SE1251042A1

SE1251042A1 - Metod för att producera en alginatbelagd titandioxidscaffold

Info

Publication number: SE1251042A1
Application number: SE1251042A
Authority: SE
Inventors: Håvard Jostein Haugen; Hanna Tiainen; Ståle Petter Lyngstadaas
Original assignee: Corticalis As
Priority date: 2012-09-18
Filing date: 2012-09-18
Publication date: 2014-03-19
Also published as: CA2880992A1; JP2015535695A; US20150209474A1; SE537635C2; KR20150058203A; WO2014044697A1

Abstract

SAMMAN DRAG Foreliggande dokument riktar sig till medicinska prostetiska anordningar som anvands for implantation for att ersatta och/eller aterstalla forlorade kroppsfunktioner. Dokumentet beskriver en metod for aft producera en alginatbelagd titandioxidscaffold vani alginatbelaggningen eventuellt innefattar en biologiskt aktiv substans.

Description

I METOD FOR ATT PRODUCERA EN ALGINATBELAGD TITAN DIOXIDSCAFFOLD TEKNISKT OMRADE Foreliggande dokument riktar sig till medicinska implantat och metoder for att forbattra deras biokompatibilitet och funktion i kroppen. I synnerhet beskriver foreliggande 5 dokument en metod for att producera en titandioxidscaffold innefattande en alginatbelaggning vilken alginatbelaggning eventuellt kan innefatta en biologiskt aktiv substans.

BAKGRUND TILL UPPFINNINGEN Tillstand sasom trauma, tumorer, cancrar, parodontit och osteoporos kan leda till 10 benforlust, reducerad benvaxt och —volym. Av dessa och andra anledningar är det av stor vikt att finna metoder for att forbattra benvaxt och for att aterfa benanatomi.

Naturlig benbildning fran osteogena celler med hjalp av en tredimensionell scaffold erbjuder ett alternativ till autotransplantat och allografter for att reparera och regenerera 15 forlorat ben. En valkonstruerad scaffold tillhandahaller en lamplig yta for celler att fasta pa och vidhafta till med ett porost och val sammankopplat natverk som guidar utvecklingen av nytt ben, stodjer migrering, proliferering och differentiering av benbildande celler och vaskularisering av den invaxande vavnaden. Aven om flera polymerer och biokeramer har utvecklats for deras anvandning i benvavnadsregenerering har deras laga mekaniska 20 egenskaper begransat deras anvandning i barande tillampningar.

Titandioxid (Ti02) Or ett biokompatibelt material vilket ocksa har rapporterats ha bioaktiva egenskaper och en viss grad av bakteriostatisk effekt. Darfor har keramiskt TiO2 studerats som ett material for syften av benvavnadsrenerering. Hogt porosa och val sammankopplade Ti02-scaffoldar med hog mekanisk styrka som nar varden av 90 % 25 porositet och 1,63-2,67 MPa tryckhallfasthet har nyligen utvecklats (Tiainen etal. 2010) och deras biokompatibilitet och osteokonduktiva egenskaper har demonstrerats in vitro och in vivo.

Forst* har gjorts att t ex forbattra scaffoldarnas biokompatibilitet, att forbattra osseointegrering, forhindra infektion och inflammation genom belaggning av 30 implantatstrukturen med olika sorters biologiskt aktiva molekyler. Emellertid, for att kunna utfora deras avsedda funktion pa implantatet efter implantation behOver de biologiskt aktiva molekylerna belaggas pa implantatet pa ett satt som tillater deras frisattning, som 2 inte allvarligt skadar deras biologiska aktivitet, som inte orsakar negativa kroppsreaktioner etc.

Hydrogeler har anvants for olika tillampningar vid vavnadsregenerering sasom som utrymmesfyllande medel, som vehiklar for aft tillfora bioaktiva molekyler och som 5 tredimensionella strukturer som organiserar celler och erbjuder stimuli kir att styra bildningen av en onskad vavnad. Alginat är ett exempel pa en polymer som valts for aft bilda hydrogeler for vavnadsregenerering och har anvants i manga olika medicinska tillampningar inkluderande inkapsling och drogstabilitet och tillforsel av celler och/eller tillvaxtfaktorer. Alginat är en hydrofil och linjar polysackaridsampolymer av monomerer av 10 [3-D-mannuronsyra (M) och a-L-glukuronsyra (G). Alginatgel bildas nar divalenta katjoner, sasom Ca2+, Ba2+ or Sr 2+ interagerar samverkande med block av G-monomerer vilket skapar jonbryggor mellan olika polymerkedjor. Pa grund av gynnsamma egenskaper for ett biomaterial, sasom ej toxiskt, bionedbrytbarhet och latthet att processa till en onskad form under normala fysiologiska forhallanden har alginat studerats utforligt i vavnadsregenerering, inkluderande regenereringen av hud-, brosk-, ben-, lever- och hjartvavnad.

Det finns emellertid fortfarande eft behov inom omradet av medicinska implantat och vavnadsregenerering for implantatstrukturer som tillhandahaller t ex en stodjande struktur, vilka är biokompatibla och/eller vilka forbattrar integreringen av implantatet i en kropp. 20 SAMMANFATTNING AV UPPFINNINGEN Ett syfte med foreliggande dokument är att tillhandahalla en titandioxidscaffold som är lampligt som ett medicinskt implantat, vilken scaffold är tillhandahallen med en a lgi natbel aggn i ng .

Detta syfte uppnas genom foreliggande beskrivning vilken i en aspekt riktar sig till en 25 metod for att producera en titandioxidscaffold innefattande en alginatbelaggning, vani namnda metod innefattar stegen av att: tillhandahalla en titandioxidscaffold, tillhandahalla en alginatlosning innefattande omkring 1-3 vikt/volym% av atminstone en alginat till atminstone del av namnda titandioxidscaffold och sedan centrifugera titandioxidscaffolden, tillhandahalla titandioxidscaffolden erhallen i steg b) med en divalent katjonsaltlosning, van i namnda divalenta katjon är vald fran gruppen 3 bestaende av Ca2+, Mg2+, Ba2+ or Sr, och sedan eventuellt skolja titandioxidscaffolden; och d) torka titandioxidscaffolden, van i steg b) och c) eventuellt upprepas atminstone en gang.

Nar steg b) uffors innan steg c) Mater centrifugeringen i steg b) och/eller de laga densiteterna av alginat och/eller divalenta katjonlosningarna i steg b) respektive c) bildandet av ett tunt lager av alginatlosning pa titandioxidscaffolden som inte är narvarande inte bara pa den yttre ytan av scaffolden men ocksa pa vaggarna av porerna inuti scaffolden. Nar den divalenta katjonlosningen tillsatts i steg c) astadkoms en gelning 10 av alginaten varvid ett alginatgellager bildas. Genom att upprepa metodsteg b) och c) kan en alginatbelaggning som bestar av en eller fler alginatgellager byggas upp. Eftersom den foreliggande metoden tillater bildningen av en tunn belaggning av alginat, uppbyggd av ett eller fler lager av alginatgel, blockeras porerna i titandioxidscaffolden inte av alginatbelaggningen utan är latt tillgangliga for celler och vavnad att vaxa in i scaffoldstrukturen. En annan effekt nar foreliggande metod anvands for att bereda en alginatbelaggning pa en titandioxidscaffold är att, nar alginatbelaggningen bildas pa insidan av atminstone del av porerna, kommer det att bli ett mycket stort forhallande av yta-till-volym jamfort med om alginatbelaggningen bara skulle bildas pa den yttre ytan av scaffolden. Detta kommer att paverka frisattningsprofilen av en substans, sasom en biologiskt aktiv substans som inkluderas i alginatbelaggningen. Dessutom, aven om alginatbelaggningen skulle flaga av fran den yttre ytan av titandioxidscaffolden skulle alginatbelaggningen forffarande vara narvarande pa ytan av porerna inuti scaffolden.

Foreliggande dokument riktar sig aven till en titandioxidscaffold erhallbar genom den ovanstaende metoden for att producera en titandioxidscaffold innefattande en a Iginatbelaggn ing.

Vidare beskrivet är ett medicinskt implantat som innefattar en titandioxidscaffold tillhandahallen med en alginatbelaggning producerad genom metoden beskriven hari. Aven beskriven är den alginatbelagda titandioxidscaffolden for anvandning som ett medicinskt implantat.

Foreliggande dokument riktar sig ocksa till den alginatbelagda titandioxidscaffolden eller ett medicinskt implantat som innefattar den for regenereringen, reparationen, ersattandet och/eller aterstallandet av vavnad sasom ben och/eller far anvandningen for regenereringen, reparationen, ersattandet och/eller aterstallandet av vavnad, sasom ben. 4 Dessutom beskrivs anvandningen av den alginatbelagda titandioxidscaffolden eller ett medicinskt implantat som innefattar den for framstallningen av ett medicinskt implantat for regenereringen, reparationen, ersattandet och/eller aterstallandet av vavnad och/eller 5 ben.

Dessutom beskrivs en metod for regenereringen, reparationen, ersattandet och/eller Merstallandet av vavnad innefattande implantationen in i ett objekt i behov darav av den alginatbelagda titandioxidscaffolden eller ett medicinskt implantat som innefattar den.

Andra sardrag och fordelar med uppfinningen kommer att bli uppenbara fr5n den foljande detaljerade beskrivningen, ritningarna, exemplen och fran patentkraven.

DEFINITION ER "Scaffold" hanfor sig i foreliggande sammanhang till en oppen porOs struktur. Scaffold kan i foreliggande sammanhang forkortas "SC". Med "titandioxidscaffold" avses en scaffold innefattande foretradesvis titandioxid, d v s titandioxid är den huvudsakliga substansen ansvarig for att bilda scaffoldstrukturen. Titandioxidscaffolden har darfor mer an 50 vikt% titandioxid, s5som omkring 51 vikt%, 60 vikt%, 70 vikt%, 80 vikt%, 90 vikt%, 95 vikt%, 96 vikt%, 97 vikt%, 98 vikt%, 99 vikt% eller 100 vikt% titandioxid. 20 Med "pordiameter" avses i sammanhanget av foreliggande dokument den hydrauliska diametern av en por utan dess omgivande vaggar. Den hydrauliska diametern är valkand for fackmannen inom teknikomr5det och definieras som 4-area av en por delat med langden av omkretsen av poren.

"Fraktaldimension av stag" (engelska "fractal dimension strut") är ett statistiskt matt som ger en indikation p5 hur fullstandigt en fraktal verkar fylla utrymme nar man zoomar ner till finare och finare skalor. Det finns m5nga specifika definitioner av fraktaldimension och ingen av dem ska behandlas som universell. Ett varde av 1 hanfor sig till en rak linje. Ju hogre numret är, desto mer komplex är ytstrukturen.

"Total porositet" definieras i foreliggande sammanhang som alla rum inom en kropp vilka inte är ett material, t ex utrymmet som inte ockuperas av nagot material. Total porositet involverar bade stangda och oppna porer.

Med "inre stagvolym" avses volymen av den inre lumen av staget.

Med "sintring", "sintra" och liknande avses en metod for att tillverka objekt fran pulver, genom att hetta upp materialet (nedan dess smaltpunkt) till dess att dess partiklar faster till varandra (fuserar). Sintring anvands traditionellt for tillverkning av keramiska objekt och har Oven funnit anvandningar inom omraden sasom pulvermetallurgi.

En "medicinsk prostetisk anordning", "medicinskt implantat", "implantat" och liknande hanfor sig i foreliggande sammanhang till en anordning avsedd att implanteras i kroppen 10 av ett vertebrat djur, sOsom ett daggdjur, t ex en manniska. lmplantat kan i foreliggande sammanhang anvandas fOr att ersatta anatomi och/eller aterstalla en kroppsfunktion. Exempel pa sadana anordningar inkluderar, men är inte begransade till, dentala implantat och ortopediska implantat. I foreliggande sammanhang inkluderar ortopediska implantat inom dess omfang vilken anordning som heist som är avsedd att implanteras i kroppen av ett vertebrat djur, i synnerhet ett daggdjur sAsom en manniska, for bevarande och aterstallande av funktionen av muskelskelettsystemet, i synnerhet leder och ben, inkluderande lindringen av smarta i dessa strukturer. I foreliggande sammanhang, inkluderar dentalimplantat i sin omfattning vilken anordning som heist som Or avsedd att implanteras i munhalan av ett vertebrat djur, i synnerhet ett daggdjur sasom en manniska, vid tandaterstallningsprocedurer. I allmanhet bestOr ett dentalimplantat av en eller flera implantatdelar. Till exempel innefattar ett dentalimplantat vanligen en dental fixtur kopplad till sekundara implantatdelar, sasom en distans och/eller en dentalaterstallning sasom en krona, brygga eller tandprotes. Emellertid kan vilken anordning som heist, sasom en dental fixtur, avsedd for implantering, i sig sjalv hanforas till som ett implantat Oven om andra delar ska sammanbindas dartill. Ortopediska och dentalimplantat kan ocks6 betecknas som ortopediska och dentala prostetiska anordningar sasom framgar fran det ovanstaende.

I foreliggande sammanhang hanfor sig "objekt" till vilket vertebrat djur som heist, sasom 30 en fagel, reptil, daggdjur, primat och manniska.

Med "keramer" avses i foreliggande sammanhang objekt av oorganiskt pulvermaterial behandlade med varme f6r att bilda en stelnad struktur. 6 Med "biologiskt aktiv substans" avses en substans vilken kan inverka p5 en biologisk process, d v s som har en biologisk aktivetet. En biologiskt aktiv substans kan vara en liten molekyl, sasom en oorganisk Jon eller en storre molekyl, sasom ett protein, och till och med en komplex struktur, sasom en cell. Exempel pa biologiskt aktiva substanser 5 som är lampliga for anvandning i sammanhanget av foreliggande dokument beskrivs nedan. En biologiskt aktiv substans kan i foreliggande samman hang ocks5 betecknas en "biomolekyl".

KORT BESKRIVNING AV RITNINGARNA Figur 1. Mikrostruktur av 2 % alginat (A och 8) och 2 % av alginat innehallande syntetisk peptid (C och D) gelnad med 300 mM av CaCl2. Observation med SEM vid x(A och C) och x100 forstoring (8 och D). Denna gel är inte narvarande p5 en titandioxidscaffold och inte framstalld genom metoden for att producera en titandioxidscaffold innefattande en alginatbelaggning beskriven hari. Darfor antar denna gel en poros struktur.

Figur 2. Frisattningsprofil av peptid 2 markt med FITC efter 21 dagars inkubering vid 37 °C. Stapeldiagram visar mangden av peptid frisatt efter vane tidpunkt. Linjediagram representerar kumulativ mangd av peptid frisatt upp till 21 dagar. Varden representerar medel ±SEM.

Figur 3. A. Toppen: antal vidhaftande celler nar olika mangder av celler s5s (30 x 3, 60 20 x 3, 100 x 3 och 200 x 3 cells/brunn) efter 1 och 5 dagars odling. Varden representerar medel ±SEM. Botten: representativ bild av osteoblastceller vidhaftade pa 2 % alginathydrogeler nar 100 x 3 cellsibrunn sas erhallen genom SEM vid x200 forstoring. B. Osteoblastvidhaftning p5 2 % alginatbelaggning. Representativa bilder erh5lIna genom konfokalmikroskopi av vidhaftande celler nar 30 x 3 (A och B), 60 x 3 25 (C och D), 100 x 3 (E och F) och 200 x 3 (G och H) cells/brunn sas efter 1 (A, C, E, G) och 5 (B, D, F, H) dagars odling. Cellkarnor presenteras i vitt (DAPI-fargning) (vanster kolumn) och aktinfilament presenteras i vitt (falloidin-FITC) (Niger kolumn). Stapelskalan representerar 150 pm.

Figur 4. LDH-aktivitet matt fran odlingsmedia samlat 24 timmar efter sadd av MC3T3-E1- 30 celler pa alginatgeler utan peptid (-) eller alginatgeler innehallande 50 pg/ml av antingen Emdogain (EMD) eller syntetiska peptider (P2, P5 och P6). Hog kontroll (100 %) var cellodlingsmedia fran celler s'adda pa vavnadsodlingsplast och inkuberade med 1 % Triton X-100. Lag kontroll (0 %) var cellodlingsmedia fran celler sac:Ida p5 vavnadsodlingsplast och inkuberade med 0,1 % attiksyra-PBS. Procenten LDH-aktivitet 7 beraknades genom att anvanda foljande ekvation: cytotoxicitet (%) = (forvantat varde — lag kontroll)/(hogkontroll — I5g kontroll) * 100. Varden representerar medel ±SEM. Skillnader mellan grupper faststalldes genom Mann—Whitney test *p < 0.05 mot kontrollalginatgel (-), #p <0.05 mot alginatgel innehallande EMD.

Figur 5A-D. Uttryck av gener relaterade till cellvidhaftning efter odling av MC3T3-E1- celler pa 2 °A av alginatgeler utan peptid (-, kontrollgrupp), innehallande syntetiska peptider eller EMD (50 pg/ml) i 14 och 21 dagar. Data representerar relativa mRNA-niv5er av malgener normaliserade med referensgener, uttryckta som procent av kontroll alginatgel vid 14 dagar av odling, vilket sattes till 100 %. Varden representerar medel ± 10 SEM. Skillnader mellan grupper faststalldes genom Studentens t-test; (*) p 5 0.05 mot kontroll alginatgel (-), (#) p 0.05 mot EMD.

Figur 6A-F. Uttryck av gener relaterade till osteoblastdifferentiering efter odling av MC3T3-E1-celler p5 2 % alginatgeler utan peptid (-, kontrollgrupp) innehallande syntetiska peptider eller EMD (50 pg/ml) 114 och 21 dagar. Data representerar relativa 15 mRNA-niv5er av malgener normaliserade med referensgener, uttryckta som procent av kontrollalginatgel vid 14 dagars odling, vilket sattes till 100 %. Varden representerar medel ± SEM. Skillnader mellan grupper faststalldes genom Studentens t-test; (*) p 5 0.05 kontroll alginatgel (-), (#) p 0.05 mot EMD.

Figur 7. Frisattningsprofil av peptid 2 (SEQ ID NO 1) fr5n P2-alginatgelbelagda scaffoldar efter 21 dagars inkubering vid 37°C. Stapeldiagram visar mangden av peptid frisatt efter varje tidpunkt. Linjediagram representerar kumulativ mangd av peptid frisatt upp till 21 dagar. Varden representerar medel ± SD.

Figur 8. LDH-aktivitet matt fr5n odlingsmedia uppsamlat efter 48 timmars odling. Varden representerar medel ± SEM. Mann-Whitney test (p5 0.05): (a) mot reguljar scaffold (SC) och (b) mot kontrollalginat scaffold (-).

Figur 9. SEM-visualisering av 2 % alginatbelagda Ti02-scaffoldar (kontrollalginatscaffold) vid 10kV och 40Pa. Figurer A och B visar mikrostrukturen av Ti02-scaffoldar direkt efter belaggningsprocessen med ett lager av 2 % alginatgel vid 50x (A) och 300x (B) forstoring. Figurer C och D visar celler odlade p5 kontrollalginatscaffoldar efter 7 dagars odling vid 30 50x (C) och 300x (D) forstoring.

Figur 10. SEM-visualisering av MC3T3-E1-celler vaxande p5 reguljara scaffoldar (A och B), kontrollalginatscaffoldar (C och D) och P2-alginatgelbelagda scaffoldar (E och F) efter 8 7 (A, C och E) och 21 (B, D och F) dagars odling. Scaffoldar observerades med SEM vid 10 kV, 40 Pa och x50 forstoring.

Figur 11. Antal av celler som vaxer pa scaffoldarna efter 7 dagar odling. DNA-innehall analyserades genom Hoechst-fluorescensfargning och korrelerades till en linjar 5 standardkurva. Varden representerar medel ± SEM. Varden representerar medel ± SEM.

Mann-Whitney test: (a)0.05 mot reguljart scaffold (SC) och (b) mot kontrollalginatgelbelagd scaffold (-).

Figur 12 A-D. Relativa mRNA-uttrycksniv5er av Itgbl(A), Itgb3 (B), Fnl(C) och Itga8 (D) i MC3T3-E1-cells odlade pa Ti02-scaffoldar i 7 (o) och 21 dagar (.). Reguljara scaffoldar 10 (SC) anvandes som referensgrupp. Data representerar faldiga forandringar (engelska "fold changes") av malgener normaliserade med referensgener (Gapdh och 18S), uttryckt som procent av celler odlade pa reguljara scaffoldar (SC) vid dag 7, vilket sattes till 100 %. Varden representerar medel ± SEM. Studentens t-test: (a)0.05 mot reguljar scaffold (SC) och (b) mot kontrollalginatscaffold (-).

Figur 13A-H. Relativa mRNA-uttrycksnivaer av A) osterix (Osx), B) bone morphogenetic protein 2 (Bmp2), C) collagen-I (Coll-/), D) interleukin 6 (I1-6), E) osteopontin (Opn), F) bone sialoprotein (Bsp), G) alkalint fosfatas (Alp) och H) osteokalcin (Oc) i MC3T3-E1- celler odlade pa Ti02-scaffoldar i 7 (o) och 21 dagar (N). Reguljara scaffoldar (SC) anvandes som referensgrupp. Data representerar faldiga forandringar (engelska "fold 20 changes") av malgener normaliserad med referensgener (Gapdh och 18S), uttryckt som procent av celler odlade pa reguljara scaffoldar (SC) vid dag 7, vilket sattes till 100 %.

Varden representerar medel ± SEM. Studentens t-test: (a)0.05 mot reguljar scaffold (SC) och (b) mot kontrollalginatscaffold (-).

DETALJERAD BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Metod far att producera en alginatbelagd titandioxidscaffold Foreliggande dokument riktar sig i en aspekt till en metod kir att producera en titandioxidscaffold innefattande en alginatbelaggning. I en forsta aspekt, riktar sig darfor foreliggande dokument till en metod for att producera en titandioxidscaffold innefattande en alginatbelaggning, vilken metod innefattar stegen av att: a) tillhandahalla en titandioxidscaffold, 9 tillhandahalla en alginatlosning innefattande omkring 1-3 %vikt/vol av atnninstone en alginat till del av namnda titandioxidscaffold och sedan centrifugera titandioxidscaffolden, tillhandahalla titandioxidscaffolden erhallen i steg b) med en divalent katjonlosning, van i namnda divalenta katjon är vald fran gruppen bestaende av 082+, Mg2+, Ba2+ eller Sr, och sedan eventuellt tvatta titandioxidscaffolden: och torka titandioxidscaffolden van i steg b) och c) eventuellt upprepas atminstone en gang. 10 Metoden kan ocksa besta av de ovanstaende stegen a)-d), van i steg b) och c) eventuellt upprepas atminstone en gang. Nar steg b) och c) upprepas, byggs en alginatbelaggning innefattande tva eller fler alginatlager upp. Alginatbelaggningen kan darfOr innefatta eller besta av en eller fler alginatgellager. 15 Den ovanstaende metoden kan ocksa betecknas en metod for att belagga atminstone del av en titandioxidscaffold med en alginatbelaggning. I sammanhanget av foreliggande dokument kan alginatbelaggningen ocksa betecknas en belaggning av alginat. Det ska forstas att i alginatbelaggningen antar alginaten ett gelliknande tillstand nar den är vat. Emellertid ska det ocksa forstas att en viss mangd av fukt kravs for att alginatbelaggningen ska anta detta gelliknande tillstand. Darfor kommer den alginatbelagda titandioxidscaffolden, nar den torkas, lagras pa ett torrt stalle och liknande, snarare vara i formen av ett tunt, dehydratiserat filmlager (aka en "xerogel"). Emellertid kommer alginatbelaggningen, nar den alginatbelagda titandioxidscaffolden utsatts for en fuktigare miljo, sasom nar den implanteras i en kropp eller nar den sanks ner i en vattenbaserad losning, att anta ett gelliknande utseende igen. Om inte uttryckligen uppenbart fran sammanhanget ska det forstas att nar en alginatbelaggning hanvisas till i foreliggande dokument, omfattar detta bade fuktiga och torra former av a lgi natbel aggn i ngen. 30 Titandioxidscaffolden som produceras med foreliggande metod kan betecknas en "titandioxidscaffoldinnefattandeenalginatbelaggning",en"alginatbelagd titandioxidscaffold" eller liknande.

Titandioxidscaffolden har en yttre yta vilken atminstone delvis kommer aft vara belagd med alginatbelaggningen. Eftersom titandioxidscaffolden antar en poros struktur, kommer med foreliggande metod emellertid alginatlosningen och den divalenta katjonlosningen aven tillatas penetrera porerna av scaffolden och alginatbelaggningen foljaktligen ocksa 5 att bildas pa ytan av atminstone del av porerna pa insidan av scaffolden. Hur djupt in i scaffoldporerna alginatbelaggningen kommer aft bildas kommer naturligtvis att bero pa faktorer sasom scaffoldporositet (en storre porositet kommer att underlatta penetreringen av alginat och tillata belaggningen att bildas djupare inuti scaffolden), koncentration av alginat och/eller divalent katjonlosning, centrifugeringshastigheten etc. Emellertid tillater 10 foreliggande metod atminstone del av ytan (vaggarna) av atminstone de yttre porerna av titandioxidscaffolden att belaggas med en alginatbelaggning. Typiskt sett ar alginatbelaggningen narvarande genom hela scaffoldstrukturen nar en alginatbelagd titandioxidscaffold analyseras genom skannande elektronmikroskopi (SEM). Med foreliggande metod bildas alginatbelaggningen darfor inte bara pa den yttre ytan av titandioxidscaffolden utan ocksa i varierande grad pa ytan av porerna inuti scaffolden. Typiskt sett kommer majoriteten av porytorna pa vilka alginatbelaggningen tillhandahalls att belaggas med alginatbelaggningen.

Naturligtvis kan bara del av titandioxidscaffolden tillhandahallas med losningarna av alginat- och/eller divalent katjon. For att alginatbelaggningen ska bildas är det viktigt att delen av scaffolden pa vilken sadan bildning av alginatbelaggning onskas utsatts for bade alginat- och divalent katjonlosningarna eftersom ingen gelning av alginaten kommer aft ske annars.

Med foreliggande metod är det mojligt att bilda en tunn alginatbelaggning pa titandioxidscaffolden eftersom centrifugeringen i steg b) tillater ett mycket tunt lager av alginatlosning aft deponeras pa den yttre ytan och aven inuti porerna av titandioxidscaffolden. Dessutom, utan 6nskan aft vara teoretiskt bunden, kan den tunna alginatbelaggningen att vara resultatet av de laga densiteterna av alginat- och divalent katjonlosningarna som anvands, vilket tillater deras penetrering in i porerna av scaffolden. Foreliggande metod tillater varje alginatgellager av alginatbelaggningen att typiskt ha en vattjocklek av atminstone 1 jim, sasom omkring 3 p.m, pa ytan den tacker. Genom aft upprepa metodsteg b) och c) kan emellertid en alginatbelaggning bestaende av tva eller fler alginatlager byggas upp. Foreliggande metod kan darfor anvandas for aft kontrollera tjockleken av alginatbelaggningen genom att upprepa steg b) och c), sasom 2-100, 2-10, 11 2-6, 2-4, 3 eller 4 ganger, tills en alginatbelaggning av onskad tjocklek erhalls.

Alginatbelaggningen kan darfor innefatta ett eller fler alginatgellager. Alginatbelaggningen har typiskt en tjocklek av omkring 1-20 pm, sasom 1-Typiskt sett bestar alginatbelaggningen av 1-10 alginatgellager, sasom 2-6, 2-4, 3 eller 4 lager. Nar en biomolekyl (biologiskt aktiv substans) inkorporeras i alginatbelaggningen (se pa annat hall i detta dokument) kan storleken av biomolekylen paverka valet av antalet lager. En mindre biomolekyl (d v s som har en lagre Mw, sasom doxicyklin) diffunderar ut ur alginatbelaggningen snabbare an en storre biomolekyl. Darfor, om en fOrdrOjd frisattning av en mindre biomolekyl onskas, kravs en alginatbelaggning innefattande ett hogre antal 10 alginatgellager. A andra sidan, for en st6rre biomolekyl, är frisattningshastigheten fran alginatbelaggningen mer beroende av nedbrytningen av alginatgelen och biomolekylen diffunderar inte ut ur alginatbelaggningen lika snabbt som en mindre biomolekyl. Darfor kan farre alginatgellager i alginatbelaggningen anvandas f6r en st6rre biomolekyl. Genom att kanna till storleken pa biomolekylen och den onskade frisattningshastigheten kan antalet alginatgellager i alginatbelaggningen darfor justeras fOr aft astadkomma den Onskade frisattningshastigheten.

Den tunna tjockleken av alginatbelaggningen är fordelaktig eftersom en sadan tunn alginatbelaggning inte vasentligen kommer att blockera poroppningarna i titandioxidscaffolden, aven am pordiametern naturligtvis minskas nagot pa grund av alginatbelaggningen. Snarare klas vaggarna av titandioxidscaffoldporerna med alginatbelaggningen. Viss initial blockering av scaffoldporerna kan ske aven nar en tunn alginatbelaggning bereds, men i en biologisk miljo, sags en viss nedbrytning av den blockerande alginatbelaggningen i de parer som forblev blockerade direkt efter belaggningsproceduren (se Exempel 2). Den vasentliga avsaknaden av porblockering är fordelaktig eftersom cellvaxt in i titandioxidscaffolden darmed kan forbattras eftersom porerna, trots alginatbelaggningen, är latt tillgangliga for penetrering av celler och vavnad. Dessutom tillater foreliggande metod en alginatbelaggning som har en mer jamn tjocklek att bildas. Vidar är alginatbelaggningen som bildas genom metoden av foreliggande dokument vasentligen icke-por6s, jamfor en alginatgel beredd genom att helt enkelt blanda alginat och en divalent katjonsaltlosning vilken har viss porositet (se t ex gelen beredd i Exempel 1 och som visas i Fig. 1). Orsaken till den vasentliga avsaknaden av porositet av alginatbelaggningen nar beredd pa en titandioxidscaffold genom metoden som beskrivs hari ar formodligen den tunna belaggningen av alginatlosning som bildas pa 35 titandioxidscaffolden efter centrifugering i steg b). 12 En annan fordel med foreliggande metod är att, eftersom alginatbelaggningen bildas pa insidan av atminstone del av porerna i ett tunt lager, kommer det att bli ett mycket stort yta-till-volym-forhallande jamfort med om alginatbelaggningen bara skulle bildas pa den yttre ytan av scaffolden. Detta kommer aft paverka frisattningsprofilen av en substans, 5 sasom en biologiskt aktiv substans (se pa annat hall hari), som är inkluderad i alginatbelaggningen. Dessutom, aven om alginatbelaggningen skulle flaga av fran den yttre ytan av titandioxidscaffolden, skulle alginatbelaggningen fortfarande vara narvarande pa ytan av porerna inuti scaffolden. 10 Dessutom tillater foreliggande metod bildningen av en alginatbelaggning innefattande ett eller fler alginatgellager genom att upprepa steg b) och c). Om foredraget tillater detta aven bildningen av olika alginatgellager med olika biologiskt aktiva substanser och/eller typer av alginat eller divalent katjon i de olika lagren. 15 Det är aven mojligt att utfora steg c) innan steg b). I detta fall bildas emellertid inte en tunn belaggning av alginat. Snarare fyller alginatbelaggningen upp majoriteten av porerna inuti titandioxidscaffolden. Detta kan vara sarskilt fordelaktigt nar celler, sasom stamceller, ska inkorporeras i titandioxidscaffolden, eftersom detta tillater ett stort antal celler aft deponeras inuti scaffoldporerna. Nar steg c) utfors innan steg b) kan det vara overflodigt 20 att upprepa steg c) och b) eftersom de fiesta av porerna i titandioxidscaffolden kommer att fyllas upp med alginatbelaggning redan efter att steg c) och b) utforts en gang.

Alginatlosningen är en vattenhaltig losning innefattande alginat. Den kan beredas genom att losa upp alginat i destillerat vatten eller en lamplig buffert, sasom fosfatbuffrad 25 saltlosning genom omrorning till alginaten loses upp, foretradesvis vid rumstemperatur, t ex i 1 timme till Over natten (t ex 1-24 timmar).

Alginaten kan t ex valjas fran gruppen bestaende av natriumalginat, kaliumalginat, kalciumalginat och strontiumalginat. En blandning av tva eller fler sorters alginater kan 30 anvandas. Alginaten ár typiskt en hogmolekylviktsalginat med en molekylvikt (Mw) av 1 000-200 000 g/mol. Koncentrationen av alginat i alginatlOsningen ar typiskt omkring 1-3% vikt/volym, sasom 1,5-2,5 % vikt/volym eller omkring 2 % vikt/volym. Alginaten kan innefatta ett minimum av omkring 60 % guluronatmonomerer. Biomolekyler (t ex biologiskt aktiva substanser, beskrivna pa annat stalle hari) kan sattas till alginatlosningen. 13 Koncentrationen av den biologiskt aktiva substansen, nar den satts till alginatlosningen, beror naturligtvis pa den specifika biologiskt aktiva substansen och/eller dess avsedda funktion i kroppen. Typiskt sett är dess koncentration i alginatlosningen i omradet av mikrogram, aven om den kan variera fran 1 ng-1 mg/ml, sasom 500 ng/m1-500 jig/ml, 1- 5 500 jig/ml, 1-100 jig/ml, 1-80 jig/ml, 20-70 jig/ml, 40-60 lig/mIeller 50 jig/mi.

For att tillhandahalla alginatlosningen till titandioxidscaffolden, kan scaffolden sankas ner i en alginatlosning. Detta kan ske under omskakning, t ex via en orbitalskak vid omkring 100 rpm/min. Omskakningen hjalper till att sprida alginatlosningen i det porosa natverket 10 av scaffolden. Typiskt sanks titandioxidscaffolden ner under en tidsperiod av omkring 10 min till 2 timmar, sasom 1-2 timmar, t ex 1 timme. Nedsankningen sker typiskt vid rumstemperatur.

Efter nedsankning i en alginatlosning, tas overskott av losning typiskt bort genom forsiktig 15 centrifugering av titandioxidscaffolden, sasom vid omkring 200-300 x g under en kort tidsperiod, sasom 0,5-2 min, t ex 1 min.

I steg c) tillhandahalls titandioxidscaffolden med en divalent katjonsaltlosning. Den divalenta katjonsaltlosningen (hari aven betecknad "divalent katjonlosning had) är en 20 vattenhaltig losning innefattande atminstone ett salt av en divalent katjon, sasom Ca2+, Mg2+, Ba2+ eller Sr. Exempel pa lampliga divalenta katjonsalter inkluderar, men är inte begransade till, CaCl2, SrCl2, SrCO3, SrPO4, CaCO3, CaPO4, MgC12, MgCO3, och MgPO4. Koncentrationen av det divalenta katjonsaltet I denna lOsning ar typiskt omkring 15-500 mM, sasom omkring 15-150, 20-500 mM, 20-100 mM, 20-400 mM, 200-400 mM, 250-3 25 mM, 30-80 mM, 40-60 mM, 45-55 mM eller omkring 50 mM. Foretradesvis är koncentrationen omkring 20-100 mM. Foretradesvis är det divalenta katjonsaltet CaCl2. For att tillhandahalla titandioxidscaffolden med den divalenta katjonlosningen kan titandioxidscaffolden sankas ner i den divalenta katjonlosningen under en tidperiod av t ex 10 min till 2 timmar, sasom 1-2 timmar, t ex 1 timme. Alternativt kan andra satt att 30 tillhandahalla den divalenta katjonlosningen anvandas, t ex sasom genom sprayning av titandioxidscaffolden med losningen. Efter att den divalenta katjonlosningen tillhandahallits titandioxiden, tvattas scaffolden eventuellt, t ex i destillerat vatten for att ta bort overskott av divalent katjonlosning. Dessutom kan biologiskt aktiva substanser sattas till den divalenta katjonlosningen (t ex i samma koncentrationer som nar satta till 14 alginatlosningen) aven om dessa foretradesvis satts till alginatlosningen nar biologiskt aktiva substanser ska inkluderas i alginatbelaggningen.

Steg d) kan är frivilligt och kan utforas under en tidsperiod av omkring 0,5 timmar till flera dagar. Det kan t ex ufforas over natten, t ex i 0,5-24 timmar, 5-10 timmar eller bara 1 timme. Typiskt utfOrs detta steg vid rumstemperatur.

Metoden for aft producera en alginatbelagd titandioxidscaffold beskriven hari tillhandahaller en titandioxidscaffold tillhandahallen med en alginatbelaggning, eventuellt 10 ocks5 innefattande en biologiskt aktiv substans(er). Detta dokument riktar sig darfor ocksa till en titandioxidscaffold innefattande en alginatbelaggning, eventuellt innefattande en biologiskt aktiv substans(er), erhallen eller erhallbar genom metoden som beskrivs har. En sadan titandioxidscaffold kan t ex betecknas en alginatbelagd titandioxidscaffold eller en titandioxidscaffold innefattande en alginatbelaggning.

Titandioxidscaffolden innefattande en alginatbelaggning anvands typiskt som eft medicinskt implantat, antingen ensamt eller innefattat som en del av ett implantat. Som är uppenbart fran andra delar av detta dokument tillater titandioxidscaffoldstrukturen som anvands att implantatstrukturer skraddarsys, specifikt anpassade till implantationsstallet 20 och den avsedda funktionen av implantatet. Detta dokument riktar sig darfor aven till en titandioxidscaffold innefattande en alginatbelaggning for anvandning som ett medicinskt implantat. Den alginatbelagda titandioxidscaffolden innefattar en poros struktur vilken har en god biokompatibilitet och vilken kan stimulera vaxten av celler och fastandet av scaffolden eller implantatet innefattande scaffolden. Den porosa strukturen dialer invaxt av celler i scaffolden vilket darmed till6ter regenereringen av vavnad. Den stora ytarean underlattar ocksa vaxten av celler in i strukturen och darmed fastande av scaffolden och regenereringen av vavnad. Eftersom titandioxidscaffolden i sig sjalv an gjord av eft material vilket har en god biokompatibilitet, reduceras negativa reaktioner mot scaffolden nar den an implanterad i ett objekt.

Anvandningar av den alginatbelagda titandioxidscaffolden Titandioxidscaffolden innefattande en alginatbelaggning kan implanteras i ett objekt vani celler kommer att vaxa in i scaffoldstrukturen. Det är ocksa mojligt att sa och vaxa celler 35 pa den alginatbelagda titandioxidscaffolden innan implantering. Den sammanbundna makroporosa strukturen av titandioxidscaffolden är sarskilt lamplig for vavnadsregenerering och i synnerhet benvavnadsregenerering, ett intressant alternativ till nar narvarande tillgangliga benreparationsterapier. I detta avseende utfors sadd av celler erhallna fran benmarg av titandioxidscaffolden genom att anvanda konventionella metoder, vilka är val kanda for fackmannen p5 omradet (se t ex Maniatopoulos et al. 1988). Celler sas p5 den alginatbelagda titandioxidscaffolden och odlas under lampliga vaxtforhallanden. Odlingarna matas med lampliga medier for att etablera vaxten darav.

Celler av olika typer kan vaxas genom den alginatbelagda titandioxidscaffolden. Mer 10 precist inkluderar celltyper hematopoetiska eller mesenkymala stamceller, och inkluderar aven celler som ger kardiovaskular, muskular eller n5gon annan bindvavnad. Celler kan vara av humant eller annat animaliskt ursprung. Emellertid är den alginatbelagda titandioxidscaffolden sarskilt lampad for vaxten av osteogena celler, i synnerhet celler som utvecklar benmatris. For vavnadsregenerering kan cellerna vara av vilket ursprung som heist. Cellerna är fordelaktigt av humant ursprung. En metod for att vaxa celler i en alginatbelagd titandioxidscaffold tillater sac:Ida osteogena celler, till exempel, att penetrera titandioxidscaffolden for att utveckla benmatris, under in vitro-steget, med genomtrangande distribuering i strukturen av titandioxidscaffolden. Penetrering av osteogena celler och, som ett resultat, benmatrisutveckling, kan forstarkas genom 20 mekaniska medel, ultraljudsmedel, medel for elektriska falt eller elektroniska medel.

Den alginatbelagda titandioxidscaffolden är anvandbar narhelst man behover en struktur att agera som en stomme for tillvaxt av celler, sasom for regenerering av en vavnad. Den alginatbelagda titandioxidscaffolden är sarskilt lampad for regenereringen av ben och broskstrukturer. Exempel p5 situationer dar regenereringen av sadana strukturer kan vara nadvandiga inkluderar trauma, kirurgiskt borttagande av ben eller tander eller i samband med cancerterapi.

Exempel p5 strukturer i en patient vilka i sin helhet eller delvis kan ersattas inkluderar, 30 men är inte begransade till, kraniofacialt ben, inkluderande arcus zygomaticus, ben i innerorat (i synnerhet hammaren, stigbygeln och stadet, maxillar och mandibular dentalalveolar 5s, vaggar och nedre vaggar av ogonhalor, vaggar och nedre vaggar av bihalor, skallben och defekter i skallben, ledskal for hoftled (Fossa acetabuli), t ex i fallet av hoftledsdysplasi, komplicerade frakturer i I5nga ben inkluderande (men inte begransat till) humerus, radius, ulna, femur, tibia och fibula, ryggrad, ben i handerna och fotterna, 16 finger- och taben, fyllning av extraktionshal (fran tandextraktioner), reparation av parodontaldefekter och reparation av periimplantitdefekter. Dessutom är den alginatbelagda titandioxidscaffolden anvandbar f6r fyllningen av alla typer av bendefekter som resulterar fran (borttagandet av) tumorer, cancrar, infektioner, trauma, kirurgi, medf6dda missbildningar, arftliga tillstand, metabola sjukdomar (t ex osteoporos och diabetes).

Den alginatbelagda titandioxidscaffolden beredd genom den beskrivna metoden eller ett medicinskt implantat innefattande en sadan scaffold kan anvandas for regenereringen, 10 reparationen, ersattandet och/eller aterstallandet av vavnad, sasom ben. Detta dokument riktar sig darfor ocksa till den alginatbelagda titandioxidscaffolden eller ett medicinskt implantat innefattande den for anvandning for regenereringen, reparationen, ersattandet och/eller aterstallandet av vavnad, sasom ben.

Den alginatbelagda titandioxidscaffolden erhallbar genom metoden av foreliggande dokument kan ocksa anvandas fOr beredningen av ett medicinskt implantat for regenereringen, reparationen, ersattandet och/eller aterstallandet av vavnad. Den alginatbelagda titandioxidscaffolden kan ocksa anvandas for beredningen av ett medicinskt implantat for regenereringen, reparationen, ersattandet och/eller aterstallandet 20 av ben.

Den alginatbelagda titandioxidscaffolden erhallbar genom metoden av foreliggande dokument eller ett medicinskt implantat innefattande den kan ocksa anvandas i en metod for regenereringen, reparationen, ersattandet och/eller aterstallandet av vavnad innefattande implantationen i ett objekt i behov darav av scaffolden eller ett medicinskt implantat.

Biologiskt aktiva substanser (biomolekyler) Som namnt oven kan alginatlosningen och/eller den divalenta katjonlosningen innefatta en eller fler olika sorters biologiskt aktiva substans(er). Den biologiskt aktiva 30 substansen(erna) kan darfor inkorporeras i alginatbelaggningen. Alginatbelaggningen kan darfor verka som en barare for en biologiskt aktiv substans. Alginatbelaggningen kan innefatta en sorts biologiskt aktiv substans eller en blandning av tva eller fler biologiskt aktiva substanser. Som namnt ovan, nar alginatbelaggningen bereds genom att upprepa 17 steg b) och c) av metoden beskriven pa annat hall han kan de olika lagren innefatta olika biologiskt aktiva substanser.

Den biologiskt aktiva substansen kan vara vilken substans som heist som har en biologisk aktivitet i kroppen s5som en syntetisk eller naturligt bioaktiv molekyl, en naturlig eller syntetisk drog och/eller en levande cell. Oorganiska, biologiskt aktiva joner kan ocksa inkorporeras, s5som kalcium, krom, fluor, guld, jod, kalium, magnesium, mangan, selen, svavel, tenn, natrium, zink, strontium, nitrat, nitrit, fosfat, klorid, sulfat, karbonat, karboxyl och liknande.

Exempel p5 levande celler for inkorporering i alginatbelaggningen inkluderar, men är inte 10 begransade till,mesenkymalastamceller,benceller,pluripotentaceller, benprekursorceller, vaskulara celler, vaskulara prekursorceller och/eller stromaceller.

Exempel p5 biologiskt aktiva substanser inkluderar ocks5, men är inte begransade till, naturliga eller rekombinanta bioadhesiver, naturliga eller rekombinanta faktorer far cellfastande; naturliga, rekombinanta eller syntetiska biopolymerer; naturliga eller rekombinanta blodproteiner; naturliga eller rekombinanta enzymer; naturliga eller rekombinanta extracellular matrisproteiner; naturliga eller syntetiska extracellular matrisbiomolekyler; naturliga eller rekombinanta signalmolekyler, tillvaxtfaktorer och hormoner; naturliga, rekombinanta och syntetiska peptider, syntetiska peptidhormoner; naturlig, rekombinanta eller syntetiska deoxiribonukleinsyror; naturliga, rekombinanta eller syntetiska ribonukleotidsyror; naturliga eller rekombinanta receptorer; enzyminhibitorer; droger; biologiskt aktiva anjoner och katjoner; vitaminer; adenosinmonofosfat (AMP), adenosindifosfat (ADP) eller adenosintrifosfat (ATP); markorbiomolekyler; aminosyror; fettsyror; nukleotider (RNA- och DNA-baser), socker, antimikrobiella substanser, sasom tetracykliner, immunaktiva komponenter, antikroppar, antiinflammatoriska molekyler, matriskomponenter, internt oorganiserade proteiner, och sma biologiska organiska molekyler, s5som statiner och/eller bisfosfonater.

Peptider och proteiner som är lampliga for inkorporering i alginatbelaggningen inkluderar i synnerhet peptider och proteiner som är kanda att p5verka cellvaxt och/eller osseointegrering av implantat. Ett antal naturliga peptider har visats inducera mineralprecipitering och kan darfor lampligen inkorporeras i alginatbelaggningen. Exempel inkluderar kollagen 1 och 2, amelogenin, ameloblastin, bone sialoprotein, enamelin och ansokalcin. Deposition och vaxt av apatiter in i mineraliserade endoskelettvavnader är en process som guidas av polyprolinrika proteiner. Upprepningar 18 av polyprolin ar ett vanligt kannetecken hos extracellular hardvavnadsmatrisproteiner, och spelar en roll i komprimeringen av proteinmatrisen, variabilitet i konformation, apatitkristallangden och bindning till proteindomaner som är frekvent involverade i signaleringshandelser. Till exempel är emaljmatrisderivat (EMD) ett extrakt av 5 tandmaterial fran grisfoster som anvands for att biomimetiskt stimulera vaxten av mjukoch hardvavnad. EMD har ocksa visats ha en mangfald av andra biologiska aktiviteter, sasom inhibering av inflammation och infektion. En kommersiell produkt som innefattar EMD är Straumann®Emdogain (Straumann AG, Peter Merian-Wegde 12, CH 4052 Basel, Schweiz). EMD innehaller en stor mangd av amelogenin, vilket är ett protein som 10 lampligen kan inkorporeras i alginatmatrisen, sasom namnt ovan.

Ytterligare exempel pa peptider som är lampliga for inkorporering i alginatbelaggningen inkluderar peptider baserade pa konsensuspeptiderna beskrivna i WO 2008/078167, vilket inducerar biomineralisering.

Peptider P2 (SEQ ID NO 1), P5 (SEQ ID NO 2) och P6 (SEQ ID NO 3), som anvands i 15 den experimentella delen, är exempel pa peptider baserade pa konsensussekvenserna av WO 2008/078167 vilka lampligen inkorporeras i alginatbelaggningen. Andra exempel pa en sadan sekvens är P1 (SEQ ID NO 4: PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP), P3 (SEQ ID NO 5: PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP) och P4 (SEQ ID NO 6: PLV FCC PLV FCC PLV FCC PCP PLPP). 20 Diffusionshastigheten av biologiskt aktiva substanser valfritt inkorporerade i alginatbelaggningen paverkas av molekylvikten och storleken av de biologiskt aktiva substanserna (definierade genom Stokes radier) jamfort med porerna av alginatbelaggningen och beror pa den kemiska naturen av den biologiskt aktiva substansen (interaktioner molekyl-alginat, polarisering, d v s hydrofila substanser kan 25 diffundera mycket snabbt medan hydrofoba substanser diffunderar langsamt genom alginatgelen). En krevadlik frisattningsprofil av den biologiskt aktiva substansen under den forsta dagen eller dagarna efter implantation av den alginatbelagda titandioxidscaffolden i ett objekt kan finnas far en biologiskt aktiv substans som är mindre, sasom peptiderna som anvands i den experimentella delen av detta dokument. Genom att justera 30 porstorleken av alginatbelaggningen (se ovan) och genom att ta egenskaper hos den biologiskt aktiva substansen i beaktande (sasom molekylvikt, form, polaritet etc.) kan frisattningshastigheten av en inkorporerad biologiskt aktiv substans justeras. 19 Titandioxidscaffolden Titandioxidscaffolden som är lamplig for anvandning i samband med foreliggande dokument är en scaffold huvudsakligen bildad av titandioxid, d v s titandioxid är den huvudsakliga strukturella komponenten av titandioxidscaffolden. Titandioxidscaffolden ska 5 anta en Oppen poros struktur.

Titandioxidscaffolden är typiskt en makroporos scaffold innefattande makroporer och sammankopplingar. Makroporer av titandioxidscaffolden har en pordiameter i omradet av mellan ungefar 10-3000 pm, sasom 20-2000 pm, omkring 30-1500 pm eller omkring 30700 pm. Det är viktigt att titandioxidscaffolden tillater invaxten av storre strukturer sasom 10 blodkarl och trabekulart ben, d v s ocksa innefattar porer med en diameter av omkring 100 pm eller mer. Det är viktigt att atminstone vissa av porerna är sammankopplade och/eller delvis sammankopplade.

Pordiametern kan paverka hastigheten och omfattningen av vaxt av celler in i titandioxidscaffolden och darfor beskaffenheten av den resulterande vavnaden. Det 15 makroporosa systemet ockuperar typiskt atminstone 50 % av volymen av titandioxidscaffolden. Volymen av makro- och mikroporerna i titandioxidscaffoldarna kan variera beroende pa funktionen av titandioxidscaffolden. Om syftet med en behandling är att ersatta mycket benstruktur och titandioxidscaffolden kan hallas obelastad under lakningstiden kan titandioxidscaffolden tillverkas med ett makroporost system som 20 ockuperar upp till 90 % av den totala scaffoldvolymen.

Titandioxidscaffolden har typiskt en total porositet av omkring 40-99 %, sasom 70-90 %.

Fraktal dimension av stag av titandioxidscaffolden är typiskt omkring 2.0-3.0, sasom 25 omkring 2.2-2.3. Stagtjockleken paverkar styrkan av titandioxidscaffoldarna, ju tjockare stagen i titandioxidscaffolden är, desto starkare är titandioxidscaffolden.

Titandioxidscaffolden har typiskt en inre stagvolym av omkring 0,001-3.0 ium3, sasom omkring 0,8-1,2 p.m3. En lagre volym och ett hogre fraktalnummer ger en starkare 30 scaffold.

Fackmannen kommer att forsta att ytan av titandioxidscaffolden har en struktur pa mikronivan och nanonivan. Denna mikro- och nanostruktur kan modifieras beroende pa tillverkningsforhallandena. Pordiametrarna pa mikronivan ar typiskt i omradet av 1-10 p.m. Pordiametrarna pa nanonivan är typiskt mindre an 1 im i diameter.

En titandioxidscaffoldstruktur i foreliggande sammanhang har typiskt en kombinerad 5 mikro- och makropordiameter av ungefar 10-3000 prn, sasom 20-2000 pm, 30-1500 p.m eller 30-700 p.m. Pordiametern kan ocksa vara ovan med sammankopplade porer av atminstone 20 p.m.

Storleken och formen av titandioxidscaffolden bestams beroende pa dess avsedda 10 anvandning. Storleken och formen av titandioxidscaffolden kan anpassas antingen pa tillverkningsstadiet eller genom senare modifiering av ett fardigt scaffold. Titandioxidscaffoldarna kan darfor latt skraddarsys for deras specifika anvandning i ett specifikt objekt. Typiskt justeras storleken, formen etc. av titanidioxidscaffolden innan den belaggs med en alginatbelaggning. 15 Typiskt kan titandioxidscaffolden produceras genom en metod av att doppa en polymersvampstruktur i en titandioxiduppslamning (se t ex metodema beskrivna i WO 08078164), tillata uppslamningen att stelna pa svampen och utfora ett eller fler sintringssteg for att ta bort svampen och skapa en stark scaffoldstruktur. Titandioxidscaffolden kan darfor till exempel vara en titandioxidscaffold beskriven i WO 20 08078164. En sadan metod kan inkludera stegen av att: bereda en uppslamning av titandioxid, tillhandahalla uppslamningen av steg a) till en brannbar poros struktur, sasom en poros polymerstruktur, sasom en svampstruktur tillata uppslamningen att stelna pa den brannbara porosa strukturen; d) ta bort den brannbara porosa strukturen fran den stelnade titandioxiduppslamningen, van i steg d) kan utforas genom i)langsam sintring av den brannbara porosa strukturen med den stelnade metalloxiduppslamningen till omkring 500°C och bibehallande av denna temperatur i atminstone 30 minuter, ii)snabb sintring till omkring minimum 1500 °C eller till omkring 1750 °C vid ca 3 K/min och bibehallande av denna temperatur i atminstone 10 timmar; och 21 iii)snabb kylning till rumstemperatur atminstone 3 K/min.

Uppfinningen kommer vidare att beskrivas i de foljande exemplen vilka inte begransar omfattningen av uppfinningen sasom beskriven i patentkraven. 22 EXP E RIM ENTALDEL Exempel 1: Beredning av alginathydrogel med och utan biologiskt aktiv substans Tabell 1. Aminosyrasekvens av syntetiska prolinrika peptider.

Peptid Sekvens (N-terminal till C-terminal) Polar AA Hydrofob AA P2 (SEQ ID NO 1) PLVPSQPLVPSQPLVPSQPQPPLPP 7 (S,Q) 18 (P,L,V) P5 (SEQ ID NO 2) PLVPSSPLVPCCPLVPCCPSPPLPP 3 (S) 22 (P,L,V,C) P6 (SEQ ID NO 3) PHQPMQPQPPVHPMQPLPPQPPLPP 7(H,Q) 18 (P,M,V,L) Aminosyra (AA); peptid 2 (P2); peptid 5 (P5); peptid 6 (P6); S = Ser; P = Pro; L = Leu; V = 5 Val; Q = Gln; M = Met; H = His; C = Cys. 1.Material och metoder 1.1.Beredning av peptid och emaljmatrisderi vat Emaljmatrisderivat (EMD) tillhandaholls vanligen av Straumann GmbH (Basel, Schweiz). EMD lostes till 10 mg/ml i 0,1 % attiksyra i fosfatbuffrad saltlosning (PBS) (PAA 10 Laboratories GmbH, Pasching, Osterrike). Tre syntetiska peptider (Tabell 1) designades som beskrivet i detalj i tidigare studier (Rubert M et al., 2011).

Peptider inkOptes fran Eurogentec (Seraing, Belgien). De syntetiska peptiderna lostes upp till Seller 10 mg/ml (i fallet med peptid 2 FITC-markt) i 0,1 % attiksyra i PBS. Alikvoter for att undvika upprepade frys-tiningscykler bereddes och lagrades vid -°C till 15 anvandning. 1.2.Beredning av alginathydrogeler Natriumalginat (Pronova UP LVG 0) - en lagviskos alginat dar minimum 60 % av monomererna är guluronat - inkoptes fran NovaMatrix (FMC BioPolymer AS, Norge). Natriumalginaten anvandes utan vidare rening. Tva procent (vikt/vol) natriumalginat 20 bereddes i PBS och omrordes vid 180 vpm vid rumstemperatur over natt for att fa en homogen alginathydrogel. Alginatlosningen blandades med syntetiska peptider eller EMD vid en slutlig koncentration av 50 pg/ml. LOsningen av alginat innehallande syntetiska peptider/EMD distribuerades sedan till 24-hals odlingsplattor och sprayades med 300 mM CaCl2 genom anvandning av en aerograph paint atomizer (Precisso CD, Madrid, Spanien). 23 Efter 1-2 timmars inkubering vid rumstemperatur var alginathydrogelen fullstandigt gelnad. 1.3. Karakterisering av morfologi av alginathydrogel genom skannande elektronmikroskopi 5 Morfologi av 2 (3/0 kontrollalginathydrogeler och 2 % alginathydrogeler innehallande syntetisk peptid 2 (50 pg/ml) observerades genom aft anvanda skannande elektronmikroskop (SEM, Hitachi S-3400N, Hitachi High-Technologies Europe GmbH, Krefeld, Tyskland). Mikrostruktur av alginathydrogeler (ej lyofiliserade och lyofiliserade) observerades. For alginathydrogellyofilisering frystes prover vid -80 °C foljt av lyofilisering 10 vid -°C. Prover frystes sedan i N2 for aft tillata ett exakt snitt till tvarsnitt genom aft anvanda en vass skalpell. Strukturer av alginathydrogeler observerades vid x25 och x100 forstoring genom att anvanda 10 kV och 40 Pa. Environmental secondary electron detector (ESED) anvandes for bilder vid x25 forstoring och aterspridningselektrondetektor (back scatter electron detector (BSED)) anvandes for bilder x100 forstoring. Diametern av 15 varje por mattes genom aft anvanda mjukvaran fran SEM, Hitachi S-3400N. 1.4.Frisattningsprofil f6r peptid Far att studera peptidfrisattningsprofilen, marktes P2 med FITC. Frisattningen av peptid innehallen i den 2 %-iga alginathydrogelen (50 pg/ml) kvantifierades genom fluorescensspektroskopi. Forst tvattades alginathydrogelerna med odlingsnnedium for aft 20 ta bort overskottet av 0a012. Sedan tillsattes 750 pl av cellodlingsmedia pa peptidladdad alginathydrogel. Proverna inkuberades vid 37 °C och 5 % CO2 i 21 dagar och cellodlingsmedia byttes tva ganger i veckan. Vid forbestamda tidpunkter (24 tim, 4 d, 7 d, 11 d, 14 d, 18 d och 21 d) samlades supernatanter och analyserades genom fluorescensspektroskopi (A ex 490 nm och A em 525 nm) for aft bestamma mangden av 25 peptid frisatt till medierna. Mangden av peptid frisatt under tvattsteget mattes ocksa. Experimentet uffordes tre ganger och varje prov analyserades i triplikat.

Relativa fluorescensenheter korrelerade med mangden frisatt peptid genom att anvanda en linjar standardkurva for varje tidpunkt. 1.5.Cellodling av MC3T3-E1 30 Musosteoblastcellinjen M03T3-E1 (DSMZ, Braunschweig, Tyskland) bibeholls som tidigare beskrivet (Tiainen H et al., 2011). Innan sadd tvattades 24-hals odlingsplattor innehallande tvarbundna alginathydrogeler med 750 pl av odlingsmedium for att ta bort overskott av CaCl2. Efter utvardering av effektiviteten av cellvidhaftning pa 2 % alginatgel 24 genom att anvanda olika celldensiteter, saddes, for de slutliga experimenten, celler vid en densitet av 100 000 celler/brunn. Media fornyades tv5 ganger per vecka. Odlingsmedia samlades 24 timmar efter sadd for att studera cellviabilitet. Celler skordades vid dagar 14 och 21 for att analysera genuttryck av cellvidhaftnings- och osteogenrelaterade markorer 5 genom att anvanda realtids RT-PCR. Odlingar observerades rutinmassigt genom att anvanda ljusmikroskopi (Leica DMIRB, Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Tyskland). 1.6.Cellvidhaftning till 2 % alginatgel Vidhaftning av celler p5 alginathydrogelen efter en och fern dagar efter s5dd utvarderades for att bestamma den basta densiteten for sadd kir experimenten. Densiteter fran 10 30 x 4 till 200 x 4 celler/brunn testades. Celler som var vidhaftade pa alginathydrogelen lyserades med en frys-tiningsmetod i avjoniserat destillerat vatten. Cellysat anvandes for bestamning av DNA-kvantitet genom att anvanda Hoechst 33 258 fluorescensanalys. Prover blandades med 20 pg/ml av Hoechst 33 258 fluorescensfarg (Sigma, St. Quentin Fallavier, Frankrike) i TNE-buffert och intensiteten av fluorescens 15 mattes vid exciterings- och emissionsvaglangder av 356/465 nm genom att anvanda en multifunktions mikroplattlasare (Cary Eclipse fluorescens spektrofotometer, Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Relativa fluorescensenheter korrelerades med cellantal genom att anvanda en linjar standardkurva.

MC3T3-E1-celler vidhaftade p5 alginathydrogeler efter en och fern dagars odling 20 visualiserades genom konfokalmikroskopi (Leica TCS SPE Microsystems Wetzlar GmbH, Wetlzar, Tyskland). I korthet fixerades celler sadda pa alginathydrogeler med 4 % formaldehyd i PBS vid 4 °C i 10 min. For fargning permeabiliserades celler i 0,2 % triton och autofluorescens fran material blockerades med 3 °A BSA in PBS. Cytoskelettet hos cellerna fargades genom att anvanda 5 pg/ml FITC phalloidin (Sigma, St. Quentin 25 Fallavier, Frankrike) och [Kaman med DAPI (Sigma, Schnelldorf, Tyskland). Vidare observerades cellvidhaftningen och —fastandet av 100 x 3 celler initialt sac:Ida p5 2 % alginathydrogeler efter cellfixering med 4 % formaldehyd i PBS vid 4 °C i 10 min foljt av visualisering genom att anvanda SEM och ESED vid 10 kV, x200 och 40 Pa. 1.7.Cellviabilitet 30 LDH-aktiviteten som bestamdes i odlingsmedia efter 24 timmar togs som en indikator av membranlackage eller cellys. Aktiviteten av det cytosoliska enzymet uppskattades som tidigare beskrivet (Rupert M et al., 2011).

Tabell 2. Sekvens av osteoblastmarkorrelaterade gener.

Gen Primersekvens 18S S 5"- GTAACCCGTTGAACCCCATT -3" (SEQ ID NO 7) A 5"- CCATCCAATCGGTAGTAGCG -3" (SEQ ID NO 8) GAPDH S 5"- ACCCAGAAGACTGTG-GATGG -3" (SEQ ID NO 9) A 5"- CACATTGGGGGTAGGAACAC -3" (SEQ ID NO 10) Itga8 S 5"- TCGCCTGGGAGGAGGCGAAA -3" (SEQ ID NO 11) A 5"- TCTTAACCGCTGTGCTCCCCG -3" (SEQ ID NO 12) Itgb1 S 5" AGCAGGCGTGGTTGCTGGAA -3" (SEQ ID NO 13) A 5"- TTTCACCCGTGTCCCACTTGGC -3" (SEQ ID NO 14) Itgb3 S 5"- AGGGGAGATGTGTTCCGGCCA -3" (SEQ ID NO 15) A 5"- ACACACAGCTGCCGCACTCG -3" (SEQ ID NO 16) Fnl S 5"- GCTGCCAGGAGACAGCCGTG -3" (SEQ ID NO 17) A 5"- GTCTTGCCGCCCTTCGGTGG -3" (SEQ ID NO 18) Bmp2 55'- GCTCCACAAACGAGAAAAG-C -3" (SEQ ID NO 19) A 5"- AGCAAGGGGAAAAG-GACACT -3" (SEQ ID NO 20) Coll-/ S 5"- AGAGC-ATGACCGATGGATTC -3" (SEQ ID NO 21) A 5"- CCTTCTTGAGGTTGCCAGTC -3" (SEQ ID NO 22) Bsp 55'- GAAAATGGAGACGGCGATAG -3" (SEQ ID NO 23) A 5"- A000GAGAGTGTGGAAAGTG-3" (SEQ ID NO 24) Alp S 5"- AACCCAGACACAAGCATT-CC -3" (SEQ ID NO 25) A 5"- GAGAGCGAAGGGTCAGTCAG -3" (SEQ ID NO 26) Oc S 5"- CCGGGAGCAGTGTGAGCTTA -3" (SEQ ID NO 27) 26 A 5"- TAGATGCGTTTGTAGGCGGTC -3" (SEQ ID NO 28) OpnS 5"- TCTGCGGCAGGCATTCTCGG -3" (SEQ ID NO 29) A 5"- GTCACTTTCACCGGGAGGGAGGA -3" (SEQ ID NO 30) 1.8.Isolering av total-RNA och utttyck av osteoblastmarkorer genom realtids-RT-PCR Effekten av syntetiska peptider och EMD laddade in i alginathydrogelerna pa genuttryck studerades efter 14 och 21 dagars behandling pa preosteoblast MC3T3-E1-celler. 5 Total-RNA isolerades genom att anvanda Tripure® (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) enligt tillverkarens protokoll. Total-RNA kvantifierades vid 260 nm genom att anvanda en Nanodrop spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA).

Samma mangd av RNA (350 ng) transkriberades omvant till cDNA genom att anvanda hogkapacitets-RNA-till-cDNA-kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), enligt protokollet 10 av leverantoren. Alikvoter av vale cDNA frystes (-20°C) tills PCR-reaktionerna utfordes.

Realtids-PCR utfordes i Lightcycler 4800 (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) genom att anvanda SYBR green detektion. Realtids-PCR utfOrdes for tva referensgener (18SrRNA och glyceraldehyde-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH)) och tio malgener (integrin alfa 8 (Itga8), integrin beta1 (Itgb1), integrin beta 3 (Itgb3), fibronektin 1 (Fn1), bone 15 morphogenic protein 2 (Bmp2), kollagen typ I (Coll-/), bone sialoprotein (Bsp), alkalint fosfatas (Alp), osteokalcin (Oc) och osteopontin (Opn)).

Primersekvenser anges i Tabell 2. Reaktionsforhallanden och relativ kvantifiering har utforts som tidigare beskrivet (Tiainen H etal., 2011). 1.9.Statistiska analyser 20 Alla data presenteras som medelvarden ± SEM. Skillnader mellan grupper bedomdes genom Mann-Whitney-test eller genom Studentens t-test beroende pa deras normaldistribution. For att mata korrelationen mellan olika variabler anvandes Pearsonkorrelationsanalys. SPSS® -programmet for Windows (Chicago, IL) version 17.0 anvandes. Resultat ansags statistiskt signifikanta vid p-varden 27 Resultat Alginatmikrostruktur Figur 1 visar mikrostrukturen av ett tvarsnitt fran en lyofiliserad 2 % alginathydrogel (Figurer 1 A) och B)) och 2 % alginathydrogel innehallande syntetisk peptid (Figurer 1C) 5 och D)). Som ses i SEM-bilderna observerades en poros och sammankopplad struktur i alla analyserade geler aven om alginatgel innehallande syntetisk peptid visade en mer irreguljar struktur an 2 % alginathydrogel. Bada tvarbundna hydrogelerna presenterade en poros och sammanbunden struktur med en pordiameter av 42.9 ±3.pm och 44.7 ± 4.1 pm, for 2 % alginathydrogel utan respektive med syntetisk peptid.

Peptidtillforsel fran 2 % alginathydrogel Peptidfrisattningsprofil fran 2 % alginathydrogeler visas i Figur 2. En krevadfrisattning av peptid under de fOrsta 24 timmarna av inkubering observerades (54,67 (Y0). Vidare, som ses i den kumulativa frisattningsprofilen, frisattes 25,8 % av peptid langsamt upp till 11 dagar, foljt av en fordrojd frisattning Over tid upp till 21 dagar. Vid slutet av experimentet 15 (efter 21 dagar) hade 5,6 % av den totala peptiden teoretiskt innehallen i alginathydrogelen inte frisatts. Det skall noteras att 12,7 % av den laddade peptiden frisattes under tvattsteget av alginathydrogelerna med odlingsmedia fOr att ta bort overskott av CaCl2.

Cellvidhaftning och —proliferering 20 En lag hastighet av cellvidhaftning pa alginathydrogelerna observerade eftersom mer an halften av de sadda cellerna inte vidhaftade till gelen en dag efter plattning. Trots detta faste celler till alginathydrogelen och prolifererade Over cellodlingen (Figur 3). Vidare visualiserades celler genom konfokalmikroskopi for att verifiera formagan av osteoblaster att fasta och sprida sig pa alginathydrogelytor. Konfokalbilder visar en okning i antalet av 25 karnor atfoljt av en okning i aktinfargning som stort antal av celler sadda och okande fran dag 1 till dag 5 (Figurer 3A)-H)). Vidare uppskattades cellfilopodia av osteoblaster odlade pa alginathydrogelen genom SEM (Figur 3J)). DNA-innehallet anvandes fOr att bestamma antalet av celler narvarande pa alginathydrogeler. Som ses i Figur 31) sags okande procenthalt av cellproliferering nar antalet av initiala celler sadda pa gelen okade. Darfor, 30 medan ingen proliferering fran dag 1 till 5 sags nar saddensiteten var 30 x 3 celler/brunn, sags en 122,9%, 98,1% och 91,8% okning for saddensiteter av 60 x 3, 100 x -3 respektive 200 x 3 celleribrunn. Bland de olika saddensiteterna som testades var 28 100 x 3 celleribrunn den som gemensamt uppvisade rimligt initialt cellfastande och en okning i cellproliferering och valdes darfor for vidare experiment.

Effekt av alginathydrogel laddad med syntetiska peptider pa cellviabilitet Inga toxiska effekter sags i celler odlade pa alginathydrogeler innehallande syntetiska 5 peptid, vare sig efter 24 timmar (Figur 4) eller efter en lang tidsperiod (data visas ej). P2 okade signifikant cellviabilitet efter 24 timmar jamfort med EMD, medan P5 visade signifikant lagre toxiska effekter jamfort med EMD och obehandlad alginatgel.

Effekter av alginathydrogeler laddade med syntetiska peptid pa genutttyck av cellvidhaftningsmarkorer 10 Uttryck av Itga8 var okat i celler behandlade med P5 jamfort med kontroll efter 21 dagars odling (Figur 5A)). m-RNA-nivaer av Itgbl minskade signifikant efter behandling med P2 och P6114 dagar jamfort med kontroll. Efter 21 dagar, reducerade celler behandlade med P6 signifikant m-RNA-nivaer av Itgbl jamfort med EMD (Figur 58)). Itgb3 och Fnl minskade signifikant efter 14 dagars behandling med P2 och P6 jamfort med kontroll 15 (Figurer 5C) och D)) och inga skillnader observerades efter 21 dagar.

Effekt av alginathydrogel laddad med syntetiska peptid pa genutttyck av osteoblastmarkorer Relativa nivaer av Bmp2-mRNA okade signifikant efter 14 dagars behandling med P6 medan de minskade efter 21 dagars behandling med P2 jamfort med EMD. Aven om 20 EMD-behandling inducerade en signifikant minskning av nivaer av Bmp2-mRNA efter 14 dagars odling jamfort med kontroll, sags en 6kning av nivaer av Bmp2-mRNA efter 21 dagar, aven om skillnader inte nadde statistisk signifikans (Figur 6A)).

Coll-/-genuttryck minskade signifikant efter 14 dagars behandling med vilken som heist av de syntetiska peptiderna jamfort med kontroll (Figur 68)). lnga skillnader i nivaer av Bsp- 25 mRNA sags bland de olika behandlingarna (Figur 6C)). Nivaer av ALP-mRNA minskade signifikant efter behandling med P6114 dagar och 21 dagar och med P2 efter 21 dagars behandling jamfort med kontroll (Figur 6D)). Efter 14 dagars cellodling detekterades okade nivaer av Oc-mRNA i celler odlade pa 2 °A alginatgel och innehallande syntetiska peptider jamfort med celler behandlade med EMD. Efter 21 dagar hade celler behandlade 30 med P5 eller P6 okade nivaer av Oc-mRNA jamfort med kontroll (Figur 6(E)). Uttryck av Opn minskade signifikant efter 14 dagars odling med P2 och P6 jamfort med kontroll. Efter 21 dagar okade nivaer av Opn-mRNA signifikant med vilken som heist av de 29 syntetiska peptiderna och EMD jamfort med kontroll. EMD-behandling okade markant uttrycksnivaer av mRNA av Opn jamfort med P2 och P6 (Figur 6F)).

Diskussion Polyprolinrika syntetiska peptider har tidigare visats inducera benbildning och 5 mineralisering in vitro och minskad benresorption in vivo. Syftet med denna studie var aft utveckla en lamplig formulering med en hydrogel f6r lokal behandling med dessa syntetiska peptider for att gynna benbildning och mineralisering, antingen i sig sjalva eller som en bionedbrytbar belaggning for skelettimplantat.

I foreliggande studie exponerades celler for alginatgel innehallande olika syntetiska 10 peptider och odlades under en Ong tidsperiod for att utvardera effekten av dessa peptider pa det biologiska svaret av osteoblaster. Den optimala formuleringen av hydrogelen maste tillata bildningen av en kompakt struktur for en kontrollerad, lokal och specifik tillforsel av bioaktiv molekyl. Sadana egenskaper styrs av den fysikaliska egenskapen (t ex mekanik, nedbrytning, gelbildning), masstransportegenskapen (t ex diffusion) och 15 kraven for biologisk interaktion (t ex cellvidhaftning och -signalering) for varje specifik tillampning.

Tidigare studier utforda genom att anvanda alginat gel (Protanal LF200M, FMC polymers, Oslo, Norge) vid olika polymerkoncentrationer (1 %, 2 %, 3 %, 6 % och 10 %) har visat en minskning i porstorlek nar polymerkoncentrationen okar, vilket resulterar i koncentrationen 20 av 2 % som den mest lovande formuleringen att verka som en peptidvehikel. Med detta i beaktande tvarbands 2 % alginathydrogel joniskt med 300 mM av CaCl2 och valdes som det valda materialet.

SEM-analys av mikrostrukturen av bade alginatgeler med och utan syntetiska peptider efter en process av lyofilisering visade en poros och sammanbunden struktur med en 25 pordiameter av 42-44 pm; likval observerades en kompakt struktur med en porstorlek av ungefar 1 pm i diameter efter SEM-analys av ej lyofiliserade geler (data visas ej). Diffusionshastighet av proteiner paverkas av molekylvikten och storleken av det som diffunderar (definierat genom Stokes radier) jamfOrt med dessa parer och beror av den kemiska naturen av proteinet (interaktioner molekyl-alginat, polarisering, d v s hydrofila 30 droger kan diffundera mycket snabbt medan hydrofoba droger diffunderar langsamt genom gelporerna). Pa grund av faktumet att syntetiska peptider anvanda i foreliggande studier är sma peptider av 25 aminosyrors langd (molekylvikt i omradet av 2509,172782,34 Da) kan en latt diffusionshastighet genom gelen forvantas. Foljaktligen uppvisade i foreliggande studie en peptid laddad i 2 % alginathydrogeler en krevadlik frisattning under de forsta 24 timmama av inkubering foljt av progressiv och fordrojd frisattning under 21-dagarsperioden.

Effektiviteten av alginatgel for cellvidhaftning och —proliferering undersoktes ocksa eftersom alginat har beskrivits som ett inert substrat med otillracklig proteininteraktion for cellvidhaftning och det har fOreslagits att mammalieceller inte kan interagera med omodifierade alginathydrogeler. I sjalva verket kopplar de fiesta studier med alginathydrogel ett helt ECM-protein eller en peptidsekvens kapabel att binda cellulara receptorer kovalent till polymeren for att fa en hogt specifik vidhaftande yta. Mycket riktigt har vissa studier rapporterat att modifiering av alginat med en RDG-innehallande peptid 10 gynnade cellvidhaftning och —spridning medan minimal cellvidhaftning observerades pa omodifierade alginathydrogeler. Emellertid visar foreliggande studie att omodifierad alginathydrogel (Pronova UP LVG 0) tillater cellvidhaftning och —spridning. Skillnaderna mellan de rapporterade studierna verkar vara pa grund av det beskrivna forhallandet mellan kompositionen och renheten av alginatgelerna som anvands och formagan hos celler att proliferera pa deras ytor. I foreliggande studie inneholl den anvanda alginaten ett minimum av 60 % G-fraktioner, vilket darfor tillat cellfastande och —spridning. Den optimala saddensiteten for in vitro-studierna utvarderades genom DNA-kvantifiering. Resultaten visade att 100 x 3 celler/brunn var densiteten med hogre effektivitet i bade cellvidhaftning och cellproliferering och valdes darfor for vidare studier. Alginathydrogelen visade sig vara icke-toxisk for MC3T3-E1-cellerna, och uppvisande nagot slags skyddande effekt pa cellviabilitet jamfort med celler odlade pa vavnadsodlingsplast. Vidare bekraftades att de syntetiska peptiderna som administrerades som en hydrogelformulering är icke-toxiska, i enlighet med resultaten erhallna i tidigare studier efter cellbehandling under rang och kort tid.

Stabil osteoblastcellvidhaftning astadkoms i hog grad av integriner, heteromera receptorer sammansatta av a och [3 -subenheter som dimeriserar i specifika kombinationer och interagerar med extracellular matrisproteiner. Det har visats att osteoblaster uttrycker olika integrinreceptorer beroende pa materialet dar de vaxes. Forutom deras roll vid cellvidhaftning reglerar integriner cytoskelettorganisation och medierar signaltransduktion 30 och reglerar darfor uttrycket av gener som kontrollerar proliferering, differentiering och matrixremodellering.

For att undersoka om de syntetiska peptiderna kan paverka integrinuttryck och cellvidhaftning pa alginathydrogeler studerades mRNA-uttrycksnivaer av Itga8, Itgbl, Itgb3 och det cellulara matrisproteinet Fnl. Uttrycket av Itgbl, Itgb3 and Fnl var 31 signifikant minskat efter 14 dagars behandling med syntetiska peptider, i synnerhet for P2 och P6. /31integrinsubenheten hittas i benreceptorer for kollagen, fibronektin och laminin och medierar vidhaftning av osteoblaster till ECM medan av/33-integrin skulle mediera vidhaftningen till Opn och vitronektin. Av intresse är upptackten att uttryck av av/33- 5 integrin stimulerar cellproliferering och inhiberar matrismineralisering i osteoblastceller; och att FN — ett rikligt forekommande ECM-protein som binder till ett stort antal integriner, inkluderande [31- och [33-integrinsubenheter — ocksa uttrycks i hog grad i de tidiga stadierna av osteogenes medan dess ackumulering i matrisen reduceras under cellmognad. Vidare okade behandling med de syntetiska peptider signifikant Itga8-uttryck 10 efter 21 dagars behandling och markant nar celler behandlades med P5. Itga8 har visats interagera med osteopontin (Opn) ett protein som uts6ndras av osteoblaster involverade i cellvidhaftning och —proliferering, vars uttryck okar efter mineralisering har initierats. Har visade bilateral korrelationsanalys mRNA-uttrycksnivaerna av Itga8 och Opn en Pearson korrelation av 0,678 (p <0,01). Dessa resultat kan indikera att celler behandlade med de 15 syntetiska peptiderna är i ett senare stadium av cellmognad jamfort med kontrollgruppen och är i linje med uttrycksresultaten av de analyserade osteoblastmarkorerna. Det har beskrivits att den korta sekvensen av PPXPP i den C-terminala regionen av peptider deltar i transaktiveringsaktiviteten av transkriptionsfaktorer och/eller samaktivatorer. Verkningsmekanismen av de syntetiska peptiderna kan involvera interaktion med en 20 receptor som är kapabel att inverka pa intracellulara signaleringskaskader och att exposition av deras C-terminaler innehallande konserverad prolinrik region (PPLPP) kan vara av vikt i signalaktiviteten av de syntetiska peptiderna. De syntetiska peptiderna visar signatur av kompakta, valpackade strukturer som saknar element av sekundarstruktur, som forvantat pa grund av det rika innehallet av proliner och exponerar deras PPLPP- 25 stracka pa ett satt som är lampligt for interaktioner. Medan peptid 2 och peptid 6 presenterar tva distinkta looper, har peptid 5 en skild topologi av loopar som gar en kontakt mellan C- och N-terminalerna mojlig. Faktumet att dessa strukturella skillnader i tillgangligheten av C-terminalen och den strukturella rigiditeten av denna korta konsensussekvens (PPXPP) mellan olika peptider skulle kunna paverka interaktionen 30 med en receptor kan darfor forklara skillnaden i uttryck av vidhaftningsgener.

A ena sidan sags det att osteokalcin, den mest specifika och senaste av uttryckta osteoblastmarkorer med en roll i mineralisering, var signifikant inducerad efter 14 och 21 dagars behandling med de formulerade syntetiska peptiderna jamfort med obehandlad och EMD-alginatgel, dvsi overensstammelse med resultaten erhallna nar administrerad i 35 odlingsmedia. Foljaktligen, var Opn, ett sialoprotein producerat vid olika stadier av 32 differentiering med hoga nivaer uttrycka efter mineralisering har initierats, signifikant uppreglerat efter 21 dagars behandling med bade EMD och syntetiska peptider jamfort med kontroll. A andra sidan, observerades vid de studerade tidpunkterna inga skillnader i uttrycket av gener relaterade till osteogenesBmp-2, Bsp och Alp) eftersom dessa 5 gener är reglerade vid tidigare stadier an osteokalcin under osteoblastdifferentiering, i huvudsak under prolifererings- och matrismognadsfasen. Det är intressant att notera att alla studierna som har utforts hittills med de syntetiska peptiderna upprepat har visat en okning i osteokalcin-mRNA-nivaer, bade in vitro och in vivo. Relevansen av denna mark& har demonstrerats i en ny in vivo-studie (Monjo M et al., 2012), dar den basta prediktiva 10 markoren for osseointegrering av Ti-implantat bland alla var osteokalcin. Det forslas aft de syntetiska peptiderna forbattrar egenskaperna hos alginathydrogelen for cellfastande och att cellema odlade pa hydrogelen formulerade med syntetiska peptider var i ett mer moget stadium av differentieringsprocessen over cellerna odlade pa kontrollhydrogel och hydrogel formulerad med EMD. 15 Man kan anta att verkningsmekanismen av de syntetiska peptiderna kan involvera interaktion med en receptor som Or kapabel av att inverka pa cellulara signaleringskaskader under de initiala stadierna av celldifferentiering for att slutligen stimulera osteoblastdifferentiering och att tillgangligheten och strukturella rigiditeten av denna korta konsensussekvens (PPXPP) kan vara av vikt i signaleringsaktiviteten av de 20 syntetiska peptiderna. Fran de foreliggande resultaten antas det vidare att peptiderna kunde binda till integrinerna som uttrycks pa cellyta, vilket forst kunde Oka osteoblastfastandet pa alginathydrogelytan och sekundart modulera uttrycket av gener relaterade med mogen osteoblast-fenotyp.

Slutsats 25 Slutligen demonstrerar resultaten att 2% av alginathydrogel Or en lamplig formulering for den lokala tillforseln av syntetiska polyprolinrika peptider, inducerande integrin alfa 8-, osteopontin- och osteokalcinuttryck i MC3T3-E1-celler. Dessa peptidmodifierade alginathydrogeler kan representera en ny generation av injicerbara barare med biologiskt aktiv substans for tillampningar i benvavnadsregenerering och Or lovande for anvandning 30 som bionedbrytbara belaggningar for skelettimplantat, sasom titandioxidscaffoldar. 33 Exempel 2: Framstallning av en alginatbelagd titandioxidscaffold MATERIAL OCH METHODER 2.1.Framstallning av syntetisk peptid 2 (P2).

Syntetisk prolin-rik peptid 2 (P2) (2HN- PLVPSQPLVPSQPLVPSQPQPPLPP-000H) 5 (SEQ ID NO 1) inkoptes fran Eurogentech (Seraing, Belgien). Ett ror innehallande 7,2 mg av den valda syntetiska peptiden tillfordes i en frystorkad pelletform och lostes upp till 10 mg/ml i 0,1% attiksyra i fosfatbuffrad saltlosning (PBS) (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Osterrike).

Alikvoter bereddes for att undvika upprepade cykler av frysning-tining och lagrades vid 10 -20°C till anvandning. 2.2.Framstallning av 2 % alginat innehallande peptid 2.

Natriumalginat (Pronova UP LVGC)) — en lagviskos alginat dar minimum 60% av monomerar är guluronat — inkoptes fran NovaMatrix (FMC BioPolymer AS, Norge).

Natriumalginaten anvandes utan vidare rening. Kvantitet (2 %, vikt/volym) av 15 natriumalginat lostes upp i destillerat vatten genom omrorning i 3 timmar vid rumstemperatur for att fa en homogen alginatlosning. En fixerad koncentration (50 pg/ml) av P2 sattes till losningen och omrordes i 1 timme. 2.3.Till verkning av Ti02_scaffoldar belagda med 2% alginat innehallande P2.

De porosa Ti02-scaffoldarna producerades genom polymersvampreplikering som tidigare 20 beskrivet av (Tiainen H et al., 2010), med en storlek av 9 mm i diameter och 8 mm hojd. Sedan belades Ti02-scaffoldarna med ett lager av 2 `)/0 alginatgel med eller utan P2. I korthet nedsanktes Ti02-scaffoldarna i 2 % alginatlosning med eller utan P2 under skakning vid 100 vpm pa en orbitalskak (IKA Vibrax VXR basic, Staufen, Tyskland) i 1 timme vid rumstemperatur. Scaffoldar centrifugerades sedan vid 252xg i 1 min. Prover 25 nedsanktes i 50 mM CaCI21 1 timme for att tillata gelning. Scaffoldar skoljdes sedan med dH20 for att ta bort overskott av CaCl2. Slutligen fick prover torka over natten vid rumstemperatur. Scaffoldar belagda med ett lager av 2 % alginatgel (kontrollalginatscaffold) anvandes som kontrollgrupp medan obelagda Ti02-scaffoldar (utan alginat SC) ocksa anvandes som kontrollgrupp. 34 2.4.Frisattningsprofil for peptid 2 fran Ti02-scaffoldar belagda med 2% alginatgel.

Ti02-scaffolds belagda med 2 % alginat innehallande peptid 2 (P2-alginatbelagd scaffold) placerades i 48-halsplattor (Nunc GmBh & Co. Kg, Langenselbold, Tyskland) innehallande 1 ml destillerat vatten (pH 7,4). For aft efterlikna cellodlingsforhallanden 5 skakades prover pa en orbitalskak vid 200 vpm (IKA® Schuttler MTS 2, Tyskland) i 6 timmar vid 37 °C och under fuktiga forhallanden (genom att anvanda en behallare med destillerat vatten). Sedan bibeholls prover vid 37 °C i en fuktsatt atmosfar i upp till 21 dagar. Vid forbestamda tidpunkter (2 d, 5 d, 7 d, 9 d, 12 d, 14 d, 16 d, 19 d och 21 d), samlades destillerat vatten upp och farskt destillerat vatten sattes till vale brunn. 10 Provabsorbanser analyserades genom UV-Vis-spektrofotometer (PerkinElmere Lambda 25 UVNis Systems, USA) vid en vaglangd av 206 nm for att bestamma mangden av frisatt peptid. ParallelIt anvandes Ti02-scaffoldar med ett lager av 2 % alginatgel som kontroll for att dra bort absorbansvarden erhallna fran degraderingsprodukter fran alginat.

Relativa absorbansenheter korrelerades med mangden av frisatt peptid genom att 15 anvanda en linjar standardkurva for varje tidpunkt och den kumulativa P2-frisattningen beraknades sedan. Experimentet uffordes i triplikat. 2.5.Cellodling av MC3T3-E1 pa belagda och obelagda Ti02-scaffoldar.

Ti02-scaffoldar (SC) obelagda och belagda med 2% alginat med eller utan peptid (P2 och kontroll (-)) placerades i 48-halsplattor (Nunc GmbH & CO. KG, Langenselbold, Tyskland) 20 under sterila forhallanden. Caller saddes vid en densitet av 200 000 celler/scaffold och bibeholls i a-MEM (PAA Laboratories, Pasching, Osterrike) kompletterat med 10% FBS (PAA Laboratories, Pasching, Osterrike) och 100 E penicillin/ml och 100 pg streptomycin/ml antibiotika (PAA Laboratories, Pasching, Osterrike). For att garantera en homogen celldistribution inuti scaffolden anvandes en skaksaddmetod (Takahashi Y et al., 2003). I korthet, after tillsats av 1 ml av cellsuspension till scaffoldarna, skakades plattor pa en orbitalskak (Unitron, Infors HT, Basel, Schweiz) i 6 timmar vid 180 vpm vid 37°C och under fuktiga forhallanden. Sedan bibeholls cellar vid 37 °C i en fuktsatt atmosfar av 5 % CO2 i upp till 21 dagar. Odlingsmedia (1m1) fornyades varannan dag.

Odlingsmedia samlades upp after 48 timmars behandling for att testa cytotoxicitet (LDH30 aktivitet).

For att uppskatta formagan av cellproliferering in i detta 3D-system studerades antalet celler efter 7 dagar ocksa genom DNA-kvantifiering genom att anvanda Hoechst- infargning. ParallelIt visualiserades cellfastning av MC3T3-E1 i scaffolden ocksa genom SEM efter 7 och 21 dagars odling.

Uttryck av markorer relaterade till osteoblastcellmognad och —differentiering efter 7 och 21 dagars cellodling uppskattades genom realtids RT-PCR. 2.6.SEM-visualisering av 2% alginatbelagda Ti02-scaffoldar.

Morfologi av alginatbelagda Ti02-scaffoldar observerades genom att anvanda ett skannande elektronmikroskop (SEM, Hitachi S-3400N, Hitachi High-Technologies Europe GmbH, Krefeld, Tyskland). SEM anvandes vidare far att visualisera cellvidhaftning i TiO2- scaffoldstrukturen efter 7 och 21 dagars odling. I korthet tvattades cellerna tva ganger 10 med PBS och fixerades med glutaraldehyd 4% i PBS i 2 timmar. Sedan togs fixeringsvatskan bort och cellerna tvattades tva ganger med destillerat vatten. Vid 30 minuters intervall dehydrerades cellerna genom tillsatsen av 50%, 70%, 90% och 100% etanollosningar. Etanol togs bort och cellerna lamnades vid rumstemperatur far att evaporera den kvarstaende etanolen. Scaffoldar observerades vid 10 kV och 40 Pa 15 genom att anvanda aterspridnings- och sekundara elektrondetektorer. Bilder som presenteras är tan en representativ area. 2.7.Cellviabilitet.

Laktatdehydrogenas (LDH)-aktivitet som bestamdes i odlingsmedia efter 48 timmar togs som en indikator pa celloverlevnad. Aktiviteten av cytosolenzymet bestamdes genom att 20 folja tillverkarens kitinstruktioner (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland).

Resultat presenterades relativt LDH-aktiviteten i mediumet fr6 n celler odlade i obelagda scaffoldar, vilket sattes till 100 %. 2.8.Bestatnning av cellantal.

Celler som vaxer pa 3D-scaffoldarna lyserades genom en frysning-tiningsmetod i 25 avjoniserat destillat vatten. Cellysat anvandes far bestamning av DNA-kvantitet genom att anvanda Hoechst 33258 fluorescensanalys. Prover blandades med 20 pg/ml av Hoechst 33258 fluorescensfarg (Sigma, St. Quentin Fallavier, Frankrike) i TNE-buffert och intensiteten av fluorescensen mattes vid excitations- och emissionvaglangder av 356/465 nm genom att anvanda en multifunktionsmikroplattlasare (Cary Eclipse fluorescence 30 spectrophotometer,AgilentTechnologies,SantaClara,USA).Relativa fluorescensenheter korrelerades med cellantal genom att anvanda en linjar standardkurva. 36 2.9.RNA-isolering och realtids RT-PCR-analys.

Totalt RNA isolerades genom att anvanda Tripure® (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland), enligt tillverkarens protokoll. Totalt RNA kvantifierades vid 260 nm genom att anvanda en Nanodrop-spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA). 5 Samma mangd av totalt RNA (850 ng) transkriberades omvant till cDNA vid 42 °C i 60 min genom att anvanda High Capacity RNA-to-cDNA kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), enligt protokollet av leverantoren. Alikvoter av vane cDNA frystes (-20 °C) tills PCRreaktionerna utfordes.

Realtids-PCR utfOrdes i Lightcycler 480® (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) 10 genom att anvanda SYBR green detektion. Realtids-PCR utfordes for tva referensgener (18SrRNA och glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (Gapdh)) och 12 malgener (integrin alpha8 (Itga8), integrin beta1 (Itgb1), integrin beta3 (Itgb3), fibronektin 1 (Fn1), osterix (Osx), bone morphogenetic protein 2 (Bmp2), kollagen-I (Coll-/), interleukin-6 (1/-6), bone sialoprotein (Bsp), alkalint fosfatas (Alp), osteokalcin (Oc) och osteopontin (Opn)).

Primersekvenserna anges i detalj i tabell 3.

Tabell 3. Primersekvenser av osteoblastmarkorrelaterade gener anvanda i realtids-PCR.

Gen Primersekvens 18S S 5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3' (SEQ ID NO 7) A 5'- CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3' (SEQ ID NO 8) Gapdh S 5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3' (SEQ ID NO 9) A 5'-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3' (SEQ ID NO 10) Itgb1 S 5'- AGCAGGCGTGGTTGCTGGAA -3' (SEQ ID NO 13) A 5'- TTTCACCCGTGTCCCACTTGGC -3' (SEQ ID NO 14) Itgb3 S 5'- AGGGGAGATGTGTTCCGGCCA -3' (SEQ ID NO 15) A 5'- ACACACAGCTGCCGCACTCG -3' (SEQ ID NO 16) Fnl S 5'- GCTGCCAGGAGACAGCCGTG -3' (SEQ ID NO 17) A 5'- GTCTTGCCGCCCTTCGGTGG -3' (SEQ ID NO 18) 37 Itga8 S 5'- TCGCCTGGGAGGAGGCGAAA -3' (SEQ ID NO 11) A 5'- TCTTAACCGCTGTGCTCCCCG -3' (SEQ ID NO 12) Osx S 5' - ACTGGCTAGGTGGTGGTCAG- 3' (SEQ ID NO 31) A 5' - GGTAGGGAGCTGGGTTAAGG- 3' (SEQ ID NO 32) Bmp2 S 5'- GCTCCACAAACGAGAAAAG-C-3' (SEQ ID NO 33) A 5'- AGCAAGGGGAAAAGGACACT-3' (SEQ ID NO 34) Coll-/ S 5'- AGAGC-ATGACCGATGGATTC -3' (SEQ ID NO 21) A 5'- CCTTCTTGAGGTTGCCAGTC -3' (SEQ ID NO 22) /I-6 S 5'- ACTTCCATCCAGTTGCCTTC- 3' (SEQ ID NO 35) A 5' -TTTCCACGATTTCCCAGAGA- 3' (SEQ ID NO 36) Bsp S 5'-GAAAATGGAGACGGCGATAG-3' (SEQ ID NO 23) A 5'-ACCCGAGAGTGIGGAAAGTG-3' (SEQ ID NO 24) Alp S 5'-AACCCAGACACAAGCATTCC-3' (SEQ ID NO 25) A 5'- GAGAGCGAAGGGTCAGTCAG-3' (SEQ ID NO 26) Oc S 5'- CCGGGAGCAGTGTGAGCTTA-3' (SEQ ID NO 27) A 5'-TAGATGC-GTTTGTAGGCGGTC -3' (SEQ ID NO 28) Opn S 5'-TCTGCGGCAGGCATTCTCGG-3' (SEQ ID NO 29) A 5'-GTCACITTCACCGGGAGGGAGGA-3' (SEQ ID NO 30) Varje reaktion inneholl 7 pl Lightcycler-FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (innehallande Fast Start Taq polymeras, reaktionsbuffert, dNTPs mix, SYBRGreen I dye och MgC12), 0,5 pM av vardera och de antisensspecifika primrarna och 3 pl av cDNA- spadningen i en slutlig volym av 10 pl. Amplifieringsprogrammet bestod av ett forinkuberingssteg for denaturering av templat cDNA (10 min 9°C), foljt av 45 cykler bestaende av ett denatureringssteg (10s 9°C), ett hybridiseringssteg (8-10 s 60 °C, 38 forutom for Osx som var 5 s 68 °C och Alp som var 8 s 6°C) och ett forlangningssteg (10 s 72 °C).

Efter vane cykel mattes fluorescens vid 72 °C (Aex 470 nm, Aem 530 nm). En negativ kontroll utan cDNA-templat kordes i vane analys. 5 Realtidseffektiviteter beraknades fran de givna lutningarna i mjukvaran for LightCycler 480 genom att anvanda seriespadningar, visande alla de undersokta transkriptens hoga realtids-PCR-effektivitetshastigheter och hog linearitet nar olika koncentrationer anvands. PCR-produkter utsattes for en smaltkurveanalys p5 LightCycler och efterfoljande 2 % agaros/TAE-gelelektrofores for aft bekrafta amplifieringsspecificitet, Tm respektive 10 amplikonstorlek.

Relativ kvantifiering efter PCR beraknades genom att dela koncentrationen av malgenen i vane prov med medelvardet av koncentrationen av de tv5 referensgenerna i samma prov genom att anvanda Advanced relative quantification-metoden tillhandahallen av analysmjukvaruversion 1.5 for LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). 2.10. Statistik Alla data presenteras som medelvarden ± SEM. Ett Kolmogorov-Smirnov-test utfordes for att anta parametriska eller icke parametriska distributioner for normalitetstesterna, skillnader mellan grupperna uppskattades genom Mann-Whitney-test eller genom Studenten t-test beroende p5 deras normalfordelning. SPSSO program for Windows 20 (Chicago, IL, US), version 17.0 anvandes. Resultat avsags statistiskt signifikanta vid pvarden 0.05.

RESULTAT Peptidfrisattning Peptidfrisattningsprofil fr5n P2-alginatbelagda scaffoldar visas iFigur 7. En 25 krevadfrisattning av peptiden under de forsta 2 dagarna av inkubering observerades (42,8 % av den kumulativa mangden av P2 frisatt efter 21 dagar). Efter 5 dagar minskade mangden frisatt peptid till en 9,4 % (av den kumulativa mangden frisatt upp till 21 dagar) foljt av en langsammare men fordrojd frisattning over tid upp till 21 dagars inkubering. Vidare fores15r den kumulativa frisattningen att det efter 21 dagars inkubering fortfarande 30 finns P2 fangad i den 2 %-iga alginatgelen. 39 LDH-aktivitet.

Som visat i Figur 8, observerades inga toxiska effekter for nagon av experimentgrupperna som studerades. Liknande procenthalt av cellviabilitet bestamdes i alla de testade grupperna, vilket indikerade aft antingen kontrollalginatscaffoldar (-) och P2- 5 alginatbelagda scaffoldar (P2) inte visade nagra toxiska effekter p5 celler efter 48 timmars cellodling.

SEM-visualisering av Ti02-scaffoldar belagda med 2 % alginatgel.

Alginatbelagda Ti02-scaffoldar observerades med SEM. Som visat i Figurer 9A och 9B, var vissa av porerna av Ti02-scaffoldarna blockerade efter belaggningsprocessen med 10 alginat aven om nastan alla porer var oblockerade efter cellsadd och 7 dagars inkubering under standardcellodlingsforhallanden (Figurer 90 och 9D). Darfor sags viss nedbrytning av den blockerande alginatgelen i de porer som forblev blockerade direkt efter belaggningsprocessen.

Aven om mangden av celler som vaxer p5 obelagda Ti02-scaffoldar (SC) var hogre (Figur 15 10A och 10B) an p5 alginatbelagda Ti02-scaffoldar (Figur 10C-10F) var celler formogna aft penetrera och vidhafta in i de belagda scaffoldarna med 2 % alginatgel antingen med eller utan P2.

En okning fran dag 7 till dag 21 i antalet celler som vaxer p5 scaffoldarna sags for alla experimentgrupper.

Cellantal.

DNA-kvantifiering anvandes for att bestamma antalet celler som vaxer p5 Ti02scaffoldarna efter 7 dagars odling (Figur 11). I enlighet med SEM-bilder, var antalet celler efter 7 dagars odling signifikant lagre i alla av de alginatbelagda Ti02-scaffoldarna jamfort med Ti02-scaffoldar (SC). Darfor sags, jamfort med SC, en 61 % och en 49 °A) red ucering 25 i cellantal p5 alginatbelagda scaffoldar utan respektive med P2. Aven om data inte n5dde statistisk signifikans, visade scaffoldar belagda med P2 32 °A fler celler an de alginatbelagda kontrollscaffoldarna (-).

Genutttyck av markorer relaterade till cellvidhaftning.

Som visat i Figur 12, var relativa mRNA-nivaer av Itbl signifikant minskade i celler som 30 vaxer pa alginatbelagda scaffoldar (antingen med eller utan P2) jamfort med Ti02scaffoldar (SC) efter 7 dagars odling. Trots det observerades inga skillnader mellan grupper efter 21 dagars odling. Efter 21 dagar var /tgb3-mRNA-nivaer okade i celler som vaxer pa alginatbelagda scaffoldar (antingen med eller utan P2) jamfort med Ti02scaffoldar (SC). Hogre mRNA-nivaer av Fnl fanns i celler som vaxer pa 2 % alginatbelagda scaffoldar efter 21 dagar och i celler som vaxer pa P2-alginatbelagda scaffoldar jamfort med obelagda scaffoldar, aven om data for den sista gruppen inte 5 nadde statistisk signifikans. itga8-mRNA var signifikant okad i celler som vaxer pa P2alginatbelagda scaffoldar jamfort med kontrollalginatscaffoldar efter 21 dagars odling.

Genutttyck av flora osteoblastdifferentieringsmarkorer.

Figur 13 visar relative mRNA-nivaer for flera osteoblastdifferentieringsmarkorgener. Efter 21 dagars odling var osterix-mRNA-nivaer Okade i celler som vaxer pa alginatbelagda 10 scaffoldar (antingen med eller utan P2) jamfort med obelagda scaffoldar. mRNA-nivaer av Bmp-2 och 11-6 var signifikant okade i celler odlade pa P2-alginatbelagda scaffoldar jamfort med bade obelagda scaffoldar och alginatbelagda scaffoldar efter 21 dagars cellodling. mRNA-nivaer av Coll-1, en markor relaterad till cellproliferering var signifikant Okade i celler odlade pa P2-alginatbelagda scaffoldar jamfort med alginatbelagda 15 scaffoldar efter 7 dagars cellodling. Efter 21 dagars odling var Co//-/ signifikant okad i bade alginatbelagda scaffoldar och P2-alginatbelagda scaffoldar jamfort med obelagda scaffoldar. lnga signifikanta skillnader observerades i mRNA-uttrycksnivaer av Opn, Bsp, Alp och Oc mellan experimentgrupper vid nagon av de studerade tidpunkterna.

DISKUSSION 20 I foreliggande experiment demonstrerades lampligheten av en titandioxidscaffold belagd med en alginatbelaggning, med och utan en biologiskt aktiv substans for anvandning i barande benvavnadsapplikationer for att gynna benbildning och mineralisering. Ti02scaffoldar har rapporterat ha styrkor upp till 2,6 MPa i kompressionsstyrka (Tiainen H et al. 2010) och visade utmarkt mekaniskt motstand i en in vivo-studie i gris. 25 Vid benvavnadsregenerering maste strukturen av scaffolden tillhandahalla en optimal mikromiljo for osteogenes. Scaffoldporositeten, sammankopplingen av pornatverket, forhallandet ytaarea-till-volym och de fysikokemiska egenskapema av ytan bestammer cellmigrering och -differentiering, beninvaxt, vaskularisering och massoverfOring mellan cellerna och miljon. Anvandningen av hogt porosa Ti02-scaffoldar genom att anvanda en 30 skakmetod for cellsadd har visats tillhandahalla en god fastning och distribution av preosteoblastiska celler fran mus. I foreliggande studie uppvisade Ti02-scaffoldar belagda med ett lager av 2 % alginat en mikrostruktur som är lamplig for deras anvandning som scaffold for tredimensionell cellvaxt. 41 Aven om ett fatal porer forblev blockerade direkt efter belaggningsprocessen var nastan alla porer oblockerade efter 7 dagars inkubering vid 37 °C pa grund av bionedbrytbarhetsegenskaperna av alginat, vilket darmed tillhandaholl oppnande fonster for celler att penetrera och migrera in i strukturen. lnga skillnader i cellviabilitet 5 observerades mellan belagda och obelagda Ti02-scaffoldar. En krevadlik frisattning av P2 under de forsta timmarnas inkubering sags foljt av progressiv och fordrojd frisattning under 21-dagarsperioden, vilket foljde samma monster som i enbart alginathydrogelerna.

Ti02-scaffoldar tillhandaholl en lamplig yta for osteoblaster att vidhafta till, migrera och proliferera. Aven om mangden av celler pa alginatbelagda Ti02-scaffoldar var lagre an i 10 obelagda Ti02-scaffoldar, stodde scaffoldar belagda med alginat cellprogression och —differentiering. Dessa resultat är i enlighet med foregaende studier som rapporterar aft alginaten är eft inert substrat for cellfastande och aft syntetiska peptider rika pa prolinsekvenser okar egenskaperna for cellfastande av alginathydrogelen. Darfor visade, aven om ej signifikant, Ti02-scaffoldar belagda med 2 % alginat innehallande syntetisk peptid 2 en trend i att forbattra cellfastande (+32 %) efter 7 dagar jamfort med alginatbelagda Ti02-scaffoldar.

Det har rapporterats att biomaterialkomposition reglerar cellfastande och organisation av cytoskelett med langtidseffekter pa cellmognad och mineralisering av osteoblaster. I enlighet med effektiviteten i cellfastande observerad genom SEM och DNA-kvantifiering pa de olika grupperna var mRNA-nivaer av Itgbl minskade i celler som vaxer pa alginatbelagda Ti02-scaffoldar jamfort med de som vaxer pa obelagda scaffoldar. Vidare var mRNA-nivaer av Itgb3 och Fnl (vilka uttrycks i hog grad vid tidiga steg av osteogenes och reduceras under den cellulara mognadsprocessen) signifikant okade i celler som vaxer in i de alginatbelagda Ti02-scaffoldarna jamfort med de obelagda scaffoldarna efter 21 dagars odling. Vidare inducerades uttryck av Itga8, en integrin som spelar en roll under mineralieringssteget genom bindningen till osteopontin, genom P2-alginatbelagda scaffoldar jamfort med alginatbelagda scaffoldar, vilket foreslar att P2 kan inverka pa mineraliseringsprocesser. Integriner är inte bara involverade i fastandet av celler till materialytan men medierar ocksa signaltransduktionsvagar som inducerar benbildning och mineralisering. lntressant nog var uttrycket av gener sasom Itgb3, Fnl, Coll-/ och Osx, som är relaterade till tidiga steg av osteoblastdifferentiering och vilka normalt uppregleras under kort period och darefter nedregleras, okade under den senare studerade tidpunkten (21 dagar) i celler som vaxte in i alginatbelagda Ti02-scaffoldar jamfort med celler som vaxer pa obelagda scaffoldar. Det är mojligt att tidvis sekvens av 42 tidiga markorer relaterade till osteoblast differentiering varierar nar MC3T3-E1-celler \taxer pa obelagda scaffoldar eller pa alginabelagda scaffoldar, sa aft celler som vaxer pa alginatbelagda ytor visade en forbattrad celldifferentiering over proliferering jamfort med obelagda Ti02-scaffoldar formodligen pa grund av de initiala svarigheterna av cellvidhaftning pa alginaten. Aven om alginatbelaggning verkar forsamra cellvidhaftning och —proliferering pa scaffoldarna, bekraftades forvarvande av en mogen och organiserad matris (ECM) kompetent for mineralisering genom en markerad okning i mRNA-nivaer av Alp och Bsp fran dag 7 till 21 dagar for alla grupperna. Nar syntesen, organisationen och mognaden av ECM är klar, uppregleras Oc-uttryck vilket leder till mineralisering. 10 Resultaten visade en liten okning i mRNA-nivaer av Oc efter 21 dagars odling, darfor kan man sluta sig till att Geller var precis vid [Dolan av mineraliseringsprocessen. I enlighet med vara resultat med genuttrycksnivaer av Opn och Bsp kunde vidare den okade relationen Bsp/Opn-mRNA i osteoblastceller vara indikativ for stimuleringen av ECMmineralisering som tidigare rapporterat med MC3T3-E1-celler sadda pa obelagda Ti02- scaffoldar.

Dessutom forbattrade tillsatsen av P2 till alginat egenskaperna for cellproliferering och —differentiering jamfort med alginatbelagda scaffoldar som det kan forstas genom mangden av celler matta genom DNA-innehall och de hogre uttrycksnivaerna av Bmp2, Coll-/ och 11-6. Hittills har de syntetiska peptiderna som är rika pa polyprolinsekvenser 20 upprepat visat en okning i mRNA-nivaer av osteokalcin, bade in vitro- och i in vivo-studier dar titanimplantat belades med peptiden och vidare laddades in i en alginathydrogel for deras anvandning som en barare for lokal tillforsel. Darfor dialer detta sammantaget oss att foresla att P2-alginatbelagda scaffoldar skulle gynna hogre celldifferentiering och mineralisering i en in vivo-miljo.

SLUTSATS Slutligen demonstrerar resultaten att alginatbelagda Ti02-scaffoldar kan agera som en matris for tillforsel av biologiskt aktiva substanser, sasom en syntetisk peptid rik pa prolinsekvenser som inducerar osteoblastcelldifferentiering. Kombinationen av de fysikaliska och osteokonduktiva egenskaperna av Ti02-scaffoldar med osteogena effekter 30 av en biologiskt aktiv substans, sasom en syntetisk prolinrik peptider, pa benbildning och mineralisering kan representera en ny strategi for benvavnadsregenerering i barande tillampningar.

Det ska fOrstas att medan uppfinningen har beskrivits i samband med den detaljerade beskrivningen darav är den foregaende beskrivningen avsedd att illustrera och inte 43 begransa omfattningen av uppfinningen, vilken definieras av omfanget av de bifogade patentkraven. Andra aspekter, fordelar och modifieringar är inom omfanget av de foljande patentkraven.

Om inte uttryckligen motsatt beskrivet kan vale av de foredragna sardragen beskrivna hari anvandas i kombination med vilket som heist och alla av de andra hari beskrivna foredragna sardragen. 44 REFERENSER Tiainen H, Lyngstadaas SP, Ellingsen JE, Haugen HJ. Ultra-porous titanium oxide scaffold with high compressive strength. J Mater Sci Mater Med 2010;21:2783-92.

Takahashi Y, Tabata Y. Homogeneous seeding of mesenchymal stem cells into 5 nonwoven fabric for tissue engineering. Tissue Eng 2003;9:931-8.

Tiainen H, Monjo M, Knychala J, Nilsen 0, Lyngstadaas S P, Ellingsen J E and Haugen H J. The effect of fluoride surface modification of ceramic TiO2 on the surface properties and biological response of osteoblastic cells in vitro Biomed. Mater. 2011;6 045006.

Rubert M, Ramis J M, Vondrasek J, Gaya A, Lyngstadaas SP and Monjo M. Synthetic 10 peptides analogue to enamel proteins promote osteogenic differentiation of MC3T3-E1 and mesenchymal stem cells J. Biomater. Tissue Eng. 2011; 1198-209.

Monjo M, Ramis J M, Ronold H J, Taxt-Lamolle S F, Ellingsen J E and Lyngstadaas S P. Correlation between molecular signals and bone bonding to titanium implants Olin. Oral Implants Res. 2012 doi: 10.1111/j.1600-0501.2012.02496.x.Maniatopoulos C, Sodek J, 15 Me!cher AH. Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell and tissue research 1988;254:317-30.

Claims

PATE NTKRAV

1. En metod for att producera en titandioxidscaffold innefattande en alginatbelaggning, van i namnda metod innefattar stegen av att: a) tillhandahalla en titandioxidscaffold, b) tillhandahalla en alginatlosning innefattande omkring 1-3 vikt/volym°/0 av atminstone en alginat till atminstone del av namnda titandioxidscaffold och sedan centrifugera titandioxidscaffolden, 3. tillhandahalla titandioxidscaffolden erhallen i steg b) med en divalent katjonsaltlosning, van i namnda divalenta katjon är vald fran gruppen bestaende av Ca2+, Mg2+, Ba2+ or Sr, och sedan eventuellt skolja titandioxidscaffolden; och 4. torka titandioxidscaffolden, van i steg b) och c) eventuellt upprepas atminstone en gang.

2. En metod i enlighet med krav 1, van i koncentrationen av alginat i alginatlosningen i steg b) är omkring 2 vikt/volym%.

3. En metod enligt vilket som heist av de foregaende kraven, van i koncentrationen av den divalenta katjonlosningen i steg c) är omkring 15-150 mM, sasom omkring 50 mM.

4. En metod i enlighet med vilket som heist av de foregaende kraven, van i steg b) och c) upprepas 2-100 ganger, sasom 2-10 ganger.

5. En metod i enlighet med vilket som heist av de foregaende kraven, vani alginatlosningen av steg b) dessutom innefattar atminstone en biologiskt aktiv substans.

6. En metod i enlighet med krav 5, van i namnda biologiskt aktiva substans valjs fran gruppen bestaende av: en syntetisk eller naturlig bioaktiv molekyl, en naturlig eller syntetisk drog och/eller en levande cell.

7. En metod i enlighet med vilket som heist av de foregaende kraven, van i alginaten har en molekylvikt (Mw) av 1 000-200 000 g/mol.

8. En metod i enlighet med vilket som heist av de foregaende kraven, van i namnda alginatbelaggning har en vattjocklek av atminstone 1 pm, sasom 1-20 pm.

9. En metod i enlighet med vilket som heist av de foregaende kraven, van i namnda atminstone en alginat an vald fran gruppen bestaende av: natriumalginat, kaliumalginat, kalciumalginat och strontiumalginat.

10. En titandioxidscaffold erhallbar genom metoden av vilket som heist av krav 1-9.

11. Ett medicinskt implantat innefattande en titandioxidscaffold i enlighet med krav 10. 46

12. En titandioxidscaffold i enlighet med krav 10 for anvandning som ett medicinskt implantat.

13. En titandioxidscaffold i enlighet med krav 10 eller ett medicinskt implantat i enlighet med krav 11 for anvandning for regenereringen, reparationen, ersattandet och/eller aterstallandet av vavnad, sasom ben.