KR20150058203A - 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드의 제조 방법 - Google Patents

알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드의 제조 방법 Download PDF

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한나 티아이넨
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코르티칼리스 에이에스
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Abstract

본 발명은 신체에서 상실된 기능을 대체하거나 및/또는 복원하기 위한 이식에 사용된 의료용 보철 장치에 관한 것이다. 본 발명은 알긴산염 코팅이 임의로 생물학적 활성 물질을 포함하는 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드를 제조하는 방법을 개시한다.

Description

알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드의 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING AN ALGINATE COATED TITANIUM DIOXIDE SCAFFOLD}
본 발명은 의료용 임플란트 및 그것의 신체에서의 생체적합성 및 기능을 개선사키기 위한 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 임의로 생물학적 활성 물질을 포함할 수 있는 알긴산염 코팅을 포함하는 이산화 티타늄 스캐폴드의 제조방법을 개시한다.
외상, 종양, 암, 치주염 및 골다공증과 같은 질환은 뼈 손실, 감소된 뼈 성장 및 부피를 유발할 수 있다. 이들 및 다른 이유로 뼈 성장을 개선시키고 뼈 해부학을 되찾기 위한 방법들을 찾는 것은 매우 중요하다.
골원성 세포로부터 삼차원 스캐폴드의 보조로 천연 뼈조직을 형성하는 것은 손실된 뼈를 복구하고 재생시키기 위한 자가이식편 및 동종이식편에 대한 대안을 제공한다. 잘 구성된 스캐폴드는 뼈-형성 세포의 이동, 증식 및 분화 및 내부성장 조직의 혈관신생을 지지하는, 새로운 뼈의 발달을 안내하는 다공성이고 상호연결이 잘 되어 있는 네트워크에 세포가 부착되고 고정되기에 적당한 표면을 제공한다. 비록 여러 중합체 및 바이오세라믹이 뼈 조직 공학에 사용되기 위해 개발되었지만, 그것들의 낮은 기계적 특성들로 인해 광범위한 용도에 사용하기에는 제한되어 왔다.
이산화 티타늄(TiO2)은 생체적합성 물질이고, 또한 생체 내에서 활성인 특성 및 특정 정도의 제균(bacteriostatic) 효과를 가지는 것으로 보고되었다. 그러므로, 세라믹 TiO2는 뼈 조직 공학 목적에 대한 물질로서 연구되었다. 다공성의 90%의 값을 달성하는 높은 기계 강도와 1.63 내지 2.67 MPa의 압축 강도를 가지는 매우 다공성이고 상호연결이 잘 되어 있는 TiO2 스캐폴드가 최근에 개발되었고(Tiainen et al. 2010), 그것의 생체적합성 및 골전도 특성은 시험관 내에서 및 생체 내에서 증명되었다.
상이한 종류의 생물학적 활성인 분자를 사용하여 임플란트 구조를 코팅함으로써 스캐폴드 생체적합성을 개선시키고, 골유착성을 개선시키며, 감염 및 염증을 억제하기 위한 시도들이 이루어져 왔다. 그러나, 이식 후에 임플란트 상에서 그것의 의도된 기능을 수행할 수 있게 하기 위해서는, 생물학적 활성 분자들은 그것들의 방출이 허용되고, 그것들의 생물학적 활성에 유해한 영향을 미치지 않으며, 네거티브한 신체 반응을 유발하지 않는 방식으로 임플란트상에 코팅될 필요가 있었다.
하이드로겔은 조직 공학에서 상이한 용도에 대해, 예를 들면 공간 충전제로서, 생체 내 활성 분자에 대한 전달 비히클로서 및 세포를 조직화하고 원하는 조직의 형성을 지시하기 위해 자극을 제공하는 삼차원 구조로서 사용되어 왔다. 세포 및/또는 성장 인자 캡슐화 및 약물 안정성 및 전달을 포함하여 광범위한 의료 용도에 사용되어 온, 조직 공학을 위한 하이드로겔을 형성하기 위해 선택된 중합체의 한 실례가 알긴산염이다. 알긴산염은 β-D-만누론산(M)과 α-L-글루쿠론산(G) 단량체의 친수성 및 선형 다당 공중합체이다. 알긴산염 겔은 이가 양이온, 예컨대 Ca2 +, Ba2 + 또는 Sr2 +가 G 단량체의 블록과 협조적으로 상호작용하여 상이한 중합체 사슬들 사이에 이온성 가교를 생성할 때 형성된다. 생체물질에 대한 우호적인 특성, 예컨대 비독성, 생체 내 분해성 및 정상적인 생리적 조건 하에서 원하는 형상으로의 처리의 용이성 때문에 알긴산염은 피부, 연골, 뼈, 간 및 심장 조직의 재생을 포함하여 조직 공학 분야에서 집중적으로 연구되어 왔다.
그러나, 여전히 의료용 임플란트 및 조직 공학 분야에는 생체부합하고 및/또는 신체에 임플란트의 통합을 개선시키는, 예컨대 지지 구조를 제공하는 임플란트 구조에 대한 요구가 존재한다.
본 발명의 한 가지 목적은 생체부합하고 및/또는 개선된 통합 특성을 가지는 지지용 구조, 예컨대 의료용 임플란트로서 적당한 이산화티타늄 스캐폴드를 제공하는 것이다.
이 목적은 한 측면이 알긴산염 코팅을 포함하는 이산화티타늄 스캐폴드의 제조 방법에 관련된 본 발명에 의해 얻어지고, 상기 방법은 다음의 단계들:
a) 이산화티타늄 스캐폴드를 제공하는 단계,
b) 상기 이산화티타늄 스캐폴드의 적어도 일부에 약 1 내지 3 %w/v의 적어도 하나의 알긴산염을 포함하는 알긴산염 용액을 제공한 후 이산화티타튬 스캐폴드를 원심분리하는 단계,
c) 단계 b)에서 얻어진 이산화티타늄 스캐폴드에 Ca2 +, Mg2 +, Ba2 + 또는 Sr2 +로 이루어진 군으로부터 선택된 2가 양이온 염 용액을 제공한 후 임의로 그 이산화티타늄 스캐폴드를 세정하는 단계, 및
d) 이산화티타늄 스캐폴드를 건조시키는 단계를 포함하고,
상기 단계 b)와 c)는 임의로 적어도 1회 반복된다.
단계 b)가 단계 c) 전에 수행될 때, 단계 b)의 원심분리 및/또는 단계 b) 및 c)의 저밀도의 알긴산염 및/또는 2가 양이온 용액은 각각 스캐폴드의 외면 상에만이 아니라 스캐폴드 내부의 기공의 벽 위에도 존재하는 이산화티타늄 스캐폴드 상의 알긴산염 용액의 얇은 층의 형성을 허용한다. 2가 양이온 염 용액이 단계 c)에서 첨가될 때, 알긴산염의 겔화가 이루어지며, 그로써 알긴산염 겔 층이 형성된다. 방법의 단계 b)와 c)를 반복함으로써 둘 또는 그것보다 많은 알긴산염 겔 층으로 이루어진 알긴산염 코팅이 구성될 수 있다. 본 발명의 방법은 하나 또는 그것보다 많은 알긴산염 겔 층에 의해 구성되는 알긴산염의 얇은 코팅의 형성을 허용하기 때문에, 티타늄 스캐폴드 기공은 알긴산염 코팅에 의해 차단되지 않지만, 쉽게 세포 및 조직에 접근할 수 있어서 스캐폴드 구조 안으로 성장할 수 있다. 본 발명의 방법이 이산화티타늄 스캐폴드 위에 알긴산염 코팅을 제조하기 위해 사용될 때의 또 다른 효과는, 알긴산염 코팅이 적어도 일부의 기공의 내부에 형성되기 때문에 알긴산염 코팅이 단지 스캐폴드의 다른 표면상에서 형성되는 경우와 비교하여 매우 큰 표면-대-부피 비율이 발생할 것이라는 것이다. 이것은 알긴산염 코팅에 포함된 어떠한 물질, 예컨대 생물학적 활성 물질의 방출 프로필에 영향을 미칠 것이다. 또한 알긴산염 코팅이 이산화티타늄 스캐폴드의 외면으로부터 사라지게 되더라도 알긴산염 코팅은 여전히 스캐폴드 내부의 기공 표면에 존재할 것이다.
본 발명은 또한 알긴산염 코팅을 포함하는 이산화티타늄 스캐폴드를 제조하기 위한 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 이산화티타늄 스캐폴드에도 관련된다.
추가로 본 발명에는 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 알긴산염 코팅을 가지는 이산화티타늄 스캐폴드를 포함하는 의료용 임플란트가 개시된다. 또한 본 발명에는 의료용 임플란트로서 사용하기 위한 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드가 개시된다.
본 발명은 또한 조직, 예컨대 뼈의 재생, 복구, 치환 및/또는 복원을 위한 및/또는 조직, 예컨대 뼈의 재생, 복구, 치환 및/또는 복원을 위해 사용하기 위한 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드 또는 그것을 포함하는 의료용 임플란트에 관련된다.
추가로 본 발명에는 조직 및/또는 뼈의 재생, 복구, 치환 및/또는 복원을 위한 의료용 임플란타의 제조를 위해 사용되는 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드 또는 그것을 포함하는 의료용 임플란트의 용도가 개시된다.
또한 본 발명에는 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드 또는 그것을 포함하는 의료용 임플란트를 필요로 하는 대상에게 그것을 이식하는 것을 포함하는 조직의 재생, 복구, 치환 및/또는 복원을 위한 방법이 개시된다.
본 발명의 다른 특징 및 장점들은 다음의 상세한 설명, 도면, 실시예 및 청구범위로부터 드러날 것이다.
정의
본 명세서에서 "스캐폴드"는 개방된 다공성 구조를 말한다. 본 명세서에서 스캐폴드는 "SC"로 약칭될 수 있다. "이산화티타늄 스캐폴드"는 스캐폴드 구조의 구성 재료로서 독점적으로 이산화티타늄을 포함하는 스캐폴드, 즉 이산화티타늄이 스캐폴드 구조를 형성하는 데 기여하는 주된 물질인 것을 의미한다. 그러므로 이산화티타늄 스캐폴드는 50wt%보다 많은, 예컨대 약 51wt%, 60wt%, 70wt%, 80wt%, 90wt%, 95wt%, 96wt%, 97wt%, 98wt%, 99wt% 또는 100wt%의 이산화티타늄, 예를 들면 약 51 내지 100wt%, 60 내지 100wt%, 60 내지 90wt%, 70 내지 100wt%, 70 내지 90wt%, 80 내지 90wt% 또는 80 내지 95wt%의 이산화티타늄을 가진다. 그로써 이산화티타늄 스캐폴드는 스캐폴드에 대한 구성 재료로서 이산화티타늄을 포함하거나 그것으로 이루어질 수 있다.
"기공 직경"은 본 발명의 명세서에서 그것을 둘러써는 벽이 없이 기공의 수력학적 직경을 나타내는 것으로 의도된다. 수력학적 직경은 해당 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고, 기공의 원주 길이로 나누어지는 원주의 4*면적으로서 정의된다.
"프랙탈 차원 지주(strut)"는 아주 세밀한 축척으로 줌 다운하였을 때, 프랙탈이 얼마나 완전하게 공간을 채우는 것으로 나타나는가에 대한 표지를 제공하는 통계학적 양이다. 프랙탈 차원의 구체적인 정의는 많이 있지만, 그 중 어느 것도 보편적인 것으로 처리되어서는 안된다. 1의 값은 직선과 관계가 있다. 숫자가 더 높을수록 더 많은 복합체가 표면 구조이다. 프랙탈 차원은 본 발명에서는 Kolmogorov 또는 "박스 계수(box counting)" 방법을 사용하여 계산된다(Liebovitch et al. 1989). 그것은 Skyscan CTAn(Kontich, Belgium)에서는 2d와 3d로 둘 다 계산된다. 표면 또는 부피는 동일한 정사각형 또는 정육면체의 배열로 나누어지며, 물체 표면의 일부를 함유하는 정사각형의 수가 계수된다. 이것은 예컨대 3 내지 100 픽셀과 같은 광범위한 박스 크기에 걸쳐 반복된다. 표면을 함유하는 박스의 수는 박스 길이에 대하여 로그-로그 도표로 도표화되며, 프랙탈 차원은 로그-로그 회귀의 기울기로부터 얻어진다.
"총 다공성"은 본 명세서에서 재료가 아닌 몸체의 모든 구획, 즉 어떠한 재료에 의해서도 차지되지 않은 공간으로서 정의된다. 총 다공성은 폐쇄된 기공과 개방된 기공을 둘 다 포함한다.
"내부 지주 부피"는 지주의 내강의 부피를 의미한다.
"소결", "소결하다" 등은 재료를 (그것의 융점 아래로) 그것의 입자가 서로 접착할 때까지 가열함으로써 분말로부터 물체를 제조하는 방법을 의미한다. 소결은 세라믹 물체를 제조하기 위해 관례적으로 사용되며, 또한 분말 야금과 같은 분야에서도 사용되었다.
"의료용 보철 장치", "의료용 임플란트", "임플란트" 등은 본 발명에서 척추 동물, 예컨대 포유류, 예를 들면 인간 포유류의 신체에 이식되도록 고안된 장치와 관련된다. 본 발명에서 임플란트는 신체의 해부학을 대체하고 및/또는 어떠한 기능을 복원하기 위해 사용될 수 있다. 그런 장치의 실례로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 치과 임플란트와 정형외과 임플란트를 포함한다. 본 발명에서, 정형외과 임플란트는 그것의 범주 내에 척추 동물, 특히 인간과 같은 포유류의 신체 안에 근골격계, 특히 관절과 뼈의 기능의 보존 및 복원, 이를테면 이들 구조의 통증의 경감을 위해 이식되도록 고안된 모든 장치를 포함한다. 본 발명에서 치과 임플란트는 척추 동물, 특히 인간과 같은 포유동물의 구강 안에 치아 복원 과정으로 이식되도록 고안된 모든 장치를 포함한다. 일반적으로 치과 임플란트는 하나 또는 여러 개의 임플란트 부분으로 구성된다. 예를 들어 치과 임플란트는 보통 이차 임플란트 부분, 예컨대 지대치에 결합된 치과 픽스춰 및/또는 치관, 브릿지 또는 의치와 같은 치과 복원물을 포함한다. 그러나 이식용으로 의도된 어떠한 장치, 예컨대 치과 픽스춰는 다른 부분들이 그것에 연결되어 있다면 단독으로도 임플란트로 언급될 수 있다. 정형외과 및 치과 임플란트는 또한 상기로부터 명백한 것과 같이 정형외과 및 치과 보철 장치로도 표시될 수 있다.
본 발명에서, "대상"은 어떠한 척추동물, 예컨대 조류, 파충류, 포유류, 영장류 및 인간을 나타낸다.
"세라믹"은 본 발명에서는 고체화된 표면을 형성하기 위하여 열로 처리된 무기 분말 재료의 물체를 의미한다.
"생물학적 활성 물질"은 생물학적 과정에 영향을 미칠 수 있는, 즉 생물학적 활성을 가지는 물질을 의미한다. 생물학적 활성 물질은 작은 분자, 예컨대 무기 이온 또는 더 큰 분자, 예컨대 단백질, 및 심지어 복합한 구조, 예컨대 세포일 수 있다. 본 발명의 맥락에 사용하기에 적당한 생물학적 활성 물질의 실례는 아래에서 개시된다. 생물학적 활성 물질은 또한 본 발명에서 "생체분자"로서 표시될 수 있다.
"연조직"은 본 명세서의 맥락상 신체의 구조 및 기관을 연결하거나, 지지하거나 또는 둘러싸는, 뼈가 아닌 조직을 의미한다. 연조직은 인대, 힘줄, 근막, 피부, 섬유상 조직, 지방, 활막, 상피, 근육, 신경 및 혈관을 포함한다.
"경조직"은 본 명세서의 맥락상 광화(mineralized) 조직, 예컨대 뼈 및 치아, 및 연골을 포함한다. 광화 조직은 미네랄을 소프트 매트릭스에 통합시키는 생물학적 조직이다.
도 1은 2% 알긴산염(A 및 B) 및 300mM의 CaCl2에 의해 겔화된 합성 펩티드를 함유하는 2% 알긴산염(C 및 D)의 미세구조를 도시한다. ×25 배율(A 및 C) 및 ×100배율(B 및 D)에서 SEM에 의한 관찰. 이 겔은 이산화티타늄 스캐폴드 상에서는 존재하지 않으며 본원에 개시된 알긴산염 코팅을 포함하는 이산화티타늄 스캐폴드를 제조하기 위한 방법에 의해 제조되지 않는다. 그러므로 이 겔은 다공성 구조를 채택한다.
도 2는 37℃에서 21일 동안 인큐베이션한 후 FITC로 표지된 펩티드의 2의 방출 프로필을 도시한다. 막대 그래프는 각 시간점 후에 방출된 펩티드의 양을 나타낸다. 선 그래프는 21일까지 방출된 펩티드의 누적된 양을 나타낸다. 값은 평균±SEM을 나타낸다.
도 3a의 상부는 1 및 5일 동안 배양한 후 상이한 양의 세포(30×103, 60×103, 100×103 및 200×103 세포/웰)를 시딩할 때 접착 세포의 수를 도시한다. 값은 평균±SEM을 나타낸다. 도 3a의 하부는 ×200 배율에서 SEM에 의해 얻어진 100×103 세포/웰을 시딩할 때 2% 알긴산염 하이드로겔 상에 접착된 골아세포의 대표적인 사진을 나타낸다. 도 3b는 2% 알긴산염 코팅 상에 부착된 골아세포를 나타낸다. 1일(A, C, E, G) 및 5일(B, D, F, H) 동안 배양한 후 30×103(A 및 B), 60×103(C 및 D), 100×103(E 및 F) 및 200×103(G 및 H) 세포/웰을 시딩할 때 공초점 현미경에 의해 얻어진 접착 세포의 대표적인 사진이 도시된다. 세포 핵은 백색으로 표시되고(DAPI 염색)(좌측 칼럼) 액틴 필라멘트는 백색으로 표시된다(팔로이딘-FITC)(우측 칼럼). 막대 축척은 150㎛를 나타낸다.
도 4는 펩티드가 없는 알긴산염 겔(-) 또는 50㎍/ml의 Emdogain(EMD) 또는 합성 펩티드(P2, P5 및 P6) 중 어느 하나를 함유하는 알긴산염 겔 상에 MC3T3-E1 세포를 시딩하고 24시간 후에 수집된 배양 배지로부터 측정된 LDH 활성을 도시한다. 높은 대조표준(100%)은 조직 배양 플라스틱 상에 시딩되고 1% 트리톤 X-100과 함께 인큐베이트된 세포 배양 배지로부터였다. 낮은 대조표준(0%)은 조직 배양 플라스틱 상에 시딩되고 0.1%의 아세트산-PBS와 함께 인큐베이션된 세포 배양 배지로부터였다. LDH 활성의 백분율은 다음 식을 사용하여 계산되었다: 세포독성(%) = (exp.값 - 낮은 대조표준)/(높은 대조표준 - 낮은 대조표준)'100. 값은 평균±SEM을 나타낸다. 그룹간 차이는 Mann-Withney 시험 *p< 0.05 대 대조표준 알긴산염 겔(-), #p< 0.05 대 EMD를 함유하는 알긴산염 겔에 의해 평가되었다.
도 5a 내지 5d는 펩티드 없는(-, 대조표준 그룹), 합성 펩티드 또는 EMD(50㎍/ml)을 함유하고 있는 2%의 알긴산염 겔 위의 MC3T3-E1 세포를 14일 및 21일 동안 배양한 후 세포 부착 관련된 유전자의 발현을 도시한다. 데이터는 100%로 설정된, 배양 후 14일째의 대조표준 알긴산염 겔의 백분율로서 나타낸, 참조 유전자로 표준화된 표적 유전자의 상대적인 mRNA 수준을 나타낸다. 값은 평균±SEM을 나타낸다. 그룹간 차이는 학생 t-시험; (*)p≤ 0.05 대 대조표준 알긴산염 하이드로겔(-), (#)p≤ 0.05 대 EMD에 의해 평가되었다.
도 6a 내지 6f는 펩티드 없는(-, 대조표준 그룹), 합성 펩티드 또는 EMD(50㎍/ml)을 함유하고 있는 2%의 알긴산염 하이드로겔 위의 MC3T3-E1 세포를 14일 및 21일 동안 배양한 후 골아세포 분화 관련된 유전자의 발현을 도시한다. 데이터는 100%로 설정된, 배양 후 14일째의 대조표준 알긴산염 하이드로겔의 백분율로서 나타낸, 참조 유전자로 표준화된 표적 유전자의 상대적인 mRNA 수준을 나타낸다. 값은 평균±SEM을 나타낸다. 그룹간 차이는 학생 t-시험; (*)p≤ 0.05 대 대조표준 알긴산염 하이드로겔(-), (#)p≤ 0.05 대 EMD에 의해 평가되었다.
도 7은 21일 동안 37℃에서 인큐베이션된 후의 P2-알긴산염-코팅된 스캐폴드로부터의 펩티드 2(SEQ ID NO:1)의 방출 프로필을 도시한다. 막대 그래프는 각 시간점 후에 방출된 펩티드의 양을 나타낸다. 선 그래프는 21일까지 방출된 펩티드의 누적 양을 나타낸다. 값은 평균±SD를 나타낸다.
도 8은 48일 동안 배양한 후에 수집된 배양 배지로부터 측정된 LDH 활성을 도시한다. 값은 평균±SEM을 나타낸다. Mann-Whitney 시험(p≤ 0.05): (a) 대 정규 스캐폴드(SC) 및 (b) 대 대조표준 알긴산염 하이드로겔 코팅된 스캐폴드(-).
도 9는 10kV 및 40Pa에서의 2% 알긴산염-코팅된 TiO2 스캐폴드(대조표준 알긴산염 스캐폴드)의 SEM 가시화를 도시한다. 도 A 및 B는 2% 알긴산염 겔의 한 개 층을 사용한 코팅 과정 직후의 50×(A) 및 300×(B) 배율에서의 TiO2 스캐폴드의 미세구조를 보여준다. 도 C 및 D는 7일 동안 배양한 후의 50×(C) 및 300×(D) 배율에서의 대조 알긴산염 스캐폴드 상에서 배양된 세포를 보여준다.
도 10은 7일(A, C 및 E) 및 21일(B, D 및 F) 동안 배양한 후의 정규 스캐폴드(A 및 B), 대조 알긴산염 스캐폴드(C 및 D) 및 P2-알긴산염-코팅된 스캐폴드(E 및 F) 상에서 성장하는 MC3T3-E1 세포의 SEM 가시화를 도시한다. 스캐폴드는 10kV, 40Pa 및 50×배율에서 SEM에 의해 관찰되었다.
도 11은 7일 동안 배양한 후의 스캐폴드 상에서 성장하는 세포의 수를 도시한다. DNA 함량은 Hoechst 형광 염색에 의해 분석되었고 선형 표준 곡선으로 상관시켰다. 값은 평균±SEM을 나타낸다. Mann-Whitney 시험: (a) p≤ 0.05 대 정규 스캐폴드(SC) 및 (b) 대 대조 알긴산염 스캐폴드(-).
도 12a 내지 12d는 TiO2 스캐폴드 상에서 7일(□) 및 21일(■) 동안 배양된 MC3T3-E1 세포의 Itgb1(A), Itgb3(B), Fn1(C) 및 Itga8(D)의 상대적인 mRNA 발현 수준을 도시한다. 정규 스캐폴드(SC)가 참조 그룹으로서 사용되었다. 데이터는 100%로 설정된, 7일째에 정규 스캐폴드(SC)상에서 배양된 세포의 백분율로서 나타낸, 참조 유전자(Gapdh 및 18S)로 표준화된 표적 유전자의 배수 변화를 나타낸다. 값은 평균±SEM을 나타낸다. 학생 시험: (a) p≤ 0.05 대 정규 스캐폴드(SC) 및 (b) 대 대조 알긴산염 스캐폴드(-).
도 13a 내지 13h는 TiO2 스캐폴드상에서 7일(□) 및 21일(■) 동안 배양된 MC3T3-E1 세포의 A) 오스테릭스(Osx), B) 뼈 형성 단백질 2(Bmp2), C) 콜라겐-1(Coll-I), D) 인터류킨 6(II -6), E) 오스테오폰틴(Opn), F) 뼈 시알로단백질(Bsp), G) 알칼리성 포스파타제(Alp) 및 H) 오스테오칼신(Oc)의 상대적인 mRNA 발현 수준을 도시한다. 정규 스캐폴드(SC)를 참조 그룹으로서 사용하였다. 데이터는 100%로 설정된, 7일째에 정규 스캐폴드(SC) 상에서 성장된 세포의 백분율로서 나타낸, 참조 유전자(Gapdh 및 18S)로 표준화된 표적 유전자의 배수 변화를 나타낸다. 값은 평균±SEM을 나타낸다. 학생 t-시험: (a) p≤ 0.05 대 정규 스캐폴드(SC) 및 (b) 대 대조 알긴산염 스캐폴드(-).
도 14는 알긴산염-코팅된 TiO2 스캐폴드의 주사 전자 현미경 특성확인을 도시한다. 250×(A) 및 1500×(B, C) 배율에서의 TiO2 스캐폴드의 지주 표면을 코팅하는 알긴산염 층의 주사 전자 현미경 가시화(화살표).
도 15는 알긴산염-코팅된 및 미코팅된 TiO2 스캐폴드의 과요오드산-쉬프 가시화를 도시한다. 알긴산염-코팅된(A, B) 및 미코팅된(C, D) TiO2 스캐폴드의 과요오드산-쉬프 염색. 알긴산염(적색)은 상부(A)로부터 및 중간(B)의 도면에서 알 수 있는 것과 같이 스캐폴드 전체를 통해 분포된다.
도 16은 심바스타틴 방출을 도시한다. 37℃에서 19일 동안 인큐베이션한 후의 2.4mM 및 0.6mM의 SIM을 함유하는 알긴산염-코팅된 TiO2 스캐폴드로부터의 SIM의 방출 프로필. 막대 그래프는 각 시간점 후에 방출된 SIM의 양을 나타낸다. 선 그래프는 19일까지 방출된 SIM의 누적된 양을 나타낸다. 값은 평균±SEM을 나타낸다.
도 17a 내지 17c는 락테이트 데하이드로게나제 활성 분석 결과를 도시한다. 10nM 및 10μM SIM을 포함한 스캐폴드로부터의 배양 배지 중의 LDH 활성은 14일까지 매 격일로 측정된 공여체 1(A), 공여체 2(B) 및 공여체 3(C)에 대해 SIM이 없는 스캐폴드와 비교하여 도시된다. 어떠한 SIM의 농도라도 SIM이 없는 알긴산염-코팅된 스캐폴드의 효과와 비교하여 LDH 활성의 상당한 증가를 유발하지 못하였다. 값은 평균±SD를 나타낸다.
도 18a 내지 18c는 알칼리성 포스파타제 활성 분석 결과를 도시한다. 10nM 및 10μM SIM을 포함한 스캐폴드로부터의 배양 배지 중의ALP 활성(y 축)은 2, 8, 14 및 21일째에 대조표준, SIM이 없는 스캐폴드, 공여체 1에 대한(A), 공여체 2에 대한(B) 및 공여체 3에 대한(C) 백분율로 나타낸다. ALP 활성은 SIM이 없는 스캐폴드와 비교할 때 10nM 또는 10μM SIM을 가지는 스캐폴드에 대해 측정된 어떠한 시간점에서든지 배양 배지의 변화를 유의미하게 유발하지 못하였다. 값은 평균±SD를 나타낸다.
도 19a 내지 19c는 면역분석 결과: 분비된 단백질의 정량을 도시한다. 10nM 및 10μM SIM을 포함하는 스캐폴드로부터의 세포 배양 배지로의 TNFRSF11 B, VEGFA 및 BGLAP의 분비는 2, 8, 14 및 21일째에, SIM이 없는 대조 스캐폴드의 백분율로 도시된다. 값은 평균±SD를 나타낸다.
도 20은 실시간 RT-PCR 분석을 도시한다. BGLAP에 대한 상대적인 mRNA 발현 수준은 SIM이 없는 스캐폴드에 비교하여 10nM 및 10μM SIM을 포함하는 스캐폴드상에서 배양된 세포에서 보여지고 7, 14 및 21일째에 참조 유전자 GAPDH에 표준화된다. 값은 평균±SD를 나타낸다.
도 21a 내지 12c는 심바스타틴이 있거나 없는 알긴산염-코팅된 TiO2에서의 유형 I 콜라겐 침착의 공초점 레이저 주사 현미경 가시화를 도시한다. 알긴산염-코팅된 TiO2 스캐폴드 상에서 배양된 일차 인간 골아세포의 유형 I 콜라겐의 형광 면역세포화학적 분석. 유형 I 콜라겐은 10nM SIM(A), 10μM SIM(B)을 포함하거나 SIM 이 없는(C) 스캐폴드에서 배양된 세포의 대부분에서 검출된다. 세포외재성 콜라겐 소섬유는 단지 SIM이 없는 스캐폴드에서만 나타난다(C). 유형 I 콜라겐, DNA, TiO2 스캐폴드 표면.
도 22는 알긴산염-코팅된 및 미코팅된 스캐폴드의 과요오드산-쉬프/Pan-카데린 가시화를 도시한다. 알긴산염-코팅된(B) 및 미코팅된(A) 스캐폴드의 과요오드산-쉬프 염색. 알긴산염(적색)은 단면도(B)로부터 알 수 있는 것과 같이 스캐폴드 전체에 분포된다. 2일째의 세포-시딩된 알긴산염-코팅된(D) 및 미코팅된(C) 스캐폴드의 과요오드산-쉬프/Pan-카데린 이중 염색. 알긴산염 층 함유 세포가 스캐폴드를 덮고 있다(D)
도 23은 세포-시딩된 알긴산염-코팅된 스캐폴드의 아크리딘-오렌지/에티듐 브로마이드 가시화를 도시한다. 인간 함지방-유도 간엽 줄기 세포가 시딩된 알긴산염-코팅된 스캐폴드의 2일째의 아크리딘-오렌지/에티듐 브로마이드 염색. 대두분의 세포가 알긴산염 코팅 과정에서 생존하였다. 살아있는 세포 염색은 녹색이고, 죽은 세포는 적색으로 염색된다.
도 24a 내지 24d는 락테이트 데하이드로게나제 활성 및 총 단백질 함량 분석을 도시한다. 엠도게인(알긴산염)을 가지거나(EMD 알긴산염) 또는 없는 세포-시딩된 알긴산염-코팅된 스캐폴드로부터의 배양 배지 중의 락테이트 데하이드로게나제 활성 및 총 단백질 함량은 14일까지 매 격일째에 측정된 인간 함지방-유도 간엽 줄기세포(hAD-MSC)(A, C) 및 일차 인간 골아세포(hOST)(B, D)에 대해 대조표준, 세포-시딩된 미코팅된 스캐폴드의 백분율로서 도시된다. 값은 평균+SD를 나타낸다. 통계학적 분석: (a) p≤ 0.05 대 엠도게인이 없는 알긴산염-코팅된 스캐폴드 및 (b) p≤ 0.05 대 세포-시딩된 미코팅된 스캐폴드.
도 25는 RUNX2 및 SOX9의 공초점 레이저 주사 현미경 가시화를 도시한다. 엠도게인을 포함한 알긴산염-코팅된 스캐폴드(A) 및 미코팅된 스캐폴드(B) 상에서 배양된 인간 함지방-유도된 간엽 줄기세포 중의 RUNX2 및 SOX9의 형광 면역세포화학 분석. RUNX2는 엠도게인을 포함한 스캐폴드상에서 배양된 세포의 대부분에서 검출된다(A). 그러나 RUNX2 및 SOX9는 미코팅된 스캐폴드(B)상에서 배양된 세포에서 동등하게 검출된다. RUNX2(녹색), SOX9(적색), Ti02 스캐폴드 표면(백색).
도 26은 개방된 다공성 구조를 보여주는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 알긴산염 층으로 코팅된 TiO2 스캐폴드의 단면을 도시한다. 단면의 직경은 3mm이다.
본 발명은 한 측면으로 알긴산염 코팅을 포함하는 이산화티타늄 스캐폴드의 제조 방법에 관련된다. 그러므로 첫 번째 측면으로, 본 발명은 알긴산염 코팅을 포함하는 이산화티타늄 스캐폴드를 제조하는 방법에 관련되고, 그 방법은 다음 단계들:
a) 이산화티타늄 스캐폴드를 제공하는 단계,
b) 상기 이산화티타늄 스캐폴드의 적어도 일부에 약 1 내지 3 %w/v의 적어도 하나의 알긴산염을 포함하는 알긴산염 용액을 제공한 후 이산화티타튬 스캐폴드를 원심분리하는 단계,
c) 단계 b)에서 얻어진 이산화티타늄 스캐폴드에 Ca2 +, Mg2 +, Ba2 + 또는 Sr2 +로 이루어진 군으로부터 선택된 2가 양이온 염 용액을 제공한 후 임의로 그 이산화티타늄 스캐폴드를 세정하는 단계, 및
d) 이산화티타늄 스캐폴드를 건조시키는 단계를 포함하고,
상기 단계 b)와 c)는 임의로 적어도 1회 반복된다.
방법은 또한 상기 단계 a) 내지 d)로 이루어질 수 있고, 이때 단계 b)와 c)는 임의로 적어도 1회 반복된다. 단계 b)와 c)가 반복될 때, 둘 또는 그것보다 많은 알긴산염 겔 층을 포함하는 알긴산염 코팅이 구성된다. 그러므로 알긴산염 코팅은 하나 또는 그것보다 많은 알긴산염 겔 층을 포함하거나 그것으로 이루어질 수 있다. 알긴산염 및/또는 2가 양이온 염 용액(들)은 추가로 본 발명의 다른 곳에서 개시된 것과 같은 하나 또는 그것보다 많은 생물학적 활성 물질을 포함할 수 있다. 단계 c)에서, 이산화티타늄 스캐폴드는 임의로 2가 양이온 염 용액이 스캐폴드에 제공된 후에, 그러나 바람직하게는 임의의 세정 전에 원심분리될 수 있다.
상기 방법은 또한 알긴산염 코팅을 가지는 이산화티타늄 스캐폴드의 적어도 일부를 코팅하기 위한 방법을 나타낼 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 알긴산염 코팅은 또한 알긴산염의 코팅을 나타낼 수 있다. 알긴산염 코팅에서 알긴산염은 젖었을 때 겔-유사 상태를 취하는 것이 인지되어야 한다. 그러나 또한 알긴산염 코팅이 이런 겔-유사 상태를 취하기 위해서는 일정한 양의 습기가 요구된다는 것이 인지되어야 한다. 그러므로, 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드가 건조되고, 건조한 장소 등에 보관될 때, 알긴산염 코팅은 오히려 얇고, 탈수된 필름층("제로겔"로도 언급된다)의 형태로 존재할 것이다. 그러나, 일단 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드가 촉촉한 환경에 처해지면, 예컨대 신체에 이식되거나 수용액에 침지될 때에, 알긴산염 코팅은 겔-유사 외관을 다시 취할 것이다. 맥락으로부터 분명하게 표시되지 않는 한, 알긴산염 코팅이 본 발명에서 언급될 때 이것은 알긴산염 코팅의 촉촉하고 건조한 형태 둘 다를 포함하는 것으로 인지되어야 한다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 이산화티타늄 스캐폴드는 "알긴산염 코팅을 포함하는 이산화티타늄 스캐폴드", "알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드" 등으로 표시될 수 있다.
이산화티타늄 스캐폴드는 적어도 부분적으로 알긴산염 코팅에 의해 덮일 외면을 가진다. 또는 다르게는, 이산화티타늄 스캐폴드의 전체 외면은 알긴산염 코팅에 의해 덮일 것이다. 그러나, 이산화티타늄 스캐폴드가 다공성 구조를 택하기 때문에 본 발명의 방법에 의해 알긴산염 용액 및 2가 양이온 용액은 또한 스캐폴드의 기공을 관통하는 것이 허용되고, 계속해서 알긴산염 코팅은 또한 스캐폴드 내부의 기공의 적어도 일부의 표면 위에 형성될 것이다. 스캐폴드 기공 안으로 얼마나 깊이 알긴산염 코팅이 형성될 것인가 하는 것은 물론 스캐폴드 다공성(더 큰 다공성은 알긴산염의 침투를 용이하게 할 것이고 스캐폴드 내부로 더 깊이 코팅이 형성되는 것을 허용할 것이다), 알긴산염 및/또는 2가 양이온 용액의 농도, 원심분리 속도 등과 같은 요인들에 좌우될 것이다. 그러나, 본 발명의 방법은 이산화티타늄 스캐폴드의 적어도 외부 기공의 표면(벽)의 적어도 일부가 알긴산염 코팅으로 코팅되는 것을 허용한다. 전형적으로, 알긴산염 코팅은 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드가 주사 전자 현미경검사(SEM)에 의해 분석될 때 스캐폴드 구조 전체를 통해 존재한다(즉 스캐폴드의 대부분 또는 전부의 벽을 라이닝한다). 그러므로 본 발명의 방법에 의해, 알긴산염 코팅은 이산화티타늄 스캐폴드의 외면 위에 형성될 뿐 아니라, 스캐폴드 내부의 기공의 표면 위에 다양한 정도로 형성될 것이다. 전형적으로, 그 위에 알긴산염 코팅이 제공되는 대부분의 기공 표면은 알긴산염 코팅으로 코팅될 것이다.
물론 이산화티타늄 스캐폴드의 전체 또는 단지 일부에, 예를 들면 스캐폴드의 내부 및 외부 표면의 10 내지 100%, 20 내지 98%, 30 내지 98%, 40 내지 98%, 50 내지 98%, 60 내지 98%, 70 내지 98%, 80 내지 98% 또는 90 내지 98%에 알긴산염 및/또는 2가 양이온 용액이 제공될 수 있다. 모든 내부 및 외부 스캐폴드 표면(즉 외면과 내부 기공의 벽 둘 다)에 알긴산염 코팅이 제공되는 경우에도, 알긴산염 층이 제조되는 동안 각각 및 모든 부분의 기공의 벽에 알긴산염 및 2가 양이온 용액이 도달하지 못할 수 있기 때문에, 표면의 미미한 부분은 코팅되지 않은 채로 유지될 수 있다. 그러나, 원심분리의 사용으로 얇은 알긴산염 코팅의 형성이 가능해지고 알긴산염과 2가 양이온 용액이 스캐폴드의 내부 부분으로 밀려들어가며, 그로써 또한 기공의 내부 부분상에 알긴산염 코팅이 형성되는 것이 가능해진다. 중요한 것은 알긴산염 코팅이 형성되기 위해서, 그 위에 그런 알긴산염 코팅 형성이 바람직한 스캐폴드의 부분에 알긴산염과 2가 양이온 용액이 둘 다 적용되어야 하는데, 알긴산염의 겔화는 그렇지 않을 경우 일어나지 않을 것이기 때문이다.
본 발명의 방법에 의하여 단계 b)에서 원심분리는 알긴산염 용액의 매우 얇은 층이 이산화티타늄 스캐폴드의 외면 및 또한 기공 내부에 침착되는 것을 허용하기 때문에 이산화티타늄 스캐폴드 상에 얇은 알긴산염 코팅이 형성되는 것이 가능하다. 또한 이론에 구속되는 것을 바라지는 않지만, 얇은 알긴산염 코팅은 사용된 알긴산염 및 2가 양이온 용액의 저밀도의 결과일 수 있고, 그것은 스캐폴드의 기공 안으로의 침투를 허용한다. 본 발명의 방법은 알긴산염 코팅의 각각의 알긴산염 겔 층이 그것이 코팅하는 표면 위에 전형적으로 적어도 1㎛, 예컨대 약 3㎛,의 습식 두께를 가지는 것을 허용한다. 그러나, 방법 단계 b)와 c)를 반복함으로써, 둘 또는 그것보다 많은 알긴산염 층으로 이루어진 알긴산염 코팅이 구성될 수 있다. 그러므로 본 발명의 방법은 원하는 두께의 알긴산염 코팅이 얻어질 때까지 단계 b)와 c)를 반복함으로써, 예컨대 2 내지 100회, 2 내지 10회, 2 내지 6회, 2 내지 4회, 3회 또는 4회 반복함으로써 알긴산염 코팅의 두께를 조절하기 위해 사용될 수 있다. 그러므로 알긴산염 코팅은 하나 또는 그것보다 많은 알긴산염 겔 층을 포함할 수 있다. 알긴산염 코팅은 전형적으로 약 1 내지 20㎛, 예컨대 1 내지 10㎛ 또는 3 내지 8㎛의 두께를 가진다. 전형적으로, 알긴산염 코팅은 1 내지 10개의 알긴산염 겔 층, 예컨대 2 내지 6, 2 내지 4, 3 또는 4개의 층으로 이루어진다. 생체분자(생물학적 활성 물질)가 알긴산염 코팅에 통합될 때(본 발명의 다른 곳 참조), 생체분자의 크기는 층의 수의 선택에 영향을 미칠 수 있다. 더 작은 생체분자(즉 낮은 Mw를 가지는 것, 예컨대 독시사이클린)는 더 큰 생체분자보다 빠르게 알긴산염 코팅 밖으로 확산된다. 그러므로 만약 더 작은 생체분자의 지연된 방출이 바람직하다면, 더 만은 수의 알긴산염 겔 층을 포함하는 알긴산염 코팅이 요구된다. 다른 한편으로, 보다 큰 생체분자의 경우, 알긴산염 코팅으로부터의 방출 속도는 알긴산염 겔의 분해에 보다 더 의존적이고, 생체분자는 더 작은 생체분자만큼 빠르게 알긴산염 코팅 밖으로 확산되지 못한다. 그러므로 알긴산염 코팅 중의 더 적은 알긴산염 겔 층은 보다 큰 생체분자에 대해 사용될 수 있다. 생체분자의 크기 및 바람직한 방출 속도를 알게 됨으로써 바람직한 방출 속도를 이루기 위하여 알긴산염 코팅의 알긴산염 겔 층의 수는 조정될 수 있다.
알긴산염 코팅의 얇은 두께는 그런 얇은 알긴산염 코팅이 기공 직경이 물론 다소 알긴산염 코팅으로 인해 감소되는 경우에도 실질적으로는 이산화티타늄 스캐폴드의 기공 개방을 차단하지 않을 것이기 때문에 유익하다. 오히려 알긴산염 코팅은 이산화티타늄 스캐폴드 기공의 벽을 라이닝한다. 얇은 알긴산염 코팅이 제조될 때 일부 초기 차단이 일어날 수 있지만, 생물학적 환경에서는 차단하는 알긴산염 코팅의 특정 분해를 코팅 과정 직후에 차단된 채로 유지되는 그런 기공들에서 찾아볼 수 있다(실시예 2 참조). 기공 차단의 실질적인 결핍은 알긴산염 코팅에도 불구하고 기공이 쉽게 세포 및 조직에 의한 침투를 허용하기 때문에 이산화티타늄 스캐폴드 안으로의 세포 성장이 그로써 개선될 수 있기 때문에 유익하다. 또한 본 발명의 방법은 보다 고른 두께를 가지는 알긴산염 코팅이 형성되는 것을 허용한다. 나아가, 본 발명의 방법에 의해 형성된 알긴산염 코팅은 단순히 알긴산염과 2가 양이온 염 용액을 혼합함으로써 제조된, 약간의 다공성을 가지는 알긴산염 겔과 비교하여 실질적으로 비-다공성이다(예컨대 실시예 1에서 제조되고 도 1에 도시된 겔 참조). 본원에 개시된 방법에 의해 이산화티타늄 스캐폴드 상에 제조될 때 알긴산염 코팅의 다공성의 실질적인 결핍에 대한 이유는 아마도 단계 b)에서 원심분리 후에 이산화티타늄 스캐폴드 상에 형성된 알긴산염 용애의 얇은 코팅이다.
본 발명의 방법에 따른 또 다른 장점은 알긴산염 코팅이 얇은 층의 기공의 적어도 일부에 형성됨에 따라 알긴산염 코팅이 스캐폴드의 외면상에서만 형성되는 경우에 비교하여 매우 큰 표면-대-부피 비율을 가질 것이라는 것이다. 이것은 알긴산염 코팅에 포함된 어떠한 물질, 예컨대 생물학적 활성 물질(본원의 다른 곳 참조)의 방출 프로필에 영향을 미칠 것이다. 또한 알긴산염 코팅이 이산화티타늄 스캐폴드의 외면으로부터 누출될지라도 알긴산염 코팅은 스캐폴드 내부의 기공 표면에 여전히 존재할 것이다.
또한, 본 발명의 방법은 단계 b)와 c)를 반복함으로써 하나 또는 그것보다 많은 알긴산염 겔 층을 포함하는 알긴산염 코팅의 형성을 허용한다. 바람직하게도 이것은 또한 상이한 생물학적 활성 물질 및/또는 상이한 층에 알긴산염 또는 2가 양이온의 유형들을 가지는 상이한 알긴산염 겔 층의 형성을 허용한다.
또한 단계 c)를 단계 b) 전에 수행하는 것이 가능하다. 그러나 그런 경우에는 알긴산염의 얇은 코팅이 형성되지 않는다. 오히려 알긴산염 코팅은 이산화티타늄 스캐폴드 내부의 대부분의 기공을 채운다. 이것은 특히 세포, 예컨대 줄기 세포가 이산화티타늄 스캐폴드 안에 통합되기를 바랄 때 유익할 수 있는데, 이것이 스캐폴드 기공 내부에 많은 수의 세포가 쌓이는 것을 허용하기 때문이다. 단계 c)가 단계 b) 전에 수행될 때, 단계 c)와 b)를 반복하는 것은 이산화티타늄 스캐폴드의 대부분의 기공이 단계 c)와 b)를 일단 수행한 후 이미 알긴산염 코팅으로 채워질 것이기 때문에 불필요하다. 본 발명은 그러므로 또한 단계 c)를 단계ㅠ) 전에 수행함으로써 생성된 알긴산염 층을 포함하는 이산화티타늄 스캐폴드에 관련된다.
알긴산염 용액은 알긴산염을 포함하는 수용액이다. 그것은 알긴산염을 증류수 또는 적당한 완충액, 예컨대 인산염 완충된 식염수에, 알긴산염이 녹을 때까지 바람직하게는 실온에서, 예컨대 1시간 내지 밤새(예컨대 1 내지 24시간) 교반하여 녹임으로써 제조될 수 있다.
알긴산염은 예컨대 알긴산 나트륨, 알긴산 칼륨, 알긴산 칼슘 및 알긴산 스트론튬으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 둘 또는 그것보다 많은 종류의 알긴산염의 혼합물이 사용될 수 있다. 알긴산염은 전형적으로 약 10 000 내지 600 000g/mol, 예컨대 약 10 000 내지 100 000g/mol, 100 000 내지 300 000g/mol, 250 000 내지 600 000g/mol, 50 000 내지 150 000g/mol, 50 000 내지 200 000g/mol 또는 50 000 내지 100 000g/mol의 분자량(Mw)을 가지는 고분자량 알긴산염이다. 알긴산염은 또한 약 1000 내지 200 000g/mol의 고분자량을 가질 수 있다. 알긴산염 용액 중의 알긴산염의 농도는 전형적으로 약 1 내지 3%w/v, 예컨대 1.5 내지 2.5%w/v 또는 약 2%w/v, 예를 들면 적어도 1% 및 최대 3.5%, 예컨대 최대 3%이다. 알긴산염은 최소 약 60%의 글루론산(글루로네이트) 단량체를 포함할 수 있다. 생체분자(즉 생물학적 활성 물질, 본원의 다른 곳에서 개시됨)는 알긴산염 용액에 첨가될 수 있다.
생물학적 활성 물질의 양은 알긴산염 용액에 첨가될 때, 물론 특이한 생물학적 활성 물질 및/또는 그것의 신체에서의 의도된 기능에 따라 좌우된다. 전형적으로 그것의 알긴산염 용액 중에서의 농도는 마이크로그램 범위지만, 1 ng 내지 1mg/ml, 예컨대 500ng/ml 내지 500㎍/ml, 1 내지 500㎍/ml, 1 내지 100㎍/ml, 1 내지 80㎍/ml, 20 내지 70㎍/ml, 40 내지 60㎍/ml 또는 50㎍/ml의 범위일 수 있다.
알긴산염 용액을 이산화티타늄 스캐폴드에 제공하기 위하여, 스캐폴드는 알긴산염 용액에 침지될 수 있다. 이것은 교반 하에, 예컨대 궤도식 진동기를 통해 약 100rpm/분에서의 교반 하에 일어날 수 있다. 교반은 알긴산염 용액이 스캐폴드의 다공성 네트워크에 펼쳐지는 것을 보조한다. 전형적으로 이산화티타늄 스캐폴드는 약 10 내지 2시간, 예컨대 1 내지 2시간, 예를 들면 1시간의 시간 주기 동안 침지된다. 침지는 전형적으로 실온에서 일어난다. 알긴산염 용액에 침지된 후 과잉 용액은 전형적으로, 예컨대 약 200 내지 300×g에서 짧은 시간 주기, 예컨대 0.5 내지 2분, 예를 들면 1분 동안 이산화티타늄 스캐폴드의 세심한 원심분리에 의해 제거된다.
단계 c)에서, 이산화티타늄 스캐폴드에 2가의 양이온 염 용액이 제공된다. 2가 양이온 염 용액(본원에서는 "2가 양이온 용액"으로 표시됨)은 2가 양이온, 예컨대 Ca2 +, Mg2 +, Ba2 + 또는 Sr2 +중 적어도 하나의 염을 포함하는 수용액이다. 적당한 2가 양이온 염의 실례로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, CaCl2, SrCl2, SrC03, SrP04, CaC03, CaP04, MgCl2, MgC03 및 MgP04를 포함한다. 이 용액 중의 2가 양이온 염의 농도는 전형적으로 약 15 내지 500mM, 예컨대 약 15 내지 150mM, 20 내지 500mM, 20 내지 100mM, 20 내지 400mM, 200 내지 400mM, 250 내지 350mM, 30 내지 80mM, 40 내지 60mM, 45 내지 55mM 또는 약 50 mM이다. 바람직하게는 2가 양이온 염은 CaCl2이다. 2가 양이온 용액을 가지는 이산화티타늄 스캐폴드를 제공하기 위해, 이산화티타늄 스캐폴드는 2가 양이온 용액에 예컨대 10분 내지 2시간, 예를 들면 1 내지 2시간, 예컨대 1시간의 주기 동안 침지될 수 있다. 이것은 교반 하에, 예컨대 궤도식 진동기를 통해 약 100rpm/분에서 일어날 수 있다. 교반은 스캐폴드의 다공성 네트워크에 2가 양이온 용액을 펼치는 것을 보조한다. 또는 다르게 2가 양이온 용액을 제공하기 위한 다른 수단, 예를 들면 이산화티타늄 스캐폴드에 용액을 분무하는 것이 사용될 수 있다. 2가 양이온 용액이 이산화티타늄에 제공된 후에, 스캐폴드는 임의로 예를 들면 증류수로 세정되어 과잉의 2가 양이온 용액이 제거된다. 과잉 2가 양이온 염 용액은 다르게는 또는 또한 이산화티타늄 스캐폴드의 세심한 원심분리에 의해, 예컨대 약 200 내지 300×g에서 짧은 시간 주기 동안, 예컨대 0.5 내지 2분, 예를 들어 1분 동안 원심분리함으로써 제거될 수 있다. 만약 원심분리 단계가 적용된다면, 임의의 세정은 바람직하게는 원심분리 후에 일어난다. 나아가, 생물학적 활성 물질은 2가 양이온 용액에(예컨대 중합체 용액에 첨가될 때와 동일한 농도로) 첨가될 수 있지만, 바람직하게는 생물학적 활성 물질을 알긴산염 코팅에 포함시키고자 할 때에는 알긴산염 용액에 첨가된다.
단계 d)는 임의적일 수 있고 약 0.5시간 내지 여러 날의 시간 주기 동안 수행될 수 있다. 그것은 예컨대 밤새, 예를 들면 0.5 내지 24시간, 5 내지 10시간 또는 단지 1시간 동안 수행될 수 있다. 전형적으로 이 단계는 실온에서 수행된다.
본원에 개시된 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드의 제조 방법은 알긴산염 코팅이 제공되고, 임의로 또한 생물학적 활성 물질(들)을 포함하는 이산화티타늄 스캐폴드를 제공한다. 그러므로 본 발명은 또한 본원에 개시된 방법에 의해 얻을 수 있거나 얻어진, 임의로 생물학적 활성 물질(들)을 포함하는 알긴산염 코팅을 포함하는 이산화티타늄 스캐폴드에도 관련된다. 그런 이산화티타늄 스캐폴드는 예를 들면 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드 또는 알긴산염 코팅을 포함하는 이산화티타늄 스캐폴드로 표시될 수 있다.
알긴산염 코팅을 포함하는 이산화티타늄 스캐폴드는 전형적으로 의료용 임플란트로서, 단독으로 또는 임플란트의 일부로서 포함되어 사용된다. 본 발명의 다른 부분으로부터 명백한 것과 같이, 사용된 이산화티타늄 스캐폴드 구조는 특별히 임플란트의 이식 부위 및 의도된 기능에 맞추어진 임플란트 구조의 맞춤-제조를 허용한다. 그러므로 본 발명은 또한 의료용 임플란트로서 사용하기 위한 알긴산염 코팅을 포함하는 이산화티타늄 스캐폴드에 관련된다. 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드는 양호한 생체적합성을 가지고 세포의 성장 및 스캐폴드 또는 스캐폴드를 포함하는 임플란트의 부착을 자극할 수 있는 다공성 구조를 포함한다. 다공성 구조는 세포의 스캐폴드 안으로의 내부 성장을 허용하고, 그로써 조직의 재생을 허용한다. 큰 표면적은 또한 세포의 구조 안으로의 성장을 용이하게 하고, 그로써 스캐폴드의 부착 및 조직의 재생을 용이하게 한다. 이산화티타늄 스캐폴드 자체가 양호한 생체적합성을 가지는 재료로 만들어지기 때문에 대상에게 이식될 때 스캐폴드에 대한 부작용은 감소된다.
알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드의 용도
알긴산염 겔은 조직 공학에서 상이한 용도에 대해, 예컨대 공간 충전제로서, 생체 내 활성 분자에 대한 전달 비히클로서, 및 세포를 조직하고 원하는 조직의 형성을 지시하기 위한 자극을 제공하는 삼차원 구조로서 사용되어 왔고, 본 발명에 개시된 알긴산염 코팅은 유익하게도 어떠한 그러한 목적에 대해서도 사용될 수 있다. 본 발명의 이산화티타늄 스캐폴드는 또한 유익하게도 본원에 개시된 방법에 의해 하이드로겔로 코팅되기 전 또는 후에 세포 시딩을 위해 사용될 수 있다.
알긴산염 코팅을 포함하는 이산화티타늄 스캐폴드는 대상에게 이식될 수 있고, 그곳에서 세포가 스캐폴드 구조 안으로 성장할 것이다. 또한 이식 전에 세포를 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드 상에 시딩하고 성장시키는 것도 가능하다. 이산화티타늄 스캐폴드의 상호연결된 매크로다공성 구조는 특히 조직 공학, 특히 현재 활용할 수 있는 뼈 복구 치료법에 대한 흥미로운 대안인 뼈 구조 공학에 적당하다. 이런 견지에서, 이산화티타늄 스캐폴드의 골수-유도 세포 시딩은 해당 기술분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있는 종래 방법을 사용하여 수행된다(예컨대 Maniatopoulos et al. 1988 참조). 세포는 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드 상에 시딩되고 적당한 성장 조건 하에서 배양된다. 배양물에는 성장을 수립하기에 적절한 배지가 공급된다. 또한 세포, 예컨대 줄기 세포, 예를 들면 간엽 줄기 세포를 알긴산염 코팅을 스캐폴드에 제공하기 전에 이산화티타늄 스캐폴드에 시딩하는 것이 가능하다(알긴산염 코팅을 사용하여 그런 세포 시딩을 수행하기 위한 예시적인 방법에 대해 실시예 4 참조).
다양한 유형의 세포들은 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드 전체를 통해 성장될 수 있다. 보다 정확하게는, 세포 유형은 조혈 또는 간엽 줄기세포를 포함하고, 또한 심혈관, 근육 또는 어떠한 연결 조직을 생산하는 세포를 포함한다. 세포는 인간 또는 다른 동물 기원의 것일 수 있다. 그러나, 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드는 골원성 세포, 특히 골기질을 발달시키는 세포의 성장에 적당하다. 조직 공학의 경우, 세포는 어떠한 기원이든지 될 수 있다. 세포는 인간 기원의 것이 유익하다. 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드에서 세포를 성장시키는 방법은 시딩된 골원성 세포가 예를 들면 시험관 내 단계 동안에, 이산화티타늄 스캐폴드를 관통하여 골기질을 발달시키고, 이산화티타늄 스캐폴드의 구조에 광범위하게 분포되는 것을 허용한다. 골원성 세포 침투 및, 그 결과로서 골기질 발달은 기계적, 초음파적, 전기장 또는 전자 수단에 의해 증강될 수 있다.
알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드는 세포의 성장, 예를 들면 조직의 재생을 위한 프레임워크로서 작용하는 구조가 필요할 때면 언제나 유용하다. 이산화티타늄 스캐폴드의 알긴산염 층의 존재는 스캐폴드 통합, 생체적합성 등을 개선시킬 수 있는 생물학적 활성 물질의 전달을 허용한다. 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드는 특히 뼈 및 연골 구조의 재생을 위해 유용하다. 그런 구조의 재생이 필요한 상황의 실례로는 외상, 뼈 또는 치아의 수술적 제거 또는 암 치료법과 연계되는 것을 포함한다.
전체적으로 또는 부분적으로 대체될 수 있는 대상의 구조의 실례로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 두개-안면 뼈, 이를테면 협골궁, 내이 뼈(특히 추골, 등골 및 침골), 상악 및 하악 치조 마루, 안와의 벽과 바닥, 부비강의 벽과 바닥, 두개골 및 두개골의 결함, 고관절 소켓(절구 오목), 예컨대 고관절 이형성증의 경우, 긴 뼈의 복합 골절, 이를테면(그것들에 한정되는 것은 아니지만) 상완골, 반경, 척골, 대퇴골, 경골 및 비골, 등골, 손과 발의 뼈, 손가락 및 발가락 뼈, 발치 구멍의 충전(치아 발치로부터), 치주 결함의 복구 및 임플란트 주변 결함의 복구를 포함한다. 또한 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드는 종양, 암, 감염, 외상, 수술, 선천성 기형, 유전성 질환, 대사성 질병(예컨대 골다공증 및 당뇨병)(의 제거)로부터 유발되는 모든 유형의 뼈 결함의 충전에 유용하다.
본 발명의 개시된 방법에 의해 제조된 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드 또는 그런 스캐폴드를 포함하는 의료용 임플란트는 조직, 예컨대 뼈의 재생, 복구, 치환 및/또는 복원에 사용될 수 있다. 그러므로 본 발명은 또한 조직, 예컨대 뼈의 재생, 복구, 치환 및/또는 복원에 사용하기 위한 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드 또는 그것을 포함하는 의료용 임플란트에 관련된다.
본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있거나 얻어진 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드는 또한 조직의 재생, 복구, 치환 및/또는 복원을 위한 의료용 임플란트의 제조를 위해 사용될 수 있다. 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드는 또한 조직, 예컨대 뼈의 재생, 복구, 치환 및/또는 복원을 위한 의료용 임플란트의 제조를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있거나 얻어진 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드 또는 그것을 포함하는 의료용 임플란트는 또한 그런 스캐폴드 또는 그런 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드를 포함하는 의료용 임플란트를 필요로 하는 대상에게 이식하는 것을 포함하는, 조직, 예컨대 뼈의 재생, 복구, 치환 및/또는 복원을 위한 방법에 사용될 수 있다.
생물학적 활성 물질(생체분자)
상기에서 언급된 것과 같이, 알긴산염 용액 및/또는 2가 양이온 용액은 하나 또는 그것보다 많은 상이한 종류의 생물학적 활성 물질(들)을 포함할 수 있다. 그러므로 생물학적 활성 물질(들)은 알긴산염 코팅 안으로 통합될 수 있다. 그러므로 알긴산염 코팅은 생물학적 활성 물질에 대한 담체로서 작용할 수 있고, 그 결과 생물학적 활성 물질은 알긴산염 코팅을 통해 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드에 의해 전달된다. 알긴산염 코팅은 한 종류의 생물학적 활성 물질 또는 둘 또는 그것보다 많은 생물학적 호라성 물질의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기에서 언급된 것과 같이, 알긴산염 코팅이 본원의 다른 곳에서 개시된 것과 같은 방법의 단계 b)와 c)를 반복함으로써 제조되는 경우, 상이한 층들은 상이한 생물학적 활성 물질을 포함할 수 있다.
생물학적 활성 물질은 신체에서 생물학적 활성을 나타내는 어떠한 물질, 예컨대 합성 또는 천연 생체 내 활성 분자, 천연 또는 합성 약물 및/또는 살아있는 세포일 수 있다. 무기의 생물학적 활성 이온 또한 통합될 수 있는데, 예컨대 칼슘, 크로뮴, 플루오라이드, 금, 요오드, 칼륨, 마그네슘, 망간, 셀레늄, 황, 주석, 나트륨, 아연, 스트론튬, 질산염, 아질산염, 인산염, 염화물, 황산염, 탄산염, 카복실 또는 옥사이드가 통합될 수 있다.
생물학적 활성 물질은 또한 세포일 수 있다. 알긴산염 코팅에 통합되기 위한 살아있는 세포의 실례로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 간엽 줄기세포, 뼈 세포, 다능 세포, 뼈 전구 세포, 혈관 세포, 혈관 전구 세포 및/또는 간질 세포를 포함한다.
생물학적 활성 물질의 실례로는 또한 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 천연 또는 재조합 생체-접착제; 천연 또는 재조합 세포 부착 인자; 천연, 재조합 또는 합성 생체중합체; 천연 또는 재조합 혈액 단백질; 천연 또는 재조합 효소; 천연 또는 재조합 세포외 매트릭스 단백질; 천연 또는 합성 세포외 매트릭스 생체분자; 천연 또는 재조합 신호 분자, 성장 인자 및 호르몬; 천연, 재조합 및 합성 펩티드, 합성 펩티드 호르몬; 천연, 재조합 또는 합성 데옥시리보핵산; 천연, 재조합 또는 합성 리보뉴클레오티드 산; 천연 또는 재조합 수용체; 효소 억제제; 약물; 생물학적 활성 음이온 및 양이온; 바이타민, 예컨대 바이타민 D; 아데노신 모노포스페이트(AMP), 아데노신 다이포스페이트(ADP) 또는 아데노신 트라이포스페이트(ATP); 마커 생체분자; 아미노산; 지방산; 뉴클레오티드(RNA 및 DNA 염기); 당, 항미생물 물질, 예컨대 테트라사이클린, 면역 활성 성분, 항체, 항-염증 분자, 매트릭스 성분, 내인성 질병 단백질, 및 작은 생물학적 유기 분자, 예컨대 스타틴 및/또는 비스포스포테이트가 있다.
알긴산염 코팅 안으로의 통합에 적당한 펩티드 및 단백질은 특히 세포 성장 및/또는 임플란트의 골유착에 영향을 주는 것으로 알려져 있는 펩티드 및 단백질을 포함한다. 많은 천연 펩티드는 미네랄 침전을 유도하는 것으로 밝혀졌고, 그러므로 적당하게 알긴산염 코팅에 통합될 수 있다. 실례로는 콜라겐 1 및 2, 아멜로게닌, 에나멜 모세포 뼈 시알로단백질, 에나멜린 및 안소칼신이 있다. 아파타이트의 골격내 광화된 조직 안으로의 침착 및 성장은 폴리프롤린-풍부 단백질에 의해 안내되는 과정이다. 폴리프롤린 반복부는 단백질 매트릭스의 압축, 형태 가변성, 아파타이트 결정 길이 및 신호화 사건에 자주 포함된 단백질 도메인에의 결합에 역할을 담당하는 경조직 세포외 매트릭스 단백질의 공통적인 특징이다. 예를 들어 에나멜 매트릭스 유도체(EMD)는 연조직 및 경조직 성장을 생체 모방학적으로 자극하기 위해 사용된 돼지 태내 치아 물질의 추출물이다. EMD는 또한 다양한 다른 생물학적 활성, 예컨대 염증 및 감염의 억제를 나타내는 것으로 증명되었다. EMD를 포함하는 상업적 생성물은 Straumann®Emdogain (Straumann AG, Peter Merian-Weg 12, CH 4052 Basel, Switzerland)이다. EMD는 다량의 아멜로게닌을 함유하는데, 그것은 상기에서 언급한 것과 같이 알긴산염 매트릭스 안으로 적당하게 통합될 수 있는 단백질이다.
알긴산염 코팅에 통합하기에 적당한 펩티드의 추가의 실례는 생체 내 광화를 유도하는, WO 2008/078167에 개시된 공통 서열을 토대로 한 펩티드를 포함한다.
실험 단원에서 사용된 펩티드 P2(SEQ ID NO:1), P5(SEQ ID NO:2) 및 P6(SEQ ID NO:3)는 알긴산염 코팅에 적당하게 통합될 수 있는 WO 2008/078167의 공통 서열을 토대로 한 펩티드의 실례이다. 그런 서열의 다른 실례는 P1(SEQ ID NO 4: PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP), P3(SEQ ID NO 5: PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP) 및 P4 (SEQ ID NO 6: PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP)이다.
생물학적 활성 물질은 전형적으로 대상에서의 이산화티타늄 스캐폴드의 통합을 촉진하는 물질일 수 있다.
임의로 알긴산염 코팅에 통합된 생물학적 활성 물질의 확산 속도는 알긴산염 코팅의 기공에 비교하여 생물학적 활성 물질(Stokes 반경에 의해 정의됨)의 분자량 및 크기에 의해 영향을 받으며, 생물학적 활성 물질의 화학적 성질에 좌우된다(분자-알긴산염 사이의 상호작용, 분극화, 즉 친수성 물질은 매우 빠르게 확산할 수 있는 한편, 소수성 물질은 알긴산염을 통해 느리게 확산한다). 대상의 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드의 이식 후 첫째 날 또는 여러 날 동안 생물학적 활성 물질의 폭발적인 방출 프로필은 더 작은 생물학적 활성 물질, 예컨대 본 발명의 실험 단원에서 사용된 펩티드에 대해 찾아볼 수 있다. 알긴산염 코팅(상기 참조)의 기공 크기를 조정함으로써 및 생물학적 활성 물질의 특성(예컨대 분자량, 형상, 극성 등)을 고려함으로써, 통합된 생물학적 활성 물질의 방출 속도는 조정될 수 있다.
이산화티타늄 스캐폴드
본 발명의 이산화티타늄 스캐폴드는 세포 부착 및 내부성장을 위한 삼차원 공간을 생성함으로써 조직 형성을 허용하는 구조적 지지체로서 기능할 수 있는 망상 스캐폴드이다. 스캐폴드의 이산화티타늄은 생체 부합하고 상이한 형상으로 처리되어 세포 성장을 위한 기계식 지지체 및 프레임워크를 제공할 수 있는 스캐폴드를 제공한다. 그러므로 이산화티타늄 스캐폴드는 뼈의 재생을 위해서와 같은 조직 공학에 사용될 수 있는 적당한 구조를 제공한다.
본 발명의 맥락에 사용하기에 적당한 이산화티타늄 스캐폴드는 기본적으로 이산화티타늄으로 형성된 스캐폴드이고, 즉 이산화티타늄은 이산화티타늄 스캐폴드의 주요한 구조적 요소이다. 이산화티타늄 스캐폴드는 개방된 다공성 구조를 취해야 한다.
이산화티타늄 스캐폴드는 전형적으로 매크로기공 및 상호연결을 포함하는 매크로다공성 스캐폴드이다. 이산화티타늄 스캐폴드의 매크로기공은 대략 10 내지 3000㎛, 예컨대 20 내지 2000㎛, 약 30 내지 1500㎛ 또는 약 30 내지 700㎛ 범위의 기공 직경을 가진다. 이산화티타늄 스캐폴드가 더 큰 구조, 예컨대 혈관 및 섬유주 골형의 내부 성장을 허용하는 것, 즉 약 100㎛ 또는 그것보다 더 큰 직경을 가지는 기공을 포함하는 것이 중요하다. 기공의 적어도 일부는 상호연결되거나 및/또는 부분적으로 상호연결되는 것이 중요하다.
기공 직경은 이산화티타늄 스캐폴드 안으로의 세포의 성장의 속도 및 정도에 영향을 줄 수 있고, 따라서 그 결과의 조직의 구성에도 영향을 미칠 수 있다. 매크로다공성 시스템은 전형적으로 이산화티타늄 스캐폴드의 적어도 50%의 부피를 차지한다. 이산화티타늄 스캐폴드의 매크로- 및 마이크로기공의 부피는 이산화티타늄 스캐폴드의 기능에 따라 좌우될 수 있다. 만약 치료 목적이 많은 뼈 구조와 이산화티타늄 스캐폴드를 교체하는 것이 치유 시간 동안 부하되지 않은 채로 유지될 수 있는 것이라면, 이산화티타늄 스캐폴드는 총 스캐폴드 부피의 90%까지를 차지하는 매크로다공성 시스템으로 만들어질 수 있다.
이산화티타늄 스캐폴드는 전형적으로 약 40 내지 99%, 예컨대 70 내지 90%의 총 다공성을 가진다.
이산화티타늄 스캐폴드의 프랙탈 차원 지주는 전형적으로 2.0 내지 3.0, 예컨대 약 2.2 내지 2.3이다. 지주 두께는 이산화티타늄 스캐폴드의 강도에 영향을 미치며, 이산화티타늄 스캐폴드의 지주가 두꺼울수록 이산화티타늄 스캐폴드는 더 강해진다.
이산화티타늄 스캐폴드는 전형적으로 약 0.001 내지 3.0㎛3, 예컨대 약 0.8 내지 1.2㎛3의 내부 지주 부피를 가진다. 부피가 더 작고 프랙탈 수가 높을수록 스캐폴드는 더 강해진다.
해당 기술분야의 숙련자들은 이산화티타늄 스캐폴드가 또한 마이크로수준 및 나노수준의 구조를 가진다는 것을 인지할 것이다. 이 마이크로 및 나노 구조는 제조 조건으로 인해 변형될 수 있다. 마이크로수준 상의 기공 직경은 전형적으로 1 내지 10㎛ 범위에 있다. 나노수준 상의 기공은 전형적으로 직경이 1㎛ 미만이다.
본 발명의 이산화티타늄 스캐폴드는 전형적으로 대략 10 내지 3000㎛, 예컨대 20 내지 2000㎛, 30 내지 1500㎛ 또는 30 내지 700㎛의 조합된 마이크로 및 매크로 기공 직경을 가진다. 기공 직경은 또한 40㎛ 이상이고, 상호연결된 기공은 적어도 20㎛이다.
이산화티타늄 스캐폴드의 크기 및 형상은 그것의 의도된 용도에 따라 결정된다. 이산화티타늄 스캐폴드 크기 및 형상은 제조 단계에서 또는 준비된 스캐폴드의 변형 후에 조정될 수 있다. 그러므로 이산화티타늄 스캐폴드는 특이한 대상에서의 특이한 용도에 대해 쉽게 맞춰질 수 있다. 전형적으로 이산화티타늄 스캐폴드의 크기, 형상 등은 알긴산염 코팅으로 코팅되기 전에 조정된다.
전형적으로, 이산화티타늄 스캐폴드는 슬러리를 스폰지 상에 고화시키고, 하나 또는 그것보다 많은 소결 단계를 수행하여 스폰지를 제거하고 강력한 스캐폴드 구조를 생성하는, 이산화티타늄 슬러리에 중합체 스폰지 구조를 침지하는 방법에 의해 제조될 수 있다(예컨대 WO 08078164에 개시된 방법 참조). 그러므로 이산화티타늄 스캐폴드는 예를 들면 WO 08078164에 개시된 이산화티타늄 스캐폴드일 수 있다. 그런 방법은 다음의 단계들을 포함할 수 있다:
a) 이산화티타늄 슬러리를 제조하는 단계,
b) 단계 a)의 이산화티타늄 슬러리를 연소성 다공성 구조, 예컨대 다공성 중합체 구조, 예를 들면 스폰지 구조에 제공하는 단계,
c) 슬러리를 연소성 다공성 구조 위에서 고화시키는 단계,
d) 고화된 이산화티타늄 슬러리로부터 연소성 다공성 구조를 제거하는 단계, 이때 단계 d)는
i) 고화된 산화 금속 슬러리를 포함한 연소성 다공성 구조를 약 500℃로 서서히 소결하고, 이 온도를 적어도 30분 동안 유지하며,
ii) 약 최소 1500℃로 또는 약 1750℃로 약 3K/분에서 빠르게 소결하고, 이 온도를 적어도 10시간 동안 유지하며,
iii) 적어도 3K/분에서 실온으로 빠르게 냉각시킴으로써 수행될 수 있다.
본 발명은 청구범위에 설멸된 본 발명의 범주를 제한하지 않는 다음의 실시예로 추가로 기술될 것이다.
실시예
실시예 1: 생물학적 활성 물질이 있거나 없는 알긴산염 하이드로겔의 제조
Figure pct00001
아미노산(AA): 펩티드 2(P2); 펩티드 5(P5); 펩티드 6(P6); S = Ser; P = Pro; L = Leu; V = Val; Q = Gin; M = Met; H = His; C = Cys.
1. 재료 및 방법
1.1. 펩티드 및 에나멜 매트릭스 유도체의 제조
에나멜 매트릭스 유도체(EMD)를 친절하게도 Straumann GmbH (Basel, Switzerland)에 의해 공급받았다. EMD를 인산염-완충된 식염수(PBS)(PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria)중의 0.1% 아세트산에 10mg/ml로 녹였다. 3개의 합성 펩티드(표 1)를 이전 연구(Rubert M ef al., 2011)에서 상세하게 기술한 것과 같이 디자인하였다. 펩티드를 Eurogentec(Seraing, Belgium)으로부터 구입하였다. 합성 펩티드를 PBS 중의 0.1% 아세트산에 5 또는 10mg/ml(펩티드 2 FITC-표지된 경우에)로 녹였다. 반복된 동결-해동 사이클을 피하기 위해 분액을 제조하여 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
1.2 알긴산염 하이드로겔의 제조
알긴산염 나트륨(Pronova UP LVG®)- 단량체의 최소 60%가 글루로네이트인 저점도 알긴산염 -을 NovaMatrix(FMC BioPolymer AS, Norway)로부터 구입하였다. 알긴산 나트륨을 추가의 정제 없이 사용하였다. 2%(w/v) 알긴산 나트륨을 PBS중에 제조하고 실온에서 밤새 180rpm에서 교반하여 균질한 알긴산염 하이드로겔을 얻었다. 알긴산염 용액을 합성 펩티드 또는 EMD와 50㎍/ml의 최종 농도로 혼합하였다. 그런 다음 합성 펩티드/EMD를 함유하는 알긴산염 용액을 24-웰 배양 플레이트에 분배하고 300mM의 CaCl2를 에어로그래프 페인트 분무기(Precisso®, Madrid, Spain)에 의해 분무하였다. 그것을 실온에서 1 내지 2시간 인큐베이션한 후에 알긴산염 하이드로겔은 완전히 겔화되었다.
1.3. 주사 전자 현미경에 의한 알긴산염 하이드로겔의 특성확인
대조 2% 알긴산염 하이드로겔 및 합성 펩티드 2(50㎍/ml)를 함유하는 2% 알긴산염 하이드로겔의 형태학을 주사 전자 현미경(SEM, Hitachi S-3400N, Hitachi High-Technologies Europe GmbH, Krefeld, Germany)을 사용하여 관찰하였다. 알긴산염 하이드로겔(동결건조되지 않은 것과 동결건조된 것)의 미세구조를 관찰하였다. 알긴산염 하이드로겔 동결건조의 경우, 샘플을 -80℃에서 냉동시키고 이어서 -35℃에서 동결건조시켰다. 그런 다음 샘플을 N2에서 냉동하여 날카로운 메스를 사용하여 단면이 정확하게 절단될 수 있도록 하였다. 알긴산염 하이드로겔의 구조를 ×25 및 ×100 배율에서 10kV와 40Pa를 사용하여 관찰하였다. 환경 이차 전자 검출기(ESED)를 ×25 배율의 영상에 대해 사용하였고, 후방 산란 전자 검출기(BSED)를 ×100 배율의 영상에 대해 사용하였다. 각 기공의 직경을 SEM, Hitachi S-3400N으로부터의 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.
1.4. 펩티드 방출 프로필
펩티드 방출 프로필을 연구하기 위하여, P2를 FITC로 표지하였다. 2% 알긴산염 하이드로겔에 함유된 펩티드(50㎍/ml)의 방출을 형광 현미경에 의해 정량하였다. 먼저, 알긴산염 하이드로겔을 배양 배지로 세척하여 과잉 CaCl2를 제거하였다. 그런 다음 750㎕의 배양 배지를 펩티드가 로딩된 알긴산염 하이드로겔 위에 첨가하였다. 샘플을 37℃ 및 5% CO2에서 21일 동안 인큐베이션하고, 세포 배양 배지를 일주일에 2회 교체하였다. 미리 정해놓은 시간점(24h, 4d, 7d, 11d, 14d, 18d 및 21d)에, 상층액을 수집하고 형광 분광계에 의해 분석하여(λ 여기 490nm 및 λ 방출 525nm) 배지로 방출되는 펩티드의 양을 측정하였다. 세척 단계 중에 방출된 펩티드의 양을 또한 측정하였다. 실험을 3회 수행하고, 각 샘플을 3중으로 분석하였다.
상대적인 형광 유닛을 각 시간점에 대한 선형 표준 곡선을 사용하여 방출된 펩티드의 양과 상호 관련지었다.
1.5. MC3T3 - E1 의 세포 배양
마우스 골아세포 셀라인 MC3T3-E1(DSMZ, Braunschweig, Germany)을 앞서 설명한 것과 같이 유지하였다(Tiainen H et al., 2011). 시딩 전에 교차결합된 알긴산염 하이드로겔을 함유하는 24-웰 배양 플레이트를 750㎕의 배양 배지로 세척하여 과인 CaCl2를 제거하였다. 상이한 세포 밀도를 사용하여 최종 실험에 대해 2% 알긴산염 겔 상의 세포 접착의 효율을 평가한 후에, 세포를 100 000 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 배지를 일주일에 2회 교체하였다. 배양 배지를 세포 생존력을 연구하기 위하여 시딩 후 24시간 후에 수집하였다. 세포를 14일과 21일에 수확하여 실시간 RT-PCR을 사용하여 접착 및 골원성-관련 마커의 유전자 발현을 분석하였다. 배양물을 광현미경(Leica DMIRB, Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Germany)을 사용하여 대략적으로 관찰하였다.
1.6. 2% 알긴산염 겔에 대한 세포 접착
시딩 후 1일 및 5일 후 알긴산염 하이드로겔 상의 세포의 접착을 평가하여 실험에 대한 최상 시딩 밀도를 측정하였다. 30×104 내지 200×104 세포/웰의 밀도를 시험하였다. 알긴산염 하이드로겔 상에 접착된 세포를 탈이온화된 증류수 중에서 냉동-해동 방법에 의해 용해시켰다. 세포 용해물을 Hoechst 33 258 분석을 사용하여 DNA 양의 측정을 위해 사용하였다. 샘플을 TNE 완충액 중에서 20㎍/ml의 Hoechst 33 258 형광 얼룩(Sigma, St. Quentin Failavier, France)과 혼합하고, 형광의 세기를 356/465nm의 여기 및 방출 파장에서 다중기능 미소플레이트 판독기(Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer, Agilent Technologies, Santa Clara, USA)를 사용하여 측정하였다. 상대적인 형광 유닛을 선형 표준 곡선을 사용하여 세포수와 상호 관련지었다.
배양 후 1일 및 5일 후에 알긴산염 하이드로겔 상에 접착된 MC3T3-E1 세포를 공초점 현미경(Leica TCS SPE Microsystems Wetzlar GmbH, Wetlzar, Germany)에 의해 가시화하였다. 간단히 설명하면, 알긴산염 하이드로겔 상에 시딩한 세포를 PBS 중의 4% 폼알데하이드로 4℃에서 10분 동안 고정시켰다. 염색을 위해 세포를 0.2% 트리톤에 침투시키고 물질의 자가형광을 PBS 중의 3% BSA로 차단하였다. 세포의 세포골격을 5㎍/ml의 FITC 팔로이딘(Sigma, St. Quentin Failavier, France)으로 염색하고 핵을 DAPI(Sigma, Schnelldorf, Germany)로 염색하였다. 추가로, 2% 알긴산염 하이드로겔 상에 초기에 시딩한 100×103 세포의 세포 접착 및 부착을, PBS 중의 4% 폼알데하이드로 4℃에서 10분 동안 세포를 고정한 후에 10kV, ×200 및 40 Pa에서 SEM과 ESED를 사용하여 관찰하였다.
1.7. 세포 생존력
24시간 후에 배양 배지에서 측정된 LDH 활성을 막 누출 또는 세포 용해의 지표로서 채택하였다. 시토졸 효소의 활성을 앞에서 기술된 것과 같이 추정하였다(Rupert M et al., 2011).
골아세포 마커 관련 유전자의 서열
유전자 프라이머 서열
18S S 5'- GTAACCCGTTGAACCCCATT -3' (SEQ ID NO 7)
A 5'- CCATCCAATCGGTAGTAGCG -3' (SEQ ID NO 8)
GAPDH S 5'- ACCCAGAAGACTGTG-GATGG -3' (SEQ ID NO 9)
A 5'- CACATTGGGGGTAGGAACAC -3' (SEQ ID NO 10)
Itga8 S 5'- TCGCCTGGGAGGAGGCGAAA -3' (SEQ ID NO 11)
A 5'- TCTTAACCGCTGTGCTCCCCG -3' (SEQ ID NO 12)
Itgb1 S 5'- AGCAGGCGTGGTTGCTGGAA -3' (SEQ ID NO 13)
A 5'- TTTCACCCGTGTCCCACTTGGC -3' (SEQ ID NO 14)
Itgb3 S 5'- AGGGGAGATGTGTTCCGGCCA -3' (SEQ ID NO 15)
A 5'- ACACACAGCTGCCGCACTCG -3' (SEQ ID NO 16)
Fn1 S 5'- GCTGCCAGGAGACAGCCGTG -3' (SEQ ID NO 17)
A 5'- GTCTTGCCGCCCTTCGGTGG -3' (SEQ ID NO 18)
Bmp2 S 5'- GCTCCACAAACGAGAAAAG-C -3' (SEQ ID NO 19)
A 5'- AGCAAGGGGAAAAG-GACACT -3' (SEQ ID NO 20)
Coll -I S 5'- AGAGC-ATGACCGATGGATTC -3' (SEQ ID NO 21)
A 5'- CCTTCTTGAGGTTGCCAGTC -3' (SEQ ID NO 22)
Bsp S 5'- GAAAATGGAGACGGCGATAG -3' (SEQ ID NO 23)
A 5'- ACCCG AGAGTGTGG AAAGTG-3 ' (SEQ ID NO 24)
Alp S 5'- AACCCAGACACAAGCATT-CC -3' (SEQ ID NO 25)
A 5'- GAGAGCGAAGGGTCAGTCAG -3' {SEQ ID NO 26)
Oc S 5'- CCGGGAGCAGTGTGAGCTTA -3' (SEQ ID NO 27)
A 5'- TAGATGCGTTTGTAGGCGGTC -3' (SEQ ID NO 28)
Opn S 5'- TCTGCGGCAGGCATTCTCGG -3' (SEQ ID NO 29)
A 5'- GTCACTTTCACCGGGAGGGAGGA -3' (SEQ ID NO 30)
1.8. 총 RNA 분리 및 실시간 RT - PCR 에 의한 골아세포 마커의 유전자 발현
유전자 발현에 미치는 알긴산염 하이드로겔에 로딩된 합성 펩티드 및 EMD의 효과를 pre-골아세포 MC3T3-E1 세포에 대해 처리 후 14일 및 21일 후에 연구하였다.
총 RNA를 Tripure®(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 사용하여 제조자의 프로토콜을 따라 분리하였다. 총 RNA를 260nm에서 Nanodrop 분광계(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 260nm에서 정량하였다.
동일한 양의 RNA(350ng)를 고용량 RNA-대-cDNA 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 공급자의 프로토콜을 따라 cDNA에 역전사시켰다. 각 cDNA의 분액을 PCR 반응을 수행할 때까지 냉동시켰다(-20℃).
실시간 PCR을 Lightcycler 480®(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)에서 SYBR 녹색 검출을 사용하여 수행하였다. 실시간 PCR을 2개의 참조 유전자(18SrRNA 및 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)) 및 10개의 표적 유전자(인티그린 알파 8(Itga8), 인티그린 베타1(Itgb1), 인티그린 베타 3(Itgb3), 피브로넥틴 1(Fn1), 뼈 형성 단백질 2(Bmp2), 콜라겐 유형 I(Coll -I), 뼈 시알로단백질(Bsp), 알칼리성 포스파타제(Alp), 오스테오칼신(Oc) 및 오스테오폰틴(Opn))에 대해 수행하였다.
프라이머 서열은 표 2에 열거한다. 반응 조선 및 상대적인 정량을 이미 기술된 것과 같이 시행하였다(Tiainen H ef al., 2011).
1.9. 통계학적 분석
모든 데이터를 평균값±SEM으로 표시한다. 그룹간 차이는 그것들의 정상적인 분포에 따라 Mann-Whitney 시험 또는 학생 t-시험에 의해 평가하였다. 상이한 변수 사이의 상관관계를 측정하기 위하여, Pearson 상관 분석을 사용하였다. 윈도우(Chicago, IL) 버전 17.0에 대하여 SPSS® 프로그램을 사용하였다. 그 결과를 P-값이 ≤0.05일 때 통계학적으로 유의미한 것으로 간주하였다.
결과
알긴산염 미세구조
도 1은 동결건조된 2% 알긴산염 하이드로겔(도 1a) 및 b)) 및 합성 펩티드를 함유하는 2% 알긴산염 하이드로겔(도 1c) 및 d))로부터의 단면의 미세구조를 도시한다. SEM 영상에서 알 수 있는 것과 같이, 비록 합성 펩티드를 함유한 알긴산염 하이드로겔이 2% 알긴산염 하이드로겔보다 더 불규칙한 구조를 보이긴 했지만, 분석한 모든 겔에서 다공성 및 상호연결된 구조를 관찰하였다. 두 개의 교차결합된 하이드로겔은 합성 펩티드가 없거나 있는 2% 알긴산염 하이드로겔에 대해 각각 42.9±3.5㎛ 및 44.7±4.1㎛의 기공 직경을 가지는 다공성의 상호연결된 구조를 나타냈다.
2% 알긴산염 하이드로겔로부터 유도된 펩티드
2% 알긴산염 하이드로겔로부터의 펩티드 방출 프로필은 도 2에 도시된다. 처음 24시간의 인큐베이션 동안 펩티드의 폭발적인 방출이 관찰되었다(54.67%). 추가로, 누적된 방출 프로필에서 볼 수 있는 것과 같이, 25.8%의 펩티드가 11일까지 느리게 방출되었고, 이어서 21일까지는 시간의 경과에 따라 꾸준히 방출되었다. 실험이 끝날 때에(21일 후) 이론적으로 5.6%의 총 펩티드가 알긴산염 하이드로겔에 방출되지 않은 채로 함유되어 있었다. 과잉 CaCl2를 제거하기 위하여 배양 배지로 알긴산염 하이드로겔을 세척하는 단계 동안 12.7%의 로딩된 펩티드가 방출된 것이 주지되어야 한다.
세포 접착 및 증식
알긴산염 하이드로겔 상의 낮은 세포 접착율이 관찰되었는데, 이것은 시딩된 세포의 절반보다 많은 양이 플레이팅 후 하루 만에 겔에 접착하지 않았기 때문이다. 그럼에도 불구하고 세포는 알긴산염 하이드로겔에 부착하였고 세포 배양 중에 증식하였다(도 3). 추가로, 세포를 공초점 현미경에 의해 가시화하여 골아세포의 알긴산염 하이드로겔 표면에의 부착 능력 및 확산 능력을 확인하였다. 공초점 영상은 시딩된 세포의 훨씬 많은 수를 염색하는 액틴의 증가가 수반되는 핵의 수의 증가 및 1일부터 5일까지 증가하는 것을 보여준다(도 3a) 내지 h)). 더욱이 알긴산염 하이드로겔 상에 배양된 골아세포의 세포 사상족을 SEM에 의해 인지하였다.
세포 생존력에 미치는 합성 펩티드가 로딩된 알긴산염 하이드로겔의 효과
합성 펩티드를 함유하는 알긴산염 하이드로겔 상에서 배양된 세포에서 24시간 후(도 4) 또는 장기간 후(데이터는 제시하지 않음) 독성 효과는 관찰되지 않았다. P2는 EMD에 비교하여 24시간 후에 세포 생존력을 상당히 증가시킨 반면, P5는 EMD 및 미처리된 알긴산염 겔에 비교하여 상당히 더 낮은 독성 효과를 보였다.
세포 접착 마커의 유전자 발현에 미치는 합성 펩티드가 로딩된 알긴산염 하이드로겔의 효과
Itga8의 발현은 배양 21일 후에 대조표준에 비교할 때 처리된 세포에서 증가하였다(도 5a)). Itgb1 mRNA 수준은 P2 및 P6으로 14일 동안 처리한 후 대조표준에 비교하여 상당히 감소하였다. 21일 후에 P6으로 처리된 세포는 EMD에 비교하여 Itgb1 mRNA 수준을 상당히 감소시켰다(도 5b)). Itgb3 및 Fn1은 P2 및 P6으로 처리하고 14일 후에 대조표준에 비교하여 상당히 감소되었고(도 5c)) 21일 후에는 차이가 관찰되지 않았다.
골아세포 마커의 유전자 발현에 미치는 합성 펩티드가 로딩된 알긴산염 하이드로겔의 효과
Bmp2 상대적인 mRNA 수준은 P6으로 처리하고 14일 후에 상당히 증가한 반면, P2로 처리한 21일 후에는 EMD에 비교하여 감소하였다. EMD 처리가 대조표준에 비교하여 14일의 세포 배양 후에 Bmp2 mRNA 수준의 상당한 감소를 유도하였음에도 불구하고, Bmp2 mRNA 수준의 증가는 21일 후에 발견되었지만, 차이는 통계학적으로 유의미하지는 않았다(도 6a)).
Coll -I 유전자 발현은 대조표준에 비교하여 합성 펩티드의 어느 것으로 처리하고 14일 후에 상당히 감소하였다(도 6b)). 상이한 처리에서 Bsp mRNA 수준의 차이는 발견되지 않았다)도 6c)). 세포 배양 후 14일 후에, EMD로 처리된 세포에 비교하여 증가된 Oc mRNA 수준이 2% 알긴산염 겔 및 합성 펩티드를 함유하는 겔 상에서 배양된 세포에서 검출되었다. 21일 후에, P5 또는 P6로 처리된 세포가 대조표준에 비교하여 Oc mRNA 수준을 증가시켰다(도 6e)). Opn의 발현은 대조표준에 비교하여 P2 및 P6와 함께 배양한 14일 후에 상당히 감소하였다. 21일 후에, Opn mRNA 수준은 대조표준에 비교하여 어떠한 합성 펩티드 및 EMD로 상당히 증가하였다. EMD 처리는 P2 및 P6 처리에 비교하여 Opn의 mRNA 발현 수준을 현저하게 증가시켰다(도 6f)).
논의
뼈폴리프롤린-풍부 합성 펩티드는 이전이 시험관 내에서 뼈 형성 및 광화를 유도하고 생체 내에서 뼈 복원을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 본 연구의 목적은 뼈 형성 및 광화를 촉진하기 위하여 단독으로 또는 골격 임플란트를 위한 생체 내 분해성 코팅으로서 이들 합성 펩티드로 국소 처리하기 위한 하이드로겔을 가지는 적당한 제형을 개발하는 것이었다.
본 연구에서, 상이한 합성 펩티드를 함유하는 알긴산염 겔에 세포를 노출하고, 골아세포의 생물학적 반응에 미치는 이들 펩티드의 효과를 평가하기 위하여 장기간 배양하였다. 하이드로겔의 최적 제형은 제어된 국소적 및 특이한 생체활성 분자 전달을 위한 압축 구조의 형성을 가능하게 하였다. 그런 특징은 각각의 특이한 용도의 물리적 특성(예컨대 기계학, 분해, 겔 형성), 질량 수송 특성(예컨대 확산) 및 생물학적 상호작용 요구조건(예컨대 세포 접착 및 신호화)에 의해 지배된다.
상이한 중합체 농도에서(1%, 2%, 3%, 6% 및 10%) 알긴산염 겔(Protanal LF200M, FMC polymers, Oslo, Norway)을 사용하여 수행된 이전의 연구들은 중합체 농도가 증가함에 따라 기공 크기의 감소를 나타냈고, 그 결과 펩티드 비히클로서 작용하는 가장 유망한 제형으로서 2%의 농도를 유발하였다. 이것을 유념하고 2% 알긴산염 하이드로겔을 300mM의 CaCl2와 이온적으로 교차결합시켰고 선택된 재료로서 선택하였다.
동결건조 과정 후의 합성 펩티드가 있거나 없는 두 가지 알긴산염 겔의 미세구조의 SEM 분석은 42 내지 44㎛의 기공 직경을 가지는 다공성의 상호연결된 구조를 나타냈고; 그럼에도 불구하고, 대략 1㎛ 직경의 기공 크기를 가지는 압축 구조를 비-동결건조된 겔의 SEM 분석 후에 관찰하였다(데이터는 제시하지 않음). 단백질의 확산 속도는 이들 기공에 비교하여 확산 종의 분자량과 크기(Stokes 반경에 의해 정의됨)에 의해 영향을 받고 단백질의 화학적 성질(분자-알긴산염 상호작용, 분극화, 즉 친수성 약물은 매우 빠르게 확산할 수 있는 반면 소수성 약물은 겔 기공을 통해 느리게 확산한다)에 좌우된다. 본 연구에 사용된 합성 펩티드가 25 아미노산 길이를 가지는 작은 펩티드(분자량은 2509.17 내지 2782.34 Da 범위 내임)라는 사실로 인해 겔을 통한 용이한 확산 속도가 예상되어야 한다. 따라서 본 연구에서, 2% 알긴산염 하이드로겔에 로딩된 펩티드는 처음 24시간의 인큐베이션 동안 폭발적인 방출을 나타냈고, 이어서 21일 기간 중에 점진적이고 지속적인 방출을 나타냈다.
세포 접착 및 증식에 대한 알긴산염 겔의 효율을 또한 조사하였는데, 왜냐하면 알긴산염이 세포 부착에 대해 불충분한 단백질 상호작용을 가지는 비활성 기질로서 기술되어 있고, 그것이 포유류 세포가 비변형 알긴산염 하이드로겔과 상호작용할 수 없을 것임을 시사하였기 때문이다. 실제로, 고도로 특이한 접착성 표면을 얻기 위하여, 알긴산염 하이드로겔을 사용한 대부분의 연구는 중합체에 완전한 ECM 단백질 또는 세포 수용체에 결합할 수 있는 펩티드 서열을 공유적으로 결합시켰다. 실제로, 일부 연구는 RGD-함유 펩티드로 알긴산염을 변형하는 것이 세포 접착 및 확산을 촉진한 한편, 최소 세포접착은 비변형 알긴산염 하이드로겔 상에서 관찰되었다고 보고하였다. 그러나, 본 연구는 비변형 알긴산염 하이드로겔(Pronova UP LVG®)이 세포 부착 및 확산을 허용하는 것을 나타낸다. 보고된 연구 중의 차이는 사용된 알긴산염 겔의 조성과 순도 사이의 기술된 관계 및 세포의 겔 표면상에서의 증식 능력에 기인하는 것으로 보인다. 본 연구에서 사용된 알긴산염은 최소 60%의 G-분획을 함유하였고, 따라서 세포 부착 및 확산을 허용하였다. 시험관 내 연구에 대한 최적의 시딩 밀도를 DNA 정량에 의해 평가하였다. 그 결과는 100×103 세포/웰이 세포 부착 및 세포 증식 두 가지에서 모두 더 높은 효율을 가지는 밀도임을 나타냈고, 따라서 추가의 연구를 위해 선택하였다. 알긴산염 하이드로겔은 조직 배양 플라스틱 상에서 배양된 세포에 비교하여 세포 생존력에 미치는 어떤 종류의 보호 효과를 나타내는 MC3T3-E1 세포에 대해 비-독성인 것으로 나타냈다. 더욱이, 하이드로겔 제형으로서 투여된 합성 펩티드가 비-세포독성이고, 그것은 단시간 및 장시간 세포 처리 후 이전의 연구에서 얻어진 결과와 일치하는 것으로 확인되었다.
적당한 골아세포 접착은 특이한 조합으로 이량체화하고 세포외재성 매트릭스 단백질과 상호작용하는 α 및 β 하위유닛으로 구성된 이종이량체 수용체인 인티그린에 의해 크게 중재된다. 골아세포는 그것들이 성장하는 재료에 따라 상이한 인티그린 수용체를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 세포 접착에서의 역할 외에, 인티그린은 세포골격 조직화를 조절하고 신호 변환을 중재하며, 따라서 증식, 분화 및 매트릭스 재모델링을 조절하는 유전자들의 발현을 조절한다.
합성 펩티드가 인티그린 발현 및 알긴산염 하이드로겔 상에의 세포 접착에 영향을 미칠 수 있는지의 여부를 조사하기 위하여, Itga8, Itgb 1, Itgb3 및 세포외재성 매트릭스 단백질 Fn1의 mRNA 발현 수준을 연구하였다. Itgb 1, Itgb3 및 Fn1의 발현은 합성 펩티드, 특히 P2 및 P6로 처리하고 14일 후에 상당히 감소하였다. β1 인티그린 하위유닛은 골아세포의 EC에의 접착을 중재하는 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌에 대한 뼈 수용체에서 발견되는 한편, αvβ3-인티그린은 Opn 및 비트로넥틴에의 접착을 중재한다. 관심이 있는 것은 αvβ3-인티그린의 발현이 세포 증식을 자극하고, 골아세포의 매트릭스 광화를 억제하며; FN -β1 및 β3-인티그린 하위유닛을 포함하여 대다수의 인티그린에 결합하는 풍부한 ECM 단백질-은 골 형성의 초기 단계에서 매우 고도로 발현되는 한편, 세포 성숙과정 중에 그것의 매트릭스에서의 축적이 감소된다는 사실이다. 더욱이, 합성 펩티드로의 처리는 처리후 21일 후에 Itga8 발현을 상당히 증가시켰고, 세포를 P5로 처리했을 때 현저하게 증가시켰다. Itga8은 세포 접착 및 증식에 포함된 골아세포에 의해 분비되는 단백질이고, 그것의 발현이 광화가 개시된 후에 증가되는 오스테오폰틴(Opn)과 작용하는 것으로 밝혀졌다. 여기에서, Itga8 및 Opn imRNA 발현 수준의 쌍방향 상관 분석은 0.678(p<0.01)의 Pearson 상관을 나타냈다. 이들 결과는 합성 펩티드로 처리된 세포들이 대조 그룹에 비교하여 세포 성숙의 후기 단계에 있고, 분석된 골아세포 마커의 발현 결과와 일직선상에 있음을 가리키는 것임에 틀림없다. 펩티드의 C-말단 영역에 있는 PPXPP의 보다 짧은 서열은 전사 인자 및/또는 조-활성화제의 전사촉진 활성에 참여하는 것으로 기술되었다. 합성 펩티드의 작용 방식은 세포내 신호화 캐스케이드에 영향을 미칠 수 있는 수용체와의 상호작용을 포함할 것이고, 보존된 프롤린-풍부 영역(PPLPP)을 함유하는 합성 펩티드의 C 말단의 노출은 합성 펩티드의 신호화 활성에 중요할 것이다. 합성 펩티드는 프롤린의 풍부한 함량으로 인해 예상되는 것과 같이 이차 구조 요소가 결핍된 조밀하고 잘-쌓여진 구조의 특징을 나타내고, 상호작용에 적당한 방법으로 PPLPP 스트레치를 노출한다. 펩티드 2 및 펩티드 6이 두 개의 구별되는 루프를 제공하는 한편, 펩티드 5는 C와 N 말단 사이의 접촉을 가능하게 만드는 루프의 상이한 위상을 가진다. 그러므로 C 말단의 접근성의 이런 구조적 차이 및 상이한 펩티드 사이의 이런 짧은 공통 서열(PPXPP)의 구조적 견고성이 수용체와의 상호작용에 영향을 미칠 수 있을 것이라는 사실은 접착 유전자의 차등적인 발현을 설명할 수 있다.
한편, 광화에서 역할을 담당하며 가장 특이적이고 가장 늦게 발현되는 골아세포 마커인 오스테오칼신은 미처리된 및 EMD 알긴산염 겔에 비교하여 제형된 합성 펩티드로 처리하고 14일 및 21일 후에 상당히 유도되었고, 즉 배양 배지에 투여될 때 얻어진 결과와 일치하였다. 따라서 광화가 개시된 후에 더 높은 수준으로 발현되는, 다양한 분화 단계에서 생성된 시알로단백질인 Opn은 EMD 및 합성 펩티드 둘 다로 처리하고 21일 후에 대조표준에 비교하여 상당히 상향-조절되었다. 다른 한편으로, 연구된 시점에서, 골 형성과 관련된 유전자의 발현에서 차이가 관찰되지 않았는데(Coll -I, Bmp -2, Bsp 및 Alp), 이들 유전자는 주로 증식 및 매트릭스 성숙 단계에서 골아세포 분화 중에 오스테오칼신보다 초기 단계에서 조절되기 때문이다. 지금까지 합성 펩티드로 수행되었던 모든 연구들이 시험관 내 및 생체 내에서 모두 오스테오칼신의 mRNA 수준의 증가를 반복적으로 나타냈다는 것을 주지하는 것은 흥미로운 일이다. 이 마커의 관련성은 최근의 생체 내 연구(Monjo M et al., 2012)에서 증명되었는데, 그 연구에서 모든 것 중에서도 Ti 임플란트의 골유착에 대해 가장 잘 예측되는 마커는 오스테오칼신이었다. 합성 펩티드는 세포 부착에 대해 알긴산염 하이드로겔 특성을 개선시키고, 합성 펩티드로 제형된 하이드로겔 상에서 배양된 세포는 대조 하이드로겔 및 EMD로 제형된 하이드로겔 상에서 배양된 세포를 뛰어넘어 분화 과정의 보다 성숙한 단계에 있었던 것으로 시사된다.
합성 펩티드의 작용 방식은 골아세포-분화를 최종적으로 자극하기 위해 세포 분화의 초기 상태에서 세포내 신호화 캐스케이드에 영향을 미칠 수 있는 수용체와의 상호작용을 포함할 수 있고 이런 짧은 공통 서열(PPXPP)의 접근성 및 구조적 견고성은 합성 펩티드의 신호화 활성에 중요할 것이라고 가설을 세울 수 있다. 나아가 본 결과로부터, 펩티드는 세포 표면상에 발현된 인티그린에 결합할 수 있을 것이고, 그것은 먼저 알긴산염 하이드로겔 표면 상에 골아세포 부착을 증가시킬 것이며 두 번째로 성숙한 골아세포 표현형과 관련된 유전자의 발현을 조절할 수 있을 것으로 가설을 세울 수 있다.
결론
결론적으로, 결과들은 2%의 알긴산염 하이드로겔이 MC3T3-E1 세포에서의 인티그린 알파 8, 오스테오폰틴 및 오스테오칼신 발현을 포함하여 합성 폴리프롤린-풍부 펩티드의 국소적 전달에 적당한 제형임을 증명한다. 이들 펩티드-변형된 알긴산염 하이드로겔은 뼈 조직 공학 용도에 대해 생물학적 활성 물질을 가지는 주사용 담체의 새로운 생성을 나타낼 수 있고, 골격 임플란트, 예컨대 이산화티타늄 스캐폴드에 대한 생체 내 분해성 코팅으로서 사용하기에 전도유망하다.
실시예 2: 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드의 제조
재료 및 방법
2.1. 합성 펩티드 2( P2 )의 제조
합성 프롤린-풍부 펩티드 2(P2)(2HN- PLVPSQPLVPSQPLVPSQPQPPLPP-COOH)(SEQ ID NO 1)를 Eurogentec (Seraing, Belgium)으로부터 구입하였다. 7.2mg의 선택된 합성 펩티드를 함유하고 있는 한 개의 바이알을 냉동-건조된 펠릿 형태로 전달하고 인산염-완충된 식염수(PBS)(PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria)중의 0.1% 아세트산에 10mg/ml로 녹였다.
반복된 냉동-해동 사이클을 피하기 위하여 분액을 제조하고 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
2.2. 펩티드 2를 함유하는 2% 알긴산염의 제조
알긴산 나트륨(Pronova UP LVG®) -최소 60%의 단량체가 글루로네이트인 저점도 알긴산염- 을 NovaMatrix(FMC BioPolymer AS, Norway)로부터 구입하였다.
알긴산 나트륨을 추가로 정제하지 않고 사용하였다. 알긴산 나트륨(2%, w/v)의 분량을 증류수에 3시간 동안 실온에서 교반함으로써 녹여서 균질한 알긴산염 용액을 얻었다. 고정 농도(50㎍/ml)의 P2를 그 용액에 첨가하고 1시간 동안 교반하였다.
2.3. P2 를 함유하는 2% 알긴산염으로 코팅된 TiO 2 스캐폴드의 제작
다공성 TiO2 스캐폴드를 이전에 기술되어 있는 것과 같이(Tiainen H et al., 2010) 중합체 스폰지 복제에 의해 9mm의 직경과 8mm 높이의 크기로 제조하였다. 그런 다음 TiO2 스캐폴드를 P2가 있거나 없는 2% 알긴산염 겔의 한 층으로 코팅하였다. 간단히 설명하면, TiO2 스캐폴드를 P2가 있거나 없는 2% 알긴산염 용액에 궤도식 진동기(IKA Vibrax VXR basic, Staufen, Germany)상에서 1시간 동안 실온에서 100rpm에서의 교반 하에 침지하였다. 그런 다음 스캐폴드를 252×g에서 1분 동안 원심분리하였다. 샘플을 50mM의 CaCl2에 1시간 동안 침지하여 겔화되도록 하였다. 그런 다음 스캐폴드를 dH2O로 세정하여 과잉 CaCl2를 제거하였다. 마지막으로, 샘플을 밤새 실온에서 건조되도록 놓아두었다. 한 층의 2% 알긴산염 겔로 코팅된 스캐폴드를 대조 그룹으로서 사용하였고, 반면 코팅되지 않은 TiO2 스캐폴드(알긴산염이 없음, SC)를 또한 대조 그룹으로서 사용하였다.
2.4. 2% 알긴산염 겔로 코팅된 TiO 2 스캐폴드로부터의 펩티드 2 방출 프로필
펩티드 2를 함유하는 2% 알긴산염으로 코팅된 TiO2 스캐폴드(P2-알긴산염-코팅된 스캐폴드)를 1ml의 증류수(pH 7.4)를 함유하고 있는 48-웰 플레이트(Nunc GmBh & Co. Kg, Langenselbold, Germany)에 넣었다. 세포 배양 조건을 모방하기 위하여, 샘플을 궤도식 진동기(IKA® Schuttler MTS 2, Germany)에서 200rpm에서 6시간 동안 37℃에서 및 습도 조건에서(증류수 용기를 사용함) 교반하였다. 그런 다음, 샘플을 37℃에서 보습 분위기에서 21일까지 유지하였다. 예정된 시간점(2d, 5d, 7d, 9d, 12d, 14d, 16d, 19d 및 21d)에서 증류수를 수집하고 새로운 증류수를 각 웰에 첨가하였다. 샘플 흡수를 UV-Vis 분광계(PerkinElmer® Lambda 25 UV/Vis Systems, USA)에 의해 206nm의 파장에서 분석하여 방출된 펩티드의 양을 측정하였다. 동시에 한 층의 2% 알긴산염 겔로 코팅된 TiO2 스캐폴드를 대조표준으로서 사용하여 알긴산염으로부터의 분해 생성물로부터 얻어진 흡수값을 뺐다.
상대적인 흡수 유닛을 각 시간점에 대한 선형 표준 곡선을 사용하여 방출된 펩티드의 양과 상호관련지었고, 그런 다음 방출된 누적 P2를 계산하였다. 실험을 3중으로 수행하였다.
2.5. 코팅된 및 비코팅된 TiO2 스캐폴드 상에서의 MC3T3 - E1 의 세포 배양
코팅되지 않았거나 펩티드가 있거나 없는(P2 및 대조표준(-)) 2% 알긴산염으로 코팅된 TiO2 스캐폴드를 멸균 조건에서 48-웰 플레이트((Nunc GmbH & CO. KG, Langenselbold, Germany)에 놓았다. 세포를 200,000 세포/스캐폴드의 밀도로 시딩하고 10% FBS(PAA Laboratories, Pasching, Austria) 및 100U의 페니실린/ml 및 100㎍의 스트렙토마이신/ml 항체(PAA Laboratories, Pasching, Austria)가 첨가된 α-MEM(PAA Laboratories, Pasching, Austria)에 유지하였다. 스캐폴드 내부에 균질한 세포 분포를 보장하기 위하여, 교반된 시딩 방법을 사용하였다(Takahashi Y et al., 2003). 간단히 설명하면, 1ml의 세포 현탁액을 스캐폴드에 첨가한 후, 플레이트를 궤도식 진동기(Unitron , Infers HT, Basel, Switzerland)상에서 6시간 동안 180rpm에서 37℃에서 및 습기 조건에서 교반하였다. 그런 다음, 세포를 37℃에서 5% CO2의 습기 분위기에서 21일까지 유지하였다. 배양 배지(1ml)를 매 격일마다 새롭게 교체하였다.
배양 배지를 처리 후 48시간 후에 수집하여 세포독성을 시험하였다(LDH 활성).
이 3D 시스템 안으로 세포 증식의 능력을 평가하기 위하여, 7일 후의 세포의 수를 또한 DNA 정량에 의해 Hoechst 염색을 사용하여 연구하였다. 동시에 스캐폴드 안으로의 MC3T3-E1의 세포 부착을 또한 배양 7일 및 21일 후에 SEM에 의해 가시화하였다.
세포 배양 7일 및 21일 후에 골아세포 성숙 및 분화에 관련된 마커의 발현을 실시간 RT-PCR에 의해 평가하였다.
2.6. 2% 알긴산염 -코팅된 TiO 2 스캐폴드의 SEM 가시화
알긴산염-코팅된 TiO2 스캐폴드의 형태를 주사 전자 현미경(SEM, Hitachi S-3400N, Hitachi High-Technologies Europe GmbH, Krefeld, Germany)을 사용하여 관찰하였다. SEM을 추가로 사용하여 배양 7일 및 21일 후에 TiO2 스캐폴드 구조 안으로의 세포 접착을 가시화하였다. 간단히 설명하면, 세포를 PBS로 2회 세척하고 PBS 중의 4% 글루타르알데하이드로 2시간 동안 고정하였다. 그런 다음 고정 용액을 제거하고 세포를 증류수로 2회 세척하였다. 30분 간격을 두고 세포를 50%, 70%, 90% 및 100% 에탄올 용액의 첨가에 의해 탈수시켰다. 에탄올을 제거하고 세포를 실온에 방치하여 남아 있는 에탄올을 증발시켰다. 스캐폴드를 10kV 및 40Pa에서 후방 산란 및 이차 전자 검출기를 사용하여 관찰하였다. 제공된 영상은 대표적인 영역으로부터 얻은 것이다.
2.7. 세포 생존력
배양 배지에서 48시간 후에 측정한 락테이트 데하이드로게나제(LDH) 활성을 세포 생존의 지표로서 채택하였다. 시토졸 효소의 활성을 제조자(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)의 키트 지시사항에 따라 측정하였다.
결과들은 미코팅된 스캐폴드에서 배양된 세포의 배지 중의 LDH 활성에 관련하여 나타냈고, 그것을 100%로 설정하였다.
2.8. 세포 수 측정
3D 스캐폴드 상에서 성장하는 세포를 탈이온화된 증류수에서 냉동-해동 방법에 의해 용해시켰다. 세포 용해물을 Hoechst 33258 형광 분석을 사용하여 DNA 양의 측정에 사용하였다. 샘플을 TNE 완충액 중의 20㎍/ml의 Hoechst 33258 형광 얼룩(Sigma, St. Quentin Fallavier, France)과 혼합하고, 형광 세기를 356/465nm의 여기 및 방출 파장에서 다중기능 미소플레이트 판독기(Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer, Agilent Technologies, Santa Clara, United States)를 사용하여 측정하였다. 상대적인 형광 유닛을 선형 표준 곡선을 사용하여 세포 수와 상호관련지었다.
2.9. RNA 분리 및 실시간 RT - PCR 분석
총 RNA를 Tripure®(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 사용하여 제조자의 프로토콜을 따라 분리하였다. 총 RNA를 260nm에서 Nanodrop 분광계(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 정량하였다. 동일한 양의 총 RNA(850ng)를 42℃에서 60분 동안 고용량 RNA-대-cDNA 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 공급자의 프로토콜을 따라 cDNA로 역전사시켰다. 각 cDNA의 분액을 PCR 반응을 수행할 때까지 냉동시켰다(-20℃).
실시간 PCR을 Lightcycler 480®(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)에서 SYBR 녹색 검출을 사용하여 수행하였다. 실시간 PCR을 2개의 참조 유전자(18SrRNA 및 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(Gapdh)) 및 12개의 표적 유전자(인티그린 알파 8(Itga8), 인티그린 베타1(Itgb1), 인티그린 베타 3(Itgb3), 피브로넥틴 1(Fn1), 오스테릭스(Osx), 뼈 형성 단백질 2(Bmp2), 콜라겐-I(Coll-I), 인터류킨-6(Il -6), 뼈 시알로단백질(Bsp), 알칼리성 포스파타제(Alp), 오스테오칼신(Oc) 및 오스테오폰틴(Opn))에 대해 수행하였다.
프라이머 서열을 표 3에 열거한다.
실시간 PCR에 사용한 골아세포 마커 관련 유전자의 프라이머 서열
유전자 프라이머 서열
18S S 5 -GTAACCCGTTGAACCCCATT-3' (SEQ ID NO 7)
A 5'- CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3' (SEQ ID NO 8)
Gapdh S 5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3' (SEQ ID NO 9)
A 5'-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3' (SEQ ID NO 10)
Itgb1 S 5'- AGCAGGCGTGGTTGCTGGAA -3' (SEQ ID NO 13)
A 5' -TTTCACCCGTGTCCCACTTGGC -3' (SEQ ID NO 14)
Itgb3 S 5'- AGGGGAGATGTGTTCCGGCCA -3' (SEQ ID NO 15)
A 5'- ACACACAGCTGCCGCACTCG -3' (SEQ ID NO 16)
Fn1 S 5'- GCTGCCAGGAGACAGCCGTG -3' (SEQ ID NO 17)
A 5'- GTCTTGCCGCCCTTCGGTGG -3' (SEQ ID NO 18)
Itga8 S 5'- TCGCCTGGGAGGAGGCGAAA -3' (SEQ !D NO 11)
A 5'- TCTTAACCGCTGTGCTCCCCG -3' (SEQ ID NO 12)
Osx S 5' - ACTGGCTAGGTGGTGGTCAG- 3' (SEQ ID NO 31)
A 5' - GGTAGGGAGCTGGGTTAAGG- 3' (SEQ ID NO 32)
Bmp2 S 5'- GCTCCACAAACGAGAAAAG-C-3' (SEQ ID NO 33)
A 5'- AGCAAGGGGAAAAGGACACT-3' (SEQ ID NO 34)
Coll -I S 5'- AGAGC-ATGACCGATGGATTC-3' (SEQ ID NO 21)
A 5'- CCTTCTTGAGGTTGCCAGTC -3' (SEQ ID NO 22)
Il -6 S 5'- ACTTCCATCCAGTTGCCTTC- 3' (SEQ ID NO 35)
A 5' -TTTCCACGATTTCCCAGAGA- 3' (SEQ ID NO 36)
Bsp S 5'-GAAAATGGAGACGGCGATAG-3' (SEQ ID NO 23)
A 5'-ACCCGAGAGTGTGGAAGTG-3' (SEQ ID NO 24)
Alp S 5'-AACCCAGACACAAGCATTCC-3' (SEQ ID NO 25)
A 5'- GAGAGCGAAGGGTCAGTCAG-31 (SEQ ID NO 26)
Oc S 5'- CCGGGAGCAGTGTGAGCTTA-3' (SEQ ID NO 27)
A S'-TAGATGC-GTTTGTAGGCGGTC -3' (SEQ ID NO 28)
Opn S 5'-TCTGCGGCAGGCATTCTCGG-3' (SEQ ID NO 29)
A 5'-GTCACTTTCACCGGGAGGGAGGA-3' (SEQ ID NO 30)
각 반응은 최종 부피 10㎕에 7㎕의 Lightcycler-FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I(Fast Start Taq 중합효소, 반응 완충액, dNTP 믹스, SYBRGreen I 염료 및 MgCl2 함유함), 0.5μM의 각각의 센스 및 안티센스 특이적 프라이머 및 3㎕의 cDNA 희석을 함유하였다. 증폭 프로그램은 주형 cDNA의 변형을 위한 사전 인큐베이션 단계(10분, 95℃), 이어서 변성 단계(10초, 95℃), 아닐링 단계(8 내지 10초, 60℃, 단 Osx에 대해서는 5초 동안 68℃이고 Alp에 대해서는 8초 동안 65℃임) 및 연장 단계(10초, 72℃)로 이루어진 사이클 45회로 이루어진다.
각 사이클 후에, 형광을 72℃(λex 470 nm, λem 530 nm)에서 측정하였다. cDNA 주형이 없는 네거티브 대조표준을 각 분석에서 작동시켰다.
실시간 효율을 LightCycler 480 소프트웨어로 연속적인 희석을 사용하여 주어진 기울기로부터 계산하였고, 그 결과 조사된 모든 전사물은 높은 실시간 PCR 효율 속도를 나타냈고, 상이한 농도를 사용했을 때 높은 선형성을 나타냈다. PCR 생성물에 대해 LightCycler상에서의 용융 곡선 분석을 수행하였고, 계속해서 2% 아가로스 TAE 겔 전기영동을 수행하여 각각 증폭 특이성, Tm 및 암플리콘 크기를 확인하였다.
PCR 후의 상대적인 정량을 각 샘플 중의 표적 유전자의 농도를 LightCycler 480 분석 소프트웨어 버전 1.5(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)에 의해 제공된 어드밴스드 상대적 정량 방법을 사용하여 동일한 샘플 중의 2개의 참조 유전자의 농도의 평균으로 나눔으로써 계산하였다.
2.10. 통계학
모든 데이터를 평균값±SEM으로 제공한다. Kolmogorov-Smtrnov 시험을 수행하여 정상성 시험에 대한 매개변수 또는 비-매개변수 분포를 추정하였고, 그룹간 차이를 그것들의 정상적인 분포에 따라 Mann-Whitney-시험 또는 학생 t-시험에 의해 평가하였다. 윈도우(Chicago, IL, US), 버전 17.0에 대한 SPSS® 프로그램을 사용하였다. 결과를 p-값이 ≤0.05일 때 통계학적으로 유의미한 것으로 간주하였다.
결과
펩티드 방출
P2-알긴산염-코팅된 스캐폴드로부터의 펩티드 방출 프로필을 도 7에 도시한다. 처음 2일의 인큐베이션 중에 펩티드의 폭발적인 방출을 관찰하였다(21일 후 방출된 P2의 누적된 양의 42.8%). 5일 후에 방출된 펩티드의 양은 9.4%(21일까지 방출된 누적된 양의)로 감소하였고, 이어서 인큐베이션하는 21일까지 시간의 경과에 따라 더 느리지만 지속적인 펩티드 방출이 계속되었다. 추가로, 누적된 방출은 21일의 인큐베이션 후에, 여전히 P2가 2% 알긴산염 겔에 포획되어 있음을 시사한다.
LDH 활성
도 8에서 알 수 있는 것과 같이, 연구한 실험 그룹의 어느 것에 대해서도 독성 효과는 관찰되지 않았다. 세포 생존력의 유사한 백분율을 시험한 모든 그룹에서 측정하였고, 그 결과 대조 알긴산염 스캐폴드(-) 및 P2-알긴산염-코팅된 스캐폴드(P2) 중 어느 것도 세포 배양 48시간 후 세포에 어떠한 독성 효과를 나타내지 않았다.
2% 알긴산염 겔로 코팅된 TiO 2 스캐폴드의 SEM 가시화
알긴산염-코팅된 TiO2 스캐폴드를 SEM에 의해 관찰하였다. 도 9a 및 9b에서 알 수 있는 것과 같이, TiO2 스캐폴드의 일부 기공은 알긴산염으로 코팅하는 과정 후에 차단되었지만, 세포를 시딩하고 표준 세포 배양 조건에서 인큐베이션(37℃에서 및 습기 분위기에서)하고 7일 후에, 거의 모든 기공이 차단되지 않았다(도 9c 및 9d). 그러므로, 차단하는 알긴산염 겔의 특정 분해를 코팅 과정 직후에 차단된 채로 남아있는 그런 기공에서 볼 수 있었다.
비록 미코팅 TiO2 스캐폴드(SC) 상에서 성장하는 세포의 양(도 10a 및 10b)이 알긴산염-코팅된 TiO2 스캐폴드에서(도 10c 내지 10f)보다 더 많긴 하지만, 세포는 P2가 있거나 없는, 2% 알긴산염 겔로 코팅된 스캐폴드를 침투하여 그 안으로 접착할 수 있었다.
스캐폴드 상에서 성장하는 세포 수의 7일부터 21일까지의 증가를 모든 실험 그룹에 대해 볼 수 있었다.
세포 수
DNA 정량을 사용하여 배양 7일 후 TiO2 스캐폴드 상에서 성장하는 세포의 수를 측정하였다(도 11). SEM 영상에 따르면, 배양 7일 후에, 세포 수는 TiO2 스캐폴드(SC)에 비교하여 알긴산염-코팅된 TiO2 스캐폴드의 어느 것에서든지 상당히 더 낮았다. 그러므로 SC에 비교하여 세포 수의 61% 및 49% 감소를 각각 P2가 없거나 있는 알긴산염-코팅된 스캐폴드 상에서 발견하였다. 비록 데이터는 통계학적 유의미에 이르진 못하였지만, P2로 코팅된 스캐폴드는 알긴산염 대조 스캐폴드(-)보다 32% 더 많은 세포를 나타냈다.
세포 접착-관련 마커의 유전자 발현
도 12에서 알 수 있는 것과 같이, Itb1의 상대적인 mRNA 수준은 TiO2 스캐폴든(SC)에 비교하여 7일의 배양 후에 알긴산염-코팅된 스캐폴드(P2가 있거나 없음) 위로 성장하는 세포에서 상당히 감소되었다. 그럼에도 불구하고, 세포 배양 21일 후에는 그룹 간에 차이는 관찰되지 않았다. 21일 후에 Itgb3 mRNA 수준은 TiO2 스캐폴드(SC)에 비교하여 알긴산염-코팅된 스캐폴드(P2가 있거나 없음) 상에서 성장하는 세포에서 증가하였다. Fn1의 더 높은 mRNA 수준은 21일 후에 미코팅 스캐폴드에 비교하여 2% 알긴산염-코팅된 스캐폴드 상에서 성장하는 세포에서, 및 P2-알긴산염-코팅된 스캐폴드 상에서 성장하는 세포에서 발견되었지만, 마지막 그룹에 대한 데이터는 통계학적으로 유의미한 수준에 도달하지 못하였다. Itga8 mRNA는 21일의 배양 후에 대조 알긴산염 스캐폴드에 비교하여 P2-알긴산염-코팅된 스캐폴드 상에서 성장하는 세포에서 상당히 증가하였다.
여러 골아세포 분화 마커의 유전자 발현
도 13은 여러 골아세포 분화 마커 유전자들에 대한 상대적인 mRNA 수준을 도시한다. 21일의 배양 후에 오스테릭스 mRNA 수준은 미코팅 스캐폴드에 비교하여 알긴산염-코팅된 스캐폴드(P2가 있거나 없음) 상에서 성장하는 세포에서 증가하였다. Bmp-2 and Il -6 mRNA 수준은 미코팅 스캐폴드 및 알긴산염-코팅된 스캐폴드 둘 다에 비교하여 21일의 세포 배양 후에 P2-알긴산염-코팅된 스캐폴드 상에서 배양된 세포에서 상당히 증가하였다. 세포 증식과 관련된 마커인 Coll -I mRNA 수준은 7일의 세포 배양 후에 알긴산염-코팅된 스캐폴드에 비교하여 P2-알긴산염-코팅된 스캐폴드 상에서 배양된 세포에서 상당히 증가하였다. 21일의 배양 후에 Coll -I은 미코팅 스캐폴드에 비교하여 알긴산염-코팅된 스캐폴드 및 P2-알긴산염-코팅된 스캐폴드 둘 다에서 상당히 증가하였다. 연구한 어떠한 시점에서 실험 그룹 중에 Opn, Bsp, Alp 및 Oc mRNA 발현 수준에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았다.
논의
본 실험에서, 생물학적 활성 물질이 있거나 없는 알긴산염 코팅으로 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드의 뼈 형성 및 광화를 촉진하기 위하여 하중 부담 뼈 조직 용도에 사용하기 위한 적합성을 증명하였다. TiO2 스캐폴드는 2.6Pa까지의 압축 강도(Tiainen H et al. 2010)를 가지는 것으로 보고되었고, 생체 내 연구에서 돼지에서 우수한 기계적 내성을 나타냈다.
뼈 조직 공학에서, 스캐폴드의 구조는 골형성을 위한 최적의 미세환경을 제공해야 한다. 표면의 스캐폴드 다공성, 기공 네트워크 상호연결성, 표면적-대-부피 비율 및 물리-화학적 특성은 세포 이동 및 분화, 뼈 내부성장, 혈관 신생 및 세포와 환경 사이에서의 질량 전달을 결정한다. 교반된 세포 시딩 방법을 사용하는 고도로 다공성인 TiO2 스캐폴드의 사용으로 마우스 골아 전구 세포의 양호한 부착 및 분포가 이루어지는 것으로 증명되었다. 본 연구에서, 한 층의 2% 알긴산염으로 코팅된 TiO2 스캐폴드가 삼차원 세포 성장을 위한 스캐폴드로서 사용하기에 적당한 미세구조를 나타냈다.
비록 소수의 기공이 코팅 과정 직후에 차단된 채로 유지되었지만, 거의 모든 기공은 7일 동안 37℃에서 인큐베이션한 후에 알긴산염의 생체 내 분해 특성으로 인해 차단되지 않았고, 그로써 세포가 구조로 침투하여 구조 안으로 이동하기 위한 개방된 창을 제공하였다. 코팅 및 미코팅 TiO2 스캐폴드 사이에 세포 생존력에 대한 차이는 관찰되지 않았다. 처음 수시간의 인큐베이션 동안 P2의 폭발적인 방출이 발견되었고, 이어서 21일의 기간 동안 점진적으로 지속적인 방출이 발견되었는데, 이것은 알긴산염 하이드로겔 단독에서와 동일한 패턴을 따른다.
TiO2 스캐폴드는 골아세포가 접착, 이동 및 증식하기에 적절한 표면을 제공하였다. 비록 세포가 알긴산염-코팅된 TiO2 스캐폴드 안으로 들어가는 양은 미코팅 TiO2 스캐폴드에서보다 낮았지만, 알긴산염으로 코팅된 스캐폴드는 세포 진행 및 분화를 지지하였다. 이들 결과는 알긴산염이 세포 부착을 위한 비활성 기질이고 프롤린 서열이 풍부한 합성 펩티드는 알긴산염 하이드로겔의 세포 부착에 대한 특성을 증가시킨다는 이전의 연구 보고와 일치한다. 그러므로 비록 상당하지는 않지만, 합성 펩티드 2를 함유하는 2% 알긴산염으로 코팅된 TiO2 스캐폴드는 알긴산염-코팅된 TiO2 스캐폴드와 비교하여 7일 후에 세포 부착을 개선하는 경향(+32%)을 나타냈다.
생체적합물질 조성물은 골아세포 세포 성숙 및 광화에 장기간 효과를 나타내는 세포 부착 및 세포골격 조직화를 조절하는 것으로 보고되어 있다. 상이한 그룹에 대해 SEM 및 DNA 정량에 의해 관찰된 세포 부착의 효율에 따르면, Itgb1 mRNA 수준은 미코팅 스캐폴드 상에서 성장하는 세포에 비교하여 알긴산염-코팅된 TiO2 스캐폴드 상에서 성장하는 세포에서 감소하였다. 나아가, Itgb3 and Fn1 mRNA 수준(골형성의 초기 단계에서 고도로 발현되고 세포 성숙 과정을 통해 감소된다)은 미코팅 스캐폴드에 비교하여 21일의 배양 후에 알긴산염-코팅된 TiO2 스캐폴드 안으로 성장하는 세포에서 상당히 증가하였다. 더욱이, 오스테오폰틴에의 결합을 통해 광화 단계 동안 역할을 담당하는 인티그린인 Itga8이 알긴산염-코팅된 스캐폴드에 비교하여 P2-알긴산염-코팅된 스캐폴드에 의해 유도되었고, 그것은 P2가 광화 과정에 영향을 미쳤을 것임을 시사한다. 인티그린은 재료 표면에 대한 세포의 부착에 포함될 뿐만 아니라 뼈 형성 및 광화를 유도하는 신호 변환 경로를 중재한다. 흥미롭게도, 골아세포 분화의 초기 단계에 관련되고, 정상적으로는 단기에서 상향조절되고 그 이후에 하향조절되는 Itgb3, Fn1, Coll -I 및 Osx와 같은 유전자의 발현은 미코팅 스캐폴드 상에서 성장하는 세포에 비교하여 알긴산염-코팅된 TiO2 스캐폴드 안으로 성장하는 세포에서 연구된 후기 시점(21일)에 증가되었다. 골아세포 분화에 관련된 초기 마커의 일시적인 서열은 MC3T3-E1 세포가 미코팅 스캐폴드 또는 알긴산염-코팅된 스캐폴드 상에서 성장할 때 달라지는 것이 가능하고, 그로써 알긴산염-코팅된 표면 위로 성장하는 세포는 아마도 알긴산염 위로 세포 접착이 초기에 어렵기 때문에 미코팅 TiO2 스캐폴드에 비교하여 증식 이상의 개선된 세포 분화를 나타냈다. 비록 알긴산염 코팅이 스캐폴드 상에서의 세포 접착과 증식을 손상시키는 것 같지만, 광화를 위한 성숙하고 조직화된 매트릭스(ECM) 성분의 획득은 어떠한 그룹에 대해서든지 7일부터 21일까지 Alp 및 Bsp mRNA 수준의 현저한 증가에 의해 확인되었다. 일단 ECM의 합성, 조직화 및 성숙이 종료되면, Oc 발현이 상향조절되어 광화를 유도한다. 그 결과는 21일의 배양 후에 Oc mRNA 수준의 경미한 증가를 나타냈고, 그러므로 세포는 단지 광화 과정의 시작에 불화하다고 결론지을 수 있다. 더욱이 Opn 및 Bsp의 유전자 발현 수준과 관련된 본 발명자들의 결과에 따르면, 골아세포에서의 Bsp/Opn mRNA의 증가된 관계는 앞서 미코팅 TiO2 스캐폴드 상에 시딩된 MC3T3-E1 세포로 보고된 것과 같이 ECM 광화의 자극에 대한 지표가 될 수 있을 것이다.
P2의 알긴산염에의 첨가는 알긴산염-코팅된 스캐폴드에 비교하여, Bmp2, Coll-I 및 Il -6의 DNA 함량 및 더 높은 발현 수준에 의해 측정된 세포의 양에 의해 인지될 수 있는 것과 같이, 세포 증식 및 분화에 대한 특성을 개선시켰다. 지금까지 폴리프롤린 서열이 풍부한 합성 펩티드는 반복적으로 티타늄 임플란트가 펩티드로 코팅되어 있는 시험관 내 및 생체 내 연구 둘 다에서, 및 추가로 국소 전달을 위한 담체로서 사용하기 위해 알긴산염 하이드로겔 안으로 로딩될 때에도 오스테오칼신 mRNA 수준의 증가를 보였다. 그러므로 이것들을 함께 고려하면, 이것은 P2-알긴산염-코팅된 스캐폴드가 시험관 내 및 생체 내 환경에서 더 높은 세포 분화 및 광화를 촉진할 것이라는 것을 시사한다.
결론
결론적으로, 결과들은 알긴산염-코팅된 TiO2 스캐폴드가 골아세포 세포 분화를 유도하는 생물학적 활성 물질, 예컨대 프롤린 서열이 풍부한 합성 펩티드의 전달을 위한 매트릭스로서 작용할 수 있음을 증명한다. 뼈 형성 및 광화에 미치는 생물학적 활성 물질, 예컨대 합성 프롤린-풍부 펩티드의 골원성 효과를 가지는 TiO2 스캐폴드의 물리적 및 골전도성 특성의 조합은 하중 부담 용도에서 뼈 조직 재생을 위한 새로운 전략을 나타낼 수 있다.
실시예 3: 심바스타틴의 국소 전달을 위한 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드의 제조
1. 요약
고도로 다공성인 이산화티타늄(TiO2) 스캐폴드를 알긴산염 용액을 함유하는 심바스타틴(SIM)(즉 생물학적 활성 물질)에 침지시켰다. 주사 전자 현미경 및 과요오드산-쉬프 염색에 의해 가시화된 스캐폴드의 미세구조는 고르게 분포된 알긴산염이 TiO2 스캐폴드 지주의 표면을 덮고 있는 것을 나타냈다. 점진적으로 지속적인 SIM 방출을 19일 동안 관찰하였다. SIM을 포함하는 스캐폴드에 의해 골아세포에 미치는 세포독성은 SIM이 없는 스캐폴드에 비교할 때 관찰되지 않았다. 골아세포 마커(콜라겐 유형 I 알파 1, 알칼리성 포스파타제, 오스테오프로테게린, 오스테오칼신 및 혈관 내피 성장인자 A)의 발현은 실시간 RT-PCR을 사용하여 정량하였다. 오스테오프로테게린, 혈관 내피 성장인자 A 및 오스테오칼신의 분비를 다중 면역분석(Luminex)에 의해 분석하였다. 오스테오칼신의 상대적인 발현 및 분비는 21일 후에 SIM이 없는 스캐폴드에 비교할 때 10μM의 SIM을 가지는 스캐폴드 상에서 배양된 세포에 의해 상당히 증가되었다. 또한, 혈관 내피 성장인자 A의 분비는 21일 후에 SIM이 없는 스캐폴드에 비교할 때 10nM 및 10μM의 SIM을 가지는 스캐폴드 상에서 배양된 세포에 의해 상당히 증대되었다. 결론적으로, 결과들은 SIM-코팅된 TiO2 스캐폴드가 지속적인 SIM 방출을 지지할 수 있고 골아세포 분화를 유도할 수 있음을 가리킨다. TiO2 스캐폴드의 물리적 특성과 SIM의 골형성 효과의 조합은 즉각적인 하중이 요구되거나 활용될 수 없는 결함의 뼈 재생에 대한 새로운 전략을 나타낼 수 있다. 그러므로 이 실시예는 본 발명의 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드가, 예컨대 골아세포 세포 성장에 긍정적 효과를 제공하기 위하여 생물학적 활성 물질을 전달하는 데 사용될 수 있다는 것을 증명한다.
2. 재료 및 방법
2.1. SIM 을 함유하는 알긴산염 하이드로겔로 코팅된 TiO2 스캐폴드의 제작
9mm 직경 및 8mm 높이의 크기를 가지는 다공성 TiO2 스캐폴드를 앞서 기술된 것과 같이(Tiainen H et al. 2010) 중합체 스폰지 복제에 의해 제조하였다. 간단히 설명하면, 중합체 발포체를 TiO2 슬러리로 침지시키고, 건조시킨 후 계속해서 1500℃에서 40시간 동안 소결시켰다. 두 번째 층의 TiO2 슬러리를 스캐폴드에 첨가하고 앞에서 언급한 것과 동일한 온도에서 재-소결시켰다. 마이크로-컴퓨터 토모그래피(1172 마이크로-CT 영상화 시스템, Skyscan, Kontich, Belgium)에 의해 측정된 스캐폴드의 총 표면적은 20.295cm2이었다. 제조된 스캐폴드를 오토클레이빙에 의해 121℃에서 20분 동안 멸균시켰다. SIM(Krebs Biochemicals & Industries, Andhra Pradesh, India)을 100% 에탄올에 녹인 후 milliQ 물 중의 2% (w/v) Pronova UP LVG 알긴산 나트륨(FMC BioPolymer, Sandvika, Norway)에 원하는 농도로 첨가하여 SIM 함유 알긴산염-코팅된 TiO2 스캐폴드를 만들었다. SIM이 있거나 없는 알긴산염 용액을 사용 전에 0.22㎛ 기공 크기 주사기 필터(TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland)를 사용하여 멸균하였다.
TiO2 스캐폴드를 SIM이 있거나 없는 알긴산염 용액에 궤도식 진동기 상에서 100rpm에서 1시간 동안 실온에서 교반 하에 침지하고, 이어서 300×g에서 1분 동안 원심분리하여 과잉 알긴산염 용액을 제거하였다. 계속해서, 스캐폴드를 SIM이 있거나 없는 50mM의 CaCl2에 궤도식 진동기 상에서 100rpm에서 1시간 동안 교반하에 침지하였다. 알긴산염-코팅된 스캐폴드를 마지막으로 milliQ 물로 세정하여 과잉의 CaCl2를 제거하고 밤새 공기-건조시켰다. SIM 없이 2% 알긴산염 하이드로겔로 코팅된 스캐폴드를 대조 그룹으로서 사용하였다.
2.2. SIM 을 함유하는 알긴산염 하이드로겔로 코팅된 TiO 2 스캐폴드의 특성확인
알긴산염-코팅된 스캐폴드를 금으로 스퍼터링하고(Cressington sputter coater 108 auto, Cressington Scientific Instruments, Watford, England), 그것의미세구조를 주사 전자 현미경(SEM)(TM-1000, Hitachi High-Technologies, Tokyo, Japan)에 의해 15kV 가속화 전압에서 후방산란된 이차 이온을 사용하여 가시화하였다. 알긴산염 코팅을 투가로 과요오드산-쉬프(PAS) 염색에 의해 평가하였다. 간단히 설명하면, 스캐폴드를 milliQ 물로 세척하고, 1% 과요오드산 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 중에서 5분 동안 산화시켰다. 그런 다음 스캐폴드를 milliQ 물로 세정하고 쉬프 시약(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 15분 동안 놓아두었다. 마지막으로 스캐폴드를 미온수에 5분 동안 담갔다가 계속해서 사진을 촬영하였다(Nikon digital camera D700, Sendai Nikon Corporation, Miyagi, Japan).
2.3. 알긴산염 -코팅된 TiO2 스캐폴드로부터의 SIM 방출의 정량
알긴산염-코팅된 스캐폴드 및 SIM(2.4mM, 0.6mM) 함유 알긴산염-코팅된 스캐폴드를 37℃에서 1ml의 milliQ 물 중에 습기 분위기에서 19일까지 유지하여 SIM의 방출 프로필을 측정하였다. 예정된 시점(0.25일, 2일, 4일, 6일, 8일, 10일, 13일, 15일, 17일, 19일)에 milliQ 물을 교체하고, 방출된 SIM의 양을 UV-Vis 분광계(PerkinElmer 람다 25 UV/Vis 시스템, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 정량하였다. 238nm 파장에서의 샘플 흡광도를 분석하고, 상대적인 흡광도 유닛을 각 시점에 대해 방출된 SIM의 양과 선형 표준 곡선을 사용하여 상관지었다. SIM 없이 알긴산염으로 코팅된 스캐폴드로부터의 흡광도 값을 대조표준으로서 사용하여 알긴산염 분해 생성물로부터 얻어진 바탕값을 뺐다. 실험을 3중으로 수행하였다.
2.4. 일차 인간 골아세포의 세포 배양 및 시딩
3명의 공여체로부터의 일차 인간 골아세포(Cambrex Bio Science, Walkersville, MD, USA), 대퇴골로부터의 2개(16- 및 10-세 남성) 및 경골로부터의 한 개(41세의 남성)를 75cm2 배양 플라스크 중의 10% 우태아 혈청, 0.1% 젠타마이신 설페이트 및 암포테리신-B 항생물질 및 0.1% 아스코브산(Lonza Walkersville, MD, USA)이 첨가된 골아세포 배양 배지에서 37℃에서 5% CO2의 습기 분위기에서 배양하였다. 7 내지 9회의 계대로부터 얻어진 세포를 400.000세포/ml의 밀도로 스캐폴드상에 시딩하였다. 전체 스캐폴드를 통해 균질한 세포 분포를 보장하기 위하여, 교반된 시딩 방법을 사용하였다(Takahshi et al 2003). 배양 배지로 흠뻑 젖은 스캐폴드를 48-웰 배양 플레이트에 넣었다. 스캐폴드에 1ml의 세포 현탁액을 첨가한 후에 플레이트를 궤도식 진동기 상에서 200rpm에서 6시간 동안 37℃에서 교반하였다. 세포-시딩된 스캐폴드를 새로운 배양 플레이트로 1ml 배양 배지에 옮겨서 37℃에서 5% CO2의 습기 분위기에서 21일까지 유지하였다. 배양 배지를 매 격일마다 교체하였다. 수집된 배지를 세포독성, 알칼리성 포스파타제(ALP) 활성 및 단백질 발현 분석에 사용하기 위해 보관하였다. 스캐폴드를 실시간 RT-PCR 및 면역세포화학에 사용하기 위하여 7, 14 및 21일 배양 후에 수확하였다.
2.5. 세포독성 분석
SIM 함유 스캐폴드의 세포독성을 배양 배지 중의 시토졸 효소 락테이트 데하이드로게나제(LDH)의 활성을 토대로 추정하였다. LDH 활성을 14일까지 격일로, 제조자의 세포독성 검출 키트 지시사항(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)을 따라 배지에서 측정하였다. 50㎕의 샘플을 키트 반응 혼합물과 함께 30분 동안 실온의 암실에서 인큐베이션하였다. 샘플의 흡광도를 492nm에서 플레이트 판독기(Biochrom Asys Expert 96 Microplate Reader, Biochrom, Holiiston, MA, USA)에서 측정하였다.
2.6. ALP 활성 분석
ALP가 P-니트로페닐 포스페이트(pNPP) 기질(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 황색 최종 생성물인 p-니트로페놀로 가수분해하는 능력을 사용하여 2, 8, 14 및 21일 배양 후에 배양 배지 중의 ALP 활성을 정량하였다. 25㎕의 배지를 각 샘플로부터 취하여 100㎕의 pNPP 용액과 함께 96-웰 플레이트에서 30분 동안 실온의 암실에서 인큐베이션하고, 계속해서 50㎕의 3M NaOH를 각 웰에 첨가하여 반응을 중단시켰다. 흡광도를 405nm에서 플레이트 판독기(Biochrom Asys Expert 96 마이크로플레이트 판독기, Biochrom, Holliston, MA, USA)에서 측정하고 ALP 활성을 소 장내 알칼리성 포스파타제(Promega, Madison, WI, USA)를 토대로 표준 곡선을 사용하여 정량하였다.
2.7. 면역분석: 분비된 단백질의 정량
수집한 배양 배지의 분액을 변형된 PES 3K 원심분리 필터(VWR, Radnor, PA, USA)를 제조자의 지시를 따라 사용하여 8-배 상향-농축하였다. 농축된 세포 배양 배지 중의 단백질 수준의 다중분석 자료수집을 Luminex 100/200 시스템(Luminex, Austin, TX, USA) 상에서 xAMP 기술을 사용하여 수행하였다. 획득한 형광 데이터를 xPONENT 3.1 소프트웨어(Luminex, Austin, TX, USA)에 의해 분석하였다. 배양 배지 중의 오스테오프로테게린(TNFRSF11B), 오스테오칼신(BGLAP) 및 혈관 내피 성장인자 A(VEGFA)의 양을 인간 뼈 패널 및 인간 사이토킨/케모카인 키트(Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 2, 8, 14 및 21일 배양 후에 측정하였다. 모든 분석을 제조자의 프로토콜을 따라 수행하였다.
2.8. RNA 분리 및 실시간 RT - PCR 분석
총 RNA를 세포-시딩된 스캐폴드로부터 Qiagen RNA 미니-키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 제조자의 프로토콜을 약간 변형시켜 사용하여 분리하였다. 간단히 설명하면, 스캐폴드를 용해 완충액에 1시간 동안 4℃에서 침지하고, 이어서 궤도식 진동기상에서 300rpm에서 10분 동안 실온에서 교반하였다. 계속해서, 스캐폴드를 꺼내고 용해 완충액을 2W에서 30초 동안 초음파 처리하였다(Sonics Vibracell VC130PB, CT, USA). 나머지 과정을 제조자에 의해 제공된 프로토콜을 따랐다.
cDNA를 RevertAid 제 1 가닥 cDNA 합성 키트(Fermenias, St. Leon- Rot, Germany)로 올리고 dT 프라이머를 사용하여 합성하였다. 실시간 PCR을 CFX 384 실시간 시스템(Bio-Rad, Hercules, California, USA)에서 SsoAdvanced SYBR® Green Supermix를 사용하여 수행하였다. 3-단계 증폭(40 사이클: 95℃에서 5초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초)을 실시하였다. 증폭 대조표준이나 주형 대조표준은 사용하지 않았다. 실시간 RT-PCR을 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH), 콜라겐 유형 I 알파 1 (COL1A1), 알칼리성 포스파타제(ALPL), 오스테오프로테게린(TNFRSF11B), 오스테오칼신(BGLAP) 및 혈관 내피 성장인자 A(VEGFA)에 대해 시행하였다. 프라이머 서열은 표 4에 열거한다. 실시간 RT-PCR 데이터를 효율 교정된 AACT 방법(Pfaffl et al. 2001)을 사용하여 분석하였다.
Figure pct00002
2.9. 면역세포화학 및 공초점 레이저 주사 현미경검사
21일 동안 배양한 후에, 스캐폴드를 메스를 사용하여 반으로 절단하고 4% 파라폼알데하이드(PFA)/4.6% D-만니톨에 15분 동안 고정시킨 다음, 계속해서 추가의 처리를 할 때까지 1% PFA/4.6% D-만니톨에 보관하였다. 고정된 스캐폴드를 milliQ 물(pH 7.4) 중의 0.05% 시트라콘산 무수물에서 95℃로 15분 동안 가열하고, 0.2% 트리톤 X가 첨가된 인산염 완충 식염수(PBS)중의 1.25% 우혈청 알부민(BSA)에 1㎍/ml로 희석된 단클론성 마우스 항-인간 콜라겐 유형 I 항체(1-8H5, MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA)와 함께 인큐베이션한 후, 2.5% BSA/0.05% Tween-20/PBS에 2mg/ml의 농도로 희석된 Cy3-포합된 당나귀 항-마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)와 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이션함으로써 열 유도 에피토프 회수를 시행하였다. 세포-시딩된 전체 마운트 염색된 스캐폴드를 DAPI를 사용하여 대비염색하고, 커버슬립 위에 놓고 Dako 형광 마운팅 배지(Dako, Glostrup, Denmark)로 덮었다. 공초점 레이저 주사 현미경검사를 FluoView 1000 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)(Olympus, Center Valley, PA, USA) 상에서 수행하였다. 스캐폴드 표면을 CLSM을 사용하여 반사 모드로 가시화하였다. 영상을 ImageJ(NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 분석하였다.
2.10. 통계학
세포독성, ALP 활성, 유전자 발현 및 단백질 분비 분석에 의해 얻어진 데이터를 정상성 시험(Shapiro-Wilk)을 통과시켜서 매개변수 1방식 ANOVA(SigmaPlot 12.3, Systat Software, San Jose, CA, USA)를 따라 Holm-Sidak 시험을 사용하여 그룹끼리 비교하였다. ≤0.05의 확률을 유의미한 것으로 간주하였다.
3. 결과
3.1. 2% 알긴산염 하이드로겔로 코팅된 TiO 2 스캐폴드의 특성확인
알긴산염-코팅된 스캐폴드의 SEM 분석은 침지-원심분리 기법이 TiO2 스캐폴드 지주의 표면을 코팅하는 알긴산염의 고른 분포를 유발하였음을 나타냈다(도 14: a 내지 c). TiO2 스캐폴드의 상부(도 15a) 및 중간(도 15b)에서의 PAS 염색에 의해 가시화된 것과 같이, 단지 미미한 변화만을 알긴산염의 분포에서 볼 수 있었다.
3.2. 심바스타틴 방출
SIM의 방출을 2.4mM 및 0.6mM SIM을 가지는 스캐폴드에 대해 조사하였다. SIM의 느린 지속성 방출을 두 가지 농도에 대해 모두 검출하였다. 그러나, 2.4mM SIM을 가지는 스캐폴드는 0.6mM SIM을 가지는 스캐폴드에 대해 볼 수 있었던 15-일 방출에 비교하여 더 느린 17-일 방출을 초래하였다(도 16). 누적된 방출은 SIM이 19일 동안의 인큐베이션 후에도 알긴산염 안에 포획되어 유지되었음을 시사하였다. 계속된 방출은 이 지점 후 농도가 검출 한계 아래로 떨어졌기 때문에 검출할 수 없었다.
3.3. LDH 활성
알긴산염-코팅된 스캐폴드의 SIM의 세포독성 효과를 광범위한 농도(2.4 mM, 0.6 mM, 24μM, 10μM, 1μM, 0.1μM 및 10nM)에 대해 시험하였다. SIM은 세포가 스캐폴드 상에 시딩되었을 때 더 높은 농도(10μM보다 높은)에서 골아세포에 대해 고도로 세포독성인 것으로 밝혀졌다(데이터는 제시하지 않음). 14-일 세포독성 연구를 더 낮은 농도(10μM 및 10nM)의 SIM에 대해 수행하여 지속적인 시간 기간 동안 SIM에 노출하였을 때 골아세포 생존력에 미치는 효과를 조사하였다. 더 높은 LDH 활성을 일반적으로 14-일의 기간을 통해 10nM의 SIM을 가지는 스캐폴드에 비교하여 10μM의 SIM을 가지는 스캐폴드로부터의 배지에서 검출하였다. SIM의 어떤 농도도 SIM이 없는 알긴산염-코팅된 스캐폴드의 효과에 비교하여 LDH 활성의 상당한 증가를 유발하지 못하였다. LDH 활성 프로필에서 약간의 변화를 볼 수 있었는데, 그것은 SIM에 대한 세포 반응의 공여체 의존성 차이를 가리킨다(도 17; a 내지 c).
3.4. 골아세포 분화에 미치는 SIM 함유 알긴산염 -코팅된 TiO 2 스캐폴드의 효과
골아세포를 SIM 함유 스캐폴드 상에서 배양하는 것은 SIM이 없는 스캐폴드에 비교할 때 10nM 또는 10μM의 SIM을 가지는 어떠한 스캐폴드에 대해서 측정된 어떠한 시점에서도 배양 배지 중의 ALP 활성을 유의미하게 변화시키지 못하였다(도 18; a 내지 c).
SIM이 없는 스캐폴드에 비교할 때 10nM 또는 10μM의 SIM을 가지는 스캐폴드로부터의 어떠한 시점에서의 배양 배지의 TNFRSF11B 함량에서 어떠한 유의미한 차이를 볼 수 없었다(도 19a). 그러나 배양 배지 중의 VEGFA의 함량은 21일의 배양 후에 SIM이 없는 스캐폴드에 비교할 때 10nM 및 10μM의 SIM을 가지는 스캐폴드 상에서 배양된 세포로부터 상당히 증가하였다(도 19b). BGLAP의 분비는 SIM이 없는 스캐폴드에 비교할 때 10μM의 SIM을 가지는 스캐폴드 상에서 배양된 세포로부터 상당히 증대된 한편, 21일의 배양 후에 SIM이 없는 스캐폴드에 비교할 때 10nM의SIM을 가지는 스캐폴드 상에서 배양된 세포에 대해서는 유의미한 차이를 볼 수 없었다(도 19c).
21일의 배양 후에, BGLAP의 상대적인 발현은 SIM이 없는 스캐폴드에 비교하고 GAPDH에 표준화할 때 10μM의 SIM을 가지는 스캐폴드 상에서 배양된 세포에서 상당히 증가하였다. 연구된 어떤 시점에서도 실험 그룹들 중에서 ALPL, COL1A1, TNFRSF11B 또는 VEGFA mRNA의 발현 수준에서는 유의미한 차이를 관찰할 수 없었다(도 20). 유형 I 콜라겐의 침착에 미치는 SIM의 효과를 평가하기 위하여, GLSM 가시화를 염색된 스캐폴드에 대해 수행하였다. 유형 I 콜라겐을 모든 스캐폴드의 대부분의 세포에서 세포내적으로 검출하였다. 그러나 세포외적 콜라겐 소섬유는 농도와 관계없이 SIM을 가지는 스캐폴드에서 거의 없었던 한편(도 21; a, b), 타입 I 콜라겐 소섬의 풍부한 네트워크를 SIM이 없는 스캐폴드에서 볼 수 있었다(도 21c).
5. 결론
결론적으로, 연구는 알긴산염-코팅된 TiO2 스캐폴드가 골아세포 세포 분화를 유도하는 SIM에 대한 매트릭스로서 작용할 수 있음을 보여준다. 10㎛의 SIM을 함유하는 알긴산염으로 코팅된 스캐폴드는 낮은 세포독성을 나타냈고, 스캐폴드 상에서 배양된 골아세포로부터의 VEGFA 및 BGLAP의 분비를 상당히 증가시켰다. SIM의 국소적인 골형성 효과와 TiO2 스캐폴드의 물리적 특성의 조합은 하중 부담 뼈의 뼈 조직 재생을 위한 새로운 전략을 나타낼 수 있다.
실시예 4: 엠도게인(EMD)의 국소 전달 및 인간 함지방세포 -유도 간엽 줄기세포의 지지를 위한 알긴산염 코팅된 이산화티타늄 스캐폴드의 제조
1. 재료 및 방법
1.1. 이산화티타늄 스캐폴드의 제작
9mm의 직경 및 4mm의 높이의 크기를 가지는 다공성 TiO2 스캐폴드를 앞서 기술된 것과 같이(Tiatnen et al 2010) 중합체 스폰지 복제에 의해 제조하였다. 간단히 설명하면, 중합체 발포체를 TiO2 슬러리로 적시고, 건조시킨 후 계속해서 1500℃에서 40시간 동안 소결시켰다. 제조된 스캐폴드를 121℃에서 20분 동안 오토클레이빙함으로써 멸균하였다.
1.2. 인간 함지방세포 -유도 간엽 줄기세포의 분리, 특성확인 및 세포 배양
피하 지방 조직으로부터 hAD-MSC를 분리하였다. 그것의 간엽 특성을 확인하기 위하여 세포를 그것의 표면 15 항원의 발현 및 환경 자극에 대한 반응으로 골원성, 연골원성 및 지방세포원성 계통으로 선택적으로 분화하는 능력과 관련하여 특성확인하였다. 다음의 마커 단백질을 평가하였다: CD14(-), CD19(-), CD34(+), CD45(-), CD44(+), CD73(+), CD90(+), CD105(+), HLA-DR(-) 및 IgG(-). 세포의 골원성 분화 표현형을 runt-20 관련 전사 인자 2(RUNX2), 콜라겐 유형 I 알파 1(COL1A1), 알칼리성 포스파타제(ALPL) 활성/mRNA 발현 및 알라자린 레드 염색을 사용한 조직학적 평가에 의해 평가하였다. 연골원성 분화를 SRY(성 결정 영역 Y)-박스 9(SOX9), 콜라겐 유형 II 알파 1(COL2A1) 및 아르레칸(ACAN) mRNA 발현을 평가함으로써 분석하였다. 지방세포원성 분화를 페록시솜 증식제-활성화된 수용체 감마(PPARG) mRNA 발현 및 오일 레드 염색을 사용한 조직 가시화에 의해 측정하였다.
1.3. 일차 인간 골아세포의 세포 배양
세 가지의 남성 공여체로부터의 hOST(Cambrex Bio Science, Walkersville, MD, USA), 30개의 경골로부터의 하나 및 대퇴골로부터의 두 개를 각각 75cm2의 배양 플라스크 중에서 10% 우태아 혈청, 0.1%의 젠타마이신 설페이트 및 암포테리신-B 항생물질 및 0.1%의 아스코브산(Lonza Walkersville, MD, USA)이 첨가된 골아세포 배양 배지에서 37℃에서 5% CO2의 습기 분위기에서 배양하였다. 세포 시딩 시점에, 경골로부터의 hOST는 9번째의 계대에 도달하였고, 두 개의 대퇴골 공여체로부터의 hOST는 각각 6 및 8번째의 계대에 도달하였다.
1.4. 인간 함지방세포 -유도된 간엽 줄기 세포 및 일차 인간 골아세포의 시딩
배양 배지로 사전 침지된 스캐폴드를 24-웰 배양 플레이트에 놓고, 세포 현탁액을 스캐폴드의 상부에 1ml의 배양 배지 중의 2×105 세포/스캐폴드의 밀도로 한방울씩 떨어트려 첨가하였다. 스캐폴드 전체를 통한 균질한 세포 분포를 보장하기 위하여, 교반된 시딩 방법(Takahashi et al 2003)을 사용하였다. 시딩 후에 플레이트를 궤도식 진동기 상에서 200rpm에서 6시간 동안 37℃에서 및 습기 조건에서 교반하였다. 세포-시딩된 스캐폴드를 새로운 배양 플레이트에 1ml의 배양 배지로 옮기고 5% CO2의 습기 분위기에서 37℃에서 유지하였다. 다음날, 모든 세포-시딩된 스캐폴드를 4.6%의 D-만니톨 용액에 2회 침지한 후, 300×g에서 1분 동안 원심분리하였다. 그런 다음 세포-삽입된 스캐폴드를 각각의 그룹에 따라 상이하게 처리하였다. 대조 그룹의 미코팅 스캐폴드는 즉시 1ml의 배양 배지 중의 새로운 배양 플레이트에 옮기고 5% CO2의 습기 분위기에서 37℃에서 21일까지 유지하였다. EMD가 없는 알긴산염 그룹의 스캐폴드는 300㎕의 2%(w/v) Pronova UP LVG 알긴산 나트륨(FMC BioPolymer, Sandvika, Norway), 600㎕의 2%(w/v) 알긴산 칼슘(FMC BioPolymer, Sandvika, Norway), 600㎕의 0.003%(w/v) 시트르산/4.6% D-만니톨 및 300㎕의 4.6% D-만니톨로 이루어진 새롭게 만들어진 용액에 10분 동안 담근 후, 이어서 300×g에서 1분 동안 원심분리하여 과잉 알긴산염 용액을 제거함으로써 알긴산염 하이드로겔로 코팅하였다. 알긴산염-코팅된 스캐폴드를 50mM CaCl2 용액에서 안정화시키고, 새로운 배양 플레이트에 1ml 배양 배지로 옮긴 후 37℃에서 5% CO2의 습기 분위기에서 21일까지 유지시켰다. EMD를 포함하는 알긴산염 그룹의 스캐폴드는 EMD가 없는 알긴산염 그룹의 스캐폴드와 동일한 방식으로 처리하되, 단 600㎕의 0.003%(w/v) 시트르산/4.6% D-만니톨에 추가로 150㎍/ml의 EMD(Lot number: EMD 9121 , Institut Straumann, Basel, Switzerland)를 첨가하여 최종 EMD 농도를 전체 알긴산염 용액에 대해 50㎍/ml로 만들었다. 각 공여체, 각 처리 및 두 개의 수확 시점에 대해 3중으로 시행하여 총 54개의 스캐폴드가 포함되었다. 배지를 격일로 교체하고, 세포독성, 알칼리성 포스파타제(ALP) 활성, 총 단백질 함량 및 발현 분석에서 사용하기 위해 보관하였다. 스캐폴드를 14일 및 21일 동안 배양한 후 실시간 RT-PCR 및 면역세포화학에 사용하기 위해 수확하였다.
1.5. 알긴산염 하이드로겔로 코팅된 세포- 시딩된 스캐폴드의 가시화
알긴산염 코팅을 과요오드산-쉬프(PAS) 염색에 의해 가시화하였다. 간단히 설명하면, 스캐폴드를 milliQ 물로 세척하고 1% 과요오드산 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 5분 동안 산화시켰다. 그런 다음 스캐폴드를 milliQ 물로 세정하고 쉬프 시약(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 15분 동안 넣었다. 마지막으로, 스캐폴드를 미지근한 수돗물에 5분 동안 담그고, 계속해서 사진을 촬영하였다. 추가로 알긴산염 코팅 중의 hAD-MSC를 2일 동안 배양한 후 PAS/Pan-카데린 이중 염색에 의해 평가하였다. 스캐폴드를 메스를 사용하여 반으로 절단하고 4% 파라폼알데하이드(PFA)/4.6% D-만니톨에 15분 동안 고정시킨 후 계속해서 1% PFA/4.6% D-만니톨에 추가로 처리할 때까지 보관하였다. 고정된 스캐폴드를 먼저 PAS 방법을 따라 염색하고 이어서 Pan-카데린으로 염색하였다. 간단히 설명하면, PAS 염색된 스캐폴드를 0.2%의 트리톤 X가 첨가된 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 1.25% 우혈청 알부민(BSA)에 4㎍/ml로 희석된 단클론성 마우스 항-인간 Pan 카데린 항체(I-8H5, MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA)와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하고, 이어서 2㎍/ml의 농도로 2.5% BSA/0.05% Tween-20/PBS에 희석된 Cy3-포합된 당나귀 항-마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)와 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세포-시딩된 전체 마운트 염색된 스캐폴드를 DAPI를 사용하여 대비염색하고, 커버슬립 위에 놓은 후 Dako 형광 마운팅 배지(Dako, Glostrup, Denmark)로 덮었다. 공초점 레이저 주사 현미경검사를 FluoView 1000 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)(Olympus, Center Valley, PA, USA) 상에서 수행하였다. 스캐폴드 표면을 CLSM을 사용하여 반사 모드로 가시화하였다. 영상을 ImageJ(NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 분석하였다.
1.6. 세포독성 분석
세포-시딩된 스캐폴드의 세포독성을 배양 배지 중의 시토졸 효소 락테이트 데하이드로게나제(LDH)의 활성을 토대로 추정하였다. LDH 활성을 14일 동안 배양할 때까지 격일로 수집한 배지에서, 제조자의 세포독성 검출 키트 지시사항(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)을 따라 측정하였다. 50㎕의 샘플을 50㎕의 키트 반응 혼합물과 함께 30분 동안 실온의 암실에서 인큐베이션하였다. 샘플의 흡광도를 492nm에서 플레이트 판독기(Biochrom Asys Expert 96 Microplate Reader, Biochrom, Holiiston, MA, USA)에서 측정하였다.
또한, hAD-MSC 생존력을 배양 2일 째에 아크리딘 오렌지/에티듐 브로마이드 염색에 의해 가시화하였다. 스캐폴드를 메스에 의해 반으로 절단하고 4% 파라폼알데하이드(PFA)/4.6% D-만니톨에 15분 동안 고정한 후 계속해서 1% PFA/4.6% D-만니톨에 추가로 처리할 때까지 보관하였다. 공초점 레이저 주사 현미경검사를 FluoView 1000 CLSM(Olympus, Center Valley, PA, USA) 상에서 수행하였다. 스캐폴드 표면을 CLSM을 사용하여 반사 모드로 가시화하였다. 영상을 ImageJ(NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 분석하였다.
1.7. 총 단백질 함량 분석
세포-시딩된 스캐폴드의 총 단백질 함량을 2, 8, 14 및 21일 동안 배양한 후에 바이신코닌산(BCA) 단백질 분석 키트(Thermo Scientific Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 사용하여 제조자의 지시를 따라 측정하였다. 25㎕의 샘플을 200㎕의 키트 작동 시약과 함께 30분 동안 37℃의 암실에서 인큐베이션하였다. 샘플의 흡광도를 562nm에서 플레이트 판독기(Biochrom Asys Expert 96 마이크로플레이트 판독기, Biochrom, Holliston, MA, USA)에서 측정하고, 총 단백질의 양을 BSA(Thermo Scientific Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 토대로 한 표준 곡선에 의하여 계산하였다.
1.8. 알칼리성 포스파타제 활성 분석
ALP가 P-니트로페닐 포스페이트(pNPP) 기질(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 황색 최종 생성물인 p-니트로페놀로 가수분해하는 능력을 사용하여 hAD-MSC에 대해 2, 4, 6, 10, 16 및 20일 동안 배양한 후에, 및 hOST에 대해 4, 8, 12, 16 및 21일 동안 배양한 후에 배양 배지 중의 ALP 활성을 정량하였다. 25㎕의 샘플을 100㎕의 pNPP와 함께 30분 동안 실온의 암실에서 인큐베이션하고, 계속해서 50㎕의 3M NaOH를 각 웰에 첨가하여 반응을 중단시켰다. 흡광도를 405nm에서 플레이트 판독기(Biochrom Asys Expert 96 마이크로플레이트 판독기, Biochrom, Holliston, MA, USA)에서 측정하고 ALP 활성을 소 장내 알칼리성 포스파타제(Promega, Madison, WI, USA)를 토대로 표준 곡선에 의해 정량하였다.
1.9. RNA 분리 및 실시간 RT-PCR 분석
총 RNA를 세포-시딩된 스캐폴드로부터 Qiagen RNA 미티-키트(Qiagen, Hilden, Germany)에 의해 제조자에 의해 제공된 프로토콜을 따라 분리하였다. cDNA를 RevertAid 제 1 가닥 cDNA 합성 키트(Fermenias, St. Leon- Rot, Germany)로 무작위 프라이머를 사용하여 합성하였다. 실시간 PCR을 Applied Biosystems 7300 실시간 시스템(Life Technologies, Paisley, UK)에서 TaqMan® Universal Master ㅁ믹스를 사용하여 수행하였다. 증폭 프로그램은 주형 cDNA 변성을 위한 예비인큐배이션 단계(95℃에서 10분), 이어서 변성 단계(95℃에서 15초) 및 아닐링 단계(60℃에서 60초)를 포함하는 40 사이클로 이루어졌다. cDNA 주형이 없는 네거티브 대조표준을 각 분석에서 실시하였다. hAD-MSC에 대한 실시간 RT-PCR을 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH), RUNX2, SOX9, PPARG, COL1A1, 오스테오프로테게린(TNFRSF11B), 분비된 인단백질 1(SPP1), ALPL 및 오스테오칼신(BGLAP)에 대해 시행하였다. hOST에 대한 실시간 RT-PCR을 GAPDH, COL1A1, TNFRSF11B, SPP1, ALPL 및 BGLAP에 대해 실시하였다. 실시간 RT-PCR 데이터를 △△CT 방법(Pfaffl et al. 2001)을 사용하여 분석하였다.
1.10. 면역분석: 분비된 단백질의 정량
배양 배지 중의 단백질 수준의 다중분석 자료수집을 Luminex 100/200 시스템(Luminex, Austin, TX, USA) 상에서 xAMP 기술을 사용하여 수행하였다. 획득한 형광 데이터를 xPONENT 3.1 소프트웨어(Luminex, Austin, TX, USA)에 의해 분석하였다. 배양 배지 중의 오스테오프로테게린(TNFRSF11B), 분비된 인단백질 1(SPP1) 및 오스테오칼신(BGLAP)의 양을 인간 뼈 패널에 의해 2, 8, 14 및 21일 배양 후에 측정하였다. 모든 분석을 제조자의 프로토콜을 따라 수행하였다.
1.11. 면역세포화학 및 공초점 레이저 주사 현미경검사
14일 및 21일 동안 배양한 후에, 스캐폴드를 메스를 사용하여 반으로 절단하고 4% 파라폼알데하이드(PFA)/4.6% D-만니톨에 15분 동안 고정시킨 다음, 계속해서 추가의 처리를 할 때까지 1% PFA/4.6% D-만니톨에 보관하였다. 고정된 스캐폴드를 milliQ 물(pH 7.4) 중의 0.05% 시트라콘산 무수물에서 95℃로 15분 동안 가열하고, 0.2% 트리톤 X가 첨가된 인산염 완충 식염수(PBS)중의 1.25% 우혈청 알부민(BSA)에 1㎍/ml로 희석된 단클론성 마우스 항-인간 항체(I-8H5, MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA)와 함께 인큐베이션한 후, 2.5% BSA/0.05% Tween-20/PBS에 2mg/ml의 농도로 희석된 Cy3-포합된 당나귀 항-마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)와 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이션함으로써 열 유도 에피토프 회수를 시행하였다. 세포-시딩된 전체 마운트 염색된 스캐폴드를 DAPI를 사용하여 대비염색하고, 커버슬립 위에 놓고 Dako 형광 마운팅 배지(Dako, Glostrup, Denmark)로 덮었다. 공초점 레이저 주사 현미경검사를 FluoView 1000 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)(Olympus, Center Valley, PA, USA) 상에서 수행하였다. 스캐폴드 표면을 CLSM을 사용하여 반사 모드로 가시화하였다. 영상을 ImageJ(NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 분석하였다.
1.12. 통계학
세포독성, ALP 활성, 유전자 발현, 총 단백질 함량 및 분비 분석에 의해 얻어진 데이터를 Holm-Sidak 시험과 이어서 매개변수 1방식 ANOVA를 사용하여 그룹 간에 비교하였다. 등분산 및/또는 정규성 검장이 실패한 경우, 등급에 대한 Kruskal-Wallis 1방식 ANOVA를 수행하였다(SigmaPlot 12.3, Systat Software, San Jose, CA, USA). ≤0.05의 확률을 유의미한 것으로 간주하였다.
2. 결과
2.1. 알긴산염 -코팅된 세포- 시딩된 스캐폴드의 특성확인
알긴산염-코팅된 스캐폴드의 PAS 염색은 TiO2 스캐폴드 지주의 전체 표면을 코팅하는 알긴산염 하이드로겔의 고른 분포를 나타냈다(도 23a). 추가로, 알긴산염-코팅된 TiO2 스캐폴드에 대한 hAD-MSC 접착은 PAS/Pan-카데린 이중 염색에 의해 증명되었다(도 22d). 더욱이, 시딩된 hAD-MSC의 대부분은 아크리딘-오렌지/에티듐 브로마이드 염색에 따르면 배양 2일째에 가변적이었다(도 23).
2.2. 인간 함지방세포 -유도 줄기세포 특성확인
세포 표면 항원 발현 패턴 CD14(-), CD19(-), CD34(+), CD45(-), CD44(+), CD73(+), CD90(+)( CD105(+), HLA-DR(-) 및 IgG(-)는 조혈 또는 내피 기원 세포의 부재를 시사하였다. 골- 및 함지방-분화는 각각 알리자린 레드 및 오일 레드로 조직을 가시화함으로써 증명하였다. 또한 세포는 배양 중에 뼈-, 연골- 및 함지방-기탁 세포로 선택적으로 분화하였다. 그것들의 항원 표면 발현 패턴, 조직학적 평가 및 골원성, 연골원성 및 함지방세포원성 계통을 따라 분화하려는 잠재력 때문에 세포들은 hDA-MSC로 언급되었다.
2.3. 세포부합성/ 락테이트 데하이드로게나제 활성
14-일의 세포독성 연구를 EMD가 있거나 없는 알긴산염-코팅된 스캐폴드에 대해 수행하여 hAD-MSC 및 hOST 생존력에 미치는 알긴산염과 EMD의 효과를 조사하였다. 더 높은 LDH 활성을 일반적으로 14-일의 전 기간을 통하여 EMD가 없는 알긴산염-코팅된 스캐폴드에 비교하여 EMD를 가지는 알긴산염-코팅된 스캐폴드로부터의 배지에서 검출하였다. 미코팅 스캐폴드의 효과에 비교하여 스캐폴드 중 어느 것도 LDH 활성의 상당한 증가를 유발하지 못하였고, 단 12일째에 EMD가 없는 알긴산염-코팅된 스캐폴드 및 미코팅 스캐폴드로부터의 hAD-MSC는 예외였다(도 24a). 더욱이, 미코팅 스캐폴드에 비교할 때 2, 4 및 14일째에 EMD가 있거나 없는 알긴산염-코팅된 스캐폴드로부터의 hOST 배지에서 LDH 활성의 상당한 감소를 관찰하였다(도 24b). hAD-MC 및 hOST의 LDH 활성 프로필에서 약간의 변동을 볼 수 있었는데, 그것은 알긴산염 및 EMD에 대한 세포 반응의 세포 유형 의존성 차이를 가리킨다(도 24; a, b).
2.4. 총 단백질 함량
일반적으로 미코팅 스캐폴드에 비교할 때 EMD가 있거나 없는 스캐폴드에 대해 어느 시점에서든지 hAD-MSC 배양 배지의 총 단백질 함량에서는 유의미한 차이를 볼 수 없었고, 단 8일째에 미코팅 스캐폴드에 비교하여 EMD가 있거나 없는 알긴산염-코팅된 스캐폴드로부터의 배지에서 총 단백질 양의 상당한 증가가 검출되었으며, 12일째에 EMD가 없는 알긴산염-코팅된 스캐폴드 및 미코팅 스캐폴드에 비교하여 EMD를 가지는 알긴산염-코팅된 스캐폴드로부터의 배지에서 총 단백질 양의 상당한 증가를 볼 수 있었다(도 24c). 미코팅 스캐폴드에 비교할 때 EMD가 있거나 없는 스캐폴드에 대해 어느 시점에서든지 hOST 배양 배지의 총 단백질 함량에서는 일반적으로 상당한 차이를 볼 수 없었고, 단 2일 및 4일째에 미코팅 스캐폴드에 비교할 때 EMD가 있거나 없는 알긴산염-코팅된 스캐폴드로부터의 배지에서 총 단백질 양의 상당한 감소를 검출하였다(도 24d).
2.5. 알칼리성 포스파타제 활성
EMD가 있거나 없는 알긴산염-코팅된 스캐폴드상에서 hAD-MSC를 배양하는 것은 미코팅 스캐폴드에 비교할 때 EMD가 있거나 없는 스캐폴드에 대해 측정된 어느 시점에서든지 배양 배지의 ALP 활성을 유의미하게 변화시키지 못하였고, 단 공여체 1에 대해 배지 중의 ALP 활성은 20일째에 EMD가 없는 알긴산염-코팅된 스캐폴드 및 미코팅 스캐폴드에 비교할 때 EMD를 가지는 알긴산염-코팅된 스캐폴드 상에서 배양된 세포로부터 상당히 증가하였으며, 공여체 3에 대해서는 배지 중의 ALP 활성이 10일째에 EMD가 없는 알긴산염-코팅된 스캐폴드 및 미코팅 스캐폴드에 비교할 때 EMD를 가지는 스캐폴드상에서 배양된 세포로부터 상당히 감소하였다.
EMD가 있거나 없는 알긴산염-코팅된 스캐폴드상에서 hOST를 배양하는 것은 미코팅 스캐폴드에 비교할 때 EMD가 있거나 없는 스캐폴드에 대해 측정된 어느 시점에서든지 배양 배지의 ALP 활성을 유의미하게 변화시키지 못하였고, 단 공여체 1에 대해 배지 중의 ALP 활성은 4일째에 미코팅 스캐폴드에 비교할 때 EMD가 없는 알긴산염-코팅된 스캐폴드 상에서 배양된 세포로부터 상당히 감소하였으며, 공여체 2에 대해서는 12일째에 미코팅 스캐폴드에 비교할 때 EMD가 없는 알긴산염-코팅된 스캐폴드 상에서 배양된 세포로부터 ALP 활성이 상당히 감소하였고, 공여체 3에 대해서는 배지 중의 ALP 활성은 4일 및 16일째에 미코팅 스캐폴드에 비교할 때 EMD가 있거나 없는 알긴산염-코팅된 스캐폴드상에서 배양된 세포로부터 상당히 감소하였다. ALP 활성 프로필에서 약간의 변동을 볼 수 있었는데, 그것은 EMD가 있거나 없는 알긴산염-코팅된 스캐폴드에 대한 세포 반응의 공여체 의존성 차이를 가리킨다.
2.6. 실시간 RT - PCR 분석
연구한 실험 그룹 중에서 hAD-MSC의 COL1A1, TNFRSF11B, SPP1, ALPL 및 BGLAP mRNA 발현 수준에서 유의미한 차이를 관찰하지 못하였다. 또한, 연구한 어느 시점에서든지 실험 그룹 중에서 RUNX2, SOX9 및 PPARG mRNA 발현 수준에서 유의미한 차이를 관찰하지 못하였다.
연구한 어느 시점에서든지 실험 그룹 중에서 hOST의 SPP1, ALPL 및 BGLAP mRNA 발현 수준에서 유의미한 차이를 관찰하지 못하였다. 그럼에도 불구하고, 14일 배양 후에, COL1A1의 상대적인 발현은 EMD가 없는 스캐폴드, 미코팅 스캐폴드에 비교하고 GAPDH로 표준화할 때 EMD를 가지는 스캐폴드상에서 배양된 hOST에서 상당히 증가하였다. 14일 배양 후의 TNFRSF11B의 상대적인 발현은 미코팅 스캐폴드에 비교하고 GAPDH로 표준화할 때 EMD를 가지는 스캐폴드상에서 배양된 세포에서 상당히 증가하였다.
2.7. 공초점 레이저 주사 현미경검사에 의한 RUNX2 및 SOX9 의 가시화
RUNX2 및 SOX9의 침착에 미치는 EMD의 효과를 평가하기 위하여, CLSM 가시화를 염색된 스캐폴드에 대해 수행하였다(도 25).
2.8. 면역분석: 분비된 단백질의 정량
어느 시점에서든지 미코팅 스캐폴드에 비교할 때 EMD가 있거나 없는 스캐폴드로부터의 hAD-MSC 또는 hOST 배양 배지의 TFRSF11B, SPP1 및 BGLAP 함량에서 유의미한 차이는 찾아볼 수 없었다. 어느 시점에서든지 EMD가 있거나 없는 스캐폴드로부터의 배양 배지의 두 번째 공여체의 TFRSF11B 함량에서 실질적인 차이를 볼 수 없었고, 첫 번째 공여체에 대해 8일, 14일 및 21일째에 EMD가 있거나 없는 스캐폴드로부터의 배양 배지의 TFRSF11B 함량에서 실질적인 차이는 검출되지 않았다. 그러나 세 번째 공여체의 배양 배지 중의 TFRSF11B의 함량은 EMD가 있는 스캐폴드에 비교할 때 모든 시점에서 EMD가 없는 스캐폴드 상에서 배양된 세포로부터 더 증가하였다. 어떠한 시점에서든 EMD가 있거나 없는 스캐폴드로부터의 배양 배지의 첫 번째 및 세 번째 공여체의 SPP1 함량에서 실질적인 차이는 관찰되지 않았고, 단 세 번째 공여체의 SPP1의 함량은 21일째에 EMD가 없는 스캐폴드에 비교할 때 EMD를 가지는 스캐폴드 상에서 배양된 세포로부터 더 많이 발현되었다. 나아가, 두 번째 공여체의 배양 배지 중의 SPP1 함량은 8일 및 21일째에 EMD가 없는 스캐폴드에 비교할 때 EMD를 가지는 스캐폴드 상에서 배양된 세포로부터 더 많이 증강되었다. 어느 시점에서든 EMD가 있거나 없는 스캐폴드로부터의 첫 번째 및 세 번째 공여체의 배양 배지의 BGLAP 함량에서 실질적인 차이는 관찰되지 않았다. 그러나 두 번째 공여체의 배양 배지 중의 BGLAP 함량은 2일 및 8일째에 EMD가 없는 스캐폴드에 비교할 때 EMD를 가지는 스캐폴드 상에서 배양된 세포로부터 더 많이 증대되었다.
첫 번째 및 두 번째 공여체의 배양 배지 중의 TNFRSF11B 함량은 모든 시점에서 EMD가 없는 스캐폴드에 비교할 때 EMD를 RKL는 스캐폴드 상에서 배양된 세포로부터 더 많이 발현되었고, 세 번째 공여체의 배양 배지 중의 TNFRSF11B 함량은 2일 및 8일째에 EMD를 가지는 스캐폴드에 비교할 때 EMD가 없는 스캐폴드 상에서 배양된 세포로부터 더 많이 발현되었다. 그러나, 14일 및 21일째에 EMD가 있거나 없는 스캐폴드로부터의 배양 배지의 세 번째 공여체의 TNFRSF11B 함량에서 실질적인 차이는 관찰되지 않았다. 배양 배지 중의 첫 번째 공여체의 SPP1 함량은 모든 시점에서 EMD가 없는 스캐폴드에 비교할 때 EMD를 가지는 스캐폴드 상에서 배양된 세포로부터 더 증가하였다. 배양 배지 중의 두 번째 공여체의 SPP1 함량은 2, 8 및 14일째에 EMD가 없는 스캐폴드에 비교할 때 EMD를 가지는 스캐폴드 상에서 배양된 세포로부터 더 증가하였다. 2일 및 8일째에 EMD가 있거나 없는 스캐폴드로부터의 배양 배지의 세 번째 공여체의 SPP1 함량에서는 실질적인 차이가 관찰되지 않았다. 배양 배지 중의 첫 번째 공여체의 BGLAP의 함량은 2일째에 EMD를 가지는 스캐폴드에 비교할 때 EMD가 없는 스캐폴드 상에서 배양된 세포로부터 더 많이 증가하였다. 그러나, 배양 배지 중의 첫 번째 공여체의 BGLAP의 함량은 8일째에 EMD가 없는 스캐폴드에 비교할 때 EMD를 가지는 스캐폴드 상에서 배양된 세포로부터 더 많이 증가하였다. 배양 배지 중의 두 번째 공여체의 BGLAP의 함량은 2일 및 21일째에 EMD를 가지는 스캐폴드에 비교할 때 EMD가 없는 스캐폴드 상에서 배양된 세포로부터 더 많이 증가하였다. 그러나, 배양 배지 중의 두 번째 공여체의 BGLAP의 함량은 14일째에 EMD가 없는 스캐폴드에 비교할 때 EMD를 가지는 스캐폴드 상에서 배양된 세포로부터 더 많이 증가하였다. 배양 배지 중의 세 번째 공여체의 BGLAP의 함량은 8일, 14일 및 21일째에 EMD가 없는 스캐폴드에 비교할 때 EMD를 가지는 스캐폴드 상에서 배양된 세포로부터 더 많이 증가하였다. 그러나, 배양 배지 중의 세 번째 공여체의 BGLAP의 함량은 2일째에 EMD를 가지는 스캐폴드에 비교할 때 EMD가 없는 스캐폴드 상에서 배양된 세포로부터 더 많이 증가하였다.
5. 결론
요약하면, 상기 결과들로부터 본 발명자들은 hAD-MSC 및 hOST가 EMC 유도체 전달을 위한 코팅 과정에서 생존하는 능력을 가지고 있다고 결론지을 수 있다. 더욱이, hOST는 EMD를 가지는 알긴산염-코팅된 스캐폴드 내에서 골원성 계통으로 분화할 수 있었는데, 그것은 생체 내에서 효능을 평가하기 전에 중요하다.
실시예 5: 개방된 다공성 구조를 제공하는 방사선 불투과성 알긴산염으로 코팅된 TiO 2 스캐폴드의 제작
다공성 TiO2 스캐폴드를 앞서 기술된 것과 같이(Tiainen H et al., 2010) 중합체 스폰지 복제에 의해 9mm의 직경 및 8mm의 높이의 크기로 제조하였다. 그런 다음, TiO2 스캐폴드를 방사선 불투과성 대비 액체(Omnipaque(iohexol), GE Heaithcare)를 포함하는 2% 알긴산염 겔의 한 층으로 코팅하였다. 간단히 설명하면, TiO2 스캐폴드를 P2(SEQ ID NO 1)가 있거나 없는 2% 알긴산염 용액에 궤도식 진동기(IKA Vibrax VX basic, Staufen, Germany) 상에서 100rpm에서 1시간 동안 실온에서 교반하에 침지하였다. 그런 다음 스캐폴드를 252×g에서 1분 동안 원심분리하였다. 샘플을 50mM의 CaCl2에 침지하여 겔화를 허용하였다. 그런 다음 스캐폴드를 dH2O로 세정하여 과잉 CaCl2를 제거하였다. 마지막으로, 샘플을 실온에서 밤새 건조되도록 놓아두었다. 한 층의 2% 알긴산염 겔로 코팅된 스캐폴드(대조 알긴산염 스캐폴드)를 대조 그룹으로서 사용한 한편, 미코팅 TiO2 스캐폴드(알긴산염 없음, SC)를 또한 대조 그룹으로서 사용하였다. 스캐폴드를 마이크로CT 스캐너(Skyscan 1172, Kontich, Belgium)로 주사하여 CTvox로 가시화하고, CTan으로 분석하였다. 스캐폴드의 기공 직경은 단지 5%로 감소되었고 다공성 변화는 3% 미만이었다. 상호연결성은 알긴산염 층을 적용하였을 때 변화하지 않았는데, 그것은 스캐폴드가 여전히 개방된 다공성 구조를 가지고 단지 매우 소수의 기공만이 차단되었음(어두운 색)을 나타낸다(도 26). 또한 모든 지주가 알긴산염의 얇은 층(<10㎛)으로 덮여있는 것을 볼 수 있었다.
본 발명이 발명의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 전술한 설명은 예시하기 위해 의도된 것이고 첨부된 청구범위의 범주에 의해서 정의되는 발명의 범주를 제한하지 않는다. 다른 측면, 장점 및 변형은 다음의 청구범위의 범주 내에 있다.
반대로 기술되지 않는 한, 본원에 기술된 각각의 바람직한 특징은 본원의 다른 곳에서 기술된 어떠한 및 모든 바람직한 특징과 조합하여 사용될 수 있다.
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<220> <223> primer <400> 48 gcttcaccct cgaaatggta 20

Claims (14)

  1. 알긴산염 코팅을 포함하는 이산화티타늄 스캐폴드의 제조 방법으로서,
    상기 방법은
    a) 이산화티타늄 스캐폴드를 제공하는 단계,
    b) 상기 이산화티타늄 스캐폴드의 적어도 일부에 약 1 내지 3 %w/v의 적어도 하나의 알긴산염을 포함하는 알긴산염 용액을 제공한 후 이산화티타튬 스캐폴드를 원심분리하는 단계,
    c) 단계 b)에서 얻어진 이산화티타늄 스캐폴드에 Ca2 +, Mg2 +, Ba2 + 또는 Sr2 +로 이루어진 군으로부터 선택된 2가 양이온 염 용액을 제공한 후 임의로 그 이산화티타늄 스캐폴드를 세정하는 단계, 및
    d) 이산화티타늄 스캐폴드를 건조시키는 단계를 포함하고,
    상기 단계 b)와 c)는 임의로 적어도 1회 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 단계 b)의 알긴산염 용액 중의 알긴산염의 농도는 약 2%w/v인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계 c)의 2가 양이온 염 용액의 농도는 약 15 내지 150mM, 예컨대 약 50mM인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b) 및 c)는 2 내지 100회, 예컨대 2 내지 10회 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)의 알긴산염 용액은 적어도 하나의 생물학적 활성 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 생물학적 활성 물질은 합성 또는 천연 생체 내 활성 분자, 천연 또는 합성 약물 및/또는 살아있는 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 알긴산염은 10 000 내지 100 000g/mol의 분자량(Mw)을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알긴산염 코팅은 적어도 1㎛, 예컨대 1 내지 20㎛의 습식 두께를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 알긴산염은 알긴산 나트륨, 알긴산 칼륨, 알긴산 칼슘 및 알긴산 스트론튬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻을 수 있는 이산화티타늄 스캐폴드.
  11. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어진 이산화티타늄 스캐폴드.
  12. 제 10항 또는 제 11항에 따르는 이산화티타늄 스캐폴드를 포함하는 의료용 임플란트.
  13. 의료용 임플란트로서 사용하기 위한 제 10항 또는 제 11항에 따르는 이산화티타늄 스캐폴드.
  14. 조직, 예컨대 뼈의 재생, 복구, 치환 및/또는 복원을 위해 사용하기 위한 제 10항 또는 제 11항에 따르는 이산화티타늄 스캐폴드 또는 제 11항 또는 제 12항에 따르는 의료용 임플란트.
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