WO2013005778A1 - 生体吸収性の傾斜した多孔質複合体及びそれを用いた人工骨、並びにそれらの製造方法 - Google Patents

生体吸収性の傾斜した多孔質複合体及びそれを用いた人工骨、並びにそれらの製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2013005778A1
WO2013005778A1 PCT/JP2012/067113 JP2012067113W WO2013005778A1 WO 2013005778 A1 WO2013005778 A1 WO 2013005778A1 JP 2012067113 W JP2012067113 W JP 2012067113W WO 2013005778 A1 WO2013005778 A1 WO 2013005778A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
porous composite
porous
collagen
bioabsorbability
phosphate
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/067113
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
田中 順三
生駒 俊之
朋彦 吉岡
嵩 吉田
Original Assignee
国立大学法人東京工業大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47437125&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2013005778(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 国立大学法人東京工業大学 filed Critical 国立大学法人東京工業大学
Priority to US14/130,841 priority Critical patent/US9119903B2/en
Priority to JP2013523039A priority patent/JP6157351B2/ja
Priority to EP12807115.6A priority patent/EP2730295B1/en
Publication of WO2013005778A1 publication Critical patent/WO2013005778A1/ja

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/58Materials at least partially resorbable by the body
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61FFILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02Prostheses implantable into the body
    • A61F2/28Bones
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/40Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
    • A61L27/42Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having an inorganic matrix
    • A61L27/425Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having an inorganic matrix of phosphorus containing material, e.g. apatite
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/40Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
    • A61L27/44Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix
    • A61L27/46Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix with phosphorus-containing inorganic fillers
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56Porous materials, e.g. foams or sponges
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Definitions

  • the present invention relates to a bioabsorbable inclined porous composite, an artificial bone using the same, and a production method thereof. According to the present invention, it is possible to provide an artificial bone that promotes bone tissue regeneration without losing strength in vivo.
  • a calcium phosphate / collagen complex obtained by adding collagen to calcium phosphate is expected as an artificial bone for bone regeneration. Since the calcium phosphate / collagen composite has osteoconductivity and exhibits flexibility not found in conventional ceramics, research into practical use as a scaffold material for bone regeneration has been studied. However, compared with a material made of conventional apatite, it is too soft and easily deforms by a slight load, so that there is a problem that it is difficult to apply to a load site as a template for bone regeneration.
  • JP 2009-132601 A JP 2010-273847 A JP 2001-286494 A JP 2008-18163 A JP 2007-98118 A
  • the present inventor can perform bone replacement by early bone remodeling in the regeneration of bone tissue by using a porous composite capable of cutting out the first fragment and the second fragment that are different in bioabsorbability by 1.5 times or more. It has been found that a calcium phosphate / collagen fiber complex is obtained that has excellent mechanical properties that can be induced and used at sites of load. Conventional calcium phosphate / collagen composites, as described above, place importance on osteoconductivity as a scaffold for bone regeneration, or place importance on mechanical strength as a template for bone regeneration. That is, there was no calcium phosphate / collagen composite for artificial bones that satisfies the induction of bone replacement and mechanical strength.
  • An object of the present invention is to provide a calcium phosphate / collagen fiber complex having excellent mechanical properties that can induce bone replacement by early bone remodeling and can be used at a site where a load is applied. is there.
  • the present inventors are able to induce bone replacement by early bone remodeling, and a calcium phosphate / collagen composite having excellent mechanical properties that can be used at a site where a load is applied.
  • a calcium phosphate / collagen composite having excellent mechanical properties that can be used at a site where a load is applied.
  • the above-mentioned problems can be solved by changing the bioabsorbability of the porous composite continuously or discontinuously. That is, the present inventors have found that a porous composite having an inclined bioabsorbability is useful for an artificial bone. Furthermore, the inventor has found that the bioabsorbable slope can be controlled by crosslinking.
  • the gradient of the crosslinking density can be controlled by using a glutaraldehyde vapor deposition method utilizing the volatilization and diffusion of glutaraldehyde.
  • radiation irradiation is excellent in substance permeability, so a homogeneous reaction is possible even inside the substance, but it is possible to control the gradient of the crosslinking density by controlling the amount of ⁇ -ray transmission using a tapered member.
  • complex with which bioabsorbability was inclined can be manufactured by these bridge
  • the present invention [1] A porous composite containing calcium phosphate crystals and collagen fibers in a weight ratio of 80:20 to 20:80, (1) the bioabsorbability is inclined, and (2) the density by gravimetry is 300 to 1500 mg / cm 3 , A porous composite, characterized by [2]
  • the inclination of the bioabsorbability is an intensity ratio by an indentation test using a 2 mm ⁇ cylindrical probe at two points of the porous composite, and the intensity ratio of the two points at a strain rate of 30% is 1.
  • the bioabsorbability gradient is such that the bioabsorbability of the porous composite changes continuously or discontinuously, and the first fragment having a high bioabsorbability and the second fragment having a slow bioabsorbability are porous.
  • the first fragment is cut out from a region of 30% by weight of the porous composite having a high swelling rate
  • the second fragment is 30% by weight of the porous composite having a low swelling rate. %
  • the ratio of the swelling rate of the first fragment to the swelling rate of the second fragment is 1.5 or more
  • the porous composite according to [3] [6] calcium phosphate is hydroxyapatite, calcium dihydrogen phosphate, calcium dihydrogen phosphate hydrate, calcium monohydrogen phosphate, calcium monohydrogen phosphate hydrate, octacalcium phosphate, tricalcium phosphate,
  • the porous composite according to any one of [1] to [5] which is at least one calcium phosphate selected from the group consisting of tetracalcium phosphate
  • An artificial bone comprising the porous composite according to any one of [1] to [6], [8] (A) The step of forming a porous composite containing calcium phosphate and collagen, and (B) The biore
  • a gradient cross-linking step to obtain a porous composite that is more than double A method for producing a porous composite, comprising: [9]
  • the porous complex forming step (A) includes (1) a crystal synthesis step for obtaining a crystal suspension of calcium phosphate or surface-modified calcium phosphate, and (2) fibrosis of collagen in the solubilized collagen solution.
  • the porous body forming step (A) includes: The method for producing a porous composite according to [8], which is a step of gelation by mixing a calcium phosphate / collagen composite fiber and a buffer solution and molding the mixture into a porous body.
  • the cross-linking in the gradient cross-linking step (B) is cross-linking by glutaraldehyde vapor deposition, and the bioabsorbability is 1.5 times or more by changing the diffusion amount of glutaraldehyde gas into the porous body.
  • the cross-linking in the inclined cross-linking step (B) is radiation cross-linking, and the bioabsorbability is different by 1.5 times or more by changing the radiation dose to the porous body in a wet environment.
  • a method for producing a porous composite according to any one of [8] to [10], wherein a composite is produced [13] The method for producing a porous composite according to [12], wherein the calcium phosphate crystal has a vinyl group introduced therein, [14]
  • the calcium phosphate is hydroxyapatite, calcium dihydrogen phosphate, calcium dihydrogen phosphate hydrate, calcium monohydrogen phosphate, calcium monohydrogen phosphate hydrate, octacalcium phosphate, tricalcium phosphate
  • the porous composite of the present invention in bone tissue regeneration, bone replacement can be induced by early bone remodeling, and it can be used at a site where a load is applied due to excellent mechanical properties.
  • it because it has a composition and physical properties similar to those of living hard tissues, it controls the space where bone replacement occurs early when bone remodeling is performed and the space where bone tissue is regenerated around the body for a long time.
  • the porous composite of the present invention can be used as a biomaterial such as a bone filling material or a scaffold material for regenerative medicine.
  • the artificial bone of the present invention using the porous composite it is possible to regenerate bone tissue or bone marrow tissue at the bone defect site.
  • the method for producing a porous composite of the present invention the calcium phosphate / collagen fiber for artificial bone satisfying the induction of bone replacement and the mechanical strength by controlling the crosslinking of the calcium phosphate / collagen fiber composite.
  • a composite can be produced.
  • Porous composite The porous composite of the present invention is a porous composite containing calcium phosphate crystals and collagen fibers in a weight ratio of 80:20 to 20:80, and (1) bioabsorbable (2)
  • the density by gravimetric method is 300 to 1500 mg / cm 3 , and preferably, the bioabsorbability gradient is the bioabsorbability of the porous composite.
  • the first fragment that changes continuously or discontinuously, the first bioabsorbable fast fragment and the second bioabsorbable second fragment can be excised from the porous composite, and the first bioabsorbable and second The ratio of the fragments to the bioabsorbability is 1.5 or more.
  • the slope of bioabsorbability can be expressed by the ratio of bioabsorbability at two specific points of the porous composite, but is preferably 2 times or more, more preferably 3 times or more, and more preferably Is 5 times or more, and most preferably 10 times or more. Moreover, although an upper limit is not specifically limited, 1000 times or less are preferable.
  • Examples of calcium phosphate that can be used for the calcium phosphate crystals include Ca (H 2 PO 4 ) 2 , Ca (H 2 PO 4 ) 2 .H 2 O, CaHPO 4 , CaHPO 4 .2H 2 O, and Ca 3 (PO 4 ) 2. , Ca 3 (PO 4 ) 2 ⁇ 2H 2 O, Ca 8 H 2 (PO 4 ) 6 ⁇ 5H 2 O, Ca 3 (PO 4 ) 2 , Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 , Ca 4 O
  • a group of compounds such as (PO 4 ) 2 , CaP 4 O 11 , Ca (PO 3 ) 2 , Ca 2 P 2 O 7 , and the like can be given.
  • Hydroxyapatite is a kind of calcium phosphate that occupies 60 to 80% of the components of living bones, and a basic component is a compound represented by a composition formula of Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 .
  • a part of the Ca component of the hydroxyapatite may be substituted with one or more selected from Sr, Ba, Mg, Fe, Al, Y, La, Na, K, H, etc., and (PO 4 )
  • a part may be substituted with one or more selected from VO 4 , BO 3 , SO 4 , CO 3 , SiO 4 and the like, and a part of the (OH) component may be F, Cl, O, CO 3, etc. It may be substituted with one or more selected from Moreover, some of each of these components may be missing.
  • the calcium phosphate crystal may contain one or more calcium phosphate crystals such as hydroxyapatite and tricalcium phosphate, hydroxyapatite and calcium monohydrogen phosphate, and hydroxyapatite and octacalcium phosphate. .
  • Collagen Collagen is known to have different molecular species of about 28 types in living tissues of a wide range of animals including mammals and fish.
  • Collagen that can be used in the porous composite of the present invention is not particularly limited in terms of animal species, tissue site, age, etc. as a starting material, but mammals (eg, cows, pigs, horses, rabbits, mice, etc.) ) Or collagen obtained from the skin, bones, cartilage, tendons, organs, etc. of birds (eg chicken), or fish (eg cod, flounder, flatfish, salmon, trout, tuna, mackerel, Thai, sardine, shark, Collagen protein obtained from skin, bone, cartilage, fin, scale, organ, etc. of tilapia etc. can be used.
  • collagen artificially obtained by gene recombination technology may be used instead of extraction from the animal tissue.
  • fish-derived collagen that does not contain pathogens such as zoonotic viruses.
  • pathogens such as zoonotic viruses.
  • scale collagen that can concentrate collagen at high density is preferable.
  • type I, II, III, and type V collagen are fiber type collagens.
  • the amino acid sequence of collagen has a primary structure in which glycine repeats every 3 residues. This repeated sequence is called a collagen-like sequence and is a characteristic of collagen protein.
  • Collagen that can be used in the present invention is limited to the above-mentioned fibrillar collagen, but amino acid residues in collagen are acetylated, succinylated, maleylated, phthalated, benzoylated, esterified, amidated, Chemically modified products such as guanidinolation can also be used.
  • the weight ratio of calcium phosphate crystals and collagen contained in the porous composite of the present invention is preferably 80:20 to 20:80, more preferably 80:20 to 50:50, most preferably 80:20 to 70:30.
  • the porous composite becomes brittle, and the collagen exceeds 80% by weight (calcium phosphate crystal is less than 20% by weight).
  • the porous composite becomes weak and lacks mechanical strength.
  • the weight ratio of calcium phosphate crystals to collagen is 80:20 to 20:80, the artificial bone has excellent mechanical strength such as bending fracture strain and bending elastic modulus, and excellent bioabsorbability.
  • a porous composite can be obtained.
  • the weight ratio of calcium phosphate crystals to collagen can be measured by analyzing the weight ratio of calcium phosphate crystals to collagen in the porous composite, but the calcium phosphate crystals / collagen fiber mixed suspension in the manufacturing process of the porous composite It can also be defined by the weight ratio of calcium phosphate and collagen contained in the liquid.
  • the porous composite of the present invention is a composite of calcium phosphate crystals and collagen fibers, but is characterized in that bioabsorbability changes continuously or discontinuously.
  • bioabsorbability changes continuously or discontinuously.
  • a calcium phosphate crystal / collagen fiber complex for artificial bones satisfying the induction of bone replacement and mechanical strength can be obtained.
  • a portion having excellent bioabsorbability is generally excellent in inducing bone replacement, and a portion having resistance to bioabsorbability has excellent mechanical strength.
  • the index indicating the bioabsorbability is not particularly limited, and for example, strength (for example, strength by indentation test, bending fracture strain, and flexural modulus), density, crosslink density, degree of swelling, porosity, pore diameter, although it can be expressed by an index such as a communicating pore diameter or a biodegradation rate by collagenase, in particular, strength by indentation test, degree of swelling, or biodegradation rate by collagenase is preferable.
  • strength for example, strength by indentation test, bending fracture strain, and flexural modulus
  • density crosslink density
  • degree of swelling porosity
  • the change in bioabsorbability is induced by the production conditions of the porous composite, and can be achieved particularly by the crosslinking conditions described later.
  • This crosslinking condition reflects the strength, swelling degree, or biodegradation rate by collagenase by the indentation test. Therefore, these three indices are preferable as indices indicating bioabsorbability.
  • a porous composite whose bioabsorbability changes continuously can be obtained by continuously changing the production conditions of the porous composite. For example, it can be obtained by continuously changing the crosslink density of the porous composite as described later.
  • a porous composite whose bioabsorbability changes discontinuously can be obtained, for example, by laminating porous composites having different bioabsorbability obtained by changing production conditions. It can also be obtained by discontinuously changing the crosslink density of the porous composite as described later.
  • the porous composite of the present invention From the porous composite of the present invention, at least two fragments that differ in bioabsorbability by 1.5 times or more, that is, a first fragment having a high bioabsorbability and a second fragment having a slow bioabsorbability can be cut out.
  • the first fragment and the second fragment can be cut out from any region of the porous composite as long as the bioabsorbability differs by 1.5 times or more.
  • the first fragment and the second fragment are obtained from the laminated porous composites, respectively. Can do.
  • the manufacturer can control the conditions for crosslinking by, for example, glutaraldehyde vapor deposition or radiation, so that the porous composite It is possible to accurately cut out the first fragment and the second fragment that are different in bioabsorbability by 1.5 times or more. Furthermore, even if it is not the manufacturer of the porous composite, the region containing the first fragment with high bioabsorbability of the porous composite and the second fragment with low bioabsorbability are included as described later. It is easy to identify the included region. Thus, the first and second fragments can be excised from those identified regions.
  • the indentation test can be performed without cutting the two pieces from the porous composite. That is, it is possible to measure the bioabsorbable slope without cutting out the two fragments.
  • the strength ratio in the indentation test which is one of the indices indicating bioabsorbability, can be measured as follows.
  • the mechanical strength of several parts of the obtained porous composite is measured by an indentation tester.
  • the intensity ratio can be obtained by comparing the intensity of two points of the intensity of each part.
  • a normal method can be used, and is not limited, but can be performed by the following method.
  • the porous composite is immersed in a Dulbeccos phosphate buffer solution, and an indentation test is performed using a texture analyzer (TA-XTplus).
  • a P / 2 2 mm ⁇ cylindrical probe As a cylinder, a P / 2 2 mm ⁇ cylindrical probe is used, and measurement is performed at several arbitrary points (for example, 5 points) of the porous composite. Using the obtained mechanical strength, for example, a strength ratio at 1.5% strain was observed to be 1.5 times or more.
  • the mechanical strength of the porous composite is not limited, but is preferably 1N to 1600N, more preferably 100N to 1000N, and still more preferably 300N to 500N.
  • the strength ratio of the two points of the porous composite is not limited as long as it is 1.5 times or more, but is preferably 2.0 times or more, and more preferably 5.0 times or more. Although an upper limit is not limited, 10 times or less are preferable.
  • a specific treatment with collagenase can be performed, for example, as follows. Approximately 10 mg of a sample piece (fragment; 0.1 ⁇ 0.1 ⁇ 1.0 cm) is taken from the porous complex by biopsy trepan. A Dulbeccos phosphate buffer solution (pH 7.2) containing collagenase 2.0 units (0.01 mg) / mL or 200 units (1 mg) / mL was prepared, and the sample piece (fragment) placed in a multiwell plate was allowed to stand. Add 3 mL each. The multiwell plate is placed in a 37 ° C. bioshaker and allowed to react for 6 hours (2.0 units) or 0.5 hours (200 units) while shaking at 50 rpm.
  • the sample piece is taken out and washed with pure water for 1 hour.
  • the washed sample piece is frozen at ⁇ 20 ° C. in a deep freezer and then freeze-dried.
  • the dry weight of the obtained sample is measured, and the biodegradation rate is determined by the relational expression (I).
  • the bioabsorbability is determined based on the biodegradation rate when immersed in a 2.0 unit / mL collagenase solution for 6 hours. However, if the biodegradation rates of the first fragment and the second fragment are both 5% or less and are hardly decomposed, the biodegradability is determined by the biodegradation rate when immersed in a 200 unit / mL collagenase solution for 0.5 hour. Make gender decisions.
  • the difference in biodegradation rate can be determined by adjusting the immersion time to an arbitrary time of 0.5 to 24 hours under the condition of a collagenase solution of 200 mL / mL or 200 units / mL.
  • the region containing the first fragment with high bioabsorbability of the porous complex and the region containing the second fragment with low bioabsorbability are preliminarily determined in the porous complex.
  • the region other than the region (A) and the region (B) is a region (C) having a medium biodegradation rate.
  • the region (A) can be a region of 10 to 30% by weight with a high biodegradation rate in the porous composite, but a region with a fast biodegradation rate of 20% by weight is preferable and the biodegradation rate is fast. A region of 30% by weight is more preferred.
  • the biodegradation rate is 1.5 with at least one combination of one first fragment cut from the region (A) and one second fragment cut from the region (B). If the difference is twice or more, the effect of the present invention can be obtained. That is, the effect of the present invention can be obtained as long as it is possible to cut out the first fragment and the second fragment that differ in biodegradation rate by a factor of 1.5 or more in one porous composite. . However, it is most preferable that the biodegradation rate differs by 1.5 times or more between a combination of an arbitrary first fragment cut out from the region (A) and an arbitrary second fragment cut out from the region (B).
  • the region (A) and the region (B) can be determined as follows.
  • a Dulbeccos phosphate buffer solution with pH 7.2 containing collagenase 2.0 units (0.01 mg) / mL or 200 units (1,0 mg) / mL is prepared, and an appropriate amount is determined according to the volume of the porous complex sample. Add the solution. For example, about 50 times the amount of the solution is added to the sample volume. Samples and solutions are placed in a 37 ° C. bioshaker and allowed to react for 1, 3, 12, 18, 24 hours with shaking at 50 rpm. After the reaction, a sample is taken out and washed with pure water for 1 hour. The sample is frozen in a deep freezer at ⁇ 20 ° C. and lyophilized.
  • Biodegradation rate (W 0 ⁇ W t ) / W 0 ⁇ 100 (I) From the biodegradation rate of 1 to 24 hours, it is possible to determine a region (A) having a fast biodegradation rate of 10 to 30% by weight and a region (B) having a slow biodegradation rate of 10 to 30% by weight.
  • the weight of the first fragment and the second fragment of the porous composite is not particularly limited as long as the biodegradation rate can be measured, but is preferably 5 to 30 mg, more preferably 5 to 20 mg. About 10 mg is most preferred. Further, the weight of the first fragment and the second fragment can be measured for the biodegradation rate with different weights, but approximately the same weight is preferable. In the case of different weights, the difference in weight is preferably 5 mg or less, and more preferably 2 mg or less.
  • the shapes of the first fragment and the second fragment of the porous composite are not particularly limited as long as the biodegradation rate can be measured, but a cube (regular hexahedron), a rectangular parallelepiped, a prism ( For example, a right-angle column) or a fragment of a shape such as a cylinder can be used.
  • a cube regular hexahedron
  • a rectangular parallelepiped For example, a right-angle column
  • a fragment of a shape such as a cylinder
  • a cylindrical fragment can be obtained.
  • FIG. 1 fragments of a portion that is resistant to bioabsorbability (portion with advanced cross-linking (21)) and a portion with excellent bioabsorbability (portion with low cross-linking (22)) are cut out, The decomposition rate can be measured.
  • the collagenase used for measuring the biodegradation rate is not particularly limited, but a collagenase derived from the genus Clostridium can be used.
  • the biodegradation rate of the portion where bone replacement occurs early is not particularly limited, but preferably, it is a condition when treated with a 2.0 unit / mL collagenase solution for 6 hours. It is 40% or more, more preferably 50% or more, and most preferably 60% or more. This is because when the biodegradation rate due to collagen is 40% or more, the bioresorbability is good, bone replacement at the time of bone regeneration occurs early, and bone regeneration is likely to proceed.
  • the biodegradation rate of the portion having mechanical strength is not particularly limited, but is preferably 30% or less, more preferably 15% or less, and most preferably 5% or less. When the biodegradation rate of collagen is 30% or less, it has biocompatibility, has a certain mechanical strength while allowing bone replacement, and remains in the living body for a long period of time, leaving bone tissue around it. An area to be reproduced can be provided.
  • the difference between the biodegradation rate of the portion having good bioabsorbability and the biodegradation rate of the portion having mechanical strength is not particularly limited as long as it is 1.5 times or more, but preferably 2 times or more. More preferably, it is 5 times or more, and most preferably 10 times or more. Moreover, although an upper limit is not specifically limited, 1000 times or less are preferable.
  • the difference between the biodegradation rate of the part with good bioabsorbability and the biodegradation rate of the part with mechanical strength is 1.5 times or more, satisfying the balance between induction of bone replacement and mechanical strength in a balanced manner Can be obtained.
  • the specific degree of swelling is not particularly limited, but can be measured by the following method.
  • a sample piece (fragment) of about 10 mg is taken from the porous composite.
  • the sample piece (fragment) is impregnated with 10 mL of a phosphate buffer solution manufactured by Dulbeccos. After impregnation, leave at 37 ° C. for 24 hours. Thereafter, the sample is quickly taken out, allowed to stand on a Kimwipe for 2 minutes, and then weighed. From the weight of the obtained sample, the swelling ratio is determined according to the relational expression (II).
  • the region including the first fragment having a high bioabsorbability of the porous composite and the region including the second fragment having a low bioabsorbability are determined in advance. It can be identified by measuring the swelling rate. For example, the entire swelling rate of the porous composite is measured, the region (A) having a high swelling rate of the porous composite is defined as a region (A) of 10 to 30% by weight, and the region of the porous composite is cut out. The region (B) having a low swelling ratio of 10 to 30% by weight can be determined as a region from which the second fragment is cut out.
  • the region other than the region (A) and the region (B) is a region (C) having a medium swelling ratio.
  • the region (A) can be a region having a high swelling ratio of 10 to 30% by weight in the porous composite, but a region having a high swelling rate of 20% by weight is preferable, and a region having a high swelling rate of 30% by weight. The region is more preferable.
  • at least one combination of one first fragment cut from the region (A) and one second fragment cut from the region (B) has a swelling ratio of 1.5 times. If different from the above, the effects of the present invention can be obtained. That is, the effect of the present invention can be obtained if it is possible to cut out the first fragment and the second fragment that differ in swelling ratio by a maximum of 1.5 times or more in one porous composite. However, it is most preferable that the swelling rate differs by 1.5 times or more between a combination of an arbitrary first fragment cut out from the region (A) and an arbitrary second fragment cut out from the region (B).
  • the region (A) and the region (B) can be determined as follows.
  • the porous composite is impregnated into a phosphate buffer solution manufactured by Dulbeccos, for example, in four parts.
  • An appropriate amount of phosphate buffer solution is adjusted according to the volume of the porous composite sample. For example, about 50 times the amount of solution is added to the volume of each sample.
  • the sample and solution are allowed to stand at 37 ° C. for 24 hours. Comparing the obtained sample with a sample that has not been impregnated, it is possible to determine a region (A) having a high swelling ratio of 10 to 30% by weight and a region (B) having a low swelling ratio of 10 to 30% by weight. it can.
  • the weight of the first fragment and the second fragment of the porous composite is not particularly limited as long as the swelling rate can be measured, but is preferably 5 to 30 mg, more preferably 5 to 20 mg, About 10 mg is most preferred. Moreover, the weight of the first fragment and the second fragment can measure the swelling ratio even when the weights are different, but approximately the same weight is preferable. In the case of different weights, the difference in weight is preferably 5 mg or less, and more preferably 2 mg or less.
  • the shapes of the first fragment and the second fragment of the porous composite are not particularly limited as long as the swelling rate can be measured.
  • a cube regular hexahedron
  • a rectangular parallelepiped for example, , A right prism
  • a fragment of a shape such as a cylinder.
  • a cylindrical fragment can be obtained.
  • fragments of a portion resistant to bioabsorbability portion with advanced cross-linking (21)
  • a portion with excellent bioabsorbability portion with low cross-linking (22)
  • the swelling rate of the portion where bone replacement occurs early is not particularly limited, but is preferably 80% or more, more preferably 100% or more, and most preferably 120%. % Or more. This is because when the swelling ratio is 80% or more, the bioresorbability is good, and bone replacement at the time of bone regeneration occurs at an early stage, and the bone regeneration is likely to proceed.
  • the swelling ratio of the portion having mechanical strength is not particularly limited, but is preferably 70% or less, more preferably 60% or less, and most preferably 50% or less. An area where the swelling rate is 70% or less, has biocompatibility, has a certain mechanical strength while enabling bone replacement, and remains in the living body for a long period of time to regenerate bone tissue around it Can be provided.
  • the difference between the swelling rate of the portion having good bioabsorbability and the swelling rate of the portion having mechanical strength is not particularly limited as long as it is 1.5 times or more, but preferably 1.5 times or more. More preferably, it is 2.0 times or more, and most preferably 3 times or more. Moreover, although an upper limit is not specifically limited, 1000 times or less are preferable.
  • the difference between the swelling rate of the part with good bioabsorbability and the swelling rate of the part with mechanical strength is 1.5 times or more, so that artificial replacement satisfying the balance of induction of bone replacement and mechanical strength in a balanced manner. You can get bones.
  • the density of the porous composite of the present invention is preferably 300 to 1500 mg / cm 3 , more preferably 500 to 1400 mg / cm 3 , and most preferably 750 to 1200 mg / cm 3 by weight method.
  • the density by the gravimetric method can be calculated by molding a cylindrical or plate-like porous composite and dividing the weight by the volume obtained by measuring with a caliper.
  • the porous composite of the present invention can contain other components.
  • the weight ratio between the calcium phosphate crystals and collagen and other components is not particularly limited as long as the density is within the above range, but the calcium phosphate crystals and collagen are preferably 70% by weight or more based on the total weight of the porous composite, More preferred is 75% by weight or more, and most preferred is 80% by weight or more.
  • a porous complex composed of calcium phosphate crystals and collagen is also included in the scope of the present invention. Since the porous composite of the present invention obtains strength by the content of calcium phosphate crystals and cross-linking between collagen fibers, if the calcium phosphate crystals and collagen are less than 70% by weight of the total weight, the strength may decrease, which is not preferable. .
  • porous composite examples include “tethering materials” that have affinity for collagen and calcium phosphate crystals, or drugs used for bone treatment.
  • binder examples include gelatin, glycosaminoglycan, and alginic acid.
  • bioabsorbable polyester such as polylactic acid, and functional polysaccharides such as ⁇ 1-3 glucan, chitin, and chitosan. You can also.
  • Glycosaminoglycan (hereinafter sometimes referred to as GAG) is a polysaccharide having a basic skeleton composed of a repeating structure of hexuronic acid or a disaccharide unit of galactose and hexosamine.
  • the hydroxyl group is partially sulfated and the amino group is acetylated or sulfated.
  • the hexuronic acid include glucuronic acid and iduronic acid
  • examples of the hexosamine include glucosamine and galactosamine.
  • GAG examples include hyaluronic acid (HA), chondroitin, chondroitin sulfate (CS), heparin, heparan sulfate, keratan sulfate, keratan polysulfate, and the like.
  • HA hyaluronic acid
  • CS chondroitin sulfate
  • heparin heparan sulfate
  • keratan sulfate examples include keratan sulfate
  • keratan polysulfate examples include hyaluronic acid (HA), chondroitin, chondroitin sulfate (CS), heparin, heparan sulfate, keratan sulfate, keratan polysulfate, and the like.
  • hyaluronic acid known to promote blood vessel induction in bone regeneration or chondroitin sulfate widely present in hard tissues is preferable.
  • the biodegradable gradient may be continuous or discontinuous. Moreover, you may incline continuously or discontinuously toward the other from one side of a porous composite_body
  • the artificial bone of the present invention contains the porous composite or consists of the porous composite. That is, it can be used as an artificial bone for bone regeneration at the time of bone defect satisfying the guidance of bone replacement and mechanical strength.
  • the shape of the artificial bone of the present invention is not particularly limited, and can be molded according to the shape of the damaged affected part.
  • the target disease of the artificial bone of the present invention is not particularly limited, but bone tumor (chondroma, scoliosis), artificial joint replacement / replacement, bone fracture, posterior cervical fusion, osteoarthritis of the hip, pseudo Mention may be made of joints, femoral head necrosis, and osteomyelitis.
  • bone tumor chondroma, scoliosis
  • artificial joint replacement / replacement bone fracture
  • posterior cervical fusion posterior cervical fusion
  • osteoarthritis of the hip pseudo Mention may be made of joints, femoral head necrosis, and osteomyelitis.
  • the method for producing the porous composite of the present invention comprises: (A) a step of forming a porous body containing calcium phosphate and collagen, and (B) a porous composite having a bioabsorbability of 1.5 times or more by performing a cross-linking treatment in which the cross-linking density is changed on the porous body.
  • a gradient crosslinking process including.
  • the porous body forming step (A) comprises: (1) Crystal synthesis step for obtaining a crystal suspension of calcium phosphate or surface-modified calcium phosphate, (2) Collagen fibrosis step for obtaining collagen fiber suspension by fibrillating collagen in solubilized collagen solution, (3 ) Mixing the collagen fiber suspension and the calcium phosphate crystal suspension to obtain a calcium phosphate crystal / collagen fiber mixed suspension; (4) Making the calcium phosphate crystal / collagen fiber mixed suspension into a porous body This is a molding step.
  • the porous composite as described in item [1] can be manufactured with the manufacturing method of the porous composite of this invention.
  • Crystal synthesis step (1) Ca (H 2 PO 4 ) 2 , Ca (H 2 PO 4 ) 2 .H 2 O, CaHPO 4 , CaHPO 4 .2H 2 O, Ca 3. (PO 4) 2, Ca 3 (PO 4) 2 ⁇ 2H 2 O, Ca 8 H 2 (PO 4) 6 ⁇ 5H 2 O, Ca 3 (PO 4) 2, Ca 10 (PO 4) 6 (OH)
  • a hydroxyapatite crystal is particularly preferable.
  • the calcium phosphate crystal can be adjusted according to a conventional method such as a wet method, a dry method, a hydrothermal method, an alkoxide method, or a flux method.
  • a hydroxyapatite crystal can be adjusted by the following wet method. .
  • hydroxyapatite calcium hydroxide (or calcium carbonate) and phosphoric acid are reacted in a solution at a temperature of about room temperature to about 80 ° C., and the obtained hydroxyapatite microcrystalline powder is 100 ° C. or less. Can be obtained by drying.
  • a white suspension (so-called slurry) insoluble in water can be obtained by mixing a calcium hydroxide aqueous solution (or calcium carbonate) and a phosphoric acid aqueous solution.
  • a calcium hydroxide aqueous solution a calcium hydroxide suspension in which calcium hydroxide is not completely dissolved can be used. It is desirable to drop the aqueous phosphoric acid solution so that the pH of the reaction solution is in the range of 7 to 11 and the range of change is within 1, and the pH is in the range of 7 to 9 and the range of change is within 0.5. More preferably.
  • a calcium phosphate crystal suspension can be obtained by calcining the obtained suspension at 50 ° C. to 1200 ° C.
  • the crystal adjustment step (1) use a surface-modified calcium phosphate crystal in which a vinyl group that is cross-linked by radiation is introduced into the calcium phosphate crystal.
  • the introduction of the vinyl group can be carried out according to a conventional method, but can be carried out as follows using, for example, trimethoxyvinylsilane.
  • the liquid phase is separated from the hydroxyapatite crystal suspension by centrifugation, and the solvent is replaced with ethanol. This operation is repeated three times to prepare a hydroxyapatite crystal suspension (6.0 mg / mL) suspended in ethanol.
  • trimethoxyvinylsilane was added to purified water to prepare a trimethoxyvinylsilane solution (20% by weight).
  • the trimethoxyvinylsilane solution is added to the hydroxyapatite crystal suspension so that the weight ratio is 9: 1, and the concentration of the hydroxyapatite is adjusted to 6% by weight.
  • the mixture was stirred for 18 hours by inversion, and then the supernatant was removed by centrifugation and dried in the air at 100 ° C. for 2 hours.
  • the introduction of the vinyl group can be performed by infrared spectrum analysis. As shown in FIG.
  • Collagen fibrosis step (2) solubilized collagen derived from mammals or fish is dissolved in an aqueous solvent such as water.
  • a neutral buffer solution is mixed into the acid-solubilized collagen solution to precipitate collagen fibers, thereby obtaining a collagen fiber suspension.
  • the pH of the acid-solubilized collagen solution is preferably between 2.0 and 6.0.
  • the pH suitable for collagen fibrillation varies depending on the type of collagen, but is often in the range of pH 5 to 9, that is, in the neutral range, and a neutral buffer is used.
  • As a condition of a neutral buffer solution for fibrillating collagen it is important that an appropriate ionic strength and pH are neutral. As long as these conditions are satisfied, the buffer solution is not particularly limited.
  • the phosphate solution has no or low cytotoxicity. It is preferable to use an aqueous salt solution having a buffer capacity such as a salt, acetate, carbonate, citrate or Tris.
  • a buffer capacity such as a salt, acetate, carbonate, citrate or Tris.
  • it is a neutral buffer solution that is inexpensive, non-toxic to the living body, and is more vigorous in causing collagen fibrosis than other neutral buffer solutions.
  • Sodium aqueous solution is preferred.
  • the collagen fibers in the collagen fiber suspension may be concentrated by centrifugation or pressure dehydration to obtain a high concentration collagen fiber suspension.
  • Centrifugation can be performed by repeating the centrifugation and homogenization of the collagen fiber suspension about 1 to 10 times. More specifically, the centrifugation is not particularly limited as long as moisture can be separated from the collagen fibers, but is preferably performed at 2000 g to 20000 g.
  • the centrifuge GRX-220 Tomy Seiko Co., Ltd.
  • Centrifugation with a centrifuge is performed to separate collagen fibers and moisture, and then moisture is removed to obtain paste-like collagen fibers.
  • the paste-like collagen fibers are homogenized using a homogenizer to facilitate separation of water retained between the collagen fibers.
  • the centrifugal separation is further repeated using a centrifuge to remove the separated water.
  • a homogenizer a commonly used one can be used.
  • a cell master manufactured by ASONE
  • the homogenizer can be used at 5000 rpm.
  • the number of centrifugations is not limited, but can be about 1 to 10 times. From the viewpoint of efficiency, it is preferably 1 to 8 times, more preferably 1 to 5 times, most preferably Perform about 1 to 3 times.
  • concentration When concentration is performed by pressure dehydration, the concentration may be performed once, but pressure dehydration and homogenization may be repeated and performed about 1 to 10 times.
  • concentration of collagen fibers in the collagen fiber suspension before centrifugation or pressure dehydration is about 0.4 to 0.5% by weight, but it is 10% by weight or more by centrifugation or pressure dehydration. Can be obtained.
  • the collagen fiber suspension (including the high-concentration collagen fiber suspension) and the calcium phosphate crystal suspension are mixed, and the calcium phosphate crystal / collagen fiber mixed suspension is mixed.
  • the calcium phosphate crystal suspension to be mixed with the collagen fiber suspension is not particularly limited, but is preferably a hydroxyapatite crystal suspension.
  • it is preferable to deaerate the obtained liquid mixture for example, using a swing centrifuge etc., after fully stirring. This is to prevent air bubbles from being mixed when freeze-drying.
  • the porous body forming step (4) is a step of forming a calcium phosphate crystal / collagen fiber mixed suspension into a porous body, and a conventionally known method is used as a method of forming the porous body. Specifically, a freeze-drying method and the like can be mentioned.
  • a freeze-drying method is used as a method for forming a porous body, a forming container having a desired size and shape is prepared, and a calcium phosphate crystal / collagen fiber mixed suspension is poured into the container.
  • the material of the molded container is not limited as long as it can withstand freezing by a refrigerator and decompression by a freeze dryer, but for example, silicon rubber can be used, and any size and shape can be used.
  • the calcium phosphate / high-concentration collagen fiber mixed suspension in the molded container is frozen at ⁇ 80 to ⁇ 0 ° C. by a refrigerator.
  • the frozen calcium phosphate / high-concentration collagen fiber mixed suspension is put into a freeze-dryer and freeze-dried at a shelf temperature of ⁇ 30 to 40 ° C. until there is no water.
  • collagen fibers in the porous body may be crosslinked by thermal dehydration in order to obtain a certain level of mechanical strength. That is, thermal dehydration crosslinking can be performed by performing a treatment at 130 ° C. for about 24 hours under a reduced pressure atmosphere.
  • the porous body forming step (A) comprises: This is a step of gelation by mixing a calcium phosphate / collagen composite fiber and a buffer solution to form a porous body. This step is a method for producing a porous material described in JP-A-2007-98118.
  • calcium phosphate is not particularly limited, but is preferably hydroxyapatite. Specifically, lyophilization may be performed after mixing the hydroxyapatite / collagen composite fiber and the buffer solution, but lyophilization can be performed after the gradient crosslinking step (B) described later.
  • incubation may be performed after mixing the hydroxyapatite / collagen composite fiber and the buffer.
  • the c-axis of hydroxyapatite is preferably oriented in the fiber axis direction.
  • Hydroxyapatite / collagen composite fibers have sponge elasticity due to the c-axis of hydroxyapatite being oriented in the fiber axis direction by mixing with a buffer solution. The problem of operability can be solved.
  • the buffer used in the present invention is a solvent in which ionic species and ionic strength are controlled.
  • Various buffer solutions can be used.
  • the ionic strength as a value in the paste-like hydroxyapatite / collagen composite, is in the range of 0.01 to 0.5 mol / L, particularly in the range of 0.02 to 0.2 mol / L. preferable.
  • the porous body can be prepared as follows. (1) Hydroxyapatite / collagen composite fiber (HAp / Col: mixing ratio is 80/20) 1 g and phosphate buffer (0.1 mol / L, pH 6.8) 8 mL until uniform Mix and incubate to form a gel. (2) The gel-like mixture was poured into a mold (such as a ⁇ 53 mm polystyrene dish for cell culture or a 24-well plate for cell culture, which can be appropriately selected). The obtained porous body can be used in the following gradient crosslinking step.
  • a mold such as a ⁇ 53 mm polystyrene dish for cell culture or a 24-well plate for cell culture, which can be appropriately selected.
  • the cross-linking method in the inclined cross-linking step is a cross-linking method capable of producing a porous composite capable of cutting out the first fragment and the second fragment different by 1.5 times or more,
  • wet crosslinking method using aldehyde, isocyanate, carbodiimide crosslinking agent, tannin, crosslinking method using metal ions (chromium, iron, etc.), ultraviolet irradiation method, thermal crosslinking, glutaraldehyde A vapor deposition method or a radiation irradiation method can be mentioned, but a glutaraldehyde vapor deposition method or a radiation irradiation method is preferable.
  • a crosslinking treatment with a changed crosslinking density is performed by these crosslinking methods.
  • the glutaraldehyde vapor deposition method can be performed by an ordinary method. That is, glutaraldehyde [OHC (CH 2 ) 3 CHO] is diluted with purified water to prepare a 1 to 25% glutaraldehyde solution. In chemical crosslinking using glutaraldehyde vapor, the concentration of glutaraldehyde affects diffusion.
  • the diffusion rate can be controlled by adjusting the concentration of the glutaraldehyde solution.
  • this glutaraldehyde solution in an open container (for example, a glass bottle or petri dish), put the glutaraldehyde solution and the sample to be crosslinked in a desiccator, etc. at 37 ° C for about 1 to 24 hours React.
  • glutaraldehyde diffuses from the surface of the sample and causes cross-linking between amino groups or between amino groups and SH groups.
  • the gradient crosslinking can be performed by preventing diffusion of glutaraldehyde from the surface where weak crosslinking is desired to be introduced. Specifically, it is possible to introduce a gradient of cross-linking by covering the surface where it is desired to suppress diffusion of glutaraldehyde with a film or the like.
  • the membrane is not particularly limited as long as it is a membrane that does not permeate glutaraldehyde, or a membrane that can inhibit permeation.
  • An ethylene or polystyrene film can be used, and a polystyrene film is particularly preferable.
  • the porous body can be produced as follows. Porous bodies having different collagen concentrations can be obtained by preparing porous bodies with different mixing ratios of collagen and apatite and laminating these porous bodies. By irradiating this porous body with radiation, a porous composite having two parts different in bioabsorbability by 1.5 times or more can be obtained.
  • the gradient when a radiation irradiation method is used, the gradient can be introduced by introducing a functional group sensitive to radiation (for example, a vinyl group) into calcium phosphate. Moreover, even if the amount of the functional group of calcium phosphate is the same, the inclination can be introduced by adjusting the radiation dose.
  • a functional group sensitive to radiation specifically, a vinyl group into calcium phosphate can be performed by the method described in the above “(1) Crystal synthesis step”.
  • the porous material can be produced as follows. A plurality of calcium phosphate crystal suspensions with different vinyl group introduction amounts are prepared. These calcium phosphate crystal suspensions are mixed with a collagen suspension to prepare a plurality of porous bodies having different vinyl group introduction amounts. By laminating these porous bodies, porous bodies having portions with different vinyl group introduction amounts can be obtained. By irradiating this porous body with radiation, a porous composite having two parts different in bioabsorbability by 1.5 times or more can be obtained.
  • Inclination can also be introduced by adjusting the radiation dose.
  • the method for adjusting the radiation dose to the porous body is not particularly limited, but can be performed by using, for example, a lead plate having a taper.
  • a “taper” of a triangular pyramid is used to irradiate radiation from above the triangular pyramid.
  • the central portion of the triangular pyramid has a thick taper, so that irradiation is reduced and radiation crosslinking is unlikely to occur. Therefore, it becomes a part excellent in bioabsorbability and swelling property and weak in mechanical strength.
  • the periphery of the triangular pyramid has a thin taper, irradiation is increased and radiation crosslinking is likely to occur. Therefore, it is resistant to bioabsorbability and has high mechanical strength.
  • the radiation source used for radiation irradiation is not particularly limited, ⁇ rays, electron beams, or ⁇ rays can be used, but ⁇ rays are preferable.
  • cross-linking occurs between collagens or at a collagen-apatite interface, and therefore the steric distance between them is important. That is, the higher the density, the stronger the crosslinking.
  • the characteristics of radiation cross-linking include excellent material permeability, cross-linking occurs in a uniform distribution in the molecule, cross-linking density can be easily adjusted, and cross-linking can be performed regardless of the shape.
  • the crosslinking of the porous composite by radiation can be performed in a wet state or a dry state, but it is preferably performed in a wet state. This is because, when carried out in a wet state, the collagen molecules are not decomposed by cleavage of the peptide bonds, and the collagens can be efficiently cross-linked.
  • the water content is not particularly limited, but is preferably the same as the volume of the porous body or 1 to 10 times. It is also possible to replace the atmosphere with an inert gas such as nitrogen or argon.
  • Example 1 a porous composite was produced by the glutaraldehyde vapor deposition method.
  • (I) Preparation of Hydroxyapatite Crystal Suspension Hydroxyapatite crystals were synthesized by a wet method. To a 0.5 mol / L calcium hydroxide suspension (4 liters), a 0.6 mol / L phosphoric acid aqueous solution (2 liters) was slowly added dropwise until the pH reached 7.5. The obtained suspension was dried at 120 ° C., and further calcined at 1200 ° C. for 30 minutes using an electric furnace. It was confirmed that the hydroxyapatite synthesized by powder X-ray diffraction measurement was a single phase.
  • Glutaraldehyde (GA) gas cross-linking was performed as follows. A GA solution (25%) was diluted with purified water to prepare a 10% solution. 20 mL of the GA solution was added to the petri dish and allowed to stand in a desiccator together with the prepared sample (10 mm ⁇ 10 mm ⁇ 10 mm; sample A). The desiccator was decompressed, placed in a constant temperature dryer at 37 ° C., and allowed to react for 3, 6, 12, 24 hours. The five sides of sample A were covered with a polystyrene film so that GA gas diffused and reacted only from one side (FIG. 1A).
  • the resulting porous composite is referred to as Sample A-GA.
  • the inclination of cross-linking by GA can be confirmed visually. That is, the central part of the sample subjected to GA treatment for 3 hours was cut with a scalpel and observed. From the surface where the GA gas diffused, the color changed from yellow to white in order, and the diffusion surface was considered to be more cross-linked. Further, in the sample treated with GA for 6 hours, the density could be confirmed more clearly.
  • Example 2 In this example, a swollen porous composite was produced by irradiation.
  • (I) Preparation of suspension of hydroxyapatite crystals and introduction of vinyl group Hydroxyapatite crystals were synthesized by a wet method. To a 0.5 mol / L calcium hydroxide suspension (4 liters), a 0.6 mol / L phosphoric acid aqueous solution (2 liters) was slowly added dropwise until the pH reached 7.5. The obtained suspension was dried at 120 ° C. and further calcined at 1200 ° C. for 30 minutes using an electric furnace. It was confirmed that the hydroxyapatite synthesized by powder X-ray diffraction measurement was a single phase.
  • the vinyl group was introduced as follows.
  • the hydroxyapatite suspension was subjected to solid-liquid separation by centrifugation, and the solvent was replaced with ethanol. This operation was repeated three times to prepare a hydroxyapatite suspension (60 mg / mL).
  • trimethoxyvinylsilane was added to purified water to prepare a methoxyvinylsilane solution (20% by weight).
  • the methoxyvinylsilane solution was added to the hydroxyapatite suspension so that the weight ratio was 9: 1. At this time, the concentration of hydroxyapatite was adjusted to 6% by weight.
  • Example 3 Preparation of Hydroxyapatite / Collagen Composite Fiber An aqueous solution in which 2.0 g of tilapia-derived collagen is dissolved in 0.15 mol / L phosphoric acid (200 mL) and a 0.25 mol / L calcium hydroxide suspension The liquid (200 mL) was adjusted. Moreover, the 1000 mL beaker which added 200 mL purified water was prepared. The prepared two liquids were simultaneously added to purified water at 25 ° C. at a dropping rate of 4 mL / min so that the pH became constant at 8.0 ⁇ 0.5.
  • the supernatant was removed by suction filtration, and the resulting hydroxyapatite / collagen composite fiber was frozen at ⁇ 20 ° C. and lyophilized.
  • TG-DTA thermal analysis
  • Comparative Example 1 Except that the vinyl group was not introduced in step (i) of Example 2, the operation of Example 2 was repeated, and sample D, which was a complex in step (iii), was obtained in step (iv). Sample Dg, which is a porous composite, was obtained.
  • Reference Example 1 a swollen porous composite was produced by carrying out radiation crosslinking without grading the crosslinking.
  • Sample C was obtained by repeating the operations (i), (ii), and (iii) of Example 2.
  • (Iv) Radiation cross-linking Sample C placed in a centrifuge tube was irradiated with ⁇ -rays (50 KGy) using a cobalt 60 radiation source. After irradiation, the sample was frozen at ⁇ 20 ° C. for one day and freeze-dried for 48 hours. Thermal dehydration crosslinking was further introduced by treatment at 130 ° C. for 24 hours under reduced pressure. The resulting porous composite is referred to as Sample C- ⁇ .
  • Reference Example 2 a radiation-induced cross-linking was performed without making the cross-linking gradient, and a dried porous composite was produced. The operations of (i) and (ii) of Example 2 were repeated to obtain a hydroxyapatite crystal suspension and a collagen fiber suspension.
  • the prepared complex was frozen at ⁇ 20 ° C. for one day and further freeze-dried for 48 hours. Thermal dehydration crosslinking was introduced by treatment at 130 ° C. for 24 hours under reduced pressure. The resulting dried composite is referred to as Sample A.
  • (Iv) Radiation Crosslinking The produced dry composite A was put in a sterilized sheet, adsorbed oxygen with an oxygen scavenger, and then irradiated with ⁇ rays at a dose of 50 KGy using a cobalt 60 radiation source. The resulting porous composite is referred to as Sample A- ⁇ .
  • Comparative Example 3 a dry porous composite was produced by subjecting a sample into which a vinyl group had not been introduced to radiation cross-linking without inclining the cross-linking. The operations of (i) and (ii) of Comparative Example 1 were repeated to obtain a hydroxyapatite crystal suspension and a collagen fiber suspension. (Iii) Preparation of dried porous composite Hydroxyapatite crystal suspension was mixed with collagen fiber suspension at a weight ratio of 4: 6. For mixing, a cell master was used and mixed and stirred sufficiently.
  • the prepared composite gel (hydroxyapatite crystal / collagen fiber mixed suspension) was further placed in a 25 mL centrifuge tube and defoamed (5 minutes) using a swing centrifuge (1000 G).
  • the prepared complex was frozen at ⁇ 20 ° C. for one day and further freeze-dried for 48 hours.
  • Thermal dehydration crosslinking was introduced by treatment at 130 ° C. for 24 hours under reduced pressure.
  • the resulting dried composite is referred to as Sample B.
  • (Iv) Radiation Crosslinking The produced dry composite B was placed in a sterilized sheet, adsorbed with oxygen by an oxygen scavenger, and then irradiated with ⁇ -rays with a dose of 50 KGy using a cobalt 60 radiation source.
  • the resulting porous composite is referred to as Sample B- ⁇ .
  • region (A) and region (B) by biodegradation rate by collagenase The region including the first fragment having a high bioabsorbability of the porous composite and the region including the second fragment having a low bioabsorbability were determined by a biodegradability test using collagenase.
  • a Dulbeccos phosphate buffer solution having a pH of 7.2 containing collagenase 2.0 units (0.01 mg) / mL or 200 units (1.0 mg) / mL was prepared, and the sample A-GA obtained in Example 1 was treated with 0. To 3 g of the porous composite, 30 mL of Dulbeccos phosphate buffer solution was added. Samples and solutions were placed in a 37 ° C.
  • Biodegradation rate (W 0 ⁇ W t ) / W 0 ⁇ 100 (I)
  • the time-series weight change obtained from the biodegradation rate of the above equation is about 20% biodegradation after 1 hour, about 40% biodegradation after 12 hours, and 60% biodegradation after 24 hours. Became a rate.
  • the decomposition performance can be roughly divided into three stages according to the time series change. That is, from the sample reacted with GA gas for 3 hours, it was possible to determine a region of 30% by weight with a fast biodegradation rate and a region of 30% by weight with a slow biodegradation rate.
  • FIG. 1B A biopsy trepan containing 10 mg of a 30% by weight region with slow cross-linked biodegradation of sample A-GA reacted for 6 hours and 10 mg of a 30% by weight region with fast non-cross-linked biodegradation rate (Fig. 1B).
  • Each sample A-GA was immersed in a 2.0 nit / mL collagenase solution or a Dulbeccos phosphate buffer solution containing 200 units / mL.
  • a multiwell plate was used as a container, 3 mL of collagenase solution was added, and the mixture was reacted for a predetermined time while shaking at 50 rpm.
  • each sample was taken out, washed with purified water for 1 hour, and lyophilized under the same conditions as in the preparation of the porous composite of (iii) to obtain the biodegradation rate (relational formula (I)).
  • the biodegradation rate of the fragment in the portion where crosslinking was advanced was about 10%
  • the biodegradation rate of the fragment in the portion where crosslinking was not advanced was 90%. Therefore, the ratio of the biodegradation rate of the second fragment to the biodegradation rate of the first fragment was 9.0.
  • Region (A) and Region (B) by Swelling Ratio The region containing the first fragment with high bioabsorbability of the porous composite and the region containing the second fragment with low bioabsorbability were determined by measuring the swelling rate.
  • Sample Cg which is a porous composite obtained in Example 2, was divided into four pieces. 300 mL of Dulbeccos phosphate buffer solution was added to and impregnated into 0.3 g of the divided porous composite piece. Samples and solutions were allowed to stand at 37 ° C. for 24 hours. The obtained sample is compared with a similarly divided sample that has not been impregnated, and a region having a high swelling ratio of 10 to 30% by weight (A) and a region having a low swelling ratio of 10 to 30% by weight (B). Were determined.
  • FIG. 1 (B) shows 10 mg of the 30% by weight region (A) having a high swelling rate and 10 mg of the 30% by weight region (B) having a low swelling rate of the sample Cg obtained in Example 2. It cut out by the same method. It left still at normal temperature for 24 hours in the container containing 5 mL purified water. In order to remove excess water, it was allowed to stand on a filter paper for 1 minute. Thereafter, the wet weight was measured, and the swelling ratio was determined from the relational expression (III). The swelling rate of the fragments with increased ⁇ -ray irradiation was about 20%, but the swelling rate of the fragments with reduced ⁇ -ray irradiation was 40%. Therefore, the ratio of the swelling rate of the second fragment to the swelling rate of the first fragment was 2.0.
  • the horizontal axis is the amount of strain, and the vertical axis is the stress (SS curve).
  • the compressive strength was more than twice as high as that of the material not irradiated with ⁇ rays.
  • the compressive strength was comparable between irradiation at 25 kGy and 50 kGy, and that there was a necessary maximum irradiation amount at 25 kGy.
  • Vinylsilane-modified hydroxyapatite and concentrated collagen (8 wt%) are uniformly dispersed so that the mixing weight ratio is 60/40, and gamma rays are 3.125 kGy, 6.25 kGy, 12.5 kGy, and 25 kGy in a humid environment. Irradiated with a dose of Thereafter, the sample was frozen and freeze-dried at ⁇ 20 ° C., and then it was wetted in a Dulbeccos phosphate buffer solution at room temperature for 4 hours for a compression test. The result is shown in FIG. The abscissa indicates the ⁇ dose applied, and the ordinate indicates the stress at a certain strain (40%, 50%, or 60%).
  • the porous composite of the present invention can be used as a biomaterial such as a bone filling material or a scaffold material for regenerative medicine, or an artificial bone.
  • a biomaterial such as a bone filling material or a scaffold material for regenerative medicine, or an artificial bone.
  • porous body 11 ... polystyrene film; 2 ... porous composite; 21... Part resistant to bioabsorbability (part with advanced crosslinking); 22: A portion having excellent bioabsorbability (a portion where crosslinking does not proceed); 31 ... Taper (triangular pyramid).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)

Abstract

 本発明の目的は、早期の骨リモデリングにより骨置換を誘導することができ、且つ荷重のかかる部位に使用することのできる優れた機械的性質を有するリン酸カルシウム/コラーゲン線維複合体を提供することである。 前記課題は、リン酸カルシウム結晶とコラーゲン線維とを、80:20~20:80の重量比で含む多孔質複合体であって、(1)生体吸収性が傾斜していること、及び(2)重量法による密度が300~1500mg/cmであること、を特徴とする多孔質複合体によって解決することができる。

Description

生体吸収性の傾斜した多孔質複合体及びそれを用いた人工骨、並びにそれらの製造方法
 本発明は、生体吸収性の傾斜した多孔質複合体及びそれを用いた人工骨、並びにそれらの製造方法に関する。本発明によれば、生体内で強度を損なわずに骨組織再生を促進する人工骨を提供することができる。
 骨組織はコラーゲン及び水酸アパタイトがナノレベルで相互作用し、コラーゲン線維に沿って水酸アパタイトが整列し、更にその集合体が階層構造を形成している。この階層構造とコラーゲン同士の相互作用により、極めて優れた力学特性を示すものである。
 骨組織が欠損した場合の治療法としては、患者自身の腸骨や脾骨等を使用する自家骨移植が主流である。しかし、自家骨移植は二次手術が必要なため、患者への負担が大きく、更に、摘出部位における感染が生じる場合がある。また、自家骨の採取量も限られるため、自家骨の代わりに人工骨を用いる方法や、自家骨の不足する部分を人工骨による補填材により補充する方法が試みられている。
 従来、人工骨としては、骨伝導能を有するリン酸カルシウムからなるセラミックス系人工骨が使用されていたが、セラミックス特有の脆性による術後の破損やハンドリングの悪さが臨床現場で指摘されていた。更に、人工骨は、生体適合性及び骨伝導性などの生理学的性質が必要である。すなわち、自家骨は吸収と再生という代謝を繰り返すのに対し、アパタイトからなる人工骨は生体内でほとんど溶解しないため、生体内に半永久的に残存する。骨再生に用いられる人工骨には、骨親和性に加えて、骨組織と融合し、骨再生を積極的に促す効果も必要である。従って、生体適用後徐々に吸収され、骨再生サイクルに取り込まれて自身の骨に置換していくための、骨伝導性や生体活性が求められる。
 この観点から、リン酸カルシウムにコラーゲンを加えたリン酸カルシウム/コラーゲン複合体が、骨再生用の人工骨として期待されている。リン酸カルシウム/コラーゲン複合体は骨伝導能をもち、これまでのセラミックスにはない柔軟性を示すことから、骨再生の足場材料としての実用化研究が検討されている。しかしながら従来のアパタイトからなる材料と比較すると、柔らかすぎるため、わずかの荷重により容易に変形するために、骨再生のテンプレートとして荷重部位には適用しにくいという問題があった。
 このようなリン酸カルシウム/コラーゲン複合体の開発には、骨再生の足場として骨伝導性を重視する方向性と、骨再生のテンプレートとして機械的強度を重視する2つの方向性がある。例えば、前者のリン酸カルシウム/コラーゲン複合体として、乾燥させたアパタイト/コラーゲン複合体線維にγ線を照射して、強度の半減期を短く調整した多孔体が開示されている(特許文献1)。一方、コラーゲン線維の濃度を上昇させ、密度を130~600mg/cmと高めることにより、生体骨に近い強い強度や弾性などの機械的性質が優れたリン酸カルシウム/コラーゲン線維複合体が開示されている(特許文献2)。
 しかしながら、骨再生の足場として、骨リモデリングにより早期に骨置換を起こすことが可能で、且つ荷重のかかる部位に使用することのできる優れた機械的性質を有するリン酸カルシウム/コラーゲン複合体は開発されていなかった。
特開2009-132601号公報 特開2010-273847号公報 特開2001-286494号公報 特開2008-18163号公報 特開2007-98118号公報
 本発明者は、生体吸収性が1.5倍以上異なる第1の断片と第2の断片を切り出すことのできる多孔質複合体により、骨組織の再生において、早期の骨リモデリングにより骨置換を誘導することができ、且つ荷重のかかる部位に使用することのできる優れた機械的性質を有するリン酸カルシウム/コラーゲン線維複合体が得られることを見出した。
 従来のリン酸カルシウム/コラーゲン複合体は、前記のように骨再生の足場として骨伝導性を重視するもの、又は骨再生のテンプレートとして機械的強度を重視するものであった。すなわち、骨置換の誘導と、機械的強度とを満足する人工骨用のリン酸カルシウム/コラーゲン複合体は存在しなかった。
 コラーゲンを用いないアパタイト又はリン酸カルシウム系の人工骨においては、気孔率の異なる部分を組み合わせた人工骨(特許文献3)、又は気孔率が傾斜化している人工骨(特許文献4)が開示されている。しかしながら、これらの人工骨は、骨置換を誘導するための生体吸収性を考慮したものではなかった。
 本発明の目的は、早期の骨リモデリングにより骨置換を誘導することができ、且つ荷重のかかる部位に使用することのできる優れた機械的性質を有するリン酸カルシウム/コラーゲン線維複合体を提供することである。
 本発明者らは、骨組織の再生において、早期の骨リモデリングにより骨置換を誘導することができ、且つ荷重のかかる部位に使用することのできる優れた機械的性質を有するリン酸カルシウム/コラーゲン複合体について鋭意、研究を進めた結果、多孔質複合体における生体吸収性を連続又は不連続に変化させることにより、前記課題を解決できることを見出した。すなわち、生体吸収性が傾斜している多孔質複合体が、人工骨に有用であることを見出した。更に、本発明者は、生体吸収性の傾斜が架橋によって制御することが可能であることを見出した。例えば、グルタルアルデヒドが揮発及び拡散することを利用したグルタルアルデヒド気相蒸着法を用いることにより、架橋密度の傾斜を制御できることを見出した。また、放射線照射は物質透過性に優れているため、物質内部まで均質な反応が可能であるが、テーパーした部材を用いてγ線の透過量を制御することで架橋密度の傾斜制御ができることを見出した。そしてこれらの架橋法により、生体吸収性が傾斜している多孔質複合体を製造することができることを見出した。
 本発明は、こうした知見に基づくものである。
 すなわち、本発明は、
[1]リン酸カルシウム結晶とコラーゲン線維とを、80:20~20:80の重量比で含む多孔質複合体であって、
(1)生体吸収性が傾斜していること、及び
(2)重量法による密度が300~1500mg/cmであること、
を特徴とする多孔質複合体、
[2]前記生体吸収性の傾斜が、多孔質複合体の2つの点における、2mmφの円柱状プローブを用いた押し込み試験による強度比であり、歪率30%における2点の強度比が1.5倍以上である、[1]に記載の多孔質複合体、
[3]前記生体吸収性の傾斜が、多孔質複合体の生体吸収性が連続又は不連続に変化し、生体吸収性の速い第1の断片及び生体吸収性の遅い第2の断片を多孔質複合体から切り出すことができ、そして第1の断片の生体吸収性と第2の断片の生体吸収性との比が1.5以上である、[1]に記載の多孔質複合体、
[4]前記生体吸収性がコラゲナーゼによる生分解率であって、生分解率は、関係式(I):
生分解率=(W-W)/W×100(I)
〔式中、W及びWは、多孔質複合体の断片を2unit/mLのコラゲナーゼ溶液により6時間浸漬した場合、又は多孔質複合体の断片を200unit/mLのコラゲナーゼ溶液により0.5時間浸漬した場合の、浸漬前の乾燥重量(W)及び浸漬後の乾燥重量(W)である〕で表され、前記第1の断片が、多孔質複合体の生分解率の速い30重量%の領域から切り出され、第2の断片が多孔質複合体の生分解率の遅い30重量%の領域から切り出され、第1の断片の生分解率に対する第2の断片の生分解率の比が1.5以上である、[3]に記載の多孔質複合体、
[5]前記生体吸収性が膨潤率であって、膨潤率は、関係式(II):
膨潤率=(W-W)/W×100(II)
〔式中、W及びWは、それぞれ、多孔質複合体の断片を、リン酸緩衝溶液により24時間浸漬した場合の、浸漬前の乾燥重量(W)及び浸漬後の湿潤重量(W)である〕で表され、前記第1の断片が、多孔質複合体の膨潤率の高い30重量%の領域から切り出され、第2の断片が多孔質複合体の膨潤率の低い30重量%の領域から切り出され、第2の断片の膨潤率に対する第1の断片の膨潤率の比が1.5以上である、[3]に記載の多孔質複合体、
[6]リン酸カルシウムが、水酸アパタイト、リン酸二水素カルシウム、リン酸二水素カルシウム水和物、リン酸一水素カルシウム、リン酸一水素カルシウム水和物、リン酸八カルシウム、リン酸三カルシウム、及びリン酸四カルシウムからなる群から選択される少なくとも1種のリン酸カルシウムである、[1]~[5]のいずれかに記載の多孔質複合体、
[7][1]~[6]のいずれかに記載の多孔質複合体を含む人工骨、
[8](A)リン酸カルシウム及びコラーゲンを含む多孔質複合体を形成する工程、及び
(B)前記多孔質複合体に架橋密度を変化させた架橋処理を行うことによって、生体吸収性が1.5倍以上異なる多孔質複合体を得る傾斜架橋工程、
を含む、多孔質複合体の製造方法、
[9]前記多孔質複合体形成工程(A)が、(1)リン酸カルシウム、又は表面修飾されたリン酸カルシウムの結晶懸濁液を得る結晶合成工程、(2)可溶化コラーゲン溶液中のコラーゲンを線維化し、コラーゲン線維懸濁液を得る、コラーゲン線維化工程、(3)前記コラーゲン線維懸濁液とリン酸カルシウム結晶懸濁液とを混合し、リン酸カルシウム結晶/コラーゲン線維混合懸濁液を得る、混合工程、(4)前記リン酸カルシウム結晶/コラーゲン線維混合懸濁液を多孔体に成形する工程である、[8]に記載の多孔質複合体の製造方法、
[10]前記多孔体形成工程(A)が、
リン酸カルシウム/コラーゲン複合繊維と緩衝液との混合によりゲル化させ、多孔体に成形する工程である、[8]に記載の多孔質複合体の製造方法、
[11]前記傾斜架橋工程(B)における架橋がグルタルアルデヒド気相蒸着法による架橋であって、多孔体へのグルタルアルデヒドガスの拡散量を変化させることにより、生体吸収性が1.5倍以上異なる多孔質複合体を作製する、[8]~[10]のいずれかに記載の多孔質複合体の製造方法、
[12]前記傾斜架橋工程(B)における架橋が、放射線照射架橋であって、湿潤環境下において多孔体への放射線照射量を変化させることにより、生体吸収性が1.5倍以上異なる多孔質複合体を作製する、[8]~[10]のいずれかに記載の多孔質複合体の製造方法、
[13]前記リン酸カルシウム結晶が、ビニル基が導入されたものである、[12]に記載の多孔質複合体の製造方法、
[14]前記リン酸カルシウムが、水酸アパタイト、リン酸二水素カルシウム、リン酸二水素カルシウム水和物、リン酸一水素カルシウム、リン酸一水素カルシウム水和物、リン酸八カルシウム、リン酸三カルシウム、及びリン酸四カルシウムからなる群から選択される少なくとも1種のリン酸カルシウムである、[8]~[13]のいずれかに記載の多孔質複合体の製造方法、
に関する。
 本発明の多孔質複合体によれば、骨組織の再生において、早期の骨リモデリングにより骨置換を誘導することができ、且つ優れた機械的特性により荷重のかかる部位に使用することができる。すなわち、生体硬組織と類似した組成及び物性を有するため、生体内に移植すると骨リモデリングに伴い早期に骨置換が生じる空間と長期にわたり生体内に残り周囲に骨組織を再生させる空間を制御することで、生体内で強度を損なわず骨組織再生を促進する傾斜機能を実現する材料である。本発明の多孔質複合体は、骨補填材料又は再生医療用足場材料などの生体材料として用いることができる。また、多孔質複合体を用いた本発明の人工骨によれば、骨欠損部位において、骨組織や骨髄組織を再生させることが可能である。
 また本発明の多孔質複合体の製造方法によれば、リン酸カルシウム/コラーゲン線維複合体の架橋を制御することによって、骨置換の誘導と、機械的強度とを満足する人工骨用のリン酸カルシウム/コラーゲン線維複合体を製造することができる。
グルタルアルデヒド気相蒸着法による、多孔体への傾斜架橋の導入を模式的に表した図である。 放射線照射法による、多孔体への傾斜架橋の導入を模式的に表した図である。 トリメトキシビニルシランにより水酸アパタイトに導入されたトリメトキシ基を、赤外線スペクトル分析で調べたグラフである。 水酸アパタイトの表面におけるトリメトキシ基の導入を模式的に表した図である。 湿潤環境下でのγ線照射により、多孔質複合体の圧縮強度が上昇することを示した図である。 湿潤環境下でのγ線照射の量を増加させることにより、40%歪率、50%歪率、及び60%歪率における圧縮強度が顕著に向上することを示した図である。
[1]多孔質複合体
 本発明の多孔質複合体は、リン酸カルシウム結晶とコラーゲン線維とを、80:20~20:80の重量比で、含む多孔質複合体であって、(1)生体吸収性が傾斜していること、(2)重量法による密度が300~1500mg/cmであること、を特徴とし、好ましくは、前記生体吸収性の傾斜は、多孔質複合体の生体吸収性が連続又は不連続に変化し、生体吸収性の速い第1の断片及び生体吸収性の遅い第2の断片を多孔質複合体から切り出すことができ、そして第1の断片の生体吸収性と第2の断片の生体吸収性との比が1.5以上であることである。
 生体吸収性の傾斜は、多孔質複合体の特定の2つの点における生体吸収性の比で表すことができるが、好ましくは2倍以上であり、より好ましくしくは3倍以上であり、より好ましくは5倍以上であり、最も好ましくは10倍以上である。また、上限は特に限定されるものではないが、1000倍以下が好ましい。
(リン酸カルシウム結晶)
 リン酸カルシウム結晶に用いることのできるリン酸カルシウムとしては、Ca(HPO、Ca(HPO・HO、CaHPO、CaHPO・2HO、Ca(PO、Ca(PO・2HO、Ca(PO・5HO、Ca(PO、Ca10(PO(OH)、CaO(PO、CaP11、Ca(PO、Ca、等の1群の化合物を挙げることができるが、特には、水酸アパタイト、リン酸二水素カルシウム、リン酸二水素カルシウム水和物、リン酸一水素カルシウム、リン酸一水素カルシウム水和物、リン酸一水素カルシウム水和物、リン酸八カルシウム、又はリン酸三カルシウムが好ましく、水酸アパタイトが最も好ましい。水酸アパタイトは、生体骨の成分の60~80%を占めるリン酸カルシウムの1種であり、Ca10(PO(OH)の組成式で示される化合物を基本成分とする。水酸アパタイトのCa成分の一部分は、Sr、Ba、Mg、Fe、Al、Y、La、Na、K、H等から選ばれる1種以上で置換されてもよく、また(PO)成分の一部分が、VO、BO、SO、CO、SiO等から選ばれる1種以上で置換されてもよく、更に、(OH)成分の一部分が、F、Cl、O、CO等から選ばれる1種以上で置換されてもよい。また、これらの各成分の一部が欠損していてもよい。
 上記のリン酸カルシウム結晶として、水酸アパタイトとリン酸三カルシウムや、水酸アパタイトとリン酸一水素カルシウムや、水酸アパタイトとリン酸八カルシウムなどの1種以上のリン酸カルシウム結晶を含有していてもよい。
(コラーゲン)
 コラーゲンは、28種類程度の分子種の異なるものが、哺乳動物、及び魚類を含む広範な動物の生体組織中に存在することが知られている。本発明の多孔質複合体に用いることのできるコラーゲンは、その出発原料とする動物の種、組織部位、年齢等は特に限定されないが、哺乳動物(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ネズミ等)若しくは鳥類(例えば、ニワトリ等)の皮膚、骨、軟骨、腱、臓器等から得られるコラーゲン、又は魚類(例えば、タラ、ヒラメ、カレイ、サケ、マス、マグロ、サバ、タイ、イワシ、サメ、ティラピア等)の皮、骨、軟骨、ひれ、鱗、臓器等から得られるコラーゲンタンパク質を用いることができる。更には、前記の動物組織からの抽出ではなく、遺伝子組み替え技術によって人工的に得られたコラーゲンを用いてもよい。特には、生体内に移植する人工骨として使用することを考えた場合、人畜共通ウイルスなどの病原体の存在しない魚類由来のコラーゲンを用いることが好ましい。また、放射線による架橋では、コラーゲン同士、又はコラーゲン―アパタイト界面の立体的距離が重要であるため、コラーゲンを高密度に濃縮できるウロココラーゲンが好ましい。
 コラーゲンには、I型コラーゲンからVIII型の分子種が知られており、I、II、III、及びV型コラーゲンが線維型コラーゲンである。コラーゲンのアミノ酸配列は、グリシンが3残基ごとに繰り返す一次構造を有しており、この繰り返し配列は、コラーゲン様配列と呼ばれ、コラーゲンタンパク質の特徴である。本発明で用いることのできるコラーゲンは、前記の線維型コラーゲンに限定されるが、コラーゲン中のアミノ酸残基を、アセチル化、コハク化、マレイル化、フタル化、ベンゾイル化、エステル化、アミド化、グアニジノ化等といった化学修飾したものを用いることもできる。
(重量比)
 本発明の多孔質複合体に含まれるリン酸カルシウム結晶とコラーゲンとの重量比は、好ましくは80:20~20:80であり、より好ましくは、80:20~50:50であり、最も好ましくは、80:20~70:30である。コラーゲンが20重量%未満である(リン酸カルシウム結晶が80重量%を超える)と多孔質複合体は、脆性が顕著になり、コラーゲンが80重量%を超える(リン酸カルシウム結晶が20重量%未満である)と、多孔質複合体は弱くなり、機械的強度が不足する。換言すると、リン酸カルシウム結晶とコラーゲンとの重量比が、80:20~20:80であることにより、人工骨として曲げ破断歪み、及び曲げ弾性率などの機械的強度に優れ、且つ生体吸収性の優れた多孔質複合体を得ることができる。
 リン酸カルシウム結晶とコラーゲンとの重量比は、多孔質複合体中のリン酸カルシウム結晶とコラーゲンの重量比を分析することによって測定可能であるが、多孔質複合体の製造工程におけるリン酸カルシウム結晶/コラーゲン線維混合懸濁液に含まれるリン酸カルシウムとコラーゲンの重量比によっても、規定することができる。
(生体吸収性)
 本発明の多孔質複合体は、リン酸カルシウム結晶及びコラーゲン線維が複合化されたものであるが、生体吸収性が連続又は不連続に変化することに特徴を有している。生体吸収性が変化することによって、1つの複合体の中に、早期に骨置換が生じる部分と、機械的特性に優れ、長期にわたり生体内に残り周囲に骨組織を再生する部分が存在することができる。すなわち、生体吸収性が連続又は不連続に変化することによって、骨置換の誘導と、機械的強度とを満足する人工骨用のリン酸カルシウム結晶/コラーゲン線維複合体を得ることができる。特に生体吸収性の優れている部分は、一般的に骨置換の誘導が優れており、生体吸収性に耐性のある部分は、機械的強度が優れている。
 生体吸収性を示す指標は、特に限定されるものではなく、例えば強度(例えば、押し込み試験による強度、曲げ破断歪み、及び曲げ弾性率)、密度、架橋密度、膨潤度、気孔率、気孔径、連通孔径又はコラゲナーゼによる生分解率などの指標で表わすことが可能であるが、特には、押し込み試験による強度、膨潤度、又はコラゲナーゼによる生分解率が好ましい。
 リン酸カルシウム結晶及びコラーゲン線維が、均一に、そして同じ条件で複合化された場合、一般的に1つの多孔質複合体の中で生体吸収性は変化しない。生体吸収性の変化は、多孔質複合体の製造条件によって誘導されるが、特には後述の架橋条件によって達成することができる。この架橋条件を、押し込み試験による強度、膨潤度、又はコラゲナーゼによる生分解率が反映しており、従って生体吸収性を示す指標として、この3つの指標が好ましい。
 「生体吸収性が連続に変化する」多孔質複合体は、多孔質複合体の製造条件を連続的に変化させることによって、得ることができる。例えば、後述のように多孔質複合体の架橋密度を連続的に変化させることによって、得ることができる。
 「生体吸収性が不連続に変化する」多孔質複合体は、例えば製造条件を変えて得られた生体吸収性の異なる多孔質複合体を、積層させることによっても得ることができる。また、後述のように多孔質複合体の架橋密度を不連続に変化させることによっても得ることができる。
 本発明の多孔質複合体から、生体吸収性が1.5倍以上異なる少なくとも2つの断片、すなわち生体吸収性の速い第1の断片及び生体吸収性の遅い第2の断片を切り出すことができる。この第1の断片及び第2の断片は、生体吸収性が1.5倍以上異なる限り、多孔質複合体の任意の領域から切り出すことができる。例えば、生体吸収性の異なる多孔質複合体を積層させることによって得られた多孔質複合体の場合、積層させたそれぞれの多孔質複合体から、それぞれ第1の断片及び第2の断片を得ることができる。また、「生体吸収性が連続に変化する」多孔質複合体においても、製造者は、例えばグルタルアルデヒド気相蒸着法による架橋、又は放射線照射による架橋の条件を制御できるため、多孔質複合体から生体吸収性が1.5倍以上異なる第1の断片及び第2の断片を、的確に切り出すことが可能である。
 更に、多孔質複合体の製造者でない場合であっても、後述のように多孔質複合体の生体吸収性の速い第1の断片が含まれる領域、及び生体吸収性の遅い第2の断片が含まれる領域を同定することは容易である。従って、同定されたそれらの領域から第1の断片及び第2の断片を切り出すことができる。
 一方、押し込み試験による強度比を用いる場合は、2つの断片を多孔質複合体から切り出すことなしに、押し込み試験を行うことができる。すなわち、2つの断片の切り出しをせずに、生体吸収性の傾斜を測定することが可能である。
(押し込み試験による強度比)
 生体吸収性を示す指標の1つである押し込み試験における強度比は、以下のように測定することができる。得られた多孔質複合体のいくつかの部位の機械強度を、押し込み試験機により測定する。それぞれの部位の強度のうちの、2点の強度を比較することにより、強度比を得ることができる。
 押し込み試験の方法は、通常の方法を用いることができ、限定されるものではないが、以下の方法によって行うことができる。
 多孔質複合体を、ダルベッコスリン酸緩衝溶液に浸し、テクスチャーアナライザー(TA-XTplus)を用い、押し込み試験を行う。シリンダーとして、P/2の2mmφの円柱状プローブを用い、多孔質複合体の任意の数点(例えば、5点)において、測定を行う。得られた機械強度を用いて、例えば歪量30%における強度比が1.5倍以上が観測された。
 多孔質複合体における機械強度は、限定されるものではないが、好まししくは1N~1600Nであり、より好ましくは100N~1000Nであり、更に好ましくは300N~500Nである。
 多孔質複合体の2点の強度比は、1.5倍以上であれば限定されるものではないが、好ましくは2.0倍以上であり、更に好ましくは5.0倍以上である。上限は限定されるものではないが、10倍以下が好ましい。
(コラゲナーゼによる生分解率)
 生体吸収性を示す指標の1つであるコラゲナーゼによる生分解率は、以下の関係式(I)によって、計算することができる。
関係式(I):
生分解率=(W-W)/W×100(I)
〔式中、W及びWは、多孔質複合体の断片を2unit/mLのコラゲナーゼ溶液により6時間浸漬した場合、又は多孔質複合体の断片を200unit/mLのコラゲナーゼ溶液により0.5時間浸漬した場合の、浸漬前の乾燥重量(W)及び浸漬後の乾燥重量(W)である〕
 前記関係式(I)により、多孔質複合体から切り出された第1の断片及び第2の断片の生分解率を求めることによって、生体吸収性が1.5倍以上異なるか否かを判断することができる。
 具体的なコラゲナーゼによる処理は、例えば以下のように行うことができる。
 多孔質複合体から、約10mgの試料片(断片;0.1×0.1×1.0cm)を、生検トレパンにより採取する。コラゲナーゼ2.0units(0.01mg)/mL、又は200units(1mg)/mLを含むダルベッコスリン酸緩衝溶液(pH7.2)を作製し、マルチウェルプレート内に静置した試料片(断片)に対して3mLずつ加える。37℃のバイオシェーカー内にマルチウェルプレートを入れ、50rpmで振盪しながら6時間(2.0units)又は0.5時間(200units)反応させる。反応後、試料片を取り出し、純水で1時間洗浄する。洗浄した試料片をディープフリーザー内で、-20℃で凍結した後、凍結乾燥する。得られた試料の乾燥重量を測定し、前記関係式(I)によって、生分解率を求める。基本的に、2.0unit/mLのコラゲナーゼ溶液により6時間浸漬した場合の生分解率により、生体吸収性の判断を行う。しかしながら、第1の断片及び第2の断片の生分解率がいずれも5%以下で、ほとんど分解されない場合は、200unit/mLのコラゲナーゼ溶液により0.5時間浸漬した場合の生分解率により生体吸収性の判断を行う。
 更に、前記のいずれかの条件においても、第1の断片及び第2の断片の生分解率がいずれも5%以下、又は95%以上で、生分解率の差がない場合は、2.0unit/mL又は200unit/mLのコラゲナーゼ溶液の条件で、浸漬時間を0.5~24時間の任意の時間に調整し、生分解率の差を求めるここともできる。
 コラゲナーゼによる生分解率の測定において、多孔質複合体の生体吸収性の速い第1の断片が含まれる領域、及び生体吸収性の遅い第2の断片が含まれる領域は、事前に多孔質複合体の全体の生分解性を測定することによって、同定することができる。例えば、多孔質複合体の全体の生分解性を測定し、多孔質複合体の生分解率の速い10~30重量%の領域(A)を第1の断片を切り出す領域とし、そして多孔質複合体の生分解率の遅い10~30重量%の領域(B)を第2の断片を切り出す領域と決定することができる。ここで、領域(A)及び領域(B)以外の領域は、生分解率の中程度の領域(C)である。
 また、領域(A)は、多孔質複合体における生分解率の速い10~30重量%の領域であることができるが、生分解率の速い20重量%の領域が好ましく、生分解率の速い30重量%の領域がより好ましい。
 本明細書において、領域(A)から切り出された1つの第1の断片と、領域(B)から切り出された1つの第2の断片との少なくとも1つの組み合わせで、生分解率が1.5倍以上異なれば、本発明の効果を得ることができる。すなわち、1つの多孔質複合体において、最大で生分解率が1.5倍以上異なる第1の断片と第2の断片とを切り出すことが可能であれば、本発明の効果を得ることができる。しかしながら、領域(A)から切り出された任意の第1の断片と、領域(B)から切り出された任意の第2の断片の組み合わせで生分解率が1.5倍以上異なることが最も好ましい。
 具体的な、領域(A)及び領域(B)の決定は、以下のように行うことができる。
 コラゲナーゼ2.0units(0.01mg)/mL、又は200units(1,0mg)/mLを含むpH7.2のダルベッコスリン酸緩衝溶液を作製し、多孔質複合体の試料の体積に応じて、適量の溶液を添加する。例えば、試料の体積に対して、約50倍量の溶液を添加する。試料及び溶液を、37℃のバイオシェーカー内に入れ、50rpmで振盪しながら1、3、12、18、24時間反応させる。反応後、試料を取り出し、純水で1時間洗浄する。試料を-20℃のディープフリーザー内で凍結し、凍結乾燥を行う。得られた試料の乾燥重量を測定し、一般式(I)から生分解率を求める。
生分解率=(W-W)/W×100(I)
 1~24時間の生分解率から、生分解率の速い10~30重量%の領域(A)及び生分解率の遅い10~30重量%の領域(B)を決定することができる。
 多孔質複合体の第1の断片及び第2の断片の重量は、生分解率を測定できる重量であれば、特に限定されることはないが、5~30mgが好ましく、5~20mgがより好ましく、約10mgが最も好ましい。また、第1の断片及び第2の断片の重量は、異なる重量でも生分解率を測定することが可能であるが、およそ同じ重量が好ましい。異なる重量の場合は、重量の差は、5mg以下が好ましく、2mg以下がより好ましい。
 また、多孔質複合体の第1の断片及び第2の断片の形状も、生分解率を測定できる形状であれば、特に限定されることはないが、立方体(正六面体)、直方体、角柱(例えば、直角柱)、又は円柱などの形状の断片を用いることができる。例えば、実施例で使用している生検トレパンを用いた場合は、円柱状の形状の断片を得ることができる。また、図1において、生体吸収性に耐性のある部分(架橋の進んだ部分(21))と生体吸収性の優れた部分(架橋の進んでない部分(22))の断片を切り出し、コラゲナーゼによる生分解率の測定を行うことができる。
 生分解率の測定に用いるコラゲナーゼは、特に限定されるものではないが、クロストリジウム属由来のコラゲナーゼを用いることができる。
 早期に骨置換が生じる部分、すなわち生体吸収性の良い部分の生分解率は、特に限定されるものではないが、2.0unit/mLのコラゲナーゼ溶液で6時間処理した場合の条件で、好ましくは40%以上であり、より好ましくは50%以上であり、最も好ましくは60%以上である。コラーゲンのよる生分解率が40%以上であると、生体吸収性がよく、骨再生時における骨置換が早期に生じ、骨再生が進みやすいからである。
 一方、機械的強度を有する部分の生分解率は、特に限定されるものではないが、好ましくは30%以下であり、より好ましくは15%以下であり、最も好ましくは5%以下である。コラーゲンの生分解率が30%以下であることにより、生体親和性を有し、骨置換を可能にしながら、一定の機械的強度を有しており、長期にわたり生体内に残り周囲に骨組織を再生させる領域を提供することができる。
 更に生体吸収性の良い部分の生分解率と、機械的強度を有する部分の生分解率との差は、1.5倍以上であれば特に限定されるものではないが、好ましくは2倍以上であり、より好ましくは5倍以上であり、最も好ましくは10倍以上である。また、上限は特に限定されるものではないが、1000倍以下が好ましい。生体吸収性の良い部分の生分解率と、機械的強度を有する部分の生分解率との差が1.5倍以上であることによって、骨置換の誘導と、機械的強度とをバランスよく満足する人工骨を得ることができる。
(膨潤度)
 生体吸収性を示す指標の1つであるコラゲナーゼによる生分解率は、以下の関係式(II)によって、計算することができる。
関係式(II)
膨潤率=(W-W)/W×100(II)
〔式中、W及びWは、それぞれ、多孔質複合体の断片を、リン酸緩衝溶液により24時間浸漬した場合の、浸漬前の乾燥重量(W)及び浸漬後の湿潤重量(W)である〕
 前記関係式(II)により、多孔質複合体から切り出された第1の断片及び第2の断片の膨潤率を求めることによって、生体吸収性が1.5倍以上異なるか否かを判断することができる。
 具体的な膨潤度は、特に限定されるものではないが、以下の方法によって測定することができる。
 多孔質複合体から約10mgの試料片(断片)を採取する。試料片(断片)をダルベッコス社製のリン酸緩衝溶液10mLに含浸させる。含浸後、37℃で24時間静置する。その後、試料を速やかに取り出し、キムワイプ上で2分間静置後、重量を計測する。得られた試料の重量から、前記関係式(II)に従い、膨潤率を求める。
 膨潤率の測定において、多孔質複合体の生体吸収性の速い第1の断片が含まれる領域、及び生体吸収性の遅い第2の断片が含まれる領域は、事前に多孔質複合体の全体の膨潤率を測定することによって、同定することができる。例えば、多孔質複合体の全体の膨潤率を測定し、多孔質複合体の膨潤率の高い10~30重量%の領域(A)を第1の断片を切り出す領域とし、そして多孔質複合体の膨潤率の低い10~30重量%の領域(B)を第2の断片を切り出す領域と決定することができる。ここで、領域(A)及び領域(B)以外の領域は、膨潤率の中程度の領域(C)である。
 また、領域(A)は、多孔質複合体における膨潤率の高い10~30重量%の領域であることができるが、膨潤率の高い20重量%の領域が好ましく、膨潤率の高い30重量%の領域がより好ましい。
 本明細書において、領域(A)から切り出された1つの第1の断片と、領域(B)から切り出された1つの第2の断片との少なくとも1つの組み合わせで、膨潤率が1.5倍以上異なれば、本発明の効果を得ることができる。すなわち、1つの多孔質複合体において、最大で膨潤率が1.5倍以上異なる第1の断片と第2の断片とを切り出すことが可能であれば、本発明の効果を得ることができる。しかしながら、領域(A)から切り出された任意の第1の断片と、領域(B)から切り出された任意の第2の断片の組み合わせで膨潤率が1.5倍以上異なることが最も好ましい。
 具体的な、領域(A)及び領域(B)の決定は、以下のように行うことができる。
 ダルベッコス社製のリン酸緩衝溶液に多孔質複合体を、例えば4つの部分に分割して含浸させる。多孔質複合体の試料の体積に応じて、適量のリン酸緩衝溶液の量を調整する。例えば、それぞれの試料の体積に対して、約50倍量の溶液を添加する。試料及び溶液を、37℃で24時間静置する。得られた試料と、含浸を行っていない試料を比較し、膨潤率の高い10~30重量%の領域(A)及び膨潤率の低い10~30重量%の領域(B)を決定することができる。
 多孔質複合体の第1の断片及び第2の断片の重量は、膨潤率を測定できる重量であれば、特に限定されることはないが、5~30mgが好ましく、5~20mgがより好ましく、約10mgが最も好ましい。また、第1の断片及び第2の断片の重量は、異なる重量でも膨潤率を測定することが可能であるが、およそ同じ重量が好ましい。異なる重量の場合は、重量の差は、5mg以下が好ましく、2mg以下がより好ましい。
 また、多孔質複合体の第1の断片及び第2の断片の形状も、膨潤率を測定できる形状であれば、特に限定されることはないが、立方体(正六面体)、直方体、角柱(例えば、直角柱)、又は円柱などの形状の断片を用いることができる。例えば、実施例で使用している生検トレパンを用いた場合は、円柱状の形状の断片を得ることができる。また、図2において、生体吸収性に耐性のある部分(架橋の進んだ部分(21))と生体吸収性の優れた部分(架橋の進んでない部分(22))の断片を切り出し、膨潤率の測定を行うことができる。
 早期に骨置換が生じる部分、すなわち生体吸収性の良い部分の膨潤率は、特に限定されるものではないが、好ましくは80%以上であり、より好ましくは100%以上であり、最も好ましくは120%以上である。膨潤率が80%以上であると、生体吸収性がよく、骨再生時における骨置換が早期に生じ、骨再生が進みやすいからである。
 一方、機械的強度を有する部分の膨潤率は、特に限定されるものではないが、好ましくは70%以下であり、より好ましくは60%以下であり、最も好ましくは50%以下である。膨潤率が70%以下であることにより、生体親和性を有し、骨置換を可能にしながら、一定の機械的強度を有しており、長期にわたり生体内に残り周囲に骨組織を再生させる領域を提供することができる。
 更に生体吸収性の良い部分の膨潤率と、機械的強度を有する部分の膨潤率との差は、1.5倍以上であれば特に限定されるものではないが、好ましくは1.5倍以上であり、より好ましくは2.0倍以上であり、最も好ましくは3倍以上である。また、上限は特に限定されるものではないが、1000倍以下が好ましい。生体吸収性の良い部分の膨潤率と、機械的強度を有する部分の膨潤率との差が1.5倍以上であることによって、骨置換の誘導と、機械的強度とをバランスよく満足する人工骨を得ることができる。
 本発明の多孔質複合体は、重量法による密度が、好ましくは300~1500mg/cmであり、より好ましくは500~1400mg/cmであり、最も好ましくは750~1200mg/cmである。密度が300mg/cm未満であると機械的強度が不足し、1500mg/cmを超えると骨組織の侵入性が悪化する。
 重量法による密度は、円柱状もしくは板状の多孔質複合体を成型し、その重量をノギスで測定して求めた体積で割ることによって計算することができる。
 本発明の多孔質複合体は、その他の成分を含むことができる。リン酸カルシウム結晶及びコラーゲンと、その他の成分との重量比は、前記密度の範囲であれば、特に限定されないが、リン酸カルシウム結晶及びコラーゲンが、多孔質複合体の総重量に対し70重量%以上が好ましく、75重量%以上がより好ましく、80重量%以上が最も好ましい。また、リン酸カルシウム結晶及びコラーゲンからなる多孔質複合体も、本発明の範囲に含まれる。本発明の多孔質複合体は、リン酸カルシウム結晶の含量及びコラーゲン線維間の架橋により強度を得るため、リン酸カルシウム結晶及びコラーゲンが総重量の70重量%未満となると強度が低下する可能性があり、好ましくない。
 多孔質複合体に含むことのできるその他の物質としては、例えば、コラーゲン及びリン酸カルシウム結晶と親和性のある「つなぎ材」、又は骨治療に使用する薬剤を挙げることができる。
 つなぎ材としては、例えば、ゼラチン、グリコサミノグリカン、アルギン酸を挙げることができ、その他に、ポリ乳酸などの生体吸収性ポリエステル、β1-3グルカン、キチン、あるいはキトサンなどの機能性多糖類を挙げることもできる。
 グリコサミノグリカン(以下、GAGと称することがある)は、ヘキスロン酸又はガラクトースとヘキソサミンの二糖単位の繰り返し構造からなる基本骨格を有する多糖であり、ヒアルロン酸及びコンドロイチンを除くGAGは、構成糖のヒドロキシル基が部分的に硫酸エステル化され、アミノ基がアセチル化又は硫酸化されている。前記ヘキスロン酸としては、例えばグルクロン酸及びイズロン酸を挙げることができ、ヘキソサミンとしては、例えばグルコサミン及びガラクトサミンを挙げることができる。本発明の多孔質複合体に使用することができるGAGとしては、例えばヒアルロン酸(HA)、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸(CS)、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、ケラタンポリ硫酸等を挙げることができるが、その中でも骨再生において血管の誘導を促進することが知られているヒアルロン酸又は硬組織に広く存在するコンドロイチン硫酸が好ましい。
 (多孔質複合体の生体分解性の傾斜の態様)
 本発明の多孔質複合体は、生体分解性が傾斜していることにより、生体内に移植すると骨リモデリングに伴い早期に骨置換が生じる空間と長期にわたり生体内に残り周囲に骨組織を再生させる空間を制御することが可能であり、それによって生体内で強度を損なわず骨組織再生を促進することができる。
 生体分解性の傾斜は、連続的であってもよく、不連続であってもよい。また、多孔質複合体の一方から他方に向かって、連続又は不連続に傾斜してもよい。更に、1つの多孔質複合体において、連続又は不連続の傾斜が交互に存在してもよい。すなわち、生体分解性の高い部分と低い部分がまだらに存在することもできる。
[2]人工骨
 本発明の人工骨は、前記多孔質複合体を含むか、前記多孔質複合体からなるものである。すなわち骨置換の誘導と、機械的強度とを満足する骨欠損時の骨再生用人工骨として用いることができる。
 本発明の人工骨の形状は、特に限定されるものではなく、欠損した患部の形状に合わせて成形することができる。
 本発明の人工骨の対象疾患は特に限定されるものではないが、骨腫瘍(軟骨腫、側弯症)、人工関節置換術・再置換術、骨折、頸椎後方固定術、変形性股関節症、偽関節、大腿骨頭壊死、及び骨髄炎を挙げることができる。
[3]多孔質複合体の製造方法
 本発明の多孔質複合体の製造方法は、
(A)リン酸カルシウム及びコラーゲンを含む多孔体を形成する工程、及び(B)前記多孔体に架橋密度を変化させた架橋処理を行うことによって、生体吸収性が1.5倍以上の多孔質複合体を得る傾斜架橋工程、
を含む。
《リン酸カルシウム結晶及びコラーゲン線維による製造方法》
 本発明の1つの実施態様においては、前記多孔体形成工程(A)が、
(1)リン酸カルシウムまたは表面修飾されたリン酸カルシウムの結晶懸濁液を得る結晶合成工程、(2)可溶化コラーゲン溶液中のコラーゲンを線維化し、コラーゲン線維懸濁液を得る、コラーゲン線維化工程、(3)前記コラーゲン線維懸濁液とリン酸カルシウム結晶懸濁液とを混合し、リン酸カルシウム結晶/コラーゲン線維混合懸濁液を得る、混合工程、(4)前記リン酸カルシウム結晶/コラーゲン線維混合懸濁液を多孔体に成形する工程である。限定されるものではないが、本発明の多孔質複合体の製造方法によって、項目[1]に記載の多孔質複合体を製造することができる。
(1)結晶合成工程
 前記結晶合成工程(1)において、前記Ca(HPO、Ca(HPO・HO、CaHPO、CaHPO・2HO、Ca(PO、Ca(PO・2HO、Ca(PO・5HO、Ca(PO、Ca10(PO(OH)等のリン酸カルシウムを用いて、リン酸カルシウム結晶を調整することが可能であるが、特には水酸アパタイト結晶が好ましい。リン酸カルシウム結晶の調整法は、湿式法、乾式法、水熱法、アルコシキド法、フラックス法などの常法に従って行うことができるが、例えば水酸アパタイト結晶は、以下の湿式法によって調整することができる。
 例えば、水酸アパタイトの場合、水酸化カルシウム(又は炭酸カルシウム)とリン酸とを溶液中で室温~80℃程度の温度下で反応させ、得られた水酸アパタイトの微結晶粉末を100℃以下で乾燥させることによって得ることができる。より具体的には、水酸化カルシウム水溶液(又は炭酸カルシウム)及びリン酸水溶液を混合することによって、水に不溶な白い懸濁液(いわゆる、スラリー)を得ることができる。水酸化カルシウム水溶液としては、水酸化カルシウムが完全に溶解していない水酸化カルシウム懸濁液を用いることもできる。反応液のpHは7~11の範囲で、かつ変化の幅を1以内となるようにリン酸水溶液を滴下することが望ましく、pH7~9の範囲で、かつ変化の幅を0.5以内とすることがより好ましい。また、得られた懸濁液を50℃~1200℃で焼成することによってリン酸カルシウム結晶懸濁液を得ることができる。
 より具体手的には、0.5mol/Lの水酸化カルシウム懸濁液(例えば、4リットル)に0.6mol/Lのリン酸水溶液(例えば2リットル)を、ゆっくりとpH7.5になるまで滴下する。得られた懸濁液は、120℃で乾燥後、1200℃で30分間焼成する。合成した水酸アパタイトは、粉末X線回折測定により単一相であるか否かを確認することができる。
 後述のコラーゲン線維架橋工程(4)で放射線照射による架橋を行う場合は、結晶調整工程(1)において、リン酸カルシウム結晶に放射線によって架橋が生じるビニル基を導入した、表面修飾されたリン酸カルシウム結晶を用いることも可能である。ビニル基の導入は常法に従って行うことができるが、例えば、トリメトキシビニルシランを用いて、以下のように行うことができる。
 前記水酸アパタイト結晶懸濁液から遠心分離により液相を分離し、エタノールに溶媒を置換する。この操作を三回繰り返し、エタノールに懸濁した水酸アパタイト結晶懸濁液(6.0mg/mL)を作製する。一方、精製水にトリメトキシビニルシランを加え、トリメトキシビニルシラン溶液(20重量%)を調整した。水酸アパタイト結晶懸濁液に、トリメトキシビニルシラン溶液を、重量比9:1になるように加え、水酸アパタイトの濃度が6重量%になるように調整する。混合液を18時間転倒撹拌後、遠心分離により、上澄みを除去し、100℃で2時間、大気中で乾燥させた。
 ビニル基の導入は、赤外線スペクトル分析によって行うことができる。図3に示すように、トリメトキシビニルシランの処理前と処理後のサンプルとを比較すると、処理後のサンプルで、3570cm-1のOHのピークが減少し、1273cm-1及び1600cm-1にC=Cのピークが、1087cm-1にSi-O-Siのピークが観察されるようになる。従って、図4に示すように、水酸アパタイト結晶の表面の水酸基と、トリメトキシビニルシランとの反応により、トリメトキシ基が結合しているものと考えられる。
 また、熱分析により、210℃と320℃に発熱挙動を観察することにより、320℃では重量減少が観測される。320℃での重量減少は、ビニルシランが水酸アパタイト表面に修飾されていることを示している。
(2)コラーゲン線維化工程
 コラーゲン線維化工程(2)においては、哺乳動物又は魚類由来の可溶化コラーゲンを水などの水性の溶媒に溶解する。酸可溶化コラーゲン溶液に中性の緩衝液を混合してコラーゲン線維を析出させ、コラーゲン線維懸濁液を得ることができる。酸可溶化コラーゲン溶液のpHは、2.0~6.0の間であることが好ましい。コラーゲンの線維化に適するpHは、コラーゲンの種類によって変化するが、pH5~9の範囲、すなわち中性の範囲である場合が多く、中性の緩衝液が用いられる。コラーゲンを線維化させる中性の緩衝液の条件としては、適度なイオン強度及びpHが中性であることが重要である。このような条件を満たすものであれば、緩衝液は、特に限定されるものではないが、生体に用いる人工骨などの最終的な用途を考慮すれば、細胞毒性が無いかあるいは低い、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、Tris等の緩衝能を有する塩水溶液を用いることが好ましい。特に、中性の緩衝液であり、安価、生体に毒性を示さない、そしてコラーゲンの線維化を他の中性の緩衝液よりも活発に起こす点において、リン酸緩衝液(特には、リン酸ナトリウム水溶液)が好ましい。
 コラーゲン線維化工程において、コラーゲン線維懸濁液中のコラーゲン線維を遠心分離、又は加圧脱水などにより濃縮し、高濃度コラーゲン線維懸濁液としてもよい。
 遠心分離は、コラーゲン線維懸濁液を、遠心機による遠心分離とホモジェナイズを1~10回程度繰り返し行うことができる。より詳細には、遠心分離は、水分をコラーゲン線維から分離できる条件であれば、特に限定されるものではないが、2000g~20000gで行うことが好ましく、例えば、遠心機GRX-220(トミー精工社製)を用い、10000rpmで行うことができる。遠心機による遠心分離を行い、コラーゲン線維と水分を分離させた後、水分を除去し、ペースト状になったコラーゲン線維を得る。次に、ペースト状のコラーゲン線維を、ホモジェナイザーを用いてホモジェナイズすることによって、コラーゲン線維間に保持されている水分を分離しやすくする。ホモジェナイズ後、更に遠心機を用い遠心分離を繰り返し、分離した水分を除去する。ホモジェナイザーは、一般に用いられているものを利用することができるが、例えば、セルマスター(アズワン社製)を用い、5000rpmで行うことができる。この遠心分離の回数は、限定されるものではないが、1回~10回程度行うことができ、効率の観点から、好ましくは1~8回、より好ましくは、1~5回、最も好ましくは1~3回程度行う。
 加圧脱水で濃縮を行う場合は、一回で濃縮を行ってもよいが、加圧脱水とホモジェナイズを繰り返し、1~10回程度行うことができる。遠心分離、又は加圧脱水を行う前のコラーゲン線維懸濁液中のコラーゲン線維の濃度は、0.4~0.5重量%程度であるが、遠心分離又は加圧脱水により、10重量%以上の濃度のコラーゲン線維懸濁液を得ることができる。
(3)混合工程
 混合工程(2)においては、前記コラーゲン線維懸濁液(高濃度コラーゲン線維懸濁液を含む)とリン酸カルシウム結晶懸濁液とを混合し、リン酸カルシウム結晶/コラーゲン線維混合懸濁液を得ることができる。コラーゲン線維懸濁液に混合するリン酸カルシウム結晶懸濁液は、特に限定されるものではないが、水酸アパタイト結晶懸濁液が好ましい。
 また、得られた混合液は、十分に攪拌を行った後に、例えばスイング式遠心機などを用いて、脱泡を行うことが好ましい。これは、凍結乾燥を行う際に、気泡の混入を防ぐためである。
(4)多孔体形成工程
 多孔体形成工程(4)は、リン酸カルシウム結晶/コラーゲン線維混合懸濁液を多孔体に成形する工程であり、多孔体の成形方法としては、従来公知の方法を用いることが可能であり、具体的には、凍結乾燥法などを挙げることができる。多孔体の成形方法として、凍結乾燥法を用いる場合は、所望の大きさ及び形態の成形容器を用意し、リン酸カルシウム結晶/コラーゲン線維混合懸濁液を流し込む。成形容器の材料は、冷凍機による凍結、及び凍結乾燥機における減圧に耐えることができる限り、限定されるものではないが、例えば、シリコンゴムなどを用いることができ、任意の大きさ及び形態の成形容器を作製することが可能である。成形容器中のリン酸カルシウム/高濃度コラーゲン線維混合懸濁液は、冷凍機により、例えば-80~-0℃で凍結される。凍結されたリン酸カルシウム/高濃度コラーゲン線維混合懸濁液は、凍結乾燥機に入れ、例えば棚温度-30~40℃で、水分がなくなるまで、凍結乾燥を行う。
 多孔体形成工程において、一定以上の機械的強度を得るために、多孔体中のコラーゲン線維を熱脱水により架橋してもよい。すなわち、滅圧雰囲気下で、130℃24時間程度の処理を行うことにより、熱脱水架橋を行うことができる。
《リン酸カルシウム/コラーゲン複合線維を用いた製造方法》
 本発明の別の実施態様においては、前記多孔体形成工程(A)が、
リン酸カルシウム/コラーゲン複合線維と緩衝液との混合によりゲル化させ、多孔体に成形する工程である。本工程は、特開2007-98118に記載の多孔質体を製造する方法である。本態様においては、リン酸カルシウムは、特に限定されるものではないが、好ましくは水酸アパタイトである。
 具体的には、水酸アパタイト/コラーゲン複合線維と緩衝液との混合後、凍結乾燥してもよいが、凍結乾燥は、後述の傾斜架橋工程(B)の後に行うことができる。また、水酸アパタイト/コラーゲン複合線維と緩衝液との混合後に、さらにインキュベーションしてもよい。水酸アパタイト/コラーゲン複合線維は、水酸アパタイトのc軸が線維軸方向に配向されていることが好ましい。
 水酸アパタイト/コラーゲン複合線維は緩衝液との混合により、水酸アパタイトのc軸が線維軸方向に配向されることにより、スポンジ状の弾力性を有し、従来の強度の問題や、使用時の操作性の問題を解消することができる。
 本願発明に用いられる緩衝液は、イオン種やイオン強度を制御した溶媒であり、例えば、イオン種が、無機イオンであるリン酸緩衝液等、あるいは、有機イオンであるトリス緩衝液や酢酸緩衝液等、各種の緩衝液を使用することができる。また、イオン強度は、ペースト状にした水酸アパタイト/コラーゲン複合物中の値として、0.01~0.5mol/Lの範囲、特に0.02~0.2mol/Lの範囲であることが好ましい。
 例えば、多孔体は、以下のとおり調製することができる。
(1)水酸アパタイト/コラーゲン複合線維体(HAp/Col:混合比率は、80/20)1gと、リン酸緩衝液(0.1mol/L, pH6.8)8mLとを、均一になるまで混合し、インキュベーションしてゲル状とした。
(2)ゲル状の混合物を、型(細胞培養用Φ53mmのポリスチレンディッシュや細胞培養用24穴プレート等、適宜に選択することができる)に注入した。
 得られた多孔体を以下の傾斜架橋工程に用いることが可能である。
(B)傾斜架橋工程
 傾斜架橋工程における架橋方法は、1.5倍以上異なる第1の断片及び第2の断片を切り出すことのできる多孔質複合体を作製することができる架橋方法であれば、特に限定されるものではなく、アルデヒド系・イソシアネート系・カルボジイミド系架橋剤・タンニンを用いた湿式架橋法、金属イオン(クロム、鉄など)を用いた架橋法、紫外線照射法、熱架橋、グルタルアルデヒド気相蒸着法、又は放射線照射法を挙げることができるが、グルタルアルデヒド気相蒸着法、又は放射線照射法が好ましい。本工程においては、これらの架橋法によって、架橋密度の変化した架橋処理を行う。
(グルタルアルデヒド気相蒸着法)
 傾斜架橋法において、グルタルアルデヒド気相蒸着法を用いる場合、多孔体へのグルタルアルデヒドガスの揮発・拡散を調整することにより、多孔体の架橋の程度を調整し、生体吸収性が異なる部分を作製することができる。
 グルタルアルデヒド気相蒸着法は、通常の方法で行うことができる。すなわち、グルタルアルデヒド〔OHC(CHCHO〕を精製水で希釈し、1~25%程度のグルタルアルデヒド溶液を調製する。グルタルアルデヒド蒸気を用いた化学架橋では、グルタルアルデヒドの濃度が拡散に影響する。濃度が高いほうが、拡散速度が速く、濃度が低いと拡散速度が遅くなる。従って、グルタルアルデヒド溶液の濃度を調整することにより、拡散速度を制御することができる。
 このグルタルアルデヒド溶液を上方の開放された容器(例えば、ガラス瓶、又はシャーレなど)に入れる、デシケータなどに、グルタルアルデヒド溶液と、架橋を行うサンプルを入れて、37℃程度で、1~24時間程度反応させる。
 グルタルアルデヒド気相蒸着法による架橋の場合、グルタルアルデヒドは、サンプルの表面から拡散し、アミノ基同士、又はアミノ基及びSH基の架橋を起こす。従って、傾斜架橋法を行う場合、弱い架橋を導入したい面からのグルタルアルデヒドの拡散を防ぐことによって、傾斜架橋を行うことができる。具体的には、グルタルアルデヒドの拡散を抑えたい面を、膜などで覆うことにより、架橋の傾斜を導入することが可能である。
 前記膜としては、グルタルアルデヒドの透過しない膜、又は透過を抑制することのできる膜であれば、特に限定されるものではないが、例えばシリコーン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリメエタクリル酸メチル、ポリテトラフルオロエチレン、又はポリスチレン膜などを挙げることができ、特にはポリスチレン膜が好ましい。
(放射線照射法)
 傾斜架橋法において、放射線照射を用いる場合、湿潤環境下における多孔質複合体のコラーゲン濃度の違いによって架橋の傾斜を導入することができる。湿潤環境下において放射線を照射するとコラーゲン同士の架橋が生じるためである。
 コラーゲン濃度の異なる多孔体で生体吸収性が異なる部分を作製する場合には、例えば以下のように多孔体を製造することができる。
 コラーゲンとアパタイトの混合比を変えた多孔体を作製し、それらの多孔体を積層することによって、コラーゲン濃度の異なる部分を有する多孔体を得ることができる。この多孔体に放射線照射を行うことによって、生体吸収性が1.5倍以上異なる2つの部分を有する多孔質複合体を得ることができる。
 傾斜架橋法において、放射線照射法を用いる場合、放射線に感受性の官能基(例えば、ビニル基)の、リン酸カルシウムへの導入の多寡によって傾斜を導入することができる。また、リン酸カルシウムの官能基の量が同じであっても、放射線の照射量を調整することによっても傾斜を導入することができる。放射線に感受性の官能基、具体的にはビニル基のリン酸カルシウムへの導入は、前記「(1)結晶合成工程」において、記載した方法によって行うことができる。
 ビニル基の導入を調整することにより、得られる多孔体で生体吸収性が異なる部分を作製する場合は、例えば以下のように多孔体を製造することができる。
 ビニル基の導入量の異なるリン酸カルシウム結晶懸濁液を、複数調製する。それらのリン酸カルシウム結晶懸濁液をコラーゲン懸濁液と混合し、ビニル基の導入量の異なる複数の多孔体を調整する。それらの多孔体を積層することによって、ビニル基の導入量の異なる部分を有する多孔体を得ることができる。この多孔体に放射線照射を行うことによって、生体吸収性が1.5倍以上異なる2つの部分を有する多孔質複合体を得ることができる。
 放射線の照射量を調整することによっても傾斜を導入することができる。例えば以下のように行うことができる。
 多孔体への放射線の照射量を調整する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、テーパーをもった鉛板を用いることによって行うことができる。例えば、図2に示すように、三角錐の「テーパー」を用い、放射線を三角錐の上方から照射する。このような照射を行うことにより、三角錐の中心部はテーパーが厚く、照射が少なくなり放射線架橋が起こりにくい。従って、生体吸収性や膨潤性に優れ、機械的強度が弱い部分となる。一方、三角錐の周辺部はテーパーが薄いため、照射が多くなり、放射線架橋が起こりやすい。従って、生体吸収性に耐性があり、機械的強度が高い部分となる。
 放射線照射に用いる線源は特に限定されるものではないが、γ線、電子線、又はβ線を用いることができるが、γ線が好ましい。
 また、放射線による湿潤環境下における架橋では、コラーゲン同士、又はコラーゲン―アパタイト界面において、架橋がおきるため、それらの立体的距離が重要である。すなわち、密度が高いほうが強固な架橋ができる。更に、放射線架橋の特徴は、物質透過性に優れ、分子内において均一な分布で架橋が起こること、架橋の密度を容易に調整できること、及び形状に係わらず架橋できること、を挙げることができる。
 多孔質複合体に対する放射線による架橋は、湿潤状態又は乾燥状態で行うことができるが、湿潤状態で行うのが好ましい。湿潤状態で行うことにより、コラーゲン分子のペプチド結合の切断による分解が起きず、コラーゲン同士を効率よく架橋させることが可能だからである。水分の含有量は、特に限定されるものではないが、多孔体の体積と同じか、1~10倍が好ましい。雰囲気を窒素・アルゴンなどの不活性ガスに置換して行うことも可能である。
 以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例1》
 本実施例ではグルタルアルデヒド気相蒸着法により、多孔質複合体を製造した。
(i)水酸アパタイト結晶の懸濁液の調製
 水酸アパタイト結晶は、湿式法により合成した。0.5mol/Lの水酸化カルシウム懸濁液(4リットル)に、0.6mol/Lのリン酸水溶液(2リットル)をゆっくりとpH7.5になるまで滴下した。得られた懸濁液を、120℃で乾燥後、更に電気炉を用いて1200℃で30分間焼成した。粉末X線回折測定により合成した水酸アパタイトが単一相であることを確認した。
(ii)コラーゲン線維懸濁液の調製
 テラピアウロコ由来コラーゲンを、pH3.0の塩酸溶液に1重量%になるように溶解させた。0.1mol/Lのリン酸水素ナトリウムとリン酸二水素ナトリウムの溶液とを混合し、pH8.2になるように緩衝溶液(PB)を作製した。コラーゲン溶液とPBを等量混合して、27℃で3日間静置して、コラーゲン線維ゲルを作製した。遠心分離を行い、上澄みを除去することで濃縮を行った。130℃で乾燥させ、コラーゲンの濃度を測定した結果、コラーゲン濃度は17.3%であった。
(iii)乾燥複合体の調製
 前記工程(ii)で得られたコラーゲン線維ゲルをコラーゲン濃度10%に調整し、水酸アパタイト結晶を重量比4:6になるように混合した。混合には、Cellmasterを用い、十分に混合撹拌を行った。得られた複合ゲル(水酸アパタイト結晶/コラーゲン線維混合懸濁液)を、25mLの遠沈管にいれ、スイング式遠心機(1000G)を用いて、脱泡(5分間)した。得られた複合体を、10mm×10mm×10mmの容器に入れ、-20℃で一日凍結させ、更に48時間凍結乾燥を行った。減圧雰囲気下、130℃で24時間処理して、熱脱水架橋を導入した。得られた複合体を試料Aと称する。
(iv)グルタルアルデヒド気相蒸着による傾斜架橋
 グルタルアルデヒド(GA)ガス架橋は、以下のように行った。GA溶液(25%)を精製水で希釈して10%の溶液を調整した。GA溶液をシャーレに20mL加え、作製した試料(10mm×10mm×10mm;試料A)とともにデシケータ―内に静置した。デシケータを減圧し、37℃の恒温乾燥機に入れ、3、6、12、24時間反応させた。試料Aの五面はポリスチレン膜で覆い、一面のみからGAガスが拡散し、反応するようにした(図1A)。得られた多孔質複合体を、試料A-GAと称する。
 GAによる架橋の傾斜は、目視でも確認することが可能である。すなわち、3時間GA処理した試料の中央部をメスにて切断し観察した。GAガスが拡散した面から、順番に黄色から白色に色が変化しており、拡散面の方が、架橋が進んでいると考えられた。また、6時間GA処理した試料では、その濃淡が更にはっきりと確認することができた。
《実施例2》
 本実施例では、放射線照射により、膨潤した多孔質複合体を製造した。
(i)水酸アパタイト結晶の懸濁液の調製及びビニル基の導入
 水酸アパタイト結晶は、湿式法により合成した。0.5mol/Lの水酸化カルシウム懸濁液(4リットル)に、0.6mol/Lのリン酸水溶液(2リットル)をゆっくりとpH7.5になるまで滴下した。得られた懸濁液を、120℃で乾燥後、更に電気炉内を用いて1200℃で30分間焼成した。粉末X線回折測定により合成した水酸アパタイトが単一相であることを確認した。
 ビニル基の導入は以下のように行った。
 水酸アパタイト懸濁液を、遠心分離により、固液分離を行い、エタノールに溶媒を置換した。この操作を三回繰り返し、水酸アパタイト懸濁液(60mg/mL)を作製した。一方、精製水にトリメトキシビニルシランを加え、メトキシビニルシラン溶液(20重量%)を調整した。水酸アパタイト懸濁液に、重量比9:1になるようにメトキシビニルシラン溶液を加えた。この際、水酸アパタイトの濃度は6重量%になるように調整した。18時間転倒撹拌後、遠心分離により、固液分離を行い、上澄みを除去し、100℃で2時間、大気中で乾燥させた。赤外線スペクトル分析により、Si-Oの振動とビニル基に由来する振動が確認された。また、熱分析の結果から、210℃と320℃に発熱挙動を観察し、320℃では重量減少が観測された。このことから、本方法によりシラン剤が水酸アパタイト表面に修飾できていることが分かった。
(ii)コラーゲン線維懸濁液の調製
 前記実施例(ii)の操作を繰り返し、コラーゲン線維懸濁液を得た。
(iii)膨潤多孔質複合体の調製
 作製したコラーゲン線維懸濁液に、水酸アパタイト結晶の懸濁液を重量比4:6になるように混合した。混合には、Cell masterを用い、十分に混合撹拌を行った。作製した複合ゲル(水酸アパタイト結晶/コラーゲン線維混合懸濁液)を、25mLの遠沈管にいれ、スイング式遠心機(1000g)を用いて、脱泡(5分間)を行った。得られた湿潤状態の複合体を試料Cと称する。
(iv)放射線による傾斜架橋
 放射線による架橋を傾斜化させるため、鉛で作製した三角錐(高さ10cm×直径1cm)をテーパーとして用いた放射線照射を行った。図1に示すように、遠心管にいれた試料Cの先端部位に鉛三角錐を取り付け、コバルト60の線源を用いてγ線(5.3kGy/h)を照射した(図2A)。照射時間は約10時間とした。照射後、-20℃で一日凍結させ、48時間凍結乾燥を行った。減圧雰囲気、130℃で24時間処理して更に熱脱水架橋を導入した。得られた多孔質複合体を、試料C-gと称する。
《実施例3》
(i)水酸アパタイト/コラーゲン複合線維の調整
 2.0gのテラピアウロコ由来コラーゲンを0.15mol/Lのリン酸(200mL)に溶解させた水溶液と、0.25mol/Lの水酸化カルシウム懸濁液(200mL)を調整した。また、200mLの精製水を加えた1000mLビーカーを準備した。調整した二液を、25℃の精製水に、pH8.0±0.5の一定になるように、滴下速度4mL/minで同時に加えた。滴下終了後、吸引濾過により上澄み液を除き、得られた水酸アパタイト/コラーゲン複合線維を-20℃で凍結後、凍結乾燥を行った。凍結乾燥した複合線維の熱分析(TG-DTA)の結果、水酸アパタイトとコラーゲンの重量比は、8:2であった。
(ii)水酸アパタイト/コラーゲン複合線維ゲルの調整と成形
 0.1mol/Lのリン酸緩衝溶液(4mL;pH8.0、リン酸二水素ナトリウムとリン酸一水素ナトリウムの混合緩衝液)を、2gの作製した水酸アパタイト/コラーゲン複合線維に加え、混練を十分に行い、均一な水酸アパタイト/コラーゲン複合線維ゲルをえた。これを直径35mm×10mmの細胞培養用ディッシュ(イージーグリップディッシュ、Falcon)に高さが3mmになるようにつめた。
(iii)放射線による傾斜架橋
 放射線による架橋を傾斜化させるため、鉛で作製した円筒(高さ4cm×直径35mmを用いた放射線照射を行った。コバルト60の線源の上に複合線維ゲルを置き、照射を行った。照射後、-20℃で凍結させ、48時間凍結乾燥を行った。減圧雰囲気、130度で12時間処理して更に熱脱水架橋を導入した。
(iv)押し込み試験による機械強度の傾斜化
 作製した水酸アパタイト/コラーゲン複合線維多孔体を、ダルベッコスリン酸緩衝溶液に浸し、テクスチャーアナライザー(TA-XTplus)で押し込み試験を行った。シリンダーには、P/2の2mmφの円柱状プローブを用いた。試料片の端から、中心部にむかい5点の測定を行った。この結果、照射量の多い端と中心部では、歪量30%において約2倍の強度の違いが観測された。
《比較例1》
 実施例2の工程(i)で、ビニル基の導入を行わなかったことを除いては、実施例2の操作を繰り返し、工程(iii)で複合体である試料Dを、工程(iv)で多孔質複合体である試料D-gを得た。
《参考例1》
 本参考例1では、架橋を傾斜化させずに、放射線架橋を行い、膨潤した多孔質複合体を製造した。実施例2の、(i)、(ii)、及び(iii)の操作を繰り返して、試料Cを得た。
(iv)放射線架橋
 遠沈管にいれた試料Cは、コバルト60の線源を用いてγ線(50KGy)を照射した。照射後、-20℃で一日凍結させ、48時間凍結乾燥を行った。減圧雰囲気、130℃で24時間処理して更に熱脱水架橋を導入した。得られた多孔質複合体を、試料C-γと称する。
《比較例2》
 本参考例1では、ビニル基を導入していない試料Dに、架橋を傾斜化させずに、放射線架橋を行い、膨潤した多孔質複合体を製造した。比較例1の(i)、(ii)、及び(iii)の操作を繰り返して、試料Dを得た。
(iv)放射線架橋
 遠沈管にいれた試料Dは、コバルト60の線源を用いてγ線(50KGy)を照射した。照射後、-20℃で一日凍結させ、48時間凍結乾燥を行った。減圧雰囲気、130℃で24時間処理して更に熱脱水架橋を導入した。得られた多孔質複合体を、試料D-γと称する。
《参考例2》
 本参考例2では、架橋を傾斜化させずに、放射線架橋を行い、乾燥した多孔質複合体を製造した。実施例2の、(i)、及び(ii)の操作を繰り返して、水酸アパタイト結晶懸濁液、及びコラーゲン線維懸濁液を得た。
(iii)乾燥多孔質複合体の調製
 コラーゲン線維懸濁液に水酸アパタイト結晶懸濁液を重量比4:6になるように混合した。混合には、Cell masterを用い、十分に混合撹拌を行った。作製した複合ゲル(水酸アパタイト結晶/コラーゲン線維混合懸濁液)は、更に25mLの遠沈管にいれ、スイング式遠心機(1000g)を用いて、脱泡(5分間)を行った。作製した複合体は、-20℃で一日凍結させ、更に48時間凍結乾燥を行った。減圧雰囲気、130℃で24時間処理して、熱脱水架橋を導入した。得られた乾燥複合体を試料Aと称する。
(iv)放射線架橋
 作製した乾燥複合体Aは、滅菌シートにいれ、脱酸素剤により酸素を吸着させた後、コバルト60の線源を用いて、50KGyの線量のγ線を照射した。得られた多孔質複合体を、試料A-γと称する。
《比較例3》
 本比較例3では、ビニル基を導入していない試料に、架橋を傾斜化させずに、放射線架橋を行い、乾燥した多孔質複合体を製造した。比較例1の、(i)、及び(ii)の操作を繰り返して、水酸アパタイト結晶懸濁液、及びコラーゲン線維懸濁液を得た。
(iii)乾燥多孔質複合体の調製
 コラーゲン線維懸濁液に水酸アパタイト結晶懸濁液を重量比4:6になるように混合した。混合には、Cell masterを用い、十分に混合撹拌を行った。作製した複合ゲル(水酸アパタイト結晶/コラーゲン線維混合懸濁液)は、更に25mLの遠沈管にいれ、スイング式遠心機(1000G)を用いて、脱泡(5分間)を行った。作製した複合体は、-20℃で一日凍結させ、更に48時間凍結乾燥を行った。減圧雰囲気、130℃で24時間処理して、熱脱水架橋を導入した。得られた乾燥複合体を試料Bと称する。
(iv)放射線架橋
 作製した乾燥複合体Bは、滅菌シートにいれ、脱酸素剤により酸素を吸着させた後、コバルト60の線源を用いて、50KGyの線量のγ線を照射した。得られた多孔質複合体を、試料B-γと称する。
《コラゲナーゼによる生分解率による領域(A)及び領域(B)の決定》
 多孔質複合体の生体吸収性の速い第1の断片が含まれる領域、及び生体吸収性の遅い第2の断片が含まれる領域の決定をコラゲナーゼによる生分解性試験により行った。
 コラゲナーゼ2.0units(0.01mg)/mL、又は200units(1.0mg)/mLを含むpH7.2のダルベッコスリン酸緩衝溶液を作製し、実施例1で得られた試料A-GAの0.3gの多孔質複合体に対して、30mLのダルベッコスリン酸緩衝溶液を添加した。試料及び溶液を、37℃のバイオシェーカー内に入れ、50rpmで振盪しながら1、3、12、18、24時間反応させた。反応後、試料を取り出し、純水で1時間洗浄した。試料を-20℃のディープフリーザー内で凍結し、凍結乾燥を行った。得られた試料の乾燥重量を測定し、一般式(I)から生分解率を求めた。
生分解率=(W-W)/W×100(I)
 12、18、24時間GAガス反応させた試料は全体にGAガスが拡散し、コラゲナーゼによる分解が1mg/mLの溶液中ですら生じなかった。3時間GAガスに反応させた試料をコラゲナーゼ分解試験(0.01mg/mL)した結果、GAガス拡散が起きた面と逆面から順番に分解が生じていた。一般式(I)の生分解率から求めた、時系列による重量変化は、1時間後に約30%の生分解率が、24時間後に約70%の生分解率が、24時間後には、ほぼ100%の生分解率となった。このように時系列変化により、大きく3段階に分けることができる分解性を示した。6時間GAガスに反応させた試料をコラゲナーゼ分解試験(0.01mg/mL)した結果、GAガス拡散が起きた面と逆面から順番に分解が生じていた。上式の生分解率から求めた、時系列による重量変化は、1時間後に約20%の生分解率が、12時間後に約40%の生分解率が、24時間後でも60%の生分解率となった。このように時系列変化により、大きく3段階に分けることができる分解性を示した。
 すなわち、3時間GAガスに反応させた試料から、生分解率の速い30重量%の領域及び生分解率の遅い30重量%の領域を決定することができた。
《コラゲナーゼによる生分解性試験》
 6時間反応させた試料A-GAの架橋の進んだ生分解率の遅い30重量%の領域の断片10mg、及び架橋の進んでない生分解率の速い30重量%の領域の断片10mgを生検トレパンにより切り出した(図1B)。各試料A-GAを2.0nit/mLのコラゲナーゼ溶液又は200unit/mLを含むダルベッコスリン酸緩衝溶液に浸漬させた。容器にはマルチウェルプレートを用い、コラゲナーゼ溶液3mLを加え、50rpmで振とうしながら、所定時間反応させた。反応後、各試料を取り出し、精製水で1時間洗浄し、(iii)の多孔質複合体の調製と同条件で凍結乾燥を行い、生分解率(関係式(I))を求めた。
 6時間のコラゲナーゼ処理では、架橋の進んだ部分の断片の生分解率は約10%で、架橋の進んでいない部分の断片の生分解率は90%であった。従って、第1の断片の生分解率に対する第2の断片の生分解率の比は、9.0であった。
《膨潤率による領域(A)及び領域(B)の決定》
 多孔質複合体の生体吸収性の速い第1の断片が含まれる領域、及び生体吸収性の遅い第2の断片が含まれる領域の決定を膨潤率の測定により行った。
 実施例2で得られた多孔質複合体である試料C-gを4つの断片に分割した。分割した0.3gの多孔質複合体の断片に対して、300mLのダルベッコスリン酸緩衝溶液を添加し、含浸させた。試料及び溶液を、37℃で24時間静置した。得られた試料と、含浸を行っていない同様に分割した試料を比較し、膨潤率の高い10~30重量%の領域(A)及び膨潤率の低い10~30重量%の領域(B)を決定した。
《膨潤率》
 実施例2で得られた試料C-gの膨潤率の高い30重量%の領域(A)の断片10mgと、膨潤率の低い30重量%の領域(B)の断片10mgを図1(B)と同様な方法で切り出した。5mLの精製水を入れた容器に24時間、常温で静置した。余分な水分を除去するため、ろ紙に1分間静置した。その後、湿潤下重量を測定し、関係式(III)から膨潤率を求めた。
 γ線照射量を多くした断片の膨潤率は20%程度であったが、γ線照射量を少なくした断片の膨潤率は、40%であった。従って、第1の断片の膨潤率に対する第2の断片の膨潤率の比は、2.0であった。
《参考試験例1》
 本試験例では、放射線架橋により、多孔質複合体の圧縮強度が上昇することを確認した。
 参考例2で得られた試料A及び試料A-γ、並びに比較例3で得られた試料B及び試料B-γの4種類の試料(φ10mm×10mm)の圧縮試験を行い、その力学特性を明らかにした。放射線架橋の効果を明確にするため、ダルベッコスリン酸緩衝溶液中に3時間浸漬させた後、50kgのロードセルを用いて、ロードヘッド速度0.1mm/minで測定を行った。水酸アパタイト/コラーゲンは、γ線照射によりコラーゲン分子又は線維が分断され、ダルベッコスリン酸緩衝溶液の浸漬によりコラーゲンが骨格構造を維持できなくなった。これに対して、ビニルシランを表面修飾した水酸アパタイト結晶を用いた試料A-γでは、γ線照射により、著しく圧縮強度が向上した。そのため、γ線照射により、コラーゲンと水酸アパタイト結晶の界面において架橋結合が形成され、ダルベッコスリン酸緩衝溶液中に含浸させても骨格を形成するコラーゲン分子の分断が低減されたと考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
《参考試験例2》
 実施例2で得られた試料C及び試料C-g、並びに比較例1で得られた試料D及び試料D-gを前記参考試験例1と同じ方法により、圧縮試験を行った。
 その結果、傾斜化させた試料は、明らかにその強度が傾斜化させない試料(CとD)と比較して弱かった。また、乾燥させた試料と比較すると2倍以上の強度を示した。更に、目視でダルベッコスリン酸緩衝溶液浸漬3時間後の膨潤度を確認したところ、中央部分での膨潤が確認できた。以上のことから、鉛円錐を用いてγ線照射することで材料内部までその膨潤度の異なる部位ができることを明らかとした。
《参考例3》
 本参考例では、湿潤状態でγ線照射を行うことにより、架橋を傾斜化できることを確認した。
(i)水酸アパタイトナノ結晶のビニルシラン修飾
 90%エタノール溶液(100mL)に、水酸アパタイトナノ結晶が1wt%になるように懸濁し、ビニルシランカップリング剤を100mgになるように混合し、良く分散・転倒撹拌(18時間)後、遠心分離による固液分離を行った。さらに90%エタノール及び遠心分離による固液分離により洗浄を行った。その後、固相を100℃で2時間乾燥させ、ビニルシラン修飾水酸アパタイトを作製した。
(ii)γ線照射による圧縮強度の向上
 得られたビニルシラン修飾水酸アパタイト及び濃縮コラーゲン(10wt%)を混合重量比が60/40になるように均一に分散させ、湿潤環境下でγ線を25kGy及び50kGyの線量で照射した。その後、-20℃で凍結及び凍結乾燥を行い、ダルベッコスリン酸緩衝溶液に室温で4時間湿潤させて圧縮試験を行った。比較対象としてγ線を照射せずに凍結及び凍結乾燥した試料を用いた。その結果を図6に示す。横軸には歪量を、縦軸には応力をプロット(S-S曲線)した。図5からも明らかなようにγ線照射しない材料と比較して圧縮強度が2倍以上高くなった。また、25kGyと50kGyの照射では、圧縮強度が同程度であり、25kGyで必要最大照射量があると考えられた。
 ビニルシラン修飾水酸アパタイト及び濃縮コラーゲン(8重量%)を混合重量比が60/40になるように均一に分散させ、湿潤環境下でγ線を3.125kGy、6.25kGy、12.5kGy及び25kGyの線量で照射した。その後、-20℃で凍結及び凍結乾燥を行い、ダルベッコスリン酸緩衝溶液に室温で4時間湿潤させて圧縮試験を行った。その結果を図6に示す。横軸には照射したγ線量を縦軸には一定の歪量(40%、50%、又は60%)における応力を示す。γ線照射量により、応力は指数関数的な相関であることが分かった。非線形最小二乗によるフィッティングの結果から、「(γ線照射処理をしない材料の応力)×EXP(0.12×照射線量)」の関係が得られた。
 本発明の多孔質複合体は、骨補填材料又は再生医療用足場材料などの生体材料、又は人工骨として用いることができる。
 以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
1・・・多孔体;
11・・・ポリスチレン膜;
2・・・多孔質複合体;
21・・・生体吸収性に耐性のある部分(架橋の進んだ部分);
22・・・生体吸収性の優れた部分(架橋の進んでない部分);
31・・・テーパー(三角錐)。

Claims (14)

  1.  リン酸カルシウム結晶とコラーゲン線維とを、80:20~20:80の重量比で含む多孔質複合体であって、
    (1)生体吸収性が傾斜していること、及び
    (2)重量法による密度が300~1500mg/cmであること、
    を特徴とする多孔質複合体。
  2.  前記生体吸収性の傾斜が、多孔質複合体の2つの点における、2mmφの円柱状プローブを用いた押し込み試験による強度比であり、歪率30%における2点の強度比が1.5倍以上である、請求項1に記載の多孔質複合体。
  3.  前記生体吸収性の傾斜が、
    多孔質複合体の生体吸収性が連続又は不連続に変化し、生体吸収性の速い第1の断片及び生体吸収性の遅い第2の断片を多孔質複合体から切り出すことができ、そして第1の断片の生体吸収性と第2の断片の生体吸収性との比が1.5以上である、請求項1に記載の多孔質複合体。
  4.  前記生体吸収性がコラゲナーゼによる生分解率であって、
    生分解率は、関係式(I):
    生分解率=(W-W)/Wx100(I)
    〔式中、W及びWは、多孔質複合体の断片を2unit/mLのコラゲナーゼ溶液により6時間浸漬した場合、又は多孔質複合体の断片を200unit/mLのコラゲナーゼ溶液により0.5時間浸漬した場合の、浸漬前の乾燥重量(W)及び浸漬後の乾燥重量(W)である〕で表され、
    前記第1の断片が、多孔質複合体の生分解率の速い30重量%の領域から切り出され、第2の断片が多孔質複合体の生分解率の遅い30重量%の領域から切り出され、第1の断片の生分解率に対する第2の断片の生分解率の比が1.5以上である、請求項3に記載の多孔質複合体。
  5.  前記生体吸収性が膨潤率であって、
    膨潤率は、関係式(II):
    膨潤率=(W-W)/W×100(II)
    〔式中、W及びWは、それぞれ、多孔質複合体の断片を、リン酸緩衝溶液により24時間浸漬した場合の、浸漬前の乾燥重量(W)及び浸漬後の湿潤重量(W)である〕で表され、
    前記第1の断片が、多孔質複合体の膨潤率の高い30重量%の領域から切り出され、第2の断片が多孔質複合体の膨潤率の低い30重量%の領域から切り出され、第2の断片の膨潤率に対する第1の断片の膨潤率の比が1.5以上である、請求項3に記載の多孔質複合体。
  6.  リン酸カルシウムが、水酸アパタイト、リン酸二水素カルシウム、リン酸二水素カルシウム水和物、リン酸一水素カルシウム、リン酸一水素カルシウム水和物、リン酸八カルシウム、及びリン酸三カルシウムからなる群から選択される少なくとも1種のリン酸カルシウムである、請求項1~5のいずれか一項に記載の多孔質複合体。
  7.  請求項1~6のいずれか一項に記載の多孔質複合体を含む人工骨。
  8.  (A)リン酸カルシウム及びコラーゲンを含む多孔体を形成する工程、及び
    (B)前記多孔体に架橋密度を変化させた架橋処理を行うことによって、生体吸収性が1.5倍以上異なる多孔質複合体を得る傾斜架橋工程、
    を含む、多孔質複合体の製造方法。
  9.  前記多孔体形成工程(A)が、
    (1)リン酸カルシウム、又は表面修飾されたリン酸カルシウムの結晶懸濁液を得る結晶合成工程、
    (2)可溶化コラーゲン溶液中のコラーゲンを線維化し、コラーゲン線維懸濁液を得る、コラーゲン線維化工程、
    (3)前記コラーゲン線維懸濁液とリン酸カルシウム結晶懸濁液とを混合し、リン酸カルシウム結晶/コラーゲン線維混合懸濁液を得る、混合工程、及び
    (4)前記リン酸カルシウム結晶/コラーゲン線維混合懸濁液を多孔体に成形する工程、である、請求項8に記載の多孔質複合体の製造方法。
  10.  前記多孔体形成工程(A)が、
    リン酸カルシウム/コラーゲン複合繊維と緩衝液との混合によりゲル化させ、多孔体に成形する工程である、請求項8に記載の多孔質複合体の製造方法。
  11.  前記傾斜架橋工程(B)における架橋がグルタルアルデヒド気相蒸着法による架橋であって、多孔体へのグルタルアルデヒドガスの拡散量を変化させることにより、生体吸収性が1.5倍以上異なる多孔質複合体を作製する、請求項8~10のいずれか一項に記載の多孔質複合体の製造方法。
  12.  前記傾斜架橋工程(B)における架橋が、放射線照射架橋であって、湿潤環境下において多孔体への放射線照射量を変化させることにより、生体吸収性が1.5倍以上異なる多孔質複合体を作製する、
    請求項8~10のいずれか一項に記載の多孔質複合体の製造方法。
  13.  前記リン酸カルシウム結晶が、ビニル基が導入されたものである、請求項12に記載の多孔質複合体の製造方法。
  14.  前記リン酸カルシウムが、水酸アパタイト、リン酸二水素カルシウム、リン酸二水素カルシウム水和物、リン酸一水素カルシウム、リン酸一水素カルシウム水和物、リン酸八カルシウム、及びリン酸三カルシウムからなる群から選択される少なくとも1種のリン酸カルシウムである、請求項8~13のいずれか一項に記載の多孔質複合体の製造方法。
PCT/JP2012/067113 2011-07-04 2012-07-04 生体吸収性の傾斜した多孔質複合体及びそれを用いた人工骨、並びにそれらの製造方法 WO2013005778A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/130,841 US9119903B2 (en) 2011-07-04 2012-07-04 Porous composite with graded bioabsorbability, artificial bone using the same, and manufacturing method thereof
JP2013523039A JP6157351B2 (ja) 2011-07-04 2012-07-04 生体吸収性の傾斜した多孔質複合体及びそれを用いた人工骨、並びにそれらの製造方法
EP12807115.6A EP2730295B1 (en) 2011-07-04 2012-07-04 Porous complex with bioabsorbability gradient, artificial bone using same, and manufacturing method of these

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011-148123 2011-07-04
JP2011148123 2011-07-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013005778A1 true WO2013005778A1 (ja) 2013-01-10

Family

ID=47437125

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/067113 WO2013005778A1 (ja) 2011-07-04 2012-07-04 生体吸収性の傾斜した多孔質複合体及びそれを用いた人工骨、並びにそれらの製造方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9119903B2 (ja)
EP (1) EP2730295B1 (ja)
JP (1) JP6157351B2 (ja)
WO (1) WO2013005778A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016163396A1 (ja) * 2015-04-08 2016-10-13 東洋紡株式会社 多孔質複合体、骨再生材料、および多孔質複合体の製造方法
JP2018094394A (ja) * 2016-12-12 2018-06-21 オリンパステルモバイオマテリアル株式会社 骨補填材および骨補填材の製造方法
JP2018130343A (ja) * 2017-02-15 2018-08-23 国立大学法人東京工業大学 組成傾斜複合体及びその製造方法
JPWO2018123814A1 (ja) * 2016-12-28 2020-01-09 株式会社高研 高強度コラーゲンスポンジ

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2969103C (en) * 2014-11-27 2023-01-17 Toyobo Co., Ltd. Porous composite, bone regeneration material, and method for producing porous composite
US10800708B2 (en) 2016-02-29 2020-10-13 Tokyo Institute Of Technology Silver-containing calcium phosphate sintered body and method for producing same
WO2019013533A2 (ko) * 2017-07-10 2019-01-17 주식회사 아모라이프사이언스 세포배양 지지체용 혼섬사 제조방법, 이를 통해 구현된 세포배양 지지체용 혼섬사 및 이를 포함하는 원단
KR101906899B1 (ko) * 2018-05-30 2018-10-11 강호창 링형 골 이식재 제조방법
NL2027479B1 (en) 2021-02-02 2022-09-05 Medskin Solutions Dr Suwelack Ag Porous osteoinductive composites

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001286494A (ja) 2000-04-07 2001-10-16 Mmt:Kk 人工骨補綴材
JP2007098118A (ja) 2005-09-09 2007-04-19 National Institute For Materials Science 多孔質弾性複合材料の製造方法および多孔質弾性複合材料
JP2008018163A (ja) 2006-07-14 2008-01-31 Olympus Terumo Biomaterials Corp 骨補填材の製造方法
JP2008513159A (ja) * 2004-09-21 2008-05-01 マサチューセッツ・インスティチュート・オブ・テクノロジー 勾配骨組及びその作成方法
JP2009132601A (ja) 2007-11-01 2009-06-18 Hoya Corp アパタイト/コラーゲン複合体繊維を含む多孔体及びその製造方法
JP2010273847A (ja) 2009-05-28 2010-12-09 Tokyo Institute Of Technology 高密度多孔質複合体

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4408603B2 (ja) 2001-10-19 2010-02-03 独立行政法人科学技術振興機構 有機無機複合生体材料およびその製造方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001286494A (ja) 2000-04-07 2001-10-16 Mmt:Kk 人工骨補綴材
JP2008513159A (ja) * 2004-09-21 2008-05-01 マサチューセッツ・インスティチュート・オブ・テクノロジー 勾配骨組及びその作成方法
JP2007098118A (ja) 2005-09-09 2007-04-19 National Institute For Materials Science 多孔質弾性複合材料の製造方法および多孔質弾性複合材料
JP2008018163A (ja) 2006-07-14 2008-01-31 Olympus Terumo Biomaterials Corp 骨補填材の製造方法
JP2009132601A (ja) 2007-11-01 2009-06-18 Hoya Corp アパタイト/コラーゲン複合体繊維を含む多孔体及びその製造方法
JP2010273847A (ja) 2009-05-28 2010-12-09 Tokyo Institute Of Technology 高密度多孔質複合体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YUNOKI S ET AL.: "Effects of increased collagen-matrix density on the mechanical properties and in vivo absorbability of hydroxyapatite-collagen composites as artificial bone materials.", BIOMED. MATER., vol. 6, no. 1, February 2011 (2011-02-01), pages 015012, XP020188072 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016163396A1 (ja) * 2015-04-08 2016-10-13 東洋紡株式会社 多孔質複合体、骨再生材料、および多孔質複合体の製造方法
JPWO2016163396A1 (ja) * 2015-04-08 2017-08-17 東洋紡株式会社 多孔質複合体、骨再生材料、および多孔質複合体の製造方法
CN107530472A (zh) * 2015-04-08 2018-01-02 东洋纺株式会社 多孔复合体、骨再生材料、以及多孔复合体的制造方法
JP2018094394A (ja) * 2016-12-12 2018-06-21 オリンパステルモバイオマテリアル株式会社 骨補填材および骨補填材の製造方法
JP7158847B2 (ja) 2016-12-12 2022-10-24 オリンパステルモバイオマテリアル株式会社 骨補填材および骨補填材の製造方法
JP7177588B2 (ja) 2016-12-12 2022-11-24 オリンパステルモバイオマテリアル株式会社 骨補填材および骨補填材の製造方法
JPWO2018123814A1 (ja) * 2016-12-28 2020-01-09 株式会社高研 高強度コラーゲンスポンジ
JP7165326B2 (ja) 2016-12-28 2022-11-04 株式会社高研 高強度コラーゲンスポンジ
JP2018130343A (ja) * 2017-02-15 2018-08-23 国立大学法人東京工業大学 組成傾斜複合体及びその製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP6157351B2 (ja) 2017-07-05
US9119903B2 (en) 2015-09-01
EP2730295B1 (en) 2018-02-28
EP2730295A1 (en) 2014-05-14
EP2730295A4 (en) 2015-03-11
US20140142717A1 (en) 2014-05-22
JPWO2013005778A1 (ja) 2015-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6157351B2 (ja) 生体吸収性の傾斜した多孔質複合体及びそれを用いた人工骨、並びにそれらの製造方法
Rahman et al. Fabrication of biocompatible porous scaffolds based on hydroxyapatite/collagen/chitosan composite for restoration of defected maxillofacial mandible bone
Khoshakhlagh et al. Development and characterization of a bioglass/chitosan composite as an injectable bone substitute
Liu et al. Cell-loaded injectable gelatin/alginate/LAPONITE® nanocomposite hydrogel promotes bone healing in a critical-size rat calvarial defect model
JP4873555B2 (ja) アパタイト/コラーゲン複合体繊維を含む多孔体の製造方法
Kweon et al. Development of nano-hydroxyapatite graft with silk fibroin scaffold as a new bone substitute
Yokoyama et al. Biomimetic porous scaffolds with high elasticity made from mineralized collagen—an animal study
CN107349470B (zh) 一种无机纳米颗粒增强水凝胶的制备方法及其在人工骨膜中的应用
Duarte et al. Production of hydroxyapatite–bacterial cellulose nanocomposites from agroindustrial wastes
Sun et al. Porous Nanocomposite Comprising Ultralong Hydroxyapatite Nanowires Decorated with Zinc‐Containing Nanoparticles and Chitosan: Synthesis and Application in Bone Defect Repair
Parisi et al. Incorporation of collagen from marine sponges (spongin) into hydroxyapatite samples: characterization and in vitro biological evaluation
WO2005097217A1 (ja) アパタイト/コラーゲン複合体繊維を含む多孔体の平均気孔径制御方法
JP2010273847A (ja) 高密度多孔質複合体
WO2007011172A1 (en) Preparation method of porous beta tricalcium phosphate granules
Do Amaral et al. In vitro and in vivo response of composites based on chitosan, hydroxyapatite and collagen
Kozlowska et al. Preparation and characterization of collagen/chitosan poly (ethylene glycol)/nanohydroxyapatite composite scaffolds
Klimek et al. New method for the fabrication of highly osteoconductive β‐1, 3‐glucan/HA scaffold for bone tissue engineering: Structural, mechanical, and biological characterization
Ramalingam et al. Biomimetics: advancing nanobiomaterials and tissue engineering
CN110947034B (zh) 一种生物活性磷酸钙/纤维蛋白复合的可注射骨修复水凝胶
Vrânceanu et al. Development and characterization of novel porous collagen based biocomposite for bone tissue regeneration
Bajpai et al. γ-Radiation assisted fabrication of hydroxyapatite-polyacrylamide nanocomposites with possible application in bone implantology
Jamalpoor Chitosan: a brief review on structure and tissue engineering application
JP7412700B2 (ja) 多孔質複合体
RU2297249C1 (ru) Способ получения композиционного материала для заполнения костных дефектов
Dragusin et al. Biocomposites based on biogenous mineral for inducing biomimetic mineralization

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12807115

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013523039

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14130841

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012807115

Country of ref document: EP