JP2003501217A

JP2003501217A - 不溶化デキストラン誘導体および増殖因子に基づく生体材料

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Publication number: JP2003501217A
Application number: JP2001502893A
Authority: JP
Inventors: シンデレラブラシャ; デルフィネロジャート−アブラモグル; エルバパティト; アレモニィエ; フレデリックショベ; ジャクリンジョゼフォビッツ; マーサルジョゼフォビッツ; ロラセデル; ジョーズコレヤ
Original assignee: ビオデックス
Priority date: 1999-06-11
Filing date: 2000-06-09
Publication date: 2003-01-14
Also published as: US6946443B2; FR2794649A1; FR2794649B1; US20020169120A1; CA2376898A1; EP1189644A1; WO2000076562A1; WO2000076562A9

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般式ＤＭＣ_aＢ_bＳｕ_cＳ_dの少なくとも１つの不溶化デキストラン誘導体および骨関節、歯科および／または顎顔面組織に対して活性を示す少なくとも１つの増殖因子を本質的に含む生物学的活性材料、ならびにその調製方法に関する。本発明はまた、骨関節、歯科または顎顔面適用のための修復または充填材料（例えば、インプラント）を調製するための、および整形外科、歯科または顎顔面プロテーゼの調製のための該生体材料の使用、ならびに該生物学的活性材料でコーティングされたプロテーゼに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、生体材料、その調製方法、および特に骨関節、歯科または顎顔面分
野における修復または充填材料としてのその適用に関する。

【０００２】骨欠損を硬化（consolidate）するために、一般的に使用される方法は、自己
移植または同種異系移植である。皮質海綿状（corticospongy）自己移植は、最
も古い方法である；それは、完全な免疫耐性を伴いおよび病原因子の伝染の危険
性を伴わずに、良質の骨硬化を得ることを可能にする。しかし、骨ストックは、
個人において、特に子供においてに制限されており、そしてそれから生じるさら
なる外科行為は、合併症の危険性を生じさせる。脳死の状態の被験者から除去さ
れる同種異系移植についての場合、それは、骨伝導（osteoconductive）および
非骨誘導（nonosteoinductive）特性を示すのみであり、何故ならば、除去され
る骨は、レシピエント身体による移植片拒絶の免疫反応を誘発し得るかまたは感
染症のベクターであり得る全ての成分を破壊するために凍結されるからである。
この処理は、さらに、骨の機械特性を低下させる。

【０００３】骨移植片の不十分のために、骨置換材料は、現在、骨硬化を促進するための必
須の研究ルートである。

【０００４】これらの材料は、かなり公衆衛生の重要性がある。実際、多数の合成または金
属材料が、骨移植片または総股関節部プロテーゼと同じぐらい多数の適応症にお
いて、骨置換材料として使用されている。現在、６００００の総股関節部プロテ
ーゼが、毎年、フランスにおいて移植されている。１９８８年、疫学研究は、１
６００万のアメリカ人患者に取り付けられたインプラントの半分が整形外科イン
プラントであることを示した。これらの統計は、フランスの状況に外挿され得る
。

【０００５】骨硬化は、間葉系（前骨芽細胞、骨芽細胞および骨細胞）、または造血系（破
骨細胞）から誘導される種々のタイプの細胞に関与する。骨表面に位置される骨
芽細胞は、新しい骨マトリクスの合成に関与する。骨細胞は、骨マトリクスに含
まれ、互いに結合してこれらは、真の細胞間ネットワークを形成する。骨を再吸
収することを可能にする破骨細胞は、増殖因子に依存する。破骨活性は、再建の
ために必須であり、何故ならば、それは、それ自体、とりわけ増殖因子による骨
芽細胞の合成の活性を増大させ得るからである。血小板もまた、重要な役割を有
する；それらは、骨修復の初期段階で大量の増殖因子を放出する。

【０００６】増殖因子は、細胞ライフ（例えば、増殖、分化、生存）の多数のパラメータを
制御する特性を有するポリペプチドの範疇である。これらの因子は、複数のタイ
プの細胞によって分泌される。同一因子の効果は、標的細胞の性質、因子の濃度
、他の因子の可能性のある同時存在によって決定される。標的細胞は、これらの
因子、最もしばしばチロシンキナーゼについての膜レセプターを有する。それら
の刺激は、調節タンパク質の合成または活性を制御する。増殖因子の名は、最も
しばしば、それらが最初に検出された材料から取られ、そして必ずしもそれらの
機能を表していない。

【０００７】骨組織は、骨形成および再吸収を制御しそしてまた軟骨および骨の発生、増殖
および修復において重要な役割を果たす、種々の増殖および分化因子を含む。こ
れらの主要因子は、ＥＧＦ（「表皮増殖因子」）、ＩＧＦ（「インスリン様増殖
因子」）、ＦＧＦ（「線維芽細胞増殖因子」）、ＴＧＦ−β（「トランスフォー
ミング増殖因子」）、ＰＤＧＦ（「血小板由来増殖因子」）およびＢＭＰ（「骨
形成因子」）である。

【０００８】ＢＭＰは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの一部である。それらの骨誘導（os
teoinductive）活性は、１９６５年、Ｍ．Ｒ．Ｕｒｉｓｔによって実証された（
Science, 1965, 150, 893-899）：鉱物質除去（demineralized）骨を、ラットに
おける異所性（ectopic）（すなわち筋肉内）部位に移植し、そして軟骨次いで
骨を形成させた。鉱物質除去骨から抽出され、そしてこの骨誘導を担うタンパク
質が、精製され、そして骨形成因子（Bone Morphogenetic Proteins）（BMP）と
名付けられた。数個のタンパク質（ＢＭＰ−１〜７）を、最初、分子生物学技術
を使用してクローニングした（Wozney, J. M.ら、Science, 1988, 242, 1528-15
34）。以来、ＢＭＰ−１は骨伝導（osteoconductive）特性を有さないことが示
されている。現在まで、多数の他のＢＭＰがクローニングされている。

【０００９】骨修復におけるＢＭＰのみの使用は、インビトロ研究において有効なものまた
は正常組織で検出されるものより遥かに多い、大量の注射を必要とする。

【００１０】その上、これらの生成物の全身効果は、ＢＭＰの周囲筋肉塊への拡散および非
骨部位における局所石灰化の危険性を示す。さらに、ＢＭＰは、遊離形態で、数
分のオーダーの、非常に短い寿命を有する。

【００１１】従って、ＢＭＰならびに骨修復に関与する他の増殖因子についてのベクターを
開発することが、望ましい。

【００１２】Ｔ．Ｒ．Ｇｅｒｈａｒｔら（Clinical orthopaedics and related research,
1993, 293, 317-326および1995, 318, 222-230）は、骨インプラントを作製する
ために、ヒト組換えＢＭＰ−２と不活性骨マトリクスを混合する（３ｇの骨マト
リクス当たり、１．５ｍｇのＢＭＰ）ことを提案した。これらのインプラントは
、ヒツジの大腿に人工的に作製された２．５ｃｍ長の損傷の再骨化を誘導するこ
とを可能にする。しかし、インプラントによって提供されるＢＭＰの量（１．５
ｍｇ）は、天然骨組織に内因性的に存在するＢＭＰの量（約０．０６μｇ）より
も２５０００倍も高い。

【００１３】他のタイプの支持体がまた提案されている：コラーゲン、ヒドロキシアパタイ
ト、ゼラチン、トリカルシックカルシウムホスフェート（tricalcic calcium ph
osphate）、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、サンゴ、ポリ乳酸およびポリグ
リコール酸のポリマーなど。

【００１４】これら全ての有機または無機の天然または合成化合物は、実際には、ＢＭＰに
ついてのベクターでない。これらは、実際、程度に関係なく増殖因子との良好で
ある親和性を示す。

【００１５】これらの研究と同時に、ヘパリンおよびヘパラン硫酸と類似の様式で、カルボ
キシメチル（ＭＣ）、ベンジルアミド（Ｂ）およびスルホネート（Ｓ）基で置換
されたデキストラン（Ｄ）（ＤＭＣＢＳと呼ばれる化合物）は、特定の増殖因子
、ＨＢＧＦ（ヘパリン結合増殖因子）、特にＦＧＦおよびＴＧＦ−βと相互作用
することが示された。それらは、損傷部位で放出されるこれら内因性因子の生物
学的効果を強化し、熱、酸またはタンパク質分解原因の分解からそれらを保護す
る（F. Blanquaertら、Bone, 1995, 17，6, 499-506; A. Meddahiら、Journal o
f Biomedical Materials Research, 1996, 31, 293-297; J. Lafontら、Growth
factors, 1998, 16, 23-38; F. Blanquaertら、Journal of Biomedical Materia
ls Research, 1999, 44, 63-72）。

【００１６】骨修復分野において、コラーゲン支持体に固定化された、特にＣＭＤＢＳ、Ｒ
ＧＴＡ９およびＲＧＴＡ１１（それぞれ、８３％または１１０％のＣＭ単位、２
３％または２．６％のＢ単位、および１３％または３６．５％のＳ単位を含む化
合物）は、骨再生の誘導を可能にした（F. Blanquaertら、1995およびJ. Lafont
ら、1996による上述の論文）。従って、ＲＧＴＡ９およびＲＧＴＡ１１はそれ自
体、外因性増殖因子を添加することなしに、骨再建を刺激できることが示された
。Ｆ．Ｂｌａｎｑｕａｅｒｔら、１９９５は、この特性を、コラーゲンに運搬さ
れて（vectorized）そして内因性的に存在するこの増殖因子と複合体を形成され
るＲＧＴＡ９は、それらの引き続く放出のための該増殖因子のリザーバーを構築
し得るという事実によって説明する。Ｊ．Ｌａｆｏｎｔらは、増殖因子を投与す
る代わりに、コラーゲン支持体に運ばれた、ＲＧＴＡ１１それ自体を使用するこ
とを提案する。

【００１７】手短に言えば、従って、Ｆ．ＢｌａｎｑｕａｅｒｔらおよびＪ．Ｌａｆｏｎｔ
らは、ＲＧＴＡ９またはＲＧＴＡ１１を、迅速かつ非制御の放出のキネティック
スを誘導すると公知であるコラーゲン支持体に運搬させること（vectorizing）
を提案する。

【００１８】その上、Ｆ．Ｂｌａｎｑｕａｅｒｔら（１９９９）による上記論文は、インビ
トロおよび溶解形態で、増殖因子（ＢＭＰ−２、ＴＧＦ−β１、ＦＧＦ−２）と
接触されて配置されたＲＧＴＡ９およびＲＧＴＡ１１による骨芽細胞表現型の発
現の刺激を記載する。この効果は、これら増殖因子と相互作用するＲＧＴＡの能
力から生じ、従って、創傷治癒プロセスを促進することを可能にすることが、示
される。ＲＧＴＡ９は、ＲＧＴＡ１１よりも効果が低く、両方の化合物は、本質
的に、スルホネート基（Ｓ）でのそれら各々の置換の程度の点で異なり、すなわ
ち、ＲＧＴＡ９について０．１３そしてＲＧＴＡ１１について０．３６５である
。これらの結果から、Ｓ単位の高い割合が、骨修復に対するデキストラン誘導体
の特性において重要な役割を果たすことが明らかである。

【００１９】従って、種々の上記の論文（F．Blanquaertら、1995および1999; A. Meddahi
ら、1996; J.Lafontら、1998）は、ＤＭＣＢＳが、これら内因性的に放出される
増殖因子を捕捉し得；それらが、損傷部位で通常分泌される増殖因子の一時的な
リザーバーの役割を果たすことを示す。

【００２０】ＤＭＣＢＳとインビボで形成される増殖因子とのこのような組み合わせは、手
術おける、特に脊椎、顎顔面または歯科手術または任意の再建手術における使用
のための、該増殖因子についての有効なベクターを構築しない。実際、それらの
溶解形態は、特定部位での増殖因子の拡散を制御することを可能にしない。さら
に、これらの組み合わせは、破壊される骨破片、特に大きな骨欠損のジオメトリ
ーを元に戻すことを可能にせず、そこでは、内因性増殖因子は、自発的硬化を開
始し得るに十分な量で存在しない。次いで、インビボで好適な放出システムと組
み合わせて使用されなければならない外因性増殖因子を添加することが、必要で
ある。

【００２１】本発明者らは、増殖因子、特にＢＭＰのための、以下の要求を満たす支持材料
を提供することを目的とする： − それが、固体形態で提供される、 − それが、骨関節物質の大量の損失の再建のために、特に骨欠損の再建のため
に好適である、 − それが、増殖因子について本当の親和性を示す、 − それが、増殖因子の放出のキネティックスを制御することを可能にする、 − それが、増殖因子の放出の位置を制御し、骨外部位におけるその拡散を防止
することを可能にする、 − それが、放出される増殖因子の局所濃度を制御することを可能にする、 − それが、突然変異活性を示さず、それが、生体適合性、非免疫原性、無毒性
および生分解性である、 − それが、それを変性させることなしに、生体活性分子を保護する、 − それが、さらに、使用されるＢＭＰの量を減少することを可能にする。

【００２２】本発明の主題は、本質的に以下を含むことを特徴とする生体材料である：（１）一般式ＤＭＣ_aＢ_bＳｕ_cＳ_dの少なくとも１つの不溶化デキストラン誘導体
、ここで：Ｄは、好ましくはグルコシド単位の連続物からなる、多糖鎖を示し、ＭＣは、メチルカルボキシレート基を示し、Ｂは、カルボキシメチルベンジルアミド基を示し、Ｓｕは、スルフェート基(sulfate group)を示し（該グルコシド単位によって
保有される遊離のヒドロキシル官能基の硫酸化）、Ｓは、スルホネート基(sulfonate group)を示し（該Ｂ基の芳香族環の硫酸化
）、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、該デキストランのグルコシド単位における遊離のヒド
ロキシル官能基の数に対して表される置換の程度（ｄｓ）を示し、それぞれ、Ｍ
Ｃ、Ｂ、ＳｕおよびＳ基において；ａ≧０．３、ｂは０に等しいかまたは０．２
以上であり、ｃは０に等しいかまたは０．１以上であり、そしてｄは０に等しい
かまたは０．１５以下であり、但し、ｂが０に等しい場合、ｃは０に等しくなく
、ならびに（２）骨関節、歯科および／または顎顔面組織に対して活性を示す、少なくとも
１つの増殖因子。

【００２３】表現「骨関節、歯科および／または顎顔面組織に対して活性を示す増殖因子」
は、骨の、および腱、靭帯などの、創傷治癒および再建のプロセスに関与する増
殖因子を意味すると理解される。

【００２４】上記のデキストラン誘導体は、架空のサブ単位Ｒ−ＯＨおよびＲ−ＯＸからな
るコポリマーであると考えられ、Ｘがメチルカルボキシレート、ベンジルアミド
、スルフェートまたはスルホネート基であることが可能であり、非置換デキスト
ランの多糖鎖は、非置換グルコシド単位が遊離の３つのヒドロキシル基を含むと
いう事実を考慮して、１００のグルコシド単位の代わりに、３００の架空のＲ−
ＯＨサブ単位からなると考えられる。従って、メチルカルボキシレート基を有す
る１．２の置換の程度（ｄｓ）を有するデキストランメチルカルボキシレート（
ＤＭＣ）は、１グルコシド単位当たり、１．２０の置換基（Ｒ−Ｃ）および１．
８０の遊離ヒドロキシル基（Ｒ−ＯＨ）を含む。

【００２５】上述のデキストラン誘導体は、デキストラン誘導体に存在する基に依存して、
以下の工程を含むプロセスによって調製され得る：ａ）カルボキシメチル化は（ｉ）デキストランを塩基性２相水性−アルコール性
液体媒体と少なくとも１時間攪拌しながら接触させることによる、非置換デキス
トランの活性化、（ｉｉ）４０〜９０℃の温度、好ましくは６０℃での、得られ
る活性化生成物へのモノクロロ酢酸の付加［比Ｒ_MC（モノクロロ酢酸のモル数／
ＯＨモル数に等しい）は０．３〜２である］、（ｉｉｉ）得られるデキストラン
メチルカルボキシレート（ＤＭＣ）の単離および必要に応じた精製、を含む、ｂ）ベンジルアミンのメチルカルボキシレート基とのカップリングは（ｉ）ａ）
で得られるＤＭＣを、少なくとも２時間そして酸性水性媒体中で、カップリング
剤として水溶性カルボジイミドの存在下、０℃〜３０℃の温度で、ベンジルアミ
ンと接触させること［水溶性カルボジイミド／ＭＣモル比は、０．２５〜２であ
り、そして、ベンジルアミン／ＭＣモル比は０．２５〜２である］、（ｉｉ）得
られるデキストランメチルカルボキシルベンジルアミド（ＤＭＣＢ）の単離およ
び必要に応じたその精製、を含む、ｃ）硫酸化は、（ｉ）ｂ）で得られたＤＭＣＢのトリアルキルアンモニウム塩の
形成、（ｉｉ）無水極性溶媒、一般的にルイス塩基（例えば、ジメチルスルホキ
シド（ＤＭＳＯ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））中で得られる塩の可
溶化、ならびに（ｉｉｉ）該溶液中の塩への、７０℃未満の温度での、同一の溶
媒中の溶液における三酸化硫黄に基づく錯体（例えば、ＳＯ₃−ピリジン、ＳＯ₃ −トリエチルアミンまたはＳＯ₃−ＤＭＦ）の添加［三酸化硫黄に基づく錯体／
遊離のＯＨのモル比は、０．２５〜１２である］、を含む、ならびにｄ）攪拌しながら、ｂ）で得られるＤＭＣＢ誘導体または無水溶媒中の懸濁液中
のｃ）で得られるＤＭＣＢＳｕを、室温〜使用される溶媒の沸騰温度で、同一の
溶媒中の溶液のクロロスルホン酸と混合することによるＢ基の硫酸化。

【００２６】工程ａ）において、該２相水性−アルコール性液体媒体の、水：アルコール比
は、例えば、１０：９０（ｖ／ｖ）〜２５：７５（ｖ／ｖ）であり、そして好ま
しくは１５：８５（ｖ／ｖ）である。

【００２７】工程ｂ）の水溶性カルボジイミドは、例えば、１−シクロヘキシル−３−（２
−モルホリノエチル）カルボジイミドメタ−ｐ−トルエンスルホネート（ＣＭ
Ｃ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒ
ドロクロリド（ＥＤＣ）からなる群から選択される。

【００２８】上記のプロセスによって調製される場合、本発明に従う生体材料に存在するデ
キストラン誘導体は、鎖のサイズの分布における均一性（高性能立体排除クロマ
トグラフィーにおける対称的ガウスタイプの溶出プロフィールによって示される
）および荷電化学基の分布における均一性（低圧イオン交換クロマトグラフィー
における対称的シングルピーク溶出プロフィールによって示される）を示す。

【００２９】好ましくは、上述の該不溶化デキストラン誘導体は、ｄが０に等しくなるよう
なものである。

【００３０】本発明に従う生体材料に存在する不溶化デキストラン誘導体は、該増殖因子の
ためのベクターとして役立つ。非共有結合相互作用（例えば、静電的、極性また
は非極性、または双極子／双極子タイプファンデルワールス結合、水素または親
水性結合）が、増殖因子とデキストランとの間に現れる。

【００３１】特に有利な様式で、固体形態で存在する本発明に従う生体材料は、増殖因子の
放出の場所めおよびキネティックスを制御することを可能にし；従って、それは
、増殖因子のための制御放出支持材料を構成する。

【００３２】好ましくは、該増殖因子は、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ
およびＢＭＰからなる群から選択される。

【００３３】この実施形態の有利な特徴に従うと、該増殖因子は、骨誘導活性を有する。そ
れは好ましくはＢＭＰであり、後者が組換えＢＭＰであることまたは抽出方法に
よって得られることが可能である。組換えＢＭＰは、例えば、それ自体で公知の
分子生物学技術を使用する遺伝子工学によって提供され得、一方、抽出されるＢ
ＭＰは、ヒトまたは動物組織から誘導され得、この場合、特に骨誘導タンパク質
の混合物を含むタンパク質の混合物が得られる。

【００３４】予想外なことに、このような生体材料は、該増殖因子のin situ制御放出のた
めに特に有効なベクターである。

【００３５】実際、本発明に従う生体材料は、生物の細胞（特に、マクロファージ）によっ
てインビボで分解され、不溶化デキストラン誘導体によって運搬される（vector
ized）増殖因子の放出を可能にする。

【００３６】本発明に従う生体材料は、それと合わされる増殖因子（外因性増殖因子）の効
果を保護および増強し；それは、該増殖因子のためのリザーバーとして作用し、
そしてそれは、生体利用可能形態での、病変部位での、その制御放出に寄与し、
従って、創傷治癒および組織再生を刺激する。本発明に従う生体材料はまた、損
傷部位で通常放出される内因性増殖因子を保護および増強する。

【００３７】外傷または腫瘍起源の骨欠損の充填および移植したプロテーゼの抜き取りは、
再建の困難な問題を引き起こす、整形外科分野において、このような生体材料は
、驚くことに、骨再生を制御様式で増強することを可能にする。このような材料
はまた、特に、脊椎手術（例えば、脊柱の関節固定術を実施することを、すなわ
ち数個の椎骨を互いに結合させること）、顎顔面手術、歯科手術および再建手術
によく適している。

【００３８】特に有利な様式で、少なくとも１つのデキストラン誘導体に基づく本発明に従
う生体材料は、生体適合性であり、そして動物起源の病原因子での汚染の危険性
を生じない。

【００３９】本発明に従う生体材料は、有利には、骨再建プロセスに関与する数個の増殖因
子と組み合わせ得る。それはまた、有利には、上記の一般式ＤＭＣ_aＢ_bＳｕ_cＳ_d に対応する数個の不溶化デキストラン誘導体を含み得る。

【００４０】該生体材料の別の有利な実施形態に従うと、それは、架橋剤を用いての架橋に
よって不溶化される。

【００４１】この実施形態の有利な特徴に従うと、該架橋剤は、ソディウムトリメタホスフ
ェート、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、グルタルアルデヒドおよびビ
スエポキシランからなる群から選択される。使用され得るビスエポキシランの例
として、１，４−ブタンジオール−ビス（エポキシプロピル）エーテルおよび１
，４−ブタンジオール−ジグリシジルエーテルが述べられ得る。

【００４２】全てのこれらの架橋剤は、デキストラン誘導体の鎖のヒドロキシル官能基の間
に架橋を作製することを可能にする。

【００４３】該生体材料の別の有利な実施形態に従うと、それは、ヒドロゲルの形態、また
は凍結乾燥粉末の形態で存在し、該凍結乾燥粉末は、有利には、上記のヒドロゲ
ルから得られる。

【００４４】該生体材料の別の有利な実施形態に従うと、それは、さらに、組織充填材料（
tissue filling material）を含む。

【００４５】該生体材料のなお別の有利な実施形態に従うと、それは、無機またはポリマー
の不溶性支持体の粒子をコーティングし、該粒子は、１００μｍを超える直径を
有する。本発明のこの局面に従うと、生体材料は、該粒子上に不溶化され、そし
て粒状形態で存在する。

【００４６】これらの実施形態の有利な特徴に従うと、該組織充填材料は、コラーゲン、ゼ
ラチン、生物学的接着剤(biological adhesive)、ポリ乳酸またはポリグリコー
ル酸のポリマー、ならびにポリエチレングリコールおよびポリラクチド−コ−グ
リコリドのコポリマーからなる群から選択される。

【００４７】本発明の別の有利な特徴に従うと、該組織充填材料は、サンゴ、ヒドロキシア
パタイト、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイトの混合物、トリカルシックカ
ルシウムホスフェート、硫酸カルシウムおよび炭酸カルシウムからなる群から選
択される骨伝導材料である。

【００４８】表現「骨伝導（osteoconductive）」は、血管再生および骨前駆細胞の増殖の
ための三次元支持体として役立つ材料を意味すると理解され、該材料は、異所性
（ectopic）部位での骨の作製を開始することなしに、徐々の骨再生を可能にし
、その役割として異所性部位での血管周囲性間葉細胞の骨前駆細胞への分化およ
び増殖を誘導することによって骨形成活性を刺激する「骨誘導（osteoinductive
）」材料とは異なる（M. R. Urist, Science, 1965, 150, 893-899）。

【００４９】本発明の主題はまた、上述の架橋によって不溶化される生体材料を調製するた
めのプロセスであり、それは以下の工程を含むことを特徴とする： − 上記の一般式ＤＭＣ_aＢ_bＳｕ_cＳ_dの少なくとも１つのデキストラン誘導体の
架橋、 − 上記で得られる不溶化デキストラン誘導体における、上記に定義の少なくと
も１つの増殖因子の吸着、 − ヒドロゲルの形態の本発明に従う生体材料の作製、 − 必要に応じて、粉末形態の本発明に従う生体材料を得るための、該ヒドロゲ
ルの凍結乾燥。

【００５０】本発明に従うプロセスの有利な実施形態に従うと、一般式ＤＭＣ_aＢ_bＳｕ_cＳ_d の少なくとも１つのデキストラン誘導体の架橋は、上記の架橋剤を用いて実施さ
れる。

【００５１】本発明に従うプロセスの別の有利な実施形態に従うと、該一般式ＤＭＣ_aＢ_bＳ
ｕ_cＳ_dの少なくとも１つのデキストラン誘導体の架橋は、上記の骨伝導充填材料
の存在下で実施される。

【００５２】本発明の主題はまた、上記の粒子形態の生体材料を調製するためのプロセスで
あり、該プロセスが、以下の工程を含むことを特徴とする： − 前記デキストラン誘導体を、上記のように、無機またはポリマーの不溶性骨
伝導性支持体の粒子と接触させて、複合材料を得ること、 − 架橋剤の存在下における、上記で得られる複合材料の不溶化、 − 上記で得られる不溶化複合材料における、上記に定義の少なくとも１つの増
殖因子の吸着。

【００５３】このプロセスにおいて使用され得る架橋剤は、上記のものと同一である。

【００５４】本発明の主題はまた、特に骨関節、歯科または顎顔面インプラントの調製のた
めの、骨関節、歯科または顎顔面用途の修復または充填材料の調製のための、上
記で定義の生体材料の使用である。

【００５５】本発明の主題はまた、整形外科、歯科または顎顔面プロテーゼのためのコーテ
ィングの調製のための、上記で定義の生体材料の使用である。

【００５６】このようなプロテーゼは、例えば、限定することなしに、セラミック、ステン
レススチール、チタン合金またはクロム−コバルト合金からなる。

【００５７】本発明の主題は、さらに、その表面の少なくとも一部が本発明に従う生体材料
でコーティングされることを特徴とする、機能化プロテーゼである。

【００５８】前記の特徴に従うと、本発明はまた、引き続き、本発明の生体材料の実施例お
よびその使用の実施例、ならびに添付の図面を参照する説明から明らかとなる他
の特徴を含む。

【００５９】しかし、これらの実施例は、本発明の主題の例示のみで提供され、そしていず
れの様式でもその限定を構成しないことが、明らかに理解されるべきである。

【００６０】実施例１：式DMC_aB_bSu_cS_dの幾つかのデキストラン誘導体の様々なポリマーと
増殖因子TGF−β１との相互作用の証明この実施例は、TGF-β1に良好な親和性を有するポリマーを選択するために、
上記定義されたようにMC、B、S及びSuから選ばれた単位を含むポリマー、特に機
能化されたデキストラン誘導体をスクリーニングするための試験に関係する。

【００６１】ａ）使用されたポリマー使用された種々のポリマーの構造的特徴を以下の表Ｉにまとめており、各ポリ
マーについてCM、B、Su及びS基による置換の程度が示されている。ポリマー"T40
"は天然デキストラン（Pharmacia Fine Chemical, 重量平均分子量M_w：37500g/m
ol、M_w/M_n：1.7、Mnは数平均分子量を示す。）を示す。他のポリマーは機能化さ
れたデキストラン誘導体に該当する。

【００６２】

【表１】

【００６３】ｂ）材料及び方法 TGF-β1（R&D Systemにより供給された）の15ng（0.5μl）が、単独で（コン
トロール）又は100μgのポリマーの存在下で、10μlのサンプルバッファー、す
なわち125mM酢酸ナトリウム、50mMトリスバッファーpH7.00及び0.5％ウシ血清ア
ルブミン（BSA）中に溶解される。サンプルが４℃で１から２時間インキュベー
トされる。

【００６４】 0.8％アガロースゲル45mlが調製される。75％グリセロールの２μl及びブロモ
フェノールブルーが前もって付着されたアガロースゲル上にサンプルが載せられ
る。電気泳動が、200mAの電流の下で４℃の温度で４時間行われる。泳動バッフ
ァーは、125mM酢酸ナトリウム及び50ｍM Tris-HClバッファーｐH7.00を含むバ
ッファーである。

【００６５】泳動の最後に、25mM Tris-HClバッファーｐH9.00、192mMグリシン、20％メ
タノール及びSDS（ラウリル硫酸ナトリウム）を含むトランスファーバッファー
中でゲルが15から20分間インキュベートされる。ゲルは、次いで毛管現象により
、予めメタノール、次いで超純水（3分間）及び最後にトランスファーバッファ
ー中に浸されたPVDF（ポリビニリデンフルオライド）膜上に移され、その転移は
毛管現象により終夜行われる。

【００６６】 PVDF膜は、次いで20分間TBSバッファー（20mM Tris-HCl及び150mM NaCl）、
0.05％Tween及び1％BSA混合物中に、次いで20分間TBSバッファー、0.05％ Tween
及び1％ゼラチン混合物中に浸される。

【００６７】二つの膜のインキュベーション工程は以下の通りである： −1時間30分間から2時間、室温で、Promegaにより供給された一次ウサギ抗TGF-
β抗体の1/1000希釈溶液（TBS／0.05％Tween／1％BSAの10ml中の抗体10μlであ
る）を用いる。インキュベーションに、TBS／0.05％Tween溶液を用いた４×10分
間の膜の洗浄が続く。 −１時間から１時間30分間、室温で、ペルオキシダーゼ（Boehringer Mannheim
）に結合された二次抗ウサギ抗体の1／2500希釈溶液を用い、それはTBS／0.05％
Tween／1％BSAの25ml中の10μlの抗体である。インキュベーションに、３×10分
間の、TBS／0.05％Tween溶液を用いた膜の洗浄、次いでTBSバッファーを用いた
最終的な洗浄が続く。

【００６８】比色可視化が、次いで行われる。この目的のために、オルト−ジアニシジン（
ortho-dianisidine）の0.5％メタノール溶液（50ｍｇ／10ｍｌ）及び0.01％過酸
化水素／10mMトリスバッファーpH7.4溶液が調製される。比色可視化は、50mlト
リスバッファー及び125μl（0.00125％）オルト−ジアニシジン溶液を膜に加え
ることにより行われる。数分間以内に茶色が現れる。比色可視化は、次いで水を
加えることにより停止される。

【００６９】増殖因子単独（コントロール）は殆ど移動せず、その等電点（pI）は泳動バッ
ファーのpHに近い。他方、それが、強いアニオン性のポリマーと複合体を形成し
ている場合には、その組み合わせは陽極（＋）に向かって移動するであろう。

【００７０】ｃ）結果図２ａは、上記説明した電気泳動の結果を示す。

【００７１】この図から、ＴＧＦ-β１は天然デキストランT40、又はカルボキシメチル化さ
れただけのデキストラン誘導体であるDMC7とは相互作用しないことが明らかであ
る。他方では、TGF-β1は他のデキストラン誘導体と様々に相互作用する。DMCB2
及びFC27のバッチから二つの産物が出てきており、そのために泳動先端は陽極に
向かい強く移動される。それらの共通点は、ベンジルアミド基による高度の置換
である。他のゲル電気泳動もまた、ここには示されないが、TGF-β1がMC（a=1.0
4）及びSu（c=0.70）基でのみ置換されたデキストラン誘導体と相互作用するこ
とを示した。

【００７２】実施例２：式DMC_aB_bSu_cS_dの幾つかのデキストラン誘導体の種々のポリマーと
抽出ウシBMP（bBMP）との相互作用の証明先行する実施例におけるように、この実施例は、bBMP（ウシBMP）に良好な親
和性を有するポリマーを選択するために、ポリマー、特に機能化されたデキスト
ラン誘導体をスクリーニングするための試験に関係する。

【００７３】ａ）使用されたポリマー先行する実施例（表Ｉ）参照。

【００７４】ｂ）材料及び方法以下のプロトコルは、以下の違い以外は、先行する実施例に類似する： −Boehringerキットに従ってビオチンで標識された、例えばSulzer Orthopedic
s Biologics Inc.（フィートリッジ、コロラド）により供給されたbBMPの250n
gが用いられる。 −0.8％アガロースゲル上で2時間電気泳動が行われる。 −PVDF膜を抗体とともにインキュベートする工程はないが、ペルオキシダーゼに
結合されたストレプトアビジンの1/2000希釈溶液（TBS／0.05％ Tween／1％BSA
の１０ｍｌ中のストレプトアビジンの5μlである）とともに室温で2時間インキ
ュベートする工程はある。インキュベーションに、４×10分間、TBS／0.05％Twe
en溶液を用いた膜の洗浄が続く。

【００７５】ｃ）結果図2bは、上記説明した電気泳動の結果を示している。この図から、TGF-β1と
類似の方法で（先行する実施例参照）bBMPは天然のデキストラン又は純粋にカル
ボキシメチル化されたデキストラン誘導体とは相互作用しないことが明らかであ
る。他方で、bBMPは試験された他のデキストラン誘導体とは相互作用する。

【００７６】実施例３：本発明による生体材料の調製ａ）ソディウムトリメタホスフェート(TMP)により不溶化されたデキストラン
誘導体の調製 TMPはデキストラン誘導体の架橋を許容する。この反応は、アルカリ性媒体中
で、ホスフェートジエステル共有結合を介した多糖のリン酸化を伴う。ジエステ
ル結合はデキストランの水酸基の上に創られる。本発明による一般式DMC_aB_bSu_cS _d のデキストラン誘導体は、それらの置換のために、殆ど遊離の水酸基を有さず
、それらの架橋は天然のデキストラン（非置換）の存在下で行われるであろう。

【００７７】 70μlの高分子量（500000g/mol以上）の天然デキストラン、例えばPharmacia
Fine Chemicalにより供給されたデキストランT500（464000g/molの重量平均分
子量（Mw）、Mw/Mn＝2.9、Mnは数平均分子量を示す）の溶液が、実施例１（表Ｉ
を参照）に定義されるように、DMCB2、即ちDMC_aB_bSu_cS_dにおいてa=0.75、b=0.37
、c=d=0である溶液20μlと混合される。前記溶液は300mg/mlの濃度で0.5M NaOH
中に調製される。0.5M NaOH中の300mg／ml濃度のTMP（すなわち（NaPO₃）₃）溶
液10μlがこの混合物に加えられる。非常に粘性の溶液の100μlがこのようにし
て得られ、粘性の増加はDMCB2及びデキストランの架橋を反映している。

【００７８】上記得られた非常に粘性の溶液はテフロン（登録商標）プレート上に１μlの
容量で計り取られ、その全体がオーブン中に40℃で2時間置かれる。このように
して得られる乾燥ゲルは、ゲルから水酸化ナトリウムの痕跡を除去するために、
超純水の大過剰（2ml）中に24時間で２回懸濁され、次いで凍結乾燥され、次い
で電離放射線（25kGray）により滅菌される。

【００７９】ｂ）増殖因子（bBMP）と不溶化デキストラン誘導体との組み合わせ各ゲルは、bBMP（例えばSulzer Orthopedics Biologics Inc、フィートリ
ッジ(Wheat Ridge)、コロラド(Colorado)により供給された抽出ウシBMP）の250n
g/ml（0.5ng/gel）を含むPBSリン酸バッファー（Dubelcco formulation）の2μ
lとともに滅菌条件下で再水和される。生体材料が、次いで本発明に従いヒドロ
ゲルの形態で得られる。

【００８０】このヒドロゲルは、粉末の形態で本発明による生体材料を保存するために、凍
結乾燥されてもよい（100μlの開始溶液から、すぐに使用できる100の凍結乾燥
品の生産）。

【００８１】インプラントの調製のために使用するときには、凍結乾燥品はそのまま、又は
凍結乾燥品mg当たり10mlの注射用蒸留水で再水和されて使用され得る。

【００８２】上記説明されたと同じプロトコルが生体材料の調製のために、一般式DMC_aB_bSu _c S_dの化合物（ここで、a=0.67、b=0.30、c=0.15、d=0.05である）（FC06と呼ば
れる化合物）を用いて実施され得る。

【００８３】実施例４：本発明による生体材料を調製するためのもう1つのプロトコルａ）1,4-ブタンジオール-ジグリシジルエーテルにより不溶化されたデキスト
ラン誘導体の調製デキストランT500（先行する実施例において使用されたデキストランと同一）
の700μlの溶液がCMDBSu（表Ｉ参照）の溶液200μlと混合され、前記溶液は２回
蒸留水中に、300mg/mlの量で調製される。得られた溶液は凍結され、凍結乾燥さ
れる。

【００８４】凍結乾燥品は、1,4-ブタンジオール-ジグリシジルエーテルのエチルエーテル
溶液（0.5容量％）中に室温で30分間浸され、次いで、エチルエーテルは真空下
に40℃で蒸発される。乾燥した架橋ゲルは、連続して、2mlの0.1M NaOH、2mlの
２回蒸留水、2mlの2M NaCl、最後に３×２ｍｌの２回蒸留水中に懸濁される。ゲ
ルは凍結乾燥され、次いで1mlの２回蒸留水で再水和される。

【００８５】得られた柔らかいゲルは、次いで、1mm高さの縁を有する3cm×3cmのガラス板
からなる容器中に置かれる。ガラスカバーがこの容器上に置かれ、全体が−80℃
に凍結される。得られたアイスケーキ（３cm×3cm×0.1cm³）はカバーなしの容
器内で凍結乾燥され、次いで安全かみそりの刃で側面に沿って5mmの乾燥ゲルに
切断される（それは25μlの容量である）。乾燥ゲルは、大過剰の超純水（20ml
）中に24時間で２回懸濁され、次いで凍結乾燥され、電離放射線（25ｋGray）に
より滅菌される。

【００８６】ｂ）増殖因子（bBMP）の不溶化デキストラン誘導体との組み合わせ各ゲルは、250ng/ml（12.5ng/gel）のbBMPを含む50μl のPBSリン酸バッファ
ー（Dubelcco formulation）と滅菌条件下で再水和され、次いで凍結乾燥され
る。約30のすぐに使用できる凍結乾燥品が、1mlの開始溶液から、このようにし
て得られる。

【００８７】インプラントの調製のための使用のときに、凍結乾燥品はそのまま、又は凍結
乾燥品mg当たり50μlの注射用蒸留水で再水和されて使用され得る。

【００８８】実施例５：増殖因子TGF-β1の、一般式DMC_aB_bSu_cS_dの不溶化デキストラン誘導
体による吸着及び放出ａ）増殖因子の吸着・TGF-β1の吸着のための及びTGF-β1吸着量の測定のためのプロトコル表Ｉ中のFC27と呼ばれるデキストラン誘導体、すなわちMC、B及びSu単位の置
換の程度がそれぞれ0.75、0.37及び0.64であるデキストランが使用され、前記デ
キストランは実施例3において記載されたプロトコルに従い不溶化されている。
コントロールは天然デキストランT500であり、それもまた実施例３において記載
されたように不溶化されている。

【００８９】シリコン化されたガラス試験管中に、 −0.24gの不溶化されたFC27、 −0.02％のアジ化ナトリウム（殺菌剤）及び0.5％のウシ血清アルブミン（BSA）
を含むPBSリン酸バッファーの200μl、この化合物は増殖因子のガラス試験管の
壁への吸着を避けることができるようにするものである、及び、 −100ng のTGF-β1 が配置される。

【００９０】コントロールが類似の方法で調製されるが、それは0.30gの天然デキストラン
とリン酸バッファーの400μlとからである（実際、デキストランゲルT500はFC27
よりも高い膨潤速度を有しており、架橋度の差によりこの差を説明できる。）。

【００９１】全体を穏やかに攪拌しながら室温で48時間放置し、次いで各ゲルは、吸収され
なかった増殖因子を除去するために、リン酸バッファーで洗浄される。試験管内
及び洗浄バッファー内に残存する増殖因子は、次いでELISA法により測定される
。

【００９２】・結果表IIは、機能化されたデキストラン誘導体（FC27）のゲル中及び天然デキスト
ランT500（コントロール）のゲル中に吸着されたTGF-β1の量をまとめている。

【００９３】

【表２】

【００９４】表IIから、T500では最初に加えた量の14.9％、FC27では23.1％の残存TGF-β1
濃度が残っていることが明らかである。このように、T500及びFC27は、それぞれ
最初に加えられたTGF-β1の85.1％及び76.9％を吸着した。：二つのゲルは有意
にTGF-β1を吸着した。

【００９５】ｂ）増殖因子のリン酸バッファー媒体への放出・プロトコルＴＧＦ-β1放出のキネティックスは、シリコン化された６ウェルプレート内で
行われる。TGF-β1が吸着されたFC27及びT500ゲルは、PBSリン酸バッファー（以
下に説明されるように5mlまたは10ml）、0.02％アジ化ナトリウム及び0.5％BSA
の存在下に、ウェル内で、室温でインキュベートされる。

【００９６】媒体中に放出されたTGF-β1のアッセイは、伝統的なELISA法により、抗TGF-β
モノクローナル抗体の炭酸バッファー溶液（2μg/ml）、pH9.6で被覆された96ウ
ェルマイクロタイタープレートを用いて行われる。プレートはシールされ、攪拌
せずに4℃で終夜インキュベートされ、次いで0.05％のTween20を含むpH7.4のPBS
バッファー300μlで５回洗浄される。非特異的部位のブロッキングが、次いで0.
5％BSA溶液を用いて行われる（ウェル当たり溶液300μlを添加し、次いで攪拌な
しに室温で１時間インキュベートする）。上記洗浄溶液でウェルを適切に洗浄し
た後、標準サンプル（TGF-β1は31.25から2000pg/mlの範囲）及び試験サンプル
が調製される。各ウェルは100μlの各サンプルを含み、室温で1時間30分間攪拌
しながらインキュベートされる。上記洗浄溶液でのプレートの適切な洗浄の後に
、PBS/0.05%Tween20/0.5%BSAバッファー中の一次ビオチン化ヒト抗TGF抗体100ng
/ml（100μｌ/ウェル）溶液とともにウェルがインキュベートされる。上記洗浄
溶液でプレートを適切に洗浄した後、ペルオキシダーゼに結合されたストレプト
アビジンの1/10000希釈（100μl/ウェル）溶液とともに、ウェルがインキュベー
トされる。プレートの最終的な洗浄が次いで行われ、次いでプレートが、ウェル
あたり200μlの試薬を加えて、ODP（9％過酸化水素の33.3μlが加えられる、0.0
5Mクエン酸バッファーpH5の25ml中の１パスチル（pastille））で可視化される
。反応は3〜４分間行われ、次いで3M硫酸の50μlを添加することにより停止され
る。

【００９７】 TGF-β1の放出のキネティックスを測定するために、二つのプロトコルが用い
られた。： −媒体の変化なしに、この場合、４つの400μlのサンプルの連続的な収集（浸漬
後15分、45分、1時間30分及び8時間）が10mlの開始バッファー容量から行われた
； −又は培地の交換をしながら、この場合バッファーの始めの5mlが集められ（30
分、1,2,5,24時間、2,3,4,5,9及び15日）、新しい培地の5mlで置き換えられる。

【００９８】・結果図3a及び3bは、それぞれ培体の交換なし（図5a）及び培体の交換あり（図5b）
での、時間(time)（時間(hours)）の関数としてのT500及びFC27ゲルにより放出
されたTGF-β1の量（pgで、累積値）を表す。

【００９９】これらの図は、T500ではTGF-β1のリン酸バッファーへの迅速な放出を示して
いるが、この放出はFC27では起こらないことを示す。従って、FC27はTGF-β1と
ともにリン酸バッファー中で解離されない複合体を形成していることが明らかで
ある：TGF-β1はゲル中に吸着されるが、そこから放出されない。しかしながら
、それはインビボ条件下で、機能化されたデキストランゲルは、ゲルの遅い分解
及びTGF-β1の徐々の放出を促進するであろうpH条件並びに種々の酵素に曝され
るであろうことを明記する。

【０１００】実施例６：ヒドロゲルの形態における本発明の生体材料を補助とする骨インプ
ラントの調製約50mm³の骨の空洞のために、本発明による生体材料の15mgが、実施例３にお
いて得られたような、砕かれて超純水の100μlで再水和された（100μlのヒドロ
ゲルの生産）凍結乾燥粉末の形態で使用される。

【０１０１】実施例７：粒子形状の充填材料であるトリカルシックカルシウムホスフェート
(tricalcic calcium phosphate)と結合された本発明による生体材料を含む固形
の骨インプラントの調製実施例３において使用されたデキストランのような高分子量（500000g/mol以
上）の天然デキストラン溶液70μlが、DMCB2（実施例３におけるのと同じデキス
トラン誘導体）の溶液20μlと混合され、前記溶液は、0.5M NaOH中に300mg/ml
の濃度で調製される。トリカルシックカルシウムホスフェートの顆粒（直径0.5m
m）80mgが、先の溶液と混合され、0.5M NaOH中の300mg/ml濃度のTMP溶液10μl
がそこへ添加される。得られた混合物は5mm³の立方体標本の形態に形作られ、40
℃のオーブン内に2時間置かれる。

【０１０２】得られた標本は、穏やかに攪拌しつつ超純水（立方体の容量の100倍）中に24
時間２回懸濁され、40℃のオーブン内で真空下に終夜乾燥され、次いで実施例３
において記載されたように滅菌される。

【０１０３】標本は、次いで、bBMPの1ng/μl（標本あたり50ng）を含む、実施例３におい
て使用されたPBSリン酸バッファー50μlとともに滅菌条件下で再水和される。立
方体は、次いで真空下に40℃で３時間乾燥される。それはそのままでインプラン
トとして使用され得る。

【０１０４】実施例８：本発明による生体材料を使用する整形外科プロテーゼのコーティン
グの調製高分子量（500000g/mol以上）の天然デキストラン、例えば実施例３において
記載されたデキストランT500の溶液210mlが、実施例３において記載されたDMCB2
の溶液60mlと混合される。前記溶液は0.5M NaOH中に300mg/mlの濃度で調製され
る。0.5M NaOH中の300mg/mlの濃度のTMP溶液30mlがこの混合物に添加される。
得られた非常に粘性の溶液（300ml）が迅速にホモジナイズされ、適した容器内
に37℃で置かれる。

【０１０５】 TiA16V4（6％アルミニウム及び4％バナジウムを含むチタン合金）でできた大
腿プロテーゼのテイルが、直ぐに、この混合物内に浸漬される。それは10分後に
引き出され、40℃に保たれたオーブン内に2時間置かれる。大腿のテイルは、超
純水1リットル中に、24時間２回浸漬され、40℃のオーブン内で真空下に終夜乾
燥され、そして実施例３において記載されるように滅菌される。

【０１０６】 bBMPの300μgを含む、実施例３において使用されたPBSリン酸バッファー溶液3
mlが、滅菌条件下に、噴霧の形態でプロテーゼの処理された表面に分散される。
プロテーゼ(prosthesis)は、次いで真空下に40℃で3時間乾燥される。プロテー
ゼは移植のときにそのままで使用され得る。

【０１０７】同じプロトコルが、膝プロテーゼ又は股関節部寛骨臼プロテーゼを被覆するた
めに使用され得る。

【０１０８】実施例９：本発明による生体材料のインビボ研究・プロトコル実施例３に記載されたように架橋され、抽出ウシBMPの100ngとともに載せられ
たDMCB2（一般式DMC_aB_bSu_cS_dのデキストラン誘導体、ここでa=0.75、b=0.37、c= d =0である）のゲル0.5cm³が使用される。

【０１０９】コントロールは、抽出ウシBMPの100ngとともに載せられた0.5cm³の珊瑚立方体
（Biocoral Inc.により供給されたポライト（Porites）である。

【０１１０】動物は、体重約70gの３週齢のSprague-Dawleyラットの10匹である。それらは
ケタラー（Ketalar；登録商標）及びキシラジン（Xylazine；登録商標）の溶液
で麻酔されている。ゲルの粒子（ゲルの開始容量の約1％）がピンセットで除去
され、椎骨に沿った筋肉内に経筋肉的に置かれる。動物の皮膚は非吸収性の縫合
糸で閉じられる。移植は１ヶ月維持され、次いで、動物は、筋肉塊におけるイン
プラントの組織学的研究のために犠牲にされる。

【０１１１】・結果図4aは骨新生物のラジオグラフを表している。

【０１１２】図4bは、筋肉内部位における新たに形成された骨小結節の像（倍率：×100）
を表している。小結節の成熟した皮質構造が観察され得る。

【０１１３】図4c（倍率：×100）は、研究のコントロール（BMPで充たされた珊瑚）を表し
ている。材料の多孔性は非常に細胞充填的ではなく、材料は完全（吸収なし）で
骨新形成は観察されなかった。

【０１１４】この研究から、BMPの低容量（100ng）は、一般式DMC_aB_bSu_cS_dのデキストラン
誘導体（ここで、a=0.75、b=0.37、c=d=0）により運搬され（vectorized）、異
所性(ectopic)部位における骨新形成を誘導できる生体材料を得ることを可能に
することが明らかである。

【０１１５】上記のことから明らかなように、本発明は、より明白に説明されたその実施例
、実行及び適用のそれらには全く限定されない。；それどころか、それは本発明
の文脈及び範囲から外れることなくその分野の専門家に起こるかもしれない全て
の変形を含む。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、一般式ＤＭＣ_aＢ_bＳｕ_cＳ_dのデキストラン誘導体の構造を図示する。

【図２】図２ａは、種々のポリマーおよび増殖因子ＴＧＦ−β１の０．８％のアガロー
スゲルにおける電気泳動の結果を示す。図２ｂは、種々のポリマーおよびウシ骨組織から抽出されたＢＭＰの０．８％
のアガロースゲルにおける電気泳動の結果を示す。

【図３】図３ａおよび３ｂは、それぞれ実施例５に記載のプロトコルに従う、培地の交
換なし（図３ａ）および培地の交換あり（図３ｂ）の、時間（時間(hour)で）の
関数としてのゲルＴ５００（天然デキストラン）およびＦＣ２７（置換デキスト
ラン誘導体）によって放出されたＴＧＦ−β１の量（ｐｇで、累積値）を示す。

【図４】図４ａは、実施例９に記載のプロトコルに従う、抽出されたウシＢＭＰによっ
てラット内に誘導された骨新形成のラジオグラフを示す。図４ｂは、実施例９に記載のプロトコルに従う、ラットにおける筋肉内部位で
形成される骨小結節の光学顕微鏡下での像を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年６月１１日（２００１．６．１１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者モニィエアレフランス国エフ−94160 セ−マデリプリソ 19 (72)発明者ショベフレデリックフランス国エフ−95600 オボンレディブワ−ジャク４エスクセ (72)発明者ジョゼフォビッツジャクリンフランス国エフ−60260 ラモルレィエドゥジェムアブニィ 65 (72)発明者ジョゼフォビッツマーサルフランス国エフ−60260 ラモルレィエドゥジェムアブニィ 65 (72)発明者セデルロラフランス国エフ−78350 ジュイアジョザスシャメダラクールロラド４ (72)発明者コレヤジョーズフランス国エフ−59230 セアマードレオルトダリル 1184 Ｆターム(参考） 4C081 AB04 AB05 AB06 CD03 CD28 CD29 CF01 DA11 DC11 4C089 BE14 BE17 CA02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】本質的に以下を含むことを特徴とする、生体材料：（１）一般式ＤＭＣ_aＢ_bＳｕ_cＳ_dの少なくとも１つの不溶化デキストラン誘導体
、ここで：Ｄは、好ましくはグルコシド単位の連続物からなる、多糖鎖を示し、ＭＣは、メチルカルボキシレート基を示し、Ｂは、カルボキシメチルベンジルアミド基を示し、Ｓｕは、スルフェート基を示し（該グルコシド単位によって保有される遊離の
ヒドロキシル官能基の硫酸化）、Ｓは、スルホネート基を示し（該Ｂ基の芳香族環の硫酸化）、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、該デキストランのグルコシド単位における遊離のヒド
ロキシル官能基の数に対して表される置換の程度（ｄｓ）を示し、それぞれ、Ｍ
Ｃ、Ｂ、ＳｕおよびＳ基において；ａは０．３以上であり、ｂは０に等しいかま
たは０．２以上であり、ｃは０に等しいかまたは０．１以上であり、そしてｄは
０に等しいかまたは０．１５以下であり、但し、ｂが０に等しい場合、ｃは０に
等しくなく、ならびに（２）骨関節、歯科および／または顎顔面組織に対して活性を示す、少なくとも
１つの増殖因子。
【請求項２】前記不溶化デキストラン誘導体が、ｄが０に等しいようなも
のであることを特徴とする、請求項１に記載の生体材料。
【請求項３】前記増殖因子が、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、Ｐ
ＤＧＦおよびＢＭＰからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１また
は請求項２に記載の生体材料。
【請求項４】前記増殖因子が、骨誘導活性を有し、そしてＢＭＰであるこ
とを特徴とする、前記請求項のいずれか１項の生体材料。
【請求項５】数個の不溶化デキストラン誘導体および／または骨再建プロ
セスに関与する数個の増殖因子を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか
１項に記載の生体材料。
【請求項６】架橋剤を用いての架橋によって不溶化されることを特徴とす
る、前記請求項のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項７】前記架橋剤が、ソディウムトリメタホスフェート、エピクロ
ロヒドリン、ジビニルスルホン、グルテルアルデヒドおよびビスエポキシランか
らなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の生体材料。
【請求項８】ヒドロゲルの形態で存在することを特徴とする、前記請求項
のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項９】凍結乾燥粉末の形態で存在することを特徴とする、請求項１
〜７のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項１０】前記凍結乾燥粉末が、請求項８に定義されるヒドロゲルか
ら得られることを特徴とする、請求項９に記載の生体材料。
【請求項１１】さらに組織充填材料を含むことを特徴とする、前記請求項
のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項１２】無機またはポリマーの不溶性支持体の粒子をコーティング
し、該粒子が１００μｍより大きい直径を有することを特徴とする、請求項１１
に記載の生体材料。
【請求項１３】前記組織充填材料が、コラーゲン、ゼラチン、生物学的接
着剤、ポリ乳酸またはポリグリコール酸のポリマー、ならびにポリエチレングリ
コールおよびポリラクチド−コ−グリコリドのコポリマーからなる群から選択さ
れることを特徴とする、請求項１１または請求項１２に記載の生体材料。
【請求項１４】前記組織充填材料が、サンゴ、ヒドロキシアパタイト、コ
ラーゲンおよびヒドロキシアパタイトの混合物、トリカルシックカルシウムホス
フェート（tricalcic calcium phosphate）、硫酸カルシウムおよび炭酸カルシ
ウムからなる群から選択される骨伝導材料であることを特徴とする、請求項１１
または請求項１２に記載の生体材料。
【請求項１５】請求項１〜１１および１３のいずれか１項に記載の生体材
料を調製するためのプロセスであって、該プロセスは以下の工程を含むことを特
徴とする： − 請求項１または請求項２に記載の一般式ＤＭＣ_aＢ_bＳｕ_cＳ_dの少なくとも１
つのデキストラン誘導体の架橋、 − 上記で得られる不溶化デキストラン誘導体における、請求項１〜４のいずれ
か１項に記載の少なくとも１つの増殖因子の吸着、 − ヒドロゲルの形態の請求項１〜８のいずれか１項に記載の生体材料の作製、
− 必要に応じて、粉末形態の該生体材料を得るための、該ヒドロゲルの凍結乾
燥。
【請求項１６】前記一般式ＤＭＣ_aＢ_bＳｕ_cＳ_dの少なくとも１つのデキス
トラン誘導体の架橋が、請求項６または請求項７に規定の架橋剤を用いて実施さ
れることを特徴とする、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】前記一般式ＤＭＣ_aＢ_bＳｕ_cＳ_dの少なくとも１つのデキス
トラン誘導体の架橋が、組織充填材料の存在下で実施されることを特徴とする、
請求項１５または請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１８】前記組織充填材料が、請求項１３または請求項１４で規定
される通りであることを特徴とする、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項１９】請求項１２に記載の生体材料を調製するためのプロセスで
あって、以下の工程を含むことを特徴とする： − 前記デキストラン誘導体を、請求項１２に規定されるように、無機またはポ
リマー不溶性支持体の粒子と接触させて、複合体を得ること、 − 架橋剤の存在下における、上記で得られる該複合体の不溶化、 − 上記で得られる該不溶化複合体における、請求項１〜４に規定の少なくとも
１つの増殖因子の吸着。
【請求項２０】骨関節、歯科または顎顔面適用のための修復または充填材
料の調製のための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の生体材料の使用。
【請求項２１】骨関節、歯科または顎顔面インプラントの調製のための、
請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】整形外科、歯科または顎顔面プロテーゼのためのコーティ
ングの調製のための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の生体材料の使用。
【請求項２３】その表面の少なくとも一部が、請求項１〜１４のいずれか
１項に記載の生体材料でコーティングされていることを特徴とする、機能化プロ
テーゼ。