FR2948572A1 - Nouvelle forme d'administration de proteines osteogeniques - Google Patents

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Abstract

L'invention concerne des compositions ostéogéniques composées d'un coprécipitat qui contient au moins un sel insoluble de calcium et au moins une protéine ostéogénique, ledit coprécipitat étant sous forme divisée, elle concerne également les kits permettant la mise en oeuvre de l'invention. Elle concerne également le procédé de préparation du coprécipitat, sous forme divisée, contenant au moins un sel insoluble de calcium et au moins un complexe entre une protéine ostéogénique et un polysaccharide. L'invention concerne également les formulations, les produits pharmaceutiques et les dispositifs médicaux comprenant ledit coprécipitat.

Description

Nouvelle forme d'administration de protéines ostéogéniques
La présente invention concerne le domaine des formulations ostéogéniques et plus particulièrement des formulations des protéines ostéogéniques appartenant à la famille des Bone Morphogenetic Proteins, BMPs.
Les Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sont des facteurs de croissance impliqués dans les mécanismes d'ostéoinduction. Les BMPs appelées également Osteogenic Proteins (OPs) ont été initialement caractérisées par Urist en 1965 (Urist MR. Science 1965; 150, 893). Ces protéines isolées à partir d'os cortical ont la capacité d'induire la formation d'os chez un grand nombre d'animaux (Urist MR. Science 1965; 150, 893).
Les BMPs sont exprimées sous forme de propeptides qui, après maturation post-traductionnelle, ont une longueur comprise entre 104 et 139 résidus. Elles possèdent une grande homologie de séquences entre elles et ont des structures tridimensionnelles similaires. En particulier, elles possèdent 6 résidus cystéine impliqués dans des ponts disulfure intramoléculaires formant un cysteine knot (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287, 103 ; Schlunegger MP,J. Mol. Biol. 1993; 231, 445). Certaines d'entre elles possèdent une 7e cystéine impliquée également dans un pont disulfure intermoléculaire à l'origine de la formation du dimère (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287:103.).
Sous leur forme active, les BMPs s'assemblent en homodimères, voire en hétérodimères comme cela a été décrit par Israel et al. (Israel DI, Growth Factors. 1996; 13(3-4), 291). Les BMPs dimériques interagissent avec les récepteurs transmembranaires de type BMPR (Mundy et al. Growth Factors, 2004, 22 (4), 233). Cette reconnaissance est à l'origine d'une cascade de signalisation intracellulaire impliquant notamment les protéines Smad aboutissant ainsi à l'activation ou à la répression des gènes cibles.
Les BMPs, à l'exception des BMP 1 et 3, jouent un rôle direct et indirect sur la différenciation des cellules mésenchymateuses provoquant leur différenciation en ostéoblastes (Cheng H., J. Bone and Joint Surgery, 2003, 85A 1544-1552). Elles possèdent en outre des propriétés de chimiotactisme et induisent la prolifération, la différentiation et l'angiogénèse.
Certaines BMPs recombinantes humaines et notamment la rhBMP-2 et la rhBMP-7 ont clairement montré une capacité à induire la formation d'os in vivo chez l'homme et ont été approuvées pour certaines applications médicales. Ainsi, la BMP-2 recombinante humaine, dibotermine alfa selon la dénomination commune internationale, est formulée dans les produits commercialisés sous le nom de InFUSE aux Etats-Unis et de InductOs en Europe. Ce produit est prescrit dans la fusion des vertèbres lombaires et la régénération osseuse du tibia pour les fractures dites non-union. Dans le cas d'InFUSE pour la fusion des vertèbres lombaires, l'intervention chirurgicale consiste tout d'abord, à imbiber une éponge de collagène avec une solution de rhBMP-2, puis à placer l'éponge dans une cage creuse, LT Cage, préalablement implantée entre les vertèbres.
La BMP-7 recombinante humaine, eptotermine alpha selon la dénomination commune internationale, a les mêmes indications thérapeutiques que la BMP-2 et constitue la base de deux produits : OP-1 Implant pour les fractures ouvertes du tibia et OP-1 Putty pour la fusion des vertèbres lombaires. OP- 1 Implant se compose d'une poudre contenant de la rhBMP-7 et du collagène à reprendre dans une solution saline à 0,9%. La pâte obtenue est ensuite appliquée au niveau de la fracture lors d'une intervention chirurgicale. OP-1 Putty se présente sous la forme de deux poudres : l'une contenant la rhBMP-7 et du collagène, l'autre de la carboxyméthylcellulose (CMC). Au cours d'une intervention chirurgicale, la CMC est reconstituée avec une solution saline 0,9% et mélangée avec la rhBMP-7 et le collagène. La pâte ainsi obtenue est appliquée sur le site à traiter.
L'administration des protéines ostéogéniques est un problème majeur en raison de leur instabilité et de la nécessité qui apparait d'obtenir des formulations ostéogéniques contenant une quantité minimale de protéine ostéogénique, afin d'éviter les effets secondaires générés par des concentrations importantes de ces protéines et également en raison du prix de ces protéines.
De nombreuses formulations ont été et sont développées comme par exemple celles citées dans la revue de Seeherman (Seeherman, H. et al., Spine 2002, 27 (16 Suppl 1), S16-S23.), dans laquelle l'importance de la nature du système de délivrance est soulignée.
Les systèmes de délivrance utilisés doivent permettre d'augmenter le temps de rétention des protéines au site d'administration, d'obtenir une libération totale de la quantité de protéine mise en oeuvre et d'éviter une libération trop brutale pouvant entrainer une diffusion hors du site d'administration. Le système de délivrance utilisé doit également pouvoir servir de matrice à la croissance osseuse sur le site à traiter tout en permettant de circonscrire cette croissance osseuse sur le site à traiter. Quatre types de matériaux sont employés dans les systèmes de délivrance à ce jour, les polymères naturels, les polymères synthétiques, les matériaux inorganiques et les mélanges de ces matériaux. Aucun des systèmes développés n'a néanmoins permis de réduire significativement la dose de BMP. Cela est lié entre autres, soit à l'instabilité de la protéine dans la formulation, soit à la mauvaise biodisponibilité de celle-ci en raison de la structure du support.
S'agissant des polymères naturels le collagène, les hyaluronanes, la fibrine, les chitosans, les alginates et d'autres polysaccharides naturels sont utilisés. Si les éponges à base de collagène recombinant permettent d'éliminer la plupart des inconvénients connus de ce polymère naturel, l'introduction dans les éponges de la protéine ostéogénique n'est pas à ce jour satisfaisante. Les autres polysaccharides naturels sous forme d'hydrogels présentent essentiellement le défaut d'être trop rapidement résorbés, sauf à être préalablement réticulés sous forme de gels, ce qui conduit aux mêmes inconvénients que ceux précités pour les éponges de collagène. S'agissant des polymères synthétiques, les plus couramment utilisés sont des polymères de poly(a-hydroxyacides) comme le polylactide (PLA), le polyglycolide (PLG) et leurs copolymères (PLGA).
Les inconvénients majeurs de ces polymères sont les abaissements de pH dus à leur dégradation et les réactions inflammatoires qu'ils peuvent induire. S'agissant des matériaux inorganiques, des systèmes de délivrance combinant des phosphates de calcium avec une protéine ostéoinductrice ont été développés. Parmi ceux-ci, on citera les céramiques à base de phosphate de calcium, comme l'hydroxyapatite (HAP) et le phosphate tricalcique (TCP) et les phosphates de calcium non-céramiques , comme les ciments à base de phosphates de calcium (CPCs). Il est connu depuis les années 1970 que les céramiques de phosphate de calcium peuvent avoir un intérêt pour la reconstruction osseuse comme cela est rappelé dans la revue de M. Bohner (Bohner, M., Injury 2000, 31 Suppl 4, 37-47.).
Mais il est admis que la dose de BMP-2 efficace est plus importante dans une céramique que dans une éponge de collagène. Une étude clinique de fusion postérolatérale chez l'homme (Boden, S. D. et al., Spine 2002, 27 (23), 2662-2673.) rapporte que la dose de BMP-2 (40 mg) est plus importante avec des granules de BCP (60 % HAP et 40 % TCP) produit développé par la société MEDTRONIC SOFAMOR, que dans une éponge de collagène qui ne contient pas de phosphate de calcium (12 mg).
Afin de pallier cet inconvénient, un très grand nombre de systèmes ont été développés à base de phosphate de calcium non-céramique et parmi ceux-ci figurent les ciments de phosphate de calcium. Les ciments ont été découverts dans les années 1980 par Brown et Chow et répondent à la définition suivante : Les ciments de phosphate de calcium sont constitués d'une solution aqueuse et de un ou plusieurs phosphates de calcium. Lorsque le mélange est effectué, le(s) phosphate(s) de calcium se dissolve(nt) et précipite(nt) en un sel de phosphate de calcium moins soluble. Au cours de la précipitation, les cristaux de phosphate de calcium grossissent et s'enchevêtrent, ce qui conduit à la rigidité mécanique du ciment. (Bohner, M., Injury 2000, 31 Suppl 4, 37-47.). Un article de Kim (Kim, H. D. et al., Methods Mol Biol 2004, 238, 49-64.) décrit l'emploi d'un ciment développé par la société Etex, l'aplha-BSM, avec de la BMP-2. Ce nouveau produit conduit bien à une acivité ostéoinductrice de la matrice. Cependant, la BMP-2 introduite dans cette matrice perd une partie importante de son activité ce qui conduit à devoir augmenter la quantité de BMP-2 embarquée. Ainsi une dose de 40 pg de BMP-2 est employée dans le modèle de la formation d'os ectopique chez le rat au lieu des 20 pg de BMP-2 employés dans une éponge de collagène. En effet, les ciments présentent deux inconvénients. Tout d'abord, le 5 ou les phosphates de calcium qui en sont les précurseurs doivent être synthétisés au préalable dans des conditions incompatibles avec des protéines. Ainsi dans le brevet US 5650176 sont décrites les conditions réactionnelles nécessaires pour la préparation du phosphate de calcium amorphe qui est un des composés de l'alpha-BSM. Ces conditions sont incompatibles avec les protéines car une quantité très importante de soude est employée. De plus, ces produits nécessitent une purification poussée puisque des composés toxiques tels que le calcium nitrate sont utilisés. D'autres exemples de ciments tels que ceux décrits par la société Graftys dans le brevet EP1891984A1 sont obtenus dans des conditions incompatibles avec les protéines puisque du dichlorométhane est employé lors de la synthèse du phosphate de calcium. Les ciments décrits par la société Lisopharm dans le brevet US2009/0155320 sont obtenus en présence d'hydroxide de calcium ce qui est également incompatible avec les protéines. De plus, d'une façon générale, la formation de ciment s'obtient en faisant réagir un sel de phosphate de calcium soluble avec un sel de phosphate de calcium solide traité à plus de 400°C afin de rendre celui-ci réactif. La réaction entre ces deux composés est incontrôlée, la plupart du temps exothermique et conduit à un ciment à structure monolithique qui séquestre dans sa masse la protéine.
Dans le brevet US563461 il est mentionné la présence de lacunes réactives dans le solide sans que l'on sache si cela est néfaste à la stabilité chimique de la BMP-2. Afin de réduire les pertes de protéine dans la masse de solide formé, il a été décrit dans le brevet US5650176 qu'il est avantageux d'ajouter au mélange réactif des composés effervescents susceptibles de réduire le caractère monolithique du ciment. Malgré ces améliorations, force est de constater que les quantités en protéine nécessaires pour obtenir une formation d'os dans le modèle de rat ectopique, restent importantes.
S'agissant des systèmes mixtes, ceux-ci n'ont pas permis à ce jour de résoudre les problèmes ci-dessus évoqués.
6 En résumé, les systèmes décrits dans l'art antérieur concernant l'emploi de polymères synthétiques, des polymères naturels ou encore des matériaux inorganiques tels que les céramiques ou les ciments de phosphates de calcium ne permettent pas de répondre complètement au cahier des charges imposé pour les applications de la réparation osseuse.
Il est du mérite de la demanderesse d'avoir développé une approche originale qui consiste à mettre en présence la protéine ostéogénique avec des sels solubles de calcium et des sels solubles de phosphate qui permettent de répondre au cahier des charges imposé pour les applications de la réparation osseuse.
Cette approche originale permet d'une part de précipiter la protéine, en évitant toute dégradation chimique au contact des réactifs présents, et d'autre part de la co-précipiter avec un sel insoluble de calcium, de préférence le phosphate de calcium, ledit coprécipité étant sous forme divisée, ce qui limite très nettement les pertes dans la masse de solide telles que constatées avec les ciments.
Ainsi, la demanderesse a mis au point de nouvelles compositions ostéogéniques composées d'un coprécipitat qui contient au moins un sel insoluble de calcium et au moins une protéine ostéogénique, ledit coprécipitat étant sous forme divisée. La conjonction de ces deux évènements permet d'obtenir des formulations très ostéogéniques contenant des quantités beaucoup plus faibles de protéine. Ces nouvelles compositions présentent ainsi l'avantage de contenir de plus faibles quantités de protéines qui est l'objectif majeur ceci afin de réduire les effets secondaires après administration chez les patients.
De plus, elles permettent de réduire les coûts des traitements en réduisant la quantité de protéine car ces protéines sont très chères.
On connait au nom de la demanderesse les demandes provisoires numéros 61/129023 et 61/129617 qui décrivent et revendiquent des compositions ostéogéniques comprenant au moins une protéine ostéogénique, un sel soluble de cation divalent et une matrice.
On connait au nom de la demanderesse les demandes provisoires numéros 61/129011 et 61/129618 qui décrivent et revendiquent des compositions ostéogéniques comprenant au moins une protéine ostéogénique, au moins une protéine angiogénique, un sel soluble de cation divalent, éventuellement un polysaccharide anionique et éventuellement une matrice. On connait au nom de la demanderesse la demande provisoire numéro US61/193217 déposée le 6 novembre 2008 qui décrit et revendique des compositions ostéogéniques comprenant au moins une protéine ostéogénique, un sel soluble de cation au moins divalent et un polymère formant un hydrogel.
S'agissant de la présente invention, la demanderesse a également mis au point le procédé de préparation du coprécipitat, sous forme divisée, contenant au moins un sel insoluble de calcium et au moins une protéine ostéogénique. L'invention concerne également les formulations, les produits pharmaceutiques et les dispositifs médicaux comprenant ledit coprécipitat.
Les compositions et les kits permettant de mettre en oeuvre ce 20 procédé et d'obtenir le coprécipitat sont également des inventions ci-après décrites.
La coprécipitation est obtenue par : - la précipitation de la protéine ostéogénique par addition d'une 25 solution de sel d'ions calcium, - la précipitation des ions calcium par l'addition d'une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium à un pH déterminé.
30 Dans un mode de réalisation, la précipitation du sel de calcium est effectuée sous forme de phosphate de calcium, par addition d'une solution de phosphate soluble.
La nature et la forme du coprécipitat peuvent varier en fonction du pH 35 des solutions mises en présence car les sels de phosphates de calcium présentent différentes phases solides en fonction du pH.15 L'invention concerne un coprécipitat consistant en au moins une protéine ostéogénique sous sa forme insolubilisée et au moins un sel de calcium insoluble, ledit coprécipitat étant sous forme divisée.
Dans un mode de réalisation, le sel de calcium insoluble est choisi dans le groupe consitué par les orthophosphates de calcium sous forme anhydre ou hydratée seuls ou en mélange.
Dans un mode de réalisation, le coprécipitat comprend en outre au moins un sel de calcium insoluble choisi dans le groupe constitué par l'oxalate de calcium, l'ascorbate de calcium, le carbonate de calcium ou le sulfate de calcium.
Lesdits sels de calcium insolubles peuvent être des sels mixtes formés entre les ions calcium cationiques et les ions anioniques tels que les phosphates, mono, di ou tribasiques, les carboxylates des polysaccharides, les carbonates, les hydroxydes et les eventuels anions portés par les bases.
Les orthophosphates de calcium sont des sels qui résultent de la neutralisation des différentes acidités de l'acide phosphorique par les sels de calcium et selon la littérature les pKa varient de 2,12 à 12,67 à 25°C.
Les principaux orthophosphates de calcium insolubles sont les phosphates dicalcique, DCP, anhydre ou dihydraté, les phosphates octacalciques, OCP, les phosphates tricalciques, TCP, les hydroxyapatites phosphacalciques, HAP ou PCA, et le phosphate tétracalcique, TTCP.
Cette coprécipitation en fonction de l'effet recherché est effectuée éventuellement en présence d'une base permettant d'ajuster le pH à une valeur prédéterminée.
Cette coprécipitation permet d'obtenir une composition chimique solide, à l'état divisé, qui permet notamment de contrôler la délivrance de la protéine ostéogénique contenue dans la composition.
Cette composition chimique solide, à l'état divisé, est obtenue spontanément dans des conditions de température ambiante, et son état divisé est stable en conditions physiologiques. 35 Dans un mode de réalisation, l'invention consiste en un kit pour la préparation d'un implant ostéogénique comprenant au moins : a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, c - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, Dans un mode de réalisation, le kit comprend en outre, une composition supplémentaire comprenant au moins une base. Dans un mode de réalisation, une deuxième base peut être additionnée aux compositions b ou c.
Certaines de ces compositions sont susceptibles d'être réunies avant la formation du coprécipitat afin de diminuer le nombre de flacons.
La composition comprenant la protéine ostéogénique peut également comprendre le sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et/ou une base.
Dans un mode de réalisation, la composition comprenant le sel de calcium soluble peut comprendre également une base.
Dans un mode de réalisation, le kit comprend : a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, d - une composition comprenant au moins une base.
Dans ce mode de réalisation une deuxième base identique ou différente à la base de la composition d peut être additionnée aux compositions b et c.
Dans un mode de réalisation, le kit comprend a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble et au moins une base c - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium.
Dans ce mode de réalisation, une deuxième base identique ou différente à la base de la composition b peut être additionnée à la composition c.
Dans un mode de réalisation, le kit comprend a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, c - une composition comprenant au moins une base.
Dans ce mode de réalisation une deuxième base identique ou différente à la base de la composition c peut être additionnée à la composition b.
Dans un mode de réalisation, le kit comprend a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble et au moins une base.
Dans ce mode de réalisation une deuxième base identique ou différente à la base de la composition b peut être additionnée à la composition a.
Dans un mode de réalisation, le kit comprend a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, c - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et au moins une base.
Dans un mode de réalisation, le kit comprend a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et au moins une base, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble.
Dans ce mode de réalisation une deuxième base identique ou différente à la base de la composition a peut être additionnée à la composition b.
Dans un mode de réalisation, la composition comprenant au moins une protéine ostéogénique comprend en outre au moins un facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique,
Dans un mode de réalisation, le kit, comprend en outre une matrice organique ou une matrice minérale ou une matrice mixte.
Dans un mode de réalisation, les compositions constituant le kit sont des solutions aqueuses. Dans un mode de réalisation, les compositions constituant le kit sont des lyophilisats. Dans un mode de réalisation, certaine des compositions constituant le kit sont des lyophilisats. Dans ce mode de réalisation, les lyophilisats sont réhydratés avant mise en réaction, par de l'eau ou une des autres compositions en solution. Ainsi par exemple, la composition comprenant la protéine ostéogénique sous forme de lyophilisat peut être réhydratée avec la solution comprenant un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et/ou une base.
Dans un mode de réalisation, les formulations et produits pharmaceutiques comprenant ledit précipitat sont des suspensions aqueuses. Dans un mode de réalisation, les formulations et produits pharmaceutiques comprenant ledit précipitat sont des lyophilisats.
Dans ce mode de réalisation les lyophilisats sont réhydratés avant emploi, au moyen de sérum physiologique eu de sang.
On entend par protéine ostéogénique un facteur de croissance ostéogéniques ou BMP seuls ou en combinaison une BMP choisie dans le groupe des BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) thérapeutiquement actives. Plus particulièrement les protéines ostéogéniques sont choisies dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison. Les BMP utilisées sont des BMP recombinantes humaines, obtenues selon les techniques connues de l'homme de l'art ou achetées auprès de fournisseurs comme par exemple la société Research Diagnostic Inc. (USA).
On entend par facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique des protéines telles que les PDGF, notamment le PDGF-BB, les VEGF ou les FGF, notamment le FGF-2.
Dans un mode de réalisation, la protéine ostéogénique est choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison et le au moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique est le PDGF. Dans un mode de réalisation, la composition comprend au moins de la BMP-2 et du PDGF-BB. Dans un mode de réalisation, la composition comprend au moins de la BMP-7 et du PDGF-BB. Dans un mode de réalisation, la composition comprend au moins du GDF-5 et du PDGF-BB.
Dans un mode de réalisation, la protéine ostéogénique est choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison et le au moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique est le VEGF.
Dans un mode de réalisation, la protéine ostéogénique est choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison et le au moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique est le FGF.
Le sel soluble de calcium est un sel de calcium dont l'anion est choisi dans le groupe constitué par le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate ou l'aspartate. Dans un mode de réalisation, le sel soluble de calcium est du chlorure de calcium. On entend par sel soluble d'un anion susceptible de former un précipité avec l'ion calcium un sel soluble dont l'anion est choisi dans le groupe constitué des anions phosphates comprenant l'ion phosphate PO43- l'ion hydrogénophosphate HPO42" et l'ion dihydrogénophosphate H2PO4
Dans un mode de réalisation, un deuxième anion choisi dans le groupe constitué par les anions oxalate, ascorbate, carbonate ou sulfate est en outre ajouté à la composition comprenant un anion phosphate.
Les sels solubles d'un anion susceptibles de former un précipité avec l'ion calcium sont choisis dans le groupe constitué par les phosphates de sodium, d'oxalate de sodium, l'ascorbate de sodium, le carbonate de sodium, le sulfate de sodium et l'hydrogénocarbonate de sodium.
Le défaut osseux détermine le volume des solutions susceptibles d'être mises en oeuvre, il y a donc nécessité de réduire les volumes de chaque solution donc les concentrations des constituants en deça de leur limite de solubilité. De plus les solutions doivent être conservées à environ 4 °C pour des questions de stabilité ce qui abaisse encore la limite de solubilité.
Afin de neutraliser les composés acides présents dans le mélange, les bases sont choisies parmi les bases minérales ou organiques. Parmi les bases minérales, on citera la soude, l'hydrogénocarbonate de sodium ou le carbonate de sodium. Parmi les bases organiques, on citera les amines et les acides aminés déprotonés. Parmi les bases organiques, on citera l'imidazole et ses dérivés notamment l'histidine, la proline, l'éthanolamine ou la sérine.
Dans un mode de réalisation, une matrice organique peut être utilisée afin de favoriser la réparation, elle est choisie parmi les matrices à base de collagène naturel purifié, stérilisé et réticulé.
Les polymères naturels comme le collagène sont des composants de la matrice extracellulaire qui favorisent l'attachement, la migration et la différentiation cellulaire. Ils présentent l'avantage d'être extrêmement biocompatibles et sont dégradés par des mécanismes de digestion enzymatique. Les matrices à base de collagène sont obtenues à partir de collagène fibrillaire de type I ou IV extraits à partir de tendon ou d'os de boeuf ou de porc. Ces collagènes sont d'abord purifiés avant d'être réticulés puis stérilisés. Elles peuvent également être obtenues par résorption en milieu acide d'os autologue, conduisant à la perte de la majorité des composants minéralisés mais à la préservation des protéines collagéniques on non-collagéniques, incluant les facteurs de croissance. Ces matrices déminéralisées peuvent également être préparées sous forme inactive après extraction avec des agents chaotropiques. Ces matrices sont essentiellement composées de collagène de Type I insoluble et réticulé.
Des matériaux mixtes peuvent également être utilisés, par exemple une matrice qui associe le collagène et des particules inorganiques. Ces matériaux qui peuvent se présenter sous la forme d'un matériau composite aux propriétés mécaniques renforcées ou encore sous la forme d'un putty ou la collagène joue un rôle de liant. Les matériaux inorganiques utilisables comprennent essentiellement des céramiques à base de phosphate de calcium telles que l'hydroxyapatite (HA), le phosphate de calcium tricalcique (TCP), le phosphate de calcium biphasique (BCP) ou le phosphate de calcium amorphe (ACP) qui présentent comme principal intérêt une composition chimique très proche de celle de l'os. Ces matériaux possèdent de bonnes propriétés mécaniques et sont immunologiquement inertes. Ces matériaux peuvent se présenter sous différentes formes comme des poudres, des granulats ou des blocs. Ces matériaux présentent des vitesses de dégradation très différentes en fonction de leurs compositions. Ainsi l'hydroxyapatite se dégrade très lentement (plusieurs mois) alors que le phosphate de calcium tricalcique se dégrade plus rapidement (plusieurs semaines). C'est dans ce but que les phosphates de calcium biphasiques ont été développés car ils présentent des vitesses de résorption intermédiaires. Ces matériaux inorganiques sont connus pour être principalement ostéoconducteurs.
Dans un mode de réalisation, la matrice organique est un hydrogel réticulé. Un hydrogel réticulé est obtenu par réticulation de chaînes de polymères. Les liaisons covalentes inter-chaînes définissant une matrice organique. Les polymères pouvant être employés pour la constitution d'une matrice organique sont décrits dans la revue de Hoffman intitulée Hydrogels for biomedical applications (Adv. Drug Deliv. Rev, 2002, 43, 3-12). Dans un mode de réalisation, l'implant peut comprendre un hydrogel non réticulé.
On entend par hydrogel non réticulé un réseau tri-dimensionel hydrophile de polymère capable d'adsorber une quantité importante d'eau ou de liquides biologiques (Peppas et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 2000, 50, 27-46). Cet hydrogel est constitué d'interactions physiques et n'est donc pas obtenu par réticulation chimique des chaînes de polymère.
La liste des polymères formant des hydrogels est très large et une liste importante mais non exhaustive est donnée dans la revue de Hoffman intitulée Hydrogels for biomedical applications (Adv. Drug Deliv. Rev., 2002, 43, 3-12). Parmi ces polymères, on peut trouver des polymères synthétiques ainsi que des polymères naturels. Une autre revue couvrant les polysaccharides formant des hydrogels permet de choisir un polymère utile pour l'invention (Alhaique et al. J.
Control. Release, 2007, 119, 5-24).
Dans un mode de réalisation, le polymère formant un hydrogel est choisi dans le groupe des polymères synthétiques parmi lesquels les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide lactique, les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide glycolique, la poly(N-Vinyl pyrrolidone), les acides polyvinyliques, les polyacrylamides, les acides polyacryliques.
Dans un mode de réalisation, le polymère formant un hydrogel est choisi dans le groupe des polymères naturels parmi lesquels l'acide hyaluronique, le kératane, le pullulane, la pectine, le dextrane, la cellulose et les dérivés de cellulose, l'acide alginique, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine, le collagène, la gélatine, la polylysine, la fibrine et leurs sels biologiquement acceptables.
Dans un mode de réalisation, le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, parmi lesquels l'acide hyaluronique, l'acide alginique, le dextrane, la pectine, la cellulose et ses dérivés, le pullulane, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine et leurs sels biologiquement acceptables.
Dans un mode de réalisation, le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, parmi lesquels l'acide hyaluronique, l'acide alginique et leurs sels biologiquement acceptables.
Dans un mode de réalisation, l'hydrogel peut être préparé juste avant l'implantation.
Dans un mode de réalisation, l'hydrogel peut être préparé et conservé dans une seringue pré-remplie afin d'être ensuite implanté.
Dans un mode de réalisation, l'hydrogel peut être préparé par réhydratation d'un lyophilisat juste avant l'implantation ou être implanté sous forme déshydraté. Le système après formation du coprécipitat est constitué de deux phases, une phase liquide et une phase solide. Dans la suite de l'exposé lorsque la notion de volume est employée, il s'agit du volume total comprenant les deux phases. Les quantités par unité de volume dans le produit résultant après mélange des compositions des différentes formes du kit sont données ci-après.
Dans un mode de réalisation, les quantités totales des différentes protéines par unité de volume sont comprises entre 0,01 mg et 2 mg, de préférence entre 0,05 mg et 1,5 mg, et encore de préférence entre 0,2 mg et 1,5 mg par ml de suspension obtenue. Les quantités totales de phosphates par unité de volume sont comprises entre 0,02 mmol à 0,5 mmol, de préférence entre 0,05 à 0,25 mmol par ml de suspension obtenue. Les quantités totales de calcium par unité de volume sont comprises entre 0,1 mmol et 1 mmol, de préférence entre 0,05 et 1 mmol et encore de préférence entre 0,1 mmol et 0,5 mmol, par unité de volume.
Le pourcentage des ions calcium dans la phase solide est compris entre 60 et 95 % des ions calcium introduits. Les quantités de base mises en oeuvre correspondent à environ 0,1 à 2 équivalents par rapport aux protons apportés par les ions phosphates.
En fonction des volumes mis en oeuvre et du nombre de compositions, on peut déterminer par le calcul les quantités mises en oeuvre dans les compositions de départ. Cela peut être réalisé pour les différents modes de réalisation des kits.
Dans un mode de réalisation, pour un implant vertébral les doses de facteur de croissance ostéogénique seront comprises entre 0,01 mg et 20 mg, de préférence entre 0,05 mg et 8 mg de préférence entre 0,1 mg et 4 mg, encore de préférence entre 0,1 mg et 2 mg, alors que les doses couramment admises dans la littérature sont comprises entre 8 et 12 mg.
Dans un mode de réalisation, pour un implant vertébral les doses de facteur de croissance angiogénique seront comprises entre 0,05 mg et 8 mg, de préférence entre 0,1 mg et 4 mg, encore de préférence entre 0,1 mg et 2 mg.
Dans un mode de réalisation, pour la formulation d'un implant comprenant le coprécipitat selon l'invention, on réalise un kit comprenant trois flacons, lesdits flacons contenant : le premier entre 2 et 10 mg de protéine ostéogénique sous forme lyophilisée, le second entre 2 et 6 ml d'une solution d'un mélange équimolaire d'hydrogénophosphate de sodium Na2HPO4 et de dihydrogénophosphate de sodium NaH2PO4 de concentration comprise entre 0,15 et 0,50 M, - le troisième entre 2 et 6 ml d'une solution de chlorure de calcium à une concentration comprise entre 0,25 et 0,90 M.
Dans un mode de réalisation, le deuxième flacon contient en outre une solution de bicarbonate de sodium à une concentration comprise entre 0,20 et 0,8 M. Dans un mode de réalisation, le deuxième et le troisième flacon contiennent en outre une solution d'histidine à une concentration comprise entre 0,02 et 0,2 M. Dans un mode de réalisation, le troisième flacon contient en outre une solution de proline à une concentration comprise entre 0,05 et 0,3M.
Les solutions sont additionnées simultanément ou successivement avant implantation sur une éponge de collagène d'un volume compris entre 15 et 30 ml.
Dans un mode de réalisation, pour la formulation d'un implant comprenant le coprécipitat selon l'invention on mélange trois solutions comprenant : la première d'un volume entre 1 et 3 ml contenant une protéine ostéogénique à une concentration comprise entre 0,33 et 2 mg/ml. la seconde d'un volume entre 1 et 3 ml un mélange équimolaire d'hydrogénophosphate de sodium Na2HPO4 et de dihydrogénophosphate de sodium NaH2PO4de concentration comprise entre 0,05 et 0,15 M, la troisième d'un volume entre 1 et 3 ml contenant du chlorure de calcium à une concentration comprise ente 0,25 et 0,50 M.
Dans un mode de réalisation, une solution de bicarbonate de sodium à une concentration comprise entre 0,20 et 0,4 M est additionnée au mélange obtenu. Dans un mode de réalisation, une solution d'histidine à une concentration comprise entre 0,02 et 0,15 M est additionnée au mélange obtenu. Dans un mode de réalisation, une solution de proline à une concentration comprise entre 0,05 et 0,3M est additionnée au mélange obtenu.
Le mélange comprenant le coprécipitat selon l'invention est ensuite lyophilisé. Au moment de la mise en oeuvre celui-ci est réhydraté avec de l'eau injectable et/ou du sang à environ 35 % du volume initial.
L'invention concerne également l'utilisation des compositions de l'invention par implantation, par exemple, pour combler des défauts osseux, pour effectuer des fusions vertébrales ou des réparations maxillo-faciales ou pour le traitement des fractures osseuses en particulier du type pseudarthrose.
L'invention concerne également l'utilisation des compositions selon l'invention comme implant osseux. 30 Dans un mode de réalisation, les compositions pourront être utilisées en combinaison avec un dispositif prothétique du type prothèse vertébrale ou cage de fusion vertébrale.
L'invention concerne également les méthodes thérapeutiques et chirurgicales utilisant les compositions dans la reconstruction osseuse. Dans ces différentes utilisations thérapeutiques, la taille de la matrice et la quantité de facteur de croissance ostéogénique sont fonction du volume du site à combler.
Des exemples de kits sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 1 : Préparation d'un kit comprenant 4 flacons Kit 1 : Un kit de 4 flacons comprend un flacon contenant la protéine ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble lyophilisé ou en solution, un flacon contenant un sel de phosphate soluble lyophilisé ou en solution et un flacon contenant une base lyophilisée ou en solution.
Exemple 2 Préparation d'un kit comprenant 3 flacons Kit 2 : Un kit de 3 flacons comprend un flacon contenant la protéine ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble lyophilisé ou en solution et un flacon contenant un sel de phosphate soluble lyophilisé ou en solution.
Exemple 3 : Préparation d'un kit comprenant 3 flacons Kit 3 : Un kit de 3 flacons comprend un flacon contenant la protéine ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble et une base lyophilisés ou en solution et un flacon contenant un sel de phosphate soluble lyophilisé ou en solution.
Exemple 4 : Préparation d'un kit comprenant 3 flacons Kit 4 : Un kit de 3 flacons comprend un flacon contenant la protéine ostéogénique lyophilisée ou en solution, un flacon contenant un sel de calcium soluble lyophilisé ou en solution et un flacon contenant un sel de phosphate soluble et une base lyophilisés ou en solution.
Exemple 5 : Préparation d'un kit comprenant 2 flacons Kit 5 : Un kit de 2 flacons comprend un flacon contenant la protéine ostéogénique et un sel de phosphate soluble lyophilisés ou en solution et un flacon contenant un sel de calcium soluble lyophilisé ou en solution.
Exemple 6 : Préparation d'un kit comprenant 2 flacons Kit 6 : Un kit de 2 flacons comprend un flacon contenant la protéine ostéogénique, un sel de phosphate soluble et une base lyophilisés ou en solution solution et un flacon contenant un sel de calcium soluble lyophilisé ou en solution.
Exemple 7 : Préparation d'un kit comprenant 2 flacons Kit 7 : Un kit de 2 flacons comprend un flacon contenant la protéine ostéogénique et un sel de phosphate soluble lyophilisés ou en solution solution et un flacon contenant un sel de calcium soluble et une base lyophilisés ou en solution.
Des exemples de solution ou de lyophilisat de protéines ostéogéniques sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 8 : Solution de rhBMP-2 en tampon HCI 1 mM 10 mL d'une solution de rhBMP-2 à 0,15 mg/ml sont préparés par ajout de 10 mL d'une solution d'HCI 1 mM à 1,5 mg de rhBMP-2 lyophilisée (R&D system). Cette solution est laissée à incuber deux heures à 4°C et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 9 : Solution de rhBMP-7 en tampon HCI 10 mM Une solution de rhBMP-7 à 3,8 mg/ml est préparée par ajout de 1 mL d'une solution d'HCI 1 mM à 3,8 mg de rhBMP-7 lyophilisée. Le pH de cette solution est de 2,2. Cette solution est laissée à incuber 15 minutes à température ambiante et est filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 10 : Solution de rhBMP-7 en tampon lactose 5% pH 3,5 Une solution de rhBMP-7 à 3,8 mg/ml est préparée par ajout de 7,8 mL d'une solution de lactose à 5% dont le pH a été fixé à 3,5 par ajout d'HCI 1 M à 30,3 mg de rhBMP-7 lyophilisée. Le pH de cette solution est de 3,5. Cette solution est laissée à incuber 15 minutes à température ambiante et est filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 11 : Solution de rhGDF-5 en tampon HCI 10 mM 1 mL d'une solution de rhGDF-5 à 1,5 mg/ml est préparé par ajout de 1 mL d'une solution d'HCI 10 mM à 1,5 mg de rhGDF-5 lyophilisé. Cette solution est laissée à incuber deux heures à 4°C et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Des exemples de préparation de solutions de sels de phosphates solubles sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 12 : Solution de phosphate de sodium Une solution de phosphate de sodium à 1 M est préparée en fiole jaugée à partir d'un mélange équimolaire d'hydrogénophosphate de sodium anhydre et de dihydrogénophosphate de sodium (Sigma). Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Des solutions plus diluées de phosphate de sodium sont préparées à partir de la solution mère décrite ci-dessus.
Exemple 13 : Solution d'hydrogénocarbonate de sodium Une solution d'hydrogénocarbonate de sodium à 1,2 M est préparée en fiole jaugée à partir d'hydrogénocarbonate de sodium anhydre (Sigma). Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Des solutions plus diluées d'hydrogénocarbonate de sodium sont préparées à partir de la solution mère décrite ci-dessus.
Des exemples de préparation de solutions de protéines ostéogéniques 30 et de phosphate sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 14 : Préparation d'une solution de rhBMP-2 en présence de phosphate de sodium Un lyophilisat contenant 0,77 mg de rhBMP-2 est repris par 3,86 mL 35 d'une solution à 0,45 M de phosphate de sodium obtenue par dilution de la solution décrite dans l'Exemple 12. La concentration en BMP-2 dans la solution est de 0,2 mg/mL. La solution est laissée à incuber deux heures à 4°C. La solution obtenue est limpide et est filtrée stérilement sur 0,22 pm. 25 Exemple 15 : Préparation d'une solution de rhBMP-2 en présence de phosphate de sodium et d'hydrogénocarbonate Un lyophilisat contenant 1,0 mg de rhBMP-2 est repris par 1,5 mL d'eau stérile, 1,0 mL d'une solution à 1,0 M de phosphate de sodium obtenue selon l'Exemple 12 et 2,5 mL d'une solution à 0,6 M d'hydrogénocarbonate de sodium obtenue selon l'Exemple 13. La concentration en BMP-2 dans la solution est de 0,2 mg/mL. La solution est laissée à incuber deux heures à 4°C. La solution obtenue est limpide et est filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Des exemples de préparation de solutions de sels de calcium solubles sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 16 : Solution de chlorure de calcium à 2 M Solution 1 : Une solution de chlorure de calcium à 2 M est préparée en fiole jaugée à partir de chlorure de calcium anhydre ou dihydrate (Sigma). Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 17 : Solution de chlorure de calcium à 0,75 M Solution 2 : Une solution de chlorure de calcium à 0,75 M est préparée par dilution à partir de la solution de chlorure de calcium 2 M décrite dans l'exemple précédent. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 18 : Solution d'acétate de calcium à 0,75 M Solution 3 : Une solution d'acétate de calcium à 0,75 M est préparée en fiole jaugée à partir d'acétate de calcium (Sigma). Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 19 : Solution de gluconate de calcium à 0,75 M Solution 4 : Une solution de gluconate de calcium à 0,75 M est préparée en fiole jaugée à partir de gluconate de calcium (Sigma). Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Des exemples de préparation de solutions de bases sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 20 : Solution d'histidine à 1 M Solution 5 : Une solution d'histidine à 1 M est préparée en fiole jaugée de 1 L en solubilisant 155,2 g de L-histidine (Sigma) dans le volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 21 : Solution de proline à 2 M Solution 6 : Une solution de proline à 2 M est préparée en fiole jaugée de 1 L en ajoutant 230,2 g de L-proline (Sigma), 200 mL de soude 10 N et le volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 dam.
Exemple 22 : Solution de serine à 2 M Solution 7 : Une solution de serine à 2 M est préparée en fiole jaugée de 1 L en ajoutant 210,2 g de L-serine (Sigma), 200 mL de soude 10 N et le volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 23 : Solution de glycine à 2 M Solution 8 : Une solution de glycine à 2 M est préparée en fiole jaugée de 1 L en ajoutant 150,1 g de L-glycine (Sigma), 200 mL de soude 10 N et le volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 24 : Solution d'alanine à 2 M Solution 9 : Une solution de alanine à 2 M est préparée en fiole jaugée de 1 L en ajoutant 178,2 g de L-alanine (Sigma), 200 mL de soude 10 N et le volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
25 Exemple 25: Solution de lysine à 2 M Solution 10 : Une solution de lysine à 2 M est préparée en fiole jaugée de 1 L en ajoutant 292,4 g de L-lysine (Sigma), 200 mL de soude 10 N et le volume d'eau désionisée nécessaire pour atteindre le trait de jauge. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Des solutions de concentration plus faible de ces différentes bases sont obtenues par dilution soit avec de l'eau, soit avec une solution de sels de calcium décrites précedemment.
Des exemples de préparation de solutions comprenant un sel de calcium soluble et une base sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Exemple 26 : Solution de chlorure de calcium et d'histidine Solution 11 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M et de l'histidine à 0,4 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de chlorure de calcium à 2 M, 120 mL d'une solution d'histidine à 1 M et 67,5 mL d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 27: Solution de chlorure de calcium et de proline Solution 12 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M et de proline à 0,75 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de chlorure de calcium à 2 M, 112,5 mL d'une solution de proline à 2 M et 75 mL d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 28 : Solution de chlorure de calcium et de glycine Solution 13 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M et de glycine à 0,75 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de chlorure de calcium à 2 M, 112,5 mL d'une solution de glycine à 2 M et 75 mL d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 29 : Solution de chlorure de calcium et d'alanine Solution 14 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M et d'alanine à 0,75 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de chlorure 35
26 de calcium à 2 M, 112,5 mL d'une solution d'alanine à 2 M et 75 mL d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 30 : Solution de chlorure de calcium et de lysine Solution 15 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M et de lysine à 0,75 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de chlorure de calcium à 2 M, 112,5 mL d'une solution de lysine à 2 M et 75 mL d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Exemple 31 : Solution de chlorure de calcium et de serine Solution 16 : Une solution contenant du chlorure de calcium à 0,75 M et de serine à 0,75 M est préparée en ajoutant 112,5 mL d'une solution de chlorure de calcium à 2 M, 112,5 mL d'une solution de serine à 2 M et 75 mL d'eau désionisée. Cette solution est laissée à incuber 30 minutes à température ambiante et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Des exemples de préparation d'implants comprenant une BMP, un sel de calcium soluble, un sel de phosphate soluble et/ou une base sont donnés à titre indicatif et non limitatif.
Les implants décrits dans les exemples suivants sont préparés avec une éponge de collagène de type-I réticulée stérile de type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). Le volume de cette éponge est de 200 pL pour une application en site ectopique chez le rat.
Exemple 32: Préparation d'implants éponge de collagène / complexe rhBMP-2/Polymère 1 en présence de chlorure de calcium et de phosphate de sodium lyophilisés Implant 1 : 40 pl d'une solution à 0.05 mg/mL de BMP-2 obtenue par dilution de 28 pL d'une solution à 1.46 mg/mL dans un tampon 10 mM HCI dans 788 pL d'eau stérile sont introduits dans une éponge de collagène réticulée de 200 mm3 stérile. La solution est laissée à incuber pendant 15 minutes dans l'éponge de collagène avant de rajouter 10 pl d'une solution de chlorure de calcium à une concentration de 1,64 M et 90 pL d'une solution de phosphate de sodium à 0,47 M. L'éponge est alors congelée et lyophilisée stérilement. La dose de rhBMP-2 est de 2 pg.
Contre-exemple 1 : Préparation d'un implant éponge de collagène contenant 20 pg de rhBMP-2 Implant 2 : 40 pl d'une solution de rhBMP-2 à 0,5 mg/ml dans un tampon 10 mM HCI sont introduits stérilement dans une éponge de collagène réticulée, de 200 mm3, stérile. La solution est laissée pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant implantation. La dose de rhBMP-2 dans l'implant 2 est de 20 pg.
Contre-exemple 2 : Préparation d'un implant éponge de collagène contenant 2 pg de rhBMP-2 Implant 3 : 40 pl d'une solution de rhBMP-2 à 0,05 mg/ml dans un tampon 10 mM HCI sont introduits stérilement dans une éponge de collagène réticulée, de 200 mm3, stérile, de type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). La solution est laissée pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant implantation. La dose de rhBMP-2 dans l'implant 3 est de 2 pg.
Exemple 33 : Evaluation du pouvoir osteoinductif des différentes formulations L'objectif de cette étude est de démontrer le pouvoir osteoinductif des différentes formulations dans un modèle de formation ectopique d'os chez le rat. Des rats mâles de 150 à 250 g (Sprague Dawley OFA û SD, Charles River Laboratories France, B.P. 109, 69592 l'Arbresle) sont utilisés pour cette étude.
Un traitement analgésique (buprenorphine, Temgesic , Pfizer, France) est administré avant l'intervention chirurgicale. Les rats sont anesthésiés par inhalation d'un mélange 02 isoflurane (1-4%). La fourrure est éliminée par rasage sur une large zone dorsale. La peau de cette zone dorsale est désinfectée à l'aide d'une solution de povidone iodine (Vetedine solution, Vetoquinol, France).
Des incisions paravertébrales d'environ 1 cm sont effectuées afin de dégager les muscles dorsaux paravertébraux droit et gauche. L'accès aux muscles est effectué par incision transfaciale. Chacun des implants est placé dans une poche de telle manière qu'aucune compression sur celles-ci ne puisse être exercée. Quatre implants sont implantés par rat (deux implants par site).
L'ouverture des implants est ensuite suturée au moyen d'un fil polypropylene (Prolene 4/0, Ethicon, France). La peau est refermée au moyen d'une suture non-absorbable. Les rats sont ensuite replacés dans leurs cages respectives et gardés en observation durant leur rétablissement.
A 21 jours, les animaux sont anesthésiés par une injection de tiletamine-zolazepam (ZOLETIL 25-50 mg/kg, IM, VIRBAC, France). Les animaux sont ensuite euthanasiés par injection d'une dose de pentobarbital (DOLETHAL , VETOQUINOL, France). Chacun des expiants est retiré de son site d'implantation et des photographies macroscopiques sont prises. La taille et le poids des expiants sont ensuite déterminés. Chaque expiant est ensuite conservé dans une solution de formol à 10% tamponnée.
Résultats : Cette expérience in vivo permet de mesurer l'effet ostéoinducteur de la rhBMP-2 placée dans un muscle du dos d'un rat. Ce site non osseux est dit ectopique. Les résultats des différentes exemples sont résumés dans le tableau suivant. Quantité de BMP-2 en pg Masse des expiants (mg) Exemple 32 2 52 Contre-exemple 1 20 38 Contre-exemple 2 2 Pas d'ossicule Une dose de 20 pg de rhBMP-2 dans une éponge de collagène (Contre-exemple 1) conduit à l'obtention d'expiants ossifiés de 38 mg de masse moyenne après 21 jours.
Une dose de 2 pg de rhBMP-2 dans une éponge de collagène (Contre-exemple 2) n'a pas un pouvoir ostéoinducteur suffisant pour qu'on puisse retrouver les implants collagéniques au bout de 21 jours.
Lorsque la rhBMP-2 est co-précipitée en présence de phosphate de 25 calcium, une dose de rhBMP-2 de 2 pg (Exemples 28) permet de générer des ossicules contrairement à la rhBMP-2 seule à la même dose. De plus, ces ossicules sont de masse et de score osseux équivalents à ceux avec la rhBMP-2 seule à la dose de 20 pg. Cette formulation permet donc d'améliorer fortement l'activité ostéogénique de la rhBMP-2 avec un effet équivalent à une dose 10 fois 30 plus faible. 15 20

Claims (43)

  1. REVENDICATIONS1. Coprécipitat consistant en au moins une protéine ostéogénique sous sa forme insolubilisée et au moins un sel de calcium insoluble, ledit coprécipitat 5 étant sous forme divisée.
  2. 2. Coprécipitat selon la revendication 1, caractérisé en ce que le sel de calcium insoluble est choisi dans le groupe consitué par les orthophosphates de calcium sous forme anhydre ou hydratée seuls ou en mélange.
  3. 3. Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un sel de calcium insoluble choisi dans le groupe constitué par l'oxalate de calcium, l'ascorbate de calcium, le carbonate de calcium ou le sulfate de calcium. 15
  4. 4. Coprécipitat selon la revendication 1, caractérisé en ce que le sel de calcium insoluble est choisi dans le groupe constitué par des sels mixtes formés entre les ions calcium cationiques et les ions anioniques choisis parmi les phosphates, mono, di ou tribasiques, les carboxylates des polysaccharides, 20 les carbonates, les hydroxydes et les anions apportés par les bases.
  5. 5. Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique.
  6. 6. Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéine ostéogénique est choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptoterminealpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison. 30
  7. 7. Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications 5 à 6, caractérisé en ce que le au moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique est le PDGF. 35
  8. 8. Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend au moins de la BMP-2 et du PDGF-BB. 10 25
  9. 9.Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend au moins de la BMP-7 et du PDGF-BB.
  10. 10.Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, 5 caractérisé en ce qu'il comprend au moins du GDF-5 et du PDGF-BB.
  11. 11.Coprécipitat selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que la protéine ostéogénique est choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine- 10 alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison et le au moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique est le VEGF.
  12. 12.Implant ostéogénique comprenant au moins un coprécipitat selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 15
  13. 13.Kit pour la préparation d'un implant ostéogénique selon la revendication 12 comprenant au moins : a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble, 20 c - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium.
  14. 14.Kit selon la revendication 13, comprenant en outre, une composition supplémentaire comprenant au moins une base.
  15. 15.Kit selon la revendication 13, comprenant en outre, une deuxième base qui peut être additionnée aux compositions b, c ou d.
  16. 16.Kit selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisé en 30 ce que la composition comprenant la protéine ostéogénique peut également comprendre le sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium et/ou une base.
  17. 17.Kit selon l'une quelconque des revendications 13 à 15 caractérisé en 35 ce que la composition comprenant le sel de calcium soluble peut comprendre également une base. 25
  18. 18.Kit pour la préparation d'un implant selon la revendication 12 comprenant au moins : a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins une base et au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble.
  19. 19.Kit pour la préparation d'un implant selon la revendication 12 10 comprenant au moins : a - une composition comprenant au moins une protéine ostéogénique, b - une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium, c - une composition comprenant au moins un sel de calcium soluble et 15 au moins une base.
  20. 20.Kit selon l'une quelconque des revendications 13 à 19, caractérisé en ce que la protéine ostéogénique est choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-20 14 et le GDF-5 seules ou en combinaison.
  21. 21. Kit selon l'une quelconque des revendications 13 à 19, caractérisé en ce que la composition comprenant au moins une protéine ostéogénique comprend au moins un facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-25 attractant et angiogénique.
  22. 22. Kit selon la revendication 21, caractérisé en ce que le facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique est le PDGF. 30
  23. 23.Kit selon l'une quelconque des revendications 13 à 19, caractérisé en ce qu'il comprend au moins de la BMP-2 et du PDGF-BB.
  24. 24.Kit selon l'une des quelconques des revendications 13 à 19, caractérisé en ce qu'il comprend au moins de la BMP-7 et du PDGF-BB. 35
  25. 25.Kit selon l'une des quelconques des revendications 13 à 19, caractérisé en ce qu'il comprend au moins du GDF-5 et du PDGF-BB.
  26. 26.Kit selon l'une des quelconques des revendications 13 à 19, caractérisé en ce que la protéine ostéogénique est choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptoterminealpha), la BMP-14 et le GDF-5 seules ou en combinaison et le au moins facteur de croissance ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique est le VEGF.
  27. 27.Kit selon l'une des quelconques des revendications 13 à 26, caractérisé en ce que le sel soluble de calcium est choisi dans le groupe constitué par le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate ou l'aspartate de calcium.
  28. 28.Kit selon l'une des quelconques des revendications 13 à 26, caractérisé en ce que le sel soluble de calcium est du chlorure de calcium.
  29. 29. Kit selon l'une des quelconques des revendications 13 à 28, caractérisé en ce que le sel soluble d'un anion susceptible de former un précipité avec l'ion calcium est un sel soluble dont l'anion est choisi dans le groupe constitué des anions phosphates comprenant l'ion phosphate PO43- l'ion hydrogénophosphate HPO42- et l'ion dihydrogénophosphate H2PO4-.
  30. 30.Kit selon l'une des quelconques des revendications 13 à 29, caractérisé en ce que la base est choisie parmi les bases minérales ou organiques.
  31. 31.Kit selon la revendication 30, caractérisé en ce que la base minérale est choisie dans le groupe constitué par la soude, l'hydrogénocarbonate de sodium ou le carbonate de sodium.
  32. 32.Kit selon la revendication 30, caractérisé en ce que la base organique est choisie dans le groupe constitué par les amines et les acides aminés déprotonés.35
  33. 33.Kit selon la revendication 30, caractérisé en ce que la base organique est choisie dans le groupe constitué par l'imidazole et ses dérivés notamment l'histidine, la proline, l'éthanolamine ou la sérine.
  34. 34.Kit selon l'une des quelconques des revendications 13 à 33, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une matrice organique ou une matrice minérale ou une matrice mixte.
  35. 35.Kit selon selon la revendication 34, caractérisé en ce que la matrice 10 est une matrice organique choisie dans le groupe constitué par les hydrogels et/ou les matrices à base de polymère réticulé.
  36. 36. Kit selon la revendication 35, caractérisé en ce que l'hydrogel est un hydrogel obtenu par réticulation chimique ou physique de chaîne de 15 polymères.
  37. 37.Kit selon la revendication 36, caractérisé en ce que le polymère réticulé est du collagène naturel purifié, stérilisé et réticulé. 20
  38. 38. Kit selon la revendication 36, caractérisé en ce que l'hydrogel est choisi dans le groupe des polymères synthétiques parmi lesquels les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide lactique, les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide glycolique, la poly(N-vinyl pyrrolidone), les acides polyvinyliques, et polyacrylamides et les acides polyacryliques. 25
  39. 39.Kit selon la revendication 36, caractérisé en ce que l'hydrogel est choisi dans le groupe des polymères naturels parmi lesquels l'acide hyaluronique, le kératane, le pullulane, la pectine, le dextrane, la cellulose et les dérivés de cellulose, l'acide alginique, le xanthane, la carraghénane, le 30 chitosane, la chondroitine, le collagène, la gélatine, la polylysine, la fibrine et leurs sels biologiquement acceptables.
  40. 40.Kit selon l'une des quelconques des revendications 13 à 39, caractérisé en ce que les compositions constituant le kit sont des solutions 35 aqueuses.
  41. 41.Kit selon l'une des quelconques des revendications 13 à 39, caractérisé en ce que les compositions constituant le kit sont des lyophilisats.
  42. 42.Procédé de préparation d'un coprécipitat selon l'une quelconque des revendications 1 à 11,comprenant les étapes suivantes : - précipitation de la protéine ostéogénique par addition d'une solution de sel d'ions calcium, - précipitation des ions calcium par addition d'une composition comprenant au moins un sel soluble d'un anion susceptible de former un sel insoluble de calcium à un pH déterminé.
  43. 43.Procédé selon la revendication 42, caractérisé en ce que la précipitation des ions calcium est effectuée sous forme de phosphate de calcium, par addition d'une solution de phosphate soluble.15
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