CN107530472A - 多孔复合体、骨再生材料、以及多孔复合体的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供具有适度的挠曲强度、并且压缩强度优异的包含OCP和胶原蛋白的多孔复合体、包含该多孔复合体的骨再生材料。本发明的多孔复合体的特征在于，包含磷酸八钙和胶原蛋白，挠曲强度及压缩强度分别为0.05～0.16MPa及0.3MPa以上。

Description

多孔复合体、骨再生材料、以及多孔复合体的制造方法
技术领域
本发明涉及多孔复合体、骨再生材料、以及多孔复合体的制造方法。
背景技术
作为以往所使用的骨再生材料，已知有羟磷灰石(HA)等磷酸钙(例如参照专利文献2、专利文献3、专利文献4、专利文献5)。
近年来，发现作为HA的前体物质的磷酸八钙(Octacalcium phosphate，以下称作“OCP”)与HA、β－磷酸三钙(β－TCP)等其他的磷酸钙相比，骨再生的促进作用高，在生物体内的吸收性也高(例如参照专利文献1)。这样，OCP在磷酸钙中作为骨再生材料具有特别优异的特性。
但是，由于OCP为无机物，因此缺乏形状赋予性。由此，如果是单独的OCP，则难以应用于宽范围的骨缺损部的再生等。因而，提出了将OCP与胶原蛋白的复合体作为骨再生材料使用的方案(例如参照专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2006－167445号公报
专利文献2：日本特开2010－273847号公报
专利文献3：日本特开2003－260124号公报
专利文献4：日本特开2009－132601号公报
专利文献5：日本特开2005－279078号公报
专利文献6：日本特开平5－070113号公报
发明内容
发明所要解决的问题
骨再生材料通常适用于无固定形状的骨缺损。对于出于此种目的使用的骨再生材料，要求骨再生促进能力是不言而喻的，同时在临床上还要求良好的操作性。例如要求如下的特征，即，①具有适度的挠曲强度，可以用镊子等与骨缺损部的形状匹配地容易地加工；②具有适度的压缩强度，在操作时不会产生破损等。
专利文献4中，公开过以最佳的平衡具有机械强度和生物体亲和性、适于人造骨材、细胞的支架材料等的包含磷灰石/胶原蛋白复合体纤维的多孔体。此种磷灰石/胶原蛋白复合体纤维由于在胶原蛋白上沉淀有微细的磷灰石粒子，因此在初期的机械强度的方面有利，然而另一方面，由于其强度，存在有难以用镊子等容易地加工的问题。
专利文献1中，公开过包含磷酸八钙和胶原蛋白、形状赋予性优异的硬组织替代性载体材料。此种硬组织替代性载体材料的柔软性优异，然而其气孔直径大，因此压缩强度低，存在有在操作时容易产生破损等问题。
本发明是鉴于上述问题而完成的，其目的在于，提供具有与以往相比得到改善的挠曲强度及压缩强度的、操作性良好的包含OCP和胶原蛋白的多孔复合体、包含该多孔复合体的骨再生材料、以及多孔复合体的制造方法。
用于解决问题的方法
鉴于上述问题，本发明人等进行了深入研究，结果发现了如下的多孔复合体，其通过使用具有给定的离子强度的包含胶原蛋白的液体，而具有所期望的范围内的挠曲强度及压缩强度，其结果是兼顾了加工容易性和机械强度。本发明人等反复进行进一步的研究和改良，提供以下述为代表的发明。
[1]一种多孔复合体，其包含磷酸八钙和胶原蛋白，挠曲强度为0.05～0.16MPa，压缩强度为0.3MPa以上。
[2]根据[1]所述的多孔复合体，其中，气孔直径为3～90μm。
[3]根据[1]或[2]所述的多孔复合体，其中，胶原蛋白为I型或I型与III型的混合物。
[4]一种骨再生材料，其包含[1]～[3]中任一项所述的多孔复合体。
[5]一种多孔复合体的制造方法，其特征在于，是包含磷酸八钙和胶原蛋白的多孔复合体的制造方法，该制造方法包括：
(1)以使离子强度为0.005～0.06、pH为6.0～9.0的方式制备包含胶原蛋白的液体，制备包含胶原蛋白的凝胶、溶胶或液体的工序；以及
(2)得到混合了所述包含胶原蛋白的凝胶、溶胶或液体与磷酸八钙的悬浮液的工序。
[6]根据[5]所述的多孔复合体的制造方法，其中，还包括(3)将所述悬浮液浸渍于液体制冷剂中急速冷冻后、进行冷冻干燥的工序。
[7]一种多孔复合体的制造方法，其特征在于，是包含磷酸八钙和胶原蛋白的多孔复合体的制造方法，该制造方法包括：
(1)得到混合了包含胶原蛋白的液体与磷酸八钙的悬浮液的工序；以及
(2)将所述悬浮液调整为离子强度为0.005～0.06、pH为6.0～9.0的工序。
[8]根据[7]所述的多孔复合体的制造方法，其中，还包括(3)将所述悬浮液浸渍于液体制冷剂中急速冷冻后、进行冷冻干燥的工序。
发明效果
根据本发明，可以提供加工性优异、并且难以破损的、与以往相比挠曲强度及压缩强度的特性优异的包含OCP和胶原蛋白的多孔复合体、以及包含该多孔复合体的骨再生材料。除此以外，本多孔复合体难以受到由蛋白分解酶造成的分解，可以更长久地停留于需要骨再生的部分，可以期待促进骨再生。
附图说明
图1是用于说明弯曲试验用的样品尺寸的示意图。
图2是用于说明挠曲强度的测定方法的示意图。
图3是表示针对实施例1的挠曲强度试验中的应力－应变曲线的图表。
图4是用于说明压缩强度的测定方法的示意图。
具体实施方式
[多孔复合体]
本发明的多孔复合体是包含OCP和胶原蛋白的多孔的复合体(OCP/胶原蛋白复合体)。本发明的多孔复合体的优选的方式是如下的多孔复合体，即，胶原蛋白形成三维的海绵状结构，OCP在该海绵状结构中作为至少100μm以上的颗粒存在。包含本发明的多孔复合体的骨再生材料利用多孔体结构使骨芽细胞侵入多孔内部，实现促进新生骨的形成的内部骨形成。
OCP(Ca8H2(PO4)6·5H2O)可以利用各种公知的方法制备，例如可以利用LeGeros的滴加法(LeGeros RZ，Calcif Tissue Int 37：194-197，1985)或专利文献6中公开的使用了合成装置(三流管)的方法等来制备。另外，可以利用混合法来制备，具体而言，例如可以通过将磷酸二氢钠水溶液与乙酸钙水溶液在恰当的条件下混合，回收所生成的沉淀物来获得OCP。优选使由沉淀物得到的OCP干燥，使用电动磨机等进行粉碎，制成粒子状的粉体后使用。粒径优选为10～1000μm的范围，更优选制成300～500μm。粒径可以利用筛分法借助筛子的孔眼的尺寸进行分级。
作为胶原蛋白，其来源、性状等没有特别限定，可以使用各种胶原蛋白。优选使用通过用蛋白分解酶(例如胃蛋白酶、链霉蛋白酶等)使之可溶化而得到，且除去了端肽的酶可溶性胶原蛋白。作为胶原蛋白的类型，优选作为纤维性胶原蛋白的I型、II型、III型及IV型胶原蛋白，特别优选生物体内大量包含的I型胶原蛋白、或I型与III型胶原蛋白的混合物。作为原料，没有特别限定，可以优选使用来自于猪、牛等的皮肤、骨骼、肌腱等的胶原蛋白。由于胶原蛋白是来自于生物体的成分，因此具有安全性高的特长，特别是酶可溶性胶原蛋白的致敏性也低，因而优选。作为上述的胶原蛋白，也可以使用市售的产品。
在本发明的多孔复合体中，OCP与胶原蛋白的配合比可以根据所期望的形状赋予性、操作性、生物体亲和性等适当地调整。相对于胶原蛋白1重量份而言的OCP的配合比优选为0.5～35重量份，更优选为1～20重量份，进一步优选为2～10重量份。如果相对于胶原蛋白1而言OCP小于0.5，则所得的复合体的骨再生功能有可能变差，另外如果大于35重量份，则形状赋予性有可能降低。
本发明的多孔复合体的挠曲强度优选为0.05～0.16MPa。更优选为0.08～0.16MPa。在挠曲强度大于0.16MPa的情况下，会有难以进行利用镊子等的容易的加工的趋势。即，在医生将多孔复合体填充于骨缺损部时，需要根据缺损部的大小将多孔复合体调整为适当的大小，而如果此时为0.16MPa以下，就可以通过用镊子等施加适度的应力而容易地切割。另一方面，在挠曲强度小于0.05MPa的情况下，容易轻易地断裂，会有容易产生手术后的破损的趋势。
本发明的挠曲强度是利用下述的方法测定。
(挠曲强度测定)
在温度：25℃、湿度：65％的环境下，将图1所示的厚(h)4mm、宽(b)10mm、长30mm的长方体状试样(样品)在磷酸缓冲生理盐水(10mM磷酸钠、0.14M氯化钠、pH7.4)中浸渍30分钟。其后，轻轻地擦掉样品表面的水气，以使支点间距离(L)为20mm的方式将样品安放于拉伸·压缩试验机(测力传感器容量：1kN)的支承台(支承台的半径R1＝5mm)。作为对样品施加载荷的夹具的压头使用半径R2＝5mm的压头。本测定如图2所示，进行三点弯曲试验。然后，将拉伸·压缩试验机的十字头以10mm/min的速度下降，直至样品发生了断裂。需要说明的是，本试验中，所谓“样品发生了断裂”，是指如图3所示在应力－应变曲线中载荷急剧地降低的点。
本发明的所谓挠曲强度(σ)，是由样品的断裂时载荷、样品的尺寸及支点间距离以式1表示。
σ＝3FL/2bh2 (式1)
σ：挠曲强度(Pa)
F：断裂时载荷(N)
L：支点间距离(mm)
b：样品的宽度(mm)
h：样品的厚度(mm)
本发明的多孔复合体的压缩强度优选为0.3MPa以上，更优选为0.3～3.0MPa，进一步优选为0.3～1.0MPa。在压缩强度小于0.3MPa的情况下，多孔复合体的操作性有降低的趋势。即，在将本发明的多孔复合体填充于骨缺损部时，如果所述复合体崩塌、或气孔压扁，就会对其后的骨再生造成不良影响。具体而言，在医生对具有各种形状的骨缺损部使用夹具进行没有间隙地填充多孔复合体的手术时，表示不会产生所述复合体的崩塌或气孔压扁的指标为压缩强度0.3MPa以上。上限没有特别限定，然而从向骨缺损部填充时的操作容易性的观点考虑，优选为3.0MPa以下。
本发明的压缩强度是利用下述的方法测定。
(压缩强度测定)
在温度：25℃、湿度：65％的环境下，将直径8.5mm、长15mm的圆柱状试样(样品)在磷酸缓冲生理盐水(10mM磷酸钠、0.14M氯化钠、pH7.4)中浸渍30分钟。其后，轻轻地擦掉样品表面的水气，使用拉伸·压缩试验机(测力传感器容量：1kN)，在圆柱的上下方向上加载单轴载荷。此后，将使载荷阶段性地变化时样品崩塌的最小载荷设为崩塌时载荷。所谓“观察到样品的崩塌”，是指在用肉眼观察试样时确认产生了明确的龟裂或剥落。
具体而言，参照图4，将样品安放于试样台41后，将安装有平型压缩夹具的十字头42以10mm/min的速度下降，在测力传感器显示出2.5N时停止十字头42而解除载荷。观察试样台的样品，如果没有崩塌，则将该样品重新安放于试样台，同样地降低十字头，直至测力传感器显示出5N。每次2.5N地增加载荷，反复该操作，将初次观察到样品的崩塌时的载荷设为崩塌时载荷。
本发明的压缩强度是由上述崩塌时载荷和样品的截面积(垂直于圆柱的厚度方向的截面的截面积)以式2表示。
Cs＝F/S (式2)
Cs：压缩强度(Pa)
F：崩塌时载荷(N)
S：样品的截面积(m2)
需要说明的是，样品的截面积大约为(0.00425)2×3.14＝5.67×10－5m2。
本发明的多孔复合体优选多孔复合体的气孔直径为3～90μm。在气孔直径大于90μm的情况下，会有多孔复合体的压缩强度降低的趋势。另一方面，在气孔直径小于3μm的情况下，难以发生骨芽细胞等骨代谢系细胞的侵入，骨再生的促进作用有可能降低。本发明的多孔复合体的更优选的气孔直径为5～40μm。
气孔直径是使用借助水银测孔计(Mercury porosimeter)的细孔分布测定进行测定，具体而言是利用以下的方法测定。
(气孔直径测定)
作为前处理，将样品在120℃恒温干燥4小时。对前处理后的各样品，利用使用了以下的测定装置的压汞法，在以下的条件下求出细孔直径0.0018～200μm的细孔分布。
测定装置：Autopore IV9520(micromeritics公司制)
测定条件：样品与水银的接触角：140deg
水银的表面张力0.48N/m(以1dyne＝10－5N换算)
发明的所谓气孔直径，是在由基于压汞法的测定压力得到的细孔分布曲线中具有最大面积的峰的显示出极大值的细孔直径的值。
多孔复合体的气孔率(空隙率)优选为80～99％，更优选为85～98％。气孔率是使用基于压汞法的总细孔容积和表观密度利用下式求出。
气孔率(％)＝总细孔容积/{(1/表观密度)+总细孔容积}×100
本发明的多孔复合体的形状优选为长方体(块体)、圆柱体或压片状、或颗粒。长方体时的大小优选5mm×5mm×5mm以上的大小，通常上限优选为100mm×100mm×100mm以内的范围。长方体并不限于立方体。圆筒状时的大小优选直径为5～50mm，优选高度为1～50mm的范围。在为颗粒状时，形状不限于球体，也可以是不定形，而直径优选为0.1～10mm。
本发明的多孔复合体是通过填补于骨缺损部而使用，而在骨缺损部观察到足够的血液或体液的情况下，可以直接填补多孔复合体，或者切割为适当的形状而填补。在骨缺损部没有观测到足够的血液等、或者无法以原来的形状填补多孔复合体的情况下，可以将多孔复合体浸渍于血液或生理盐水等中，在确认多孔复合体显示出海绵状的弹力性后填补于骨缺损部。
[多孔复合体的制造方法]
本发明的多孔复合体的制造方法优选将OCP与胶原蛋白混合的制造方法，可以使用如下所述的制造方法。利用公知的共沉淀法等使OCP向胶原蛋白析出而复合化的方法因挠曲强度变得过高，有可能难以进行容易的加工。
(a)混合OCP而复合化的方法
首先，向将浓度调整为0.1～5重量％、将pH调整为6.0～9.0、并凝胶化了的胶原蛋白溶液中添加OCP，混炼后制作OCP与胶原蛋白的混合物。然后，将该混合物加入适当的模具中成型，进行冷冻，通过冷冻干燥而得到复合体。对所得的该复合体根据需要实施热脱水交联处理，再利用惯用的灭菌法(例如γ射线照射、电子束照射、环氧乙烷气体等)进行灭菌。
(b)混合OCP悬浮液而复合化的方法
将适当浓度的胶原蛋白酸性溶液用适当的缓冲液(例如磷酸缓冲液、Tris缓冲液、乙酸钠缓冲液等)无菌地调整为pH5.5～7.5，在胶原蛋白发生凝胶化前添加OCP，制备胶原蛋白与OCP的悬浮液。其后，在将pH保持为中性到弱碱性的状态下浇入模具中，赋予形状后，在适当的温度(例如37℃)使之凝胶化，反复进行水清洗而除去缓冲液的盐等后制成复合载体，与上述相同地进行冷冻干燥及灭菌处理。
本发明的多孔复合体的制造方法优选包括如下的工序，即，以使离子强度为0.005～0.06、pH为6.0～9.0的方式制备包含胶原蛋白的液体，制备包含胶原蛋白的凝胶、溶胶或液体。离子强度更优选为0.005～0.05。pH更优选为6.5～8.0。在所述(a)的方法中，在添加OCP前进行本工序，在所述(b)的方法中，在添加OCP并制作出OCP/胶原蛋白悬浮液后进行本工序。离子强度及pH可以通过向在蒸馏水中溶解有胶原蛋白的液体中添加惯用的缓冲液或盐类来调整。例如，作为缓冲液，可以举出乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液、作为Good's buffer的MES缓冲液、HEPES缓冲液等。作为盐类，可以举出氯化钠(NaCl)、氯化钾、氢氧化钠、稀盐酸等。
本发明中，离子强度(μ)是利用式3算出。
μ＝1/2∑(cizi 2) (式3)
μ：离子强度
ci：离子的摩尔浓度
zi：离子的电荷
例如，后述的实施例1中存在的电解质仅为胶原蛋白中所含的NaCl及因pH调整而产生的NaCl的合计0.01M的NaCl，因此离子强度为1/2×(0.01×12+0.01×12)＝0.01。
通常而言，已知在生理的条件下(离子强度约为0.2左右、pH为7.0付近)胶原蛋白会有效地自组织化(纤维化)。本发明人发现，在确定本多孔复合体的压缩强度及挠曲强度的特性方面，将包含胶原蛋白的液体的离子强度及pH调整为本发明的给定的范围内是重要的要素。本发明中，可以认为，通过在低于生理的离子强度的条件下进行纤维化，可以恰当地控制胶原蛋白纤维直径、纤维长度、胶原蛋白分子间的相互作用，获得优选的挠曲强度。
本发明的多孔复合体的制造方法优选包括将包含OCP和胶原蛋白的凝胶、溶胶或液体浸渍于液体制冷剂中急速冷冻后、进行冷冻干燥的工序。液体制冷剂是温度低于包含磷酸八钙和胶原蛋白的凝胶、溶胶或液体的冻结温度的液体，例如可以举出甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、液氮。该液体制冷剂的温度优选为－20℃以下，更优选为－40℃以下，进一步优选为－80℃以下。
可以认为，通过将包含磷酸八钙和胶原蛋白的凝胶、溶胶或液体利用液体制冷剂浸渍急速地冷冻，可以减小所得的多孔复合体的气孔直径。
本发明的多孔复合体优选被实施了热处理或热脱水交联处理。由于热处理，OCP分子结构的一部分崩塌而容易发生骨形成系细胞的侵入，骨再生得到促进，并且胶原蛋白交联而使形状保持力提高。
热处理的温度优选为50～200℃，更优选为60～180℃。另外，热处理优选在减压条件下进行。压力优选为0～3000Pa，更优选为0～300Pa。热处理的处理时间优选为2小时～10天，更优选为12小时～5天。
利用上述方法制造的多孔复合体作为其他的效果，在可以控制生物分解性的速度这一点上也优异。本发明人等发现，利用多孔复合体制造时的胶原蛋白悬浮液的离子强度，可以控制生物分解性。由于骨再生需要数周到数月的时间，因此优选多孔复合体长时间地存在于骨缺损部，作为骨再生的支架停留。根据本制造方法，可以提供难以受到生物分解性的多孔复合体。分解性的程度可以利用可溶性蛋白比例进行评价，具体而言，将多孔复合体浸渍于0.2mg/ml胶原蛋白酶溶液中，在37℃、静置72小时后，对存在于溶液中的可溶化了的胶原蛋白的蛋白质进行BCA(Bicinchoninic Acid)蛋白定量分析而测定蛋白量。将该可溶化了的蛋白量除以原来的多孔复合体的胶原蛋白重量，就可以求出可溶性蛋白比例(％)。本发明的多孔复合体的优选的可溶性蛋白比例为1.5％～4.0％。
[骨再生材料]
本发明还涉及包含上述的多孔复合体的骨再生材料。骨再生材料可以用于牙科口腔外科领域、整形外科领域中的骨缺损修复、开颅、开胸手术后的骨缺损修复等。例如，在牙科口腔外科领域中，对于因牙周病、囊腔、萎缩牙槽嵴、腭裂部、拔牙窝等而产生的骨缺损，通过填补包含多孔复合体的骨再生材料，可以在数周到数月确认到出色的骨再生效果。在整形外科领域中，例如对于骨肿瘤切除后的骨缺损、因骨折等外伤而产生的骨缺损，可以将本骨再生材料填补于骨缺损部，促进骨再生。
骨再生材料可以除了OCP及胶原蛋白以外，例如还含有具有骨形成能力的细胞因子(bone morphogenetic protein-2、transforming growth factorβ1等)，通过含有该细胞因子，可以加快骨再生速度。
除此以外，骨再生材料可以还含有该领域中惯用的配合成分。作为该配合成分，例如可以举出生物体吸收性高分子(聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸－聚乙二醇共聚物等)、OCP以外的生物体吸收性磷酸钙(β－TCP等)。
[实施例]
以下，举出实施例而对本发明更详细地说明，然而本发明并不限定于它们。
(实施例1)
(1)OCP的制备
首先，如下所示地制备出OCP制备用的1液及2液。
[1液]将磷酸二氢钠二水合物31.2g溶解于蒸馏水2500g中，制备出1液。
[2液]将乙酸钙一水合物35.2g溶解于蒸馏水2500g中，制备出2液。
然后，将1液加入可分离烧瓶中，在覆套式电阻加热器中升温到70℃。然后，在搅拌机(东京理化器械公司制、MAZELA Z)中安装搅拌叶片(叶片直径12cm)，在以250rpm的速度搅拌的同时，以大约28mL/min的速度向1液中滴加2液。滴加结束后，将1液与2液的混合液在70℃以250rpm再搅拌2小时。
然后，将上述混合液中生成的沉淀物用膜滤器(孔径3μm、ADVANTEC东洋公司制、A300A293C)过滤、回收。使回收的沉淀物分散于1500mL蒸馏水中，搅拌15分钟而进行了清洗。再重复进行3次同样的过滤、清洗的工序。
然后，将清洗后的沉淀物用恒温干燥机在30℃干燥24小时。将干燥后的沉淀物用电动磨机粉碎后，用筛子将粒径分级为300～500μm，得到粉体。最后，对所得的粉体在120℃进行2小时的干热灭菌。
(2)OCP/胶原蛋白复合体(多孔复合体)的制备
将包含I型及III型胶原蛋白的来自于猪真皮的胶原蛋白(日本HAM公司制、NMP胶原蛋白PS)1重量份溶解于冷却到4℃的蒸馏水200重量份中，得到约0.5重量％的胶原蛋白溶液。在将液温保持为4℃的同时，向胶原蛋白水溶液中加入氢氧化钠水溶液，将pH调整为约7.4，得到胶原蛋白悬浮液。此时，胶原蛋白悬浮液的离子强度约为0.01。然后，以使OCP与胶原蛋白以重量比为77：23的方式向胶原蛋白悬浮液中加入OCP(粒径300～500μm)后，在室温进一步搅拌，得到OCP/胶原蛋白悬浮液。
然后，将所得的OCP/胶原蛋白悬浮液加入离心瓶中，使用离心分离机(TOMY精工公司制、GRX－250)以7000×g的离心力进行20分钟离心。然后，以使OCP/胶原蛋白悬浮液中的胶原蛋白为3重量％的方式废弃上清液，得到OCP/胶原蛋白复合凝胶。将其加入具有圆柱状的内部空间的塑料容器(内径8.5mm、容积约3.0cm3)或具有长方体状的内部空间的塑料容器(10mm×10mm×50mm)，以230×g的离心力进行1分钟离心而脱泡。
将容器密闭，浸渍于相对于被冷冻体的容积而言大幅度过量的冷却到－80℃的甲醇中而急速地冷冻。打开容器后，利用冷冻干燥机使冷冻体干燥(－10℃、48小时)而成形。然后，将其在减压下、在150℃加热24小时而进行了热脱水交联。将圆柱体用手术刀切割为厚15mm，将长方体切割为4mm×10mm×30mm。最后，照射电子束(15kGy)，进行了灭菌。如此所述地操作，得到实施例1的多孔复合体(OCP/胶原蛋白复合体)。
(实施例2)
实施例2中，在制备多孔复合体时，使用了减少了NaCl含量的包含I型及III型胶原蛋白的来自于猪真皮的胶原蛋白(减盐胶原蛋白)。除此以外利用与实施例1相同的方法得到多孔复合体(OCP/胶原蛋白复合体)。需要说明的是，减盐胶原蛋白利用下述的方法制备。
减盐胶原蛋白的制备
将包含I型及III型胶原蛋白的来自于猪真皮的胶原蛋白(日本HAM公司制、NMP胶原蛋白PS)1重量份溶解于冷却到4℃的蒸馏水200重量份中，得到约0.5重量％的胶原蛋白溶液。来自于猪真皮的胶原蛋白中所含的NaCl为4重量％。在将液温保持为4℃的同时向胶原蛋白水溶液中加入氢氧化钠水溶液，将pH调整为约8.0，得到胶原蛋白悬浮液。然后，将胶原蛋白悬浮液加入离心瓶，使用离心分离机(TOMY精工公司制、GRX－250)，以7000×g的离心力进行20分钟离心。将完全废弃上清液而得的胶原蛋白凝胶用－35℃的冷冻库冷冻。利用冷冻干燥机干燥冷冻体，得到减盐胶原蛋白。当对减盐胶原蛋白中所含的NaCl用原子吸光光度法(灰化)进行测定时，为1重量％。
(实施例3)
实施例3中，将实施例1的胶原蛋白悬浮液加入磷酸缓冲生理盐水(PBS)而将离子强度调整为0.05。除此以外利用与实施例1相同的方法得到多孔复合体(OCP/胶原蛋白复合体)。
(比较例1)
将包含I型及III型胶原蛋白的来自于猪真皮的胶原蛋白(日本HAM公司制、NMP胶原蛋白PS)1重量份溶解于冷却到4℃的蒸馏水200重量份中，得到约0.5重量％的胶原蛋白溶液。在将液温保持为4℃的同时向胶原蛋白水溶液中加入氢氧化钠水溶液，将pH调整为约7.4，得到胶原蛋白悬浮液。向其中加入磷酸缓冲生理盐水(PBS)而将离子强度调整为0.1。然后，向胶原蛋白悬浮液中以使OCP与胶原蛋白以重量比计为77：23的方式加入实施例1中制作的OCP(粒径300～500μm)后，在室温进一步搅拌，得到OCP/胶原蛋白悬浮液。
然后，将所得的OCP/胶原蛋白悬浮液加入离心瓶，使用离心分离机(TOMY精工公司制、GRX－250)，以7000×g的离心力进行20分钟离心。然后，以使OCP/胶原蛋白悬浮液中的胶原蛋白为3重量％的方式废弃上清液，得到OCP/胶原蛋白复合凝胶。将其加入具有圆柱状的内部空间的塑料容器(内径8.5mm、容积约3.0cm3)或具有长方体状的内部空间的塑料容器(10mm×10mm×50mm)，以230×g的离心力进行1分钟离心而脱泡。
将容器密闭，浸渍于相对于被冷冻体的容积而言大幅度过量的冷却到－80℃的甲醇中而急速地冷冻。打开容器后，利用冷冻干燥机使冷冻体干燥(－10℃、48小时)而成形。然后，将其在减压下、在150℃加热24小时而进行了热脱水交联。将圆柱体用手术刀切割为厚15mm，将长方体切割为4mm×10mm×30mm。最后，照射电子束(15kGy)，进行了灭菌。如此所述地操作，得到比较例1的多孔复合体(OCP/胶原蛋白复合体)。
(比较例2)
比较例2中，将比较例1的胶原蛋白悬浮液加入磷酸缓冲生理盐水(PBS)而将离子强度调整为0.15。除此以外利用与比较例1相同的方法得到多孔复合体(OCP/胶原蛋白复合体)。
(比较例3)
比较例3中，在将液温保持为4℃的同时向约0.5重量％胶原蛋白水溶液中加入氢氧化钠水溶液，得到pH约为7.4、离子强度为0.01的胶原蛋白悬浮液。继而，对于加入了OCP/胶原蛋白复合凝胶的容器，不是浸渍于冷却到－80℃的甲醇中而急速地冷冻，而是放入－80℃的冷冻库中冷冻。除此以外利用与比较例1相同的方法得到多孔复合体(OCP/胶原蛋白复合体)。
(比较例4)
羟磷灰石/胶原蛋白复合体的制备
将包含I型及III型胶原蛋白的来自于猪真皮的胶原蛋白(日本HAM公司制、NMP胶原蛋白PS)溶解于冷却到4℃的蒸馏水中，得到约0.8重量％的胶原蛋白溶液。向该胶原蛋白溶液中，加入等量的磷酸氢二钠与氯化钠的混合液(30mM Na2HPO4、70mM NaCl)，搅拌，得到胶原蛋白悬浮液。此时，胶原蛋白悬浮液的离子强度约为0.07。
将胶原蛋白悬浮液均化后，加入离心瓶，使用离心分离机(TOMY精工公司制、GRX－250)，以20000×g的离心力进行20分钟离心。然后，以使胶原蛋白悬浮液中的胶原蛋白为5重量％的方式废弃上清液，得到5重量％胶原蛋白凝胶。
向5重量％胶原蛋白凝胶中，以使HA与胶原蛋白以重量比计为60：40的方式加入羟磷灰石(HA)(和光纯药工业公司制、Apatite HAP，monoclinic)后，用药勺混合。将其加入具有圆柱状的内部空间的塑料容器(内径8.5mm、容积约3.0cm3)或具有长方体状的内部空间的塑料容器(10mm×10mm×50mm)，以230×g的离心力进行1分钟离心而脱泡。
将容器密闭，放入－20℃的冷冻库而冷冻。打开容器后，利用冷冻干燥机使冷冻体干燥(－10℃、48小时)而成形。然后，将其在减压下、在150℃加热24小时而进行了热脱水交联。将圆柱体用手术刀切割为厚15mm，将长方体切割为4mm×10mm×30mm。最后，照射电子束(15kGy)，进行了灭菌。如此所述地操作，得到比较例4的HA/胶原蛋白复合体。
(比较例5)
比较例5中，利用离心浓缩得到5重量％胶原蛋白凝胶后，将其再次均化，同样地以20000×g的离心力进行20分钟离心。最后，以使胶原蛋白悬浮液中的胶原蛋白为10重量％的方式废弃上清液，得到10重量％胶原蛋白凝胶。向10重量％胶原蛋白凝胶中，以使HA与胶原蛋白以重量比计为20：80的方式加入羟磷灰石(HA)(和光纯药工业公司制、Apatite HAP，monoclinic)后，用药勺混合。除此以外的部分与比较例4相同，得到比较例5的HA/胶原蛋白复合体。
对于实施例1～3及比较例1～5，在各实施例及比较例中制成3个样品。对各样品进行挠曲强度及压缩强度的测定，分别求出它们的平均值。需要说明的是，实施例中的挠曲强度及压缩强度的测定具体而言是利用下述的方法进行。
(挠曲强度测定)
在温度：25℃、湿度：65％的环境下，将图1所示的厚度(h)：4mm、宽度(b)：10mm、长度：30mm的长方体状试样在磷酸缓冲生理盐水(10mM磷酸钠、0.14M氯化钠、pH7.4)中浸渍30分钟。其后，轻轻地擦掉样品表面的水气，使用精密万能试验机(Autograph AGS－J、株式会社岛津制作所制、测力传感器容量：1kN)，如图2所示地加载载荷。根据所得的应力－应变曲线求出挠曲强度。
具体而言，参照图2，将样品1安放于支承台21(支承台的半径R1＝5mm)后，将安装有半径R2＝5mm的压头的十字头22以10mm/min的速度下降至样品发生了断裂。需要说明的是，本试验中，所谓“样品发生了断裂”，是指如图3所示在应力－应变曲线中载荷急剧地降低的点。
本发明的所谓挠曲强度(σ)，是由样品的断裂时载荷、样品的尺寸及支点间距离以式4表示。
σ＝3FL/2bh2 (式4)
σ：挠曲强度(Pa)
F：断裂时载荷(N)
L：支点间距离(mm)
b：样品的宽度(mm)
h：样品的厚度(mm)
需要说明的是，本试验中的支点间距离为20mm。
(压缩强度测定)
在温度：25℃、湿度：65％的环境下，将直径8.5mm、长度15mm的圆柱状试样在磷酸缓冲生理盐水(10mM磷酸钠、0.14M氯化钠、pH7.4)中浸渍30分钟。其后，轻轻地擦掉试样表面的水气，使用精密万能试验机(Autograph AGS－J、株式会社岛津制作所制、测力传感器容量：1kN)，如图4所示地加载单轴载荷。此后，将使载荷阶段性变化时样品崩塌的最小载荷设为崩塌时载荷。
具体而言，参照图4，在将样品2安放于试样台41后，将安装有平型压缩夹具的十字头42以10mm/min的速度下降，在测力传感器显示出2.5N时停止十字头42而解除载荷。观察试样台的样品，如果没有崩塌，则将该样品重新安放于试样台，同样地下降十字头，直至测力传感器显示出5N。使载荷每次2.5N地增加，反复进行该操作，将初次观察到样品的崩塌时的载荷设为崩塌时载荷。需要说明的是，本试验中，所谓“观察到样品的崩塌”，是指用肉眼观察试样时确认产生了明确的龟裂或剥落。
本发明的压缩强度是由上述崩塌时载荷和样品的截面积(垂直于圆柱的厚度方向的截面的截面积)以式5表示。
Cs＝F/S (式5)
Cs：压缩强度(Pa)
F：崩塌时载荷(N)
S：样品的截面积(m2)
需要说明的是，样品的截面积大约为(0.00425)2×3.14＝5.67×10－5m2。
将针对上述实施例及比较例的挠曲强度及压缩强度的测定结果表示于表1中。
[表1]
[表1]
根据表1所示的结果，实施例1～3的样品(多孔复合体)的挠曲强度为0.05～0.16MPa并且压缩强度为0.3MPa以上，与以往的多孔复合体相比，加工性及操作性优异。
比较例1及2的样品虽然压缩强度为0.3MPa以上且操作性足够，然而由于胶原蛋白纤维化时的离子强度高，因此挠曲强度高于0.16MPa，难以容易地加工。
比较例3的样品虽然挠曲强度为适度的值，能够实现容易的加工，然而由于在OCP与胶原蛋白的复合凝胶冷冻时，使用了借助冷冻机的缓慢的气相冷却，因此压缩强度小于0.3MPa，导致操作性差的结果。
比较例4及5的样品由于胶原蛋白纤维化时的离子强度高，因此挠曲强度高于0.16MPa，另外，由于在HA与胶原蛋白的复合凝胶冷冻时，使用了借助冷冻机的缓慢的气相冷却，因此压缩强度小于0.3MPa，在加工性及操作性方面差。
(分解性测定)
对于实施例1、实施例3、比较例1、比较例2的各样品，将圆柱体切割为厚约10mm，将所得的样品浸渍于胶原蛋白酶溶液中，测定胶原蛋白的可溶性蛋白的比例，测定出多孔复合体的生物分解性。
具体而言，对实施例1、实施例3、比较例1、比较例2中制作的各样品，将圆柱体切割为厚约10mm，将所得的样品浸渍于0.2mg/mL胶原蛋白酶I型溶液(和光纯药工业公司制、180Unit/mg)中，在37℃静置72小时。作为对照，将没有浸渍样品的仅由胶原蛋白酶溶液构成的材料在37℃静置72小时。其后，为了测定溶液中所含的可溶化了的蛋白量，使用BCA蛋白定量分析试剂盒(Thermo SCIENTIFIC公司制、Pierce BCA Protein Assay Kit)，利用微板检测仪(BIO－RAD公司制、iMark)测定570nm的吸光度，对上清液蛋白量(μg)进行定量。需要说明的是，标准物质使用了牛血清白蛋白。将定量了的上清液蛋白量除以样品中所含的胶原蛋白重量(mg)，求出可溶性蛋白比例(％)。需要说明的是，胶原蛋白重量是在约10mm的圆柱体重量上乘以0.23而求出。将结果表示于表2中。
[表2]
[表2]
根据表2所示的结果，在胶原蛋白悬浮液的离子强度与可溶性蛋白比例中存在有正的相关性，显示出存在有离子强度越高则越容易受到胶原蛋白酶的分解的趋势。通过抑制多孔复合体的分解性，可以在骨缺损部作为用于骨再生的支架长久地停留，可以期待进一步促进骨再生的效果。
应当认为，此次公开的实施方式及实施例在所有的方面都是示例性的，而非限制性的。本发明的范围不是由上述的说明给出，而是由技术方案的范围给出，意图包含与技术方案的范围等效的意味及范围内的所有变更。
产业上的可利用性
本发明的多孔复合体及包含该多孔复合体的骨再生材料兼顾加工容易性和机械强度而具有优异的操作性，并且具有高的骨再生能力，因此主要用于牙科口腔外科领域、整形外科领域中的骨缺损修复。
符号的说明
1 弯曲试验用样品
2 压缩试验用样品
21 支承台
22 压头
41 试样台
42 十字头

Claims (8)

1.一种多孔复合体，其包含磷酸八钙和胶原蛋白，挠曲强度为0.05～0.16MPa，压缩强度为0.3MPa以上。
2.根据权利要求1所述的多孔复合体，其中，气孔直径为3～90μm。
3.根据权利要求1或2所述的多孔复合体，其中，胶原蛋白为I型或I型与III型的混合物。
4.一种骨再生材料，其包含权利要求1～3中任一项所述的多孔复合体。
5.一种多孔复合体的制造方法，其特征在于，是包含磷酸八钙和胶原蛋白的多孔复合体的制造方法，该制造方法包括：
(1)以使离子强度为0.005～0.06、pH为6.0～9.0的方式制备包含胶原蛋白的液体，制备包含胶原蛋白的凝胶、溶胶或液体的工序；以及
(2)得到混合了所述包含胶原蛋白的凝胶、溶胶或液体与磷酸八钙的悬浮液的工序。
6.根据权利要求5所述的多孔复合体的制造方法，其中，还包括(3)将所述悬浮液浸渍于液体制冷剂中急速冷冻后进行冷冻干燥的工序。
7.一种多孔复合体的制造方法，其特征在于，是包含磷酸八钙和胶原蛋白的多孔复合体的制造方法，该制造方法包括：
(1)得到混合了包含胶原蛋白的液体与磷酸八钙的悬浮液的工序；以及
(2)将所述悬浮液调整为离子强度为0.005～0.06、pH为6.0～9.0的工序。
8.根据权利要求7所述的多孔复合体的制造方法，其中，还包括(3)将所述悬浮液浸渍于液体制冷剂中急速冷冻后进行冷冻干燥的工序。
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