WO2016163396A1 - 多孔質複合体、骨再生材料、および多孔質複合体の製造方法 - Google Patents

多孔質複合体、骨再生材料、および多孔質複合体の製造方法 Download PDF

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porous composite
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suspension
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敦史 岩井
文彦 梶井
田中　秀典
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東洋紡株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a porous composite, a bone regeneration material, and a method for producing a porous composite.
  • Conventionally used bone regeneration materials include calcium phosphates such as hydroxyapatite (HA) (see, for example, Patent Document 2, Patent Document 3, Patent Document 4, and Patent Document 5).
  • HA hydroxyapatite
  • OCP octacalcium phosphate
  • HA HA
  • ⁇ -TCP ⁇ -tricalcium phosphate
  • Bone regeneration material is generally applied to irregular bone defects.
  • the bone regeneration material used for such a purpose is clinically required to have good operability, not to mention the ability to promote bone regeneration.
  • it has an appropriate bending strength and can be easily processed according to the shape of the bone defect with tweezers, etc.
  • (2) has an appropriate compressive strength and does not cause breakage during handling. It has been demanded.
  • Patent Document 4 discloses a porous body including an apatite / collagen composite fiber that has an optimal balance between mechanical strength and biocompatibility and is suitable for artificial bone materials, cell scaffolds, and the like.
  • Such an apatite / collagen composite fiber is advantageous in terms of initial mechanical strength because fine apatite particles are deposited on collagen, but on the other hand, it can be easily used with tweezers because of its strength. There is a problem that it is difficult to process.
  • Patent Document 1 discloses a hard tissue substituting carrier material composed of eighth calcium phosphate and collagen and having excellent shape imparting properties. Such a hard tissue substituting carrier material is excellent in flexibility, but has a problem that since its pore diameter is large, the compressive strength is low and breakage or the like is likely to occur during handling.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and has a porous composite containing OCP and collagen, which has improved bending strength and compressive strength as compared with the prior art, and has excellent operability, and bone regeneration including the same It is an object to provide a material and a method for producing a porous composite.
  • the present inventors diligently studied, and by using a liquid containing collagen having a predetermined ionic strength, it has a bending strength and a compressive strength within a predetermined range, and as a result, easy processing. And a porous composite with both mechanical strength.
  • the present inventors have made further studies and improvements, and provide the inventions represented below.
  • a porous composite containing eighth calcium phosphate and collagen having a flexural strength of 0.05 to 0.16 MPa and a compressive strength of 0.3 MPa or more.
  • a bone regeneration material comprising the porous composite according to any one of [1] to [3].
  • a method for producing a porous composite containing eighth calcium phosphate and collagen (1) a step of preparing a collagen-containing liquid, a gel, a sol or a liquid containing a collagen, wherein the liquid has an ionic strength of 0.005-0.06 and a pH of 6.0-9.0; And (2) obtaining a suspension obtained by mixing a gel, sol, or liquid containing collagen and eighth calcium phosphate,
  • a method for producing a porous composite comprising:
  • a method for producing a porous composite containing eighth calcium phosphate and collagen (1) a step of obtaining a suspension in which a liquid containing collagen and eighth calcium phosphate are mixed; and (2) the suspension has an ionic strength of 0.005 to 0.06 and a pH of 6.0 to 9. Adjusting to zero,
  • a method for producing a porous composite comprising:
  • the porous composite_body complex containing OCP and collagen excellent in the property of bending strength and compressive strength which is excellent in workability and is hard to break, and a bone regeneration material including the same are provided.
  • the present porous composite is less susceptible to degradation by proteolytic enzymes, can remain longer in the portion that requires bone regeneration, and is expected to promote bone regeneration.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram for demonstrating the sample dimension for a bending test. It is a schematic diagram for demonstrating the measuring method of bending strength. 3 is a graph showing a stress-strain curve in a bending strength test for Example 1. FIG. It is a schematic diagram for demonstrating the measuring method of compressive strength.
  • the porous composite of the present invention is a porous composite (OCP / collagen composite) containing OCP and collagen.
  • a preferred embodiment of the porous composite of the present invention is a porous composite in which collagen forms a three-dimensional sponge-like structure and OCP is present as granules of at least 100 ⁇ m or more in the sponge-like structure.
  • the bone regeneration material comprising the porous composite of the present invention realizes the formation of internal bone in which osteoblasts invade into the porous body and promote the formation of new bone by the porous body structure.
  • OCP (Ca 8 H 2 (PO 4) 6 ⁇ 5H 2 O) may be prepared by a variety known methods, for example, dropping method of LeGeros (LeGeros RZ, Calcif Tissue Int 37: 194-197,1985) And a method using a synthesizer (a three-flow tube) disclosed in Patent Document 6. Further, it can be prepared by a mixing method. Specifically, for example, an OCP can be obtained by mixing a sodium dihydrogen phosphate aqueous solution and a calcium acetate aqueous solution under appropriate conditions, and collecting the generated precipitate. Obtainable. The OCP obtained from the precipitate is preferably dried, pulverized using an electric mill or the like, and used as a particulate powder. The particle size is preferably in the range of 10 to 1000 ⁇ m, more preferably 300 to 500 ⁇ m. The particle size can be classified according to the size of the sieve opening by a sieving method.
  • the origin and properties of collagen are not particularly limited, and various collagens can be used.
  • an enzyme-solubilized collagen obtained by solubilization with a proteolytic enzyme (for example, pepsin, pronase, etc.) from which telopeptide is removed is used.
  • type of collagen type I, type II, type III and type IV collagen which are fibrous collagens are preferable, and type I collagen contained in a large amount in the living body or a mixture of type I and type III collagen is particularly preferable.
  • Collagen derived from skins, bones, tendons, etc. of pigs and cows can be preferably used. Since collagen is a biological component, it has the feature of high safety. In particular, enzyme-solubilized collagen is preferable because it has low allergenicity.
  • a commercial product may be used as the collagen.
  • the mixing ratio of OCP and collagen can be adjusted as appropriate according to the desired shape imparting property, operability, biocompatibility, and the like.
  • the blending ratio of OCP to 1 part by weight of collagen is preferably 0.5 to 35 parts by weight, more preferably 1 to 20 parts by weight, still more preferably 2 to 10 parts by weight. If the OCP is less than 0.5 with respect to the collagen 1, the resulting bone composite may have poor bone regeneration function, and if it exceeds 35 parts by weight, the shape impartability may be lowered.
  • the bending strength of the porous composite of the present invention is preferably 0.05 to 0.16 MPa. More preferably, it is 0.08 to 0.16 MPa.
  • the bending strength exceeds 0.16 MPa, easy processing with tweezers or the like tends to be difficult. That is, when a doctor fills a bone defect with a porous composite, it is necessary to adjust the porous composite to an appropriate size according to the size of the defect. If there is, it can be easily cut by applying an appropriate stress with tweezers or the like.
  • the bending strength is less than 0.05 MPa, it tends to break easily and tends to cause damage after surgery.
  • the bending strength in the present invention is measured by the following method.
  • a three-point bending test is performed as shown in FIG.
  • the crosshead of the tensile / compression tester is lowered at a speed of 10 mm / min until the sample breaks.
  • “the sample broke” means a point where the load rapidly decreases in the stress-strain curve as shown in FIG.
  • the bending strength ( ⁇ ) in the present invention is expressed by Equation 1 from the load at break of the sample, the size of the sample, and the distance between fulcrums.
  • ⁇ 3FL / 2bh 2 (Formula 1)
  • ⁇ Bending strength (Pa)
  • F Load at break (N)
  • L Distance between fulcrums (mm)
  • b Width of sample (mm)
  • h sample thickness (mm)
  • the compressive strength of the porous composite of the present invention is preferably 0.3 MPa or more, more preferably 0.3 to 3.0 MPa, still more preferably 0.3 to 1.0 MPa.
  • the compressive strength is less than 0.3 MPa, the operability of the porous composite tends to decrease. That is, when the bone composite part is filled with the porous composite of the present invention, if the composite is collapsed or the pores are crushed, the subsequent bone regeneration is adversely affected.
  • a doctor performs a procedure of filling a porous composite without gaps using a jig to a bone defect portion having various shapes, the composite does not collapse or collapses pores.
  • the index shown is a compressive strength of 0.3 MPa or more.
  • the upper limit is not particularly defined, but is preferably 3.0 MPa or less from the viewpoint of ease of operation when filling the bone defect.
  • the compressive strength in the present invention is measured by the following method.
  • Compressive strength measurement A cylindrical sample (sample) having a diameter of 8.5 mm and a length of 15 mm in an environment of temperature: 25 ° C. and humidity: 65% was subjected to phosphate buffered saline (10 mM sodium phosphate, 0.14 M sodium chloride, pH 7.4). ) For 30 minutes. Thereafter, water on the sample surface is wiped lightly, and a uniaxial load is applied in the vertical direction of the cylinder using a tensile / compression tester (load cell capacity: 1 kN). And the minimum load which a sample collapses when changing a load in steps is made into the load at the time of collapse. “A sample collapse was observed” means that it was confirmed that a clear crack or peeling occurred when the sample was observed with the naked eye.
  • the crosshead 42 equipped with the flat compression jig was lowered at a speed of 10 mm / min, and the load cell showed 2.5N.
  • the crosshead 42 is stopped and the load is released. Observe the sample on the sample stage, and if it has not collapsed, return the sample to the sample stage and set it again, and similarly lower the crosshead until the load cell shows 5N. This operation is repeated by increasing the load by 2.5N, and the load when the sample collapse is recognized for the first time is defined as the collapse load.
  • the compressive strength in the present invention is expressed by Formula 2 from the collapse load and the cross-sectional area of the sample (cross-sectional area in a cross section perpendicular to the thickness direction of the cylinder).
  • Cs F / S (Formula 2)
  • the porous composite of the present invention preferably has a pore size of 3 to 90 ⁇ m.
  • the pore diameter exceeds 90 ⁇ m, the compressive strength of the porous composite tends to decrease.
  • the pore diameter is less than 3 ⁇ m, invasion of bone metabolic cells such as osteoblasts is difficult to occur, and the bone regeneration promoting action may be reduced.
  • a more preferable pore size of the porous composite of the present invention is 5 to 40 ⁇ m.
  • the pore diameter is measured by using a pore distribution measurement with a mercury porosimeter, and is specifically measured by the following method. (Pore diameter measurement) As a pretreatment, the sample is dried at 120 ° C. for 4 hours. With respect to each sample after the pretreatment, a pore distribution with a pore diameter of 0.0018 to 200 ⁇ m is obtained under the following conditions by mercury porosimetry using the following measuring apparatus.
  • the pore diameter in the invention is a value of a pore diameter showing a maximum value of a peak having the largest area in a pore distribution curve obtained from a measurement pressure by a mercury intrusion method.
  • the porosity (porosity) of the porous composite is preferably 80 to 99%, more preferably 85 to 98%.
  • the shape of the porous composite of the present invention is preferably a rectangular parallelepiped (block body), a cylindrical body or a tablet, or a granule.
  • the size of the rectangular parallelepiped is preferably 5 mm ⁇ 5 mm ⁇ 5 mm or more, and generally the upper limit is preferably within a range of 100 mm ⁇ 100 mm ⁇ 100 mm.
  • a rectangular parallelepiped is not limited to a cube.
  • the diameter is preferably 5 to 50 mm, and the height is preferably in the range of 1 to 50 mm.
  • the shape is not limited to a sphere and may be an indeterminate shape, but the diameter is preferably 0.1 to 10 mm.
  • the porous composite of the present invention is used by filling a bone defect part.
  • the porous composite is cut as it is or in an appropriate shape. Can be compensated. If sufficient blood or the like is not found in the bone defect part or the porous complex cannot be compensated for in its original shape, the porous complex is immersed in blood or physiological saline so that the porous complex is sponge-like. It is possible to make up for the bone defect after confirming that the elasticity is high.
  • the manufacturing method of the porous composite of the present invention is preferably a manufacturing method in which OCP and collagen are mixed, and the following manufacturing method can be used.
  • the method of depositing OCP on collagen by a known coprecipitation method or the like the bending strength becomes excessively high and easy processing may be difficult.
  • (A) Method of mixing and mixing OCP First, the concentration is adjusted to 0.1 to 5% by weight and the pH is adjusted to 6.0 to 9.0, and OCP is added to the gelled collagen solution and kneaded. To make a mixture of OCP and collagen. Then, the mixture is added to an appropriate mold, molded, frozen, and lyophilized to obtain a composite. The obtained complex is subjected to thermal dehydration crosslinking treatment as necessary, and further sterilized by a conventional sterilization method (for example, ⁇ -ray irradiation, electron beam irradiation, ethylene oxide gas, etc.).
  • a conventional sterilization method for example, ⁇ -ray irradiation, electron beam irradiation, ethylene oxide gas, etc.
  • a collagen-containing liquid is prepared by preparing a liquid containing collagen so that the ionic strength is 0.005 to 0.06 and the pH is 6.0 to 9.0. It is preferable to include a step of preparing a sol or liquid.
  • the ionic strength is more preferably 0.005 to 0.05. More preferably, the pH is 6.5 to 8.0.
  • this step is performed before adding OCP, and in the method (b), this step is performed after adding OCP to prepare an OCP / collagen suspension.
  • the ionic strength and pH can be adjusted by adding a conventional buffer or salt to a liquid in which collagen is dissolved in distilled water.
  • examples of the buffer include an acetate buffer, a phosphate buffer, a Tris buffer, a MES buffer that is a good buffer, and a HEPES buffer.
  • examples of the salts include sodium chloride (NaCl), potassium chloride, sodium hydroxide, dilute hydrochloric acid and the like.
  • collagen is known to self-organize (fibrosis) efficiently under physiological conditions (ionic strength is about 0.2, pH around 7.0).
  • ionic strength is about 0.2, pH around 7.0.
  • adjusting the ionic strength and pH of a liquid containing collagen within the predetermined range of the present invention is an important factor in determining the compressive strength and bending strength characteristics of the present porous composite. I found out.
  • the method for producing a porous composite of the present invention includes a step of immersing a gel, sol or liquid containing OCP and collagen in a liquid refrigerant, rapidly freezing, and then freeze-drying.
  • the liquid refrigerant is a liquid having a temperature lower than the freezing temperature of a gel, sol, or liquid containing eighth calcium phosphate and collagen, and examples thereof include methanol, ethanol, acetone, acetonitrile, and liquid nitrogen.
  • the temperature of the liquid refrigerant is preferably ⁇ 20 ° C. or lower, more preferably ⁇ 40 ° C. or lower, and further preferably ⁇ 80 ° C. or lower.
  • the pore diameter of the resulting porous composite can be reduced by rapidly freezing the gel, sol or liquid containing the eighth calcium phosphate and collagen by immersion in a liquid refrigerant.
  • the porous composite of the present invention is preferably subjected to heat treatment or thermal dehydration crosslinking treatment.
  • heat treatment a part of the OCP molecular structure is broken, and the invasion of bone-forming cells is likely to occur. Bone regeneration is promoted and collagen is cross-linked to improve shape retention.
  • the temperature of the heat treatment is preferably 50 to 200 ° C, more preferably 60 to 180 ° C.
  • the heat treatment is preferably performed under reduced pressure conditions.
  • the pressure is preferably 0 to 3000 Pa, more preferably 0 to 300 Pa.
  • the treatment time for the heat treatment is preferably 2 hours to 10 days, more preferably 12 hours to 5 days.
  • the porous composite produced by the above method is excellent in that the speed of biodegradability can be controlled.
  • biodegradability can be controlled by the ionic strength of the collagen suspension during the production of the porous composite. Since bone regeneration requires a period of several weeks to several months, it is preferable that the porous composite exists in the bone defect part for a long time and remains as a scaffold for bone regeneration. According to this production method, a porous composite that is not easily biodegradable can be provided. The degree of degradability can be evaluated by the solubilized protein ratio. Specifically, the porous complex is immersed in a 0.2 mg / ml collagenase solution, left at 37 ° C. for 72 hours, and then present in the solution.
  • the solubilized collagen protein is subjected to BCA (Bicinchoninic® Acid) protein assay to measure the protein amount.
  • BCA Bactinic® Acid
  • the solubilized protein amount (%) can be determined by dividing the solubilized protein amount by the collagen weight of the original porous complex.
  • the preferred solubilized protein ratio in the porous composite of the present invention is 1.5% to 4.0%.
  • the present invention further relates to a bone regeneration material containing the above porous composite.
  • the bone regeneration material can be used for bone defect repair in the dental and oral surgery region and the orthopedic region, craniotomy, bone defect repair after thoracotomy, and the like.
  • bone replacement caused by periodontal disease, cyst cavity, atrophied alveolar ridge, jaw cleft, extraction fossa, etc.
  • bone regeneration material consisting of a porous composite
  • Excellent bone regeneration effect can be confirmed in weeks to months.
  • bone regeneration caused by trauma such as bone defect after bone tumor resection and bone fracture can be compensated for in the bone defect part to promote bone regeneration.
  • the bone regeneration material may contain, for example, cytokines having bone forming ability (bone morphogenetic protein -2, transforming growing factor ⁇ 1, etc.). Playback speed can be increased.
  • cytokines having bone forming ability bone morphogenetic protein -2, transforming growing factor ⁇ 1, etc.
  • the bone regeneration material can contain a compounding ingredient conventionally used in this field.
  • a compounding ingredient conventionally used in this field.
  • examples of such ingredients include bioabsorbable polymers (polyglycolic acid, polylactic acid, polylactic acid-polyethylene glycol copolymer, etc.) and bioabsorbable calcium phosphates other than OCP ( ⁇ -TCP, etc.). .
  • Example 1 (1) Preparation of OCP First, 1 liquid and 2 liquids for OCP preparation were prepared as follows. [Part 1] 31.2 g of sodium dihydrogen phosphate dihydrate was dissolved in 2500 g of distilled water to prepare Part 1. [Second liquid] 35.2 g of calcium acetate monohydrate was dissolved in 2500 g of distilled water to prepare two liquids.
  • the precipitate formed in the mixed solution was filtered and collected using a membrane filter (pore size 3 ⁇ m, manufactured by Advantech Toyo Co., Ltd., A300A293C).
  • the collected precipitate was dispersed in 1500 mL of distilled water, stirred for 15 minutes and washed. The same filtration and washing steps were repeated three more times.
  • the washed precipitate was dried at 30 ° C. for 24 hours using a constant temperature dryer.
  • the dried precipitate was pulverized with an electric mill and then classified into 300 to 500 ⁇ m using a sieve to obtain a powder.
  • the obtained powder was sterilized by dry heat at 120 ° C. for 2 hours.
  • the obtained OCP / collagen suspension was placed in a centrifuge bottle and centrifuged for 20 minutes at a centrifugal force of 7000 ⁇ g using a centrifuge (GRX-250, manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.). Next, the supernatant was discarded so that the collagen in the OCP / collagen suspension was 3% by weight, and an OCP / collagen composite gel was obtained.
  • This is put into a plastic container having a cylindrical inner space (inner diameter 8.5 mm, volume of about 3.0 cm 3 ) or a plastic container having a rectangular parallelepiped inner space (10 mm ⁇ 10 mm ⁇ 50 mm), and 230 ⁇ g Centrifugation was performed for 1 minute with centrifugal force to degas.
  • the vessel was sealed and immersed in methanol cooled to ⁇ 80 ° C. in a large excess with respect to the volume of the object to be frozen and rapidly frozen.
  • the frozen body was dried ( ⁇ 10 ° C., 48 hours) with a freeze dryer and shaped.
  • this was heated at 150 ° C. under reduced pressure for 24 hours to carry out thermal dehydration crosslinking.
  • the cylinder was cut with a knife to a thickness of 15 mm, and the rectangular parallelepiped was cut to 4 mm ⁇ 10 mm ⁇ 30 mm.
  • electron beam irradiation (15 kGy) was performed for sterilization.
  • the porous composite (OCP / collagen composite) of Example 1 was obtained.
  • Example 2 porcine dermis-derived collagen (reduced-salt collagen) containing type I and type III collagen with a reduced NaCl content was used in the preparation of the porous composite. Otherwise, a porous composite (OCP / collagen composite) was obtained in the same manner as in Example 1.
  • low-salt collagen was prepared by the following method. Preparation of low-salt collagen 1 part by weight of porcine dermis-derived collagen (NMP Collagen PS, manufactured by Nippon Ham Co.) containing type I and type III collagen was dissolved in 200 parts by weight of distilled water cooled to 4 ° C., and about 0.5% by weight % Collagen solution was obtained. NaCl contained in porcine dermis-derived collagen was 4% by weight.
  • a sodium hydroxide aqueous solution was added to the collagen aqueous solution to adjust the pH to about 8.0 to obtain a collagen suspension.
  • the collagen suspension was placed in a centrifuge bottle, and centrifuged for 20 minutes at a centrifugal force of 7000 ⁇ g using a centrifuge (manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd., GRX-250).
  • the collagen gel obtained by completely discarding the supernatant was frozen using a -35 ° C freezer.
  • the frozen body was dried with a freeze dryer to obtain reduced salt collagen.
  • NaCl contained in the low-salt collagen was measured by atomic absorption spectrophotometry (ashing), it was 1% by weight.
  • Example 3 phosphate suspension physiological saline (PBS) was added to the collagen suspension of Example 1 to adjust the ionic strength to 0.05. Otherwise, a porous composite (OCP / collagen composite) was obtained in the same manner as in Example 1.
  • PBS phosphate suspension physiological saline
  • Comparative Example 1 1 part by weight of porcine dermis-derived collagen (NMP Collagen PS, manufactured by Nippon Ham Co.) containing type I and type III collagen is dissolved in 200 parts by weight of distilled water cooled to 4 ° C., and a collagen solution of about 0.5% by weight is prepared. Obtained. While maintaining the liquid temperature at 4 ° C., an aqueous sodium hydroxide solution was added to the collagen aqueous solution to adjust the pH to about 7.4 to obtain a collagen suspension. To this, phosphate buffered saline (PBS) was added to adjust the ionic strength to 0.1.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Example 1 the OCP prepared in Example 1 (particle size: 300 to 500 ⁇ m) was added to the collagen suspension so that the OCP and collagen were in a weight ratio of 77:23, and then further stirred at room temperature for OCP / collagen suspension. A liquid was obtained.
  • the obtained OCP / collagen suspension was placed in a centrifuge bottle and centrifuged for 20 minutes at a centrifugal force of 7000 ⁇ g using a centrifuge (GRX-250, manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.). Next, the supernatant was discarded so that the collagen in the OCP / collagen suspension was 3% by weight, and an OCP / collagen composite gel was obtained.
  • This is put into a plastic container having a cylindrical inner space (inner diameter 8.5 mm, volume of about 3.0 cm 3 ) or a plastic container having a rectangular parallelepiped inner space (10 mm ⁇ 10 mm ⁇ 50 mm), and 230 ⁇ g Centrifugation was performed for 1 minute with centrifugal force to degas.
  • the vessel was sealed and immersed in methanol cooled to ⁇ 80 ° C. in a large excess with respect to the volume of the object to be frozen and rapidly frozen.
  • the frozen body was dried ( ⁇ 10 ° C., 48 hours) with a freeze dryer and shaped.
  • this was heated at 150 ° C. under reduced pressure for 24 hours to carry out thermal dehydration crosslinking.
  • the cylinder was cut with a knife to a thickness of 15 mm, and the rectangular parallelepiped was cut to 4 mm ⁇ 10 mm ⁇ 30 mm.
  • electron beam irradiation (15 kGy) was performed for sterilization. In this way, the porous composite (OCP / collagen composite) of Comparative Example 1 was obtained.
  • Comparative Example 2 In Comparative Example 2, the ionic strength of the collagen suspension of Comparative Example 1 was adjusted to 0.15 by adding phosphate buffered saline (PBS). Otherwise, a porous composite (OCP / collagen composite) was obtained in the same manner as in Comparative Example 1.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Comparative Example 3 In Comparative Example 3, a sodium hydroxide aqueous solution was added to an about 0.5 wt% collagen aqueous solution while maintaining the liquid temperature at 4 ° C., and a collagen suspension having a pH of about 7.4 and an ionic strength of 0.01 was obtained. . Further, the container containing the OCP / collagen composite gel was frozen in a freezer at -80 ° C. instead of being rapidly frozen by being immersed in methanol cooled to ⁇ 80 ° C. Otherwise, a porous composite (OCP / collagen composite) was obtained in the same manner as in Comparative Example 1.
  • the collagen suspension was homogenized, then placed in a centrifuge bottle, and centrifuged for 20 minutes with a centrifugal force (GRX-250, manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.) at a centrifugal force of 20000 ⁇ g. Next, the supernatant was discarded so that the collagen in the collagen suspension was 5% by weight, and a 5% by weight collagen gel was obtained.
  • a centrifugal force GRX-250, manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.
  • HA Hydroxyapatite
  • Apatite HAP monoclinic manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was added to 5 wt% collagen gel so that the weight ratio of HA and collagen was 60:40, and then mixed with a spoon. This is put into a plastic container having a cylindrical inner space (inner diameter 8.5 mm, volume of about 3.0 cm 3 ) or a plastic container having a rectangular parallelepiped inner space (10 mm ⁇ 10 mm ⁇ 50 mm), and 230 ⁇ g Centrifugation was performed for 1 minute with centrifugal force to degas.
  • HA Hydroxyapatite
  • the container was sealed and frozen in a ⁇ 20 ° C. freezer. After opening the container, the frozen body was dried ( ⁇ 10 ° C., 48 hours) with a freeze dryer and shaped. Next, this was heated at 150 ° C. under reduced pressure for 24 hours to carry out thermal dehydration crosslinking.
  • the cylinder was cut with a knife to a thickness of 15 mm, and the rectangular parallelepiped was cut to 4 mm ⁇ 10 mm ⁇ 30 mm. Finally, electron beam irradiation (15 kGy) was performed for sterilization.
  • the HA / collagen composite of Comparative Example 4 was obtained.
  • Comparative Example 5 In Comparative Example 5, a 5 wt% collagen gel was obtained by centrifugal concentration, then homogenized again, and similarly centrifuged for 20 minutes at a centrifugal force of 20000 ⁇ g. Finally, the supernatant was discarded so that the collagen in the collagen suspension was 10% by weight, and a 10% by weight collagen gel was obtained. Hydroxyapatite (HA) (Apatite HAP, monoclinic) manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was added to 10 wt% collagen gel so that the weight ratio of HA and collagen was 20:80, and then mixed with a spoon. Except for this point, the HA / collagen composite of Comparative Example 5 was obtained in the same manner as Comparative Example 4.
  • HA Hydroxyapatite
  • Example 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 5 three samples were prepared in each Example and Comparative Example.
  • the bending strength and the compressive strength were measured for each sample, and the average values thereof were obtained.
  • the measurement of the bending strength and compressive strength in an Example was specifically performed by the following method.
  • the bending strength ( ⁇ ) in the present invention is expressed by Equation 4 from the load at break of the sample, the dimension of the sample, and the distance between fulcrums.
  • ⁇ 3FL / 2bh 2 (Formula 4)
  • ⁇ Bending strength (Pa)
  • F Load at break (N)
  • L Distance between fulcrums (mm)
  • b Width of sample (mm)
  • h sample thickness (mm)
  • the distance between fulcrums in this test was 20 mm.
  • the crosshead 42 equipped with the flat compression jig is lowered at a speed of 10 mm / min, and the load cell shows 2.5N.
  • the crosshead 42 is stopped to release the load.
  • the load cell shows 5N.
  • This operation was repeated by increasing the load by 2.5N, and the load when the sample collapsed for the first time was taken as the load at the time of collapse.
  • disintegration of the sample means that it was confirmed that a clear crack or peeling occurred when the sample was observed with the naked eye.
  • the compressive strength in the present invention is expressed by Equation 5 from the collapse load and the cross-sectional area of the sample (cross-sectional area in a cross section perpendicular to the thickness direction of the cylinder).
  • Cs F / S (Formula 5)
  • Table 1 shows the measurement results of bending strength and compressive strength for the above Examples and Comparative Examples.
  • the samples of Examples 1 to 3 have a flexural strength of 0.05 to 0.16 MPa and a compressive strength of 0.3 MPa or more. Compared with, it was excellent in workability and handleability.
  • the samples of Comparative Examples 1 and 2 have a compressive strength of 0.3 MPa or more and are easy to handle. However, since the ionic strength at the time of collagen fibrillation is high, the bending strength is higher than 0.16 MPa. It was difficult to process.
  • the sample of Comparative Example 3 has a moderate bending strength and can achieve easy processing. However, when the composite gel of OCP and collagen is frozen, slow gas phase cooling by a refrigerator is used.
  • the compressive strength was less than 0.3 MPa, resulting in poor handleability. Since the samples of Comparative Examples 4 and 5 have high ionic strength at the time of collagen fibrillation, the bending strength is higher than 0.16 MPa, and when the composite gel of HA and collagen is frozen, the gas phase is slowly cooled by a refrigerator. Therefore, the compressive strength was less than 0.3 MPa, and there were difficulties in workability and handleability.
  • Example 1 (Degradability measurement) About each sample of Example 1, Example 3, Comparative Example 1, and Comparative Example 2, a sample obtained by cutting a cylindrical body into a thickness of about 10 mm was immersed in a collagenase solution, and the ratio of collagen solubilized protein was measured. The biodegradability of the porous composite was measured.
  • Example 3 a sample obtained by cutting a cylindrical body into a thickness of about 10 mm was added to a 0.2 mg / mL collagenase type I solution ( It was immersed in Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (180Unit / mg), and left still at 37 degreeC for 72 hours.
  • a mixture consisting only of a collagenase solution in which the sample was not immersed was allowed to stand at 37 ° C. for 72 hours.
  • a BCA protein assay kit (Thermo SCIENTIFIC, Pierce BCA Protein Assay Kit) is used and 570 nm by a microplate reader (BIO-RAD, iMark).
  • the amount of supernatant protein ( ⁇ g) was quantified.
  • the standard substance used was bovine serum albumin.
  • the quantified amount of the supernatant protein was divided by the collagen weight (mg) contained in the sample to determine the solubilized protein ratio (%).
  • the collagen weight was obtained by multiplying the weight of a cylinder of about 10 mm by 0.23. The results are shown in Table 2.
  • porous composite of the present invention and the bone regeneration material containing the same have both excellent processability and mechanical strength and excellent operability, and have high bone regeneration ability, mainly dental and oral surgery It is useful for bone defect repair in the area and orthopedic area.

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Abstract

【課題】適度に曲げ強度を有し、かつ圧縮強度に優れたＯＣＰとコラーゲンとを含む多孔質複合体、それを含む骨再生材料を提供する。 【解決手段】第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含み、曲げ強度および圧縮強度がそれぞれ、０．０５～０．１６ＭＰａおよび０．３ＭＰａ以上であることを特徴とする多孔質複合体。

Description

多孔質複合体、骨再生材料、および多孔質複合体の製造方法
　本発明は、多孔質複合体、骨再生材料、および多孔質複合体の製造方法に関する。
　従来より使用されている骨再生材料としては、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）などのリン酸カルシウムが知られている（例えば、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５参照）。
　近年、ＨＡの前駆物質である第８リン酸カルシウム（Octacalcium　phosphate、以下、「ＯＣＰ」という）は、ＨＡやβ－第３リン酸カルシウム（β－ＴＣＰ）等の他のリン酸カルシウムに比して、骨再生の促進作用が高く、生体内での吸収性も高いことが分かってきた（例えば、特許文献１参照）。このようにＯＣＰは、リン酸カルシウムの中でも骨再生材料として特に優れた特性を有している。
　しかし、ＯＣＰは無機物であるために形状付与性に乏しい。このため、ＯＣＰ単独では、広範囲の骨欠損部の再生等への適用は難しい。そこで、ＯＣＰとコラーゲンとの複合体を骨再生材料として用いることが提案されている（例えば、特許文献１参照）。
特開２００６－１６７４４５号公報 特開２０１０－２７３８４７号公報 特開２００３－２６０１２４号公報 特開２００９－１３２６０１号公報 特開２００５－２７９０７８号公報 特開平５－０７０１１３号公報
　骨再生材料は、一般に不定形の骨欠損に適用される。このような目的で使用される骨再生材料には、骨再生促進能は言うまでもないが、良好な操作性も臨床的に要求される。例えば、（１）適度な曲げ強度を有し、ピンセット等で骨欠損部の形状に合わせて容易に加工できる、（２）適度な圧縮強度を有し、取り扱い時に破損等が生じないといった特徴が求められている。
特許文献４には、機械的強度と生体親和性とを最適なバランスで有し、人工骨材、細胞の足場材等に好適なアパタイト／コラーゲン複合体繊維を含む多孔体が開示されている。このようなアパタイト／コラーゲン複合体繊維は、コラーゲンに微細なアパタイト粒子が沈着しているため、初期の機械的強度の面で有利であるが、一方で、その強度のためにピンセット等で容易に加工するのが困難であるという問題点がある。
特許文献１には、第８リン酸カルシウムとコラーゲンからなり、形状付与性に優れた硬組織代替性担体材料が開示されている。このような硬組織代替性担体材料は柔軟性には優れるが、その気孔径が大きいため圧縮強度が低く、取り扱い時に破損等が生じ易いといった問題点がある。
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、従来よりも改善された曲げ強度および圧縮強度を有する、操作性の良好なＯＣＰとコラーゲンとを含む多孔質複合体、それを含む骨再生材料、および多孔質複合体の製造方法を提供することを目的とする。
　上記課題を鑑み、本発明者らが鋭意検討したところ、所定のイオン強度を有するコラーゲンを含む液体を用いることにより、所期の範囲内の曲げ強度及び圧縮強度を有し、その結果加工容易性と機械的強度を両立した多孔質複合体を見出した。本発明者らは更なる検討と改良を重ね、以下に代表される発明を提供する。
［１］　第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含み、曲げ強度が０．０５～０．１６ＭＰａであり、圧縮強度が０．３ＭＰａ以上である多孔質複合体。
［２］　気孔径が３～９０μｍである、［１］に記載の多孔質複合体。
［３］　コラーゲンがタイプＩ又はタイプＩとタイプＩＩＩの混合物である、［１］又は［２］に記載の多孔質複合体。
［４］　［１］～［３］のいずれかに記載の多孔質複合体を含む骨再生材料。
［５］　第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含む多孔質複合体の製造方法であって、
（１）コラーゲンを含む液体を、イオン強度が０．００５～０．０６であり、ｐＨが６．０～９．０となるよう調製し、コラーゲンを含むゲル、ゾル又は液体を調製する工程、及び
（２）前記コラーゲンを含むゲル、ゾル又は液体と第８リン酸カルシウムを混合した懸濁液を得る工程、
を含むことを特徴とする、多孔質複合体の製造方法。
［６］　さらに、（３）前記懸濁液を液体冷媒に浸漬し急速凍結した後に、凍結乾燥する工程を含む、［５］に記載の多孔質複合体の製造方法。
［７］　第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含む多孔質複合体の製造方法であって、
（１）コラーゲンを含む液体と第８リン酸カルシウムを混合した懸濁液を得る工程、及び
（２）前記懸濁液を、イオン強度が０．００５～０．０６、ｐＨが６．０～９．０に調整する工程、
を含むことを特徴とする、多孔質複合体の製造方法。
［８］　さらに、（３）前記懸濁液を液体冷媒に浸漬し急速凍結した後に、凍結乾燥する工程を含む、［７］に記載の多孔質複合体の製造方法。
　本発明によれば、加工性に優れ、かつ破損しにくいという、従来よりも曲げ強度および圧縮強度の特性に優れたＯＣＰとコラーゲンとを含む多孔質複合体、及びそれを含む骨再生材料を提供することができる。加えて、本多孔質複合体は、タンパク分解酵素による分解を受けにくく、骨再生を要する部分により長く留まることができ、骨再生を促進することが期待される。
曲げ試験用のサンプル寸法を説明するための模式図である。 曲げ強度の測定方法を説明するための模式図である。 実施例１についての曲げ強度試験における応力－ひずみ曲線を示すグラフである。 圧縮強度の測定方法を説明するための模式図である
［多孔質複合体］
　本発明の多孔質複合体は、ＯＣＰとコラーゲンとを含む多孔質の複合体（ＯＣＰ／コラーゲン複合体）である。本発明の多孔質複合体の好ましい態様は、コラーゲンが３次元のスポンジ状構造を形成し、ＯＣＰが該スポンジ状構造中に少なくとも１００μｍ以上の顆粒として存在している多孔質複合体である。本発明の多孔質複合体からなる骨再生材料は、多孔質体構造によって、多孔質内部に骨芽細胞が侵入し、新生骨の形成を促進する内部骨形成を実現している。
　ＯＣＰ（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）は、種々公知の方法によって調製することができ、例えば、LeGerosの滴下法（LeGeros　RZ，Calcif　Tissue　Int　37：194-197，1985）や特許文献６に開示される合成装置（三流管）を使用した方法などによって調製することができる。また、混合法によって調製することができ、具体的には、例えば、リン酸二水素ナトリウム水溶液と、酢酸カルシウム水溶液を適切な条件下で混合し、生成した沈殿物を回収することにより、ＯＣＰを得ることができる。沈殿物から得られたＯＣＰは、乾燥させ、電動ミル等を用い粉砕し、粒子状の粉体にして用いることが好ましい。粒径は１０～１０００μｍの範囲であることが好ましく、更に好ましくは３００～５００μｍに調製することが好ましい。粒径は、ふるい分け法によりふるいの目開きのサイズによって分級することができる。
　コラーゲンとしては、その由来、性状などは特に限定されず、種々のコラーゲンを使用することができる。好ましくは、蛋白分解酵素（例えばペプシン、プロナーゼ等）で可溶化することにより得られ、テロペプチドが除去されている酵素可溶化コラーゲンが使用される。コラーゲンのタイプとしては、繊維性コラーゲンであるＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型及びＩＶ型コラーゲンが好ましく、生体内に大量に含まれるＩ型コラーゲン、又はＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンの混合物が特に好ましい。原料としては、特に限定されないが、豚、牛などの皮膚、骨、腱などに由来するコラーゲンを好ましく用いることができる。コラーゲンは生体由来成分であるので、安全性が高いという特長を有し、特に酵素可溶化コラーゲンはアレルゲン性も低く好ましい。上記のコラーゲンとしては、市販の製品を使用してもよい。
　本発明の多孔質複合体において、ＯＣＰとコラーゲンの配合比は、所望する形状付与性、操作性、生体親和性などに応じて適宜調整することができる。コラーゲン１重量部に対するＯＣＰの配合比は、好ましくは０．５～３５重量部、より好ましくは１～２０重量部、更に好ましくは２～１０重量部である。コラーゲン１に対してＯＣＰが０．５未満であると、得られた複合体の骨再生機能が劣るおそれがあり、また３５重量部を超えると形状付与性が低下するおそれがある。
　本発明の多孔質複合体の曲げ強度は、０．０５～０．１６ＭＰａであることが好ましい。より好ましくは０．０８～０．１６ＭＰａである。曲げ強度が０．１６ＭＰａを超える場合、ピンセット等での容易な加工が困難となる傾向がある。すなわち、医師が多孔質複合体を骨欠損部に充填する際に、欠損部の大きさに応じて多孔質複合体を適当な大きさに調整する必要があるが、この際０．１６ＭＰａ以下であれば、ピンセット等で適度な応力を加えることにより、容易にカットすることができる。一方、曲げ強度が０．０５ＭＰａ未満である場合、容易に破断し易く、手術後の破損が生じ易くなる傾向がある。
　本発明における曲げ強度は下記の方法により測定される。
　（曲げ強度測定）
　温度：２５℃、湿度：６５％の環境下、図１に示す、厚さ（ｈ）４ｍｍ、幅（ｂ）１０ｍｍ、長さ３０ｍｍの直方体状試料（サンプル）をリン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１４Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に３０分間浸漬する。その後、サンプル表面の水気を軽く拭い、引張・圧縮試験機（ロードセル容量：１ｋＮ）の支持台（支持台の半径Ｒ１＝５ｍｍ）に、支点間距離（Ｌ）が２０ｍｍとなるようサンプルをセットする。サンプルに荷重を加える治具である圧子は、半径Ｒ２＝５ｍｍの圧子を用いる。本測定は、図２に示すように、三点曲げ試験を行う。次いで、引張・圧縮試験機のクロスヘッドをサンプルが破断するまで１０ｍｍ／ｍｉｎの速度で下げる。なお、本試験において、「サンプルが破断した」とは、図３に示すように、応力－ひずみ曲線において荷重が急激に低下する点を意味する。
本発明における曲げ強度（σ）とは、サンプルの破断時荷重、サンプルの寸法および支点間距離とから、式１で表される。
　　σ＝３ＦＬ／２ｂｈ２　（式１）
　　　　σ：曲げ強度（Ｐａ）
　　　　Ｆ：破断時荷重（Ｎ）
Ｌ：支点間距離（ｍｍ）
ｂ：サンプルの幅（ｍｍ）
ｈ：サンプルの厚さ（ｍｍ）
　本発明の多孔質複合体の圧縮強度は、好ましくは０．３ＭＰａ以上であり、より好ましくは０．３～３．０ＭＰａ、更に好ましくは０．３～１．０ＭＰａである。圧縮強度が０．３ＭＰａ未満である場合、多孔質複合体の操作性が低下する傾向がある。すなわち、本発明の多孔質複合体を骨欠損部に充填する際に、前記複合体が崩壊してしまったり、気孔が潰れてしまったりすると、その後の骨再生に悪影響を与えることになる。具体的には、さまざまな形状を有する骨欠損部に、医師が治具を用いて多孔質複合体を隙間なく充填する施術を行う際に、前記複合体の崩壊や気孔潰れが生じないことを示す指標が圧縮強度０．３ＭＰａ以上である。上限は特に定められるものではないが、骨欠損部への充填の際の操作容易性の観点から、３．０ＭＰａ以下であることが好ましい。
　本発明における圧縮強度は下記の方法により測定される。
　（圧縮強度測定）
　温度：２５℃、湿度：６５％の環境下、直径８．５ｍｍ、長さ１５ｍｍの円柱状試料（サンプル）をリン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１４Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に３０分間浸漬する。その後、サンプル表面の水気を軽く拭い、引張・圧縮試験機（ロードセル容量：１ｋＮ）を用いて、円柱の上下方向に単軸荷重を負荷する。そして、段階的に荷重を変化させたときにサンプルが崩壊する最小荷重を崩壊時荷重とする。「サンプルの崩壊を認めた」とは、試料を肉眼で観察した時に明確な亀裂または剥がれが生じていることが確認されたことを意味する。
　具体的には、図４を参照して、サンプルを試料台４１にセットした後、平型圧縮治具を装着したクロスヘッド４２を１０ｍｍ／ｍｉｎの速度で下げ、ロードセルが２．５Ｎを示した時にクロスヘッド４２を止めて荷重を解く。試料台のサンプルを観察し、崩壊していなければ、そのサンプルを試料台に戻して再びセットし、同様にロードセルが５Ｎを示すまでクロスヘッドを下げる。荷重を２．５Ｎずつ増加させて、この操作を繰り返し、初めてサンプルの崩壊を認めたときの荷重を崩壊時荷重とする。
　本発明における圧縮強度は、上記崩壊時荷重とサンプルの断面積（円柱の厚さ方向に垂直な断面における断面積）とから、式２で表される。
　　Ｃｓ＝Ｆ／Ｓ　（式２）
　　　　Ｃｓ：圧縮強度（Ｐａ）
　　　　Ｆ　：崩壊時荷重（Ｎ）
　　　　Ｓ　：サンプルの断面積（ｍ２）
　なお、サンプルの断面積は、およそ（０．００４２５）２×３．１４＝５．６７×１０－５ｍ２である。
　本発明の多孔質複合体は、多孔質複合体の気孔径が３～９０μｍであることが好ましい。気孔径が９０μｍを超える場合、多孔質複合体の圧縮強度が低下する傾向がある。一方、気孔径が３μｍ未満である場合、骨芽細胞等の骨代謝系細胞の侵入が起こり難くなり、骨再生の促進作用が低下する恐れがある。本発明の多孔質複合体のより好ましい気孔径は５～４０μｍである。
　気孔径は水銀ポロシメーター（Mercury porosimeter）による細孔分布測定を用いて測定し、具体的には以下の方法により測定される。
（気孔径測定）
　前処理として、サンプルを１２０℃で４時間恒温乾燥する。前処理後の各サンプルについて、以下の測定装置を用いた水銀圧入法により、以下の条件で細孔径０．００１８～２００μｍの細孔分布を求める。
　　測定装置：オートポアＩＶ９５２０（ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）
　　測定条件：サンプルと水銀の接触角：１４０ｄｅｇ
　　　　　　　水銀の表面張力０．４８Ｎ／ｍ（１ｄｙｎｅ＝１０－５Ｎで換算）
　発明における気孔径とは、水銀圧入法による測定圧力から得られた細孔分布曲線において、最も大きな面積を有するピークの極大値を示す細孔直径の値である。
　多孔質複合体の気孔率（空隙率）は８０～９９％であることが好ましく、より好ましくは８５～９８％である。気孔率は水銀圧入法による全細孔容積と見かけ密度を用いて下記の式により求められる。
気孔率(％)= 全細孔容積／｛（１／見かけ密度）＋全細孔容積｝×１００
　本発明の多孔質複合体の形状は、直方体（ブロック体）、円柱体もしくはタブレット状、又は顆粒であることが好ましい。直方体である場合の大きさは５ｍｍ×５ｍｍ×５ｍｍ以上の大きさが好ましく、一般に上限は１００ｍｍ×１００ｍｍ×１００ｍｍ以内の範囲であることが好ましい。直方体は立方体に限られない。円筒状である場合の大きさは、直径が５～５０ｍｍであることが好ましく、高さは１～５０ｍｍの範囲であることが好ましい。顆粒状である場合、形状は球体に限られず不定形でもよいが、直径が０．１～１０ｍｍであることが好ましい。
　本発明の多孔質複合体は骨欠損部に補填することにより使用されるが、骨欠損部に十分な血液もしくは体液が認められる場合には、多孔質複合体をそのまま、もしくは適当な形状に切断し補填することができる。骨欠損部に十分な血液等が認められない、又は多孔質複合体を元の形状で補填できない場合は、多孔質複合体を血液もしくは生理食塩水等に浸漬し、多孔質複合体がスポンジ状の弾力性を示すことを確認した上で骨欠損部に補填することができる。
［多孔質複合体の製造方法］
　本発明の多孔質複合体の製造方法は、ＯＣＰとコラーゲンを混合する製造方法が好ましく、下記のような製造方法を用いることができる。公知の共沈法などによりＯＣＰをコラーゲンに析出させて複合化する方法は、曲げ強度が過度に高くなり容易な加工が困難となるおそれがある。
　（ａ）ＯＣＰを混合して複合化する方法
　まず、濃度を０．１～５重量％、ｐＨを６．０～９．０に調製し、ゲル化したコラーゲン溶液にＯＣＰを添加し、混練してＯＣＰとコラーゲンの混合物を作製する。次いで、当該混合物を適当な型に加えて成型し、凍結し、凍結乾燥することにより複合体を得る。得られた当該複合体は、必要に応じて、熱脱水架橋処理を施し、更に、慣用の滅菌法（例えば、γ線照射、電子線照射、エチレンオキサイドガス等）により滅菌する。
　（ｂ）ＯＣＰ懸濁液を混合して複合化する方法
　適当な濃度のコラーゲン酸性溶液を、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）で無菌的にｐＨ５．５～７．５に調整し、コラーゲンがゲル化する前にＯＣＰを添加して、コラーゲンとＯＣＰの懸濁液を調製する。その後、ｐＨを中性から弱アルカリ性に保持した状態で型に流し込み、形状を付与した後、適当な温度（例えば３７℃）でゲル化させ、水洗浄を繰り返して緩衝液の塩などを除去して複合担体とし、上記と同様に凍結乾燥および滅菌処理する。
　本発明の多孔質複合体の製造方法は、コラーゲンを含む液体を、イオン強度が０．００５～０．０６であり、ｐＨが６．０～９．０となるよう調製し、コラーゲンを含むゲル、ゾルまたは液体を調製する工程を含むことが好ましい。イオン強度は０．００５～０．０５であることがより好ましい。ｐＨは６．５～８．０であることがより好ましい。前記（ａ）の方法において、本工程はＯＣＰを添加する前に行われ、前記（ｂ）の方法において、本工程はＯＣＰを添加しＯＣＰ／コラーゲン懸濁液を作製した後に行われる。イオン強度およびｐＨは、コラーゲンを蒸留水に溶解した液体に、慣用の緩衝液や塩類を添加することで調整することができる。例えば、緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッドバッファーであるＭＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液などが挙げられる。塩類としては、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム、水酸化ナトリウム、希塩酸などが挙げられる。
　本発明において、イオン強度（μ）は式３により算出される。
　　μ＝１／２Σ（ｃｉｚｉ ２）　（式３）
μ：イオン強度
　　　　ｃｉ：イオンのモル濃度
ｚｉ：イオンの電荷
　例えば、後述する実施例１において存在する電解質は、コラーゲンに含有されるＮａＣｌおよびｐＨ調整で生じたＮａＣｌの合計０．０１ＭのＮａＣｌのみであったので、イオン強度は、１／２×（０．０１×１２＋０．０１×１２）＝０．０１である。
一般に、生理的な条件下で（イオン強度 約 ０．２程度、ｐＨ　７．０付近）コラーゲンは効率的に自己組織化（線維化）することが知られている。本発明らは、コラーゲンを含む液体のイオン強度及びｐＨを本発明の所定の範囲内に調整することが、本多孔質複合体の圧縮強度及び曲げ強度の特性を決める上で重要な要素であることを見出した。本発明において、生理的なイオン強度よりも低い条件で線維化を行うことで、コラーゲン線維径、線維長、コラーゲン分子間の相互作用を適切に制御でき、好ましい曲げ強度が得られると考えられる。
　本発明の多孔質複合体の製造方法は、ＯＣＰとコラーゲンとを含むゲル、ゾルまたは液体を液体冷媒に浸漬し急速凍結した後、凍結乾燥する工程を含むことが好ましい。液体冷媒は、第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含むゲル、ゾルまたは液体の凍結温度より低い温度の液体であり、例えば、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、液体窒素が挙げられる。該液体冷媒の温度は、好ましくは－２０℃以下であり、より好ましくは－４０℃以下であり、さらに好ましくは－８０℃以下である。
　第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含むゲル、ゾルまたは液体を液体冷媒浸漬によって急速に凍結させることにより、得られる多孔質複合体の気孔径を小さくすることができると考えられる。
　本発明の多孔質複合体は、熱処理もしくは熱脱水架橋処理が施されていることが好ましい。熱処理により、ＯＣＰ分子構造の一部が崩れて骨形成系細胞の侵入が起こり易くなり、骨再生が促進されると共に、コラーゲンが架橋して形状保持力が向上する。
　熱処理の温度は、好ましくは５０～２００℃、より好ましくは６０～１８０℃である。また、熱処理は、減圧条件下で行うことが好ましい。圧力は、好ましくは０～３０００Ｐａ、より好ましくは０～３００Ｐａである。熱処理の処理時間は、好ましくは２時間～１０日間、より好ましくは１２時間～５日間である。
　上記方法により製造された多孔質複合体は、別の効果として、生分解性の速度を制御できる点でも優れている。本発明者らは、多孔質複合体製造時のコラーゲン懸濁液のイオン強度により、生分解性を制御できることを見出した。骨再生には数週間から数か月の期間を要するため、長い時間にわたり多孔質複合体が骨欠損部に存在し、骨再生の足場として留まることが好ましい。本製造方法によれば、生分解性を受けにくい多孔質複合体を提供できる。分解性の程度は可溶化タンパク割合により評価することができ、具体的には、多孔質複合体を０．２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ溶液に浸漬し、３７℃、７２時間静置後、溶液中に存在する可溶化したコラーゲンのタンパク質についてＢＣＡ（Bicinchoninic Acid）プロテインアッセイを行ってタンパク量を測定する。その可溶化したタンパク量を元の多孔質複合体のコラーゲン重量で除して、可溶化タンパク割合（％）を求めることができる。本発明の多孔質複合体における好ましい可溶化タンパク割合は１．５％～４．０％である。
［骨再生材料］
　本発明は、さらに上記の多孔質複合体を含む骨再生材料に関する。骨再生材料は歯科口腔外科領域、整形外科領域における骨欠損修復、開頭、開胸術後の骨欠損修復などに用いることができる。例えば、歯科口腔外科領域においては、歯周病、嚢胞腔、萎縮歯槽堤、顎裂部、抜歯窩等により生じた骨欠損に対し、多孔質複合体からなる骨再生材料を補填することにより、数週間から数ヶ月には優れた骨再生効果が確認できる。整形外科領域においては、例えば骨腫瘍切除後の骨欠損、骨折等外傷により生じた骨欠損に対し、本骨再生材料を骨欠損部に補填し、骨再生を促進することができる。
　骨再生材料は、ＯＣＰおよびコラーゲンの他に、例えば、骨形成能を有するサイトカイン(bone morphogenetic protein-2、transforming growth factor β１など)を含有していてもよく、係るサイトカインを含有させることにより、骨再生速度を速めることができる。
　骨再生材料は、それ以外にも、この分野で慣用の配合成分を含ませることができる。かかる配合成分としては、例えば、生体吸収性高分子（ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ乳酸－ポリエチレングリコール共重合体等）、ＯＣＰ以外の生体吸収性リン酸カルシウム（β－ＴＣＰ等）を挙げることができる。
　以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　（実施例１）
　（１）ＯＣＰの調製
　まず、ＯＣＰ調製用の１液および２液を次の通り調製した。
　［１液］リン酸二水素ナトリウム二水和物３１．２ｇを蒸留水２５００ｇに溶解し、１液を調製した。
　［２液］酢酸カルシウム一水和物３５．２ｇを蒸留水２５００ｇに溶解し、２液を調製した。
　次に、１液をセパラブルフラスコに入れ、マントルヒーターにて７０℃に昇温した。次に、撹拌機（東京理化器械社製、ＭＡＺＥＬＡ　Ｚ）に撹拌翼（羽径１２ｃｍ）を取り付け、２５０ｒｐｍの速度で撹拌しながら、１液に対して２液を約２８ｍＬ／ｍｉｎの速度で滴下した。滴下終了後、１液と２液の混合液を７０℃、２５０ｒｐｍでさらに２時間撹拌した。
　次に、上記混合液中に生成した沈殿物をメンブレンフィルター（孔径３μｍ、アドバンテック東洋社製、Ａ３００Ａ２９３Ｃ）を用いてろ過し、回収した。回収した沈殿物を蒸留水１５００ｍＬに分散させ、１５分間撹拌し洗浄した。同様のろ過、洗浄の工程をさらに３回繰り返した。
　次に、洗浄後の沈殿物を、恒温乾燥機を用いて３０℃で２４時間乾燥した。乾燥後の沈殿物を電動ミルにて粉砕した後、ふるいを用いて粒径を３００～５００μｍに分級し、粉体を得た。最後に、得られた粉体に対して１２０℃で２時間の乾熱滅菌を行った。
　（２）ＯＣＰ／コラーゲン複合体（多孔質複合体）の調製
　Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンを含むブタ真皮由来コラーゲン（日本ハム社製、ＮＭＰコラーゲンＰＳ）１重量部を４℃に冷却した蒸留水２００重量部に溶解し、約０．５重量％のコラーゲン溶液を得た。液温を４℃に保ちながらコラーゲン水溶液に水酸化ナトリウム水溶液を加え、ｐＨを約７．４に調整しコラーゲン懸濁液を得た。このとき、コラーゲン懸濁液のイオン強度は約０．０１であった。次いで、コラーゲン懸濁液にＯＣＰ（粒径３００～５００μｍ）をＯＣＰとコラーゲンが重量比で７７：２３となるように加えた後、室温でさらに撹拌しＯＣＰ／コラーゲン懸濁液を得た。
　次に、得られたＯＣＰ／コラーゲン懸濁液を遠心瓶に入れ、遠心分離機（トミー精工社製、ＧＲＸ－２５０）を用い７０００×ｇの遠心力で２０分間遠心した。次いで、ＯＣＰ／コラーゲン懸濁液中のコラーゲンが３重量％となるように上清を廃棄し、ＯＣＰ／コラーゲン複合ゲルを得た。これを円柱状の内部空間を有するプラスチック容器（内径８．５ｍｍ、容積約３．０ｃｍ３）または、直方体状の内部空間を有するプラスチック容器（１０ｍｍ×１０ｍｍ×５０ｍｍ）に入れて、２３０×ｇの遠心力で１分間遠心して脱泡した。
　容器を密閉し、被凍結体の容積に対して大過剰の－８０℃に冷却したメタノールに浸漬して急速に凍結した。容器を開栓した後、凍結体を凍結乾燥機により乾燥（－１０℃、４８時間）させ成形した。次いで、これを減圧下、１５０℃で２４時間加熱し熱脱水架橋を行った。円柱体はメスで厚さ１５ｍｍに、直方体は、４ｍｍ×１０ｍｍ×３０ｍｍにカットした。最後に、電子線を照射（１５ｋＧｙ）し、滅菌を行った。このようにして、実施例１の多孔質複合体（ＯＣＰ／コラーゲン複合体）を得た。
　（実施例２）
　実施例２では、多孔質複合体の調製の際に、ＮａＣｌ含量を減じたＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンを含むブタ真皮由来コラーゲン（減塩コラーゲン）用いた。それ以外は実施例１と同じ方法により多孔質複合体（ＯＣＰ／コラーゲン複合体）を得た。なお、減塩コラーゲンは、下記の方法で調製した。
減塩コラーゲンの調製
Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンを含むブタ真皮由来コラーゲン（日本ハム社製、ＮＭＰコラーゲンＰＳ）１重量部を４℃に冷却した蒸留水２００重量部に溶解し、約０．５重量％のコラーゲン溶液を得た。ブタ真皮由来コラーゲンに含有されるＮａＣｌは４重量％であった。液温を４℃に保ちながらコラーゲン水溶液に水酸化ナトリウム水溶液を加え、ｐＨを約８．０に調整しコラーゲン懸濁液を得た。次に、コラーゲン懸濁液を遠心瓶に入れ、遠心分離機（トミー精工社製、ＧＲＸ－２５０）を用い７０００×ｇの遠心力で２０分間遠心した。上清を完全に廃棄して得たコラーゲンゲルを－３５℃の冷凍庫を用いて凍結した。凍結体を凍結乾燥機により乾燥し、減塩コラーゲンを得た。減塩コラーゲンに含有されるＮａＣｌを原子吸光光度法（灰化）で測定すると、１重量％であった。
　（実施例３）
　実施例３では、実施例１のコラーゲン懸濁液を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えてイオン強度を０．０５に調整した。それ以外は実施例１と同じ方法により多孔質複合体（ＯＣＰ／コラーゲン複合体）を得た。
　（比較例１）
　Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンを含むブタ真皮由来コラーゲン（日本ハム社製、ＮＭＰコラーゲンＰＳ）１重量部を４℃に冷却した蒸留水２００重量部に溶解し、約０．５重量％のコラーゲン溶液を得た。液温を４℃に保ちながらコラーゲン水溶液に水酸化ナトリウム水溶液を加え、ｐＨを約７．４に調整しコラーゲン懸濁液を得た。これにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えてイオン強度を０．１に調整した。次いで、コラーゲン懸濁液に実施例１で作製したＯＣＰ（粒径３００～５００μｍ）をＯＣＰとコラーゲンが重量比で７７：２３となるように加えた後、室温でさらに撹拌しＯＣＰ／コラーゲン懸濁液を得た。
　次に、得られたＯＣＰ／コラーゲン懸濁液を遠心瓶に入れ、遠心分離機（トミー精工社製、ＧＲＸ－２５０）を用い７０００×ｇの遠心力で２０分間遠心した。次いで、ＯＣＰ／コラーゲン懸濁液中のコラーゲンが３重量％となるように上清を廃棄し、ＯＣＰ／コラーゲン複合ゲルを得た。これを円柱状の内部空間を有するプラスチック容器（内径８．５ｍｍ、容積約３．０ｃｍ３）または、直方体状の内部空間を有するプラスチック容器（１０ｍｍ×１０ｍｍ×５０ｍｍ）に入れて、２３０×ｇの遠心力で１分間遠心して脱泡した。
　容器を密閉し、被凍結体の容積に対して大過剰の－８０℃に冷却したメタノールに浸漬して急速に凍結した。容器を開栓した後、凍結体を凍結乾燥機により乾燥（－１０℃、４８時間）させ成形した。次いで、これを減圧下、１５０℃で２４時間加熱し熱脱水架橋を行った。円柱体はメスで厚さ１５ｍｍに、直方体は、４ｍｍ×１０ｍｍ×３０ｍｍにカットした。最後に、電子線を照射（１５ｋＧｙ）し、滅菌を行った。このようにして、比較例１の多孔質複合体（ＯＣＰ／コラーゲン複合体）を得た。
　（比較例２）
　　比較例２では、比較例１のコラーゲン懸濁液を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えてイオン強度を０．１５に調整した。それ以外は比較例１と同じ方法により多孔質複合体（ＯＣＰ／コラーゲン複合体）を得た。
　（比較例３）
　比較例３では、液温を４℃に保ちながら約０．５重量％コラーゲン水溶液に水酸化ナトリウム水溶液を加え、ｐＨが約７．４、イオン強度が０．０１のコラーゲン懸濁液を得た。さらに、ＯＣＰ／コラーゲン複合ゲルを入れた容器を、－８０℃に冷却したメタノールに浸漬して急速に凍結する代わりに、－８０℃の冷凍庫に入れ凍結した。それ以外は比較例１と同じ方法により多孔質複合体（ＯＣＰ／コラーゲン複合体）を得た。
　（比較例４）
ヒドロキシアパタイト／コラーゲン複合体の調製
　Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンを含むブタ真皮由来コラーゲン（日本ハム社製、ＮＭＰコラーゲンＰＳ）を４℃に冷却した蒸留水に溶解し、約０．８重量％のコラーゲン溶液を得た。このコラーゲン溶液に、等量のリン酸水素２ナトリウムおよび塩化ナトリウムの混合液（３０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、７０ｍＭ　ＮａＣｌ）を加え、撹拌し、コラーゲン懸濁液を得た。このとき、コラーゲン懸濁液のイオン強度は約０．０７であった。
　コラーゲン懸濁液をホモジナイズした後、遠心瓶に入れ、遠心分離機（トミー精工社製、ＧＲＸ－２５０）を用い２００００×ｇの遠心力で２０分間遠心した。次いで、コラーゲン懸濁液中のコラーゲンが５重量％となるように上清を廃棄し、５重量％コラーゲンゲルを得た。
　５重量％コラーゲンゲルに、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）（和光純薬工業社製、Ａｐａｔｉｔｅ ＨＡＰ，ｍｏｎｏｃｌｉｎｉｃ）をＨＡとコラーゲンが重量比で６０：４０となるように加えた後、薬さじで混合した。これを円柱状の内部空間を有するプラスチック容器（内径８．５ｍｍ、容積約３．０ｃｍ３）または、直方体状の内部空間を有するプラスチック容器（１０ｍｍ×１０ｍｍ×５０ｍｍ）に入れて、２３０×ｇの遠心力で１分間遠心して脱泡した。
　容器を密閉し、－２０℃の冷凍庫に入れ凍結した。容器を開栓した後、凍結体を凍結乾燥機により乾燥（－１０℃、４８時間）させ成形した。次いで、これを減圧下、１５０℃で２４時間加熱し熱脱水架橋を行った。円柱体はメスで厚さ１５ｍｍに、直方体は、４ｍｍ×１０ｍｍ×３０ｍｍにカットした。最後に、電子線を照射（１５ｋＧｙ）し、滅菌を行った。このようにして、比較例４のＨＡ／コラーゲン複合体を得た。
　（比較例５）
　比較例５では、遠心濃縮により５重量％コラーゲンゲルを得た後、これを再度ホモジナイズし、同様に２００００×ｇの遠心力で２０分間遠心した。最後に、コラーゲン懸濁液中のコラーゲンが１０重量％となるように上清を廃棄し、１０重量％コラーゲンゲルを得た。１０重量％コラーゲンゲルに、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）（和光純薬工業社製、Ａｐａｔｉｔｅ ＨＡＰ，ｍｏｎｏｃｌｉｎｉｃ）をＨＡとコラーゲンが重量比で２０：８０となるように加えた後、薬さじで混合した。それ以外の点は、比較例４と同様にして、比較例５のＨＡ／コラーゲン複合体を得た。
　実施例１～３及び比較例１～５について、各実施例及び比較例でサンプルを３つ作成した。各サンプルに対して曲げ強度および圧縮強度の測定を行い、それらの平均値をそれぞれ求めた。なお、実施例における曲げ強度及び圧縮強度の測定は、具体的に下記の方法により行った。
　（曲げ強度測定）
温度：２５℃、湿度：６５％の環境下、図１に示す厚さ（ｈ）：４ｍｍ、幅（ｂ）：１０ｍｍ、長さ：３０ｍｍの直方体状試料を、リン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１４Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に３０分間浸漬した。その後、サンプル表面の水気を軽く拭い、精密万能試験機（オートグラフＡＧＳ－Ｊ、株式会社島津製作所製、ロードセル容量：１ｋＮ）を用いて、図２に示すように荷重を負荷した。得られた応力－ひずみ曲線より曲げ強度を求めた。
　具体的には、図２を参照して、サンプル１を支持台２１（支持台の半径Ｒ１＝５ｍｍ）にセットした後、半径Ｒ２＝５ｍｍの圧子を装着したクロスヘッド２２をサンプルが破断するまで１０ｍｍ／ｍｉｎの速度で下げた。なお、本試験において、「サンプルが破断した」とは、図３に示すように、応力－ひずみ曲線において荷重が急激に低下する点を意味する。
本発明における曲げ強度（σ）とは、サンプルの破断時荷重、サンプルの寸法および支点間距離とから、式４で表される。
　　σ＝３ＦＬ／２ｂｈ２　（式４）
　　　　σ：曲げ強度（Ｐａ）
　　　　Ｆ：破断時荷重（Ｎ）
Ｌ：支点間距離（ｍｍ）
ｂ：サンプルの幅（ｍｍ）
ｈ：サンプルの厚さ（ｍｍ）
　なお、本試験における支点間距離は、２０ｍｍであった。
　（圧縮強度測定）
　温度：２５℃、湿度：６５％の環境下、直径８．５ｍｍ、長さ１５ｍｍの円柱状試料をリン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１４Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に３０分間浸漬した。その後、試料表面の水気を軽く拭い、精密万能試験機（オートグラフＡＧＳ－Ｊ、株式会社島津製作所製、ロードセル容量：１ｋＮ）を用いて、図４に示すように単軸荷重を負荷した。そして、段階的に荷重を変化させたときにサンプルが崩壊する最小荷重を崩壊時荷重とした。
　具体的には、図４を参照して、サンプル２を試料台４１にセットした後、平型圧縮治具を装着したクロスヘッド４２を１０ｍｍ／ｍｉｎの速度で下げ、ロードセルが２．５Ｎを示した時にクロスヘッド４２を止めて荷重を解く。試料台のサンプルを観察し、崩壊していなければ、そのサンプルを試料台に戻して再びセットし、同様にロードセルが５Ｎを示すまでクロスヘッドを下げる。荷重を２．５Ｎずつ増加させて、この操作を繰り返し、初めてサンプルの崩壊を認めたときの荷重を崩壊時荷重とした。なお、本試験において、「サンプルの崩壊を認めた」とは、試料を肉眼で観察した時に明確な亀裂または剥がれが生じていることが確認されたことを意味する。
　本発明における圧縮強度は、上記崩壊時荷重とサンプルの断面積（円柱の厚さ方向に垂直な断面における断面積）とから、式５で表される。
　　Ｃｓ＝Ｆ／Ｓ　（式５）
　　　　Ｃｓ：圧縮強度（Ｐａ）
　　　　Ｆ　：崩壊時荷重（Ｎ）
　　　　Ｓ　：サンプルの断面積（ｍ２）
　なお、サンプルの断面積は、およそ（０．００４２５）２×３．１４＝５．６７×１０－５ｍ２であった。
　上記実施例および比較例についての曲げ強度および圧縮強度の測定結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示される結果から、実施例１～３のサンプル（多孔質複合体）は、曲げ強度が０．０５～０．１６ＭＰａかつ圧縮強度が０．３ＭＰａ以上であり、従来の多孔質複合体と比較し、加工性および取扱性に優れていた。
　比較例１および２のサンプルは、圧縮強度が０．３ＭＰａ以上で取扱性は十分であるが、コラーゲン線維化時のイオン強度が高いため、曲げ強度が０．１６ＭＰａより高くなっており、容易に加工することが困難であった。
　比較例３のサンプルは、曲げ強度が適度な値であり、容易な加工を達成することは可能であるが、ＯＣＰとコラーゲンの複合ゲル凍結の際に、冷凍機による緩慢な気相冷却を用いているため、圧縮強度が０．３ＭＰａ未満となり取扱性に劣る結果となった。
　比較例４および５のサンプルは、コラーゲン線維化時のイオン強度が高いため、曲げ強度が０．１６ＭＰａより高く、また、ＨＡとコラーゲンの複合ゲル凍結の際に、冷凍機による緩慢な気相冷却を用いているため、圧縮強度が０．３ＭＰａ未満となり加工性および取扱性に難があった。
（分解性測定）
　実施例１、実施例３、比較例１、比較例２の各サンプルについて、円柱体を厚さ約１０ｍｍにカットしたサンプルをコラゲナーゼ溶液に浸漬し、コラーゲンの可溶化タンパクの割合を測定して、多孔質複合体の生分解性を測定した。
　具体的には、実施例１、実施例３、比較例１、比較例２で作製した各サンプルについて、円柱体を厚さ約１０ｍｍにカットしたサンプルを、０．２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼタイプＩ溶液（和光純薬工業社製、１８０Ｕｎｉｔ／ｍｇ）に浸漬し、３７℃で７２時間静置した。コントロールとして、サンプルを浸漬しないコラゲナーゼ溶液のみからなるものを、３７℃７２時間静置した。その後、溶液中に含まれる可溶化したタンパク量を測定するため、ＢＣＡプロテインアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、Ｐｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ）を用い、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製、ｉＭａｒｋ）により５７０ｎｍの吸光度を測定して、上清タンパク量（μｇ）を定量した。なお、標準物質はウシ血清アルブミンを使用した。定量した上清タンパク量をサンプルに含まれるコラーゲン重量（ｍｇ）で除して、可溶化タンパク割合（％）を求めた。なお、コラーゲン重量は約１０ｍｍの円柱体重量に０．２３を乗じて求めた。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示される結果から、コラーゲン懸濁液のイオン強度と可溶化タンパク割合には正
の相関があり、イオン強度が高いほどコラゲナーゼによる分解を受け易い傾向があることが示された。多孔質複合体の分解性を抑制することで、骨欠損部に骨再生のための足場として長く留まることができ、より骨再生を促進する効果が期待される。
　今回開示された実施形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
　本発明の多孔質複合体及びそれを含む骨再生材料は、加工容易性と機械的強度を両立して優れた操作性を有し、かつ高い骨再生能を有することから、主に歯科口腔外科領域、整形外科領域における骨欠損修復に有用である。
　１　曲げ試験用サンプル
　２　圧縮試験用サンプル
　２１　支持台
　２２　圧子
　４１　試料台
　４２　クロスヘッド

Claims (8)

  1. 　第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含み、曲げ強度が０．０５～０．１６ＭＰａであり、圧縮強度が０．３ＭＰａ以上である多孔質複合体。
  2. 　気孔径が３～９０μｍである、請求項１に記載の多孔質複合体。
  3. 　コラーゲンがタイプＩ又はタイプＩとタイプＩＩＩの混合物である、請求項１又は２に記載の多孔質複合体。
  4. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の多孔質複合体を含む骨再生材料。
  5. 　第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含む多孔質複合体の製造方法であって、
    （１）コラーゲンを含む液体を、イオン強度が０．００５～０．０６であり、ｐＨが６．０～９．０となるよう調製し、コラーゲンを含むゲル、ゾル又は液体を調製する工程、及び
    （２）前記コラーゲンを含むゲル、ゾル又は液体と第８リン酸カルシウムを混合した懸濁液を得る工程、
    を含むことを特徴とする、多孔質複合体の製造方法。
  6. 　さらに、（３）前記懸濁液を液体冷媒に浸漬し急速凍結した後に、凍結乾燥する工程を含む、請求項５に記載の多孔質複合体の製造方法。
  7. 　第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含む多孔質複合体の製造方法であって、
    （１）コラーゲンを含む液体と第８リン酸カルシウムを混合した懸濁液を得る工程、及び
    （２）前記懸濁液を、イオン強度が０．００５～０．０６、ｐＨが６．０～９．０に調整する工程、
    を含むことを特徴とする、多孔質複合体の製造方法。
  8. 　さらに、（３）前記懸濁液を液体冷媒に浸漬し急速凍結した後に、凍結乾燥する工程を含む、請求項７に記載の多孔質複合体の製造方法。
     
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