EP2288371A1 - Composition osteogenique comprenant un facteur de croissance un sel soluble de cation et un support organique - Google Patents

Composition osteogenique comprenant un facteur de croissance un sel soluble de cation et un support organique

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EP2288371A1
EP2288371A1 EP09733038A EP09733038A EP2288371A1 EP 2288371 A1 EP2288371 A1 EP 2288371A1 EP 09733038 A EP09733038 A EP 09733038A EP 09733038 A EP09733038 A EP 09733038A EP 2288371 A1 EP2288371 A1 EP 2288371A1
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implant according
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divalent cation
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implant
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Withdrawn
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EP09733038A
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Rémi SOULA
Olivier Soula
Gérard Soula
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Adocia SAS
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Adocia SAS
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    • A61L2300/414—Growth factors

Definitions

  • the present invention relates to the field of osteogenic formulations and more particularly to formulations of osteogenic proteins belonging to the family of Bone Morphogenetic Proteins, BMPs.
  • BMPs Bone Morphogenetic Proteins
  • OPs Osteogenic Proteins
  • BMPs are expressed as propeptides which, after post-translational processing, have a length of between 104 and 139 residues. They have a great homology of sequences between them and have similar three-dimensional structures. In particular, they have 6 cysteine residues involved in intramolecular disulfide bonds forming a "cysteine knot" (Scheufler C. 2004 J. Mol Biol 1999, 287, 103, Schlunegger MP, J. Mol Biol 1993, 231, 445). Some of them have a 7 th cysteine also involved in an intermolecular disulfide bridge responsible for dimer formation (Scheufler C. Mol Biol 2004 J. 1999; 287:... 103).
  • BMPs In their active form, BMPs assemble into homodimers or even heterodimers as described by Israel et al. (Israel Dl, Growth Factors, 1996, 13 (3-4), 291). Dimeric BMPs interact with BMPR transmembrane receptors (Mundy et al., Growth Factors, 2004, 22 (4), 233). This recognition is at the origin of a cascade of intracellular signaling involving Smad proteins in particular resulting in the activation or repression of target genes.
  • BMPs with the exception of BMPs 1 and 3, play a direct and indirect role in the differentiation of mesenchymal cells causing their differentiation into osteoblasts (Cheng H., J Bone and Joint Surgery, 2003, 85A). 1544-1552). They also possess chemotaxis properties and induce proliferation and differentiation.
  • recombinant BMPs and in particular rhBMP ⁇ 2 and rhBMP-7, have clearly demonstrated an ability to induce bone formation in vivo in humans and have been approved for certain medical applications.
  • recombinant human BMP-2 dibotermin alfa according to the international nonproprietary name, is formulated in products sold under the name Infuse ® in the US and InductOs ® in Europe. This product is prescribed in the fusion of lumbar vertebrae and the bone regeneration of the tibia for so-called non-union fractures.
  • the surgical procedure consists first of all, to soak a collagen sponge with a solution of rhBMP-2, then to place the sponge in a hollow cage, LT Cage, previously implanted between the vertebrae.
  • OP-1 Implant Human recombinant BMP-7, eptotermin alpha according to the international nonproprietary name, has the same therapeutic indications as BMP-2 and is the basis of two products: OP-1 Implant for open fractures of the tibia and OP-1 Putty for the fusion of the lumbar vertebrae.
  • OP-1 Implant consists of a powder containing rhBMP-7 and collagen to be taken up in 0.9% saline solution. The paste obtained is then applied to the fracture during a surgical procedure.
  • OP-1 Putty comes in the form of two powders: one containing rhBMP-7 and collagen, the other carboxymethylcellulose (CMC). During surgery, the CMC solution is reconstituted with 0.9% saline and mixed with rhBMP-7 and collagen. The paste thus obtained is applied to the site to be treated.
  • Patent application US2008 / 014197 discloses an osteoinductive implant consisting of a support (scaffold) containing a mineral ceramic, a solid membrane integrally bonded to the support and an osteogenic agent.
  • the support is preferably a collagen sponge.
  • the mineral ceramic comprises a calcium derivative, preferably a water-insoluble mineral matrix such as biphasic calcium phosphate ([0024], p2).
  • the solid membrane integrally bound to the implant must be impermeable to limit entry of surrounding soft tissue cells and also prevent the entry of inflammatory cells ([0030], p 3). The entry of these cells into the implant is described as possibly leading to a reduction in bone growth and treatment failure ([0007], p 1).
  • This invention is focused on adding a membrane to the implant to improve osteogenesis.
  • US2007 / 0254041 discloses a sheet-shaped device containing a demineralized bone matrix (DBM), collagen particles and a physically cross-linked polysaccharide matrix.
  • This implant may also contain an osteogenic substance such as a growth factor.
  • the physically cross-linked polysaccharide serves as a stabilizer for the demineralized bone particles ([0026], p 3).
  • the alginate-based polysaccharide is crosslinked by addition of calcium chloride.
  • the patent application WO96 / 39203 describes an osteogenic and biocompatible composite material with a physical resistance.
  • This osteoinductive material is composed of demineralized bone, osteoinduction can only take place in the presence of demineralized bone, or in the presence of protein extracts of demineralized bone, or in the presence of these two elements according to the authors (lines 2-5, p 2).
  • a calcium salt or a mineral salt is described as possibly being sodium hydroxide, sodium chloride, magnesium chloride or magnesium hydroxide (lines 4-9, p 17).
  • the calcium salt may be a soluble salt or not (lines 20-21, p 17) and is preferably calcium hydroxide.
  • the selection of the hydroxides of different cations, in particular of calcium, to be added is justified by the effect of increasing the pH of the matrix favorable to the increase of the collagen synthesis in this environment (lines 7-11, p 15 ).
  • This invention covers the formation of new demineralized bone implants whose physical and osteogenic properties would be improved by increasing the pH of the implant.
  • this new formulation makes it possible to produce the same osteogenic effect with lesser amounts of growth factors.
  • the invention relates to an open implant consisting of an osteogenic composition comprising at least: • an osteogenic growth factor,
  • a soluble salt of at least divalent cation A soluble salt of at least divalent cation
  • Said organic support does not comprise a demineralized bone matrix.
  • open implant means an implant having no membrane or envelope capable of limiting or regulating exchanges with the tissues surrounding the implant and substantially homogeneous in its constitution.
  • Demineralized bone matrix is defined as
  • DBM a matrix obtained by acid extraction of autologous bone, leading to the loss of the majority of the mineralized components but to the preservation of collagenic or non-collagenic proteins, including growth factors.
  • a demineralized matrix may also be prepared in an inactive form after extraction with chaotropic agents.
  • organic support is meant a support consisting of an organic matrix and / or a hydrogel.
  • organic matrix is meant a matrix consisting of cross-linked hydrogels and / or collagen.
  • the organic matrix is a hydrogel obtained by chemical crosslinking of polymer chains. Interchain covalent bonds defining an organic matrix. Polymers which can be used for the constitution of an organic matrix are described in Hoffman's review Hydrogels for Biomedical Applications (Adv Drug Deliv Rev, 2002, 43, 3-12).
  • the matrix is chosen from the matrices based on purified natural collagen, sterilized, preferably crosslinked.
  • Natural polymers such as collagen are components of the extracellular matrix that promote attachment, migration and cell differentiation. They have the advantage of being extremely biocompatible and are degraded by enzymatic digestion mechanisms. Collagen-based matrices are obtained from fibrillar type I or IV collagen extracted from tendon or beef or pork bone. These collagens are first purified before being crosslinked and then sterilized.
  • the organic supports according to the invention may be used as a mixture to obtain materials which may be in the form of a material with sufficient mechanical properties to be shaped or molded or in the form of a "putty" where collagen or a hydrogel acts as a binder.
  • Mixed materials can also be used, for example a matrix which combines collagen and inorganic particles and which can be in the form of a composite material with reinforced mechanical properties or in the form of a "putty" or the collagen plays a role of binder.
  • Usable inorganic materials include essentially calcium phosphate ceramics such as hydroxyapatite (HA), tricalcium calcium phosphate (TCP), biphasic calcium phosphate (BCP) or amorphous calcium phosphate (ACP) which have as their main interest a chemical composition very close to that of the bone. These materials have good mechanical properties and are immunologically inert. These materials can be in various forms such as powders, aggregates or blocks.
  • hydrogel means a hydrophilic three-dimensional network of polymer capable of adsorbing a large quantity of water or biological fluids (Peppas et al., Eur J Pharm Biopharm 2000, 50, 27-46). Such a hydrogel consists of physical interactions and is therefore not obtained by chemical crosslinking of the polymer chains.
  • the crosslinked or non-crosslinked hydrogel-forming polymer is selected from the group of synthetic polymers, among which are copolymers of ethylene glycol and lactic acid, copolymers of ethylene glycol and glycolic acid, poly (N-vinyl pyrrolidone), polyvinyl acids, polyacrylamides, polyacrylic acids.
  • the hydrogel-forming polymer is chosen from the group of natural polymers among which hyaluronic acid, keratane, pullulan, pectin, dextran, cellulose and cellulose derivatives, alginic acid , xanthan, carrageenan, chitosan, chondroitin, collagen, gelatin, polylysine, fibrin and their biologically acceptable salts.
  • the natural polymer is chosen from the group of polysaccharides forming hydrogels, among which hyaluronic acid, alginic acid, dextran, pectin, cellulose and its derivatives, pullulan, xanthan, carrageenan, chitosan, chondroitin and their biologically acceptable salts.
  • the natural polymer is chosen from the group of hydrogel-forming polysaccharides, among them hyaluronic acid, alginic acid and their biologically acceptable salts.
  • said composition is in the form of lyophilisate.
  • the at least one divalent cation soluble salt is a divalent cation soluble salt selected from calcium, magnesium or zinc cations.
  • the at least one divalent cation soluble salt is a calcium salt.
  • soluble salt of at least divalent cation means a salt whose solubility is equal to or greater than 5 mg / ml, preferably 10 mg / ml, preferably 20 mg / ml.
  • the divalent cation soluble salt is a calcium salt whose counterion is selected from chloride, D-gluconate, formate, D-saccharate, acetate, L-lactate, glutamate, aspartate, propionate, fumarate, sorbate, bicarbonate, bromide or ascorbate.
  • the divalent cation soluble salt is a magnesium salt whose counterion is selected from the group consisting of
  • D-gluconate formate, D-saccharate, acetate, L-lactate, glutamate, aspartate, propionate, fumarate, sorbate, bicarbonate, bromide or ascorbate.
  • the divalent cation soluble salt is a zinc salt whose counterion is selected from chloride, D-gluconate, formate, D-saccharate, acetate, L-lactate, glutamate, aspartate, propionate, fumarate, sorbate, bicarbonate, bromide or ascorbate.
  • the divalent cation soluble salt is calcium chloride.
  • the soluble cation salt is a soluble multivalent cation salt.
  • multivalent cations are meant species carrying more than two positive charges such as iron, aluminum, cationic polymers such as polylysine, spermine, protamine, fibrin.
  • osteogenic growth factor or BMP alone or in combination is meant a BMP selected from the group of therapeutically active BMPs (Bone Morphogenetic Proteins).
  • the osteogenic proteins are selected from the group consisting of BMP-2 (Dibotermin-alpha), BMP-4, BMP-7 (Eptotermin-alpha), BMP-14 and GDF-5.
  • the osteogenic protein is BMP-2 (Dibotermin-alpha).
  • the osteogenic protein is GDF-5.
  • the BMPs used are recombinant human BMPs, obtained according to the techniques known to those skilled in the art or purchased from suppliers such as, for example, Research Diagnostic Inc. (USA).
  • the hydrogel can be prepared just prior to implantation.
  • the hydrogel may be prepared and stored in a pre-filled syringe for subsequent implantation.
  • the hydrogel may be prepared by rehydrating a lyophilisate just prior to implantation or implanted in dehydrated form.
  • Lyophilization is a water sublimation technique allowing dehydration of the composition. This technique is commonly used for protein storage and stabilization.
  • a lyophilizate is very rapid and allows easy obtaining of a ready-to-use formulation, said formulation being rehydrated before implantation by the addition of blood or implanted in its dehydrated form, the rehydration intervening then, after implantation, by contact with biological fluids.
  • osteogenic growth factors In addition to these osteogenic growth factors, it is possible to add other proteins and in particular angiogenic growth factors such as PDGF, VEGF or FGF.
  • angiogenic growth factors such as PDGF, VEGF or FGF.
  • the invention therefore relates to a composition according to the invention characterized in that it further comprises angiogenic growth factors selected from the group consisting of PDGF, VEGF or FGF.
  • the osteogenic compositions according to the invention are used by implantation for example to fill bone defects, to perform vertebral fusions or maxillofacial repairs or for the treatment of the absence of fracture consolidation (non-union).
  • the size of the matrix and the amount of osteogenic growth factor are a function of the volume of the site to be filled.
  • the osteogenic growth factor doses will be between 0.05 mg to 8 mg, preferably between 0.1 mg and 4 mg, more preferably between 0.1 mg and 2 mg.
  • the doses currently accepted in the literature are between 8 and
  • the doses of angiogenic growth factor will be between 0.05 mg and 8 mg, preferably between 0.1 mg and 4 mg, more preferably between 0.1 mg and 2 mg. mg.
  • doses administered will be less than 1 mg.
  • the divalent cation solutions have concentrations of between 0.01 and 1 M, preferably between 0.05 and 0.2 M.
  • the anionic polysaccharide solutions have concentrations of between 0.1 mg / ml and 100 mg / ml, preferably 1 mg / ml at 75 mg / ml, more preferably between 5 and 50 mg / ml.
  • the invention also relates to the method for preparing an implant according to the invention which comprises at least the following steps: a) a solution comprising an osteogenic growth factor is available, b) an organic matrix is available and or a hydrogel, c) the solution containing the growth factor is added to the organic matrix and / or the hydrogel, and the mixture is optionally homogenized, d) the implant obtained in c) is added to solution of a soluble salt of at least divalent cation,
  • the invention also relates to the method for preparing an implant according to the invention which comprises at least the following steps: a) a solution comprising an osteogenic growth factor is available, b) an organic matrix is available and / or a hydrogel, c) adding to the organic matrix and / or hydrogel b) a solution of a soluble salt of cation at least divalent, d) adding the solution containing the growth factor to the organic matrix and / or the hydrogel obtained in c) and the mixture is optionally homogenized, e) the lyophilization of the implant obtained in step d) is optionally carried out.
  • the organic matrix is a matrix consisting of crosslinked hydrogels and / or collagen.
  • the matrix is chosen from the matrices based on purified natural collagen, sterilized, preferably crosslinked.
  • the crosslinked or non-crosslinked hydrogel-forming polymer is chosen from the group of synthetic polymers, among which the copolymers of ethylene glycol and lactic acid, the copolymers of ethylene glycol and glycolic acid, poly (N-vinyl pyrrolidone), polyvinyl acids, polyacrylamides, polyacrylic acids.
  • the crosslinked or non-crosslinked hydrogel-forming polymer is chosen from the group of natural polymers, among which hyaluronic acid, keratane, pectin, dextran, cellulose and cellulose derivatives, alginic acid, xanthan, carrageenan, chitosan, chondroitin, collagen, gelatin, polylysine, fibrin and their biologically acceptable salts.
  • the natural polymer is chosen from the group of hydrogel-forming polysaccharides, among which hyaluronic acid, alginic acid, dextran, pectin, cellulose and its derivatives, pullulan, xanthan, carrageenan, chitosan, chondroitin and their biologically acceptable salts.
  • the natural polymer is chosen from the group of hydrogel-forming polysaccharides, among which hyaluronic acid, alginic acid and their biologically acceptable salts.
  • the at least divalent cation soluble salt solution is a divalent cation solution.
  • the divalent cation soluble salt is a calcium salt whose counterion is selected from chloride, D-gluconate, formate, D-saccharate, acetate, L-lactate, glutamate, aspartate, propionate, fumarate, sorbate, bicarbonate, bromide or ascorbate.
  • the divalent cation soluble salt is calcium chloride.
  • the soluble salts of divalent cation are magnesium salts whose counterion is chosen from chloride,
  • D-gluconate formate, D-saccharate, acetate, L-lactate, glutamate, aspartate, propionate, fumarate, sorbate, bicarbonate, bromide or ascorbate
  • the soluble salts of divalent cation are zinc salts whose counterion is chosen from chloride, D-gluconate, formate, D-saccharate, acetate, L-lactate, glutamate, aspartate, propionate, fumarate, sorbate, bicarbonate, bromide or ascorbate
  • the at least divalent cation soluble salt solution is a multivalent cation solution.
  • the multivalent cations are selected from the group consisting of multivalent cations of iron, aluminum, cationic polymers such as polylysine, spermine, protamine, fibrin.
  • an organic matrix of the formulation obtained in step c) is impregnated and then the at least divalent cation solution is added.
  • step a) a solution of a non-osteogenic growth factor is also available.
  • the invention also relates to the use of the composition according to the invention as a bone implant.
  • said composition may be used in combination with a prosthetic device of the type vertebral prosthesis or vertebral fusion cage.
  • Implant 1 40 ⁇ l of a solution of rhBMP-2 at 0.05 mg / ml are introduced sterilely, in a sterile 200 mm 3 cross-linked collagen sponge of the Helistat type (Integra Life Sciences, Plainsboro, New Jersey). The solution is allowed to incubate for 30 minutes in the collagen sponge before use.
  • the dose of rhBMP-2 is 2 ⁇ g.
  • Implant 2 II is prepared as implant 1 with 40 ⁇ l of a solution of rhBMP-2 at 0.5 mg / ml.
  • the dose of rhBMP-2 is 20 ⁇ g.
  • Implant 3 40 ⁇ l of a solution of rhBMP-2 at 1.5 mg / ml are introduced sterilely into a sterile 200 mm3 cross-linked collagen sponge of the type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). The solution is incubated for 30 minutes in the collagen sponge before adding 100 ⁇ l of a solution of calcium chloride at a concentration of 18.3 mg / ml. The sponge is ready for use after 15 minutes. The dose of rhBMP-2 is 20 ⁇ g.
  • Implant 4 40 ⁇ l of a solution of rhBMP-2 at 0.15 mg / ml are introduced sterilely into a Helistat type sterile 200 mm 3 cross-linked collagen sponge (Integra Life Sciences, Plainsboro, New Jersey). The solution is incubated for 30 minutes in the collagen sponge before adding 100 ⁇ l of a solution of calcium chloride at a concentration of 18.3 mg / ml. The sponge is then frozen and sterilized lyophilized. The dose of rhBMP-2 is 2 ⁇ g.
  • Implant 5 II is prepared as implant 4 with 40 ⁇ l of a solution of rhBMP-2 at 1.5 mg / ml.
  • the dose of rhBMP-2 is 20 ⁇ g.
  • Gel 1 10.62 ml of sterile water are introduced into a 50 ml Falcon. 0.44 g of sodium hyaluronate (Pharma grade 80, Kibun Food Chemifa, LTD) are added with vigorous vortexing. 0.14 g of calcium chloride are then added to the sodium hyaluronate gel, also with stirring. The concentration of calcium chloride in the gel is 13.1 mg / ml.
  • Gel 2 615 ⁇ l of a solution of rhBMP-2 at 0.57 mg / ml are prepared by diluting a solution of rhBMP-2 at 1.35 mg / ml in an Infuse-type buffer with water sterile. This rhBMP-2 solution is transferred to a sterile 10 ml syringe. 2.9 ml of 4% sodium hyaluronate gel 1 containing calcium chloride at a concentration of 13.1 mg / ml are transferred to a sterile 10 ml syringe.
  • the rhBMP-2 solution is added to the gel 1 by coupling the two syringes and the gel obtained is homogenized by several passages from one syringe to the other.
  • the final gel is transferred to a 10 ml Falcon.
  • the concentration of rhBMP-2 in gel 2 is 0.10 mg / ml.
  • rhBMP-2 implanted 200 ⁇ l of the gel 2 are injected per implantation site.
  • the dose of rhBMP-2 implanted is 20 ⁇ g.
  • the objective of this study is to demonstrate the osteoinductive power of different formulations in a model of ectopic bone formation in rats.
  • Male rats of 150 to 250 g Male rats of 150 to 250 g (Sprague Dawley OFA - SD, Charles River Laboratories France, B.P. 109, 69592 ArbresIe) are used for this study.
  • Analgesic treatment (buprenorphine, Temgesic®, Pfizer, France) is given before surgery.
  • the rats are anesthetized by inhalation of a mixture of O2 isoflurane (1-4%).
  • the fur is removed by shaving over a wide dorsal area.
  • the skin of this dorsal zone is disinfected with a solution of povidone iodine (Vetedine ® solution, Vetoquinol, France).
  • Paravertebral incisions of about 1 cm are made to clear the left and right paravertebral dorsal muscles. Access to the muscles is performed by transfacial incision. Each of the implants is placed in a pocket in such a way that no compression on them can be exerted. Four implants are implanted per rat (two implants per site). The opening of the implants is then sutured using a polypropylene wire (Prolene 4/0, Ethicon, France). The skin is closed with a non-absorbable suture. The rats are then returned to their respective cages and kept under observation during their recovery.
  • the animals are anesthetized with an injection of tiletamine-zolazepam (ZOLETI L ® 25-50 mg / kg, IM, Virbac, France).
  • the animals are then euthanized by injecting a dose of pentobarbital (DOLETHAL ®, VÉTOQUINOL, France).
  • DOLETHAL ® pentobarbital
  • VÉTOQUINOL pentobarbital
  • a macroscopic observation of each site is then made, any sign of local intolerance (inflammation, necrosis, haemorrhage) and the presence of bone tissue and / or cartilaginous is recorded and scored according to the following scale: O: absence, 1: weak, 2: moderate, 3: marked, 4: important.
  • Each of the implants is removed from its implantation site and macroscopic photographs are taken. The size and weight of the implants are then determined. Each implant is then stored in a 10% buffered formalin solution.
  • This in vivo experiment makes it possible to measure the osteoinductive effect of rhBMP-2 by placing the implant in a muscle of the back of a rat.
  • This non-osseous site is said to be ectopic.
  • a dose of 2 ⁇ g of rhBMP-2 in a collagen sponge (Implant 1) does not have sufficient osteoinductive power to be able to find the collagen implants after 21 days.
  • a dose of 20 ⁇ g of rhBMP-2 in a collagen sponge (Implant 2) does not have sufficient osteoinductive power to obtain, after 21 days, ossified implants with an average weight of 38 mg.
  • the addition of calcium salts in the collagen sponge containing rhBMP-2 makes it possible to increase the osteogenic activity of rhBMP-2.
  • the average mass of ossified implants 3 is twice that of implants 2.
  • lyophilization makes it possible to increase the effect of the calcium salt on the osteogenic activity of rhBMP-2 (Implant 5).
  • the average mass of freeze-dried implants containing rhBMP-2 and CaCl 2 is approximately four times that of implants containing only rhBMP-2 (implant 2).
  • the bone score is equivalent between these implants.
  • rhBMP-2 for a dose of rhBMP-2 of 2 ⁇ g, rhBMP-2 in the presence of freeze-dried CaCl 2 in the collagen sponge (Implant 4) makes it possible to generate ossified implants contrary to rhBMP-2 alone at the same dose.
  • the sodium hyaluronate gel containing rhBMP-2 (gel 2) in the presence of calcium chloride makes it possible to increase the osteogenic activity of rhBMP-2.
  • the average mass of the explants obtained with the gel 2 is approximately 3 times greater than that of the explants obtained with the collagen implants containing 20 ⁇ g of rhBMP-2 alone (Implant 2).

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Abstract

L'invention concerne un implant ouvert constitué d'une composition ostéogénique comprenant au moins : • un facteur de croissance ostéogénique, • un sel soluble de cation au moins divalent, et • un support organique • ledit support organique ne comprenant pas de matrice d'os déminéralisé. Dans un mode de réalisation ledit implant est sous forme de lyophilisât. Elle concerne également son procédé de préparation.

Description

COMPOSITION OSTEOGENIQUE COMPRENANT UN FACTEUR DE CROISSANCE UN SEL SOLUBLE DE CATION ET UN SUPPORT ORGANIQUE
La présente invention concerne le domaine des formulations ostéogéniques et plus particulièrement des formulations des protéines ostéogéniques appartenant à la famille des Bone Morphogenetic Proteins, BMPs.
Les Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sont des facteurs de croissance impliqués dans les mécanismes d'ostéoinduction. Les BMPs appelées également Osteogenic Proteins (OPs) ont été initialement caractérisées par Urist en 1965 (Urist MR. Science 1965; 150, 893). Ces protéines isolées à partir d'os cortical ont la capacité d'induire la formation d'os chez un grand nombre d'animaux (Urist MR. Science 1965; 150, 893).
Les BMPs sont exprimées sous forme de propeptides qui, après maturation post-traductionnelle, ont une longueur comprise entre 104 et 139 résidus. Elles possèdent une grande homologie de séquences entre elles et ont des structures tridimensionnelles similaires. En particulier, elles possèdent 6 résidus cystéine impliqués dans des ponts disulfure intramoléculaires formant un « cystéine knot » (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287, 103 ; Schlunegger MP, J. Mol. Biol. 1993; 231 , 445). Certaines d'entre elles possèdent une 7e cystéine impliquée également dans un pont disulfure intermoléculaire à l'origine de la formation du dimère (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287:103.).
Sous leur forme active, les BMPs s'assemblent en homodimères, voire en hétérodimères comme cela a été décrit par Israël et al. (Israël Dl, Growth Factors. 1996; 13(3-4), 291 ). Les BMPs dimériques interagissent avec les récepteurs transmembranaires de type BMPR (Mundy et al. Growth Factors, 2004, 22 (4), 233). Cette reconnaissance est à l'origine d'une cascade de signalisation intracellulaire impliquant notamment les protéines Smad aboutissant ainsi à l'activation ou à la répression des gènes cibles.
Les BMPs, à l'exception des BMP 1 et 3, jouent un rôle direct et indirect sur la différenciation des cellules mésenchymateuses provoquant leur différenciation en ostéoblastes (Cheng H., J. Bone and Joint Surgery, 2003, 85A 1544-1552). Elles possèdent en outre des propriétés de chimiotactisme et induisent la prolifération et la différentiation.
Certaines BMPs recombinantes humaines et notamment la rhBMPτ2 et la rhBMP-7 ont clairement montré une capacité à induire la formation d'os in vivo chez l'homme et ont été approuvées pour certaines applications médicales. Ainsi, la BMP-2 recombinante humaine, dibotermine alfa selon la dénomination commune internationale, est formulée dans les produits commercialisés sous le nom de InFUSE® aux Etats-Unis et de InductOs® en Europe. Ce produit est prescrit dans la fusion des vertèbres lombaires et la régénération osseuse du tibia pour les fractures dites de non-union. Dans le cas d'InFUSE® pour la fusion des vertèbres lombaires, l'intervention chirurgicale consiste tout d'abord, à imbiber une éponge de collagène avec une solution de rhBMP-2, puis à placer l'éponge dans une cage creuse, LT Cage, préalablement implantée entre les vertèbres.
La BMP-7 recombinante humaine, eptotermine alpha selon la dénomination commune internationale, a les mêmes indications thérapeutiques que la BMP-2 et constitue la base de deux produits : OP-1 Implant pour les fractures ouvertes du tibia et OP-1 Putty pour la fusion des vertèbres lombaires. OP- 1 Implant se compose d'une poudre contenant de la rhBMP-7 et du collagène à reprendre dans une solution saline à 0,9%. La pâte obtenue est ensuite appliquée au niveau de la fracture lors d'une intervention chirurgicale. OP-1 Putty se présente sous la forme de deux poudres : l'une contenant la rhBMP-7 et du collagène, l'autre de la carboxyméthylcellulose (CMC). Au cours d'une intervention chirurgicale, la solution de CMC est reconstituée avec une solution saline 0,9% et mélangée avec la rhBMP-7 et le collagène. La pâte ainsi obtenue est appliquée sur le site à traiter.
On connaît de la demande de brevet US2008/014197 un implant ostéoinducteur constitué d'un support (scaffold) contenant une céramique minérale, d'une membrane solide liée intégralement au support et d'un agent ostéogénique. Le support est de préférence une éponge de collagène. La céramique minérale comprend un dérivé de calcium, de préférence une matrice minérale insoluble dans l'eau telle que le phosphate de calcium biphasique ([0024], p2). La membrane solide liée intégralement à l'implant doit être imperméable de façon à limiter l'entrée de cellules des tissus mous environnants et également prévenir l'entrée de cellules inflammatoires ([0030], p 3). L'entrée de ces cellules dans l'implant est décrite comme pouvant conduire à une réduction de la croissance osseuse et à un échec du traitement ([0007], p 1 ).
Cette invention est centrée sur l'ajout d'une membrane à l'implant pour améliorer l'ostéogénèse.
La demande de brevet US2007/0254041 décrit un dispositif en forme de feuillet contenant une matrice d'os déminéralisé (Demineralized Bone Matrix ou DBM), des particules de collagène et une matrice polysaccharidique réticulée physiquement. Cet implant peut par ailleurs contenir une substance ostéogénique telle qu'un facteur de croissance. Le polysaccharide réticulé physiquement sert d'agent de stabilisation des particules d'os déminéralisé ([0026], p 3) celui-ci à base d'alginate est réticulé par ajout de chlorure de calcium.
La demande de brevet WO96/39203 décrit un matériau composite ostéogénique et biocompatible doté d'une résistance physique. Ce matériau ostéoinductif est composé d'os déminéralisé, l'ostéoinduction ne pouvant avoir lieu qu'en présence d'os déminéralisé, ou en présence d'extraits protéiques d'os déminéralisé, ou en présence de ces deux éléments selon les auteurs (lignes 2-5, p 2). A ce matériau est ajouté un sel de calcium ou un sel minéral. Le sel minéral est décrit comme pouvant être de l'hydroxyde de sodium, du chlorure de sodium, du chlorure de magnésium ou de l'hydroxyde de magnésium (lignes 4-9, p 17). Le sel de calcium peut être un sel soluble ou non (lignes 20-21 , p 17) et est de préférence de l'hydroxyde de calcium. La sélection des hydroxydes de différents cations, en particulier de calcium, à ajouter est justifié par l'effet d'augmentation de pH de la matrice favorable à l'augmentation de la synthèse de collagène dans cet environnement (lignes 7-11 , p 15).
Cette invention couvre la formation de nouveaux implants à base d'os déminéralisés dont les propriétés physique et ostéogénique seraient améliorées par l'augmentation du pH de l'implant.
Il a par ailleurs été démontré qu'il était particulièrement intéressant de former des complexes entre un facteur de croissance et un polymère dans le but de le stabiliser, d'augmenter sa solubilité et/ou d'augmenter son activité. II reste cependant essentiel de trouver une formulation permettant d'améliorer la performance de ces facteurs de croissance BMPs afin de pouvoir, par exemple, diminuer les quantités à administrer.
Cette problématique est commune à de nombreuses formulations de facteurs de croissance puisque ces protéines sont en général utilisées à des doses dépassant de plusieurs ordres de grandeur les doses physiologiques.
Il est du mérite de la demanderesse d'avoir trouvé une formulation de facteurs de croissance ostéogéniques permettant d'améliorer leur activité par addition d'une solution d'un sel soluble d'un cation au moins divalent, ledit sel soluble de cation, au moins divalent, potentialisant l'effet du facteur de croissance.
D'une façon surprenante, cette nouvelle formulation permet de produire le même effet ostéogénique avec des quantités moindres de facteurs de croissance.
L'invention concerne implant ouvert constitué d'une composition ostéogénique comprenant au moins : • un facteur de croissance ostéogénique,
• un sel soluble de cation au moins divalent, et
• un support organique
• ledit support organique ne comprenant pas de matrice d'os déminéralisé.
On entend par implant ouvert, un implant ne comportant ni membrane ni enveloppe susceptible de limiter ou de réguler les échanges avec les tissus environnant l'implant et substantiellement homogène dans sa constitution.
On entend par matrice d'os déminéralisé (Demineralized Bone Matrix ou
DBM) une matrice obtenue par extraction acide d'os autologue, conduisant à la perte de la majorité des composants minéralisés mais à la préservation des protéines collagéniques on non-collagéniques, incluant les facteurs de croissance. Une telle matrice déminéralisée peut également être préparée sous forme inactive après extraction avec des agents chaotropiques. On entend par support organique, un support constitué par une matrice organique et/ou un hydrogel.
On entend par matrice organique, une matrice constituée par des hydrogels réticulés et/ou du collagène.
La matrice organique est un hydrogel obtenu par réticulation chimique de chaînes de polymère. Les liaisons covalentes inter-chaînes définissant une matrice organique. Les polymères pouvant être employés pour la constitution d'une matrice organique sont décrits dans la revue de Hoffman intitulée Hydrogels for biomédical applications (Adv. Drug Deliv. Rev, 2002, 43, 3-12).
Dans un mode de réalisation, la matrice est choisie parmi les matrices à base de collagène naturel purifié, stérilisé de préférence réticulé.
Les polymères naturels comme le collagène sont des composants de la matrice extracellulaire qui favorisent l'attachement, la migration et la différentiation cellulaire. Ils présentent l'avantage d'être extrêmement biocompatibles et sont dégradés par des mécanismes de digestion enzymatique. Les matrices à base de collagène sont obtenues à partir de collagène fibrillaire de type I ou IV extraits à partir de tendon ou d'os de bœuf ou de porc. Ces collagènes sont d'abord purifiés avant d'être réticulés puis stérilisés.
Les supports organiques selon l'invention peuvent être utilisés en mélange pour obtenir des matériaux qui peuvent se présenter sous la forme d'un matériau aux propriétés mécaniques suffisantes pour être mis en forme voire moulé ou encore sous la forme d'un « putty » où le collagène ou un hydrogel joue un rôle de liant.
Des matériaux mixtes peuvent également être utilisés, par exemple une matrice qui associe le collagène et des particules inorganiques et qui peuvent se présenter sous la forme d'un matériau composite aux propriétés mécaniques renforcées ou encore sous la forme d'un « putty » ou le collagène joue un rôle de liant. Les matériaux inorganiques utilisables comprennent essentiellement des céramiques à base de phosphate de calcium telles que l'hydroxyapatite (HA), le phosphate de calcium tricalcique (TCP), le phosphate de calcium biphasique (BCP) ou le phosphate de calcium amorphe (ACP) qui présentent comme principal intérêt une composition chimique très proche de celle de l'os. Ces matériaux possèdent de bonnes propriétés mécaniques et sont immunologiquement inertes. Ces matériaux peuvent se présenter sous différentes formes comme des poudres, des granulats ou des blocs. Ces matériaux présentent des vitesses de dégradation très différentes en fonction de leurs compositions ainsi l'hydroxyapatite se dégrade très lentement (plusieurs mois) alors que le phosphate de calcium tricalcique se dégrade plus rapidement (plusieurs semaines). C'est dans ce but que les phosphates de calcium biphasiques ont été développés car ils présentent des vitesses de résorption intermédiaires. Ces matériaux inorganiques sont connus pour être principalement ostéoconducteurs.
On entend par hydrogel, un réseau tri-dimensionel hydrophile de polymère capable d'adsorber une quantité importante d'eau ou de liquides biologiques (Peppas et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 2000, 50, 27-46). Un tel hydrogel est constitué d'interactions physiques et n'est donc pas obtenu par réticulation chimique des chaînes de polymère.
Parmi ces polymères, on peut trouver des polymères synthétiques ainsi que des polymères naturels. Les polysaccharides formant des hydrogels sont décrits par exemple dans l'article intitulé : Polysaccharide hydrogels for modified release formulations (Coviello et al. J. Control. Release, 2007, 119, 5-24).
Dans un mode de réalisation, le polymère formant un hydrogel réticulé ou non réticulé est choisi dans le groupe des polymères synthétiques parmi lesquels les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide lactique, les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide glycolique, la poly(N-Vinyl pyrrolidone), les acides polyvinyliques, les polyacrylamides, les acides polyacryliques. Dans un mode de réalisation, le polymère formant un hydrogel est choisi dans le groupe des polymères naturels parmi lesquels l'acide hyaluronique, le kératane, le pullulane, la pectine, le dextrane, la cellulose et les dérivés de cellulose, l'acide alginique, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine, le collagène, la gélatine, la polylysine, la fibrine et leurs sels biologiquement acceptables.
Dans un mode de réalisation, le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, parmi lesquels l'acide hyaluronique, l'acide alginique, le dextrane, la pectine, la cellulose et ses dérivés, le pullulane, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine et leurs sels biologiquement acceptables.
Dans un mode de réalisation, le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, parmi lesquels l'acide hyaluronique, l'acide alginique et leurs sels biologiquement acceptables.
Dans un mode de réalisation, ladite composition est sous forme de lyophilisât.
Dans un mode de réalisation, le sel soluble de cation au moins divalent est un sel soluble de cation divalent, choisi parmi les cations du calcium, du magnésium ou du zinc.
Dans un mode de réalisation, le sel soluble de cation au moins divalent est un sel du calcium.
On entend par sel soluble de cation au moins divalent, un sel dont la solubilité est égale ou supérieure à 5 mg/mL, de préférence 10 mg/mL, de préférence 20 mg/mL.
Dans un mode de réalisation, le sel soluble de cation divalent est un sel de calcium dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate, le propionate, le fumarate, le sorbate, le bicarbonate, le bromure ou l'ascorbate . Dans un mode de réalisation, le sel soluble de cation divalent est un sel de magnésium dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le
D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate, le propionate, le fumarate, le sorbate, le bicarbonate, le bromure ou l'ascorbate.
Dans un mode de réalisation, le sel soluble de cation divalent est un sel de zinc dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate, le propionate, le fumarate, le sorbate, le bicarbonate, le bromure ou l'ascorbate.
Dans un mode de réalisation, le sel soluble de cation divalent est du chlorure de calcium.
Dans un mode de réalisation, le sel soluble de cation est un sel soluble de cation multivalent.
On entend par cations multivalents, des espèces portant plus de deux charges positives comme le fer, l'aluminium, des polymères cationiques tels que la polylysine, la spermine, la protamine, la fibrine.
On entend par facteur de croissance ostéogéniques ou BMP seuls ou en combinaison une BMP choisie dans le groupe des BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) thérapeutiquement actives.
Plus particulièrement les protéines ostéogéniques sont choisies dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5.
Dans un mode de réalisation la protéine ostéogénique est la BMP-2 (Dibotermine-alpha).
Dans un mode de réalisation la protéine ostéogénique est le GDF-5.
Les BMP utilisées sont des BMP recombinantes humaines, obtenues selon les techniques connues de l'homme de l'art ou achetées auprès de fournisseurs comme par exemple la société Research Diagnostic Inc. (USA). Dans un mode de réalisation, l'hydrogel peut être préparé juste avant l'implantation.
Dans un mode de réalisation, l'hydrogel peut être préparé et conservé dans une seringue pré-remplie afin d'être ensuite implanté.
Dans un mode de réalisation, l'hydrogel peut être préparé par réhydratation d'un lyophilisât juste avant l'implantation ou être implanté sous forme déshydraté.
La lyophilisation est une technique de sublimation de l'eau permettant une déshydratation de la composition. Cette technique est couramment utilisée pour la conservation et la stabilisation des protéines.
La réhydratation d'un lyophilisât est très rapide et permet l'obtention aisée d'une formulation prête à l'emploi, ladite formulation pouvant être réhydratée avant l'implantation par l'ajout de sang ou implantée sous sa forme déshydratée, la réhydratation intervenant alors, après implantation, par le contact avec les fluides biologiques.
En outre, à ces facteurs de croissance ostéogéniques, il est possible d'ajouter d'autres protéines et en particulier des facteurs de croissance angiogéniques tel que le PDGF, le VEGF ou le FGF.
L'invention concerne donc une composition selon l'invention caractérisée en ce qu'elle comprend en outre des facteurs de croissance angiogéniques choisis dans le groupe constitué par le PDGF, le VEGF ou le FGF.
Les compositions ostéogéniques selon l'invention sont utilisées par implantation par exemple pour combler des défauts osseux, pour effectuer des fusions vertébrales ou des réparations maxillo-faciales ou pour le traitement de l'absence de consolidation des fractures (pseudarthrose).
Dans ces différentes utilisations thérapeutiques la taille de la matrice et la quantité de facteur de croissance ostéogénique sont fonction du volume du site à combler. Dans un mode de réalisation, pour un implant vertébral les doses de facteur de croissance ostéogénique seront comprises entre 0,05 mg à 8 mg, de préférence entre 0,1 mg et 4 mg, encore de préférence entre 0,1 mg et 2 mg, alors que les doses couramment admises dans la littérature sont comprises entre 8 et
12 mg.
Dans un mode de réalisation, pour un implant vertébral, les doses de facteur de croissance angiogénique seront comprises entre 0,05 mg et 8 mg, de préférence entre 0,1 mg et 4 mg, encore de préférence entre 0,1 mg et 2 mg.
S'agissant des utilisations en réparation maxillo-faciale ou dans le traitement de la pseudarthrose, par exemple, les doses administrées seront inférieure au mg.
Dans un mode de réalisation, les solutions de cation divalent ont des concentrations comprises entre 0,01 et 1 M, de préférence entre 0,05 et 0,2 M.
Dans un mode de réalisation les solutions de polysaccharide anionique ont des concentrations comprises entre 0,1 mg/ml et 100 mg/ml, de préférence 1 mg/ml à 75 mg/ml, encore de préférence entre 5 et 50 mg/ml.
L'invention concerne également le procédé de préparation d'un implant selon l'invention qui comprend au moins les étapes suivantes : a) on dispose d'une solution comprenant un facteur de croissance ostéogénique, b) on dispose d'une matrice organique et/ou d'un hydrogel, c) on ajoute la solution contenant le facteur de croissance à la matrice organique et/ou à l'hydrogel, et on homogénéise éventuellement le mélange, d) on additionne à l'implant obtenu en c) une solution d'un sel soluble de cation au moins divalent,
e) on procède éventuellement à la lyophilisation de l'implant obtenu à l'étape d). L'invention concerne également le procédé de préparation d'un implant selon l'invention qui comprend au moins les étapes suivantes : a) on dispose d'une solution comprenant un facteur de croissance ostéogénique, b) on dispose d'une matrice organique et/ou d'un hydrogel, c) on additionne à la matrice organique et/ou à l'hydrogel b) une solution d'un sel soluble de cation au moins divalent, d) on ajoute la solution contenant le facteur de croissance à la matrice organique et/ou à l'hydrogel obtenu en c) et on homogénéise éventuellement le mélange, e) on procède éventuellement à la lyophilisation de l'implant obtenu à l'étape d).
Dans un mode de réalisation, la matrice organique est une matrice constituée par des hydrogels réticulés et/ou du collagène.
Dans un mode de réalisation, la matrice est choisie parmi les matrices à base de collagène naturel purifié, stérilisé de préférence réticulé.
Dans un mode de réalisation, à l'étape c), le polymère formant un hydrogel réticulé ou non réticulé est choisi dans le groupe des polymères synthétiques parmi lesquels les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide lactique, les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide glycolique, la poly(N- Vinyl pyrrolidone), les acides polyvinyliques, les polyacrylamides, les acides polyacryliques.
Dans un mode de réalisation, à l'étape b), le polymère formant un hydrogel réticulé ou non réticulé est choisi dans le groupe des polymères naturels parmi lesquels l'acide hyaluronique, le kératane, la pectine, le dextrane, la cellulose et les dérivés de cellulose, l'acide alginique, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine, le collagène, la gélatine, la polylysine, la fibrine et leurs sels biologiquement acceptables.
Dans un mode de réalisation, à l'étape b), le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, parmi lesquels l'acide hyaluronique, l'acide alginique, le dextrane, la pectine, la cellulose et ses dérivés, le pullulane, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine et leurs sels biologiquement acceptables.
Dans un mode de réalisation, à l'étape b), le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, parmi lesquels l'acide hyaluronique, l'acide alginique et leurs sels biologiquement acceptables.
Dans un mode de réalisation à l'étape c), la solution de sel soluble de cation au moins divalent est une solution de cation divalent.
Dans un mode de réalisation, le sel soluble de cation divalent est un sel de calcium dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate, le propionate, le fumarate, le sorbate, le bicarbonate, le bromure ou l'ascorbate .
Dans un mode de réalisation le sel soluble de cation divalent est du chlorure de calcium.
Dans un mode de réalisation les sels solubles de cation divalent sont des sels de magnésium dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le
D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate, le propionate, le fumarate, le sorbate, le bicarbonate, le bromure ou l'ascorbate
Dans un mode de réalisation les sels solubles de cation divalent sont des sels de zinc dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate, le propionate, le fumarate, le sorbate, le bicarbonate, le bromure ou l'ascorbate
Dans un mode de réalisation à l'étape c), la solution de sel soluble de cation au moins divalent est une solution de cation multivalent.
Dans un mode de réalisation les cations multivalents sont choisis dans le groupe consitué par les cations multivalents du fer, de l'aluminium, des polymères cationiques tels que la polylysine, la spermine, la protamine, la fibrine. Dans un mode de réalisation à la suite de l'étape c), on imprègne une matrice organique de la formulation obtenue à l'étape c) puis l'on procède à l'ajout de la solution de cation au moins divalent.
Dans un mode de réalisation, à l'étape a), on dispose également d'une solution d'un facteur de croissance non ostéogénique.
L'invention concerne également l'utilisation de la composition selon l'invention comme implant osseux.
Dans un mode de réalisation, ladite composition pourra être utilisée en combinaison avec un dispositif prothétique du type prothèse vertébrale ou cage de fusion vertébrale.
Elle concerne également les méthodes thérapeutiques et chirurgicales utilisant ladite composition dans la reconstruction osseuse.
L'invention est illustrée par les exemples suivants.
Exemple 1 : Préparation des implants éponge de collagène / rhBMP-2
Implant 1 : 40 μl d'une solution de rhBMP-2 à 0.05 mg/ml sont introduits stérilement, dans une éponge de collagène réticulée de 200 mm3 stérile de type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). La solution est laissée à incuber pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant utilisation.
La dose de rhBMP-2 est de 2 μg.
Implant 2 : II est préparé comme l'implant 1 avec 40 μl d'une solution de rhBMP-2 à 0.5 mg/ml. La dose de rhBMP-2 est de 20 μg.
Exemple 2 : Préparation des implants éponge de collagène / rhBMP-2 avec chlorure de calcium
Implant 3 : 40 μl d'une solution de rhBMP-2 à 1.5 mg/ml sont introduits stérilement, dans une éponge de collagène réticulée de 200 mm3 stérile de type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). La solution est laissée à incuber pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant de rajouter 100 μl d'une solution de chlorure de calcium à une concentration de 18,3 mg/ml. L'éponge est prête à l'emploi après 15 minutes. La dose de rhBMP-2 est de 20 μg.
Exemple 3 : Préparation des implants éponge de collagène / rhBMP-2 avec chlorure de calcium, lyophilisés
Implant 4 : 40 μl d'une solution de rhBMP-2 à 0.15 mg/ml sont introduits stérilement, dans une éponge de collagène réticulée de 200 mm3 stérile de type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). La solution est laissée à incuber pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant de rajouter 100 μl d'une solution de chlorure de calcium à une concentration de 18,3 mg/ml. L'éponge est alors ensuite congelée et lyophilisée stérilement. La dose de rhBMP-2 est de 2 μg.
Implant 5 : II est préparé comme l'implant 4 avec 40 μl d'une solution de rhBMP-2 à 1.5 mg/ml. La dose de rhBMP-2 est de 20 μg.
Exemple 4 : Préparation d'un gel de hyaluronate de sodium contenant du chlorure de calcium
Gel 1 : 10,62 ml d'eau stérile sont introduits dans un Falcon de 50 ml. 0,44 g de hyaluronate de sodium (Pharma grade 80, Kibun Food Chemifa, LTD) sont ajoutés sous vive agitation au vortex. 0,14 g de chlorure de calcium sont ensuite ajoutés au gel de hyaluronate de sodium également sous agitation. La concentration en chlorure de calcium dans le gel est de 13,1 mg/ml.
Exemple 5 : Préparation d'un gel de hyaluronate de sodium contenant de la rhBMP-2 et du chlorure de calcium
Gel 2 : 615 μl d'une solution de rhBMP-2 à 0,57 mg/ml sont préparés par dilution d'une solution de rhBMP-2 à 1 ,35 mg/mL dans un tampon de type Infuse avec de l'eau stérile. Cette solution de rhBMP-2 est transférée dans une seringue stérile de 10 ml. 2,9 ml du gel 1 de hyaluronate de sodium à 4% contenant du chlorure de calcium à une concentration de 13,1 mg/ml sont transférés dans une seringue stérile de 10 ml. La solution de rhBMP-2 est ajoutée au gel 1 en couplant les deux seringues et le gel obtenu est homogénéisé par plusieurs passages d'une seringue à l'autre. Le gel final est transféré dans un Falcon de 10 ml. La concentration en rhBMP-2 dans le gel 2 est de 0,10 mg/ml.
200 μl du gel 2 sont injectés par site d'implantation. La dose de rhBMP-2 implantée est de 20 μg.
Exemple 6 : Evaluation du pouvoir osteoinductif des différentes formulations
L'objectif de cette étude est de démontrer le pouvoir osteoinductif des différentes formulations dans un modèle de formation ectopique d'os chez le rat. Des rats mâles de 150 à 250 g (Sprague Dawley OFA - SD, Charles River Laboratories France, B. P. 109, 69592 l'ArbresIe) sont utilisés pour cette étude.
Un traitement analgésique (buprenorphine, Temgesic®, Pfizer, France) est administré avant l'intervention chirurgicale. Les rats sont anesthésiés par inhalation d'un mélange O2 isoflurane (1-4%). La fourrure est éliminée par rasage sur une large zone dorsale. La peau de cette zone dorsale est désinfectée à l'aide d'une solution de povidone iodine (Vetedine® solution, Vetoquinol, France).
Des incisions paravertébrales d'environ 1 cm sont effectuées afin de dégager les muscles dorsaux paravertébraux droit et gauche. L'accès aux muscles est effectué par incision transfaciale. Chacun des implants est placé dans une poche de telle manière qu'aucune compression sur celles-ci ne puisse être exercée. Quatre implants sont implantés par rat (deux implants par site). L'ouverture des implants est ensuite suturée au moyen d'un fil polypropylene (Prolene 4/0, Ethicon, France). La peau est refermée au moyen d'une suture non- absorbable. Les rats sont ensuite replacés dans leurs cages respectives et gardés en observation durant leur rétablissement.
A 21 jours, les animaux sont anesthésiés par une injection de tiletamine-zolazepam (ZOLETI L®25-50 mg/kg, IM, VIRBAC, France).
Les animaux sont ensuite euthanasiés par injection d'une dose de pentobarbital (DOLETHAL®, VETOQUINOL, France). Un observation macroscopique de chaque site est ensuite réalisée, tout signe d'intolérance locale (inflammation, nécrose, hémorrhagie) et la présence de tissu osseux et/ou cartilagineux est enregistrée et cotée selon le barème suivant : O: absence, 1 : faible, 2: modéré, 3: marqué, 4: important.
Chacun des implants est retiré de son site d'implantation et des photographies macroscopiques sont prises. La taille et le poids des implants sont ensuite déterminés. Chaque implant est ensuite conservé dans une solution de formol à 10% tamponnée.
Résultats :
Cette expérience in vivo permet de mesurer l'effet ostéoinducteur de la rhBMP-2 en plaçant l'implant dans un muscle du dos d'un rat. Ce site non osseux est dit ectopique.
Les observations macroscopiques des explants nous permettent d'évaluer la présence des tissus osseux et de déterminer la masse des explants.
Une dose de 2 μg de rhBMP-2 dans une éponge à collagène (Implant 1 ) n'a pas un pouvoir ostéoinducteur suffisant pour qu'on puisse retrouver les implants collagéniques au bout de 21 jours.
Une dose de 20 μg de rhBMP-2 dans une éponge à collagène (Implant 2) n'a pas un pouvoir ostéoinducteur suffisant pour qu'on obtienne au bout de 21 jours des implants ossifiés avec un poids moyen de 38 mg.
Pour la même dose de rhBMP-2 de 20 μg, l'ajout de sels de calcium dans l'éponge à collagène contenant la rhBMP-2 permet d'augmenter l'activité ostéogénique de la rhBMP-2. La masse moyenne des implants ossifiés 3 est deux fois plus importante que celle des implants 2. Egalement pour la dose de rhBMP-2 de 20 μg, la lyophilisation permet d'accroître l'effet du sel de calcium sur l'activité ostéogénique de la rhBMP-2 (Implant 5). La masse moyenne des implants lyophilisés contenant la rhBMP-2 et les CaCI2 est environ quatre fois supérieure à celle des implants contenant seulement de la rhBMP-2 (implant 2). En outre, le score osseux est équivalent entre ces implants.
Pour une dose de rhBMP-2 de 2 μg, la rhBMP-2 en présence de CaCI2 lyophilisé dans l'éponge à collagène (Implant 4) permet de générer des implants ossifiés contrairement à la rhBMP-2 seule à la même dose.
Pour une dose de rhBMP-2 de 20 μg, le gel de hyaluronate de sodium contenant de la rhBMP-2 (gel 2) en présence de chlorure de calcium permet d'augmenter l'activité ostéogénique de la rhBMP-2. La masse moyenne des explants obtenus avec le gel 2 est environ 3 fois supérieure à celle des explants obtenus avec les implants de collagène contenant 20 μg de rhBMP-2 seule (Implant 2).

Claims

REVENDICATIONS
1. Implant ouvert constitué d'une composition ostéogénique comprenant au moins :
• un facteur de croissance ostéogénique,
• un sel soluble de cation au moins divalent, et
• un support organique
• ledit support organique ne comprenant pas de matrice d'os déminéralisé.
2. Implant selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le support est constitué par une matrice organique et/ou un polymère formant un hydrogel.
3. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la matrice organique est une matrice constituée par des hydrogels réticulés et/ou du collagène.
4. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la matrice est choisie parmi les matrices à base de collagène naturel purifié, stérilisé et réticulé.
5. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polymère formant un hydrogel réticulé ou non réticulé est choisi dans le groupe des polymères synthétiques parmi lesquels les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide lactique, les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide glycolique, la poly(N-Vinyl pyrrolidone), les acides polyvinyliques, les polyacrylamides, les acides polyacryliques.
6. Implant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le polymère formant un hydrogel réticulé ou non réticulé est choisi dans le groupe des polymères naturels parmi lesquels l'acide hyaluronique, le kératane, le pullulane, la pectine, le dextrane, la cellulose et les dérivés de cellulose, l'acide alginique, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine, le collagène, la gélatine, la polylysine, la fibrine et leurs sels biologiquement acceptables.
7. Implant selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, parmi lesquels l'acide hyaluronique, l'acide alginique, le dextrane, le pullulane, la pectine, la cellulose et ses dérivés, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine et leurs sels biologiquement acceptables.
8. Implant selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, parmi lesquels l'acide hyaluronique, l'acide alginique et leurs sels biologiquement acceptables
9. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite composition est sous forme de lyophilisât.
10. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le facteur de croissance ostéogénique est choisi dans le groupe des BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) thérapeutiquement actives.
11. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le facteur de croissance ostéogénique est choisi dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5.
12. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéine ostéogénique est la BMP-2 (Dibotermine- alpha).
13. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéine ostéogénique est le GDF-5.
14. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'ilcomprend en outre des facteurs de croissance angiogéniques choisis dans le groupe constitué par le PDGF, le VEGF ou le FGF.
15. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le cation au moins divalent est un cation divalent choisi dans le groupe constitué par les sels de calcium, de magnésium ou de zinc.
16. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le sel soluble de cation divalent est un sel de calcium dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate, le propionate, le fumarate, le sorbate, le bicarbonate, le bromure ou l'ascorbate.
17. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le sel soluble de cation divalent est du chlorure de calcium.
18. Implant selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le cation au moins divalent est un cation multivalent choisi dans le groupe constitué par les cations du fer, de l'aluminium ou des polymères cationiques choisis parmi la polylysine, la spermine, la protamine et la fibrine, seuls ou en combinaison.
19. Procédé de préparation d'un implant selon l'invention comprenant au moins les étapes suivantes : a) on dispose d'une solution comprenant un facteur de croissance ostéogénique, b) on dispose d'une matrice organique et/ou d'un polymère formant un hydrogel, c) on ajoute la solution contenant le facteur de croissance à la matrice organique et/ou à l'hydrogel, et on homogénéise éventuellement le mélange, d) on additionne à l'implant obtenu en c) une solution d'un sel soluble de cation au moins divalent, e) on procède éventuellement à la lyophilisation de l'implant obtenu à l'étape d).
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que la matrice organique est une matrice constituée par un hydrogel réticulé et/ou du collagène.
21. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que la matrice est choisie parmi les matrices à base de collagène naturel purifié, stérilisé et réticulé.
22. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que le polymère formant un hydrogel réticulé ou non réticulé est choisi dans le groupe des polymères synthétiques parmi lesquels les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide lactique, les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide glycolique, la poly(N-Vinyl pyrrolidone), les acides polyvinyliques, les polyacrylamides, les acides polyacryliques.
23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 à 23 caractérisé en ce que, le polymère formant un hydrogel réticulé ou non réticulé est choisi dans le groupe des polymères naturels parmi lesquels l'acide hyaluronique, le kératane, la pectine, le dextrane, la cellulose et les dérivés de cellulose, l'acide alginique, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine, le collagène, la gélatine, la polylysine, la fibrine et leurs sels biologiquement acceptables.
24. Procédé selon la revendication 24 caractérisé en ce qu'à l'étape b), le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, constitué par l'acide hyaluronique, l'acide alginique, le dextrane, la pectine, la cellulose et ses dérivés, le pullulane, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine et leurs sels biologiquement acceptables.
25. Procédé selon la revendication 24 caractérisé en ce que le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, constitué par l'acide hyaluronique, l'acide alginique et leurs sels biologiquement acceptables.
26. Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 à 25 caractérisé en ce que la solution de sel soluble de cation au moins divalent est une solution de cation divalent.
27. Procédé selon la revendication 27 caractérisé en ce qu'à l'étape d) le sel soluble de cation divalent est choisi parmi les sels de magnésium dont le contre-ion est le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate, le propionate, le fumarate, le sorbate, le bicarbonate, le bromure ou l'ascorbate.
28. Procédé selon la revendication 27 caractérisé en ce qu'à l'étape d) le sel soluble de cation divalent est choisi parmi les sels de calcium dont le contre-ion est le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate, le propionate, le fumarate, le sorbate, le bicarbonate, le bromure ou l'ascorbate.
29. Procédé selon la revendication 27 caractérisé en ce qu'à l'étape d) le sel soluble de cation divalent est du chlorure de calcium.
30. .Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 à .26 caractérisé en ce qu'à l'étape a), on dispose également d'une solution d'un facteur de croissance non ostéogénique.
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