TWI623329B - Method for producing porous composite - Google Patents

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Abstract

本發明的課題為提供一種具有適當的撓曲強度且壓縮強度優異之包含有OCP以及膠原蛋白之多孔質複合體以及包含有多孔質複合體之骨頭再生材料。
多孔質複合體係包含有第8磷酸鈣與膠原蛋白，且撓曲強度以及壓縮強度分別為0.05MPa至0.16MPa以及0.3MPa以上。

Description

多孔質複合體的製造方法
本發明係關於一種多孔質複合體、骨頭再生材料以及多孔質複合體的製造方法。
以往所使用的骨頭再生材料已知有羥基磷灰石(Calcium Hydroxyapatite；HA)等之磷酸鈣(例如參照專利文獻2、專利文獻3、專利文獻4、專利文獻5)。
近年來，已知與羥基磷灰石或β-第3磷酸鈣(beta Tricalcium Phosphate；β-TCP)等其它的磷酸鈣相比，屬於羥基磷灰石的前驅物質之第8磷酸鈣(Octacalcium phosphate；以下稱為「OCP」)的骨頭再生的促進作用高且於生物體內的吸收性也高(例如參照專利文獻1)。該OCP具有即使在磷酸鈣中作為骨頭再生材料亦特別優異的特性。
然而，由於OCP為無機物質，故賦形性差。因此，OCP難以單獨地應用於廣範圍的骨頭缺損部位之再生等。因此，有以OCP與膠原蛋白(collagen)的複合體作為 骨頭再生材料使用(例如參照專利文獻1)的提議。
[先前技術文獻] [專利文件]
專利文獻1：日本特開2006-167445號公報。
專利文獻2：日本特開2010-273847號公報。
專利文獻3：日本特開2003-260124號公報。
專利文獻4：日本特開2009-132601號公報。
專利文獻5：日本特開2005-279078號公報。
專利文獻6：日本特開平5-070113號公報。
骨頭再生材料一般應用於不定形之骨頭缺損。對使用於此種目的的骨頭再生材料，不僅要求骨頭再生促進能力，良好的操作性也是臨床上所要求的。例如要求的特徵為①具有適當的撓曲強度，能夠容易以鑷子等加工使其與骨頭缺損部位的形狀相符合；②具有適當的壓縮強度，在操作時不產生破損等。
在專利文獻4中，揭示了一種具有最佳的機械強度與生物親和性之平衡且適用於人工骨材、細胞支架等之包含有磷灰石/膠原蛋白複合體纖維的多孔體。由於該磷灰石/膠原蛋白複合體纖維係於膠原蛋白沉積附著有微細的磷 灰石粒子，因此對於初期的機械強度此一方面有利，但另一方面存在此強度難以以鑷子等容易加工的問題。
在專利文獻1中揭示有一種由第8磷酸鈣與膠原蛋白所構成且賦形性良好的硬組織代替性載體材料。雖然此種硬組織代替性載體材料具有良好的柔軟性，但由於其氣孔徑大，故存在壓縮強度低且易於操作時發生破損等問題。
本發明有鑑於上述課題而研創，其目的為提供一種具有較以往改善的撓曲強度及壓縮強度並包含有操作性良好的OCP與膠原蛋白之多孔質複合體、包含多孔質複合體的骨頭再生材料、以及多孔質複合體的製造方法。
有鑑於上述課題，本發明人等銳意研究的結果，發現一種多孔質複合體，其使用包含具有預定離子強度之膠原蛋白的液體，藉此具有預期範圍內之撓曲強度及壓縮強度，並兼顧加工容易性與機械強度。本發明人等不斷地進一步研究與改善以提供以下代表之發明。
[1]一種多孔質複合體，係包含有第8磷酸鈣與膠原蛋白，且撓曲強度為0.05MPa至0.16MPa、壓縮強度為0.3MPa以上。
[2]如[1]所記載的多孔質複合體，其氣孔徑為3μm 至90μm。
[3]如[1]或[2]所記載的多孔質複合體，其膠原蛋白為第I型或第I型與第III型的混合物。
[4]一種骨頭再生材料，係包含[1]至[3]中任一項所記載的多孔質複合體。
[5]一種多孔質複合體的製造方法，係製造包含有第8磷酸鈣與膠原蛋白的多孔質複合體，該多孔質複合體的製造方法係包含下述步驟(1)及步驟(2)。
步驟(1)：將含有膠原蛋白的液體調製成離子強度為0.005至0.06且pH為6.0至9.0，並調製含有膠原蛋白的凝膠(gel)、溶膠(sol)、或液體。
步驟(2)：將含有前述膠原蛋白的凝膠、溶膠、或液體與第8磷酸鈣混合得到懸浮液。
[6]如[5]所記載的多孔質複合體的製造方法，係更包含步驟(3)：將前述懸浮液浸漬於液態冷媒並急速凍結後，進行凍結乾燥。
[7]一種多孔質複合體的製造方法，係製造包含有第8磷酸鈣與膠原蛋白的多孔質複合體，該多孔質複合體的製造方法係包含下述步驟(1)及步驟(2)。
步驟(1)：將含有膠原蛋白的液體與第8磷酸鈣混合 得到懸浮液。
步驟(2)：將前述懸浮液調製成離子強度為0.005至0.06且pH為6.0至9.0。
[8]如[7]所記載的多孔質複合體的製造方法，係更包含步驟(3)：將前述懸浮液浸漬於液態冷媒並急速凍結後，進行凍結乾燥。
藉由本發明得以提供一種加工性良好且不易破損之較以往的撓曲強度及壓縮強度之特性優良之包含有OCP與膠原蛋白之多孔質複合體、以及包含此多孔質複合體的骨頭再生材料。另外，該多孔質複合體不易被蛋白質分解酵素分解，可在需要骨頭再生的部位停留更長的時間，可期望其促進骨頭再生。
1‧‧‧(撓曲試驗用)樣品
2‧‧‧(壓縮試驗用)樣品
21‧‧‧支撐台
22‧‧‧壓頭
41‧‧‧試料台
42‧‧‧十字頭
b‧‧‧寬度
h‧‧‧厚度
L‧‧‧支點間距離
S‧‧‧樣品的截面積
圖1係顯示用以說明撓曲試驗用的樣品尺寸之示意圖。
圖2係顯示用以說明撓曲強度的測定方法之示意圖。
圖3係顯示根據實施例1的撓曲強度試驗之呈現應力-應變曲線之曲線圖。
圖4係顯示用以說明壓縮強度的測定方法之示意圖。
[多孔質複合體]
本發明的多孔質複合體為包含OCP與膠原蛋白之多孔質的複合體(OCP/膠原蛋白複合體)。本發明之多孔質複合體的較佳態樣為膠原蛋白形成三維的海綿狀結構，且OCP以至少100μm以上的顆粒存在於該海綿狀結構中。由本發明之多孔質複合體所構成的骨頭再生材料因藉由多孔質體結構，使成骨細胞侵入多孔質內部，而得以實現促進新生骨形成的內部骨形成。
OCP(Ca8H2(PO4)6．5H2O)係可藉由各種已知方法予以調製，例如可藉由使用LeGeros的滴液法(LeGeros RZ,Calcif Tissue Int 37：194-197,1985)或是專利文獻6所揭示的使用合成裝置(三流管)等方法來調製。又，可藉由混合法來調製，具體而言，例如在適當的條件下混合磷酸二氫鈉(sodium dihydrogen phosphate)水溶液與乙酸鈣(calcium acetate)水溶液，藉由收集生成的沉澱物而獲得OCP。乾燥從沉澱物得到的OCP，並利用電動研磨機等予以粉碎，且較佳為做成粒子狀的粉體來使用。粒徑較佳為調製成10μm至1000μm之範圍，更佳為調製成300μm至500μm之範圍。粒徑可根據篩分法(sieving method)並藉由篩子的網目大小來分級。
以膠原蛋白而言，其來源、性質等並無特別限定，可 使用各種的膠原蛋白。較佳為使用可藉由溶於蛋白分解酵素(例如胃蛋白酶、鏈蛋白酶等)而獲得之已去除端肽(telopeptide)的酵素可溶膠原蛋白。以膠原蛋白的類型而言，較佳為屬於纖維性膠原蛋白之第I型、第II型、第III型及第IV型之膠原蛋白，特佳為富含於生物體內的第I型膠原蛋白、或是第I型及第III型膠原蛋白的混合物。以原料而言，雖無特別限定，但較佳為可使用豬、牛等之皮膚、骨頭、韌帶等來源之膠原蛋白。由於膠原蛋白為生物體來源的成分，具有安全性高之特性，特別是酵素可溶膠原蛋白的過敏性低因而較佳。上述的膠原蛋白亦可使用市售之產品。
在本發明的多孔質複合體中，OCP與膠原蛋白的配合比例可因應所期望的賦形性、操作性、生物親和性等予以適當調整。OCP相對於膠原蛋白1重量份之配合比例較佳為0.5重量份至35重量份，更佳為1重量份至20重量份，又更佳為2重量份至10重量份。若OCP相對於膠原蛋白1重量份未滿0.5重量份時，則所得到的複合體之骨頭再生功能恐有變差之虞，又若超過35重量份則恐有賦形性降低之虞。
本發明的多孔質複合體之撓曲強度較佳為0.05MPa至0.16MPa，更佳為0.08MPa至0.16MPa。在撓曲強度超過0.16MPa的情況下，則有難以以鑷子等容易的加工之傾 向。亦即，當醫師將多孔質複合體填充於骨頭缺損部位時，雖然有針對缺損部位的大小將多孔質複合體調整至適合的大小之必要，但此時若撓曲強度在0.16MPa以下，藉由鑷子等施加適當的應力即可容易地將其切割。另一方面，若在撓曲強度未滿0.05MPa的情況下，則容易斷裂且有易發生手術後的破損之傾向。
本發明之撓曲強度係根據下述方法來測定。
(撓曲強度測定)
在溫度25℃、濕度65%的環境下，將於圖1所示的厚度(h)4mm、寬度(b)10mm、長度30mm的長方體狀試料(樣品)浸漬於磷酸緩衝生理食鹽水(10mM磷酸鈉、0.14M氯化鈉、pH7.4)30分鐘。之後，輕拭樣品表面的水氣，將樣品設置於拉伸/壓縮試驗機(荷重元：1kN)的支持台(支持台的半徑R1=5mm)使其支點間距離(L)成為20mm。用以將荷重施加於樣品之屬於治具之壓頭係使用半徑R2=5mm之壓頭。本測定係如圖2所示進行三點撓曲試驗。接著，將拉伸/壓縮試驗機的十字頭以10mm/min的速度下降直至樣品斷裂為止。此外，在本試驗中，「樣品斷裂」意指如圖3所示的應力-應變曲線中荷重快速下降的點。
本發明之撓曲強度(σ)係從樣品的斷裂時之荷重、樣品的尺寸以及支點間的距離以式1表示。
σ=3FL/2bh2 (式1)
σ：撓曲強度(Pa)
F：斷裂時荷重(N)
L：支點間距離(mm)
b：樣品的寬度(mm)
h：樣品的厚度(mm)
本發明之多孔質複合體的壓縮強度較佳為0.3MPa以上，更佳為0.3MPa至3.0MPa，又更佳為0.3MPa至1.0MPa。若壓縮強度未滿0.3MPa的情況下，則有多孔質複合體的操作性降低的傾向。亦即，將本發明的多孔質複合體填充至骨頭缺損部位時，若是前述複合體崩散或是氣孔粉碎，則會造成之後的骨頭再生有負面影響。具體而言，醫師在進行使用治具將多孔質複合體無間隙地填充於具有各種形狀的骨頭缺損部位之手術時，不產生前述複合體之崩散或是氣孔粉碎的指標為壓縮強度0.3MPa以上。雖無特別限定上限，但以填充至骨頭缺損部位時的操作容易性之觀點而言，較佳為3.0MPa以下。
本發明之壓縮強度係根據下述方法來測定。
(壓縮強度測定)
在溫度25℃、濕度65%的環境下，將直徑8.5mm、長度15mm的圓柱狀試料(樣品)浸漬於磷酸緩衝生理食鹽水(10mM磷酸鈉、0.14M氯化鈉、pH7.4)30分鐘。之後，輕拭樣品表面的水氣，使用拉伸/壓縮試驗機(荷重元： 1kN)，使圓柱的上下方向負荷單軸荷重。接著，以在階段性地變化荷重時使樣品崩散的最小荷重作為崩散時的荷重。「確認樣品的崩散」意指以肉眼觀察試料時有產生明確的龜裂或剝裂。
具體而言，請參照圖4，將樣品設置於試料台41後，將安裝有平型壓縮治具的十字頭42以10mm/min的速度下降，直至荷重元顯示為2.5N時停止十字頭42並解除荷重。觀察試料台的樣品，若無崩散則將此樣品放回試料台再度設置，同樣地，將十字頭下降至荷重元顯示為5N。每次以增加2.5N的荷重重複該操作，並以最初確定樣品崩散時的荷重作為崩散時荷重。
本發明之壓縮強度係從上述崩散時荷重與樣品的截面積(垂直於圓柱的厚度方向的截面之截面積)以式2表示。
Cs=F/S (式2)
Cs：壓縮強度(Pa)
F：崩散時荷重(N)
S：樣品的截面積(m2)
此外，樣品的截面積大約為(0.00425)2×3.14=5.67×10-5m2。
本發明的多孔質複合體係以多孔質複合體的氣孔徑為 3μm至90μm為佳。若氣孔徑為超過90μm的情況下，則有多孔質複合體的壓縮強度降低的傾向。另一方面，若氣孔徑為未滿3μm的情況下，則不易發生成骨細胞等之骨頭代謝系細胞的侵入，恐有降低骨頭再生的促進作用之虞。本發明之多孔質複合體的氣孔徑更佳為5μm至40μm。
氣孔徑的測定係利用藉由水銀孔隙計(Mercury porosimeter)之微孔分布(micropore distribution)測定，具體來說係根據以下的方法進行測定。
(氣孔徑測定)
以120℃恆溫乾燥樣品4小時作為前處理。前處理後的各樣品係根據使用以下的測定裝置之汞壓法(mercury intrusion technique)，利用以下的條件求得微孔徑0.0018μm至200μm的微孔分布。
測定裝置：Autopore IV9520(micromeritics公司製)
測定條件：樣品與水銀的接觸角：140deg
水銀的表面張力：0.48N/m(以1dyne=10-5N換算)
本發明之氣孔徑係根據汞壓法的測定壓力而得到的微孔分布曲線中，具有極大面積的波峰之極大值所表示的微孔直徑之值。
多孔質複合體的氣孔率(空隙率)較佳為80%至99%，更佳為85%至98%。氣孔率可利用根據汞壓法之總微孔體積 (total pore volume)與表觀密度(apparent density)並依據下式求得。
氣孔率(%)=總微孔體積/{(1/表觀密度)+總微孔體積}×100
本發明之多孔質複合體的形狀較佳為長方體(塊體)、圓柱體或薄片狀、或是顆粒。在長方體的情況下，其大小較佳為5mm×5mm×5mm以上之大小，一般的上限較佳為100mm×100mm×100mm以內的範圍。長方體不限於是立方體。在圓柱體的情況下，其大小較佳為直徑5mm至50mm且高度為1mm至50mm之範圍。在顆粒的情況下，形狀雖不限於球體亦可為不定形，但較佳為直徑0.1mm至10mm。
本發明之多孔質複合體雖被使用在填補骨頭缺損部位，但當骨頭缺損部位確認有充分的血液或體液的情況下，可直接將多孔質複合體進行填補或是將其切割為適當的形狀再進行填補。當確認骨頭缺損部位沒有充分的血液等或是無法將多孔質複合體以原本的形狀填補的情況下，則將多孔質複合體浸漬於血液或生理食鹽水等，在確認多孔質複合體表現出海綿狀的彈性後即可填補至骨頭缺損部位。
[多孔質複合體的製造方法]
本發明之多孔質複合體的製造方法較佳為混合OCP與膠原蛋白之製造方法，可使用如下所述的製造方法。藉由已知的共沈澱法(coprecipitation method)使OCP析出至膠 原蛋白來複合化的方法，恐有撓曲強度過度地變高難以容易的加工之虞。
(a)混合OCP以複合化之方法
首先，將膠原蛋白溶液調製成濃度0.1重量%至5重量%且pH為6.0至9.0，並將OCP添加至凝膠化的膠原蛋白溶液中，混練以製備OCP與膠原蛋白的混合物。其次，藉由將該混合物倒入適當的模具成型後，使之凍結並進行凍結乾燥以獲得複合體。所得到的該複合體依需求實施熱脫水交聯處理(thermal dehydration crosslinking treatment)，更且藉由常用的滅菌法(例如γ射線照射、電子射線照射、環氧丙烷氣體等)來滅菌。
(b)混合OCP懸浮液以複合化之方法
以適當的緩衝液(例如磷酸緩衝液、三羥甲基氨基甲烷緩衝液、醋酸鈉緩衝液等)將適當濃度的膠原蛋白酸性溶液在無菌下調整pH使其成為5.5至7.5，在膠原蛋白凝膠化之前加入OCP，以調製膠原蛋白與OCP的懸浮液。其後，在pH保持中性至弱鹼性的狀態下，將上述懸浮液澆注至模具而賦予形狀後，以適當的溫度(例如37℃)凝膠化，重複水洗以去除緩衝液的鹽類等使其作為複合載體，並進行與上述同樣的凍結乾燥及滅菌處理。
本發明之多孔質複合體的製造方法較佳為包含以下步 驟：將含有膠原蛋白的液體調製成離子強度為0.005至0.06且pH為6.0至9.0，並調製含有膠原蛋白的凝膠、溶膠、或液體之步驟。離子強度更佳為0.005至0.05，pH更佳為6.5至8.0。在前述(a)的方法中，本步驟是在添加OCP之前進行，而在前述(b)的方法中，本步驟是在添加OCP以製備成OCP/膠原蛋白懸浮液後進行。離子強度及pH係可將常用的緩衝液或鹽類添加至溶解有膠原蛋白之蒸餾水的液體中予以調整。例如作為緩衝液而言可例舉：醋酸緩衝液、磷酸緩衝液、三羥甲基氨基甲烷緩衝液、良好緩衝液之MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid buffer；2-(N-嗎啉)乙磺酸)緩衝液、HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid；4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半鈉鹽)緩衝液等。作為鹽類而言可例舉氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、氫氧化鈉(NaOH)、稀鹽酸(dilute hydrochloric acid)等。
在本發明中，離子強度(μ)係依據式3算出。
μ=1/2 Σ(CiZi 2) (式3)
μ：離子強度
Ci：離子的莫耳濃度
Zi：離子的電荷
例如在後述實施例1中所存在的電解質係由於在膠原蛋白中所含有的NaCl以及透過調整pH而生成的NaCl之合計僅有0.01M的NaCl，因此離子強度為1/2×(0.01×12+0.01 ×12)=0.01。
一般而言，已知在生理條件下(離子強度約0.2左右、pH為7.0附近)膠原蛋白會有效率地自我組織化(self-organization)(纖維化)。本發明人等發現將含有膠原蛋白之液體的離子強度以及pH調整至本發明的預定範圍內，是決定本發明多孔質複合體的壓縮強度以及撓曲強度之特性的重要因素。在本發明中，由於以較生理的離子強度低的條件進行纖維化，能適當地控制膠原蛋白的纖維徑、纖維長、膠原蛋白分子間的相互作用，而獲得較佳的撓曲強度。
本發明之多孔質複合體的製造方法較佳為包含以下步驟：將含有OCP與膠原蛋白的凝膠、溶膠、或液體浸漬於液態冷媒並急速凍結後，進行凍結乾燥。液態冷媒為比含有第8磷酸鈣與膠原蛋白的凝膠、溶膠、或液體的凍結溫度更低的溫度之液體，例如為甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、液態氮等。該液態冷媒的溫度較佳為-20℃以下、更佳為-40℃以下、又更佳為-80℃以下。
認為藉由將含有第8磷酸鈣與膠原蛋白的凝膠、溶膠、或液體浸漬於液態冷媒而使其急速凍結，故能夠縮小所得到的多孔質複合體之氣孔徑。
本發明的多孔質複合體較佳為實施熱處理或是熱脫水交聯處理。藉由熱處理可造成OCP分子結構的一部分破裂而使骨形成系細胞的侵入變得容易，並促進骨頭再生，且膠原蛋白進行交聯而提升形狀保持性(shape retention)。
熱處理的溫度較佳為50℃至200℃，更佳為60℃至180℃。又，熱處理較佳為在減壓條件下進行。壓力較佳為0Pa至3000Pa、更佳為0Pa至300Pa。熱處理的處理時間較佳為2小時至10天、更佳為12小時至5天。
藉由上述方法所製造的多孔質複合體，以其它的效果而言，可控制生物分解性的速度之處亦優良。本發明人等發現可藉由多孔質複合體製造時的膠原蛋白懸浮液之離子強度來控制生物分解性。由於骨頭再生需要數週至數個月的期間，多孔質複合體在經過長時間後仍存在於骨頭缺損部位並作為骨頭再生的基礎而停留，故較佳。藉由本發明的製造方法，能夠提供生物分解性不易的多孔質複合體。分解性的程度可依據可溶性蛋白質的比例來評價，具體而言，將多孔質複合體浸漬於0.2mg/ml膠原蛋白酶溶液，在37℃下靜置72小時後，針對存在於溶液中之可溶性之膠原蛋白的蛋白質進行二金雞鈉酸(Bicinchoninic Acid；BCA)蛋白質分析(Protein Assay)以測定蛋白質量。將此可溶性之蛋白質量除以原多孔質複合體的膠原蛋白重量，可求得可溶性蛋白質比例(%)。本發明之多孔質複合體的較佳可溶性蛋白質比例 為1.5%至4.0%。
[骨頭再生材料]
本發明更有關於含有上述的多孔質複合體之骨頭再生材料。骨頭再生材料可用於牙科口腔外科領域、整形外科領域中的骨頭缺損修復，開顱、開胸術後的骨頭缺損修復等。例如在牙科口腔外科領域中，針對因牙周病、囊性空洞(cystic cavity)、牙槽嵴萎縮(atrophic alveolar ridge)、顎裂(cleft jaw)部位、拔牙窩(extraction socket)等所造成的骨頭缺損，藉由填補由多孔質複合體所構成的骨頭再生材料，可確認具有從數週至數個月的優異的骨頭再生功效。在整形外科領域中，例如針對因骨腫瘤(bone neoplasm)切除後的骨頭缺損、骨折等外傷所造成的骨頭缺損，將本發明的骨頭再生材料填補於骨頭缺損部位，即可促進骨頭再生。
骨頭再生材料除了含有OCP與膠原蛋白之外，亦可含有例如具有成骨能力(osteogenic ability)的細胞介質(骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2)、轉化生長因子β 1(transforming growth factor β 1)等)，藉由含有相關的細胞介質即可加速骨頭再生速度。
除了那些之外，骨頭再生材料可含有在該領域常用的摻配成分。作為相關的摻配成分而言，可例舉如生物可吸收性高分子(bioabsorbable polymer)(聚乙醇酸(polyglycolic acid)、 聚乳酸、聚乳酸-聚乙二醇共聚物(polylactic acid-polyethylene glycol copolymer)等)、OCP以外的生物可吸收性磷酸鈣(β-TCP等)。
[實施例]
以下雖藉由例舉實施例來詳細說明本發明，但本發明非以此為限定。
(實施例1)
(1)OCP之調製
首先，如以下方式調製OCP調製用的1液及2液。
[1液]將31.2g的磷酸二氫鈉二水合物溶解於2500g的蒸餾水以調製成1液。
[2液]將35.2g的乙酸鈣一水合物溶解於2500g的蒸餾水以調製成2液。
接著，將1液加入分離燒瓶並在加熱包以70℃升溫。接著，將攪拌葉片(葉片徑12cm)安裝於攪拌機(東京理化器械公司製，MAZELA Z)，一邊以250rpm的速度攪拌，一邊以28mL/min的速度將2液滴定於1液。滴定完成後，再以70℃、250rpm攪拌1液與2液的混合液2小時。
接著，利用膜過濾器(孔徑3μm，ADVANTEC東洋公司製，A300A293C)過濾上述混合液中生成的沉澱物並收 集。以1500mL的蒸餾水分散所收集的沉澱物並攪拌15分鐘予以洗滌。再重複3次同樣的過濾、洗滌之步驟。
接著，利用恆溫乾燥機以30℃乾燥洗滌後的沉澱物24小時。以電動研磨機粉碎乾燥後的沉澱物之後，利用篩子將粒徑分級至300μm至500μm，以獲得粉體。最後對所得到的粉體以120℃進行2小時的乾熱滅菌。
(2)OCP/膠原蛋白複合體(多孔質複合體)之調製
將1重量份的含有第I型及第III型膠原蛋白的豬皮來源膠原蛋白(日本火腿公司製，NMP膠原蛋白PS)溶解於冷卻至4℃的200重量份的蒸餾水，以獲得約0.5重量%的膠原蛋白溶液。一邊使液溫保持於4℃，一邊將氫氧化鈉水溶液加入膠原蛋白水溶液，並將pH調整成約7.4以得到膠原蛋白懸浮液。此時，膠原蛋白懸浮液的離子強度為約0.01。其次，將OCP(粒徑300μm至500μm)以OCP與膠原蛋白的重量比成為77：23之方式添加至膠原蛋白懸浮液之後，再於室溫下攪拌以獲得OCP/膠原蛋白懸浮液。
接著，將所獲得的OCP/膠原蛋白懸浮液加入離心瓶，利用離心機(TOMY精工公司製，GRX-250)以7000×g的離心力離心20分鐘。接著，清除上清液使得OCP/膠原蛋白懸浮液中的膠原蛋白成為3重量%，以獲得OCP/膠原蛋白複合凝膠。將其加入具有圓柱狀的內部空間之塑膠容 器(內徑8.5mm、容積約3.0cm3)，或是具有長方體狀的內部空間之塑膠容器(10mm×10mm×50mm)，以230×g的離心力離心1分鐘予以消泡。
將容器密閉，將被凍結體浸漬於相對於其容積為大量過剩且冷卻至-80℃的甲醇以急速凍結。打開容器後，藉由凍結乾燥機將凍結體進行乾燥(-10℃、48小時)並使之成形。接著，將其於減壓下以150℃加熱24小時以進行熱脫水交聯。以手術刀切割成厚度15mm的圓柱體、4mm×10mm×30mm的長方體。最後以電子射線照射(15kGy)來進行滅菌。以此方式獲得實施例1的多孔質複合體(OCP/膠原蛋白複合體)。
(實施例2)
在實施例2中調製多孔質複合體時，使用了減少NaCl含量的含有第I型及第III型膠原蛋白的豬皮來源膠原蛋白(減鹽膠原蛋白)。除此之外係藉由與實施例1相同的方法來獲得多孔質複合體(OCP/膠原蛋白複合體)。此外，減鹽膠原蛋白係以下述方法調製。
減鹽膠原蛋白之調製
將1重量份的含有第I型及第III型膠原蛋白的豬皮來源膠原蛋白(日本火腿公司製，NMP膠原蛋白PS)溶解於冷卻至4℃的200重量份的蒸餾水，以獲得約0.5重量%的膠原蛋白溶液。在豬皮來源膠原蛋白中所含有的NaCl 為4重量%。一邊使液溫保持於4℃，一邊將氫氧化鈉水溶液加入膠原蛋白水溶液，並將pH調整成約8.0以得到膠原蛋白懸浮液。接著，將膠原蛋白懸浮液加入離心瓶，利用離心機(TOMY精工公司製，GRX-250)以7000×g的離心力離心20分鐘。完全清除上清液並利用-35℃的冷凍庫凍結所獲得的膠原蛋白凝膠。藉由凍結乾燥機將凍結體進行乾燥並獲得減鹽膠原蛋白。以原子吸收分光光度法(atomic absorption spectrophotometry)(灰化)測定減鹽膠原蛋白中所含有的NaCl為1重量%。
(實施例3)
在實施例3中，將磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)添加至實施例1的膠原蛋白懸浮液以將離子強度調整成0.05。除此之外係藉由與實施例1相同的方法來獲得多孔質複合體(OCP/膠原蛋白複合體)。
(比較例1)
將1重量份的含有第I型及第III型膠原蛋白的豬皮來源膠原蛋白(日本火腿公司製，NMP膠原蛋白PS)溶解於冷卻至4℃的200重量份的蒸餾水，以獲得約0.5重量%的膠原蛋白溶液。一邊使液溫保持於4℃，一邊將氫氧化鈉水溶液加入膠原蛋白水溶液，並將pH調整成約7.4以得到膠原蛋白懸浮液。將磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)添加於此膠原蛋白懸浮液以將離子強度調整成0.1。接著， 將實施例1製備的OCP(粒徑300μm至500μm)以OCP與膠原蛋白的重量比成為77：23之方式添加至膠原蛋白懸浮液之後，再於室溫下攪拌以獲得OCP/膠原蛋白懸浮液。
接著，將所獲得的OCP/膠原蛋白懸浮液加入離心瓶，利用離心機(TOMY精工公司製，GRX-250)以7000×g的離心力離心20分鐘。接著，清除上清液使得OCP/膠原蛋白懸浮液中的膠原蛋白成為3重量%，以獲得OCP/膠原蛋白複合凝膠。將其加入具有圓柱狀的內部空間之塑膠容器(內徑8.5mm、容積約3.0cm3)，或是具有長方體狀的內部空間之塑膠容器(10mm×10mm×50mm)，以230×g的離心力離心1分鐘予以消泡。
將容器密閉，將被凍結體浸漬於相對於其容積為大量過剩且冷卻至-80℃的甲醇以急速凍結。打開容器後，藉由凍結乾燥機將凍結體進行乾燥(-10℃、48小時)並使之成形。接著，將其於減壓下以150℃加熱24小時以進行熱脫水交聯。以手術刀切割成厚度15mm的圓柱體、4mm×10mm×30mm的長方體。最後以電子射線照射(15kGy)來進行滅菌。以此方式獲得比較例1的多孔質複合體(OCP/膠原蛋白複合體)。
(比較例2)
在比較例2中，將磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)添加至 比較例1的膠原蛋白懸浮液以將離子強度調整成0.15。除此之外係藉由與比較例1相同的方法來獲得多孔質複合體(OCP/膠原蛋白複合體)。
(比較例3)
在比較例3中，一邊使液溫保持於4℃，一邊將氫氧化鈉水溶液加入約0.5重量%的膠原蛋白水溶液，以獲得pH為約7.4、離子強度為0.01的膠原蛋白懸浮液。更且，將放有OCP/膠原蛋白複合凝膠的容器放入-80℃的冷凍庫使之凍結，以取代浸漬於冷卻至-80℃的甲醇以急速凍結。除此之外係藉由與比較例1相同的方法來獲得多孔質複合體(OCP/膠原蛋白複合體)。
(比較例4)
羥基磷灰石/膠原蛋白複合體之調製
將含有第I型及第III型膠原蛋白的豬皮來源膠原蛋白(日本火腿公司製，NMP膠原蛋白PS)溶解於冷卻至4℃的蒸餾水，獲得約0.8重量%的膠原蛋白溶液。將等量的磷酸氫二鈉(sodium hydrogen phosphate)以及氯化鈉的混合液(30mM Na2HPO4、70mM NaCl)加入該膠原蛋白溶液中予以攪拌並獲得膠原蛋白懸浮液。此時，膠原蛋白懸浮液的離子強度為約0.07。
將膠原蛋白懸浮液均勻化(homogenize)之後，倒入離 心瓶內，利用離心機(TOMY精工公司製，GRX-250)以20000×g的離心力離心20分鐘。接著，清除上清液使得膠原蛋白懸浮液中的膠原蛋白成為5重量%，以獲得5重量%的膠原蛋白凝膠。
將羥基磷灰石(HA)(和光純藥工業公司製，Apatite HAP,monoclinic)以羥基磷灰石與膠原蛋白的重量比成為60：40之方式添加至5重量%的膠原蛋白凝膠之後，以藥勺混合。將其加入具有圓柱狀的內部空間之塑膠容器(內徑8.5mm、容積約3.0cm3)，或是具有長方體狀的內部空間之塑膠容器(10mm×10mm×50mm)，以230×g的離心力離心1分鐘予以消泡。
將容器密閉，並置於-20℃的冷凍庫予以凍結。打開容器後，藉由凍結乾燥機將凍結體進行乾燥(-10℃、48小時)並使之成形。接著，將其於減壓下以150℃加熱24小時以進行熱脫水交聯。以手術刀切割成厚度15mm的圓柱體、4mm×10mm×30mm的長方體。最後以電子射線照射(15kGy)來進行滅菌。以此方式獲得比較例4的羥基磷灰石/膠原蛋白複合體。
(比較例5)
在比較例5中，藉由離心濃縮獲得5重量%的膠原蛋白凝膠之後，再度將其均勻化並同樣以20000×g的離心力 離心20分鐘。最後，清除上清液使得膠原蛋白懸浮液中的膠原蛋白成為10重量%，以獲得10重量%的膠原蛋白凝膠。將羥基磷灰石(HA)(和光純藥工業公司製，Apatite HAP,monoclinic)以羥基磷灰石與膠原蛋白的重量比成為20：80之方式添加至10重量%的膠原蛋白凝膠之後，以藥勺混合。除此之外的地方係藉由與比較例4同樣的方式來獲得比較例5之羥基磷灰石/膠原蛋白複合體。
在實施例1至實施例3以及比較例1至比較例5中，於各實施例以及比較例中製備3個樣品。針對各樣品進行撓曲強度以及壓縮強度的測定，並分別求其平均值。此外，實施例之撓曲強度以及壓縮強度的測定係藉由下述具體的方法來進行。
(撓曲強度測定)
在溫度25℃、濕度65%的環境下，將於圖1所示之厚度(h)4mm、寬度(b)10mm、長度30mm的長方體狀試料浸漬於磷酸緩衝生理食鹽水(10mM磷酸鈉、0.14M氯化鈉、pH7.4)30分鐘。之後，輕拭樣品表面的水氣，並利用精密萬能試驗機(Autograph AGS-J，株式會社島津製作所製，荷重元：1kN)使其負荷如圖2所示之荷重。藉由所得之應力-應變曲線求得撓曲強度。
具體而言，參照圖2並將樣品1設置於支持台21(支 持台的半徑R1=5mm)之後，將安裝有半徑R2=5mm之壓頭的十字頭22以10mm/min的速度下降直至樣品斷裂為止。此外，在本試驗中，「樣品斷裂」意指如圖3所示的應力-應變曲線中荷重快速下降的點。
本發明之撓曲強度(σ)係從樣品的斷裂時之荷重、樣品的尺寸以及支點間的距離以式4表示。
σ=3FL/2bh2 (式4)
σ：撓曲強度(Pa)
F：斷裂時荷重(N)
L：支點間距離(mm)
b：樣品的寬度(mm)
h：樣品的厚度(mm)
此外，本試驗的支點間距離為20mm。
(壓縮強度測定)
在溫度25℃、濕度65%的環境下，將直徑8.5mm、長度15mm的圓柱狀試料浸漬於磷酸緩衝生理食鹽水(10mM磷酸鈉、0.14M氯化鈉、pH7.4)30分鐘。之後，輕拭試料表面的水氣，使用精密萬能試驗機(Autograph AGS-J，株式會社島津製作所製，荷重元：1kN)使其負荷如圖4所示之單軸荷重。接著，以在階段性地變化荷重時使樣品崩散的最小荷重作為崩散時的荷重。
具體而言，參照圖4並將樣品2設置於試料台41之後，將安裝有平型壓縮治具的十字頭42以10mm/min的速度下降，直至荷重元顯示為2.5N時停止十字頭42並解除荷重。觀察試料台的樣品，若無崩散則將此樣品放回試料台再度設置，同樣地，將十字頭下降至荷重元顯示為5N。每次以增加2.5N的荷重重複該操作，並以最初確定樣品崩散時的荷重作為崩散時荷重。此外，在本試驗中，「確認樣品的崩散」意指以肉眼觀察試料時有產生明確的龜裂或剝裂。
本發明之壓縮強度係從上述崩散時荷重與樣品的截面積(垂直於圓柱的厚度方向的截面之截面積)以式5表示。
Cs=F/S (式5)
Cs：壓縮強度(Pa)
F：崩散時荷重(N)
S：樣品的截面積(m2)
此外，樣品的截面積大約為(0.00425)2×3.14=5.67×10-5m2。
將上述實施例以及比較例的撓曲強度以及壓縮強度的測定結果示於圖1。
[表1]
從表1所示之結果得知，實施例1至實施例3的樣品(多孔質複合體)之撓曲強度為0.05MPa至0.16MPa且壓縮強度為0.3MPa以上，相較於以往的多孔質複合體，具有良好的加工性以及操作性。
雖然比較例1以及比較例2的樣品之壓縮強度為0.3MPa以上而具有足夠的操作性，但由於膠原蛋白纖維化時的離子強度高，而使撓曲強度變得比0.16MPa還高，從而變得難以容易加工。
比較例3的樣品之撓曲強度為適當的數值，雖可達成容易加工之事，但在凍結OCP與膠原蛋白的複合凝膠時，由於使用了藉由冷凍機而進行的緩慢的氣相冷卻，使得壓縮強度未滿0.3MPa而造成操作性變差的結果。
比較例4以及比較例5的樣品由於膠原蛋白纖維化時 的離子強度高，而使撓曲強度較0.16MPa高；又，在凍結羥基磷灰石與膠原蛋白的複合凝膠時，由於使用了藉由冷凍機而進行的緩慢的氣相冷卻，使得壓縮強度未滿0.3MPa而造成加工性以及操作性不佳。
(分解性測定)
有關於實施例1、實施例3、比較例1、比較例2的各樣品，將切割成厚度為約10mm的圓柱體的樣品浸漬於膠原蛋白酶溶液，測定膠原蛋白的可溶性蛋白質之比例，以測定多孔質複合體的生物分解性。
具體而言，有關於在實施例1、實施例3、比較例1、比較例2製備的各樣品，將切割成厚度為約10mm的圓柱體的樣品浸漬於0.2mg/mL的第I型膠原蛋白酶溶液(和光純藥工業公司製，180Unit/mg)，並在37℃下靜置72小時。作為控制組而言，不浸漬樣品而僅使膠原蛋白酶溶液在37℃下靜置72小時。之後，為測定溶液中所含有的可溶性蛋白質含量而使用二金雞鈉酸蛋白質分析套件(Thermo SCIENTIFIC公司製，Pierce BCA Protein Assay Kit)，並藉由微盤分析儀(BIO-RAD公司製，iMARK)以570nm的吸光度進行測定並定量上清液蛋白質含量(μg)。此外，標準物質係使用牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin；BSA)。以樣品中所含有的膠原蛋白重量(mg)除以定量的上清液蛋白質含量，求得可溶性蛋白質比例(%)。此外，膠原蛋白重量係 以約10mm的圓柱體重量乘以0.23而求得。將結果示於表2。
從表2所示之結果得知，膠原蛋白懸浮液的離子強度與可溶性蛋白質比例呈正相關，顯示出離子強度愈高時愈容易受膠原蛋白酶分解的傾向。藉由抑制多孔質複合體的分解性，可為了作為骨頭缺損部位的骨頭再生的基礎而長時間停留，更得以期望促進骨頭再生的功效。
本說明書中所揭示的所有實施形態以及實施例僅作為範例而非以限制為目的。本發明的範圍並非為上述之說明而是以申請專利範圍所請求之範圍所示，並可包含與申請專利範圍所請求之範圍具有均等的意思以及範圍內的所有變化。
[產業上的可利用性]
本發明的多孔質複合體以及含有該多孔質複合體的骨頭再生材料，由於兼顧加工容易性與機械強度而具有良好的操作性並且具有高度的骨頭再生能力，因此主要可有效地應用於牙科口腔外科領域、整形外科領域中的骨頭缺損修復。

Claims (4)

  1. 一種多孔質複合體的製造方法，係製造包含有第8磷酸鈣與膠原蛋白的多孔質複合體，該多孔質複合體的製造方法係包含：步驟(1)：將含有膠原蛋白的液體調製成離子強度為0.005至0.06且pH為6.0至9.0，並調製含有膠原蛋白的凝膠、溶膠、或液體；以及步驟(2)：將含有前述膠原蛋白的凝膠、溶膠、或液體與第8磷酸鈣混合得到懸浮液。
  2. 如請求項1所記載的多孔質複合體的製造方法，係更包含步驟(3)：將前述懸浮液浸漬於液態冷媒並急速凍結後，進行凍結乾燥。
  3. 一種多孔質複合體的製造方法，係製造包含有第8磷酸鈣與膠原蛋白的多孔質複合體，該多孔質複合體的製造方法係包含：步驟(1)：將含有膠原蛋白的液體與第8磷酸鈣混合得到懸浮液；以及步驟(2)：將前述懸浮液調製成離子強度為0.005至0.06且pH為6.0至9.0。
  4. 如請求項3所記載的多孔質複合體的製造方法，係更包含步驟(3)：將前述懸浮液浸漬於液態冷媒並急速凍結後，進行凍結乾燥。
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