JP7158847B2 - 骨補填材および骨補填材の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、骨補填材および骨補填材の製造方法に関するものである。

従来、リン酸カルシウムとコラーゲンの複合材からなり、コラーゲンに架橋が導入された生体吸収性の骨補填材が知られている（例えば、特許文献１参照。）。骨補填材を体内に移植して新生骨の形成を期待するとき、骨補填材の生体内での安定性が重要となる。すなわち、移植後の骨補填材の吸収および分解が速過ぎる場合、骨補填材は、新生骨形成の促進等の機能を、期待される新生骨形成が達成されるまで発揮し続けることができない。

特許文献１では、コラーゲン中のアミノ基に架橋を導入することで、骨補填材の生体内での分解速度を制御して骨補填材の安定性の向上を図っている。コラーゲンの熱脱水架橋は、安全性が高い架橋処理として知られるものの、酵素分解、加水分解等の影響を受けやすく、生体内での安定性が懸念される。一方、グルタルアルデヒド、エポキシ系化合物、カルボジイミド化合物のような化学架橋剤を使用する化学架橋は、熱脱水架橋に比べて骨補填材の生体内での安定性をより向上することができる。

特開２００３－２６０１２４号公報

骨補填材には、生体内での安定性に加えて柔軟性および骨形成能が要求される。骨補填材の柔軟性および骨形成能はリン酸カルシウムとコラーゲンとの比率によって影響されるが、特許文献１では、コラーゲンとリン酸カルシウムとの比率と、柔軟性および骨形成能との関係について考慮されていないという問題がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、良好な柔軟性および骨形成能を有し、かつ、生体内で高い安定性を有する骨補填材およびその製造方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、リン酸カルシウムとコラーゲンとを８０：２０よりも大きく９６．８：３．２以下の質量比で含み、前記コラーゲンが、線維化されており、線維化された前記コラーゲンが、化学架橋されている骨補填材である。
骨補填材の柔軟性および骨形成能は、リン酸カルシウムとコラーゲンとの質量比によって影響される。すなわち、コラーゲンに対してリン酸カルシウムが少な過ぎる場合には、期待される骨形成能を得ることが難しい。一方、コラーゲンに対してリン酸カルシウムが多過ぎる場合には、骨補填材の柔軟性が低下して移植時の操作性が悪くなるとともに骨補填材が脆くなる。

本態様によれば、リン酸カルシウムとコラーゲンとの質量比が８０：２０よりも大きく９６．８：３．２以下に規定されているので、良好な柔軟性を有しつつ、生体内で良好な骨形成能を発揮することができる。また、コラーゲンが化学架橋されているので、生体内においてコラゲナーゼ等の酵素によるコラーゲンの分解が抑制され高い安定性を発揮することができる。

上記態様においては、コラゲナーゼによる分解反応によって産生されるペプチドおよび生体温度で緩衝液中に溶出するタンパク質の総量の濃度が、１００μｇ／ｍＬ以下であることが好ましい。
このようにすることで、生体内での酵素耐性および安定性をさらに向上することができる。

上記態様においては、前記リン酸カルシウムが、１００μｍ以上の最頻径を有する顆粒であることが好ましい。
生体内でのマクロファージによるリン酸カルシウムの貪食および分解の速度は、リン酸カルシウムの粒子径に依存する。最頻径が１００μｍ以上であるリン酸カルシウムの顆粒を使用することで、期待される新生骨形成が達成されるまでリン酸カルシウムが移植部位に残存することができる。１００μｍ未満のリン酸カルシウムの顆粒は、マクロファージによる貪食および分解を受け易いため、期待される新生骨形成が達成されるまで移植部位に残存することが難しい。

上記態様においては、前記コラーゲン中の反応可能なアミノ基の５０％以上が化学架橋されていることが好ましい。
このようにすることで、生体内での酵素耐性および安定性をさらに向上することができる。

上記態様においては、前記リン酸カルシウムが、低結晶性ハイドロキシアパタイト、カルシウム欠損アパタイト、β型－リン酸三カルシウム、α型－リン酸三カルシウム、リン酸八カルシウム、リン酸水素カルシウム二水和物、および炭酸含有ハイドロキシアパタイトから選択されることが好ましい。
このように生体吸収性のリン酸カルシウムを用いることで、生体吸収性の骨補填材を提供することができる。

上記態様においては、前記化学架橋が、アミド結合を有していてもよい。
上記態様においては、前記化学架橋が、前記コラーゲンのアミノ基とカルボキシル基とが直接結合することで形成されたアミド結合であることが好ましい。
このようにアミノ基とカルボキシル基とが直接結合したアミド結合によって化学架橋することで、アミノ基とカルボキシル基との間に化学架橋剤が介在する化学架橋に比べて、骨補填材の生体親和性をより高めることができる。

本発明の他の態様は、リン酸カルシウムとコラーゲンとを８０：２０よりも大きく９６．８：３．２以下の質量比で混合する混合工程と、コラーゲンを線維化する線維化工程と、該線維化工程の後、リン酸カルシウムと線維化されたコラーゲンとが混合された懸濁液に化学架橋剤を添加してコラーゲンを化学架橋する化学架橋工程とを含む骨補填材の製造方法である。
本態様によれば、リン酸カルシウムとコラーゲンとの質量比が８０：２０よりも大きく９６．８：３．２以下であり、コラーゲンが化学架橋された骨補填材が製造される。したがって、良好な柔軟性および骨形成能を有し、かつ、生体内で高い安定性を有する骨補填材を製造することができる。

上記態様においては、コラーゲンを線維化する線維化工程を含み、前記化学架橋工程が、前記線維化工程の後に行われる。
このようにすることで、生体内においてより高い酵素耐性および安定性を発揮する骨補填材を製造することができる。

上記態様においては、前記化学架橋剤が、カルボジイミド化合物であることが好ましい。
このようにすることで、カルボジイミド化合物によってコラーゲンのアミノ基とカルボキシル基とが脱水縮合により直接結合されることで、コラーゲンはアミド結合により化学架橋される。これにより、生体親和性がより高い骨補填材を製造することができる。カルボジイミド化合物は、ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、ＥＤＣ塩酸塩、およびＤＣＣ（Ｎ、Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド）から選択される少なくとも１つであることが好ましい。

上記態様においては、前記化学架橋工程において、コラーゲン１ｇに対して０．１３ｍｍｏｌ以上のカルボジイミド化合物を添加することが好ましい。
このようにすることで、コラーゲンに含まれる反応可能なアミノ基の５０％以上がカルボジイミド化合物によって化学架橋され生体内においてより高い酵素耐性および安定性を発揮する骨補填材を製造することができる。

本発明によれば、良好な柔軟性および骨形成能を有し、かつ、生体内で高い安定性を有するという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る骨補填材の構造を模式的に示す断面図である。 本発明の一実施形態に係る骨補填材の製造方法を示すフローチャートである。 コラーゲンへの化学架橋の導入位置を説明する図であり、（ａ）コラーゲン分子内、（ｂ）コラーゲン分子間および（ｃ）コラーゲン線維間の化学架橋を示す模式図である。 実施例１における骨補填材の移植部位を説明する図である。 実施例１において使用した骨補填材のサンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄの製造条件を示す図表である。 実施例１において撮影された移植部位のμＣＴ画像である。 μＣＴ画像に基づくサンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄの骨性架橋の進行度の評価結果を示すグラフである。 実施例１において撮影された移植部位のＨＥ染色画像である。 ＨＥ染色画像に基づくサンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄの骨性架橋の進行度の評価結果を示すグラフである。 実施例２において測定された、骨補填材のサンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄから溶出したタンパク質の濃度を示すグラフである。 実施例３において測定された、コラーゲン１ｇに対するＥＤＣの添加量と、コラーゲンのアミノ基の架橋反応率との関係を示すグラフである。 実施例４において使用した骨補填材のサンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄのβ－ＴＣＰとコラーゲンの配合質量比および形状回復率を示す図表である。

以下に、本発明の一実施形態に係る骨補填材およびその製造方法について図面を参照して説明する。
本実施形態に係る骨補填材１は、図１に示されるように、コラーゲンを主成分とする多孔質のコラーゲンマトリクス２と、コラーゲンマトリクス２に担持されたβ－ＴＣＰ（β型－リン酸三カルシウム）顆粒３とからなるコラーゲン／β－ＴＣＰ複合材から形成された多孔体である。

コラーゲンマトリクス２は、相互に化学架橋されたコラーゲン分子からなる。β－ＴＣＰ顆粒３は、コラーゲンマトリクス２の気孔に取り込まれる形でコラーゲンマトリクス２と複合化されており、コラーゲンマトリクス２全体に分散している。

コラーゲンマトリクス２を構成するコラーゲン分子は、化学架橋剤を使用した架橋処理によって相互に化学架橋されている。より具体的には、コラーゲン分子のアミノ基とカルボキシル基とが化学架橋されている。化学架橋は、コラーゲン中の反応可能なアミノ基の５０％以上に導入されている。

化学架橋剤としては、カルボジイミド化合物、エポキシ系化合物またはグルタルアルデヒドが使用される。架橋反応のしやすさや骨補填材１の生体適合性等を考慮して、カルボジイミド化合物およびエポキシ系化合物が好ましく、ＥＤＣ塩酸塩（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）がより好ましい。カルボジイミド化合物およびエポキシ系化合物を使用した場合には、アミド結合を有する化学架橋が形成される。特に、ＥＤＣ塩酸塩のようなカルボジイミド化合物を使用した場合には、コラーゲン分子のアミノ基とカルボキシル基とが脱水縮合によって直接結合することで形成されたアミド結合によりコラーゲン同士が化学架橋される。

β－ＴＣＰ顆粒３の体積粒度分布における最頻径は、１００μｍ以上である。β－ＴＣＰの粒子径は、生体内でのβ－ＴＣＰの分解速度に影響する。すなわち、粒子径（直径）が１００μｍ以上であるβ－ＴＣＰ顆粒３は、マクロファージによる貪食および分解を受け難いため、長期間にわたって生体内に残存する。一方、粒子径が１００μｍ未満であるβ－ＴＣＰ顆粒３は、マクロファージによって貪食および分解され易いため、期待される新生骨形成が達成されるまで生体内に残存することが難しい。

骨補填材１におけるβ－ＴＣＰとコラーゲンとの質量比は、８０：２０から９６．８：３．２までである。β－ＴＣＰとコラーゲンとの質量比を上記範囲に制御することで、骨補填材１は、良好な柔軟性を有するとともに、生体内において良好な骨形成能を発揮することができる。
骨補填材１に対するβ－ＴＣＰの質量比が８０％未満である場合、期待される骨形成能を得ることが難しい。一方、骨補填材１に対するβ－ＴＣＰの質量比が９６．８％よりも高い場合、良好な骨形成能を期待することができるが、コラーゲンの含有率が低くなり過ぎることで骨補填材１の柔軟性が低下し骨欠損部への充填時の骨補填材１の操作性が低下し得る。

次に、骨補填材１の製造方法について説明する。
本実施形態に係る骨補填材１の製造方法は、図２（ａ）～（ｃ）に示されるように、β－ＴＣＰ顆粒３を製造するβ－ＴＣＰ顆粒製造工程ＳＡ１，ＳＡ２と、熱変性コラーゲンを製造する熱変性コラーゲン製造工程ＳＢ１～ＳＢ３と、β－ＴＣＰ顆粒製造工程により得られたβ－ＴＣＰ顆粒３およびアテロコラーゲン酸性溶液からコラーゲン／β－ＴＣＰ複合材からなる骨補填材１を製造する骨補填材製造工程ＳＣ１～ＳＣ１１と、を含む。

β－ＴＣＰ顆粒製造工程は、図２（ａ）に示されるように、β－ＴＣＰの前駆体を合成する工程ＳＡ１と、合成されたβ－ＴＣＰの前駆体からβ－ＴＣＰ顆粒３を作製する工程ＳＡ２とを含む。
工程ＳＡ１は、例えば、カルシウム供給物質とリン酸供給物質とから合成されたβ－ＴＣＰの前駆物質を含むスラリーを乾燥することにより行われる。工程ＳＡ１によりβ－ＴＣＰの前駆体が得られる。
工程ＳＡ２は、工程ＳＡ１により得られたβ－ＴＣＰの前駆体を焼成および粉砕することにより行われる。粉砕の方法は特に限定されない。

熱変性コラーゲン製造工程は、図２（ｂ）に示されるように、ペプシン処理によりアテロ化されたアテロコラーゲンを、酸性溶媒に溶解してアテロコラーゲン酸性溶液を調製する工程ＳＢ１と、工程ＳＢ１により得られたアテロコラーゲン酸性溶液を凍結乾燥させる工程ＳＢ２と、工程ＳＢ２により得られたコラーゲンスポンジに適量のリン酸緩衝溶液を加えて調製し、加熱処理を施してコラーゲンを変性させ熱変性コラーゲンを得る工程ＳＢ３と、を含む。

骨補填材製造工程は、図２（ｃ）に示されるように、ペプシン処理によりアテロ化されたアテロコラーゲンを、酸性溶媒に溶解してアテロコラーゲン酸性溶液を調製する工程ＳＣ１と、β－ＴＣＰ顆粒製造工程により得られたβ－ＴＣＰ顆粒３と、工程ＳＣ１により得られたアテロコラーゲン酸性溶液とを混合して撹拌する工程（混合工程）ＳＣ２と、工程ＳＣ２により得られた混合液に適量のリン酸緩衝溶液を加えて中和し、生体温度近傍（３７℃）にて保温することでアテロコラーゲンを線維化してコラーゲン／β－ＴＣＰ複合材ゲルを得る工程（線維化工程）ＳＣ３と、コラーゲン／β－ＴＣＰ複合材ゲルを撹拌してゲルを崩し、懸濁させる工程ＳＣ４と、工程ＳＣ４により得られた成果物にリン酸緩衝溶液を添加しコラーゲン／β－ＴＣＰ複合材懸濁液を調製する工程ＳＣ５と、工程ＳＣ５により得られたコラーゲン／β－ＴＣＰ複合材懸濁液に工程ＳＢ３で得られた熱変性コラーゲンを添加して混合する工程（混合工程）ＳＣ６と、工程ＳＣ６により得られた混合物に化学架橋剤を添加してコラーゲンに架橋処理を施す工程（化学架橋工程）ＳＣ７と、架橋処理されたコラーゲン／β－ＴＣＰ複合材懸濁液を凍結乾燥する工程ＳＣ８と、工程ＳＣ８により得られたコラーゲン／β－ＴＣＰ複合材から未反応の架橋剤および反応副生成物を洗浄する工程ＳＣ９と、洗浄後のコラーゲン／β－ＴＣＰ複合材を凍結乾燥させる工程ＳＣ１０と、乾燥されたスポンジ状のコラーゲン／β－ＴＣＰ複合材を加工して任意形状の骨補填材１を生成する工程ＳＣ１１と、を含む。

混合工程ＳＣ２，ＳＣ６では、工程ＳＣ２でのβ－ＴＣＰ顆粒３の質量と、工程ＳＣ２および工程ＳＣ６でのコラーゲンの合計の質量との比が、８０：２０から９６．８：３．２までとなるように、β－ＴＣＰ顆粒３およびコラーゲンが混合される。
化学架橋工程ＳＣ７では、コラーゲン中の反応可能なアミノ基の５０％以上が化学架橋さるように、化学架橋剤の添加量が制御される。例えば、カルボジイミド化合物の場合には、コラーゲン１ｇに対して０．１３ｍｍｏｌ以上のカルボジイミド化合物が添加される。

このようにして製造された本実施形態に係る骨補填材１は、骨欠損部の治療のために生体内の骨欠損部に移植される。移植された骨補填材１の内部には、周辺組織から気孔を通じて新生血管や骨形成細胞が侵入し、骨補填材１は骨形成細胞による骨欠損修復の足場となる。これにより、骨欠損部を治癒することができる。

この場合に、本実施形態によれば、β－ＴＣＰとコラーゲンとの質量比が８０：２０から９６．８：３．２までである骨補填材１は、良好な柔軟性を有する。したがって、骨補填材１を骨欠損部に隙間なく移植することができる。

また、骨補填材１の移植部位において期待される新生骨形成を達成するためには、骨補填材１に含まれるコラーゲンの生分解速度が十分に遅く移植部位に骨補填材１が安定して存在し続ける必要がある。コラーゲンの生分解が速過ぎる場合、コラーゲンによって固定されていたβ－ＴＣＰ顆粒３が移植部位に安定して存在することができない。特に、脊椎領域における椎体間固定やオンレイグラフト（骨外補填）等では、骨癒合に要する期間が長いため、使用する骨補填材１には生体内に長期間存在し続けることができる高い安定性が要求される。

本実施形態によれば、コラーゲンマトリクス２を構成するコラーゲン分子の反応可能なアミノ基の５０％以上に化学架橋が導入されてコラーゲン同士が化学架橋されていることで、骨補填材１は、コラゲナーゼ等の酵素に対して高い耐性を示し生体内において高い安定性を発揮する。特に、コラーゲンを化学架橋する化学架橋工程ＳＣ７を、コラーゲンを線維化する線維化工程ＳＣ３の後に行うことで、製造される骨補填材１の酵素耐性が大幅に向上する。具体的には、生体温度（３７℃）で骨補填材１から緩衝液中に溶出するタンパク質と、コラゲナーゼによる骨補填材１中のコラーゲンの分解反応によって産生されるペプチドとの総量の濃度が、１００μｇ／ｍＬ以下まで抑制される。これにより、骨補填材１は、新生骨形成のための足場として移植部位に長期間にわたって残存することができ、高い骨形成能を発揮することができるという利点がある。

さらに、β－ＴＣＰ顆粒３の最頻径が１００μｍ以上であるので、β－ＴＣＰ顆粒３はマクロファージによって容易に貪食および分解されることなく、長期間にわたって残存する。これにより、骨補填材１は、長期間にわたって骨伝導能を発揮し続けることができ、さらに高い骨形成能を発揮することができるという利点がある。

なお、化学架橋工程ＳＣ７を線維化工程ＳＣ３の後に行うことで骨補填材１の生体内での酵素耐性および安定性が向上するのは、以下の理由によるものと考察される。
図３（ａ）～（ｃ）に示されるように、１つのコラーゲン分子５は３重螺旋構造を形成する３本のポリペプチド鎖４からなり、複数のコラーゲン分子５が自己集束してコラーゲン線維６を形成する。化学架橋剤によるアミノ基とカルボキシル基との化学架橋７は、コラーゲン分子５の内部（図３（ａ）参照。）、コラーゲン分子５間（図３（ｂ）参照。）、およびコラーゲン線維６間（図３（ｃ）参照。）に形成され得る。
工程ＳＣ３で線維化と同時に化学架橋処理を行った場合、コラーゲン分子の自己集束（すなわち線維化）が、コラーゲン分子間に作用する架橋反応によって阻害され得る。一方、線維化後に化学架橋処理を行った場合、コラーゲン線維６が形成された後にコラーゲン線維６間に化学架橋７が形成されるため、骨補填材１の生体内での安定性が向上すると考えられる。

タンパク質分解酵素は、ポリペプチド鎖の特定部位を切断する。特定部位に化学架橋７が形成されている場合には、ポリペプチド鎖は酵素によって切断され難い。また、コラーゲン線維６間に化学架橋７が形成されていない場合には、分解されたポリペプチド鎖が容易に溶出するが、コラーゲン線維６間に化学架橋７が形成されている場合には、ポリペプチド鎖が切断されたとしても溶出し難い。したがって、コラーゲン線維６間に多くの化学架橋７が形成されることで、酵素によってポリペプチド鎖が切断されたとしてもポリペプチド鎖が溶出し難く、コラーゲンマトリクス２の酵素耐性および生体内での安定性が向上すると考えられる。

本実施形態においては、リン酸カルシウムとしてβ－ＴＣＰを含む骨補填材１について説明したが、他の種類のリン酸カルシウム、例えば、低結晶性ハイドロキシアパタイト、カルシウム欠損アパタイト、α型－リン酸三カルシウム、リン酸八カルシウム（ＯＣＰ）、リン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）、炭酸含有ハイドロキシアパタイトのいずれか、またはこれらの組み合わせを使用してもよい。

次に、上述した本実施形態の実施例について説明する。
〔実施例１〕
（ウサギＰＬＦ埋植試験）
本発明の骨補填材１を使用してウサギの腰椎に後側方固定術（ＰＬＦ）を行い、横突起間の骨性架橋の進行度を評価した。
図４に示されるように、第４腰椎Ｌ４および第５腰椎Ｌ５の横突起Ｔに、骨補填材１への血行および骨形成に関与する細胞の移動を促すための直径０．５ｍｍ～１ｍｍのデコルチケーション領域（小孔）Ｐを形成し、腰椎Ｌ４，Ｌ５の横突起Ｔ間に短冊状（３０ｍｍ×１０ｍｍ×５ｍｍ）の骨補填材１を埋植した。骨補填材１として、図５に示されるように、β－ＴＣＰの粒子径および化学架橋工程のタイミングが異なる４種類のサンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄを使用した。
埋植から１２週間後、腰椎Ｌ４，Ｌ５を含む骨補填材１の埋植部位を切り出し、埋植部位における骨形成をμＣＴ画像およびＨＥ染色画像に基づいて以下の通り評価した。

μＣＴ画像に基づいて、横突起Ｔ間の新生骨の連続性を以下のグレード０～３の４段階で評価した。図６に、本実施例において撮影された一部のμＣＴ画像を示す。
グレード０：骨形成が認められず、移植塊に変化がないか、または吸収されて消失している状態。
グレード１：横突起付近を中心に骨形成の進行が認められるが、横突起間の移植塊に連続性がなく、明確なギャップや移植塊を分断する透亮線が見られる状態。
グレード２：移植部位の骨形成が進行し、移植塊は横突起間を架橋して横突起、椎弓または椎体と癒合しているが、一塊ではなく横突起間の連続性が一部だけ、あるいは移植塊の一部にギャップや透亮線が認められる状態。
グレード３：移植部位の骨形成が進行し、移植塊は横突起間を架橋して均一な連続性を持って横突起、椎弓または椎体と癒合している状態。

サンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄのスコア（グレードの平均値）を図７に示す。
サンプルＡ，Ｂ，Ｃの比較から分かるように、β－ＴＣＰ顆粒の粒子径が大きい程、高いスコアが得られた。また、サンプルＡ，Ｄの比較から分かるように、コラーゲンの線維化の後にＥＤＣ塩酸塩を添加した場合には、コラーゲンの線維化と同時にＥＤＣ塩酸塩を添加する場合に比べて、高いスコアが得られた。

腰椎Ｌ４，Ｌ５の横突起Ｔを縦割し、割断面にＨＥ染色を施した。ＨＥ染色画像に基づいて、横突起Ｔ間における骨形成を以下の評価値０～５の６段階で評価した。図８に、本実施例において撮影された一部のＨＥ画像を示す。
０：異常・変化なし
１：きわめて軽度
２：軽度
３：中程度
４：やや重度
５：重度

サンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄのスコア（評価値の平均値）を図９に示す。
サンプルＡ，Ｂ，Ｃの比較から分かるように、β－ＴＣＰ顆粒の粒子径が大きい程、高いスコアが得られた。また、サンプルＡ，Ｄの比較から分かるように、コラーゲンの線維化の後にＥＤＣ塩酸塩を添加した場合には、コラーゲンの線維化と同時にＥＤＣ塩酸塩を添加する場合に比べて、高いスコアが得られた。

以上の実験結果から、β－ＴＣＰ顆粒の粒子径および化学架橋工程のタイミングが骨補填材１の骨形成能に寄与し、β－ＴＣＰ顆粒の最頻径を１００μｍ以上とすることで、また、コラーゲンの化学架橋を線維化後に行うことで、骨補填材１の骨形成能が向上することが確認された。

〔実施例２〕
（コラゲナーゼ分解性試験）
骨補填材１のサンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄの酵素耐性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。
酵素としては、細菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のコラゲナーゼを使用した。コラゲナーゼ溶液にサンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄを一定時間浸漬し、コラゲナーゼによるサンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄの分解後、緩衝液中に溶出したタンパク質（ペプチド）の濃度を測定した。サンプルＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄのタンパク質の濃度の測定結果を図１０に示す。

サンプルＡ，Ｂ，ＣとサンプルＤとの比較から分かるように、化学架橋をコラーゲンの線維化と同時に行ったサンプルＤのタンパク質の溶出量は、１００μｇ／ｍＬを超えていたのに対し、化学架橋をコラーゲンの線維化後に行ったサンプルＡ，Ｂ，Ｃのタンパク質の溶出量は、１００μｇ／ｍＬ以下であった。この実験結果から、化学架橋工程のタイミングが骨補填材１の酵素耐性に寄与し、コラーゲンの化学架橋を線維化後に行うことで、骨補填材１の酵素耐性が大幅に向上することが確認された。

〔実施例３〕
（架橋反応率試験）
ＥＤＣ塩酸塩の添加量と、コラーゲンのアミノ基の架橋反応率との関係を調べた。
化学架橋工程における、コラーゲン１ｇに対するＥＤＣ塩酸塩の添加量が異なる骨補填材１の複数のサンプルを製造し、各サンプルにおける化学架橋に寄与していない残留アミノ基の量を、トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＴＮＢＳ）を用いたＴＮＢＳ法によって測定した。また、化学架橋工程を行わずに製造した未架橋の骨補填材１のサンプルを製造し、未架橋のサンプルについても同様にアミノ基の量を測定した。
ＴＮＢＳは、リシン残基中のε－アミノ基との反応によって黄から橙を呈する物質を生成する。したがって、各サンプルをＴＮＢＳと反応させ、３４５ｎｍまたはその近傍の波長で吸光度を測定することで、それぞれの残留アミノ基の量が測定される。

図１１は、コラーゲン１ｇに対するＥＤＣ塩酸塩の添加量と、コラーゲンのアミノ基の架橋反応率との関係を示すグラフである。架橋反応率は、下式によって定義される。

図１１に示されるように、コラーゲン１ｇに対してＥＤＣ塩酸塩を０．１３ｍｍｏｌ以上を添加することで、コラーゲンのアミノ基の５０％以上が架橋された骨補填材１が製造されることが確認された。

〔実施例４〕
（形状回復性評価）
β－ＴＣＰとコラーゲンの配合質量比が異なる３つの骨補填材１のサンプルＥ，Ｆ，Ｇを作製し、作製した各サンプルＥ，Ｆ，Ｇの形状回復性を以下の手順により評価した。また、比較例として、β－ＴＣＰとコラーゲンの配合質量比のみがサンプルＥ，Ｆ，Ｇとは異なるサンプルＨを作製し、サンプルＥ，Ｆ，Ｇと同様に形状回復性を評価した。図１２に、各サンプルＥ，Ｆ，Ｇ，Ｈの配合質量比と形状回復性の評価結果とを示す。サンプルＥ，Ｆ，Ｇ，Ｈは全て、１ｃｍ^３の立方体に加工された。

サンプルＥ，Ｆ，Ｇ，Ｈの形状回復性を、以下の実験により評価した。
まず、サンプルＥ，Ｆ，Ｇ，Ｈのそれぞれの寸法（高さ）を測定した。次に、サンプルＥ，Ｆ，Ｇ，Ｈのそれぞれに、最大吸水可能量を超えて吸水不可となるまで精製水を滴下した。次に、十分吸水させたサンプルＥ，Ｆ，Ｇ，Ｈにオートグラフを用いて荷重をかけ、サンプルＥ，Ｆ，Ｇ，Ｈを高さが２ｍｍになるまで圧縮した。次に、圧縮されたサンプルＥ，Ｆ，Ｇ，Ｈを除圧して形状を回復させ、回復したサンプルＥ，Ｆ，Ｇ，Ｈの高さを測定した。そして、サンプルＥ，Ｆ，Ｇ，Ｈの形状回復率（％）（＝（除圧後に測定された高さ／圧縮前に測定された高さ）×１００）を算出した。

図１２に示されるように、コラーゲンに対するβ－ＴＣＰの配合率（質量比）と、形状回復率との間には相関関係が存在することが確認され、コラーゲンに対するβ－ＴＣＰの配合率（質量比）が小さいほど形状回復率が高くなるという知見が得られた。具体的には、本発明のサンプルＥ，Ｆ，Ｇでは９５％を超える高い形状回復率が確保できることが確認された。一方、比較例のサンプルＨの形状回復率は７０％未満であり、サンプルＥ，Ｆ，Ｇと比較して顕著に低かった。

以上の結果から、β－ＴＣＰとコラーゲンとの質量比を８０：２０から９６．８：３．２までとすることにより骨補填材の形状回復性を向上することができ、それにより、骨欠損部に隙間なくかつ密に骨補填材を充填させた場合にも、骨補填材内部への血液や骨芽細胞の侵入を促し、新生骨形成を促進することができることが示唆された。

１ 骨補填材
２ コラーゲンマトリクス
３ β－ＴＣＰ顆粒
４ ポリペプチド鎖
５ コラーゲン分子
６ コラーゲン線維
７ 化学架橋

Claims (10)

1. リン酸カルシウムとコラーゲンとを８０：２０よりも大きく９６．８：３．２以下の質量比で含み、
   前記コラーゲンが、線維化されており、
   線維化された前記コラーゲンが、化学架橋されている骨補填材。
2. コラゲナーゼによる分解反応によって産生されるペプチドおよび生体温度で緩衝液中に溶出するタンパク質の総量の濃度が、１００μｇ／ｍＬ以下である請求項１に記載の骨補填材。
3. 前記リン酸カルシウムが、１００μｍ以上の最頻径を有する顆粒である請求項１または請求項２に記載の骨補填材。
4. 前記コラーゲン中の反応可能なアミノ基の５０％以上が化学架橋されている請求項１から請求項３のいずれかに記載の骨補填材。
5. 前記リン酸カルシウムが、低結晶性ハイドロキシアパタイト、カルシウム欠損アパタイト、β型－リン酸三カルシウム、α型－リン酸三カルシウム、リン酸八カルシウム、リン酸水素カルシウム二水和物、および炭酸含有ハイドロキシアパタイトから選択される請求項１から請求項４のいずれかに記載の骨補填材。
6. 前記化学架橋が、アミド結合を有する請求項１から請求項５のいずれかに記載の骨補填材。
7. 前記化学架橋が、前記コラーゲンのアミノ基とカルボキシル基とが直接結合することで形成されたアミド結合である請求項６に記載の骨補填材。
8. リン酸カルシウムとコラーゲンとを８０：２０よりも大きく９６．８：３．２以下の質量比で混合する混合工程と、
   コラーゲンを線維化する線維化工程と、
   該線維化工程の後、リン酸カルシウムと線維化されたコラーゲンとが混合された懸濁液に化学架橋剤を添加してコラーゲンを化学架橋する化学架橋工程とを含む骨補填材の製造方法。
9. 前記化学架橋剤が、カルボジイミド化合物である請求項８に記載の骨補填材の製造方法。
10. 前記化学架橋工程において、コラーゲン１ｇに対して０．１３ｍｍｏｌ以上のカルボジイミド化合物を添加する請求項９に記載の骨補填材の製造方法。

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