WO2016084413A1 - 多孔質複合体、骨再生材料、および、多孔質複合体の製造方法 - Google Patents

多孔質複合体、骨再生材料、および、多孔質複合体の製造方法 Download PDF

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porous composite
collagen
ocp
bone regeneration
sample
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敦史 岩井
文彦 梶井
田中　秀典
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東洋紡株式会社
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    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Definitions

  • the present invention relates to a porous composite, a bone regeneration material, and a method for producing the porous composite.
  • Conventionally used bone regeneration materials include calcium phosphates such as hydroxyapatite (HA) (for example, Patent Document 2: JP 2010-273847 A, Patent Document 3: JP 2003-260124 A). Gazette, patent document 4: JP 2009-132601 A, patent document 5: JP 2005-279078 A).
  • HA hydroxyapatite
  • OCP octacalcium phosphate
  • HA HA
  • ⁇ -TCP ⁇ -tricalcium phosphate
  • Bone regeneration material is generally applied to irregular bone defects.
  • the bone regeneration material is required to have good operability when applied to the body or the like as well as the ability to promote bone regeneration.
  • the complex of OCP and collagen used for the bone regeneration material needs to be a porous body in order to function as a scaffold for osteoblasts for bone regeneration.
  • Such porous composites generally have low compressive strength and are liable to be damaged during handling, resulting in poor operability.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and a porous composite containing OCP and collagen having superior compressive strength than conventional ones, a bone regeneration material containing the same, and a method for producing a porous composite The purpose is to provide.
  • the bone regeneration material composed of a porous composite material achieves internal bone formation that promotes the formation of new bone by the introduction of osteoblasts into the porous body due to the porous body structure.
  • a certain pore size is required.
  • the larger the pore size the easier the osteoblasts enter the porous interior.
  • the inventors have found that the strength of the porous composite itself decreases as the pore size increases.
  • the porous composite has a constant pore diameter, so that osteoblasts can easily enter the inside, effectively functioning as a scaffold for bone regeneration, and have an appropriate strength.
  • the present inventors have found a porous composite that is easy to handle during clinical surgery and has excellent operability.
  • the present invention provides the following inventions.
  • Porous composite contains 8th calcium phosphate and collagen, has a pore diameter of 5 to 40 ⁇ m as measured with a mercury porosimeter, and a ratio of 71 to 200 ⁇ m pores in the whole pores of 200 ⁇ m or less is 8% or less.
  • a method for producing a porous composite containing eighth calcium phosphate and collagen A method for producing a porous composite comprising a step of immersing a gel, sol, or liquid containing eighth calcium phosphate and collagen in a liquid refrigerant and freezing.
  • the present invention it is possible to provide a porous composite containing OCP and collagen having superior compressive strength than the conventional one, a bone regeneration material containing the same, and a method for producing the porous composite. Since the porous composite of the present invention has a predetermined pore diameter, osteoblasts enter the inside and promote bone regeneration. In addition, by having an appropriate compressive strength, it has an excellent effect that it can be easily processed such as cutting in accordance with the shape of the bone defect portion with tweezers or the like at the time of surgery, etc., and is hardly damaged during handling. .
  • FIG. 2 is a graph showing a pore distribution curve in pore diameter measurement for Example 1.
  • FIG. It is a schematic diagram for demonstrating the measuring method of compressive strength.
  • 2 is an enlarged photograph of a cross section of the porous composite produced in Example 1 taken with an SEM.
  • 2 is an enlarged photograph of a cross section of a porous composite produced in Comparative Example 1 taken with an SEM.
  • 4 is a graph showing a comparison of pore distribution curves in the pore diameter measurement of Example 1 and Comparative Example 1.
  • the porous composite of the present invention is a porous composite (OCP / collagen composite) containing eighth calcium phosphate and collagen.
  • a preferred embodiment of the porous composite of the present invention is a porous structure in which collagen forms a sponge-like structure that is present in a three-dimensional manner as a fiber or film, and OCP exists as a granule in the sponge-like structure. It is a complex.
  • OCP (Ca 8 H 2 (PO 4 ) 6 ⁇ 5H 2 O) can be prepared by various known methods, for example, LeGeros' drop method (LeGeros RZ, Calcif Tissue Int 37: 194-197, 1985). Alternatively, it can be prepared by a method using a synthesizer (three-stream pipe) disclosed in JP-A-5-070113. Further, it can be prepared by a mixing method. Specifically, for example, an OCP can be obtained by mixing a sodium dihydrogen phosphate aqueous solution and a calcium acetate aqueous solution under appropriate conditions, and collecting the generated precipitate. Obtainable. The OCP obtained from the precipitate is preferably dried, pulverized using an electric mill or the like, and used as a particulate powder. The particle size is preferably in the range of 10 to 1000 ⁇ m, more preferably 300 to 500 ⁇ m.
  • the origin and properties of collagen are not particularly limited, and various collagens can be used.
  • an enzyme-solubilized collagen obtained by solubilization with a proteolytic enzyme (for example, pepsin, pronase, etc.) from which telopeptide is removed is used.
  • type of collagen type I, type II, type III and type IV collagen which are fibrous collagens are preferable, and type I collagen contained in a large amount in a living body or a mixture of type I and type III collagen is particularly preferable.
  • Collagen derived from skins, bones, tendons, etc. of pigs and cows can be preferably used. Since collagen is a biological component, it has the feature of high safety. In particular, enzyme-solubilized collagen is preferable because it has low allergenicity.
  • a commercial product may be used as the collagen.
  • the mixing ratio of OCP and collagen can be adjusted as appropriate according to the desired shape imparting property, operability, biocompatibility, and the like.
  • the blending ratio of OCP to 1 part by weight of collagen is preferably 0.5 to 35 parts by weight, more preferably 1 to 20 parts by weight, still more preferably 2 to 10 parts by weight. If the OCP is less than 0.5 with respect to collagen 1, the bone regeneration function of the obtained composite may be inferior, and if it exceeds 35, the shape imparting property may be deteriorated.
  • the pore diameter of the porous composite of the present invention is preferably 5 to 40 ⁇ m.
  • the compressive strength of the porous composite tends to decrease to less than 0.3 MPa.
  • the pore diameter is less than 5 ⁇ m, invasion of bone metabolic cells such as osteoblasts is difficult to occur, and the bone regeneration promoting action may be reduced.
  • the pore diameter of the porous composite of the present invention is more preferably 7 to 36 ⁇ m, still more preferably 10 to 20 ⁇ m.
  • the pore diameter is measured using a pore distribution measurement with a mercury porosimeter, and specifically, is measured by the following method. (Pore diameter measurement) As a pretreatment, the sample is dried at 120 ° C. for 4 hours. With respect to each sample after the pretreatment, a pore distribution with a pore diameter of 0.0018 to 200 ⁇ m is obtained under the following conditions by mercury porosimetry using the following measuring apparatus.
  • the pore diameter in the present invention is a value of the pore diameter showing the maximum value of the peak having the largest area in the pore distribution curve obtained from the measurement pressure by the mercury intrusion method.
  • the porous composite of the present invention is characterized in that, in the pore distribution measured by the mercury intrusion method, the ratio of pores having a size of 71 to 200 ⁇ m in the whole pores of 200 ⁇ m or less is 8% or less. And Preferably, it is 3 to 8%.
  • the pore ratio is expressed by the following equation using the cumulative pore volume and the total pore volume measured by a mercury porosimeter.
  • Porosity ratio (%) cumulative pore volume / total pore volume ⁇ 100
  • the porous composite of the present invention means that the pore distribution is relatively narrow and has a more uniform pore diameter. Thereby, while being able to provide a homogeneous cell scaffold throughout the porous composite, it is possible to impart uniform structural properties. Conventionally, it has been difficult to realize more uniform pores.
  • TANUMA Y. et al. TISUUE ENGINEERING: Part A, Volume 18, Numbers 5 and 6, 2012
  • the inventors have used TANUMA Y. et al.
  • the ratio of the pore diameter of 71 ⁇ m or more to the whole pores is about 9 to 15%, the pore distribution is wide, and there are relatively many large pore diameters. .
  • the porous composite of the present invention is excellent in compressive strength by having a pore diameter in the above range.
  • the compressive strength of the porous composite is preferably 0.3 MPa or more, more preferably 0.3 MPa or more and 3.0 MPa or less, and further preferably 0.3 MPa or more and 1.0 MPa or less.
  • the compressive strength is less than 0.3 MPa, the operability of the porous composite tends to decrease. That is, when the bone composite part is filled with the porous composite of the present invention, if the composite is collapsed or the pores are crushed, the subsequent bone regeneration is adversely affected.
  • the composite when a doctor performs a procedure of filling a porous composite without gaps using a jig to a bone defect having various shapes, the composite does not collapse or collapses the pores.
  • the index is a compressive strength of 0.3 MPa or more.
  • the upper limit is not particularly defined, but is preferably 3.0 MPa or less from the viewpoint of ease of operation when filling the bone defect.
  • the compressive strength in the present invention is measured by the following method.
  • Compressive strength measurement A cylindrical sample (sample) having a diameter of 9.0 mm and a height of 15 mm in an environment of temperature: 25 ° C. and humidity: 65% was subjected to phosphate buffered saline (10 mM sodium phosphate, 0.14 M sodium chloride, pH 7.4). ) For 30 minutes. Thereafter, water on the sample surface is wiped lightly, and a uniaxial load is applied in the vertical direction of the cylinder using a tensile / compression tester (load cell capacity: 1 kN). And the minimum load which a sample collapses when changing a load in steps is made into the load at the time of collapse.
  • a sample was confirmed to have collapsed means that a clear crack or peeling was confirmed when the sample was visually observed.
  • Visual observation can be performed by naked-eye observation, and when visual observation is difficult, a method of magnifying and photographing with a video camera or the like and visually observing with a monitor can be used.
  • the cross head (pressing jig) 22 is lowered at a speed of 10 mm / min, and the load cell shows 2.5N.
  • the head 22 is stopped and the load is released.
  • This operation is repeated by increasing the load by 2.5N, and the load when the sample collapse is recognized for the first time is defined as the collapse load.
  • Equation 1 The compressive strength in the present invention is expressed by Equation 1 from the collapse load and the cross-sectional area of the sample (cross-sectional area in a cross section perpendicular to the thickness direction of the cylinder).
  • Cs F / S (Formula 1)
  • the porosity (porosity) of the porous composite is preferably 80 to 98%, more preferably 85 to 95%. More preferably, it is 85 to 90%.
  • the shape of the porous composite of the present invention is preferably a rectangular parallelepiped (block body), a cylindrical body or a tablet, or a granule.
  • the size of the rectangular parallelepiped is preferably 5 mm ⁇ 5 mm ⁇ 5 mm or more, and generally the upper limit is preferably within a range of 100 mm ⁇ 100 mm ⁇ 100 mm.
  • a rectangular parallelepiped is not limited to a cube.
  • the diameter is preferably 5 to 50 mm, and the height is preferably in the range of 1 to 50 mm.
  • the shape is not limited to a sphere and may be an indeterminate shape, but the diameter is preferably 0.1 to 10 mm.
  • the porous composite of the present invention is used by filling a bone defect part.
  • the porous composite is cut as it is or in an appropriate shape. Can be compensated. If sufficient blood or the like is not found in the bone defect part or the porous complex cannot be compensated for in its original shape, the porous complex is immersed in blood or physiological saline so that the porous complex is sponge-like. It is possible to make up for the bone defect after confirming that the elasticity is high.
  • the manufacturing method of the porous composite of the present invention is preferably a manufacturing method in which OCP and collagen are mixed, and the following manufacturing method can be used.
  • OCP is added to a collagen solution whose concentration, pH, etc. are adjusted to a gelable range, and kneaded thoroughly to produce a mixture of OCP and collagen. To do.
  • the mixture is added to an appropriate mold, molded, frozen, and lyophilized to obtain a composite.
  • the obtained composite is subjected to thermal dehydration crosslinking treatment, and further sterilized by a conventional sterilization method (for example, ⁇ -ray irradiation, electron beam irradiation, ethylene oxide gas, etc.).
  • (C) A method of precipitating OCP on collagen to form a complex
  • An acidic collagen solution having an appropriate concentration is aseptically pH-treated with an appropriate buffer (eg, phosphate buffer, Tris buffer, sodium acetate buffer, etc.). Is adjusted to 5.5 to 7.5, and before the collagen gels, a calcium solution and a phosphate solution are added to precipitate OCP on the collagen. Then, after pouring into a mold where the pH is maintained from neutral to weakly alkaline, after giving the shape, gelation is performed at an appropriate temperature (for example, 37 ° C.), and then washing with water is repeated to remove salts such as buffer solutions. Then, a composite carrier is obtained, and lyophilized and sterilized in the same manner as described above.
  • an appropriate buffer eg, phosphate buffer, Tris buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • the OCP precipitation is based on the degree of supersaturation (ionic product / solubility product) determined by Ca 2+ , PO 4 3 ⁇ , pH, and the like. Therefore, the OCP can be precipitated by pouring the Ca 2+ solution and the PO 4 3 ⁇ solution into the collagen solution adjusted in pH under conditions that are supersaturated with respect to OCP. OCP spontaneously precipitates in the collagen gap or precipitates with the surface of the collagen fiber as a nucleus.
  • the method for producing a porous composite of the present invention preferably includes a step of immersing a gel, sol or liquid containing eighth calcium phosphate and collagen in a liquid refrigerant and freezing, followed by lyophilization.
  • immersing gel, sol or liquid in a liquid refrigerant and freezing means, for example, sealing a gel, sol or liquid container and then immersing the container in liquid refrigerant to A mode of freezing the liquid is also included.
  • the liquid refrigerant is a liquid having a temperature lower than the freezing temperature of a gel, sol or liquid containing eighth calcium phosphate and collagen, and examples thereof include methanol, ethanol, acetone, acetonitrile, and liquid nitrogen.
  • the temperature of the liquid refrigerant is preferably ⁇ 20 ° C. or lower, more preferably ⁇ 40 ° C. or lower, and further preferably ⁇ 80 ° C. or lower.
  • the pore diameter of the resulting porous composite can be reduced by rapidly freezing the gel, sol, or liquid containing the eighth calcium phosphate and collagen by immersing them in a liquid refrigerant.
  • a method of freezing with a ⁇ 20 ° C. freezer or a ⁇ 80 ° C. deep freezer has been widely known.
  • One feature of the present invention is that it can be produced not only at ⁇ 196 ° C. liquid nitrogen but also at a relatively high temperature such as ⁇ 40 ° C. and ⁇ 80 ° C. by using a liquid refrigerant. Has an excellent effect in that it is found that the temperature does not depend only on the temperature.
  • the porous composite of the present invention is preferably subjected to heat treatment.
  • heat treatment a part of the OCP molecular structure is broken, and the invasion of bone-forming cells is likely to occur. Bone regeneration is promoted and collagen is cross-linked to improve shape retention.
  • the temperature of the heat treatment is preferably 50 to 200 ° C, more preferably 60 to 180 ° C.
  • the heat treatment is preferably performed under reduced pressure conditions.
  • the pressure is preferably 0 to 3000 Pa, more preferably 0 to 300 Pa.
  • the treatment time for the heat treatment is preferably 0.1 to 10 days, more preferably 0.5 to 5 days.
  • the present invention further relates to a bone regeneration material containing the above porous composite.
  • the bone regeneration material can be used for bone defect repair in the field of dental and oral surgery, orthopedics, bone defect repair after craniotomy or thoracotomy, and the like.
  • bone replacement caused by periodontal disease, cyst cavity, atrophied alveolar ridge, jaw cleft, extraction fossa, etc.
  • An excellent bone regeneration effect can be confirmed after several weeks to several months.
  • bone regeneration caused by trauma such as bone defect after bone tumor resection and bone fracture can be compensated for in the bone defect part to promote bone regeneration.
  • the bone regeneration material may contain, in addition to OCP and collagen, for example, a bone-forming cytokine (such as bone-morphogenetic protein-2, transforming growth factor ⁇ 1, etc.). Playback speed can be increased.
  • a bone-forming cytokine such as bone-morphogenetic protein-2, transforming growth factor ⁇ 1, etc.
  • the bone regeneration material can contain a compounding ingredient conventionally used in this field.
  • a compounding ingredient conventionally used in this field.
  • examples of such ingredients include bioabsorbable polymers (polyglycolic acid, polylactic acid, polylactic acid-polyethylene glycol copolymer, etc.) and bioabsorbable calcium phosphates other than OCP ( ⁇ -TCP, etc.). .
  • Example 1 (1) Preparation of OCP First, 1 liquid and 2 liquids for OCP preparation were prepared as follows. [Part 1] 31.2 g of sodium dihydrogen phosphate dihydrate was dissolved in 2500 g of distilled water to prepare one part. [Second liquid] 35.2 g of calcium acetate monohydrate was dissolved in 2500 g of distilled water to prepare a second liquid.
  • the precipitate formed in the mixed solution was filtered and collected using a membrane filter (pore size 3 ⁇ m, manufactured by Advantech Toyo Co., Ltd., A300A293C).
  • the collected precipitate was dispersed in 1500 mL of distilled water, stirred for 15 minutes and washed. The same filtration and washing steps were repeated three more times.
  • the washed precipitate was dried at 30 ° C. for 24 hours using a constant temperature dryer.
  • the dried precipitate was pulverized with an electric mill and then classified into 300 to 500 ⁇ m using a sieve to obtain a powder.
  • the obtained powder was sterilized by dry heat at 120 ° C. for 2 hours.
  • the obtained OCP / collagen suspension was placed in a centrifuge bottle and centrifuged for 20 minutes at a centrifugal force of 7000 ⁇ g using a centrifuge (GRX-250, manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.).
  • a centrifuge GRX-250, manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.
  • the contents were mixed with a spoon for about 2 minutes to obtain an OCP / collagen composite gel.
  • the vessel was sealed and immersed in methanol cooled to ⁇ 80 ° C. in a large excess with respect to the volume of the object to be frozen and rapidly frozen.
  • the frozen body was dried ( ⁇ 10 ° C., 48 hours) with a freeze dryer and shaped. Subsequently, this was heated at 150 ° C. under reduced pressure for 24 hours to carry out thermal dehydration crosslinking, and then cut into a thickness of 1.5 mm or 15 mm with a knife. Finally, electron beam irradiation (15 kGy) was performed for sterilization.
  • the porous composite (OCP / collagen composite) of Example 1 was obtained.
  • Example 2 Example 3, Comparative Example 1 and Comparative Example 2
  • the object to be frozen was frozen using liquid nitrogen at -196 ° C.
  • Example 3 the object to be frozen was frozen using methanol cooled to ⁇ 40 ° C.
  • Comparative Example 1 the object to be frozen was frozen using a freezer set at ⁇ 80 ° C.
  • Comparative Example 2 the object to be frozen was frozen using a freezer set at ⁇ 20 ° C.
  • Example 2 porous composites (OCP / collagen composites) of Example 2, Example 3, Comparative Example 1 and Comparative Example 2 were obtained in the same manner as Example 1.
  • the pore diameter in the present invention is a value of the pore diameter showing the maximum value of the peak having the largest area in the pore distribution curve obtained from the measurement pressure by the mercury intrusion method.
  • the pore diameter of the pore diameter distribution curve (Log Differential Intrusion) shown in FIG. 1 is a radius
  • the pore diameter was measured for three samples prepared under the same conditions, and the average value of the pore diameters was obtained. Further, the ratio of pores of 71 ⁇ m to 200 ⁇ m in the entire pore diameter (pore diameter) distribution curve was determined. Table 1 shows the measurement results of the pore diameters for the above Examples and Comparative Examples. Moreover, the state of the pore diameter of Example 1 and Comparative Example 1 is shown in FIGS. 3 and 4 as a representative, and the comparison of the pore diameter distribution curves of Example 1 and Comparative Example 1 is shown in FIG.
  • the cross head (pressing jig) 22 is lowered at a speed of 10 mm / min, and the load cell shows 2.5N.
  • the head 22 is stopped and the load is released.
  • This operation was repeated by increasing the load by 2.5N, and the load when the sample collapsed for the first time was taken as the load at the time of collapse.
  • “disintegration of the sample was recognized” means that it was confirmed that a clear crack or peeling occurred when the sample was visually observed.
  • the compressive strength in the present invention is expressed by Equation 1 from the collapse load and the cross-sectional area of the sample (cross-sectional area in a cross section perpendicular to the thickness direction of the cylinder).
  • Cs F / S (Formula 1)
  • Table 1 shows the measurement results of compressive strength for the examples and comparative examples.
  • the samples of Examples 1 to 3 (porous composite) produced by immersing in a liquid refrigerant, which is a more rapid freezing method than the comparative example, have a pore diameter of 5 to 40 ⁇ m. It can be seen that the pore diameter is smaller than the comparative example. It can also be seen that the samples of Examples 1 to 3 having a pore diameter in the range of 5 to 40 ⁇ m have a high compressive strength of 0.3 MPa or more.
  • the samples of Examples 1 to 3 were 8% or less, while the comparative example was 14% or more, indicating a high ratio. This indicates that the samples of Examples 1 to 3 have a narrower pore size distribution and more uniform structural characteristics. In addition, the porosity of Example 1 was 89%, and the porosity of Comparative Example 1 was 92%.
  • porous composite of the present invention and the bone regeneration material containing the same have both excellent processability and mechanical strength and excellent operability, and have high bone regeneration ability, mainly dental and oral surgery It is useful for bone defect repair in the area and orthopedic area.

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Abstract

　従来よりも圧縮強度に優れたＯＣＰとコラーゲンとを含む多孔質複合体、それを含む骨再生材料、および、多孔質複合体の製造方法を提供する。第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含み、水銀ポロシメーターでの測定による気孔径が５～４０μｍであり、２００μｍ以下の気孔全体における７１～２００μｍの気孔の割合が８％以下であることを特徴とする多孔質複合体。

Description

多孔質複合体、骨再生材料、および、多孔質複合体の製造方法
　本発明は、多孔質複合体、骨再生材料、および、多孔質複合体の製造方法に関する。
　従来より使用されている骨再生材料としては、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）などのリン酸カルシウムが知られている（例えば、特許文献２：特開２０１０－２７３８４７号公報、特許文献３：特開２００３－２６０１２４号公報、特許文献４：特開２００９－１３２６０１号公報、特許文献５：特開２００５－２７９０７８号公報参照）。
　近年、ＨＡの前駆物質である第８リン酸カルシウム（Octacalcium  phosphate、以下、「ＯＣＰ」という）は、ＨＡやβ－第３リン酸カルシウム（β－ＴＣＰ）等の他のリン酸カルシウムに比して、骨再生の促進作用が高く、生体内での吸収性も高いことが分かってきた（例えば、特許文献１：特開２００６－１６７４４５号公報参照）。このようにＯＣＰは、リン酸カルシウムの中でも骨再生材料として特に優れた特性を有している。
　しかし、ＯＣＰは無機物であるために形状付与性に乏しい。このため、ＯＣＰ単独では、広範囲の骨欠損部の再生等への適用は難しい。そこで、ＯＣＰとコラーゲンとの複合体を骨再生材料として用いることが提案されている（例えば、特許文献１参照）。
特開２００６－１６７４４５号公報 特開２０１０－２７３８４７号公報 特開２００３－２６０１２４号公報 特開２００９－１３２６０１号公報 特開２００５－２７９０７８号公報
　骨再生材料は、一般に不定形の骨欠損に適用される。骨再生材料には、骨再生促進能は言うまでもなく、体内等への適用の際における良好な操作性が求められる。しかし、骨再生材料に用いられるＯＣＰとコラーゲンとの複合体は、骨再生のための骨芽細胞の足場として機能するために多孔質体である必要がある。このような多孔質複合体は、一般に圧縮強度が低く、取り扱い時に破損等が生じ易いため、操作性が悪いという問題点があった。
　本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、従来よりも圧縮強度に優れたＯＣＰとコラーゲンとを含む多孔質複合体、それを含む骨再生材料、および、多孔質複合体の製造方法を提供することを目的とする。
　多孔質複合体からなる骨再生材料は、多孔質体構造によって、多孔質内部に骨芽細胞が進入し、新生骨の形成を促進する内部骨形成を実現している。骨芽細胞が進入するためには一定の孔径が必要であり、一般に大きな孔径を有するほど多孔質内部に骨芽細胞が進入し易くなる。一方、発明者らは孔径が大きくなると多孔質複合体自体の強度が弱くなることを見出した。そこで、発明者らが鋭意検討した結果、多孔質複合体が一定の孔径を有することにより内部に骨芽細胞が進入しやすく、骨再生の足場として有効に機能すると共に、適度な強度を有し、臨床手術等の際に取り扱い易く、操作性に優れた多孔質複合体を見出した。本発明は以下に代表される発明を提供する。
　（１）　第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含み、水銀ポロシメーターでの測定による気孔径が５～４０μｍであり、２００μｍ以下の気孔全体における７１～２００μｍの気孔の割合が８％以下であることを特徴とする多孔質複合体。
　（２）　（１）に記載の多孔質複合体を含む骨再生材料。
　（３）　第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含む多孔質複合体の製造方法であって、
　第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含むゲル、ゾルまたは液体を液体冷媒に浸漬し凍結する工程を含むことを特徴とする、多孔質複合体の製造方法。
　（４）　（３）に記載の製造方法によって得られる、第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含む多孔質複合体。
　本発明によれば、従来よりも圧縮強度に優れたＯＣＰとコラーゲンとを含む多孔質複合体、それを含む骨再生材料、および、多孔質複合体の製造方法を提供することができる。本発明の多孔質複合体は、所定の気孔径を有することにより骨芽細胞が内部に進入し、骨再生を促進する。また、適度な圧縮強度を有することにより、手術等の際にピンセット等で骨欠損部の形状に合わせて切断等の加工が容易にでき、かつ取り扱い時に破損等が生じにくいという優れた効果を有する。
実施例１についての気孔径測定における細孔分布曲線を示すグラフである。 圧縮強度の測定方法を説明するための模式図である。 実施例１で作製した多孔質複合体の断面をＳＥＭで撮影した拡大写真である。 比較例１で作製した多孔質複合体の断面をＳＥＭで撮影した拡大写真である。 実施例１と比較例１の気孔径測定における細孔分布曲線の比較を示すグラフである。
［多孔質複合体］
　本発明の多孔質複合体は、第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含む多孔質の複合体（ＯＣＰ／コラーゲン複合体）である。本発明の多孔質複合体の好ましい態様は、コラーゲンが線維状またはフィルム状として３次元にランダムに存在するスポンジ状構造を形成し、ＯＣＰが該スポンジ状構造中に顆粒として存在している多孔質複合体である。
　ＯＣＰ（Ｃａ8Ｈ2（ＰＯ4）6・５Ｈ2Ｏ）は、種々公知の方法によって調製することができ、例えば、LeGerosの滴下法（LeGeros  RZ，Calcif　Tissue　Int  37：194-197，1985）や特開平５－０７０１１３号公報に開示される合成装置（三流管）を使用した方法などによって調製することができる。また、混合法によって調製することができ、具体的には、例えば、リン酸二水素ナトリウム水溶液と、酢酸カルシウム水溶液を適切な条件下で混合し、生成した沈殿物を回収することにより、ＯＣＰを得ることができる。沈殿物から得られたＯＣＰは、乾燥させ、電動ミル等を用い粉砕し、粒子状の粉体にして用いることが好ましい。粒径は１０～１０００μｍの範囲であることが好ましく、更に好ましくは３００～５００μｍに調製することが好ましい。
　コラーゲンとしては、その由来、性状などは特に限定されず、種々のコラーゲンを使用することができる。好ましくは、蛋白分解酵素（例えばペプシン、プロナーゼ等）で可溶化することにより得られ、テロペプチドが除去されている酵素可溶化コラーゲンが使用される。コラーゲンのタイプとしては、繊維性コラーゲンであるＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型コラーゲンが好ましく、生体内に大量に含まれるＩ型コラーゲン、又はＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの混合物が特に好ましい。原料としては、特に限定されないが、豚、牛などの皮膚、骨、腱などに由来するコラーゲンを好ましく用いることができる。コラーゲンは生体由来成分であるので、安全性が高いという特長を有し、特に酵素可溶化コラーゲンはアレルゲン性も低く好ましい。上記のコラーゲンとしては、市販の製品を使用してもよい。
　本発明の多孔質複合体において、ＯＣＰとコラーゲンの配合比は、所望する形状付与性、操作性、生体親和性などに応じて適宜調整することができる。コラーゲン１重量部に対するＯＣＰの配合比は、好ましくは０．５～３５重量部、より好ましくは１～２０重量部、更に好ましくは２～１０重量部である。コラーゲン１に対してＯＣＰが０．５未満であると、得られた複合体の骨再生機能が劣るおそれがあり、また３５を超えると形状付与性が低下するおそれがある。
　本発明の多孔質複合体の気孔径は、５～４０μｍであることが好ましい。気孔径が４０μｍを超える場合、多孔質複合体の圧縮強度が０．３ＭＰａ未満に低下する傾向がある。一方、気孔径が５μｍ未満である場合、骨芽細胞等の骨代謝系細胞の侵入が起こり難くなり、骨再生の促進作用が低下する恐れがある。
　本発明の多孔質複合体の気孔径は、より好ましくは７～３６μｍであり、更に好ましくは１０～２０μｍである。
　気孔径は水銀ポロシメーター（Mercury  porosimeter)による細孔分布測定を用いて測定し、具体的には以下の方法により測定される。
（気孔径測定）
　前処理として、サンプルを１２０℃で４時間恒温乾燥する。前処理後の各サンプルについて、以下の測定装置を用いた水銀圧入法により、以下の条件で細孔径０．００１８～２００μｍの細孔分布を求める。
測定装置：オートポアＩＶ９５２０（ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）
測定条件：サンプルと水銀の接触角：１４０ｄｅｇ
　　　　　水銀の表面張力：０．４８Ｎ／ｍ（１ｄｙｎｅ＝１０－５Ｎで換算）
　本発明における気孔径とは、水銀圧入法による測定圧力から得られた細孔分布曲線において、最も大きな面積を有するピークの極大値を示す細孔径の値である。
　さらに、本発明の多孔質複合体は、上記水銀圧入法により測定された細孔分布において、２００μｍ以下の気孔全体に占める７１～２００μｍの大きさの気孔の割合が８％以下であることを特徴とする。好ましくは３～８％である。
　気孔割合は水銀ポロシメーターにより測定された累積細孔容積および全細孔容積とを用いて下式で表される。
　　気孔割合（％）＝　累積細孔容積／全細孔容積×１００
　本発明の多孔質複合体は気孔の分布が比較的狭く、より均一な気孔径を有することを意味している。これにより、多孔質複合体全体にわたって均質な細胞足場を提供することができるとともに、均一な構造的特性を付与することができる。従来、より均一な細孔を実現することは困難であった。例えば、TANUMA　Y.　et　al．（TISUUE　ENGINEERING：Part　A，Volume　18，Numbers  5　and  6，2012）には、ＯＣＰとコラーゲンからなる複合体であって気孔径が３０μｍ以下である複合体が記載されている。しかしながら、本発明者らがTANUMA　Y.　et　al．に記載された細孔分布曲線を解析した結果、気孔全体に占める７１μｍ以上の気孔径の割合は約９～１５％であり、細孔分布が広く、大きな気孔径が比較的多く存在している。
　本発明の多孔質複合体は前記範囲の気孔径を有することにより、圧縮強度に優れる。多孔質複合体の圧縮強度は、好ましくは０．３ＭＰａ以上であり、より好ましくは０．３ＭＰａ以上３．０ＭＰａ以下であり、更に好ましくは０．３ＭＰａ以上１．０ＭＰａ以下である。圧縮強度が０．３ＭＰａ未満である場合、多孔質複合体の操作性が低下する傾向がある。すなわち、本発明の多孔質複合体を骨欠損部に充填する際に、前記複合体が崩壊してしまったり、気孔が潰れてしまったりすると、その後の骨再生に悪影響を与えることになる。具体的には、さまざまな形状を有する骨欠損部に、医師が冶具を用いて多孔質複合体を隙間なく充填する施術を行う際に、前記複合体の崩壊や気孔潰れが生じないことを示す指標が圧縮強度０．３ＭＰａ以上である。上限は特に定められるものではないが、骨欠損部への充填の際の操作容易性の観点から、３．０ＭＰａ以下であることが好ましい。
　本発明における圧縮強度は下記の方法により測定される。
　（圧縮強度測定）
　温度：２５℃、湿度：６５％の環境下、直径９．０ｍｍ、高さ１５ｍｍの円柱状試料（サンプル）をリン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１４Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に３０分間浸漬する。その後、サンプル表面の水気を軽く拭い、引張・圧縮試験機（ロードセル容量：１ｋＮ）を用いて、円柱の上下方向に単軸荷重を負荷する。そして、段階的に荷重を変化させたときにサンプルが崩壊する最小荷重を崩壊時荷重とする。「サンプルの崩壊を認めた」とは、試料を目視で観察した時に明確な亀裂または剥がれが生じていることが確認されたことを意味する。目視は肉眼観察で行うことができ、肉眼観察が困難な場合はビデオカメラ等で拡大撮影してモニターで目視により観察する方法を用いることもできる。
　具体的には、図２を参照して、サンプル１を試料台２１にセットした後、クロスヘッド（押圧治具）２２を１０ｍｍ／ｍｉｎの速度で下げ、ロードセルが２．５Ｎを示した時にクロスヘッド２２を止めて荷重を解く。試料台のサンプルを観察し、崩壊していなければ、そのサンプルを試料台に戻して再びセットし、同様にロードセルが５Ｎを示すまでクロスヘッドを下げる。荷重を２．５Ｎずつ増加させて、この操作を繰り返し、初めてサンプルの崩壊を認めたときの荷重を崩壊時荷重とする。
　本発明における圧縮強度は、上記崩壊時荷重とサンプルの断面積（円柱の厚さ方向に垂直な断面における断面積）とから、式１で表される。
　　Ｃｓ＝Ｆ／Ｓ　・・・（式１）
　　　　Ｃｓ：圧縮強度（Ｐａ）
　　　　Ｆ　：崩壊時荷重（Ｎ）
　　　　Ｓ　：サンプルの断面積（ｍ2）
　多孔質複合体の気孔率（空隙率）は８０～９８％であることが好ましく、より好ましくは８５～９５％である。更に好ましくは８５～９０％である。気孔率は水銀圧入法による全細孔容積と見かけ密度を用いて下記の式２により求められる。
気孔率（％）＝全細孔容積／｛（１／見かけ密度）＋全細孔容積｝×100  （式２）
　本発明の多孔質複合体の形状は、直方体（ブロック体）、円筒体もしくはタブレット状、又は顆粒であることが好ましい。直方体である場合の大きさは５ｍｍ×５ｍｍ×５ｍｍ以上の大きさが好ましく、一般に上限は１００ｍｍ×１００ｍｍ×１００ｍｍ以内の範囲であることが好ましい。直方体は立方体に限られない。円筒状である場合の大きさは、直径が５～５０ｍｍであることが好ましく、高さは１～５０ｍｍの範囲であることが好ましい。顆粒状である場合、形状は球体に限られず不定形でもよいが、直径が０．１～１０ｍｍであることが好ましい。
　本発明の多孔質複合体は骨欠損部に補填することにより使用されるが、骨欠損部に十分な血液もしくは体液が認められる場合には、多孔質複合体をそのまま、もしくは適当な形状に切断し補填することができる。骨欠損部に十分な血液等が認められない、又は多孔質複合体を元の形状で補填できない場合は、多孔質複合体を血液もしくは生理食塩水等に浸漬し、多孔質複合体がスポンジ状の弾力性を示すことを確認した上で骨欠損部に補填することができる。
［多孔質複合体の製造方法］
　本発明の多孔質複合体の製造方法は、ＯＣＰとコラーゲンとを混合する製造方法が好ましく、下記のような製造方法を用いることができる。
　（ａ）ＯＣＰとコラーゲンとを混合して複合化する方法
　まず、濃度、ｐＨ等をゲル化し得る範囲に調整されたコラーゲン溶液にＯＣＰを添加し、十分に混練してＯＣＰとコラーゲンの混合物を作製する。次いで、当該混合物を適当な型に加えて成型し、凍結し、凍結乾燥することにより複合体を得る。得られた当該複合体は、熱脱水架橋処理を施し、更に、慣用の滅菌法（例えば、γ線照射、電子線照射、エチレンオキサイドガス等）により滅菌する。
　（ｂ）ＯＣＰ懸濁液を混合して複合化する方法
　適当な濃度のコラーゲン酸性溶液を、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）で無菌的にｐＨ５．５～７．５に調整し、コラーゲンがゲル化する前にＯＣＰを添加して、コラーゲンとＯＣＰの懸濁液を調製する。その後、ｐＨを中性から弱アルカリ性に保持した状態で型に流し込み、形状を付与した後、適当な温度（例えば３７℃）でゲル化させ、水洗浄を繰り返して緩衝液の塩などを除去して複合担体とし、上記と同様に凍結乾燥および滅菌処理する。
　（ｃ）ＯＣＰをコラーゲンに析出させて複合化する方法
　適当な濃度のコラーゲン酸性溶液を、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）で無菌的にｐＨを５．５～７．５に調整し、コラーゲンがゲル化する前に、カルシウム溶液およびリン酸溶液を添加してコラーゲン上にＯＣＰを析出させる。その後、ｐＨを中性から弱アルカリ性に保持したところで型に流し込んで、形状を付与した後、適当な温度（例えば３７℃）でゲル化した後、水洗浄を繰り返して緩衝液などの塩を除去して複合担体とし、上記と同様に凍結乾燥および滅菌処理する。
　なお、ＯＣＰの析出は、Ｃａ2+，ＰＯ4 3-，ｐＨなどにより決まる過飽和度（イオン積／溶解度積）に基づく。このため、ＯＣＰに関して過飽和となる条件でＣａ2+溶液およびＰＯ4 3-溶液を、ｐＨを調節したコラーゲン溶液に注加してＯＣＰを析出させることができる。ＯＣＰは、コラーゲン間隙に自発的に析出するか、又はコラーゲン線維の表面を核として析出する。
　本発明の多孔質複合体の製造方法は、第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含むゲル、ゾルまたは液体を液体冷媒に浸漬し凍結した後、凍結乾燥する工程を含むことが好ましい。なお、「ゲル、ゾルまたは液体を液体冷媒に浸漬し凍結し」とは、例えば、ゲル、ゾルまたは液体が収容された容器を密閉した後に該容器を液体冷媒に浸漬して、ゲル、ゾルまたは液体を凍結させる態様も含んでいる。
　液体冷媒は、第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含むゲル、ゾルまたは液体の凍結温度より低い温度の液体であり、例えば、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、液体窒素が挙げられる。該液体冷媒の温度は、好ましくは－２０℃以下であり、より好ましくは－４０℃以下であり、さらに好ましくは－８０℃以下である。
　第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含むゲル、ゾルまたは液体を液体冷媒に浸漬することによって急速に凍結させることにより、得られる多孔質複合体の気孔径を小さくすることができると考えられる。従来、－２０℃のフリーザーや－８０℃のディープフリーザーで凍結する方法が広く知られてきた。本発明は、液体冷媒を使用することにより、－１９６℃の液体窒素のみならず、－４０℃や－８０℃等の比較的高い温度でも作製できることが特徴の一つであり、気孔径の大きさが温度だけに依存しないことを見出した点で優れた効果を有する。
　本発明の多孔質複合体は、熱処理が施されていることが好ましい。熱処理により、ＯＣＰ分子構造の一部が崩れて骨形成系細胞の侵入が起こり易くなり、骨再生が促進されると共に、コラーゲンが架橋して形状保持力が向上する。
　熱処理の温度は、好ましくは５０～２００℃、より好ましくは６０～１８０℃である。また、熱処理は、減圧条件下で行うことが好ましい。圧力は、好ましくは０～３０００Ｐａ、より好ましくは０～３００Ｐａである。熱処理の処理時間は、好ましくは０．１～１０日、より好ましくは０．５～５日である。
［骨再生材料］
　本発明は、さらに上記の多孔質複合体を含む骨再生材料に関する。骨再生材料は歯科口腔外科領域、整形外科領域における骨欠損修復、開頭または開胸術後の骨欠損修復などに用いることができる。例えば、歯科口腔外科領域においては、歯周病、嚢胞腔、萎縮歯槽堤、顎裂部、抜歯窩等により生じた骨欠損に対し、多孔質複合体からなる骨再生材料を補填することにより、数週間から数ヶ月後には優れた骨再生効果が確認できる。整形外科領域においては、例えば骨腫瘍切除後の骨欠損、骨折等外傷により生じた骨欠損に対し、本骨再生材料を骨欠損部に補填し、骨再生を促進することができる。
　骨再生材料は、ＯＣＰおよびコラーゲンの他に、例えば、骨形成能を有するサイトカイン(bone  morphogenetic　protein-2、transforming　growth　factor　β１など)を含有していてもよく、係るサイトカインを含有させることにより、骨再生速度を速めることができる。
　骨再生材料は、それ以外にも、この分野で慣用の配合成分を含ませることができる。かかる配合成分としては、例えば、生体吸収性高分子（ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ乳酸－ポリエチレングリコール共重合体等）、ＯＣＰ以外の生体吸収性リン酸カルシウム（β－ＴＣＰ等）を挙げることができる。
　以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　（実施例１）
　（１）ＯＣＰの調製
　まず、ＯＣＰ調製用の１液および２液を次の通り調製した。
［１液］　リン酸二水素ナトリウム二水和物３１．２ｇを蒸留水２５００ｇに溶解し、１液を調製した。
［２液］　酢酸カルシウム一水和物３５．２ｇを蒸留水２５００ｇに溶解し、２液を調製した。
　次に、１液をセパラブルフラスコに入れ、マントルヒーターにて７０℃に昇温した。次に、撹拌機（東京理化器械社製、ＭＡＺＥＬＡ　Ｚ）に撹拌翼（羽径１２ｃｍ）を取り付け、２５０ｒｐｍの速度で撹拌しながら、１液に対して２液を約２８ｍＬ／ｍｉｎの速度で滴下した。滴下終了後、１液と２液の混合液を７０℃、２５０ｒｐｍでさらに２時間撹拌した。
　次に、上記混合液中に生成した沈殿物をメンブレンフィルター（孔径３μｍ、アドバンテック東洋社製、Ａ３００Ａ２９３Ｃ）を用いてろ過し、回収した。回収した沈殿物を蒸留水１５００ｍＬに分散させ、１５分間撹拌し洗浄した。同様のろ過、洗浄の工程をさらに３回繰り返した。
　次に、洗浄後の沈殿物を、恒温乾燥機を用いて３０℃で２４時間乾燥した。乾燥後の沈殿物を電動ミルにて粉砕した後、ふるいを用いて粒径を３００～５００μｍに分級し、粉体を得た。最後に、得られた粉体に対して１２０℃で２時間の乾熱滅菌を行った。
　（２）ＯＣＰ／コラーゲン複合体（多孔質複合体）の調製
　Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンを含むブタ真皮由来コラーゲン（日本ハム社製、ＮＭＰコラーゲンＰＳ）１重量部を４℃に冷却した蒸留水２００重量部に溶解し、約０．５重量％のコラーゲン溶液を得た。液温を４℃に保ちながらコラーゲン水溶液に水酸化ナトリウム水溶液を加え、ｐＨを約７．４に調整しコラーゲン懸濁液を得た。次いで、コラーゲン懸濁液にＯＣＰ（粒径３００～５００μｍ）をコラーゲンとＯＣＰが重量比で７７：２３となるように加えた後、室温でさらに撹拌しＯＣＰ／コラーゲン懸濁液を得た。
　次に、得られたＯＣＰ／コラーゲン懸濁液を遠心瓶に入れ、遠心分離機（トミー精工社製、ＧＲＸ－２５０）を用い７０００×ｇの遠心力で２０分間遠心した。次いで、ＯＣＰ／コラーゲン懸濁液中のコラーゲンが３重量％となるように上清を廃棄した後、内容物を薬さじで約２分間混合し、ＯＣＰ／コラーゲン複合ゲルを得た。これを円柱状の内部空間を有するプラスチック容器（内径８．５ｍｍ、容積約３．０ｃｍ3）に入れて、２３０×ｇの遠心力で１分間遠心して脱泡した。
　容器を密閉し、被凍結体の容積に対して大過剰の－８０℃に冷却したメタノールに浸漬して急速に凍結した。容器を開栓した後、凍結体を凍結乾燥機により乾燥（－１０℃、４８時間）させ成形した。次いで、これを減圧下、１５０℃で２４時間加熱し熱脱水架橋を行った後、メスで厚さ１．５ｍｍまたは１５ｍｍにカットした。最後に、電子線を照射（１５ｋＧｙ）し、滅菌を行った。このようにして、実施例１の多孔質複合体（ＯＣＰ／コラーゲン複合体）を得た。
　（実施例２、実施例３、比較例１および比較例２）
　実施例２では、被凍結体の凍結を－１９６℃の液体窒素を用いて行った。実施例３では、被凍結体の凍結を－４０℃に冷却したメタノールを用いて行った。比較例１では、被凍結体の凍結を－８０℃に設定した冷凍庫を用いて行った。比較例２では、被凍結体の凍結を－２０℃に設定した冷凍庫を用いて行った。
　それ以外の点は、実施例１と同様にして、実施例２、実施例３、比較例１および比較例２の多孔質複合体（ＯＣＰ／コラーゲン複合体）を得た。
　（気孔径測定）
　上記実施例１～３並びに比較例１および２で得られた直径８．５ｍｍ、厚さ１．５ｍｍの円柱状（タブレット状）のサンプルについて、気孔径を以下のようにして測定した。
　前処理として、サンプルを１２０℃で４時間恒温乾燥した。前処理後の各サンプルについて、以下の測定装置を用いた水銀圧入法により、以下の条件で細孔径０．００１８～１００μｍの細孔分布を求めた。得られた細孔分布曲線を図１に示す。
測定装置：オートポアＩＶ９５２０（ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）
測定条件：サンプルと水銀の接触角：１４０ｄｅｇ
　　　　　水銀の表面張力０．４８Ｎ／ｍ（１ｄｙｎｅ＝１０-5Ｎで換算）
　細孔径は、下記のＷａｓｈｂｕｒｎの式を用いて算出した。
　　Ｗａｓｈｂｕｒｎの式：　ＰＤ=－４σｃｏｓθ
　　　　Ｐ：圧力（Ｐａ）
　　　　σ：水銀の表面張力（Ｎ／ｍ）
　　　　Ｄ：細孔直径（ｍ）
　　　　θ：水銀と試料との接触角（ｄｅｇ）
　なお、本発明における気孔径とは、水銀圧入法による測定圧力から得られた細孔分布曲線において、最も大きな面積を有するピークの極大値を示す細孔径の値である。ただし、図１に示される孔径分布曲線（Log  Differential  Intrusion）の細孔径は半径であるため、実施例１のサンプルの気孔径は、７．５×２＝１５μｍである。
　（気孔割合）
　気孔割合は水銀ポロシメーターにより測定された累積細孔容積および全細孔容積から下記式を用いて算出した。
　　気孔割合（％）＝　累積細孔容積／全細孔容積×１００
　例えば、実施例１の場合、７１μｍを超える範囲の累積細孔容積は０．２０３ｍ／ｇであり、全細孔容積は６．２２ｍL／ｇであった。したがって、７１μｍを超える気孔の割合は０．２０３／６．２２×１００＝３．２％であった。
　また、同一条件で作製したサンプル３つに対して気孔径の測定を行い、気孔径の平均値を求めた。また、孔径（細孔直径）分布曲線全体における７１μｍ～２００μｍの気孔の割合を求めた。上記実施例および比較例についての気孔径の測定結果を表１に示す。また、代表として実施例１と比較例１の気孔径の様子を図３および図４に示し、実施例１と比較例１の孔径分布曲線の比較を図５に示す。
　（圧縮強度測定）
　温度：２５℃、湿度：６５％の環境下、直径９．０ｍｍ、高さ１５ｍｍの円柱状試料（サンプル）をリン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１４Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に３０分間浸漬した。その後、試料表面の水気を軽く拭い、精密万能試験機（オートグラフＡＧＳ－Ｊ、株式会社島津製作所製、ロードセル容量：１ｋＮ）を用いて、図２に示すように単軸荷重を負荷した。そして、段階的に荷重を変化させたときに試料が崩壊する最小荷重を崩壊時荷重とした。
　具体的には、図２を参照して、サンプル１を試料台２１にセットした後、クロスヘッド（押圧治具）２２を１０ｍｍ／ｍｉｎの速度で下げ、ロードセルが２．５Ｎを示した時にクロスヘッド２２を止めて荷重を解く。試料台のサンプルを観察し、崩壊していなければ、そのサンプルを試料台に戻して再びセットし、同様にロードセルが５Ｎを示すまでクロスヘッドを下げる。荷重を２．５Ｎずつ増加させて、この操作を繰り返し、初めてサンプルの崩壊を認めたときの荷重を崩壊時荷重とした。なお、本試験において、「サンプルの崩壊を認めた」とは、試料を目視で観察した時に明確な亀裂または剥がれが生じていることが確認されたことを意味する。
　本発明における圧縮強度は、上記崩壊時荷重とサンプルの断面積（円柱の厚さ方向に垂直な断面における断面積）とから、式１で表される。
　　Ｃｓ＝Ｆ／Ｓ　・・・（式１）
　　　　Ｃｓ：圧縮強度（Ｐａ）
　　　　Ｆ　：崩壊時荷重（Ｎ）
　　　　Ｓ　：サンプルの断面積（ｍ2）
　なお、サンプルの断面積は、およそ（０．００４５）2×３．１４＝６．３６×１０-5ｍ2であった。
　また、同一条件で作製したサンプル３つに対して圧縮強度の測定を行い、圧縮強度の平均値を求めた。上記実施例および比較例についての圧縮強度の測定結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示される結果から、比較例よりも急速な凍結方法である液体冷媒に浸漬することによって作製された実施例１～３のサンプル（多孔質複合体）は、気孔径が５～４０μｍの範囲内となっており、比較例よりも気孔径が小さくなっていることが分かる。また、気孔径が５～４０μｍの範囲内にある実施例１～３のサンプルは、０．３ＭＰａ以上の高い圧縮強度を有することが分かる。
　７１μｍ以上の気孔割合については、実施例１～３のサンプルは８％以下であったのに対し、比較例では１４％以上となり高い割合を示した。このことから、実施例１～３のサンプルは気孔径の分布が狭く、より均一な構造的特性を有していることが示された。なお、実施例１の気孔率は８９％であり、比較例１の気孔率は９２％であった。
　今回開示された実施形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
　本発明の多孔質複合体およびそれを含む骨再生材料は、加工容易性と機械的強度を両立して優れた操作性を有し、かつ高い骨再生能を有することから、主に歯科口腔外科領域、整形外科領域における骨欠損修復に有用である。
　１　サンプル、２１　試料台、２２　クロスヘッド。

Claims (4)

  1. 　第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含み、水銀ポロシメーターでの測定による気孔径が５～４０μｍであり、２００μｍ以下の気孔全体における７１～２００μｍの気孔の割合が８％以下であることを特徴とする多孔質複合体。
  2. 　請求項１に記載の多孔質複合体を含む骨再生材料。
  3. 　第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含む多孔質複合体の製造方法であって、
    　第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含むゲル、ゾルまたは液体を液体冷媒に浸漬し凍結する工程を含むことを特徴とする、多孔質複合体の製造方法。
  4. 　請求項３に記載の製造方法によって得られる、第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含む多孔質複合体。
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