EP1189644A1 - Biomateriau a base d'un derive de dextrance insolubilise et d'un facteur de croissance - Google Patents

Biomateriau a base d'un derive de dextrance insolubilise et d'un facteur de croissance

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EP1189644A1
EP1189644A1 EP00940481A EP00940481A EP1189644A1 EP 1189644 A1 EP1189644 A1 EP 1189644A1 EP 00940481 A EP00940481 A EP 00940481A EP 00940481 A EP00940481 A EP 00940481A EP 1189644 A1 EP1189644 A1 EP 1189644A1
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EP
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biomaterial according
biomaterial
dextran
growth factor
dextran derivative
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Withdrawn
Application number
EP00940481A
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German (de)
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Inventor
Cinderella Blanchat
Delphine Logeart-Avramoglou
Hervé Petite
Alain Meunier
Frédéric CHAUBET
Jacqueline Jozefonvicz
Marcel Jozefowicz
Laurent Sedel
José CORREIA
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Biodex SARL
Original Assignee
Biodex SARL
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    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A61L2300/414—Growth factors

Definitions

  • the present invention relates to a biomaterial, to its preparation process and to its applications, in particular as a repair or filling material in the osteo-articular, dental or maxillofacial field.
  • autograft or allograft To consolidate bone defects, commonly used methods are autograft or allograft.
  • the autologous cortico-cancellous is the oldest method: it achieves a bone consolidation of good quality, perfect tol ⁇ immune rancid and without risk of pathogen transmission.
  • the bone stock is limited in an individual, especially in children, and the additional surgical procedure which results therefrom involves risks of complications.
  • the allograft taken from subjects in a state of brain death, it only has osteoconductive and non-osteoinductive properties, since the bone taken is frozen so as to destroy all the elements which could trigger an immune rejection rejection reaction. transplant by the recipient organism or be a vector of infections. This treatment also reduces the mechanical properties of the bone.
  • bone substitute materials are at present the essential way of research to promote bone consolidation. These materials are of considerable importance in public health. In fact, many synthetic or metallic materials are used as bone replacement materials for indications as diverse as bone grafting or total hip replacement. Currently, 60,000 total hip prostheses are implanted each year in France. In 1988, an epidemiological study showed that half of the implants placed in 16 million American patients were orthopedic implants. These statistics can be extrapolated to the French situation.
  • Bone consolidation involves different types of cells from either the mesenchymal line (preosteoblasts, osteoblasts and osteocytes), or from the hematopoietic line (osteoclasts).
  • the osteoblasts located on the bone surface, are involved in the synthesis of a new bone matrix. Osteocytes are included in the bone matrix; interconnected, they form a veritable intercellular network. Osteoclasts, which help absorb bone, are dependent on growth factors. Osteoclastic activity is essential for reconstruction, since it is itself capable of amplifying the activities of osteoblast synthesis through, inter alia, growth factors. Platelets also play an important role: they release large amounts of growth factors at the initial stage of bone repair.
  • Growth factors are a category of polypeptides that have regulatory properties for many parameters of cell life (such as proliferation, differentiation, survival). These factors are secreted by multiple types of cells. The effects of the same factor are determined by the nature of the target cell, the concentration of the factor, the possible simultaneous presence of other factors. Target cells have membrane receptors for these factors, most often tyrosine kinases. Their stimulation regulates the synthesis or activity of regulatory proteins. The name of the growth factors is most often taken from the material where they were highlighted for the first time and is not always representative of their function. Bone tissue contains a variety of growth and differentiation factors that control bone formation and resorption, and which also play an important role in the development, growth, cartilage and bone repair and repair.
  • EGFs Epidermic Growth Factor
  • IGFs Insulin-like Growth Factor
  • FGFs Fibroblast Growth Factor
  • TGF- ⁇ Transforming Growth Factor
  • PDGFs Pla telet- Derived Growth Factor
  • BMPs Bone Morphogenetic Proteins
  • BMPs are part of the TGF- ⁇ superfamily. Their osteoinductive activity was demonstrated by MR Urist in 1965 (Science, 1965, 150, 893-899): demineralized bone was implanted in ectopic site, namely intramuscular, in the rat and gave rise to the formation of cartilage, then bone. The proteins extracted from demineralized bone and responsible for this bone induction have been purified and called the Bone Morphogenetic Proteins (BMP). Seven proteins (BMP-1 to 7) were initially cloned using molecular biology techniques (Wozney, J.M. et al., Science, 1988, 242, 1528-1534). BMP-1 has since been shown to have no osteoconductive properties. To date, many other BMPs have been cloned.
  • BMPs alone in bone repair involves the injection of large quantities, much greater than those effective in in vitro studies or detected in normal tissues.
  • BMPs have very short lifetimes, of the order of a few minutes in free form.
  • TR Gerhart et al. (Clinical orthopedics and related research, 1993, 293, 317-326 and 1995, 318, 222-230) proposed mixing human recombinant BMP-2 with inactive bone matrix (1.5 mg BMP per 3 g bone matrix) to make bone implants. These implants allow re-ossification of defects 2.5 cm long artificially created in sheep femurs. However, the amount of BMP provided by the implant (1.5 mg) is 25,000 times greater than the amount of BMP endogenously present in native bone tissue ( ⁇ 0.06 ⁇ g).
  • HBGFs Heparin Binding Growth
  • FGFs and TGF- ⁇ potentiate the biological effects of these endogenous factors, released at the injured site, by protecting them against degradation of thermal, acid or proteolytic origin (F. Blanquaert et al., Bone, 1995, 17, 6, 499-506 ; A. Meddahi et al., Journal of Biomedical Materials Research, 1996, 31, 293-297; J. Lafont et al., Growth factors, 1998, 16, 23-38; F. Blanquaert et al., Journal of Biomedical Materials Research, 1999, 44, 63-72).
  • CMDBS In the field of bone repair, specific CMDBS, RGTA9 and RGTA11 (compounds comprising respectively 83% or 110% of CM units, 23% or 2.6% of B units and 13% or 36.5% of S units), immobilized in a collagen support, made it possible to induce bone regeneration (aforementioned articles of temporary for growth factors that are naturally secreted at the injured site.
  • the inventors therefore set themselves the goal of providing a support material for growth factors, in particular BMPs, which meets the following requirements:
  • the subject of the present invention is a biomaterial, characterized in that it essentially comprises:
  • D represents a polysaccharide chain, preferably consisting of sequences of glucoside units
  • MC represents methylcarboxylate groups
  • B represents carboxymethyl-benzylamide groups
  • Su represents sulphate groups
  • S represents sulfonate groups (sulfonation of the aromatic nuclei of groups B), a, b, c and d represent the degree of substitution (ds), expressed in relation to the number of free hydroxyl functions in a glucosidic unit of dextran, respectively in groups MC, B, Su and S; a> 0.3, b being 0 or> 0.2, c being 0 or> 0.1 and d being 0 or ⁇ 0.15, provided that when b is equal to 0, c is not equal to 0, and
  • At least one growth factor having activity on the osteo-articular, dental and / or maxillofacial tissues At least one growth factor having activity on the osteo-articular, dental and / or maxillofacial tissues.
  • “Growth factor presenting an activity on osteoarticular, dental and / or maxillofacial tissues” is understood to mean a growth factor intervening in the healing and reconstruction processes of bones, but also of tendons, ligaments, etc.
  • dextran derivatives described above are considered to be copolymers consisting of fictitious subunits R-OH and R-OX, X being able to be a methylcarboxylate, benzylamide, sulphate or sulphonate group, the polysaccharide chain of unsubstituted dextran being considered to be made up of 300 fictitious R-OH subunits, instead of 100 glycosidic units, having regard to the fact that a non-glycosidic unit substituted has three free hydroxyl groups.
  • a dextran methylcarboxylate (DMC) with a degree of substitution (ds) of 1.2 in methylcarboxylate groups contains 1.20 substituted group (RC) and 1.80 free hydroxyl group (R-OH) per glucoside unit.
  • the dextran derivatives described above can be prepared by a process which comprises the following stages, depending on the groups present in the dextran derivative: a) carboxymethylation comprising (i) activation of an unsubstituted dextran, by setting in contact with said dextran with a basic biphasic liquid hydro-alcoholic medium for at least 1 h with stirring, (ii) addition of monochloroacetic acid to the activated product obtained, at a temperature between 40 and 90 ° C, preferably at 60 ° C, the ratio R MC , equal to the number of moles of monochloroacetic acid / number of moles of OH being between 0.3 and 2, (iii) isolation and optionally purification of the dextran methylcarboxylate (DMC) obtained, b) coupling of benzylamine to the methylcarboxylate groups comprising (i) bringing the DMC obtained in a) into contact with benzylamine for at least 2 hours in an acidic aqueous medium, in
  • the water: alcohol ratio of said two-phase liquid hydroalcoholic medium is for example between 10:90 (v / v) and 25:75 (v / v), and is preferably 15:85 (v / v).
  • the water-soluble carbodiimide from step b) is for example selected from the group consisting of l-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) -carbodiimide meta-p-toluene sulfonate (CMC) and l-ethyl-3 hydrochloride - (3-dimethylamino-propyl) -carbodiimide (EDC).
  • the dextran derivatives present in the biomaterial according to the invention exhibit a homogeneity in the distribution of chain sizes, illustrated by an elution profile of symmetrical Gaussian type in chromatography d 'high performance steric exclusion, and homogeneity of the distribution of charged chemical groups, illustrated by an elution profile with a single symmetrical peak in low pressure ion exchange chromatography.
  • said insoluble dextran derivative described above is such that d is equal to 0.
  • the insolubilized dextran derivative present in the biomaterial according to the present invention serves as a vector for said growth factor.
  • Non-covalent interactions for example of electrostatic, polar or apolar type, dipole / dipole, Van der aals bonds, hydrogen or hydrophilic bonds) develop between the growth factor and the dextran derivative.
  • the biomaterial according to the present invention which is in solid form, makes it possible to control the location and the kinetics of the release of the growth factor; it thus constitutes a support material for growth factors with controlled release.
  • said growth factor is selected from the group consisting of EGFs, IGFs, FGFs, TGF- ⁇ , PDGFs and BMPs.
  • said growth factor exhibits osteoinductive activity.
  • It is preferably a BMP, the latter being able to be a recombinant BMP or to be obtained by an extraction process.
  • a recombinant BMP can be produced, for example, by genetic engineering using techniques of molecular biology known in themselves, while an extracted BMP can come from human or animal tissues, in which case a mixture of protein, which includes a mixture of osteoinductive proteins.
  • a biomaterial is a particularly effective vector for an in-situ controlled release of said growth factor.
  • the biomaterial according to the invention is degraded, in vivo, by the cells of the organism, in particular the macrophages, which allows the release of the growth factor vectorized by the insoluble dextran derivative.
  • the biomaterial according to the invention protects and potentiates the effects of the growth factor associated with it (exogenous growth factor); it acts as a reservoir for the said growth factor and it contributes to its controlled release, in bioavailable form, at the level of the injured sites, thereby stimulating healing and tissue regeneration.
  • the biomaterial according to the invention also protects and potentiates endogenous growth factors, released naturally at the injured site.
  • Such a biomaterial makes it possible, surprisingly, to potentiate bone regeneration in a controlled manner.
  • Such a material is also particularly well suited to spinal surgery
  • the biomaterial according to the invention based on at least one dextran derivative, is biocompatible and does not involve the risk of contamination by pathogens of animal origin.
  • the biomaterial according to the invention can advantageously be associated with several growth factors involved in the process of bone reconstruction. It can also advantageously comprise several insolubilized dextran derivatives corresponding to the general formula DMC a BbSu c S d as defined above.
  • biomaterial it is insolubilized by crosslinking using a crosslinking agent.
  • said crosslinking agent is selected from the group consisting of trimetaphosphate 12
  • bisepoxyranes sodium, epichlorohydrin, divinylsulfone, glutaraldehyde and bisepoxyranes.
  • 1,4-butanediol-bis (epoxypropyl) ether 1,4-butanediol-diglycidyl ether.
  • said biomaterial is in the form of a hydrogel, or in the form of a lyophilized powder, said lyophilized powder advantageously being obtained from the above-mentioned hydrogel.
  • biomaterial further comprises a tissue filling material.
  • said biomaterial coats particles of an inorganic or polymeric insoluble support, said particles having a diameter greater than 100 ⁇ m.
  • the biomaterial is insolubilized on said particles and is in a particulate form.
  • said tissue filling material is selected from the group consisting of collagen, gelatin, biological glue, polymers of polylactic or polyglycolic acids and copolymers of polyethylene glycol and polylactide- co-glycolide.
  • said tissue filling material is an osteoconductive material selected from the group consisting of coral, hydroxyapatite, a mixture of collagen and hydroxyapatite, calcium phosphate tricalcium, sulfate calcium and calcium carbonate.
  • Ostoconductive is understood to mean a material serving as a three-dimensional support for regrowth vascular and the growth of osteoprogenitor cells, said material allowing bone regrowth step by step, without being able to initiate the manufacture of bone at an ectopic site, unlike a material "osteoinductive” which, in turn, stimulates osteogenic activity in inducing proliferation and differentiation of cells of the perivascular mesenchyme into osteoprogenitor cells at ectopic site (MR Urist, Science, 1965, 150, 893-899).
  • a subject of the present invention is also a process for preparing the insolubilized biomaterial by crosslinking as described above, characterized in that it comprises the following stages: crosslinking of at least one dextran derivative of general formula DMC a B b Su c S d as described above,
  • said crosslinking of at least one dextran derivative of general formula DMC a B b Su c Sd is carried out using a crosslinking agent as described previously.
  • said crosslinking of at least one dextran derivative of general formula DMC a B b Su c S d is carried out in the presence of an osteoconductive filling material such as previously described.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of the biomaterial in particulate form as described above, characterized in that it comprises the following steps: contacting the dextran derivative with particles of an inorganic or polymeric insoluble osteoconductive support as described above, so as to obtain a composite, insolubilization of the composite obtained above, in the presence of a crosslinking agent,
  • crosslinking agents which can be used in this process are identical to those described above.
  • the present invention also relates to the use of a biomaterial as defined above for the preparation of a repair or filling material for osteoarticular, dental or maxillofacial applications, in particular for the preparation of osteoarticular, dental implants or maxillofacial.
  • the present invention also relates to the use of a biomaterial as defined above for the preparation of an orthopedic, dental or maxillofacial prosthesis coating.
  • Such a prosthesis is for example, and in a nonlimiting manner, made up of a ceramic, a stainless steel, a titanium alloy or a chromium-cobalt alloy.
  • the present invention further relates to a functionalized prosthesis, characterized in that at least part of its surface is coated with a biomaterial according to the invention.
  • FIG. 1 schematically illustrates the structure of a dextran derivative of general formula DMC a B b Su c S d ;
  • FIG. 2a represents the results of electrophoresis on agarose gel at 0.8% of different polymers and of the growth factor TGF- ⁇ 1;
  • FIG. 1 schematically illustrates the structure of a dextran derivative of general formula DMC a B b Su c S d ;
  • FIG. 2a represents the results of electrophoresis on agarose gel at 0.8% of different polymers and of the growth factor TGF- ⁇ 1;
  • FIG. 1 schematically illustrates the structure of a dextran derivative of general formula DMC a B b Su c S d ;
  • FIG. 2a represents the results of electrophoresis on agarose gel at 0.8% of different polymers and of the growth factor TGF- ⁇ 1;
  • FIG. 1 schematically illustrates the structure of a dextran derivative of general formula DMC a B b Su c S d
  • FIG. 2b represents the results of electrophoresis on agarose gel at 0.8% of different polymers and of BMP extracted from bovine bone tissue;
  • Figures 3a and 3b represent the amount (in pg, cumulative values) of TGF- ⁇ l released by the gels T500 (native dextran) and FC27 (derivative of substituted dextran) as a function of time (in hours), respectively without renewal of the medium ( Figure 3a) and with renewal of the medium ( Figure 3b), according to the protocol described in Example 5;
  • FIG. 4a shows an x-ray of bone neoformation induced in rats by BMP extracted from bovine, according to the protocol described in Example 9
  • FIG. 4b represents a view under an optical microscope of a bone nodule formed at an intramuscular site in a rat, according to the protocol described in Example 9
  • FIG. 4c represents a view under an optical microscope of a coral-based implant and of BMP extracted from bovine at an intramuscular site, in a rat, according to the protocol described in example 9.
  • EXAMPLE 1 Demonstration of the interaction of different polymers, including several dextran derivatives of formula DMC a B b Su 0 S d , with the growth factor TGF- ⁇ 1.
  • This example relates to screening tests for polymers, in particular functional dextran derivatives.
  • nalised comprising units chosen from MC, B, S and Su_ j _ as defined above, with a view to selecting polymers having a good affinity for TGF- ⁇ l. a) Polymers used.
  • the structural characteristics of the various polymers used are summarized in Table I below, the degrees of substitution in groups CM, B, Su and S being indicated for each polymer.
  • the polymer "T40" indicates a native dextran (Pharmacia Fine Chemical, average molar mass by weight M w : 37,500 g / mol, M w / M n : 1.7, M n representing the average molar mass by number).
  • the other polymers correspond to functionalized dextran derivatives.
  • sample buffer namely 125 mM sodium acetate, Tris buffer pH 7.00, 50 mM and 0.5% bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • the samples are loaded onto the agarose gel, onto which 2 ⁇ l of 75% glycerol and Bromophenol Blue have been previously deposited.
  • the electrophoresis is carried out for 4 h under a current of 200 mA, at a temperature of 4 ° C.
  • the migration buffer is a buffer comprising 125 mM sodium acetate and Tris-HCl buffer pH 7.00, 50 mM.
  • the gel is incubated for 15 to 20 minutes in a transfer buffer comprising Tris-HCl buffer pH 9.00, 25 mM, glycine 192 mM, 20% methanol and ⁇ DS ( sodium lauryl sulfate).
  • a transfer buffer comprising Tris-HCl buffer pH 9.00, 25 mM, glycine 192 mM, 20% methanol and ⁇ DS ( sodium lauryl sulfate).
  • the gel is then transferred by capillarity onto a PVDF membrane (polyvinylidene fluoride) previously soaked in methanol then in ultrapure water (3 minutes) and finally in the transfer buffer, the transfer being carried out by capillary action overnight .
  • PVDF membrane polyvinylidene fluoride
  • the PVDF membrane is then soaked for 20 minutes in a TBS buffer mixture (20 mM Tris-HCl and 150 mM NaCl), 0.05% Tween and 1% BSA, then 20 minutes in a TBS, 0.05% Tween buffer mixture and 1% gelatin.
  • a TBS buffer mixture (20 mM Tris-HCl and 150 mM NaCl), 0.05% Tween and 1% BSA, then 20 minutes in a TBS, 0.05% Tween buffer mixture and 1% gelatin.
  • a colorimetric development is then carried out.
  • a 0.5% orthodianisidine solution in methanol 50 mg in 10 ml
  • a 0.01% hydrogen peroxide solution / Tris buffer pH 7.4, 10 mM are prepared.
  • the colorimetric revelation is carried out by adding to the membrane 50 ml of Tris buffer and 125 ⁇ l of the ortho-dianisidine solution (ie 0.00125%). A brown coloration appears in a few minutes.
  • the colorimetric development is then stopped by adding water.
  • TGF- ⁇ l does not interact with native dextran T40, nor with DMC7, derived from dextran only carboxymethylated.
  • DMCB2 Two products stand out from the crowd: DMCB2 and FC27, for which the migration front is strongly displaced towards the anode. Their common point is a high rate of substitution with benzylamide groups.
  • Other gel electrophoreses, not shown here, have also shown that TGF- ⁇ 1 interacts with a dextran derivative substituted only by MC groups
  • EXAMPLE 2 Demonstration of the interaction of different polymers, including several dextran derivatives of formula DMC a B b Su c S d , with bovine extract BMP (bBMP).
  • this example has relates to screening tests for polymers, in particular functionalized dextran derivatives, with a view to selecting polymers having a good affinity for bBMP (bovine BMP).
  • bBMP bovine BMP
  • EXAMPLE 3 Preparation of a biomaterial according to the invention. a) Preparation of a dextran derivative insoluble in sodium trimetaphosphate (TMP)
  • TMP allows the crosslinking of the dextran derivative. This reaction involves phosphorylation of the polysaccharide through covalent bonds 20
  • dextran derivatives of general formula DMC a B b Su c S d according to the invention having, due to their substitution, few free hydroxyl groups, their crosslinking will be carried out in the presence of native dextran (unsubstituted).
  • the very viscous solution obtained above is aliquoted in volumes of 1 ⁇ l on a teflon® plate and the whole is placed in an oven at 40 ° C for 2 h.
  • the dry gels thus obtained are suspended twice for 24 h in a large excess (2 ml) of ultrapure water, this in order to remove the traces of soda in the gel, then lyophilized and then sterilized by ionizing radiation. (25 kGray).
  • bBMP association of a growth factor
  • This hydrogel can be lyophilized in order to preserve the biomaterial according to the invention in the form of a powder (obtaining 100 ready-to-use lyophilisates from 100 ⁇ l of starting solution).
  • the lyophilisate can be used as it is or rehydrated with 10 ⁇ l of ppi water (for injection) per mg of lyophilisate.
  • EXAMPLE 4 Another protocol for preparing a biomaterial according to the invention. a) Preparation of a dextran derivative insolubilized with the ether of 1,4-butanediol-diglycidyl 700 ⁇ l of a dextran solution T500
  • the lyophilisate is immersed in a solution of 1, -butanediol-diglycidyl ether in ethyl ether (0.5% by volume) for 30 minutes at room temperature, then the ethyl ether is evaporated at 40 ° C under empty.
  • the dry crosslinked gel is successively suspended in 2 ml of 0.1 M NaOH, 2 ml of double distilled water, 2 ml of 2 M NaCl and finally 3 x 2 ml of double distilled water.
  • the gel is lyophilized, then rehydrated with 1 ml of double distilled water.
  • the soft gel obtained is then placed in a container consisting of a glass plate of 3 cm x 3 cm having a rim 1 mm in height.
  • a glass cover is placed on this container and the whole is frozen at -80 ° C.
  • the ice-cream cake obtained (3 x 3 x 0.1 cm 3 ) is freeze-dried in the container, which has been removed from its lid, then cut with a razor blade into dry gels with a side size of 5 mm (i.e. volumes of 25 ⁇ l).
  • the dry gels are suspended twice for 24 h in a large excess of ultrapure water (20 ml), then lyophilized and sterilized by ionizing radiation (25 kGray).
  • the dextran derivative designated FC27 in Table I is used, that is to say a dextran whose respective degrees of substitution in MC, B and Su units are 0.75, 0.37 and 0.64, said dextran being insolubilized according to the protocol described in example 3.
  • the control is a native dextran T500, also insolubilized as described in example 3.
  • PBS phosphate buffer comprising 0.02% sodium azide (bactericidal agent) and 0.5% bovine serum albumin (BSA), this compound making it possible to avoid the adsorption of growth factor on the walls glass tube, and
  • TGF- ⁇ l 100 ng of TGF- ⁇ l.
  • the control is prepared in a similar manner, but using 0.30 g of native dextran and 400 ⁇ l of phosphate buffer (in fact, dextran gel T500 has a greater swelling rate than FC27, this difference being able to s '' explain by a difference in the crosslinking rates).
  • each gel is washed with phosphate buffer in order to remove the unabsorbed growth factor.
  • the growth factor remaining in the tube and in the washing buffer is then assayed by the ELISA method.
  • Table II summarizes the quantities of TGF- ⁇ 1 adsorbed in the gel of functionalized dextran derivative (FC27) and in the native dextran gel T500 (control).
  • TGF- ⁇ l concentration of TGF- ⁇ l of 14.9% at the amount initially added for T500 and 23.1% for FC27.
  • T500 and FC27 respectively adsorbed 85.1% and 76.9% of the TGF- ⁇ 1 initially added: the two gels adsorb TGF- ⁇ l significantly.
  • Protocol. The kinetics of release of TGF- ⁇ 1 are carried out in 6-well silicone plates.
  • FC27 and T500 gels in which TGF- ⁇ 1 is adsorbed are incubated in the wells in the presence of PBS phosphate buffer (either 5 ml or 10 ml, as described below), of 0.02% azide sodium and 0.5% BSA, at room temperature.
  • the assay of TGF- ⁇ l released into the medium is carried out by a conventional ELISA method, using 96-well microtiter plates coated with a solution of anti-TGF- ⁇ monoclonal antibody (2 ⁇ g / ml) in a buffer. carbonate, pH 9.6.
  • the plate is sealed, incubated overnight at 4 ° C. without shaking, then washed 5 times with 300 ⁇ l of PBS buffer pH 7.4 comprising 0.05% Tween 20.
  • the blocking of non-specific sites is then carried out with a 0.5% BSA solution (addition of 300 ⁇ l of the solution per well, followed by 1 h of incubation at room temperature without shaking).
  • the standard samples are prepared (range of TGF- ⁇ 1 from 31.25 to 2000 pg / ml) and the samples to be tested.
  • Each well contains 100 ⁇ l of each sample and is incubated with shaking for 1 h 30 min at room temperature. After a suitable washing of the plate with the washing solution described above, the wells are incubated with a solution of primary anti-human TGF antibody biotinylated at 100 ng / ml (100 ⁇ l / well) in PBS / Tween buffer 20 to 0.05% / BSA 0.5%.
  • the wells are incubated with a solution diluted to 1/10000 (100 ⁇ l / well) of streptavidin coupled with peroxidase.
  • a final washing of the plate is then carried out, then the plate is revealed to the ODP (1 tablet in 25 ml of citrate buffer pH 5, 0.05 M, to which 33.3 ⁇ l of 9% hydrogen peroxide is added %) by adding 200 ⁇ l of reagent per well.
  • the reaction develops for 3-4 minutes then is stopped by adding 50 ⁇ l of 3M sulfuric acid.
  • Figures 3a and 3b represent the quantity (in pg, cumulative values) of TGF- ⁇ l released by the T500 and FC27 gels as a function of time (in hours), respectively without renewal of the medium ( Figure 5a) and with renewal of the medium ( Figure 5b).
  • a solution of native dextran of high molar mass (greater than or equal to 500,000 g / mol), such as the dextran used in Example 3 are mixed with 20 ⁇ l of a solution of DMCB2 (same derivative of dextran as in Example 3), said solutions being produced in 0.5 M NaOH at concentra- 300 mg / ml.
  • 80 mg of granules (0.5 mm in diameter) of tricalcium calcium phosphate are mixed with the preceding solution and 10 ⁇ l of a solution of TMP in 0.5 M NaOH at a concentration of 300 mg / ml are added thereto.
  • the mixture obtained is molded in the form of a cubic specimen of 5 mm 3 and placed in the oven at 40 ° C for 2 h.
  • the specimen obtained is suspended twice for 24 h in ultrapure water (100 times the volume of the cube) with gentle stirring, dried in an oven under vacuum at 40 ° C for 1 night, then sterilized as described in Example 3.
  • 210 ml of a solution of native dextran of high molar mass (greater than or equal to 500,000 g / mol), for example the dextran T500 described in example 3, are mixed with 60 ml of a solution of DMCB2 as described in Example 3, said solutions being produced in 0.5 M NaOH at concentrations of 300 mg / ml.
  • 30 ml of a solution of TMP in 0.5 M NaOH at a concentration of 300 mg / ml are added to this mixture.
  • the very viscous solution obtained (300 ml) is quickly homogenized and placed at 37 ° C in a suitable container.
  • the control is a 0.5 cm 3 coral cube (Porites supplied by Biocoral Inc.) loaded with 100 ng of BMP extracted from bovine.
  • the animals, 10 in number are 3-week-old Sprague-Dawley rats, weighing approximately 70 g. They are anesthetized with a solution of Ketalar ® and Xylaxine ® .
  • a gel particle (approximately 1% of the initial volume of the gel) is removed with forceps and placed intramuscularly, in the paravertebral muscles.
  • the skin of the animals is closed with a non-absorbable suture thread.
  • the implantation is maintained for 1 month, then the animals are sacrificed for a histological study of the implants in the muscle mass.
  • FIG. 4a represents an X-ray of the new bone formation.
  • Figure 4b shows a view (magnification: x 100) of a newly formed bone nodule at the intramuscular site. Note the mature cortical structure of the nodule. 28
  • Figure 4c (magnification: x 100) represents the control of the study (coral loaded with BMP).
  • the porosities of the material are poorly cellularized, the material is intact (no resorption) and no new bone formation is observed.

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Abstract

L'invention est relative à un biomatériau comprenant essentiellement au moins un dérivé de dextrane insolubilisé de formule générale DMCaBbSucSd et au moins un facteur de croissance présentant une activité sur les tissus ostéo-articulaires, dentaires et/ou maxillo-faciaux, et à son procédé de préparation. L'invention est également relative aux utilisations dudit biomatériau pour la préparation d'un matériau de réparation ou de comblement, tel qu'un implant, pour applications ostéoarticulaires, dentaires ou maxillo-faciales et pour la préparation d'un revêtement de prothèse orthopédique, dentaire ou maxillo-faciale, ainsi qu'à la prothèse revêtue dudit biomatériau.

Description

BIOMATERIAU A BASE D'UN DERIVE DE DEXTRANE INSOLUBILISE ET D'UN FACTEUR DE CROISSANCE
La présente invention est relative à un bio- matériau, à son procédé de préparation et à ses applications, notamment comme matériau de réparation ou de comblement dans le domaine ostéo-articulaire, dentaire ou maxillo-facial .
Pour consolider des défauts osseux, des métho- des couramment employées sont l' autogreffe ou l' allogreffe . L' autogreffe cortico-spongieuse est la méthode la plus ancienne : elle permet d' obtenir une consolidation osseuse de bonne qualité, de parfaite tolé¬ rance immunitaire et sans risque de transmission d'agents pathogènes. Toutefois, le stock osseux est limité chez un individu surtout chez l'enfant, et le geste chirurgical supplémentaire qui en découle entraîne des risques de complications. Quant à l' allogreffe, prélevée sur des sujets en état de mort cérébrale, elle ne présente que des propriétés ostéoconductrices et non ostéoinductrices, puisque l'os prélevé est congelé de manière à détruire tous les éléments qui pourraient déclencher une réaction immunitaire de rejet de la greffe par l'organisme receveur ou être vecteur d'infections. Ce traitement diminue en outre les propriétés mécaniques de l'os.
De par les insuffisances des greffes osseuses, les matériaux substitutifs de l'os sont à l'heure actuelle la voie essentielle de recherche pour favoriser la consolidation osseuse. Ces matériaux ont une importance considérable en santé publique. En effet, de nombreux matériaux synthétiques ou métalliques sont utilisés en tant que matériaux de remplacement de l'os dans des indications aussi diverses que la greffe osseuse ou la prothèse totale de hanche. Ce sont actuellement 60 000 prothèses totales de hanche qui sont implantées chaque année en France. En 1988, une étude épidémiologique a montré que la moitié des implants posés chez 16 millions de patients américains était des implants orthopédiques. Ces statistiques peuvent être extrapolées à la situation française.
La consolidation osseuse fait intervenir différents types de cellules issues soit de la lignée mésen- chymateuse (préostéoblastes, osteoblastes et ostéocytes) , soit de la lignée hématopoïétique (ostéoclastes) . Les osteoblastes, localisés à la surface osseuse, interviennent dans la synthèse d'une nouvelle matrice osseuse. Les ostéocytes sont inclus dans la matrice osseuse ; reliés entre eux, ils forment un véritable réseau intercellulaire. Les ostéoclastes, qui permettent de résorber l'os, sont sous la dépendance de facteurs de croissance. L'activité ostéoclastique est essentielle à la reconstruction, car elle est elle-même capable d'amplifier les acti- vités de synthèse des osteoblastes par l'intermédiaire, entre autres, de facteurs de croissance. Les plaquettes ont également un rôle important : elles libèrent de grandes quantités de facteurs de croissance, au stade initial de la réparation osseuse. Les facteurs de croissance sont une catégorie de polypeptides ayant des propriétés régulatrices de nombreux paramètres de la vie cellulaire (tels que la prolifération, la différenciation, la survie) . Ces facteurs sont sécrétés par de multiples types de cellules. Les effets d'un même facteur sont déterminés par la nature de la cellule cible, la concentration du facteur, la présence simultanée éventuelle d'autres facteurs. Les cellules cibles possèdent des récepteurs membranaires à ces facteurs, le plus souvent des tyrosines kinases. Leur sti- mulation régule la synthèse ou l'activité de protéines régulatrices. La dénomination des facteurs de croissance est le plus souvent tirée du matériel où ils ont été mis en évidence pour la première fois et n'est pas toujours représentative de leur fonction. Le tissu osseux contient une variété de facteurs de croissance et de différenciation qui contrôlent la formation et la résorption osseuse et qui jouent également un rôle important dans le développement, la crois- sance et la réparation du cartilage et de l'os. Ces principaux facteurs sont les EGFs (« Epidermic Growth Factor ») , les IGFs (« Insulin-like Growth Factor ») , les FGFs (« Fibroblast Growth Factor ») , les TGF-β (« Transforming Growth Factor ») , les PDGFs (« Pla telet- Derived Growth Factor ») et les BMPs (« Bone Morphogenetic Proteins ») .
Les BMPs font partie de la superfamille des TGF-β. Leur activité ostéoinductrice a été démontrée par M. R. Urist en 1965 (Science, 1965, 150, 893-899) : de l'os déminéralisé a été implanté en site ectopique, à savoir intramusculaire, chez le rat et a donné lieu à la formation de cartilage, puis d'os. Les protéines extraites de l'os déminéralisé et responsables de cette induction osseuse ont été purifiées et appelées les Bone Morphogenetic Proteins (BMP) . Sept protéines (BMP-1 à 7) ont été initialement clonées grâce à des techniques de biologie moléculaire (Wozney, J.M. et al . , Science, 1988, 242, 1528-1534). Il a depuis été montré que la BMP-1 n'a pas de propriétés ostéoconductrices. A ce jour, de nombreuses autres BMPs ont été clonées.
L'utilisation de BMPs seules dans la réparation osseuse implique l'injection de grandes quantités, bien supérieures à celles efficaces dans les études in vi tro ou détectées dans les tissus normaux.
Par ailleurs, l'effet systémique de ces produits présente des risques de diffusion de BMP dans la masse musculaire environnante et de calcification locale en site non-osseux. En outre, les BMP ont des durées de vie très courtes, de l'ordre de quelques minutes sous forme libre.
Il serait donc souhaitable de développer un vecteur des BMPs ainsi que des autres facteurs de croissance impliqués dans la réparation osseuse. T.R. Gerhart et al . (Clinical orthopaedics and related research, 1993, 293, 317-326 et 1995, 318, 222- 230) ont proposé de mélanger la BMP-2 recombinante humaine à de la matrice osseuse inactive (1,5 mg de BMP pour 3 g de matrice osseuse) afin de réaliser des implants osseux. Ces implants permettent d'induire une réossification de défauts d'une longueur de 2,5 cm artificiellement créés au niveau des fémurs de moutons. Toutefois, la quantité de BMP apportée par l'implant (1,5 mg) est 25 000 fois supérieure à la quantité de BMP présente de façon endogène dans les tissus osseux natifs (~ 0,06 μg) .
D'autres types de supports ont également été proposés : collagène, hydroxyapatite, gélatine, phosphate de calcium tricalcique, sulfate de calcium, carbonate de calcium, corail, polymères d'acides polylactique et poly- glycolique, etc.
Tous ces composés naturels ou synthétiques, organiques ou minéraux, ne sont pas réellement des vecteurs de la BMP. Ils présentent en effet une affinité plus ou moins bonne avec le facteur de croissance.
Parallèlement à ces travaux, il a été montré que, de façon similaire à l'héparine et aux héparanes sulfates, les dextranes (D) substitués par des groupes carboxyméthyles (MC) , benzylamides (B) et sulfonates (S)
(composés dénommés DMCBS) interagissent avec certains facteurs de croissance, les HBGFs (Heparin Binding Growth
Factors) , en particulier avec les FGFs et les TGF-β. Ils potentialisent les effets biologiques de ces facteurs endogènes, libérés au niveau du site lésé, en les protégeant contre les dégradations d'origine thermique, acide ou protéolytique (F. Blanquaert et al . , Bone, 1995, 17, 6, 499-506 ; A. Meddahi et al . , Journal of Biomédical Materials Research, 1996, 31, 293-297 ; J. Lafont et al . , Growth factors, 1998, 16, 23-38 ; F. Blanquaert et al . , Journal of Biomédical Materials Research, 1999, 44, 63-72) .
Dans le domaine de la réparation osseuse, des CMDBS particuliers, le RGTA9 et le RGTA11 (composés comprenant respectivement 83 % ou 110 % d'unités CM, 23 % ou 2,6 % d'unités B et 13 % ou 36,5 % d'unités S), immobilisés dans un support de collagène, ont permis d'induire une régénération osseuse (articles précités de temporaire pour les facteurs de croissance qui sont naturellement sécrétés au niveau du site lésé.
De telles combinaisons entre les DMCBS et les facteurs de croissance, qui se forment in vivo, ne constituent pas un vecteur efficace desdits facteurs de croissance dans une utilisation en chirurgie, notamment en chirurgie rachidienne, maxillo-faciale, dentaire ou toute chirurgie reconstructive . En effet, leur forme soluble ne permet pas de maîtriser la diffusion des facteurs de croissance au niveau d'un site précis. En outre, ces combinaisons ne permettent pas de restituer la géométrie de pièces osseuses détruites, notamment de grands défauts osseux, au niveau desquels les facteurs de croissance endogènes ne sont pas présents en quantité suffisante pour pouvoir initier une consolidation spontanée. Il est alors nécessaire d'ajouter des facteurs de croissance exogènes, qui doivent être utilisés in vivo en combinaison avec un système de libération adapté.
Les Inventeurs se sont donc donné pour but de pourvoir à un matériau support de facteurs de croissance, notamment de BMPs, répondant aux impératifs suivants :
- il se présente sous forme solide,
- il est adapté à la reconstruction de grandes pertes de substance ostéoarticulaire, notamment à la reconstruction de défauts osseux,
- il présente une réelle affinité pour le facteur de croissance,
- il permet de contrôler la cinétique de libération du facteur de croissance, - il permet de contrôler la localisation de la libération du facteur de croissance, en évitant sa diffusion en site extra-osseux, il permet de contrôler la concentration locale de facteur de croissance libéré, - il ne présente pas d'activité mutagène, il est biocompatible, non-immunogénique,- non toxique, biodégradable, - il protège la molécule bioactive, sans la dénaturer, il permet en outre de diminuer la quantité de BMP utilisée. La présente invention a pour objet un biomatériau, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement :
(1) au moins un dérivé de dextrane insolubilisé, de formule générale DMCaBbSucSd, dans laquelle :
D représente une chaîne polysaccharidique, de préférence constituée par des enchaînements d'unités glucosidiques,
MC représente des groupes méthylcarboxylates, B représente des groupes carboxyméthyl-benzyl- amides, Su représente des groupes sulfates
(sulfatation des fonctions hydroxyles libres portées par les unités glucosidiques) ,
S représente des groupes sulfonates (sulfonatation des noyaux aromatiques des groupes B) , a, b, c et d représentent le degré de substitution (ds) , exprimé par rapport au nombre de fonctions hydroxyles libres dans une unité glucosidique du dextrane, respectivement en groupements MC, B, Su et S ; a > à 0,3, b étant égal à 0 ou > à 0,2, c étant égal à 0 ou > à 0,1 et d étant égal à 0 ou < 0,15, à la condition que, lorsque b est égal à 0, c n'est pas égal à 0, et
(2) au moins un facteur de croissance présentant une activité sur les tissus ostéo- articulaires, dentaires et/ou maxillo-faciaux. On entend par « facteur de croissance présentant une activité sur les tissus ostéoarticulaires, dentaires et/ou maxillo-faciaux » un facteur de croissance intervenant dans les processus .de cicatrisation et de reconstruction des os, mais aussi des tendons, des ligaments, etc.
Les dérivés de dextrane décrits ci-dessus sont considérés comme étant des copolymères constitués de sous-unités fictives R-OH et R-OX, X pouvant être un groupement methylcarboxylate, benzylamide, sulfate ou sulfonate, la chaîne polysaccharidique du dextrane non substitué étant considérée comme étant constituée de 300 sous-unités fictives R-OH, au lieu de 100 unités glucosi- diques, eu égard au fait qu'une unité glucosidique non substituée comporte trois groupes hydroxyles libres. Ainsi, un dextrane methylcarboxylate (DMC) avec un degré de substitution (ds) de 1,2 en groupements méthylcarboxylates contient 1,20 groupement substitué (R-C) et 1,80 groupement hydroxyle libre (R-OH) par unité glucosidique.
Les dérivés du dextrane décrits ci-dessus peuvent être préparés par un procédé qui comprend les étapes suivantes, en fonction des groupes présents dans le dérivé de dextrane : a) carboxyméthylation comprenant (i) l'activation d'un dextrane non substitué, par mise en contact dudit dextrane avec un milieu hydro-alcoolique liquide biphasique basique pendant au moins 1 h sous agitation, (ii) addition de l'acide monochloroacetique au produit activé obtenu, à une température comprise entre 40 et 90°C, de préférence à 60°C, le rapport RMC, égal au nombre de moles d'acide monochloracétique/nombre de moles d'OH étant compris entre 0,3 et 2, (iii) isolement et éventuellement purification du dextrane methylcarboxylate (DMC) obtenu, b) couplage de la benzylamine sur les groupes méthylcarboxylates comprenant (i) la mise en contact, pendant au moins 2 h et en milieu aqueux acide, du DMC obtenu en a) avec de la benzylamine, en présence d'une carbodiimide hydrosoluble comme agent de couplage, à une température comprise entre 0°C et 30°C, le rapport molaire carbodiimide hydrosoluble/MC étant compris entre 0,25 et 2 et le rapport molaire benzylamine/MC étant compris' entre 0,25 et 2, (ii) l'isolement du dextrane méthylcarboxyle benzylamide (DMCB) obtenu et éventuellement sa purification, c) sulfatation comprenant (i) la formation d'un sel de trialkylammonium du DMCB obtenu en b) , (ii) la solubilisation du sel obtenu dans un solvant polaire anhydre, généralement une base de Lewis, telle que le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou la diméthylformamide (DMF) et (iii) l'ajout audit sel en solution, d'un complexe à base de trioxyde de soufre tel que S03-pyridine, S03- triéthylamine ou S03-DMF en solution dans le même solvant, à une température inférieure à 70 °C, le rapport molaire complexe à base de trioxyde de soufre/OH libres étant compris entre 0,25 et 12, et d) sulfonatation des groupes B par mélange sous agitation d'un dérivé DMCB obtenu en b) ou DMCBSu obtenu en c) en suspension dans un solvant anhydre avec de l'acide chlorosulfonique en solution dans le même solvant, à une température comprise entre la température ambiante et la température d'ébullition du solvant utilisé.
A l'étape a), le rapport eau:alcool dudit milieu hydro-alcoolique liquide biphasique est par exemple compris entre 10:90 (v/v) et 25:75 (v/v), et est de préférence de 15:85 (v/v).
La carbodiimide hydrosoluble de l'étape b) est par exemple sélectionnée dans le groupe constitué par le l-cyclohexyl-3- (2-morpholinoéthyl) -carbodiimide méta-p- toluène sulfonate (CMC) et le chlorhydrate de l-éthyl-3- (3-diméthylamino-propyl) -carbodiimide (EDC) .
Lorsqu'ils sont préparés par le procédé décrit ci-dessus, les dérivés de dextrane présents dans le biomatériau selon l'invention présentent une homogénéité de la distribution des tailles de chaînes, illustrée par un profil d'élution de type gaussien symétrique en chromatographie d'exclusion stérique haute performance, et une homogénéité de la distribution des groupements chimiques chargés, illustrée par un profil d'élution à un seul pic symétrique en chromatographie d'échange d'ions basse pression.
De façon préférée, ledit dérivé de dextrane insolubilisé décrit ci-dessus est tel que d est égal à 0. Le dérivé de dextrane insolubilisé présent dans le biomatériau selon la présente invention sert de vecteur audit facteur de croissance. Des interactions non covalentes (par exemple de type électrostatique, polaire ou apolaire, dipôle/dipôle, des liaisons de Van der aals, des liaisons hydrogènes ou hydrophiles) se développent entre le facteur de croissance et le dérivé de dextrane.
De façon particulièrement avantageuse, le biomatériau selon la présente invention, qui se présente sous forme solide, permet de contrôler la localisation et la cinétique de la libération du facteur de croissance ; il constitue ainsi un matériau support de facteurs de croissance à libération contrôlée. De préférence, ledit facteur de croissance est sélectionné dans le groupe constitué par les EGF, les IGFs, les FGFs, les TGF-β, les PDGFs et les BMPs.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit facteur de croissance présente une activité ostéoinductrice. Il s'agit de préférence d'une BMP, cette dernière pouvant être une BMP recombinante ou être obtenue par un procédé d'extraction. Une BMP recombinante peut être produite, par exemple, par génie génétique en faisant appel à des techniques de biologie moléculaire connues en elles-mêmes, alors qu'une BMP extraite peut être issue de tissus humains ou animaux, auquel cas on obtient un mélange de protéines, qui comprend notamment un mélange de protéines ostéoinductrices . De manière inattendue, un tel biomatériau est un vecteur particulièrement efficace pour une libération contrôlée in si tu dudit facteur de croissance.
En effet, le biomatériau selon l'invention est dégradé, in vivo, par les cellules de l'organisme, notamment les macrophages, ce qui permet la libération du facteur de croissance vectorisé par le dérivé de dextrane insolubilisé. Le biomatériau selon l'invention protège et potentialise les effets du facteur de croissance qui lui est associé (facteur de croissance exogène) ; il agit comme un réservoir pour ledit facteur de croissance et il contribue à sa libération contrôlée, sous forme biodisponible, au niveau des sites lésés, stimulant ainsi la cicatrisation et la régénération tissulaire. Le biomatériau selon l'invention protège et potentialise également les facteurs de croissance endogènes, libérés naturelle- ment au niveau du site lésé.
Dans le domaine orthopédique, où le comblement de défauts osseux d'origine traumatique ou tumorale et le descellement de prothèses implantées posent des problèmes difficiles de reconstruction, un tel biomatériau permet, de manière surprenante, de potentialiser la régénération osseuse de façon contrôlée. Un tel matériau est également particulièrement bien adapté à la chirurgie rachidienne
(par exemple pour réaliser des arthrodèses du rachis, c'est-à-dire faire fusionner plusieurs vertèbres entre elles), à la chirurgie maxillo-faciale, à la chirurgie dentaire et à la chirurgie reconstructive .
De façon particulièrement avantageuse, le biomatériau selon l'invention, à base d'au moins un dérivé du dextrane, est biocompatible et n'entraîne pas de ris- que de contamination par des agents pathogènes d'origine animale .
Le biomatériau selon l'invention peut avantageusement être associé à plusieurs facteurs de croissance impliqués dans le processus de reconstruction osseuse. Il peut également avantageusement comprendre plusieurs dérivés de dextrane insolubilisés répondant à la formule générale DMCaBbSucSd telle que définie ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit biomatériau, il est insolubilisé par réticulation à l'aide d'un agent réticulant.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit agent réticulant est sélectionné dans le groupe constitué par le trimétaphosphate de 12
sodium, l' épichlorhydrine, la divinylsulfone, le glutaraldehyde et les bisepoxyranes. A titre d'exemple de bisepoxyranes utilisables, on peut citer l'éther de 1,4- butanediol-bis (époxypropyle) et l'éther de 1, 4-butanediol- diglycidyle.
Tous ces agents réticulants permettent de créer des ponts entre les fonctions hydroxyles des chaînes des dérivés de dextrane.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit biomatériau, il se présente sous la forme d'un hydrogel, ou sous la forme d'une poudre lyophilisée, ladite poudre lyophilisée étant avantageusement obtenue à partir de l' hydrogel sus-mentionné .
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit biomatériau, il comprend en outre un matériau de comblement tissulaire.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux dudit biomatériau, il enrobe des particules d'un support insoluble minéral ou polymérique, lesdites particules ayant un diamètre supérieur à 100 μm. Selon cet aspect de l'invention, le biomatériau est insolubilisé sur lesdites particules et se présente sous une forme particulaire.
Selon une disposition avantageuse de ces modes de réalisation, ledit matériau de comblement tissulaire est sélectionné dans le groupe constitué par le collagène, la gélatine, la colle biologique, les polymères d'acides polylactique ou polyglycolique et les copolymères de polyéthylène glycol et de polylactide-co-glycolide. Selon une autre disposition avantageuse de ces modes de réalisation, ledit matériau de comblement tissulaire est un matériau ostéoconducteur sélectionné dans le groupe constitué par le corail, l' hydroxyapatite, un mélange de collagène et d' hydroxyapatite, le phosphate de calcium tricalcique, le sulfate de calcium et le carbonate de calcium.
On entend par « ostéoconducteur » un matériau servant de support tridimensionnel pour la repousse vasculaire et la croissance des cellules ostéoprogénitrices, ledit matériau permettant la repousse osseuse de proche en proche, sans être capable d'initier la fabrication d'os en site ectopique, contrairement à un matériau « ostéoinducteur » qui, lui, stimule une activité ostéogénique en induisant une prolifération et une différenciation des cellules du mésenchyme périvasculaire en cellules ostéoprogénitrices en site ectopique (M. R. Urist, Science, 1965, 150, 893-899) . La présente invention a également pour objet un procédé de préparation du biomatériau insolubilisé par réticulation tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce qu' il comprend les étapes suivantes : réticulation d' au moins un dérivé de dextrane de formule générale DMCaBbSucSd telle que décrite ci-dessus,
- adsorption, dans le dérivé de dextrane insolubilisé obtenu ci-dessus, d'au moins un facteur de croissance tel que défini précédemment, - obtention d'un biomatériau selon l'invention sous la forme d'un hydrogel,
- éventuellement, lyophilisation dudit hydrogel afin d'obtenir le biomatériau selon l'invention sous la forme d'une poudre. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé selon l'invention, ladite réticulation d'au moins un dérivé de dextrane de formule générale DMCaBbSucSd s'effectue à l'aide d'un agent réticulant tel que décrit précédemment . Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé selon l'invention, ladite réticulation d'au moins un dérivé de dextrane de formule générale DMCaBbSucSd s'effectue en présence d'un matériau de comblement ostéoconducteur tel que décrit précédemment. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation du biomatériau sous forme particulaire tel que décrit précédemment, caractérisé en ce qu' il comprend les étapes suivantes : - mise en contact du dérivé de dextrane avec des particules d'un support ostéoconducteur insoluble minéral ou polymérique telles que décrites précédemment, de façon à obtenir un composite, - insolubilisation du composite obtenu ci- dessus, en présence d'un agent réticulant,
- adsorption, dans le composite insolubilisé obtenu ci-dessus, d'au moins un facteur de croissance tel que défini précédemment. Les agents réticulants utilisables dans ce procédé sont identiques à ceux décrits précédemment.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un biomatériau tel que défini précédemment pour la préparation d'un matériau de réparation ou de comblement pour applications ostéoarticulaires, dentaires ou maxillo-faciales, notamment pour la préparation d'implants ostéoarticulaires, dentaires ou maxillo- faciaux.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un biomatériau tel que défini précédemment pour la préparation d'un revêtement de prothèse orthopédique, dentaire ou maxillo-faciale.
Une telle prothèse est par exemple, et de façon non limitative, constituée d'une céramique, d'un acier inoxydable, d'un alliage de titane ou encore d'un alliage chrome-cobalt.
La présente invention a, en outre, pour objet une prothèse fonctionnalisée, caractérisée en ce qu'une partie au moins de sa surface est revêtue d'un biomatériau selon l'invention.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui res- sortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de biomatériaux selon l'invention et à des exemples de leur utilisation, ainsi qu'aux figures annexées, dans lesquelles : la figure 1 illustre schématiquement la structure d'un dérivé de dextrane de formule générale DMCaBbSucSd ; la figure 2a représente les résultats d' électrophorèses sur gel d'agarose à 0,8 % de différents polymères et du facteur de croissance TGF-βl ; la figure 2b représente les résultats d' électrophorèses sur gel d'agarose à 0,8 % de différents polymères et de BMP extraite d'un tissu osseux bovin ; - les figures 3a et 3b représentent la quantité (en pg, valeurs cumulées) de TGF-βl libéré par les gels T500 (dextrane natif) et FC27 (dérivé de dextrane substitué) en fonction du temps (en heures), respectivement sans renouvellement du milieu (figure 3a) et avec renouvellement du milieu (figure 3b) , selon le protocole décrit dans l'exemple 5 ;
- la figure 4a représente une radiographie de la néoformation osseuse induite chez des rats par de la BMP extraite bovine, selon le protocole décrit dans l'exemple 9 ; la figure 4b représente une vue au microscope optique d'un nodule osseux formé en site intramusculaire chez un rat, selon le protocole décrit dans l'exemple 9 ; - la figure 4c représente une vue au microscope optique d'un implant à base de corail et de BMP extraite bovine en site intramusculaire, chez un rat, selon le protocole décrit dans l'exemple 9.
Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Mise en évidence de l'interaction de différents polymères , dont plusieurs dérivés de dextrane de formule DMCaBbSu0Sd, avec le facteur de croissance TGF-βl .
Cet exemple a trait à des tests de criblage de polymères, en particulier de dérivés de dextrane fonction- 16
nalisés comportant des unités choisies parmi MC, B, S et Su_j_ telles que définies précédemment, en vue de sélectionner des polymères ayant une bonne affinité pour le TGF-βl. a) Polymères utilisés.
Les caractéristiques structurelles des différents polymères utilisés sont résumées dans le tableau I ci-après, les degrés de substitution en groupes CM, B, Su et S étant indiqués pour chaque polymère. Le polymère « T40 » indique un dextrane natif (Pharmacia Fine Chemical, masse molaire moyenne en poids Mw : 37500 g/mol, Mw/Mn : 1,7, Mn représentant la masse molaire moyenne en nombre) . Les autres polymères correspondent à des dérivés de dextrane fonctionnalisés.
Tableau I
b) Matériels et méthode.
15 ng (0,5 μl) de TGF-βl (fourni par R&D System) , seul (contrôle) ou en présence de 100 μg de 17
polymère, sont dissous dans 10 μl de tampon d'échantillon, à savoir de l'acétate de sodium 125 mM, du tampon Tris pH 7,00, 50 mM et 0,5 % de sérum albumine bovine (BSA). Les échantillons sont incubés pendant 1 à 2 h à 4°C. On prépare 45 ml d'un gel d'agarose à 0,8 %.
Les échantillons sont chargés sur le gel d'agarose, sur lequel 2 μl de glycérol à 75 % et du Bleu de Bromophénol ont été préalablement déposés. L' électrophorèse est réalisée pendant 4 h sous un courant de 200 mA, à la température de 4°C. Le tampon de migration est un tampon comportant de l'acétate de sodium 125 mM et du tampon Tris-HCl pH 7,00, 50 mM.
En fin de migration, le gel est incubé, pendant 15 à 20 minutes, dans un tampon de transfert comprenant du tampon Tris-HCl pH 9,00, 25 mM, de la glycine 192 mM, du méthanol à 20 % et du ΞDS (sodium lauryl sulfate) . Le gel est ensuite transféré par capillarité sur une membrane PVDF (fluorure de polyvinylidène) préalablement trempée dans du méthanol puis dans de l'eau ultrapure (3 minutes) et enfin dans le tampon de transfert, le transfert s' effectuant par capillarité pendant une nuit.
La membrane de PVDF est ensuite trempée 20 minutes dans un mélange tampon TBS (Tris-HCl 20 mM et NaCl 150 mM) , Tween 0,05 % et BSA 1 %, puis 20 minutes dans un mélange tampon TBS, Tween 0,05 % et gélatine 1 %.
Suivent deux étapes d'incubation de la membrane :
- de 1 h 30 à 2 h, à température ambiante, avec une solution diluée au 1/1000 d'anticorps primaire anti-TGF-β de lapin, fourni par Promega (soit 10 μl d'anticorps dans 10 ml de TBS/Tween 0,05 %/BSA 1 %). L'incubation est suivie d'un lavage de la membrane 4 x 10 minutes avec une solution TBS/Tween 0,05 % ; " - de 1 h à 1 h 30, à température ambiante, avec une solution diluée au 1/2500 d'anticorps secondaire anti-lapin couplé à de la peroxydase (Boehringer Mannheim) , soit 10 μl d'anticorps dans 25 ml de TBS/Tween 0,05 %/BSA 1 %. L'incubation est suivie d'un lavage de la membrane 3 x 10 minutes avec une solution TBS/Tween 0,05 %, puis d'un dernier lavage avec le tampon TBS.
On effectue ensuite une révélation colorimé- trique. Dans ce but, on prépare une solution d'ortho- dianisidine à 0,5 % dans le méthanol (50 mg dans 10 ml) et une solution de peroxyde d'hydrogène 0,01 %/tampon Tris pH 7,4, 10 mM. La révélation colorimétrique s'effectue en ajoutant à la membrane 50 ml du tampon Tris et 125 μl de la solution d' ortho-dianisidine (soit 0,00125 %). Une coloration brune apparaît en quelques minutes. La révélation colorimétrique est alors arrêtée par addition d' eau.
Le facteur de croissance seul (contrôle) doit peu migrer, son point isoélectrique (pi) étant proche du pH du tampon de migration ; en revanche, s'il se complexe avec un polymère qui est fortement anionique, l'ensemble va migrer vers l'anode (+) . c) Résultats . La figure 2a représente les résultats des électrophorèses décrites ci-dessus.
Il ressort de cette figure que le TGF-βl n' interagit ni avec le dextrane natif T40, ni avec le DMC7, dérivé du dextrane uniquement carboxyméthylé . En revanche, le TGF-βl interagit de façon variable avec les autres dérivés du dextrane. Deux produits sortent du lot : le DMCB2 et le FC27, pour lesquels le front de migration est fortement déplacé vers l'anode. Leur point commun est un fort taux de substitution en groupements benzylamides . D'autres électrophorèses sur gel, non représentées ici, ont également montré que le TGF-βl interagit avec un dérivé de dextrane substitué uniquement par des groupes MC
(a = 1,04) et Su (c = 0,70) .
EXEMPLE 2 : Mise en évidence de l'interaction de différents polymères, dont plusieurs dérivés de dextrane de formule DMCaBbSucSd, avec de la BMP extraite bovine (bBMP) .
Comme dans l'exemple précédent, cet exemple a trait à des tests de criblage de polymères, en particulier de dérivés de dextrane fonctionnalisés, en vue de sélectionner des polymères ayant une bonne affinité pour la bBMP (BMP bovine) . a) Polymères utilisés.
Cf. exemple précédent (tableau I) . b) Matériels et méthode.
Le protocole suivi est similaire à l'exemple précédent, aux différences près suivantes : - on utilise 250 ng de bBMP fournie par exemple par Sulzer Orthopedics Biologics Inc. ( heat Ridge, Colorado) , marquée par de la biotine selon le kit de Boehringer,
- l' électrophorèse est réalisée pendant 2 h sur le gel d'agarose à 0,8 %,
- il n'y a pas d'étape d'incubation de la membrane PVDF avec des anticorps, mais une étape d'incubation, pendant 2 h et à température ambiante, avec une solution au 1/2000 de streptavidine couplée à de la peroxydase (soit 5 μl de streptavidine dans 10 ml de TBS/Tween 0,05 %/BSA 1 %). L'incubation est suivie d'un lavage de la membrane 4 x 10 minutes avec une solution TBS/Tween 0,05 %. c) Résultats . La figure 2b représente les résultats des électrophorèses décrites ci-dessus. Il ressort de cette figure que, de façon similaire au TGF-βl (voir l'exemple précédent), la bBMP n' interagit ni avec le dextrane natif, ni avec un dérivé de dextrane uniquement carboxyméthylé. En revanche, la bBMP interagit avec les autres dérivés du dextrane testés.
EXEMPLE 3 : Préparation d' un biomatériau selon 1' invention . a) Préparation d' un dérivé de dextrane insolu- bilisé par le trimétaphosphate de sodium (TMP)
Le TMP permet la réticulation du dérivé de dextrane. Cette réaction fait intervenir une phosphoryla- tion du polysaccharide par le biais de liaisons covalentes 20
phosphate-diester, en milieu alcalin. Les liaisons diesters se créent sur les groupements hydroxyles du dextrane. Les dérivés de dextrane de formule générale DMCaBbSucSd selon l'invention ayant, du fait de leur subs- titution, peu de groupements hydroxyles libres, leur réticulation sera réalisée en présence de dextrane natif (non substitué) .
70 μl d'une solution de dextrane natif de masse molaire élevée (supérieure ou égale à 500,000 g/mol), par exemple le dextrane T500 fourni par
Pharmacia Fine Chemical (masse molaire moyenne en poids
(M„) de 464,000 g/mol, Mw/Mn = 2,9, Mn représentant la masse molaire moyenne en nombre) sont mélangés à 20 μl d'une solution de DMCB2 tel que défini dans l'exemple 1 (voir le tableau I) , à savoir un DMCaBbSucS dans lequel a = 0,75, b = 0, 37 et c = d = 0, lesdites solutions étant réalisées dans NaOH 0,5 M à des concentrations de 300 mg/ml. 10 μl d'une solution de TMP (c'est-à-dire (NaP03)3) dans NaOH 0,5 M à la concentration de 300 mg/ml sont ajoutés à ce mélange. On obtient ainsi 100 μl d'une solution très visqueuse, l'augmentation de viscosité traduisant la réticulation du DMCB2 et du dextrane.
La solution très visqueuse obtenue ci-dessus est aliquotée par volumes de 1 μl sur une plaque de téflon® et l'ensemble est placé à l'étuve à 40°C pendant 2 h. Les gels secs ainsi obtenus sont mis en suspension deux fois pendant 24 h dans un grand excès (2 ml) d'eau ultrapure, ceci afin d'éliminer les traces de soude dans le gel, puis lyophilisés et ensuite stérilisés par rayon- nement ionisant (25 kGray) . b) Association d'un facteur de croissance (bBMP) au dérivé de dextrane insolubilisé
Chaque gel est réhydraté en conditions stériles avec 2 μl d'un tampon phosphate PBS (formulation Dubelcco) contenant 250 ng/ml (0,5 ng/gel) de bBMP (BMP extraite bovine, fournie par exemple par Sulzer Orthopedics Biologics Inc, heat Ridge, Colorado) . On 21
obtient alors un biomatériau selon l'invention sous la forme d'un hydrogel.
Cet hydrogel peut être lyophilisé afin de conserver le biomatériau selon l'invention sous la forme d'une poudre (obtention de 100 lyophilisats prêts à l'emploi à partir de 100 μl de solution de départ).
Au moment de l'utilisation pour la préparation d'un implant, le lyophilisât peut être utilisé tel quel ou réhydraté avec 10 μl d'eau ppi (pour préparation injectable) par mg de lyophilisât.
Le même protocole de préparation d'un biomatériau tel que décrit ci-avant pourrait être réalisé à l'aide d'un composé de formule générale DMCaBbSucSd dans lequel a = 0,67, b = 0,30, c = 0,15 et d = 0,05 (composé dénommé FC 06) .
EXEMPLE 4 : Autre protocole de préparation d' un biomatériau selon l' invention . a) Préparation d'un dérivé de dextrane insolubilisé par l'éther de 1, 4-butanediol-diglycidyle 700 μl d'une solution de dextrane T500
(identique au dextrane utilisé dans l'exemple précédent) sont mélangés à 200 μl d'une solution de CMDBSu (cf. tableau I), lesdites solutions étant réalisées dans de l'eau bidistillée, à raison de 300 mg/ml. La solution résultante est congelée et lyophilisée.
Le lyophilisât est immergé dans une solution d'éther de 1, -butanediol-diglycidyle dans de l'éther éthylique (0,5 % en volume) pendant 30 minutes à température ambiante, puis l'éther éthylique est évaporé à 40 °C sous vide. Le gel réticulé sec est suspendu successivement dans 2 ml de NaOH 0,1 M, 2 ml d'eau bidistillée, 2 ml de NaCl 2 M et enfin 3 x 2 ml d'eau bidistillée. Le gel est lyophilisé, puis réhydraté avec 1 ml d'eau bidistillée. Le gel mou obtenu est alors placé dans un récipient constitué d'une plaque de verre de 3 cm x 3 cm comportant un rebord de 1 mm de hauteur. Un couvercle en verre est placé sur ce récipient et l'ensemble est congelé à -80°C. La galette de glace obtenue (3 x 3 x 0,1 cm3) est lyophilisée dans le récipient débarrassé de son couvercle, puis découpée avec une lame de rasoirs en gels secs de 5 mm de côté (soit des volumes de 25 μl) . Les gels secs sont sont mis en suspension deux fois pendant 24 h dans un grand excès d'eau ultrapure (20 ml), puis lyophilisés et stérilisés par rayonnement ionisant (25 kGray) . b) Association d'un facteur de croissance (bBMP) au dérivé de dextrane insolubilisé Chaque gel est réhydraté en conditions stériles avec 50 μl d'un tampon phosphate PBS (formulation Dubelcco) contenant 250 ng/ml (12,5 ng/gel) de bBMP, puis lyophilisé. On obtient ainsi une trentaine de lyophilisats prêts à l'emploi à partir de 1 ml de solution de départ. Au moment de l'utilisation pour la préparation d'un implant, le lyophilisât peut être utilisé tel quel ou réhydraté avec 50 μl d'eau ppi par mg de lyophilisât. EXEMPLE 5 : Adsorption et libération du facteur de croissance TGF-βl par un dérivé de dextrane insolubilisé de formule générale DMCaBbSucSd. a) Adsorption du facteur de croissance.
• Protocole d' adsorption du TGF-βl et de mesure de la quantité de TGF-βl adsorbé.
On utilise le dérivé de dextrane dénommé FC27 dans le tableau I, c'est-à-dire un dextrane dont les degrés de substitution respectifs en unités MC, B et Su sont de 0,75, 0,37 et 0,64, ledit dextrane étant insolubilisé conformément au protocole décrit dans l'exemple 3. Le témoin est un dextrane natif T500, lui aussi insolubilisé comme décrit dans l'exemple 3.
Dans un tube de verre siliconé, on place :
- 0,24 g de FC27 insolubilisé,
- 200 μl de tampon phosphate PBS comprenant 0,02 % d'azidure de sodium (agent bactéricide) et 0,5 % de sérum albumine bovine (BSA) , ce composé permettant d'éviter l' adsorption du facteur de croissance sur les parois du tube de verre, et
- 100 ng de TGF-βl. Le témoin est préparé de façon similaire, mais à partir de 0,30 g de dextrane natif et de 400 μl de tampon phosphate (en effet, le gel de dextrane T500 a un taux de gonflement plus important que le FC27, cette différence pouvant s'expliquer par une différence dans les taux de réticulation) .
Le tout est laissé 48 h à température ambiante sous agitation douce, puis chaque gel est lavé par du tampon phosphate afin d'éliminer le facteur de croissance non absorbé. Le facteur de croissance restant dans le tube et dans le tampon de lavage est ensuite dosé par la méthode ELISA.
• Résultats
Le tableau II résume les quantités de TGF-βl adsorbees dans le gel de dérivé de dextrane fonctionnalisé (FC27) et dans le gel de dextrane natif T500 (contrôle) .
Tableau II : quantité de TGF-βl adsorbé (ng)
II ressort du tableau II qu'il reste une concentration résiduelle en TGF-βl de 14,9 % à la quantité initialement ajoutée pour le T500 et de 23,1 % pour le FC27. Ainsi, le T500 et le FC27 ont respectivement adsorbé 85,1 % et 76,9 % du TGF-βl initialement ajouté : les deux gels adsorbent le TGF-βl de manière significative. b) Libération du facteur de croissance dans un milieu tampon phosphate. • Protocole. La cinétique de libération du TGF-βl est réa- lisée dans des plaques 6 puits siliconées. Les gels de FC27 et de T500 dans lesquels est adsorbé le TGF-βl sont incubés dans les puits en présence de tampon phosphate PBS (soit 5 ml, soit 10 ml, comme décrit ci-après), de 0,02 % d'azidure de sodium et de 0,5 % de BSA, à température ambiante. Le dosage du TGF-βl libéré dans le milieu se fait par une méthode ELISA classique, mettant en œuvre des plaques de microtitration à 96 puits revêtues par une solution d'anticorps monoclonal anti-TGF-β (2 μg/ml) dans un tampon carbonate, pH 9,6. La plaque est scellée, incubée une nuit à 4°C sans agitation, puis lavée 5 fois avec 300 μl de tampon PBS pH 7,4 comprenant 0,05 % de Tween 20. Le blocage des sites non spécifiques s'effectue alors avec une solution de BSA à 0,5 % (ajout de 300 μl de la solution par puits, suivi d' 1 h d'incubation à température ambiante sans agitation) . Après un lavage convenable des puits avec la solution de lavage décrite ci-dessus, on prépare les échantillons standards (gamme de TGF-βl de 31,25 à 2000 pg/ml) et les échantillons à tester. Chaque puits contient 100 μl de chaque échantillon et est incubé sous agitation pendant 1 h 30 à température ambiante. Après un lavage convenable de la plaque avec la solution de lavage décrite ci-dessus, les puits sont incubés avec une solution d' anticorps primaire anti-TGF humain biotinylé à 100 ng/ml (100 μl/puits) dans un tampon PBS/Tween 20 à 0,05 %/BSA 0,5 %. Après un lavage convenable de la plaque avec la solution de lavage décrite ci-dessus, les puits sont incubés avec une solution diluée au 1/10000 (100 μl/puits) de streptavidine couplée à la peroxydase. Un dernier lavage de la plaque est alors effectué, puis la plaque est révélée à l'ODP (1 pastille dans 25 ml de tampon citrate pH 5, 0,05 M, auquel on ajoute 33,3 μl de peroxyde d'hydrogène à 9 %) en ajoutant 200 μl de réactif par puits. La réaction se développe pendant 3-4 minutes puis est arrêtée en ajoutant 50 μl d'acide sulfurique 3M.
Pour mesurer la cinétique de libération du TGF-βl, deux protocoles ont été employés :
- soit sans renouvellement du milieu, auquel cas 4 prélèvements successifs (à 15 min., 45 min., 1 h 30 et 8 h après immersion) de 400 μl ont été réalisés à partir d'un volume de tampon initial de 10 ml ; - soit avec renouvellement du milieu, auquel cas les 5 ml initiaux de tampon sont prélevés (à 30 min., 1, 2, 5, 24 heures, 2, 3, 4, 5, 9 et 15 jours) et remplacés par 5 ml de tampon frais. • Résultats.
Les figure 3a et 3b représentent la quantité (en pg, valeurs cumulées) de TGF-βl libéré par les gels T500 et FC27 en fonction du temps (en heures) , respectivement sans renouvellement du milieu (figure 5a) et avec renouvellement du milieu (figure 5b) .
Ces figures montrent une libération rapide du TGF-βl dans le tampon phosphate pour le T500, alors que cette libération ne se produit pas avec le FC27. Il ressort ainsi que le FC27 forme, avec le TGF-βl, un complexe qui n'est pas dissocié dans le tampon phosphate : le TGF-βl est adsorbé dans le gel mais n'en est pas libéré. Il convient toutefois de préciser que dans des conditions in vivo, le gel de dextrane fonctionnalisé serait exposé à différentes enzymes ainsi qu'à des conditions de pH qui favoriseraient la dégradation lente du gel et la libération progressive du TGF-βl. EXEMPLE 6 : Préparation d'un implant osseux à l'aide d'un biomatériau selon l'invention sous la forme d'un hydrogel. Pour une cavité osseuse d'environ 50 mm3, on utilise 15 mg du biomatériau selon l'invention sous forme d'une poudre lyophilisée, telle qu'obtenue dans l'exemple 3, qui sont concassés et réhydratés avec 100 μl d'eau ultrapure (obtention d'un hydrogel de 100 μl) . EXEMPLE 7 : Préparation d'un implant osseux solide comprenant un biomatériau selon l'invention associé à un matériau de comblement sous forme particulaire, le phosphate de calcium tricalcique.
70 μl d'une solution de dextrane natif de masse molaire élevée (supérieure ou égale à 500,000 g/mol), tel que le dextrane utilisé dans l'exemple 3, sont mélangés à 20 μl d'une solution de DMCB2 (même dérivé de dextrane que dans l'exemple 3), lesdites solutions étant réalisées dans NaOH 0,5 M à des concentra- tions de 300 mg/ml. 80 mg de granules (0,5 mm de diamètre) de phosphate de calcium tricalcique sont mélangés à la solution précédente et 10 μl d'une solution de TMP dans NaOH 0,5 M à la concentration de 300 mg/ml y sont ajoutés. Le mélange obtenu est moulé sous forme d'un spécimen cubique de 5 mm3 et mis à l'étuve à 40°C pendant 2 h.
Le spécimen obtenu est mis en suspension deux fois pendant 24 h dans de l'eau ultrapure (100 fois le volume du cube) sous agitation douce, séché à l'étuve sous vide à 40 °C pendant 1 nuit, puis stérilisé comme décrit dans l'exemple 3.
Le spécimen est alors réhydraté en conditions stériles avec 50 μl du tampon phosphate PBS utilisé dans l'exemple 3, contenant 1 ng/μl (50 ng par spécimen) de bBMP. Le cube est ensuite séché sous vide à 40 °C pendant 3 h. Il peut être utilisé tel quel en tant qu'implant. EXEMPLE 8 : Préparation d' un revêtement d' une prothèse orthopédique à l'aide d'un biomatériau selon l'invention. 210 ml d'une solution de dextrane natif de masse molaire élevée (supérieure ou égale à 500,000 g/mol), par exemple le dextrane T500 décrit dans l'exemple 3, sont mélangés à 60 ml d'une solution de DMCB2 tel que décrit dans l'exemple 3, lesdites solutions étant réalisées dans NaOH 0,5 M à des concentrations de 300 mg/ml. 30 ml d'une solution de TMP dans NaOH 0,5 M à la concentration de 300 mg/ml sont ajoutés à ce mélange. La solution très visqueuse obtenue (300 ml) est homogénéisée rapidement et placée à 37 °C dans un récipient adapté. La queue d'une prothèse fémorale en TiA16V4
(alliage de titane comprenant 6 % d'aluminium et 4 % de vanadium) est immédiatement plongée dans ce mélange. Elle en est retirée après 10 minutes et placée dans une étuve maintenue à 40 °C pendant 2 h. La queue fémorale est immer- gée dans 1 1 d'eau ultrapure deux fois pendant 24 h, séchée à l'étuve sous vide à 40°C pendant 1 nuit et stérilisée comme décrit dans l'exemple 3. 3 ml d'une solution du tampon PBS utilisé dans l'exemple 3, contenant 300 μg de bBMP, sont dispersés à la surface traitée de la prothèse sous forme de spray, en conditions stériles. La prothèse est ensuite séchée sous vide à 40°C pendant 3 h. La prothèse peut être utilisée telle quelle au moment de l'implantation.
Le même protocole peut être utilisé pour enrober une prothèse de genou ou un cotyle de prothèse de hanche . EXEMPLE 9 : Etudes In vivo de biomatériaux selon 1' invention.
• Protocole.
On utilise 0,5 cm3 d'un gel de DMCB2 (dérivé de dextrane de formule générale DMCaBbSucSd, dans laquelle a = 0,75, b = 0,37 et c = d = 0) réticulé de la façon décrite dans l'exemple 3 et chargé avec 100 ng de BMP extraite bovine.
Le contrôle est un cube de corail de 0,5 cm3 (Porites fournies par Biocoral Inc.) chargé avec 100 ng de BMP extraite bovine.
Les animaux, au nombre de 10, sont des rats Sprague-Dawley âgés de 3 semaines, pesant environ 70 g. Ils sont anesthésiés par une solution de Ketalar® et de Xylaxine®. Une particule de gel (environ 1 % du volume initial du gel) est prélevée avec une pince et mise en place en intramusculaire, dans les muscles paravertébraux. La peau des animaux est refermée avec un fil de suture non résorbable. L'implantation est maintenue pendant 1 mois, puis les animaux sont sacrifiés en vue d'une étude histologique des implants dans la masse musculaire.
• Résultats.
La figure 4a représente une radiographie de la néoformation osseuse.
La figure 4b représente une vue (grossisse- ment : x 100) d'un nodule osseux néoformé en site intramusculaire. On remarque la structure corticale mature du nodule. 28
La figure 4c (grossissement : x 100) représente le contrôle de l'étude (corail chargé en BMP).
Les porosités du matériau sont peu cellularisées, le matériau est intact (aucune résorption) et aucune néoformation osseuse n'est observée.
Il ressort de cette étude qu'une dose faible de BMP (100 ng) , vectorisée par un dérivé de dextrane de formule générale DMCaBbSucSd, dans laquelle a = 0,75, b =
0,37 et c = d = 0, permet d'obtenir un biomatériau capable d'induire une néoformation osseuse en site ectopique.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Biomatériau, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement : (1) au moins un dérivé de dextrane insolubilisé, de formule générale DMCaBbSucSd, dans laquelle :
D représente une chaîne polysaccharidique, de préférence constituée par des enchaînements d'unités glucosidiques, MC représente des groupes méthylcarboxylates,
B représente des groupes carboxyméthyl-benzyl- amides,
Su représente des groupes sulfates (sulfatation des fonctions hydroxyles libres portées par les unités glucosidiques),
S représente des groupes sulfonates (sulfonatation des noyaux aromatiques des groupes B) , a, b, c et d représentent le degré de substitution (ds) , exprimé par rapport au nombre de fonctions hydroxyles libres dans une unité glucosidique du dextrane, respectivement en groupements MC, B, Su et S ; a étant > à 0,3, b étant égal à 0 ou > à 0,2, c étant égal à 0 ou > à 0,1 et d étant égal à 0 ou < 0,15, à la condition que, lorsque b est égal à 0, c n'est pas égal à 0, et
(2) au moins un facteur de croissance présentant une activité sur les tissus ostéo-articulaires, dentaires et/ou maxillo-faciaux.
2. Biomatériau selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit dérivé de dextrane insolubilisé est tel que d est égal à 0.
3. Biomatériau selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que ledit facteur de croissance est sélectionné dans le groupe constitué par les EGF, les IGFs, les FGFs, les TGF-β, les PDGFs et les BMPs.
4. Biomatériau l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit facteur de croissance présente une activité ostéoinductrice et est une BMP.
5. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend plusieurs dérivés de dextrane insolubilisés et/ou plusieurs facteurs de croissance impliqués dans le processus de reconstruction osseuse.
6. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est insolubilisé par réticulation à l'aide d'un agent réticu- lant.
7. Biomatériau selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit agent réticulant est sélectionné dans le groupe constitué par le trimétaphosphate de sodium, l' épichlorhydrine, la divinylsulfone, le glutaraldehyde et les bisepoxyranes.
8. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un hydrogel.
9. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'une poudre lyophilisée.
10. Biomatériau selon la revendication 9, caractérisé en ce ladite poudre lyophilisée est obtenue à partir de l' hydrogel défini dans la revendication 8.
11. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un matériau de comblement tissulaire.
12. Biomatériau selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il enrobe des particules d'un support insoluble minéral ou polymérique, lesdites particules ayant un diamètre supérieur à 100 μm.
13. Biomatériau selon la revendication 11 ou la revendication 12, caractérisé en ce que ledit matériau de comblement tissulaire est sélectionné dans le groupe constitué par le collagène, la gélatine, la colle biologique, les polymères d'acides polylactique ou polyglycolique et les copolymères de polyéthylène glycol et de polylactide-co-glycolide.
14. Biomatériau selon la revendication 11 ou la revendication 12, caractérisé en ce que ledit matériau de comblement tissulaire est un matériau ostéoconducteur sélectionné dans le groupe constitué par le corail, 1' hydroxyapatite, un mélange de collagène et d' hydroxyapatite, le phosphate de calcium tricalcique, le sulfate de calcium et le carbonate de calcium.
15. Procédé de préparation du biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 et 13, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : réticulation d'au moins un dérivé de dextrane de formule générale DMCaBbSucSd telle que défini dans la revendication 1 ou la revendication 2,
- adsorption, dans le dérivé de dextrane insolubilisé obtenu ci-dessus, d'au moins un facteur de croissance tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 4, - obtention d'un biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, sous la forme d'un hydrogel,
- éventuellement, lyophilisation dudit hydrogel afin d'obtenir ledit biomatériau sous la forme d'une poudre.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ladite réticulation d' au moins un dérivé de dextrane de formule générale DMCaBbSucSd s'effectue à l'aide d'un agent réticulant tel que défini dans la revendication 6 ou la revendication 7.
17. Procédé selon la revendication 15 ou la revendication 16, caractérisé en ce que la réticulation d' au moins un dérivé de dextrane de formule générale 32
DMCaBbSucSd s'effectue en présence d'un matériau de comblement tissulaire.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que ledit matériau de comblement tissulaire est tel que défini dans la revendication 13 ou la revendication 14.
19. Procédé de préparation du biomatériau selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mise en contact du dérivé de dextrane avec des particules d'un support insoluble minéral ou polymérique telles que définies dans la revendication 12, de façon à obtenir un composite, insolubilisation du composite obtenu ci-dessus, en présence d'un agent réticulant,
- adsorption, dans le composite insolubilisé obtenu ci-dessus, d'au moins un facteur de croissance tel que défini dans les revendications 1 à 4.
20. Utilisation du biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 pour la préparation d'un matériau de réparation ou de comblement pour applications ostéoarticulaires, dentaires ou maxillo-faciales .
21. Utilisation selon la revendication 20 pour la préparation d'implants ostéoarticulaires, dentaires ou maxillo-faciaux.
22. Utilisation d'un biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 pour la préparation d'un revêtement de prothèse orthopédique, dentaire ou maxillo-faciale.
23. Prothèse fonctionnalisée, caractérisée en ce qu'une partie au moins de sa surface est revêtue d'un biomatériau selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.
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