WO2009144578A2 - Composition synergique osteogenique - Google Patents

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WO2009144578A2 PCT/IB2009/005799 IB2009005799W WO2009144578A2 WO 2009144578 A2 WO2009144578 A2 WO 2009144578A2 IB 2009005799 W IB2009005799 W IB 2009005799W WO 2009144578 A2 WO2009144578 A2 WO 2009144578A2
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    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Definitions

  • the present invention relates to the field of osteogenic formulations and more particularly to formulations of osteogenic proteins belonging to the family of Bone Morphogenetic Proteins, BMPs.
  • BMPs Bone Morphogenetic Proteins
  • OPs Osteogenic Proteins
  • Morphogenic Protein, BMP of another growth factor with chemoattractant and angiogenic potencies such as Platelet Derived Growth Factor, PDGF, to promote bone formation.
  • PDGF Platelet Derived Growth Factor
  • This combination leads to a synergy between the two growth factors and allows to create a bone mass greater than that obtained with only one of these growth factors including at lower doses than those commonly used.
  • BMPs make it possible to differentiate stem cells into osteoblasts capable of generating bone.
  • Two therapeutic products are marketed for osteogenic applications:
  • Infuse (Medtronic) which is a BMP-2 formulation for the fusion of lumbar vertebrae and non-union fractures of the tibia.
  • PDGF-BB is not a cell differentiation factor, which is confirmed by the fact that PDGF-BB does not make it possible to create bone formations on an ectopic site.
  • the invention thus relates to an osteogenic synergistic composition
  • an osteogenic synergistic composition comprising at least one osteogenic growth factor, and at least one growth factor, having a chemo-attracting and angiogenic power.
  • osteogenic growth factor or BMP is meant, alone or in combination, a BMP selected from the group of therapeutically active BMPs (Bone Morphogenetic Proteins).
  • the osteogenic proteins are selected from the group consisting of BMP-2 (Dibotermin-alpha), BMP-4, BMP-7 (Eptotermin-alpha), BMP-14 and GDF-5 alone or in combination .
  • the BMPs used are recombinant human BMPs, obtained according to the techniques known to those skilled in the art or purchased from suppliers such as, for example, Research Diagnostic Inc. (USA).
  • Chemo-attractant and angiogenic growth factors are understood to mean a protein selected from the group consisting of PDGF, VEGF or FGF, alone or in combination.
  • the invention thus relates to an osteogenic synergistic composition
  • an osteogenic synergistic composition comprising at least one osteogenic growth factor, and at least one growth factor, having a chemo-attractant and angiogenic potency, PDGF.
  • the invention relates to a synergistic composition
  • a synergistic composition comprising at least one osteogenic protein selected from the group consisting of BMP-2 (Dibotermin-alpha), BMP-4, BMP-7 (Eptotermin-alpha), BMP-14 and GDF-5 alone or in combination and at least one growth factor having a chemoattractant and angiogenic potency, PDGF.
  • the invention relates to a composition comprising at least BMP-2 and PDGF-BB.
  • the invention relates to a composition comprising at least BMP-7 and PDGF-BB.
  • the invention thus relates to an osteogenic synergistic composition comprising at least one osteogenic growth factor, and at least one growth factor, having a chemo-attracting, and angiogenic, VEGF.
  • the invention relates to a synergistic composition
  • a synergistic composition comprising at least one osteogenic protein selected from the group consisting of BMP-2 (Dibotermin-alpha), BMP-4, BMP-7 (Eptotermin-alpha), BMP-14 and GDF-5 alone or in combination and at least one growth factor, having a chemo-attracting, and angiogenic, VEGF.
  • the invention thus relates to an osteogenic synergistic composition
  • an osteogenic synergistic composition comprising at least one osteogenic growth factor, and at least one growth factor, having a chemo-attractant, and angiogenic, FGF.
  • the invention relates to a synergistic composition
  • a synergistic composition comprising at least one osteogenic protein selected from the group consisting of BMP-2 (Dibotermin-alpha), BMP-4, BMP-7 (Eptotermin-alpha), BMP-14 and GDF-5 alone or in combination and at least one growth factor, having a chemo-attracting, and angiogenic, FGF.
  • bone formation is further enhanced by the fact that the growth factors are formulated with an amphiphilic polymer capable of forming complexes with said growth factors.
  • the invention thus relates to a synergistic composition as defined above, characterized in that it also comprises an anionic polysaccharide chosen from the group consisting of anionic polysaccharides functionalized with hydrophobic derivatives chosen from dextrans derivatives bearing hydrophobic substitutes such as tryptophan and tryptophan drifts.
  • an anionic polysaccharide chosen from the group consisting of anionic polysaccharides functionalized with hydrophobic derivatives chosen from dextrans derivatives bearing hydrophobic substitutes such as tryptophan and tryptophan drifts.
  • the functionalized dextran can meet the following general formulas:
  • R being a chain comprising between 1 and 18 carbons, optionally branched and / or unsaturated comprising one or more heteroatoms, such as O, N or / and S, and having at least one acidic function
  • F being either an ester, a thioester, an amide, a carbonate, a carbamate, an ether, a thioether or an amine
  • AA being a hydrophobic amino acid residue, L or D, produces a coupling between the amine of the amino acid and an acid carried by the R group, said hydrophobic amino acid being chosen from tryptophan derivatives, such as than tryptophan, tryptophanol, tryptophanamide, 2-indole ethylamine and their alkaline cation salts.
  • i represents the mole fraction of substituent FR- [AA] n per glycoside unit and is between 0, 1 and 2
  • n represents the mole fraction of Rs substituted by AA and is between 0.05 and 1.
  • the acid or acids of the R group are cationic carboxylates, alkali preferably Na, K, said dextran being amphiphilic at neutral pH.
  • the alkaline cation is Na + .
  • F is either an ester, a carbonate, a carbamate or an ether.
  • the polysaccharide according to the invention is a carboxymethyl dextran (DMC) of formula IV.
  • DMC carboxymethyl dextran
  • the polysaccharide according to the invention is a monosuccinic ester of dextran or succinicaciddextran (DSA) of formula V:
  • the polysaccharide according to the invention is characterized in that the group R is chosen from the following groups:
  • the dextran according to the invention is characterized in that the tryptophan derivatives are selected from the formula II tryptophan esters.
  • E being a group that can be:
  • a linear or branched C1 to C8 alkyl A linear or branched C1 to C8 alkyl.
  • a linear or branched C 6 -C 20 alkylaryl or arylalkyl is A linear or branched C 6 -C 20 alkylaryl or arylalkyl.
  • the dextran according to the invention is a carboxymethyl-dextran modified with the ethyl ester of tryptophan of formula VI:
  • the dextran according to the invention is a monosuccinic ester of dextran or succinicaciddextran (DSA) modified with the ethyl ester of tryptophan of formula VII:
  • the dextran according to the invention is characterized in that the hydrophobic amino acid is phenylalanine and its alcohol, amide or decarboxylated derivatives.
  • the dextran according to the invention is characterized in that the phenylalanine derivatives are chosen from the esters of this amino acid of formula III.
  • Dextran may have a degree of polymerization m of between 10 and 10,000.
  • it has a degree of polymerization m of between 10 and 1000.
  • it has a degree of polymerization m of between 10 and 500.
  • bone formation is also promoted in the presence of soluble salts of divalent or multivalent cations.
  • the invention relates to a composition characterized in that it further comprises a divalent cation selected from the group consisting of calcium or magnesium or zinc cations.
  • the soluble divalent cation salt is a calcium salt whose counterion is selected from chloride, D-gluconate, oxalate, hydroxide, formate, D-saccharate , phosphate, carbonate, acetate, sulfate, L-ascorbate, L-tartrate, L-lactate, glutamate, aspartate.
  • the divalent cation soluble salt is calcium chloride.
  • composition according to any preceding claim characterized in that it further comprises multivalent cations selected from the group consisting of iron cations, aluminum, cationic polymers selected among polylysine, spermine, protamine and fibrin alone or in combination.
  • the invention also relates to a composition as defined above characterized in that it further comprises an organic matrix selected from the matrices based on purified natural collagen, and sterilized preferably crosslinked.
  • the invention also relates to the use of synergistic compositions according to the invention for the preparation and manufacture of pharmaceutical products intended for bone reconstruction or regeneration in the form of topical compositions, for example in the form of implants.
  • the synergistic compositions according to the invention are prepared by solubilization of the growth factors in a buffered solution at physiological pH.
  • a polymer solution is added to the growth factor solution.
  • the solution is added to a matrix chosen from matrices based on purified natural collagen, and sterilized, preferably cross-linked.
  • the formulations according to the invention are lyophilized before use.
  • the invention thus relates to a formulation as defined above, characterized in that it is in the form of a lyophilizate.
  • Lyophilisate is the product or composition resulting from a freeze-drying operation.
  • Lyophilization is a water sublimation technique allowing dehydration of the composition. This technique is commonly used for protein storage and stabilization.
  • a lyophilizate is very rapid and makes it easy to obtain a ready-to-use formulation, said formulation being rehydrated before implantation or implanted in its dehydrated form, the rehydration then taking place, after implantation, by contact with biological fluids.
  • the osteogenic compositions according to the invention are used by implantation for example to fill bone defects, to perform vertebral fusions or maxillofacial repairs or for the treatment of the lack of consolidation of fractures (pseudarthrosis).
  • the size of the matrix and the total amount of growth factors are a function of the volume of the site to be filled.
  • the doses of growth factors will be between 0.05 mg to 8 mg, preferably between 0.1 mg and 4 mg, more preferably between 0.1 mg and
  • the doses administered will be of the order of ten ⁇ g.
  • the cation solutions have concentrations of between 0.01 and 1 M, preferably between 0.05 and 0.2 M.
  • the anionic polysaccharide solutions have concentrations of between 1 mg / ml and 2 mg / ml, preferably between 5 and 100 mg / ml, more preferably between 10 and 50 mg / ml.
  • the invention also relates to the use of the composition according to the invention as a bone implant.
  • said composition may be used in combination with a prosthetic device of the type vertebral prosthesis or vertebral fusion cage.
  • the invention also relates to therapeutic and surgical methods using said composition in bone reconstruction.
  • the invention also relates to the process for preparing the compositions according to the invention which comprises at least the following stages: a) an organic matrix is available, b) said matrix is impregnated with a solution comprising the two growth factors and and / or the anionic amphiphilic anionic polysaccharide complex (s) and / or the amphiphilic anionic polysaccharide, c) adding to the matrix obtained in step b) a solution of a soluble salt of at least divalent cation, d) optionally lyophilizes the matrix obtained in step c).
  • the at least divalent cation soluble salt solution is a divalent cation solution.
  • the soluble salts of divalent cation are calcium salts whose counterion is chosen from chloride,
  • the divalent cation soluble salt is calcium chloride.
  • Step 1 carboxymethyldextran modified with tryptophan ethyl ester
  • This amphiphilic polymer is synthesized from a carboxymethyldextran having a degree of carboxymethyl substitution per saccharide unit of 1.0 and an average molecular weight of 60 kg / mol.
  • the ethyl ester of tryptophan is grafted onto the carboxylic acids of this polymer according to a conventional method of organic solvent coupling using the ethyl chloroformate and N-methyl morpholine. After dilution of the reaction medium in water and adjusting the pH to 7 by adding 1N NaOH, the polymer is purified by ultrafiltration.
  • the final polymer is characterized by: * a degree of substitution at TrpOEt per saccharide unit of 0.45, determined by 1 H NMR in DaO / NaOD.
  • Step 2 tryptophan modified carboxymethyldextran, polymer sodium salt 1
  • This amphiphilic polymer is obtained by basic hydrolysis of carboxymethyldextran modified with the ethyl ester of tryptophan. 1N sodium hydroxide (3.79 ml) is added to an aqueous solution of tryptophan ethyl ester modified carboxymethyl dextran (64 ml at 31 mg / ml) to reach pH 12.7. The resulting solution is stirred overnight at room temperature. The polymer is purified by dialysis against water (NaCl 0.9% and H2O). The final polymer is characterized by: * a degree of substitution in TrpONa per saccharide unit of 0.45, determined by 1 H NMR in DaO / NaOD.
  • Implant 1 40 ⁇ l of a solution of rhBMP-2 at 0.5 mg / ml are introduced sterilely in a sterile 200 mm 3 cross-linked collagen sponge of the Helistat type (Integra Life Sciences, Plainsboro, New Jersey). The solution is allowed to incubate for 30 minutes in the collagen sponge before use. The dose of BMP-2 is 20 ⁇ g.
  • Example 2 Preparation of the collagen sponge implant / rhBMP-2 / PDGF-BB
  • Implant 2 20 ⁇ l of a solution of rhBMP-2 at 1.0 mg / ml as well as 20 ⁇ l of a solution of rhPDGF-BB at 1.0 mg / ml are introduced sterilely into a collagen sponge.
  • Helistat type sterile 200 mm 3 reticulated tissue (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). The solution is allowed to incubate for 30 minutes in the collagen sponge before use.
  • the dose of BMP-2 and that of PDGF-BB are 20 ⁇ g each.
  • Formulation 1 50 ⁇ l of a solution of rhBMP-2 at 1, 5 mg / ml are mixed with 100 ⁇ l of a solution of Polymer 1 at 37.5 mg / ml.
  • the solutions of rhBMP-2 and Polymer 1 are buffered at pH 7.4. This solution is incubated for two hours at 4 ° C. and sterile filtered through
  • Formulation 2 50 ⁇ l of a solution of rhBMP-2 at 0.75 mg / ml are mixed with 100 ⁇ l of a solution of Polymer 1 at 37.5 mg / ml.
  • the solutions of rhBMP-2 and Polymer 1 are buffered at pH 7.4. This solution is incubated for two hours at 4 ° C. and sterile filtered through
  • Formulation 3 50 ⁇ l of a solution of rhPDGF-BB at 1, 5 mg / ml are mixed with 100 ⁇ l of a solution of Polymer 1 at 37.5 mg / ml.
  • the solutions of rhPDGF-BB and Polymer 1 are buffered at pH 7.4. This solution is incubated for two hours at 4 ° C. and sterile filtered through
  • Implant 3 40 ⁇ l of Formulation 1 are introduced into a sterile 200 mm 3 cross-linked collagen sponge of the Helistat type (Integra Life Sciences, Plainsboro, New Jersey). The solution is incubated for 30 minutes in the collagen sponge before adding 100 ⁇ l of a calcium chloride solution at a concentration of 18.3 mg / ml. The sponge is then frozen and sterilized lyophilized. The dose of BMP-2 is 20 ⁇ g.
  • Implant 4 20 ⁇ l of Formulation 2 as well as 20 ⁇ l of Formulation 3 are introduced into a sterile 200 mm 3 cross-linked collagen sponge of the Helistat type (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). The solution is allowed to incubate for 30 minutes in the collagen sponge before adding 100 ⁇ l of a calcium chloride solution at a concentration of 18.3 mg / ml. The sponge is then frozen and sterilized lyophilized. The dose of BMP-2 is 5 ⁇ g and that of PDGF-BB 10 ⁇ g.
  • the objective of this study is to demonstrate the osteoinductive power of different formulations in a model of ectopic bone formation in rats.
  • Analgesic treatment (buprenorphine, Temgesic ® , Pfizer, France) is given before surgery.
  • the rats are anesthetized by inhalation of a mixture O2 isoflurane (1-4%). Fur is shaved off over a wide dorsal area. The skin of this dorsal zone is disinfected with a solution of povidone iodine (Vetedine ® solution, Vetoquinol, France).
  • Paravertebral incisions of about 1 cm are made to clear the left and right paravertebral dorsal muscles. Access to the muscles is performed by transfacial incision. Each of the implants is placed in a pocket in such a way that no compression on them can be exerted. Four implants are implanted per rat (two implants per site). The opening of the implants is then sutured using a polypropylene wire (Prolene 4/0, Ethicon, France). The skin is closed with a non-absorbable suture. The rats are then returned to their respective cages and kept under observation during their recovery.
  • the animals are anesthetized with an injection of tiletamine-zolazepam (Z0LETIL ® 25-50 mg / kg, IM, Virbac, France).
  • the animals are then euthanized by injecting a dose of pentobarbital (DOLETHAL ®, VÉTOQUINOL, France).
  • DOLETHAL ® pentobarbital
  • VÉTOQUINOL pentobarbital
  • a macroscopic observation of each site is then made, any sign of local intolerance (inflammation, necrosis, haemorrhage) and the presence of bone and / or cartilage is recorded and scored according to the following scale: 0: absence, 1: low, 2: moderate, 3: marked, 4: important.
  • Each of the implants is removed from its implantation site and macroscopic photographs are taken. The size and weight of the implants are then determined. Each implant is then stored in a 10% buffered formalin solution.
  • This in vivo experiment measures the osteoinductive effect of BMP-2 by placing the implant in a muscle of the back of a rat. This non-osseous site is said to be ectopic.
  • a dose of 20 ⁇ g of BMP-2 in a collagen sponge makes it possible to obtain, after 21 days, ossified implants with an average weight of 37 mg.
  • PDGF-BB For the same dose of BMP-2 associated with 20 ⁇ g of PDGF-BB, the mass of implants almost doubled since the implants weigh on average 68 mg. PDGF-BB therefore stimulates the osteogenic activity of BMP-2 well and a synergistic activity is observed.

Abstract

L'invention concerne une composition synergique ostéogénique comprenant au moins un facteur de croissance ostéogénique, et au moins un facteur de croissance, ayant un pouvoir chémo-attractant, et angiogénique. Elle concerne également son procédé de préparation et son utilisation pour la préparation et la fabrication de produits pharmaceutiques destinés à la reconstruction ou régénération osseuse sous formes de compositions topiques par exemple implants, pâtes ou gels.

Description

COMPOSITION SYNERGIQUE OSTEOGENIQUE
La présente invention concerne le domaine des formulations ostéogéniques et plus particulièrement des formulations des protéines ostéogéniques appartenant à la famille des Bone Morphogenetic Proteins, BMPs.
Les Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sont des facteurs de croissance impliqués dans les mécanismes d'ostéoinduction. Les BMPs appelées également Osteogenic Proteins (OPs) ont été initialement caractérisées par Urist en 1965 (Urist MR. Science 1965; 150, 893). Ces protéines isolées à partir d'os cortical ont la capacité d'induire la formation d'os chez un grand nombre d'animaux (Urist MR. Science 1965; 1 50, 893). La présente invention concerne l'association à une Bone
Morphogenic Protein, BMP, d'un autre facteur de croissance ayant des pouvoirs chémo-attractant et angiogénique tel que le Platelet Derived Growth Factor, PDGF, pour favoriser la formation osseuse.
Cette association entraine une synergie entre les deux facteurs de croissance et permet de créer une masse osseuse supérieure à celle obtenue avec un seul de ces facteurs de croissance y compris à des doses plus faibles que celles communément utilisées.
II est connu de l'homme de l'art que les BMPs permettent de différentier les cellules souches en ostéoblastes capables de générer de l'os. Deux produits thérapeutiques sont commercialisés pour des applications ostéogéniques :
* Infuse (Medtronic) qui est une formulation de BMP-2 pour la fusion des vertèbres lombaires et des fractures de type non-union du tibia.
* OP1 (Stryker), produit à base de BMP-7 également pour la fusion des vertèbres lombaires.
Une équipe universitaire japonaise dont les travaux ont été publiés dans le British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 2003, 41 , 1 73-1 78, a établi que chez le rat, du PDGF-BB et de la BMP-2 sont sécrétés lors du processus de cicatrisation d'une fracture de la mandibule.
II est admis que le PDGF-BB n'est pas un facteur de différentiation cellulaire, ce qui est confirmé par le fait que le PDGF-BB ne permet pas de créer des formations osseuses sur un site ectopique.
Toutefois, un produit à base de PDGF-BB a été développé par BioMimetic pour la régénération osseuse dans le cas de maladie périodontale.
Dans la demande WO2007/092622, l'association du PDGF à d'autres facteurs de croissance est évoquée sans que cette évocation ne soit supportée par aucun résultat ni exemple.
Une autre équipe japonaise a publié dans le Journal of Bone and Minerai Research, 2002, 1 7, 2, 257-265, que le PDGF-BB a un rôle dans le processus de remodelage osseux mais qu'il est responsable : * d'un surcroît d'activité des ostéoclastes, responsables de la dégradation de l'os
* d'une inhibition des ostéoblastes responsables de la formation de l'os.
Aucun de ces travaux n'a enseigné qu'un effet synergique du point de vue de l'ostéosynthèse puisse être obtenu pour une formulation associant un facteur de croissance de chacune des deux familles précitées.
Il est du mérite de la demanderesse d'avoir obtenu de façon surprenante, une formulation à base de BMP et de PDGF qui se révèle favoriser, de façon synergique, l'ostéosynthèse.
L'invention concerne ainsi une composition synergique ostéogénique comprenant au moins un facteur de croissance ostéogénique, et au moins un facteur de croissance, ayant un pouvoir chémo-attractant, et angiogénique. On entend par facteur de croissance ostéogéniques ou BMP, seule ou en combinaison, une BMP choisie dans le groupe des BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) thérapeutiquement actives.
Plus particulièrement les protéines ostéogéniques sont choisies dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seul ou en combinaison.
Les BMP utilisées sont des BMP recombinantes humaines, obtenues selon les techniques connues de l'homme de l'art ou achetées auprès de fournisseurs comme par exemple la société Research Diagnostic Inc. (USA).
On entend par facteurs de croissance chémo-attractants et angiogéniques une protéine choisie dans le groupe constitué par le PDGF, le VEGF ou le FGF, seuls ou en combinaison.
L'invention concerne ainsi une composition synergique ostéogénique comprenant au moins un facteur de croissance ostéogénique, et au moins un facteur de croissance, ayant un pouvoir chémo-attractant et angiogénique, le PDGF.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une composition synergique comprenant au moins une protéine ostéogénique choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP- 4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seul ou en combinaison et au moins un facteur de croissance ayant un pouvoir chémo- attractant et angiogénique, le PDGF.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une composition comprenant au moins de la BMP-2 et du PDGF-BB.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une composition comprenant au moins de la BMP-7 et du PDGF-BB. L'invention concerne ainsi une composition synergique ostéogénique comprenant au moins un facteur de croissance ostéogénique, et au moins un facteur de croissance, ayant un pouvoir chémo-attractant, et angiogénique, le VEGF.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une composition synergique comprenant au moins une protéine ostéogénique choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP- 4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seul ou en combinaison et au moins un facteur de croissance, ayant un pouvoir chémo-attractant, et angiogénique, le VEGF.
L'invention concerne ainsi une composition synergique ostéogénique comprenant au moins un facteur de croissance ostéogénique, et au moins un facteur de croissance, ayant un pouvoir chémo-attractant, et angiogénique, le FGF.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une composition synergique comprenant au moins une protéine ostéogénique choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP- 4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 seul ou en combinaison et au moins un facteur de croissance, ayant un pouvoir chémo-attractant, et angiogénique, le FGF.
Dans un autre mode de réalisation, la formation d'os est d'autant plus favorisée que les facteurs de croissance sont formulés avec un polymère amphiphile capable de former des complexes avec lesdits facteurs de croissance.
L'invention concerne ainsi une composition synergique telle que précédemment définie caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un polysaccharide anionique choisi dans le groupe constitué par les polysaccharides anioniques fonctionalisés par des dérivés hydrophobes choisis parmi les dérivés des dextrans portant des substituts hydrophobes tels que le tryptophane et les dérives du tryptophane. Selon l'invention le dextran fonctionnalisé peut répondre aux formules générales suivantes :
Figure imgf000006_0001
Formule
• R étant une chaîne comprenant entre 1 et 1 8 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide
• F étant soit un ester, un thioester, un amide, un carbonate, un carbamate, un éther, un thioéther ou une aminé,
• AA étant un reste amino-acide hydrophobe, L ou D, produit du couplage entre l'aminé de l'amino-acide et un acide porté par le groupement R, ledit amino-acide hydrophobe étant choisi parmi les dérivés du tryptophane, tels que le tryptophane, le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2-indole éthylamine et leurs sels de cation alcalin.
i représente la fraction molaire de substituant F-R-[AA]n par unité glycosidique et est comprise entre 0, 1 et 2, n représente la fraction molaire des R substitués par AA et est comprise entre 0,05 et 1 . Lorsque R n'est pas substitué par AA, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na, K, ledit dextran étant amphiphile à pH neutre. Dans un mode de réalisation le cation alcalin est Na+.
Dans un mode de réalisation, F est soit un ester, un carbonate, un carbamate ou un éther.
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est un carboxymethyl dextran (DMC) de formule IV.
Figure imgf000007_0001
Formule IV ou l'acide correspondant.
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est un ester monosuccinique de dextran ou succinicaciddextran (DSA) de formule V :
Figure imgf000007_0002
Formule V ou l'acide correspondant.
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes suivants :
Figure imgf000007_0003
ou leurs sels de cations alcalins. Dans un mode de réalisation, le dextran selon l'invention est caVactérisé en ce que les dérivés du tryptophane sont choisis parmi les esters du tryptophane de formule II
Figure imgf000008_0001
Formule II
E étant un groupement pouvant être :
• un alkyle linéaire ou ramifié en C1 à C8.
• un alkylaryle ou un arylalkyle linéaire ou ramifié en C6 à C20.
Dans un mode de réalisation le dextran selon l'invention est un carboxyméthyldextran modifié par l'ester éthylique du tryptophane de formule Vl :
Figure imgf000008_0002
Formule Vl
Dans un mode de réalisation, le dextran selon l'invention est un ester monosuccinique de dextran ou succinicaciddextran (DSA) modifié par l'ester éthylique du tryptophane de formule VII :
Figure imgf000009_0001
Formule
VII
Dans un mode de réalisation, le dextran selon l'invention est caractérisé en ce que l'amino-acide hydrophobe est la phenylalanine et ses dérivés alcool, amide ou décarboxylés.
Dans un mode de réalisation, le dextran selon l'invention est caractérisé en ce que les dérivés de la phenylalanine sont choisis parmi les esters de cet acide aminé de formule III.
Figure imgf000009_0002
Formule
E étant défini comme précédemment.
Le dextran peut avoir un degré de polymérisation m compris entre 10 et 10000.
Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 1000.
Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 500. Dans un autre mode de réalisation, la formation d'os est également favorisée en présence de sels solubles de cations divalents ou multivalents.
L'invention concerne une composition caractérisée en ce qu'elle comporte en outre un cation divalent choisi dans le groupe constitué par les cations du calcium ou du magnésium ou du zinc.
Elle concerne une composition caractérisée en ce que le sel soluble de cation divalent est un sel de calcium dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, l'oxalate, l'hydroxyde, le formate, le D-saccharate, le phosphate, le carbonate, l'acétate, le sulfate, le L-ascorbate, le L-tartrate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate.
Dans un mode de réalisation le sel soluble de cation divalent est du chlorure de calcium.
Dans un mode de réalisation, elle concerne une composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comprend en outre des cations multivalents choisis dans le groupe constitué par les cations du fer, de l'aluminium, des polymères cationiques choisis parmi la polylysine, la spermine, la protamine et la fibrine seuls ou en combinaison.
L'invention concerne également une composition telle que précédemment définie caractérisée en ce quelle comporte en outre une matrice organique choisie parmi les matrices à base de collagène naturel purifié, et stérilisé de préférence réticulé.
L'invention concerne également l'utilisation de compositions synergiques selon l'invention pour la préparation et la fabrication de produits pharmaceutiques destinés à la reconstruction ou régénération osseuse sous formes de compositions topiques par exemple sous forme d'implants. Les compositions synergiques selon l'invention sont préparées par solubilisation des facteurs de croissance dans une solution tamponnée à pH physiologique.
Dans un mode de réalisation, une solution de polymère est additionnée à la solution de facteurs de croissance.
Dans un mode de réalisation, la solution est additionnée à une matrice choisie parmi les matrices à base de collagène naturel purifié, et stérilisé de préférence réticulé.
Dans un mode de réalisation d'implants, les formulations selon l'invention sont lyophilisées avant mise en œuvre.
L'invention concerne ainsi une formulation telle que précédemment définie caractérisée en ce qu'elle est sous forme de lyophilisât.
On entend par lyophilisât le produit ou la composition résultant d'une opération de lyophilisation.
La lyophilisation est une technique de sublimation de l'eau permettant une déshydratation de la composition. Cette technique est couramment utilisée pour la conservation et la stabilisation des protéines.
La réhydratation d'un lyophilisât est très rapide et permet l'obtention aisée d'une formulation prête à l'emploi, ladite formulation pouvant ête réhydratée avant l'implantation ou implantée sous sa forme déshydratée, la réhydratation intervenant alors, après implantation, par le contact avec les fluides biologiques.
Les compositions ostéogéniques selon l'invention sont utilisées par implantation par exemple pour combler des défauts osseux, pour effectuer des fusions vertébrales ou des réparations maxillo-faciales ou pour le traitement de l'absence de consolidation des fractures (pseudarthrose).
Dans ces différentes utilisations thérapeutiques, la taille de la matrice et la quantité totale de facteurs de croissance sont fonction du volume du site à combler.
Dans un mode de réalisation, pour un implant vertébral les doses de facteurs de croissance seront comprises entre 0,05 mg à 8 mg, de préférence entre 0,1 mg et 4 mg, encore de préférence entre 0,1 mg et
2 mg, alors que les doses couramment admises dans la littérature sont comprises entre 8 et 12 mg de BMP-2.
S'agissant des utilisations en réparation maxillo-faciale ou dans le traitement de la pseudarthrose, par exemple, les doses administrées seront de l'ordre de la dizaine de μg.
Dans un mode de réalisation, les solutions de cation ont des concentrations comprises entre 0,01 et 1 M, de préférence entre 0,05 et 0,2 M.
Dans un mode de réalisation les solutions de polysaccharide anionique ont des concentrations comprises entre 1 mg/ml et 2 mg/ml, de préférence entre 5 et 100 mg/ml, encore de préférence entre 10 et 50 mg/ml..
L'invention concerne également l'utilisation de la composition selon l'invention comme implant osseux.
Dans un mode de réalisation, ladite composition pourra être utilisée en combinaison avec un dispositif prothétique du type prothèse vertébrale ou cage de fusion vertébrale.
Elle concerne également les méthodes thérapeutiques et chirurgicales utilisant ladite composition dans la reconstruction osseuse. L'invention concerne également le procédé de préparation des compositions selon l'invention qui comprend au moins les étapes suivantes : a) on dispose d'une matrice organique, b) on imprègne ladite matrice d'une solution comprenant les deux facteurs de croissance et/ou le ou les complexes polysaccharides anioniques amphiphiles facteurs de croissance et/ou le polysaccharide anionique amphiphile, c) on additionne à la matrice obtenue à l'étape b) une solution d'un sel soluble de cation au moins divalent, d) on procède éventuellement à la lyophilisation de la matrice obtenue à l'étape c).
Dans un mode de réalisation à l'étape c), la solution de sel soluble de cation au moins divalent est une solution de cation divalent.
Dans un mode de réalisation les sels solubles de cation divalent sont des sels de calcium dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le
D-gluconate, l'oxalate, l'hydroxyde, le formate, le D-saccharate, le phosphate, le carbonate, l'acétate, le sulfate, le L-ascorbate, le L-tartrate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate.
Dans un mode de réalisation le sel soluble de cation divalent est du chlorure de calcium.
L'invention est illustrée par les exemples suivants.
Synthèse du Carboxymethyldextran fonctionnalisé par le sel de sodium du tryptophane (polymère 1 )
Etape 1 : carboxymethyldextran modifié par l'ester éthylique du tryptophane
Ce polymère amphiphile est synthétisé à partir d'un carboxymethyldextran ayant un degré de substitution en carboxyméthyl par unité saccharidique de 1 ,0 et une masse molaire moyenne de 60 kg/mol. L'ester éthylique du tryptophane est greffé sur les acides carboxyliques de ce polymère selon une méthode classique de couplage en solvant organique employant le chloroformiate d'éthyle et la N-MéthylMorpholine. Après dilution du milieu réactionnel dans l'eau et réglage du pH à 7 par ajout de NaOH 1 N, le polymère est purifié par ultrafiltration. Le polymère final est caractérisé par : * un degré de substitution en TrpOEt par unité saccharidique de 0,45, déterminé par RMN 1H dans DaO/NaOD.
* un degré de substitution en carboxylates (méthylcarboxylate) de 0,55, déterminé par dosage potentiométrique.
Etape 2 : carboxyméthyldextran modifié par le tryptophane, sel de sodium polymère 1
Ce polymère amphiphile est obtenu par hydrolyse basique du carboxyméthyldextran modifié par l'ester éthylique du tryptophane. De la soude 1 N (3.79 ml) est ajoutée à une solution aqueuse du carboxyméthyldextran modifié par l'ester éthylique du tryptophane (64 ml à 31 mg/ml) pour atteindre pH 12,7. La solution obtenue est agitée une nuit à température ambiante. Le polymère est purifié par dialyse contre de l'eau (NaCI 0.9% et H2O). Le polymère final est caractérisé par : * un degré de substitution en TrpONa par unité saccharidique de 0,45, déterminé par RMN 1H dans DaO/NaOD.
* un degré de substitution en carboxylates (méthylcarboxylate, carboxylate du tryptophane) de 1 ,0 déterminé par dosage potentiométrique.
Exemple 1 : Préparation de l'implant éponge de collagène / rhBMP-2
Implant 1 : 40 μl d'une solution de rhBMP-2 à 0,5 mg/ml sont introduits stérilement, dans une éponge de collagène réticulée de 200 mm3 stérile de type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). La solution est laissée à incuber pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant utilisation. La dose de BMP-2 est de 20 μg. Exemple 2 : Préparation de l'implant éponge de collagène / rhBMP-2 / PDGF-BB
Implant 2 : 20 μ\ d'une solution de rhBMP-2 à 1 ,0 mg/ml ainsi que 20 μ\ d'une solution de rhPDGF-BB à 1 ,0 mg/ml sont introduits stérilement, dans une éponge de collagène réticulée de 200 mm3 stérile de type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). La solution est laissée à incuber pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant utilisation. La dose de BMP-2 ainsi que celle de PDGF-BB sont de 20 μg chacune.
Exemple 3 : Préparation du complexe rhBMP-2/Polymère 1
Formulation 1 : 50 μ\ d'une solution de rhBMP-2 à 1 ,5 mg/ml sont mélangés à 100 //I d'une solution de Polymère 1 à 37,5 mg/ml. Les solutions de rhBMP-2 et de Polymère 1 sont tamponnées à pH 7,4. Cette solution est laissée à incuber deux heures à 4° C et filtrée stérilement sur
0,22 μm.
Formulation 2 : 50 μ\ d'une solution de rhBMP-2 à 0,75 mg/ml sont mélangés à 100 μ\ d'une solution de Polymère 1 à 37,5 mg/ml. Les solutions de rhBMP-2 et de Polymère 1 sont tamponnées à pH 7,4. Cette solution est laissée à incuber deux heures à 4°C et filtrée stérilement sur
0,22 μm.
Exemple 4 : Préparation du complexe rhPDGF-BB/ Polymère 1
Formulation 3 : 50 μ\ d'une solution de rhPDGF-BB à 1 ,5 mg/ml sont mélangés à 100 //I d'une solution de Polymère 1 à 37,5 mg/ml. Les solutions de rhPDGF-BB et de Polymère 1 sont tamponnées à pH 7.4. Cette solution est laissée à incuber deux heures à 4°C et filtrée stérilement sur
0,22 μm. Exemple 5 : Préparation des implants éponge collagène / complexe BMP-2/Polymère 1 en présence de chlorure de calcium lyophilisés
Implant 3: 40 μ\ de la Formulation 1 sont introduits dans une éponge de collagène réticulée de 200 mm3 stérile de type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). La solution est laissée à incuber pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant de rajouter 100 μ\ d'une solution de chlorure de calcium à une concentration de 18,3 mg/ml. L'éponge est alors ensuite congelée et lyophilisée stérilement. La dose de BMP-2 est de 20 μg.
Exemple 6 : Préparation des implants éponge collagène / complexe BMP-2/PDGF-BB/Polymère 1 en présence de chlorure de calcium lyophilisés
Implant 4 : 20 μ\ de la Formulation 2 ainsi que 20 μ\ de la Formulation 3 sont introduits dans une éponge de collagène réticulée de 200 mm3 stérile de type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). La solution est laissée à incuber pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant de rajouter 100 //I d'une solution de chlorure de calcium à une concentration de 18,3 mg/ml. L'éponge est alors ensuite congelée et lyophilisée stérilement. La dose de BMP-2 est de 5 μg et celle de PDGF-BB de 10 μg.
Exemple 7 : Evaluation du pouvoir ostéoinductif des différentes formulations
L'objectif de cette étude est de démontrer le pouvoir ostéoinductif des différentes formulations dans un modèle de formation ectopique d'os chez le rat. Des rats mâles de 1 50 à 250 g (Sprague
Dawley OFA - SD, Charles River Laboratories France, B. P. 109, 69592 l'ArbresIe) sont utilisés pour cette étude.
Un traitement analgésique (buprenorphine, Temgesic®, Pfizer, France) est administré avant l'intervention chirurgicale. Les rats sont anesthésiés par inhalation d'un mélange O2 isoflurane (1 -4%). La fourrure est éliminée par rasage sur une large zone dorsale. La peau de cette zone dorsale est désinfectée à l'aide d'une solution de povidone iodine (Vetedine® solution, Vetoquinol, France).
Des incisions paravertébrales d'environ 1 cm sont effectuées afin de dégager les muscles dorsaux paravertébraux droit et gauche. L'accès aux muscles est effectué par incision transfaciale. Chacun des implants est placé dans une poche de telle manière qu'aucune compression sur celles-ci ne puisse être exercée. Quatre implants sont implantés par rat (deux implants par site). L'ouverture des implants est ensuite suturée au moyen d'un fil polypropylene (Prolene 4/0, Ethicon, France). La peau est refermée au moyen d'une suture non-absorbable. Les rats sont ensuite replacés dans leurs cages respectives et gardés en observation durant leur rétablissement.
A 21 jours, les animaux sont anesthésiés par une injection de tiletamine-zolazepam (Z0LETIL®25-50 mg/kg, IM, VIRBAC, France).
Les animaux sont ensuite euthanasiés par injection d'une dose de pentobarbital (DOLETHAL®, VETOQUINOL, France). Un observation macroscopique de chaque site est ensuite réalisée, tout signe d'intolérance locale (inflammation, nécrose, hémorrhagie) et la présence de tissu osseux et/ou cartilagineux est enregistrée et cotée selon le barème suivant : 0 : absence, 1 : faible, 2 : modéré, 3 : marqué, 4 : important.
Chacun des implants est retiré de son site d'implantation et des photographies macroscopiques sont prises. La taille et le poids des implants sont ensuite déterminés. Chaque implant est ensuite conservé dans une solution de formol à 10% tamponnée.
Résultats :
Cette expérience in vivo permet de mesurer l'effet ostéoinducteur de la BMP-2 en plaçant l'implant dans un muscle du dos d'un rat. Ce site non osseux est dit ectopique.
Les observations macroscopiques des explants nous permettent d'évaluer la présence des tissus osseux et la masse des implants.
Figure imgf000018_0001
Une dose de 20 μg de BMP-2 dans une éponge à collagène (Implant 1 ) permet d'obtenir au bout de 21 jours des implants ossifiés avec un poids moyen de 37 mg.
Pour la même dose de BMP-2 associé à 20 μg de PDGF-BB, la masse des implants a presque doublé puisque les implants pèsent en moyenne 68 mg. Le PDGF-BB stimule donc bien l'activité ostéogénique de la BMP-2 et une activité synergique est observée.
Cette observation est encore plus marquée en présence d'une formulation à base de complexes de BMP-2 et de PDGF-BB et de chlorure de calcium. Un implant contenant 20 μg de BMP-2 associés à 1 mg de Polymère 1 conduit à des os d'une masse moyenne de 267 mg. Lorsque l'implant contient seulement 5 μg de BMP-2 et 10 μg de PDGF-BB associés à 1 mg de Polymère 1 , la masse des os expiantes est très supérieure, en moyenne de 401 mg.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Composition synergique ostéogénique comprenant au moins un facteur de croissance ostéogénique, et au moins un facteur de croissance, ayant un pouvoir chémo-attractant, et angiogénique.
2. Composition selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le facteur de croissance ostéogénique est choisi dans le groupe des BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) thérapeutiquement actives.
3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que les protéines ostéogéniques sont choisies dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5, seuls ou en combinaison.
4. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le facteur de croissance chémo- attractant et angiogénique est une protéine choisie dans le groupe constitué par le PDGF, le VEGF ou le FGF, seuls ou en combinaison.
5. Composition synergique ostéogénique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le facteur de croissance chémo-attractant et angiogénique est le PDGF.
6. Composition synergique selon la revendication 3 caractérisée en ce que le facteur de croissance chémo-attractant et angiogénique est le PDGF.
7. Composition synergique selon la revendication 6, comprenant au moins de la BMP-2 et du PDGF-BB.
8. Composition synergique selon la revendication 6, comprenant au moins de la BMP-7 et du PDGF-BB.
9. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un polysaccharide anionique choisi dans le groupe constitué par les polysaccharides anioniques fonctionnalisés par des dérivés hydrophobes choisis parmi les dérivés des dextrans fonctionnalisés portant des substituts hydrophobes tels que le tryptophane et les dérivés du tryptophane.
10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que le dextran fonctionnalisé répond à la formule générale suivante :
Dextran
AA
Formule I
• R étant une chaîne comprenant entre 1 et 1 8 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide
• F étant soit un ester, un thioester, un amide, un carbonate, un carbamate, un éther, un thioéther ou une aminé, • AA étant un reste amino-acide hydrophobe, L ou D, produit du couplage entre l'aminé de l'amino-acide et un acide porté par le groupement R, ledit amino-acide hydrophobe étant choisi parmi les dérivés du tryptophane, tels que le tryptophane, le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2-indole éthylamine et leurs sels de cation alcalin. i représente la fraction molaire de substituant F-R-[AA]n par unité glycosidique et est comprise entre 0, 1 et 2, n représente la fraction molaire des R substitués par AA et est comprise entre 0,05 et 1 . Lorsque R n'est pas substitué par AA, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na, K, ledit dextran étant amphiphile à pH neutre.
1 1 . Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comporte en outre un sel soluble de cation divalent choisi dans le groupe constitué par les cations du calcium ou du magnésium ou du zinc.
12. Composition selon la revendication 1 1 , caractérisée en ce que le sel soluble de cation divalent est un sel de calcium dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, l'oxalate, l'hydroxyde, le formate, le D-saccharate, le phosphate, le carbonate, l'acétate, le sulfate, le L-ascorbate, le L-tartrate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate.
13. Composition selon la revendication 1 2, caractérisée en ce que le sel soluble de cation divalent est du chlorure de calcium.
14. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce quelle comporte en outre une matrice choisie parmi les matrices à base de collagène naturel.
15. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comprend en outre des cations multivalents choisis dans le groupe constitué par les cations du fer, de l'aluminium, des polymères cationiques choisis parmi la polylysine, la spermine, la protamine et la fibrine seuls ou en combinaison.
16. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle est sous forme de lyophilisât.
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