，主要對於牙科口腔外科領域及整形外科領域中之骨缺損修復是有效的。

Claims

一種多孔質複合體，係含有第八磷酸鈣與膠原蛋白；在將多孔質複合體的平面之5.0mm×5.0mm的範圍以掃描型電子顯微鏡擴大15倍所得之影像中，第八磷酸鈣的凝集粒子的分形維數為0.70以上；在由：a)第八磷酸鈣的凝集粒子所構成的部分、b)第八磷酸鈣的微粒子與膠原蛋白所構成的部分與c)膠原蛋白所構成的部分之中，c)膠原蛋白所構成的部分的面積比率為5%以下。
一種多孔質複合體，係含有第八磷酸鈣與膠原蛋白；在將多孔質複合體的平面之5.0mm×5.0mm的範圍以掃描型電子顯微鏡擴大15倍所得之影像中，第八磷酸鈣的凝集粒子的分形維數為0.60以上，且第八磷酸鈣的凝集粒子全體中之具有300μm以上的長度之凝集粒子的面積比率為75%以上；在由：a)第八磷酸鈣的凝集粒子所構成的部分、b)第八磷酸鈣的微粒子與膠原蛋白所構成的部分與c)膠原蛋白所構成的部分之中，c)膠原蛋白所構成的部分的面積比率為5%以下。
如請求項1或2所記載之多孔質複合體，其壓縮彈性模數為0.08MPa以上。
一種骨頭再生材料，其含有如請求項1至3中任一項所記載之多孔質複合體。