JPWO2018123814A1 - 高強度コラーゲンスポンジ - Google Patents
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Abstract
Description
1.ポア構造を有する多孔質構造体のコラーゲンスポンジであって、どの方向でも引張強度が1N以上5N以下である、コラーゲンスポンジ。
2.化学架橋剤により不溶化処理されている、前項1に記載のコラーゲンスポンジ。
3.前記ポアの平均直径が1μm以上50μm未満の範囲である、前項1または2に記載のコラーゲンスポンジ。
4.ひずみ10%負荷時に7kPa以上30kPa以下の応力を持つ、前項1〜3のいずれか一に記載のコラーゲンスポンジ。
5.酸性コラーゲン溶液の凍結乾燥体である、前項1〜4のいずれか一に記載のコラーゲンスポンジ。
6.撹拌脱泡処理されたコラーゲン溶液を凍結乾燥したポア構造を有する多孔質構造体に、化学架橋剤による不溶化処理が加えられた、引張強度が1N以上5N以下、応力がひずみ10%負荷時に7kPa以上30kPa以下であるコラーゲンスポンジ。
7.前記コラーゲン溶液が、線維化工程を経ていないコラーゲン溶液である、前項6に記載のコラーゲンスポンジ。
8.以下の工程を含む、コラーゲンスポンジの製造方法:
(1)コラーゲンと溶媒とを混合したコラーゲン溶液を攪拌脱泡処理する工程;
(2)コラーゲン溶液を凍結乾燥処理する工程;
(3)凍結乾燥処理後のコラーゲン乾燥物を不溶化処理する工程。
9.前記工程(2)のコラーゲン溶液が、線維化工程を経ていないコラーゲン溶液である、前項8に記載のコラーゲンスポンジの製造方法。
10.前記コラーゲン溶液のpHが酸性である、前項8又は9に記載のコラーゲンスポンジの製造方法。
11.前記工程(1)が、以下の工程(1−1)及び工程(1−2)を含む、前項8〜10のいずれか一に記載のコラーゲンスポンジの製造方法:
(1−1)コラーゲンを溶媒に添加して攪拌脱泡処理することにより、コラーゲン溶液を調製する工程;
(1−2)容器に注入したコラーゲン溶液を撹拌脱泡処理することにより、コラーゲン溶液中の気泡を低減させる工程。
12.前記攪拌脱泡処理の公転遠心力が1G以上600G以下、自転遠心力が0.1G以上80G以下である、前項8〜11のいずれかに一に記載のコラーゲンスポンジの製造方法。
13.前項1〜7のいずれか一に記載のコラーゲンスポンジを基材とする、軟骨治療用補填材。
14.軟骨治療が線維性軟骨再生治療である、前項13に記載の軟骨治療用補填材。
15.軟骨治療が半月板再生治療である、前項13に記載の軟骨治療用補填材。
16.前項1〜7のいずれかに記載のコラーゲンスポンジを軟骨に埋植する、軟骨の治療方法。
17.軟骨が線維性軟骨である前項16に記載の軟骨の治療方法。
18.線維性軟骨が半月板である、前項17に記載の軟骨の治療方法。
19.前記コラーゲン溶液が、アテロコラーゲン溶液である前項5〜7のいずれか一に記載のコラーゲンスポンジ。
20.前記コラーゲン溶液がアテロコラーゲン溶液である前項8〜12のいずれか一に記載のコラーゲンスポンジの製造方法。
21.コラーゲンスポンジの厚さが1mm以上10mm以下である、前項1〜7のいずれか一に記載のコラーゲンスポンジ。
コラーゲンスポンジは、コラーゲンを材料とする、複数のポア構造を有する多孔質構造体である。本発明のコラーゲンスポンジは、軟骨治療の操作上求められる引張強度1N以上5N以下を有する。本発明のコラーゲンスポンジの引張強度は、好ましくは1.5N以上5N以下である。本発明のコラーゲンスポンジは、引張強度がどの方向にでも強く優れたものである。本発明のコラーゲンスポンジは、コラーゲン線維を形成していない状態のコラーゲン溶液を直接凍結乾燥処理することにより製造されることから、コラーゲン分子がランダムな配置でスポンジを形成していると考えられる。コラーゲン分子の配向が一方向ではなく、ランダムであることから、どの方向でも引張強度が優れている。尚、引張強度は、1N未満では軟骨治療において組織への縫合にて必要とされる強度を満たさない。また5Nを超えると、軟骨治療にて求められる応力(ひずみ10%負荷時の応力が7kPa以上30kPa以下)に影響を与える。また、どの方向でも引張強度が1N以上5N以下であることより、縫合により種々の方向に引っ張られたとしても縫合糸の穴の部分から千切れることなく組織に保持される。
本発明のコラーゲンスポンジは、少なくとも以下の(1)〜(3)の工程を含む製造方法により製造される。
(1)コラーゲンと溶媒とを混合したコラーゲン溶液を攪拌脱泡処理する工程。
(2)コラーゲン溶液を凍結乾燥処理する工程。
(3)凍結乾燥処理後の乾燥物を不溶化処理する工程。
(1−2)容器に注入したコラーゲン溶液を撹拌脱泡処理することにより、コラーゲン溶液中の気泡を低減させる工程、
好ましくは、工程(1)は、工程(1−1)及び工程(1−2)の両方が含まれる。
また、コラーゲン溶液の粘性に応じて公転遠心力、自転遠心力、およびその比率を変更することもできる。公転遠心力が上記範囲内であれば、容器内のコラーゲン溶液に十分な遠心力を与えることができ、コラーゲン溶液から泡を効率的に除去することができる。また、自転遠心力が上記範囲内であれば、容器の自転によるコラーゲン溶液の攪拌効果が高く、コラーゲン分子が偏ることなく、分散されるため好ましい。高濃度のコラーゲン溶液について、公転自転式の攪拌脱泡ではなく一般的な遠心脱泡を行った場合は、脱泡できる遠心力ではコラーゲン分子が遠心作用により偏ってしまい、コラーゲン濃度及び凍結乾燥後の構造に斑が生じてしまう。
撹拌脱泡後のコラーゲン溶液は速やかに凍結乾燥される(工程(2))。凍結乾燥前のコラーゲン溶液は、好ましくは線維化工程を経ていない溶液である。凍結乾燥を行うことにより、海綿構造を有するコラーゲン乾燥物が作製される。凍結乾燥方法は、まずコラーゲンスポンジ用成形容器にてコラーゲン溶液を凍結させた後、減圧乾燥を行うものであるが、自体公知の凍結乾燥の手法を用いることができる。凍結乾燥方法は、急速、緩慢凍結等があるが、凍結の方法によって乾燥物のポアサイズに違いが出るので、希望するポアサイズにできる凍結方法を選択する。例えば、急速に凍結乾燥すれば、ポアサイズは小さくなり、緩慢に凍結乾燥すれば、ポアサイズは大きくなる。ポアサイズは、細胞がコラーゲンスポンジの内部に浸潤でき、コラーゲンスポンジを出入りする体液により細胞の接着が妨げられないことが望ましい。よって、ポアサイズは、平均直径を1μm以上50μm未満、好ましくは5μm以上30μm以下にすることが望ましい。減圧乾燥は、減圧することにより凍結物の沸点を下げて、低い温度で凍結物の水分を昇華させることにより凍結物内を乾燥させる。本発明においては、減圧乾燥は開始時の温度を−40℃〜−15℃とし、経時的に常温まで温度を上げることにより行うことができる。具体的には、−30℃に冷却した凍結乾燥機内に、コラーゲン溶液を充填した容器を静置し、該溶液を凍結させた後に、−30℃から常温まで経時的に温度を上げながら減圧乾燥を70〜75時間行うことで所望のポアサイズを得ることができる。
本発明においては、工程(3)コラーゲン乾燥物の不溶化処理を行うことによって、コラーゲン乾燥物の物理的な強度を高め、移植した組織内でのコラーゲンスポンジの残存期間を調節することができる。不溶化処理を行う場合、コラーゲン乾燥物の形状を崩すことなく、またコラーゲン乾燥物の内部にまで均一に不溶化処理が必要である。本発明の不溶化処理としては、乾燥物の内部にまで不溶化処理が可能な、化学架橋化剤による処理、乾熱処理、γ線照射が望ましい。化学架橋化剤としては、水溶性化学架橋剤、気化可能な化学架橋剤等が挙げられる。不溶化処理を行うことにより、コラーゲンがランダムな配向で架橋することができ、コラーゲンスポンジの力学的強度を高めることができると考えられる。
本発明のコラーゲンスポンジは、軟骨治療に用いることができる。本発明のコラーゲンスポンジは、軟骨組織の補強材又は補填材として生体に埋植されるのに適している。本発明のコラーゲンスポンジは、そのまま生体内に埋植することもできるし、埋植前に細胞を播種し、培養した後に埋植することも可能である。培養する際には、生体の軟骨組織が受ける負荷と類似の負荷を加えながら培養することも可能である。本発明のコラーゲンスポンジは、埋植する軟骨組織と同等の引張強度と圧縮強度(応力)を有し、構造及び強度にむらがないものであることから、埋植周辺組織への力学的な負担を軽減でき、かつ、細胞が浸潤するためのポア構造を維持することができるものである。
(1)ウシ真皮由来の酵素可溶化コラーゲン(アテロコラーゲン)を、塩酸に加え、さらにあわとり練太郎(登録商標)ARE−310(株式会社シンキー)を用いて、公転遠心力420G、自転遠心力25Gで、5分(30秒×10回)で、撹拌脱泡し、酸性のコラーゲン溶液(pH3)を得た。なお攪拌脱泡を10回に分けたのは、コラーゲン溶液の温度上昇を防ぐためである。本実施例では、攪拌脱泡30秒ごとに運転を停止し、コラーゲン溶液の温度をモニタリングし、30℃を超えていないことを確認した。該溶液中のコラーゲン濃度をケルダール法により測定し、溶液中のコラーゲン濃度が80mg/mlとなるように調節した。なお、80mg/mlより濃度が低い場合には、酵素可溶化コラーゲンを加えて、濃度を上げた。
コラーゲン濃度が80mg/mlのコラーゲン溶液7mlを、ポリアセタール製のカップに分注し、さらにあわとり練太郎(登録商標)ARE−310(株式会社シンキー)を用いて公転遠心力516G、自転遠心力0.14G(脱泡モード2200rpm)で、90秒で攪拌脱泡処理を行った。
次に、不溶化処理後のコラーゲンスポンジを、イオン交換水を入れたPP製容器に移し替えて、撹拌(30℃、30分×10〜15回)し、その後架橋剤の中和液を添加して撹拌(30℃、18時間)し、再度イオン交換水を入れたPP製容器に移し替えて、撹拌(30℃、30分×10〜15回)することで、洗浄を行った。最後に、乾燥することにより、本発明のコラーゲンスポンジを得た。
実施例1で製造した本発明のコラーゲンスポンジと、従来のコラーゲンスポンジについて、走査型電子顕微鏡像(SEM像)、引張強度、圧縮強度を確認した。
実施例1で作製した本発明のコラーゲンスポンジをミニブタに埋植し、半月板欠損修復の有効性及び安全性を評価した。10〜12ヶ月齢のミニブタ8頭8膝の内側半月前〜中節部に3×8mmの欠損を作製し、欠損部に同サイズのコラーゲンスポンジを装填した補填群4膝と、非補填群4膝を術後6ヶ月にて比較検討した。肉眼的観察を欠損部組織修復、軟骨損傷、滑膜増生の有無につき、また組織学的観察を、欠損部修復組織量、修復組織像、サフラニンO染色性、半月板表面形状、半月板inner形状、周囲組織との接着につき、点数化による定量評価を行った。
線維化工程を経ていないコラーゲンスポンジと、線維化工程を経たコラーゲンスポンジとの構造の違いを確認した。
Claims (15)
- ポア構造を有する多孔質構造体のコラーゲンスポンジであって、どの方向でも引張強度が1N以上5N以下である、コラーゲンスポンジ。
- 化学架橋剤により不溶化処理されている、請求項1に記載のコラーゲンスポンジ。
- 前記ポアの平均直径が1μm以上50μm未満の範囲である、請求項1または2に記載のコラーゲンスポンジ。
- ひずみ10%負荷時に7kPa以上30kPa以下の応力を持つ、請求項1〜3のいずれか一に記載のコラーゲンスポンジ。
- 酸性コラーゲン溶液の凍結乾燥体である、請求項1〜4のいずれか一に記載のコラーゲンスポンジ。
- 撹拌脱泡処理されたコラーゲン溶液を凍結乾燥したポア構造を有する多孔質構造体に、化学架橋剤による不溶化処理が加えられた、引張強度が1N以上5N以下、応力がひずみ10%負荷時に7kPa以上30kPa以下であるコラーゲンスポンジ。
- 前記コラーゲン溶液が、線維化工程を経ていないコラーゲン溶液である、請求項6に記載のコラーゲンスポンジ。
- 以下の工程を含む、コラーゲンスポンジの製造方法:
(1)コラーゲンと溶媒とを混合したコラーゲン溶液を攪拌脱泡処理する工程;
(2)コラーゲン溶液を凍結乾燥処理する工程;
(3)凍結乾燥処理後のコラーゲン乾燥物を不溶化処理する工程。 - 前記工程(2)のコラーゲン溶液が、線維化工程を経ていないコラーゲン溶液である、請求項8に記載のコラーゲンスポンジの製造方法。
- 前記コラーゲン溶液のpHが酸性である、請求項8又は9に記載のコラーゲンスポンジの製造方法。
- 前記工程(1)が、以下の工程(1−1)及び工程(1−2)を含む、請求項8〜10のいずれか一に記載のコラーゲンスポンジの製造方法;
(1−1)コラーゲンを溶媒に添加して攪拌脱泡処理することにより、コラーゲン溶液を調製する工程;
(1−2)容器に注入したコラーゲン溶液を撹拌脱泡処理することにより、コラーゲン溶液中の気泡を低減させる工程。 - 前記攪拌脱泡処理の公転遠心力が1G以上600G以下、自転遠心力が0.1G以上80G以下である、請求項8〜11のいずれか一に記載のコラーゲンスポンジの製造方法。
- 請求項1〜7のいずれか一に記載のコラーゲンスポンジを基材とする、軟骨治療用補填材。
- 軟骨治療が線維性軟骨再生治療である、請求項13に記載の軟骨治療用補填材。
- 軟骨治療が半月板再生治療である、請求項13に記載の軟骨治療用補填材。
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