SE537633C2

SE537633C2 - Hydrogelbelagd titandioxidscaffold och metod för att framställa denna scaffold

Info

Publication number: SE537633C2
Application number: SE1251043A
Authority: SE
Inventors: Ståle Petter Lyngstadaas; Håvard Jostein Haugen; Hanna Tiainen
Original assignee: Corticalis As
Priority date: 2012-09-18
Filing date: 2012-09-18
Publication date: 2015-08-25
Also published as: WO2014044704A9; ES2608777T3; PL2897656T3; CA2880998A1; KR20150058202A; WO2014044704A8; EP2897656A1; JP2015529527A; US9629941B2; US20150250923A1; WO2014044704A1; SE1251043A1; EP2897656B1; JP6169178B2

Abstract

SAMMAN DRAG Foreliggande dokument riktar sig till en titandioxidscaffold innefattande en hydrogelbelaggning innefattande en biologiskt aktiv substans. Aven beskrivet är en metod for aft producera en tunn hydrogelbelaggning pa en titandioxidscaffold och anvandningar av de hydrogelbelagda scaffoldarna som medicinska implantat.

Description

HYDROGELBELAGD TITAN DIOXIDSCAFFOLD OCH METOD FOR ATT FRAMSTALLA DEN NA SCAFFOLD TEKNISKT OMRADE Foreliggande dokument riktar sig till medicinska implantat som har en scaffoldstruktur. I 5 synnerhet beskriver foreliggande dokument en titandioxidscaffold vilken har en hydrogelbelaggning innefattande en biologiskt aktiv substans och anvandningar darav.

BAKGRUND TILL UPPFINNINGEN Tillstand sasom trauma, tumbrel-, cancrar, parodontit och osteoporos kan leda till benforlust, reducerad benvaxt och —volym. Av dessa och andra anledningar är det av stor 10 vikt att finna metoder for att forbattra benvaxt och for att aterfa benanatomi.

Naturlig benbildning fran osteogena celler med hjalp av en tredimensionell scaffold erbjuder ett alternativ till autotransplantat och allografter for att reparera och regenerera forlorat ben. En valkonstruerad scaffold tillhandahaller en lamplig yta for celler att fasta 15 och vidhafta med ett porost och val sammanbundet natverk som guidar utvecklingen av nytt ben, stodjer migrering, proliferering och differentiering av benbildande celler och vaskularisering av den invaxande vavnaden. Aven om flera polymerer och biokeramer har utvecklats for deras anvandning i benvavnadsregenerering har deras laga mekaniska egenskaper begransat deras anvandning i barande tillampningar. 20 Titandioxid (Ti02) är eft biokompatibelt material vilket ocksa har rapporterats ha bioaktiva egenskaper och en viss grad av bakteriostatisk effekt. Darfor har keramiskt TiO2 studerats som ett material kir syften av benvavnadsrenerering. Hogt porosa och val sammankopplade Ti02-scaffoldar med hog mekanisk styrka som nar varden av 90 % porositet och 1,63-2,67 MPa tryckhallfasthet har nyligen utvecklats (Tiainen etal. 2010) 25 och deras biokompatibilitet och osteokonduktiva egenskaper har demonstrerats in vitro och in viva Forst* har gjorts att t ex forbattra scaffoldarnas biokompatibilitet, att forbattra osseointegrering, forhindra infektion och inflammation genom belaggning av implantatstrukturen med olika sorters biologiskt aktiva molekyler. Emellertid, for att kunna 30 utfora deras avsedda funktion pa implantatet efter implantation behover de biologiskt aktiva molekylerna belaggas pa implantatet pa ett satt som tillater deras frisattning, som inte allvarligt skadar deras biologiska aktivitet, som inte orsakar negativa kroppsreaktioner etc. 1 Hydrogeler har anvants for olika tillampningar vid vavnadsregenerering sasom som utrymmesfyllande medel, som vehiklar for att tillfora bioaktiva molekyler och som tredimensionella strukturer som organiserar celler och erbjuder stimuli for att styra bildningen av en onskad vavnad. En hydrogel innefattar typiskt ett natverk av 5 polymerkedjor som är hydrofila och Mgt absorbenta och kan innehAlla over 99,9 % vatten. Alginat är ett exempel p5 en polymer som valts for att bilda hydrogeler for vavnadsregenerering och har anvants i manga olika medicinska tillampningar inkluderande inkapsling och drogstabilitet och leverans av celler och/eller tillvaxtfaktorer. Alginat är en hydrofil och linjar polysackaridsampolymer av monomerer av 13-D- 10 mannuronsyra (M) och a-L-glukuronsyra (G). Alginatgel bildas nar divalenta katjoner, s5som Ca2+, Ba2+ or Sr2+ interagerar samverkande med block av G-monomerer vilket skapar jonbryggor mellan olika polymerkedjor. Pa grund av gynnsamma egenskaper for ett biomaterial, sasom icke toxiskt, bionedbrytbarhet och latthet att processa till en onskad form under normala fysiologiska forhallanden har alginat studerats utforligt i 15 vavnadsregenerering, inkluderande regenereringen av hud-, brosk-, ben-, lever- och hjartvavnad.

Kitosan är det deacetylerade derivatet av kitin, en naturlig komponent av rak- och krabbskal. Det är en biokompatibel, pH-beroende kajonpolymer, vilken är loslig i vatten upp till pH 6,2. Kitosan är mer stabilt an alginater men bryts ner snabbare i I5gt pH, t ex 20 fOrhallanden som är narvarande i inflammerade, infekterade eller hypoxiska vavnader. Kitosan tros ocks5 ha antiinflammatoriska egenskaper i sig sjalvt. Andra hydrogeler, likt starkelser och kollagenbaserade geler har liknande egenskaper, men bryts snabbare ner lokala vavnadsfaktorer som kollagenaser. Cellulosor är ocks5 pH-beroende och kan formas i m5nga olika kemiska modifieringar beroende p5 anvandningen, den mekaniska 25 styrkan etc. som behovs. PLA och PGA bryts snabbt ner till organiska syror (t ex mjolksyra) som kan ha gynnsamma lokala effekter p5 vavnader, infektioner och pa nedbrytningshastigheten av andra hydrogeler (t ex kitosan) nar anvanda i kombinationer.

Hyaluronsyra är en annan viktig hydrogel med biologiska effekter. Det är en viktig bestandsdel av brosk och anvands ofta i leder, kir sarlakning och i ogonen. Den är milt 30 antiinflammatorisk och tros stimulera regenereringen av vissa typer av bindvavnader sasom brosk, ligament och hornhinneceller. PEG är en mycket biokompatibel hydrogel som är mycket flexibel med avseende p5 styrka, tvarbindning for designade nedbrytningshastigheter etc. och en gel som kan lankas kemiskt till biologiska molekyler fOr att tillhandahalla en vehikel far kontrollerad fordrOjd frisattning som kan designas far 35 manga olika tillstand. Blandningen och gelningen av vissa PEG skiljer sig fran de fiesta 2 andra hydrogeler i att den inte helt enkelt kan losas upp i vatten och tillatas gelna i narvaron av joner (likt nastan alla biologiska hydrogeler sasom kitosan, cellulosor, starkelser, kollagener, agaroser) men behover en kemisk reaktant sasom merkaptoetanol for att bilda stabila tvarbindningar och bli en gel. Emellertid kan andra PEG-konjugat ocksa gelnas genom olika medel s5som UV-Ijus, tvarbindning genom joninteraktioner, tillsatsen av divalenta katjonsalter och kondensationsreaktioner (kondensationsreaktioner mellan hydroxylgrupper eller aminer med karboxylsyror eller derivat harav anvands ofta for syntesen av polymerer for att ge polyestrar och polyamider, respektive PEG).

Emellertid finns det forffarande ett behov inom omr5det av medicinska implantat och 10 vavnadsregenerering for implantatstrukturer som tillhandahaller t ex en stOdjande struktur, vilka är biokompatibla och/eller som forbattrar integreringen av implantaten i en kropp.

SAMMANFATTNING AV UPPFINNINGEN Ett syfte med foreliggande dokument är att tillhandahalla en titandioxidscaffold som är lamplig som ett medicinskt implantat, vilken scaffold är tillhandahallen med en hydrogelbelaggning innefattande en biologiskt aktiv substans.

Detta syfte uppn5s genom foreliggande beskrivning vilken i en aspekt är riktad till en titandioxidscaffold, van i atminstone del av ytan av namnda titandioxidscaffold är tillhandahallen med en hydrogelbelaggning innefattande atminstone en biologiskt aktiv 20 substans. En sadan titandioxidscaffold kan betecknas en hydrogelbelagd titandioxidscaffold. Hydrogelbelaggningen innefattar typiskt atminstone en polymer vald fr5n gruppen besthende av alginat, kitosan, hyaluronsyra, polyetylenglykol (PEG), cellulosa, poly(akrylsyra) (PAA), poly(glykolsyra) (PGA), poly(mjolksyra) (PLA), PLA-PGA, PLA-PEG, dextran, dextran-PEG, starkelse, kollagenbaserade geler, agaroser, pluronic- syra, heparansulfat, glykosaminoglykaner, polyetylenoxid (PEO), sampolymer av etylenoxid och propylenoxid (P(E0-co-P0)), och pluronic/poloxamer aven om andra polymerer som kan bilda hydrogel ocks6 kan anvandas som beskrivet p6 annat h611 hari. Hydrogelen bildas typiskt genom att anvanda polymer som har en molekylvikt av omkring 1 000-1 000 000 g/mol, sasom 1000-200 000 g/mol.

Foreliggande dokument riktar sig ocksa till en metod for att producera en titandioxidscaffold innefattande en hydrogel innefattande en biologiskt aktiv substans beskriven hari, van i metoden innefattar stegen av att: a) tillhandahalla en titandioxidscaffold, 3 b) tillhandahalla en polymerlosning innefattande en biologiskt aktiv substans/substanser och omkring 1-10 % vikt/vol av en polymer vald fran gruppen bestaende av alginat, kitosan, hyaluronsyra, polyetylenglykol (PEG), cellulosa, poly(akrylsyra) (PAA), poly(glykolsyra) (PGA), poly(mjolksyra) (PLA), PLA-PGA, PLA-PEG, dextran, dextran-PEG, starkelse, kollagenbaserade geler, agaroser, pluronic-syra, heparansulfat, glykosaminoglykaner, polyetylenoxid (P ED), sampolymer av etylenoxid och propylenoxid (P(E0-co-P0)), och pluronic/poloxamer, till atminstone del av namnda titandioxiscaffold och sedan centrifugera titandioxidscaffolden, c) astadkomma gelning av polymeren tillhandahallen till titandioxidscaffolden i steg b); och d) eventuellt torka titandioxidscaffolden, van i steg b) och c) eventuellt upprepas atminstone en gang.

Foreliggande dokument riktar sig ocksa till en titandioxidscaffold innefattande en hydrogelbelaggning innefattande en biologiskt aktiv substans erhallbar eller erhallen genom denna metod.

Foreliggande dokument riktar sig ocksa till ett medicinskt implantat innefattande titandioxidscaffolden innefattande en hydrogelbelaggning innefattande en biologiskt aktiv substans och en sadan scaffold for anvandning som ett medicinskt implantat. 20 Dessutom beskrivs den hydrogelbelagda titandioxidscaffolden eller ett medicinskt implantat innefattande den for regenereringen, reparationen, ersattandet och/eller aterstallandet av vavnad, sasom ben och den hydrogelbelagda scaffolden eller ett medicinskt implantat innefattande den for anvandning far regenereringen, reparationen, ersattandet och/eller aterstallandet av vavnad, sasom ben.

Aven beskrivet är anvandningen av en hydrogelbelagd titandioxidscaffold for framstallningen av ett medicinskt implantat for regenereringen, reparationen, ersattandet och/eller aterstallandet av vavnad.

Vidare beskrivet är en metod kir regenereringen, reparationen, ersattandet och/eller aterstallandet av vavnad innefattande implanteringen i ett objekt i behov darav av en 30 hydrogelbelagd titandioxidscaffold eller ett medicinskt implantat innefattande sadan scaffold.

Andra sardrag och fordelar av uppfinningen kommer att bli uppenbara fran den foljande detaljerade beskrivningen, ritningarna, exemplen och fran kraven. 4 DEFINITIONER "Scaffold" hanfor sig i foreliggande sammanhang till en oppen poros struktur. "Scaffold" kan i foreliggande sammahang forkortas "SC". Med "titandioxidscaffold" avses en scaffold innefattande overvagande titandioxid, d v s titandioxid är den huvudsakliga substansen 5 ansvarig for att bilda scaffoldstrukturen. Titandioxidscaffolden har darfor mer an 50 vikt% titandioxid, sasom omkring 51 vikt%, 60 vikt%, 70 vikt%, 80 vikt%, 90 vikt%, 95 vikt%, 96 vikt%, 97 vikt%, 98 vikt%, 99 vikt% eller 100 vikt% titandioxid.

Med "pordiameter" avses i sammanhanget av foreliggande dokument den hydrauliska diametern av en por utan dess omgivande vaggar. Den hydrauliska diametern är valkand 10 for fackmannen inom teknikomradet och definieras som 4-area av en por delat med langden av omkretsen av poren.

"Fraktal dimension av stag" (engelska "fractal dimension strut") är ett statistiskt malt som ger en indikation pa hur fullstandigt en fraktal verkar fylla utrymme nar man zoomar ner till 15 finare och finare skalor. Det finns manga specifika definitioner av fraktaldimension och ingen av dem ska behandlas som universell. Ett varde av 1 hanfor sig till en rak linje. Ju hogre numret är, desto mer komplex är ytstrukturen.

"Total porositet" definieras i foreliggande sammanhang som alla rum inom en kropp vilka 20 inte är ett material, t ex utrymmet som inte ockuperas av nagot material. Total porositet involverar bade stangda och oppna porer.

Med "inre stagvolym" avses volymen av den inre lumen av staget. 25 Med "sintring", "sintra" och liknande avses en metod for att tillverka objekt fran pulver, genom att hetta upp materialet (nedan dess smaltpunkt) till dess att dess partiklar faster till varandra. Sintring anvands traditionellt for tillverkning av keramiska objekt och har aven funnits anvandbar inom omr6den s5som pulvermetallurgi. 30 En "medicinsk protetisk anordning", "medicinskt implantat", "implantat" och liknande hanfor sig i foreliggande sammanhang till en anordning avsedd att implanteras i kroppen av en vertebrat, sasom ett daggdjur, t ex en manniska. lmplantat kan i foreliggande sammanhang anvandas for att ersatta anatomi och/eller 5terstalla en kroppsfunktion. Exempel pa sadana anordningar inkluderar, men är inte begransade till, dentala implantat 35 och ortopediska implantat. I foreliggande sammanhang inkluderar ortopediska implantat inom dess omfang vilken anordning som heist som är avsedd att implanteras i kroppen av ett vertebrat djur, i synnerhet ett daggdjur sasom en manniska for bevarande och aterstallande av funktionen av muskelskelettsystemet, i synnerhet leder och ben, inkluderande lindringen av smarta i dessa strukturer. I foreliggande sammanhang, inkluderar dentalimplantat inom sin omfattning vilken anordning som heist som är avsedd att implanteras i munhalan av ett vertebrat djur, i synnerhet ett daggdjur sasom en manniska, vid tandaterstallningsprocedurer. I allmanhet bestar ett dentalimplantat av en eller flera implantatdelar. Till exempel innefattar ett dentalimplantat vanligen en dental fixtur kopplad till sekundara implantatdelar, sasom en distans och/eller en 10 dentalaterstallning sasom en krona, brygga eller tandprotes. EmeIlertid kan vilken anordning som heist, sasom en dental fixtur, avsedd for implantering sjalv hanfOras till som ett implantat aven om andra delar ska sammanbindas dartill. Ortopediska och dentalimplantat kan ocksa betecknas som ortopediska och dentala protetiska anordningar sasom framgar tan det ovanstaende.

I foreliggande sammanhang hanfOr sig "patient" till en vertebrat, sasom en fagel, reptil, daggdjur, primat och manniska.

Med keramer avses i foreliggande sammanhang objekt av oorganiskt pulvermaterial 20 behandlade med varme for att bilda en stelnad struktur.

Med "biologiskt aktiv substans" avses en substans som kan inverka pa en biologisk process, d v s som har en biologisk aktivitet. En biologiskt aktiv substans kan vara en liten molekyl, sasom en oorganisk Jon eller en storre molekyl, sasom ett protein, och till och med en komplex struktur, sasom en cell. Exempel pa biologiskt aktiva substanser som är lampliga for anvandning i sammanhanget av foreliggande dokument beskrivs nedan. En biologiskt aktiv substans kan i foreliggande sammanhang ocksa betecknas en "biomolekyl".

KORT BESKRIVNING AV RITNINGARNA Figur 1. Mikrostruktur av 2 (3/0 alginat (A och B) och 2 % av alginat innehallande syntetisk peptid (C och D) gelnad med 300 mM av CaCl2. Observation med SEM vid x(A och C) och x100 forstoring (B och D). Denna gel är inte narvarande pa en titandioxidscaffold och inte framstalld genom metoden for att producera en titandioxidscaffold innefattande en alginatbelaggning beskriven hari. DarfOr antar denna gel en porOs struktur. 6 Figur 2. Frisattningsprofil av peptid 2 markt med FITC efter 21 dagars inkubering vid 37 °C. Stapeldiagram visar mangden av peptid frisatt efter vane tidpunkt. Linjediagram representerar kumulativ mangd av peptid frisatt upp till 21 dagar. Varden representerar medel ±SEM.

Figur 3. A. Toppen: antal vidhaftande celler nar olika mangder av celler sas (30 x 3, 60 x 3, 100 x 3 och 200 x 3 cellsibrunn) efter 1 och 5 dagars odling. Varden representerar medel ±SEM. Botten: representativ bild av osteoblastceller vidhaftade pa 2 alginathydrogeler nar 100 x 3 cellsibrunn sas erhallen genom SEM vid x200 forstoring. B. Osteoblastvidhaftning pa 2 % alginatbelaggning. Representativa bilder erhallna genom konfokalmikroskopi av vidhaftande celler nar 30 x 3 (A och B), 60 x 3 (C och D), 100 x 3 (E och F) och 200 x 3 (G och H) cells/brunn sas efter 1 (A, C, E, G) och 5 (B, D, F, H) dagars odling. Cellkarnor presenteras i vitt (DAPI-fargning) (vanster kolumn) och aktinfilament presenteras i vitt (falloidin-FITC) (Niger kolumn). Stapelskalan representerar 150 pm.

Figur 4. LDH-aktivitet matt fran odlingsmedia samlat 24 timmar efter sadd av M03T3-E1- celler pa alginathydrogeler utan peptid (-) eller alginathydrogeler innehallande 50 pg/ml av antingen Emdogain (EMD) eller syntetiska peptider (P2, P5 och P6). Hog kontroll (100 %) var cellodlingsmedia fran celler sadda pa vavnadsodlingsplast och inkuberade med 1 °A Triton X-100. Lag kontroll (0 %) var cellodlingsmedia fran celler sadda pa vavnadsodlingsplast och inkuberade med 0,1 % attiksyra-PBS. Procenten LDH-aktivitet beraknades genom att anvanda foljande ekvation: cytotoxicitet (`)/0) = (forvantat varde — lag kontroll)/(htigkontroll — lag kontroll)100. Varden representerar medel ±SEM.

Skillnader mellan grupper faststalldes genom Mann—Whitney test *p < 0.05 mot kontrollalginathydrogel (-), #p <0.05 mot alginathydrogel innehallande EMD.

Figur 5A-D. Uttryck av gener relaterade till cellvidhaftning efter odling av M03T3-E1- celler pa 2 °A av alginathydrogeler utan peptid (-, kontrollgrupp), innehallande syntetiska peptider eller EMD (50 pg/ml) i 14 och 21 dagar. Data representerar relativa mRNA-nivaer av malgener normaliserade med referensgener, uttryckta som procent av kontroll alginatgel vid 14 dagar av odling, vilket sattes till 100 %. Varden representerar medel ± SEM. Skillnader mellan grupper faststalldes genom Studentens t-test; (.) p 0.05 mot kontroll alginathydrogel (-), (#)p 0.05 mot EMD.

Figur 6A-F. Uttryck av gener relaterade till osteoblastdifferentiering efter odling av MC3T3-E1-celler pa 2 % alginatgeler utan peptid (-, kontrollgrupp) innehallande syntetiska peptider eller EMD (50 pg/ml) i 14 och 21 dagar. Data representerar relativa 7 mRNA-nivaer av malgener nornnaliserade med referensgener, uttryckta som procent av kontrollalginathydrogel vid 14 dagars odling, vilket sattes till 100 %. Varden representerar medel ± SEM. Skillnader mellan grupper faststalldes genom Studentens t-test;0.0 kontroll alginathydrogel (-), (#)p 0.05 mot EMD.

Figur 7. Frisattningsprofil av peptid 2 (SEQ ID NO 1) fran P2-alginathydrogelbelagda scaffoldar efter 21 dagars inkubering vid 37°C. Stapeldiagram visar mangden av peptid frisatt efter vane tidpunkt. Linjediagram representerar kumulativ mangd av peptid frisatt upp till 21 dagar. Varden representerar medel ± SD.

Figur 8. LDH-aktivitet matt fran odlingsmedia uppsamlat efter 48 timmars odling. Varden 10 representerar medel ± SEM. Mann-Whitney test (p5 0.05): (a) mot reguljar scaffold (SC) och (b) mot kontrollalginathydrogelbelagd scaffold (-).

Figur 9. SEM-visualisering av 2 % alginathydrogelbelagda Ti02-scaffoldar (kontrollalginatscaffold) vid 10kV och 40Pa. Figurer A och B visar mikrostrukturen av Ti02- scaffoldar direkt efter belaggningsprocessen med ett lager av 2 % alginathydrogel vid 50x (A) och 300x (B) forstoring. Figurer C och D visar celler odlade pa kontrollalginatscaffoldar efter 7 dagars odling vid 50x (C) och 300x (D) forstoring.

Figur 10. SEM-visualisering av MC3T3-E1-celler vaxande pa reguljara scaffoldar (A och B), kontrollalginatscaffoldar (C och D) och P2-alginathydrogelbelagda scaffoldar (E och F) efter 7 (A, C och E) och 21 (B, D och F) dagars odling. Scaffoldar observerades med SEM 20 vid 10 kV, 40 Pa och x50 forstoring.

Figur 11. Antal av celler som vaxer pa scaffoldarna efter 7 dagar odling. DNA-innehall analyserades genom Hoechst-fluorescensfargning och korrelerades till en linjar standardkurva. Varden representerar medel ± SEM. Varden representerar medel ± SEM. Mann-Whitney test: (a) p5 0.05 mot reguljart scaffold (SC) och (b) mot kontrollalginathydrogelbelagd scaffold (-).

Figur 12 A-D. Relativa mRNA-uttrycksnivaer av Itgb1(A), Itgb3 (B), Fn1(C)och Itga8 (D) i MC3T3-E1-cells odlade pa Ti02-scaffoldar i 7 (o) och 21 dagar (.). Reguljara scaffoldar (SC) anvandes som referensgrupp. Data representerar faldiga forandringar (engelska "fold changes") av malgener normaliserade med referensgener (Gapdh och 18S), uttryckt som procent av celler odlade pa reguljara scaffoldar (SC) vid dag 7, vilket sattes till 100 %. Varden representerar medel ± SEM. Studentens t-test: (a) p5 0.05 mot reguljar scaffold (SC) och (b) mot kontrollalginatscaffold (-).

Figur 13A-H. Relativa mRNA-uttrycksnivaer av A) osterix (Osx), B) bone morphogenetic 8 protein 2 (Bmp2), C) collagen-I (Coll-/), D) interleukin 6 (11-6), E) osteopontin (Opn), F) bone sialoprotein (Bsp), G) alkalint fosfatas (Alp) och H) osteokalcin (Oc) i MC3T3-E1- celler odlade pa Ti02-scaffoldar i 7 (0) och 21 dagar (.). Reguljara scaffoldar (SC) anvandes som referensgrupp. Data representerar faldiga forandringar (engelska "fold 5 changes") av malgener normaliserad med referensgener (Gapdh och 18S), uttryckt som procent av celler odlade pa reguljara scaffoldar (SC) vid dag 7, vilket sattes till 100 %. Varden representerar medel ± SEM. Studentens t-test: (a) 1.) 0.05 mot reguljar scaffold (SC) och (b) mot kontrollalginatscaffold (-).

DETALJERAD BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN 10 Foreliggande dokument beskriver en titandioxidscaffold, van i atminstone del av ytan av namnda titandioxidscaffold är tillhandahallen med en hydrogelbelaggning vilken hydrogelbelaggning innefattar atminstone en biologiskt aktiv substans (hari ocksa betecknad biomolekyl).

Titandioxidscaffolden med hydrogelbelaggningen innefattande atminstone en biologiskt 15 aktiv substans kan i sammanhanget av foreliggande dokument ocksa betecknas en "titandioxidscaffold innefattande en hydrogelbelaggning", en "hydrogel-belagd titandioxidscaffold" och liknande. Ytan vilken an tillhandahallen med hydrogelen kan bade vara den yttre ytan av titandioxidscaffolden men ocksa ytan av porerna inuti scaffolden (vaggarna av porerna). Det ska forstas att hydrogelbelaggningen innefattar atminstone en 20 biologiskt aktiv substans, om det inte an uttryckligen klart fran sammanhanget att ingen sadan biologiskt aktiva substans är narvarande.

En hydrogel kan definieras som en gel som innehaller vatten. Hydrogelbelaggningen som beskrivs hari innefattar ett natverk av polymerkedjor som är hydrofila och h6gt absorberande och darfor antar hydrogelen ett gelliknande tillstand nar den är vat. 25 Emellertid ska det forstas att en viss mangd av fukt kravs for att hydrogelbelaggningen ska anta detta gellika tillstand. Darfor kommer en hydrogel, nar en hydrogelbelagd titandioxidscaffold t ex torkas eller lagras pa ett torrt stalle, snarare att vara i formen av ett tunt, dehydrerat filmlager (aka en "xerogel"). EmeMedd kommer detta filmlager, nar den hydrogelbelagda titandioxidscaffolden utsatts for en fuktigare miljo, sasom nar den 30 implanteras i en kropp eller sanks ner i en vattenhaltig losning, att anta utseendet av en hydrogel igen. Om inte uttryckligen uppenbart fran sammanhanget ska det forstas att nar en hydrogel hanvisas till i foreliggande dokument omfattar detta bade fuktiga och torra former av gelen. 9 Hydrogelen bildas fran en polymer med hog molekylvikt som har en molekylvikt av omkring 1 000-1 000 000 g/mol, sasom 1 000-200 000 g/mol, sasom alginat, kitosan, hyaluronsyra, polyetylenglykol (PEG), cellulosa, poly(akrylsyra) (PAA), poly(glykolsyra) (PGA), poly(mjolksyra) (PLA), PLA-PGA, PLA-PEG, dextran, dextran-PEG, starkelse, 5 kollagenbaserade geler, agaroser, pluronic-syra, heparansulfat, glykosaminoglykaner, polyetylenoxid (PEO), sampolymer av etylenoxid och propylenoxid (P(E0-co-P0)), och pluronic/poloxamer.

Kitosan är mer stabil an alginater, men bryts snabbt ner i lagt pH, t ex vid forhallanden som är narvarande i inflammerade, infekterade eller hypoxiska vavnader. Kitosan tros 10 ocksa i sig sjalvt ha antiinflammatoriska egenskaper. Andra hydrogeler, likt starkelse- och kollagenbaserade geler har liknande egenskaper, men bryts ner snabbare lokala vavnadsfaktorer likt kollagenaser. Cellulosor är ocksa pH-beroende och kan formas i manga olika kemiska modifieringar beroende pa anvandningen, den mekanisk styrkan etc. som behovs. PLA och PGA bryts snabbt ner till organiska syror (d v s mjolksyra) som 15 kan ha gynnsamma lokala effekter pa vavnader, infektioner och pa nedbrytningshastigheten av andra hydrogeler (t ex kitosan) nar anvanda i kombinationer. Hyaluronsyra är en annan viktigt hydrogel med biologiska effekter. Den är en viktig bestandsdel av brosk och anvands ofta i leder, for sarlakning och i ogonen. Den är milt antiinflammatorisk och tros stimulera regenereringen av vissa typer av bindvav, ligament 20 och hornhinneceller. PEG är en mycket biokompatibel hydrogel som är mycket flexibel med avseende pa styrka, tvarbindning for designade nedbrytningshastigheter etc. och en gel som kan lankas kemiskt till biologiska molekyler for att tillhandahalla en kontrollerad fordrojd frisattningsvehikel som kan designas for manga olika tillstand.

Ytterligare exempel pa polymerer som kan anvandas kir att bilda hydrogelen inkluderar, 25 men är inte begransade till: poly(propylenoxid) (PPO), poly(butylenoxid) (PBO), poly(2- hydroxietylmetakrylat), hydroxietylmetakrylat, poly(etylenglykol) metakrylat, akrylsyra akrylamid, N-isopropylakrylamid, poly(vinylalkohol) (PVA), polyakrylamid(PAAm), poly(Nvinylpyrrolidon) (PNVP), poly(hydroxietylmetakrylat) PHEMA), poly(etylenoxid) (PEO), poly(etylenglykol) monometyleter (PEGME), metylcellulosor sasom karboximetyl 30 cellulosa, poly(hydroxietylmetakrylat) (PHEMA) sampolymeriserad med NVP metakrylsyra (MAA),butylmetakrylat(BMA),metylmetakrylat(M MA),3-metoxi-2- hydroxipropylmetakrylat (MHPM), PHEMA/poly(etylenterftalat) (PTFE), PH EMA, P(HEMAco-MMA), P(HEMA-b-siloxan), PVA, poly(akrylsyra) (PAA), poly (glyceriyl metakrylat), HEMA, polycyanoakrylater, fumarsyra-PEG, sebacinsyra/1,3-bis(p-karboxifenoxi) propan 35 (P (CPP-SA)) PHEMA, PVA, PNVP, poly(etylen-co-vinylacetat) (PEVAc), poly(akrylamid) (PAAm), poly (dietylaminoetylmetakrylat) (PDEAEMA), poly (dimetylaminoetyl metakrylat), (PDMAEMA), poly(metakrylsyra-ympad-poly(etylenglykol)), (P(MAA-g-EG)), poly(akryl syra-ympad-poly(etylenglykol) (P(PAA-g-EG)), poly(N-isopropylakrylamid) (PNI PAAm), PNI PAAm/PAA, polyglykol-alginat, collagenbaserade geler (gelatiner) och heparansulfat och dess analoger och andra glykosaminoglykaner.

Hydrogelen kan fungera som en barare for den biologiskt aktiva substansen men vissa polymerer kan ocksa ha en biologisk aktivitet i sig sjalva (t ex kitosan, heparansulfat, hyaluronsyra och kollagener) eller brytas ner till biologiskt aktiva metaboliter genom naturliga processer i en kropp (t ex PLA, PGA, kollagener, heparansulfatanaloger). 10 Polymeren är typiskt en polymer med hog molekylvikt, d v s en polymer som har en molekylvikt (M,) av omkring 1 000-1 000 000 g/mol, sasom 1 000-200 000 g/mol. Hydrogelbelaggningen kan innefatta en eller fler typer av polymerer som blandas med varandra nar hydrogelen bereds. Alternativt kan hydrogelen byggas upp av olika lager av hydrogel som kan innefatta olika polymerer eller olika blandningar av polymerer.

Genom att variera den/de biologiskt aktiv(a) molekylen/molekylerna i hydrogelen och polymeren/polymererna som det respektive hydrogellagret byggs upp av och/eller polymeren/polymererna i de olika hydrogellagren kan den onskade biologiska funktionen av hydrogelen erhallas beroende pa den avsedda funktionen av den hydrogelbelagda titandioxidscaffolden i ett objekt.

Nar hydrogelen är en alginathydrogel kan alginaten vara t ex natriumalginat, kaliumalginat, kalciumalginat och strontiumalginat. Alginat är en linjar sampolymer med homopolymera block av (1-4)-lankade 6-D-mannuronat (M)- respektive dess C-5-epimer a-L-guluronat (G)-rester, kovalent lankade tillsammans i olika sekvenser eller block. Monomererna kan upptrada i homopolymera block av pa varandra foljande G-rester (G- 25 block), pa varandra foljande M-rester (M-block) eller alternerande M- och G-rester (MG-block). Egenskaperna hos alginaten forandras med olika forhallande av M- och Gblocken, likval som deras sekvens. Alginaten kan innefatta ett minimum av omkring 60 % guluronatmonomerer.

Hydrogelen är narvarande pa den yttre ytan av titandioxidscaffolden, men den kan ocksa i olika grader penetrera scaffolden och belagga vaggarna av porerna inuti scaffolden eller fylla upp utrymmet av scaffoldporerna.

Hydrogelbelaggningen kan ha en vattjocklek av atminstone 1 pm, sasom 1-20 pm eller 110 pm. En sadan tunn hydrogel kan belagga atminstone del av den yttre ytan av 11 titandioxidscaffolden men kan ocksa belagga vaggarna av porerna inuti scaffolden. Hydrogelbelaggningen kan innefatta en eller fler efter varandra bildade lager av hydrogel. Hydrogelbelaggningen kan darfor byggas upp av 1-10 hydrogellager, sasom 2-6, 2-4, 3 eller 4 lager. En tunn tjocklek av hydrogelbelaggningen kan vara fordelaktig eftersom en sadan tunn belaggning inte vasentligen kommer att blockera poroppningama av titandioxidscaffolden, aven om pordiametern naturligtvis reduceras nagot pa grund av hydrogelbelaggningen. Viss initial blockering av scaffoldporerna kan ske aven nar en tunn hydrogelbelaggning bereds, men i en biologisk miljo sags en viss nedbrytning av den blockerande hydrogelbelaggningen i de porer som forblev blockerade direkt efter 10 belaggningsprocessen (se Exempel 2). Den vasentliga avsaknaden av porblockering är fOrdelaktig eftersom cellvaxt in i titandioxidscaffolden darmed kan fOrbattras eftersom porerna, trots hydrogelbelaggningen, är latt tillgangliga for penetrering av celler och vavnad.

En annan fordel med en tunn hydrogelbelaggning som ocksa bildas i vaggarna av scaffoldporerna är att det kommer att bli eft mycket stort forhallande av yta-till-volym jamfort med nar hydrogelbelaggningen huvudsakligen bildas pa den yttre ytan av scaffolden. Detta kommer att paverka frisattningsprofilen av en substans, sasom den biologiskt aktiv substansen som inkluderas i hydrogelbelaggningen. Dessutom, aven om hydrogelbelaggningen skulle flaga av fran den yttre ytan av titandioxidscaffolden, om hydrogelen ocksa är narvarande inuti scaffolden, fOrloras inte alit av hydrogelen fran scaffolden genom avflagningen utan hydrogelen med biomolekyl(er) skulle fortfarande vara narvarande inuti scaffolden.

Storleken av biomolekylen kan paverka valet av antalet hydrogellager och/eller den totala tjockleken av hydrogellagret. En mindre biomolekyl (d v s som har en lagre Mw, sasom doxycyklin) diffunderar ut ur hydrogelbelaggningen snabbare an en storre biomolekyl. Darfor, om en fordrojd frisattning av den mindre biomolekylen onskas, kravs en tjockare hydrogelgekaggningen. A andra sidan, for en store biomolekyl, är frisattningshastigheten mer beroende pa nedbrytningen av hydrogelen och biomolekylen diffunderar inte ut ur hydrogelbelaggningen lika snabbt som en mindre biomolekyl. Darfor kan en tunnare hydrogelbelaggning anvandas for en storre biomolekyl. Genom att [canna storleken av biomolekylen och den onskade frisattningshastigheten kan tjockleken av hydrogelbelaggningen darfor justeras for att astadkomma den onskade frisattningshastigheten. 12 Alternativt kan hydrogelen fylla upp utrymmet inuti titandioxidscaffolden, d v s fylla upp porerna i olika omfattning (likval som eventuellt vara narvarande pa den yttre ytan av titandioxidscaffolden). Detta kan vara sarskilt fordelaktigt nar celler (for exempel pa celltyper, se pa annat hall hari), sasom stamceller, ska inkorporeras i 5 titandioxidscaffolden, eftersom detta dialer ett stort antal celler att deponeras inuti scaffoldporerna. Till exempel kan omkring 50-100 %, 60-100 %, 70-100 %, 80-100 %, 90100 % eller 90-99 °A av den totala porvolymen inuti titandioxidscaffolden fyllas med en hydrogelbelaggning.

Metoden f6r att producera en hydrogelbelagd(a) titandioxidscaffold(ar) som beskrivs hari 10 tillhandahaller en titandioxidscaffold van i atminstone del av scaffolden tillhandahalls med en hydrogelbelaggning innefattande en biologiskt aktiv substans/biologiskt aktiva substanser. Detta dokument riktar sig darfor ocksa till en titandioxidscaffold innefattande en hydrogelbelaggning innefattande en biologiskt aktiv substans/biologiskt aktiva substanser, erhallbar eller erhallen genom metoden beskriven hari.

Metoder f6r att bilda hydrogelbelaggningen innefattande en biologiskt aktiv substans(er) Eft exempel pa en metod for att producera den hari beskrivna titandioxidscaffolden innefattande en hydrogelbelaggning innefattande en biologiskt aktiv substans är en metod innefattande stegen av att: a) tillhandahalla en titandioxidscaffold. tillhandahalla en polymerlosning innefattande en biologiskt aktiv substans(er) och omkring 1-10 vikt/vol% av en polymer vald fran gruppen bestaende av alginat, kitosan, hyaluronsyra, polyetylenglykol (PEG), cellulosa, poly(akrylsyra) (FAA), poly(glykolsyra) (PGA), poly(mjolksyra) (PLA), PLA-PGA, PLA-PEG, dextran, dextran-PEG, starkelse, kollagenbaserade geler, agaroser, pluronic-syra, heparansulfat, glykosaminoglykaner, PEO, P(E0-co-P0), och pluronic/poloxamer, till atminstone del av namnda titandioxidscaffold och sedan centrifugera titandioxidscaffolden, astadkomma gelning av polymeren som tillhandahallits titandioxidscaffolden i steg b); och eventuellt torka titandioxidscaffolden, van i steg b) och c) eventuellt upprepas atminstone en gang. 13 Metoden kan ocksa besta av de ovanstaende stegen a)-d), van i steg b) och c) eventuellt upprepas atminstone en gang. Nar steg b) och c) upprepas byggs en hydrogelbelaggning som innefattar tva eller fler hydrogellager upp.

Titandioxidscaffolden av steg a) är en titandioxidscaffold som beskriven pa annat hall hari.

Polymerlosningen är en vattenhaltig losning innefattande atminstone en av polymererna som listas hari som lampliga for aft bilda hydrogelen (eller en polymer som har en liknande funktion) vid en koncentration av omkring 1-10 vikt/vol%. Polymerlosningen kan beredas genom aft lOsa upp polymeren i destillerat vatten eller en lamplig buffert, sasom 10 fosfatbuffrad saltlosning, genom omrorning tills polymeren losts upp, foretradesvis vid rumstemperatur, t ex i 1 timme till over natt (t ex 1-24 timmar). Den biologiskt aktiva substansen(erna) an en biologiskt aktiv substans som beskrivet pa annat stalle hari och satts foretradesvis till polymerlosningen. Koncentrationen av den biologiskt aktiva substansen, nar den satts till polymerlOsningen, beror naturligtvis pa den specifika biologiskt aktiva substansen och/eller dess avsedda funktion i kroppen. Dess koncentration i polymerlosningen är typiskt i omradet av mikrogram, aven om den kan variera fran 1 ng-1 mg/ml, sasom 500 ng/m1-500 mg/m1 eller 0,5-500 m.g/ml.

For att tillhandahalla polymerlosningen till titandioxidscaffolden kan titandioxidscaffolden sankas ner i en polymerlosning. Detta kan ske under omrorning, t ex via en orbitalskak vid omkring 100 rpm/min. Skakningen hjalper till att sprida alginatlosningen i det porosa natverket av scaffolden. Typiskt sanks titandioxidscaffolden ner under en tidsperiod av omkring 10 min till 2 timmar, sasom 1-2 timmar, t ex 1 timme. Nedsankningen sker typiskt vid rumstemperatur.

Efter nedsankning i en polymerlosning tas overskott av losning typiskt bort genom forsiktig centrifugering av titandioxidscaffolden, sasom vid omkring 200-300 x g under en kort tidsperiod, sasom 0,5-2 min, t ex 1 min.

For att astadkomma gelning av polymeren i steg c), kan standardmetoder, kanda av fackmannen pa omradet, anvandas. Beroende pa den specifika polymeren som anvands f6r att bereda den hydrogelbelagda titandioxidscaffolden kan gelningen i steg c) astadkommas pa olika satt, sasom genom att andra pH eller temperatur, genom tillsatsen av eft salt, exponering f6r ljus av vissa vaglangder, anvandningen av tvarbindande medel etc. 14 Nar alginat anvands som en polymer tillhandahalls titandioxidscaffolden i steg c) med en divalent katjonlosning. Den divalenta katjonsaltlosningen (hari aven betecknad "divalent katjonlosning" hari) är en vattenhaltig losning innefattande atminstone eft salt av en divalent katjon, sasom Ca2+, Mg2+, Ba2+ eller Sr. Exempel pa lampliga divalenta katjonsalter inkluderar, men är inte begransade till, CaCl2, SrCl2, SrCO3, SrPO4, CaCO3, CaPO4, MgC12, MgCO3, och MgPO4. Koncentrationen av det divalenta katjonsattet denna lashing är typiskt omkring 15-500 mM, sasom omkring 15-150, 20-500 mM, 20-100 mM, 20-400 mM, 200-400 mM, 250-350 mM, 30-80 mM, 40-60 mM, 45-55 mM eller omkring 50 mM. Foretradesvis an koncentrationen omkring 20-100 mM. Foretradesvis är det 10 divalenta katjonsaltet CaCl2. For att tillhandahalla titandioxidscaffolden med den divalenta katjonlOsningen kan titandioxidscaffolden sankas ner i den divalenta katjonlOsningen under en tidperiod av t ex 10 min till 2 timmar, sasom 1-2 timmar, t ex 1 timme. Alternativt kan andra satt att tillhandahalla den divalenta katjonlosningen anvandas, t ex sasom den divalenta katjonlosningen tillhandahallits titandioxiden, skoljs scaffolden eventuellt, t ex i destillerat vatten for att ta bort overskott av divalent katjonlosning. Dessutom kan biologiskt aktiva substanser sattas till den divalenta katjonlosningen (t ex i samma koncentrationer som nar de satts till polymerlosningen) aven om dessa foretradesvis satts till alginatlosningen. Nar polymeren On kitosan eller PEG, kan gelning ocksa astadkommas som beskrivet for hur gelning av alginat astadkoms. 20 Nar kitosan anvands som polymeren kan gelningen (steg c)) astadkommas genom en forandring i pH eller genom tvarbindning genom joninteraktioner. Kitosan On det deacetylerade derivatet av kitin, en naturlig komponent av rak- och krabbskal. Det On en biokompatibel, pH-beroende katjonpolymer, vilken Or loslig i vatten upp till pH 6,2. Gelning av kitosan kan t ex astadkommas genom en hojning i pH till ett basiskt pH, sasom pH 8 eller men. Start-pH av kitosanlOsningen kan vara fran 3 till mindre On 8, sasom omkring 5,5. Basgoring av vattenhaltiga kitosanlosningar ovan ett pH av 8 leder till bildningen av ett hydrerat gelliknande precipitat. Fasseparering On en foljd av neutraliseringen av kitosanamingrupper och den efterfoljande elimineringen av repulsiva elektrostatiska krafter inom kedjor, vilket darefter tillater omfattande vatebindning och hydrofoba interaktioner mellan kedjor. Nar gelning av kitosan astadkoms genom anvandningen av tvarbindning genom joninteraktioner, tillhandahalls ett divalent katjonsalt till titandioxidscaffolden som erhalls i steg b) pa liknande satt som beskrivs f6r alginat.

Nar poly(etylenglykol) (PEG) anvands som polymeren i steg b) kan gelning t ex astadkommas genom tvarbindning genom joninteraktioner genom att tillhandahalla en divalent katjonsaltlosning till titandioxidscaffolden erhallen i steg b) pa liknande satt som beskrivs for alginat. Gelningen kommer att vara snabbare och skapa en tatare gel med hogre divalent saltkoncentration. Kondenseringsreaktioner mellan hydroxylgrupper eller aminer med karboxylsyror eller derivat harav anvands ofta for syntesen av polymerer for att ge polyestrar och polyaminer respektive PEG. Emellertid är ett antal andra metoder for 5 att Astadkomma gelning av PEG tillgangliga och kanda for fackmannen pa omradet.

Nar bluronic gel bereds sasom genom anvandningen av polexamer kan gelning astadkornmas genom en okning temperatur. I detta fall m6ste startternperaturen nar gelning ska Astadkommas vara 00 eller mindre. Temperaturen hojs sedan till omkring 35-°C, s5som 37 °C, vilket kommer att orsaka en gelning av polymeren och bildningen 10 av en pluronicgel.

Nar en hyaluronsyrabaserad hydrogel ska beredas sanks titandioxidscaffolden i steg c) ner i en losning innefattande en kemisk tvarbindare, sasom tetra-tiol-derivatiserad polyetylenglykol (PEG). —SH4 (Mw 10 000) i koncentrationsintervall av omkring 0,01 till 10 g/I. 15 Nar polyetylenoxid (PEO) hydrogel ska bildas kan gelning i steg c) astadkommas genom temperaturberoende polymerisering genom en okning i temperatur fran °C till 37 °C, eller minskning av temperaturen fra'n 50 °C till 37 °C. Alternativt kan titandioxidscaffolden erhallen i steg b) exponeras for straining med ljus vid en vaglangd av 200-400 nm kir att astadkomma gelning i steg c) nar en PEO-hydrogel ska bildas. 20 Steg d) kan utforas under en tidsperiod av omkring 0,5 timmar till flera dagar. Det kan t ex utforas Over natten, t ex i 0,5-24 timmar, 5-10 timmar eller bara 1 timme. Detta steg utfors typiskt vid rumstemperatur.

Metoden for att producera en hydrogelbelagd titandioxidscaffold beskriven hari tillhandahaller en titandioxidscaffold tillhandahallen med en hydrogelbelaggning 25 innefattande en biologiskt aktiv substans(er). Detta dokument är darfor ocksa riktat till den hari beskrivna titandioxidscaffolden innefattande en hydrogelbelaggning innefattande en biologiskt aktiv substans(er), erhallbar eller erhallen genom den ovansthende metoden.

Nar den ovanstaende metoden anvands for att bereda den hydrogelbelagda titandioxidscaffolden kommer atminstone del av den yttre ytan av scaffolden att 30 tillhandahallas med hydrogelbelaggningen. Eftersom titandioxidscaffolden antar en poros struktur kommer emellertid polymerlosningen genom den ovansthende metoden ocksa tillatas att penetrera porerna av scaffolden och hydrogelbelaggningen foljaktligen att bildas ocksa pa ytan av atminstone del av porerna inuti scaffolden. Hur djupt in i 16 scaffoldporerna hydrogelbelaggningen kommer att bildas kommer naturligtvis att bero pa faktorer sasom scaffoldporositet (en storre porositet kommer att underlagga penetreringen av polymer och tillata belaggningen att bildas djupare inuti scaffolden), koncentrationen av polymer och/eller metoden som anvands for att astadkomma gelning i steg c), centrifugeringshastigheten etc. Emellertid tillater foreliggande metod atminstone del av ytan (vaggarna) av atminstone de yttre porerna av titandioxidscaffolden att belaggas med en hydrogelbelaggning. Hydrogelbelaggningen är typiskt narvarande alltigenom scaffoldstrukturen nar en hydrogelbelagd titandioxidscaffold analyseras genom skannande elektronmikroskopi (SEM). Genom den ovanstaende metoden bildas 10 hydrogelbelaggningen darfor inte bara pa den yttre ytan av titandioxidscaffolden, men ocksa i en varierande grad pa ytan av porerna inuti scaffolden. Typiskt kommer majoriteten av porytorna pa vilka hydrogelbelaggningen tillhandahalls belaggas med hydrogelbelaggningen.

Naturligtvis kan bara del av titandioxidscaffolden tillhandahallas med polymerlosningen. For att hydrogelen ska bildas är det viktigt att delen av scaffolden pa vilken bildning av sadan hydrogel onskas kommer att utsattas for bade polymerlosningen och metoden for att astadkomma gelning.

Med foreliggande metod är det mojligt att bilda en tunn hydrogelbelaggning pa titandioxidscaffolden eftersom centrifugeringen i steg b) tillater ett mycket tunt lager av 20 polymerlosning att deponeras pa den yttre ytan och aven inuti porerna pa titandioxidscaffolden. Dessutom, utan onskan att vara teoretiskt bunden, kan hydrogelbelaggningen vara resultatet av den laga densiteten av polymerlosningen som anvands, vilken tillater dess penetrering in i porerna av scaffolden. Den ovanstaende metoden tillater varje hydrogellager av hydrogelbelaggningen att typiskt ha en vattjocklek av atminstone 1 pi, sasom omkring 3 pm pa ytan den belagger. Genom att upprepa metodsteg b) och c) kan emellertid en hydrogelbelaggning bestaende av tva eller fler hydrogellager byggas upp. Den ovanstaende metoden kan darfor anvandas for att kontrollera tjockleken av hydrogelbelaggningen genom att upprepa steg b) och c), sasom 2-100, 2-10, 2-6, 2-4, 3 eller 4 ganger, tills en hydrogelbelaggning av den onskade 30 tjockleken erhalls.

Dessutom tillater den ovanstaende metoden bildandet av en hydrogelbelaggning som har en mer jamn tjocklek att bildas. Dessutom är hydrogelbelaggningen som bildas genom denna metod vasentligen ickeporos, jamfor med en alginathydrogel som bereds genom att helt enkelt blanda alginat och en divalent katjonsaltlOsning vilken har viss porositet (se 17 t ex gelen som bereds i Exempel 1 och som visas i Fig. 1). Anledningen for den vasentliga avsaknaden av porositet av hydrogelbelaggningen nar den bereds pa en titandioxidscaffold av metoden beskriven ovan är troligen den tunna belaggningen av polymerlosning bildad pa titandioxidscaffolden efter centrifugering i steg b).

Den ovanstaende metoden tillater ocksa bildningen av en hydrogelbelaggning innefattande en eller fler hydrogellager genom att upprepa steg b) och c). Om det är foredraget tillater detta aven bildningen av olika hydrogellager med olika biologiskt aktiva substans(er) och/eller typer av polymerer i de olika lagren.

Nar polymeren som anvands är PEG, kitosan eller alginat det ocksa mojligt att utfora steg 10 c) innan steg b). EmeMedd bildas i det fallet inte en tunn belaggning av hydrogelen. Snarare fyller i detta fall hydrogelbelaggningen upp majoriteten av porerna inuti titandioxidscaffolden. Detta kan vara sarskilt fordelaktigt nar celler, sasom stamceller, ska inkorporeras i titandioxidscaffolden, eftersom detta tillater ett storre antal celler att deponeras inuti scaffoldporerna. Nar steg c) utfors innan steg b) kan det vara overflOdigt 15 att upprepa steg c) och b) eftersom de fiesta porerna av titandioxidscaffolden kommer att fyllas upp med hydrogelbelaggning redan efter steg c) och b) utforts en gang.

Genom att uffora den ovanstaende metoden produceras en hydrogelbelagd titandioxidscaffold som beskriven hari. Foreliggande dokument riktar sig darfor ocksa till en hydrogelbelagd titandioxidscaffold som definierad hari, erhallbar eller erhallen genom 20 att utf6ra den ovanstaende metoden.

Tillampningar av den hydrogelbelagda titandioxidscaffolden Titandioxidscaffolden innefattande en hydrogelbelaggning anvands typiskt som ett medicinskt implantat, antingen ensamt eller innefattat som en del av ett implantat. Som är uppenbart fran andra delar av detta dokument tillater titandioxidscaffolden som anvands att implantatstrukturer skraddarsys, specifikt anpassade till implantationsstallet och den avsedda funktionen av implantatet. Detta dokument riktar sig darfor till en titandioxidscaffold innefattande en hydrogelbelaggning for anvandning som ett medicinskt implantat. Den hydrogelbelagda titandioxidscaffolden innefattar en poros struktur vilken har en god biokompatibilitet och vilken kan stimulera vaxten av celler och fastandet av 30 scaffolden eller implantatet som innefattar scaffolden. Den porosa strukturen tillater invaxt av celler i scaffolden, vilket darmed tillater for regenereringen av vavnad. Den stora ytarean av underlattar ocksa vaxten av celler in i strukturen och darmed fastandet av scaffolden och regenerering av vavnad. Eftersom titandioxidscaffold i sig sjalv an gjord av 18 ett material som har en god biokompatibilitet reduceras negativa reaktioner till scaffolden nar den implanteras i ett objekt.

Titandioxidscaffolden innefattande en hydrogelbelaggning kan implanteras i ett objekt vani celler kommer att vaxa in i scaffoldstrukturen. Det är ocksa mojligt att sa och vaxa celler 5 pa den hydrogelbelagda titandioxidscaffolden innan implantering. Den sammankopplade makroporosa strukturen av titandioxidscaffolden är sarskilt lamplig for vavnadsregenerering och sarskilt benvavnadsregenerering, ett spannande alternativ till for narvarande tillgangliga benreparationsterapier. I detta avseende utfors sadd av celler erhallna fran benmarg pa titandioxidscaffolden genom att anvanda konventionella 10 metoder, vilka är valkanda for fackmannen pa omradet (se t ex Maniatopoulos etal. 1988) Celler sas pa den hydrogelbelagda titandioxidscaffolden och odlas under lampliga forhallanden. Odlingarna matas med media som är lampligt for att etablera vaxten darav.

Hydrogeler som är associerad med att ha positiv effekt pa benbildning och drogtillforsel i ben är t ex kitosan, PEG, poloxamerer sasom pluronic, hyaluronsyrabaserade hydrogeler, 15 polyetylenoxid (PEO) hydrogel och heparinsulfater.

Celler av olika typer kan vaxas genom den hydrogelbelagda titandioxidscaffolden. Mer precist inkluderar celltyper hematopoetiska eller mesenkymala stamceller och inkluderar ocksa celler som ger kardiovaskular, muskular eller vilken bindvavnad som heist. Celler kan vara av humant eller annat animalt ursprung. Emellertid är den hydrogelbelagda 20 titandioxidscaffolden sarskilt lampad for vaxten av osteogena celler, benprekursorceller, progenitorceller, stamceller, pluripotenta celler, multipotenta celler, vaskulara (endotel-) celler, i synnerhet celler som bildar benmatrix. For vavnadsregenerering kan cellerna ha vilket ursprung som heist. Cellerna är fordelaktigt av humant ursprung. En metod av att vaxa celler i en hydrogelbelagd titandioxidscaffold tillater sadda osteogena celler, till 25 exempel, att penetrera titandioxidscaffolden for att bilda benmatris, under in vitro-steget, med genomtrangande distribution i strukturen av titandioxidscaffolden. Osteogen cellpenetrering och, som ett resultat, benmatrisbildning kan forstarkas genom mekaniska, ultraljuds-, elektriska falt eller elektroniska medel. 30 Den hydrogelbelagda titandioxidscaffolden är anvandbar narhelst man ar i behov av en struktur att verka som en struktur for vaxt av celler, sasom for regenerering av en vavnad. Den hydrogelbelagda titandioxidscaffolden är synnerligen lamplig for regenereringen av ben- och broskstrukturer. Exempel pa situationer dar regenereringen av sadana strukturer 19 kan vara nodvandig inkluderar trauma, kirurgiskt borttagande av ben eller tander eller i samband med cancerterapi.

Exempel pa strukturer i en patient vilka i sin helhet eller delvis kan ersattas inkluderar, men är inte begransade till, kraniofaciala ben, inkluderande arcus zygomaticus, ben i innerbrat (i synnerhet hammaren, stigbygeln och stadet, maxillar och mandibular dentalalveolar as, vaggar och nedre vaggar av ogonhalor, vaggar och nedre vaggar av bihalor, skallben och defekter i skallben, ledskal for hoftled (Fosse acetabuli), t ex i fallet av hoftledsdysplasi, komplicerade frakturer i langa ben inkluderande (men inte begransat 10 till) humerus, radius, ulna, femur, tibia och fibula, ryggrad, ben i handerna och fotterna, finger- och taben, fyllning av extraktionshal (fran tandextraktioner), reparation av parodontaldefekter och reparation av periimplantitdefekter. Dessutom är den hydrogelbelagda titandioxidscaffolden anvandbar for fyllningen av alla typer av bendefekter som resulterar fran (borttagandet av) turnorer, cancrar, infektioner, trauma, kirurgi, medfodda missbildningar, arftliga tillstand, metabola sjukdomar (t ex osteoporos och diabetes).

Den hydrogelbelagda titandioxidscaffolden beredd genom den beskrivna metoden eller ett medicinskt implantat innefattande en sadan scaffold kan anvandas for regenereringen, 20 reparationen, ersattandet och/eller 6terstallandet av vavnad, sasom ben. Detta dokument riktar sig darfor ocksa till den hydrogelbelagda titandioxidscaffolden eller ett medicinskt implantat innefattande den for anvandning for regenereringen, reparationen, ersattandet och/eller aterstallandet av vavnad, sasom ben.

Den hydrogelbelagda titandioxidscaffolden erhallbar genom metoden av foreliggande dokument kan ocksa anvandas for beredningen av ett medicinskt implantat for regenereringen, reparationen, ersattandet och/eller aterstallandet av vavnad, sasom ben. Den hydrogelbelagda titandioxidscaffolden kan ocksa anvandas for beredningen av ett medicinskt implantat for regenereringen, reparationen, ersattandet och/eller aterstallandet 30 av ben.

Den hydrogelbelagda titandioxidscaffolden erhallbar genom metoden av foreliggande dokument eller ett medicinskt implantat innefattande den kan ocksa anvandas i en metod for regenereringen, reparationen, ersattandet och/eller aterstallandet av vavnad innefattande implantationen i ett objekt i behov darav av scaffolden eller det medicinska implantatet.

Biologiskt aktiva substanser (biomolekyler) Som namnt ovan kan hydrogellosningen och/eller den divalenta katjonlosningen innefatta 5 en eller fler olika sorters biologiskt aktiva substans(er). Den biologiskt aktiva substansen(erna) kan darfor inkorporeras i hydrogelbelaggningen. Hydrogelbelaggningen kan darfor verka som en barare for en biologiskt aktiv substans. Hydrogelbelaggningen kan innefatta en sorts biologiskt aktiv substans eller en blandning av tva eller fler biologiskt aktiva substanser. Som narnnt ovan, nar hydrogelbelaggningen bereds genom 10 att upprepa steg b) och c) av metoden beskriven pa annat hall hari kan de olika lagren innefatta olika biologiskt aktiva substanser.

Den biologiskt aktiva substansen kan vara vilken substans som heist som har en biologisk aktivitet i kroppen sasom en syntetisk eller naturligt bioaktiv molekyl, en naturlig eller syntetisk drag och/eller en levande cell. Oorganiska, biologiskt aktiva joner kan ocksa 15 inkorporeras, sasom kalcium, krom, fluor, guld, jod, kalium, magnesium, mangan, selen, svavel, tenn, natrium, zink, strontium, nitrat, nitrit, fosfat, klorid, sulfat, karbonat, karboxyl och liknande.

Exempel pa levande celler for inkorporering i hydrogelbelaggningen inkluderar, men är inte begransade till, mesenkymala stamceller, benceller, pluripotenta celler, 20 benprekursorceller, vaskulara celler, vaskulara prekursorceller och/eller stromaceller.

Exempel pa biologiskt aktiva substanser inkluderar ocksa, men är inte begransade till, naturliga eller rekombinanta bioadhesiver, naturliga eller rekombinanta faktorer for cellfastande; naturliga, rekombinanta eller syntetiska biopolymerer; naturliga eller rekombinanta blodproteiner; naturliga eller rekombinanta enzymer; naturliga eller rekombinanta extracellular matrisproteiner; naturliga eller syntetiska extracellular matrisbiomolekyler; naturliga eller rekombinanta signalmolekyler, tillvaxtfaktorer och hormoner; naturliga, rekombinanta och syntetiska peptider, syntetiska peptidhormoner; naturlig, rekombinanta eller syntetiska deoxiribonukleinsyror; naturliga, rekombinanta eller syntetiska ribonukleotidsyror; naturliga eller rekombinanta receptorer; enzyminhibitorer; 30 droger; biologiskt aktiva anjoner och katjoner; vitaminer; adenosinmonofosfat (AMP), adenosindifosfat (ADP) eller adenosintrifosfat (ATP); markorbiomolekyler; aminosyror; fettsyror; nukleotider (RNA- och DNA-baser), socker, antimikrobiella substanser, sasom tetracykliner, och sma biologiska organiska molekyler, sasom statiner och/eller bisfosfonater. 21 Peptider och proteiner som är lampliga for inkorporering i hydrogelbelaggningen inkluderar i synnerhet peptider och proteiner som är kanda att paverka cellvaxt och/eller osseointegrering av implantat. Ett antal naturliga peptider har visats inducera mineralprecipitering och kan darfOr lampligen inkorporeras i hydrogelbelaggningen. Exempel inkluderar kollagen 1 och 2, amelogenin, ameloblastin, bone sialoprotein, enamelin och ansokalcin. Deposition och vaxt av apatiter in i mineraliserade endoskelettvavnader är en process som guidas av polyprolinrika proteiner. Upprepningar av polyprolin är ett vanligt kannetecken has extracellular hardvavnadsmatrisproteiner, och 10 spelar en roll i komprimeringen av proteinmatrisen, variabilitet i konformation, apatitkristallangden och bindning till proteindomaner som är frekvent involverade i signalhandelser. Till exempel är emaljmatrisderivat (EMD) ett extrakt av tandmaterial fran grisfoster som anvands for att biomimetiskt stimulera vaxten av mjuk- och hardvavnad. EMD har ocksa visats ha en mangfald av andra biologiska aktiviteter, sasom inhibering av inflammation och infektion. En kommersiell produkt som innefattar EMD är Straumann®Emdogain (Straumann AG, Peter Merian-Weg 12, CH 4052 Basel, Schweiz). EMD innehaller en stor mangd av amelogenin, vilket är ett protein som lampligen kan inkorporeras i hydrogelmatrisen, sasom namnt ovan.

Ytterligare exempel pa peptider som är lampliga for inkorporering i hydrogelbelaggningen inkluderar peptider baserade pa konsensuspeptiderna beskrivna i WO 2008/078167, vilket inducerar biomineralisering.

Peptider P2 (SEQ ID NO 1), P5 (SEQ ID NO 2) och P6 (SEQ ID NO 3), som anyands i den experimentella delen, är exempel pa peptider baserade pa konsensussekvenserna av WO 2008/078167 vilka lampligen inkorporeras i hydrogelbelaggningen. Andra exempel pa en sadan sekvens är P1 (SEQ ID NO 4: PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP), P3 (SEQ ID NO 5: PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP) och P4 (SEQ ID NO 6: PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP).

Diffusionshastigheten av biologiskt aktiva substanser valfritt inkorporerade i hydrogelbelaggningen paverkas av molekylvikten och storleken av de biologiskt aktiva 30 substanserna (definierade genom Stokes radier) jamfort med porerna av hydrogelbelaggningen och beror pa den kemiska naturen av den biologiskt aktiva substansen (interaktioner molekyl-hydrogel, polarisering, d v s hydrofila substanser kan diffundera mycket snabbt medan hydrofoba substanser diffunderar langsamt genom hydrogelgelen). En krevadlik frisattningsprofil av den biologiskt aktiva substansen under 22 den forsta dagen eller dagarna efter implantation av den hydrogelbelagda titandioxidscaffolden i ett objekt kan finnas for en biologiskt aktiv substans som är mindre, sasom peptiderna som anvands i den experimentella delen av detta dokument. Genom att justera porstorleken av hydrogelbelaggningen (se ovan) och genom att ta egenskaper hos den biologiskt aktiva substansen i beaktande (sasom molekylvikt, form, polaritet etc.) kan frisattningshastigheten av en inkorporerad biologiskt aktiv substans justeras.

Koncentrationen av den biologiskt aktiva substansen i hydrogelen är typiskt i omradet av mikrogram, aven om den kan variera fran 1 ng-100 mg/ml, sasom 50 ng/m1-50 mg/ml, 100 ng/m1-50000 ng/ml. Naturligtvis kommer koncentrationen av den biologiskt aktiva 10 substansen i hydrogelen att bero av den specifika substansen, dess avsedda funktion i ett objekt etc.

Titandioxidscaffolden Titandioxidscaffolden som är lamplig fOr anvandning i samband med foreliggande dokument är en scaffold huvudsakligen bildad av titandioxid, d v s titandioxid är den huvudsakliga strukturella komponenten av titandioxidscaffolden. Titandioxidscaffolden ska anta en oppen poros struktur.

Titandioxidscaffolden är typiskt en makropor6s scaffold innefattande makroporer och sammankopplingar. Makroporer av titandioxidscaffolden har en pordiameter i omradet av mellan ungefar 10-3000 pm, sasom 20-2000 pm, omkring 30-1500 pm eller omkring 30- 20 700 pm. Det är viktigt att titandioxidscaffolden dialer invaxten av storre strukturer sasom blodkarl och trabekulart ben, d v s ocksa innefattar porer med en diameter av omkring 100 pm eller mer. Det är viktigt att atminstone vissa av porerna är sammankopplade och/eller delvis sammankopplade.

Pordiametern kan paverka hastigheten och omfattningen av vaxt av celler in i titandioxidscaffolden och darfor beskaffenheten av den resulterande vavnaden. Det makroporosa systemet ockuperar typiskt atminstone 50 % av volymen av titandioxidscaffolden. Volymen av makro- och mikroporerna i titandioxidscaffoldarna kan variera beroende pa funktionen av titandioxidscaffolden. Om syftet med en behandling är att ersatta mycket benstruktur och titandioxidscaffolden kan hallas obelastad under lakningstiden kan titandioxidscaffolden tillverkas med ett makroporost system som ockuperar upp till 90 % av den totala scaffoldvolymen.

Titandioxidscaffolden har typiskt en total porositet av omkring 40-99 %, sasom 70-90 %. 23 Fraktal dimension av stag av titandioxidscaffolden är typiskt omkring 2.0-3.0, sasom omkring 2.2-2.3. Stagtjockleken paverkar styrkan av titandioxidscaffoldarna, ju tjockare stagen i titandioxidscaffolden är, desto starkare är titandioxidscaffolden.

Titandioxidscaffolden har typiskt en inre stagvolym av omkring 0,001-3.0 i.m3, sasom omkring 0,8-1,2 pm3. En lagre volym och eft hOgre fraktalnummer ger en starkare scaffold.

Fackmannen kommer att forsta att ytan av titandioxidscaffolden har en struktur pa 10 mikronivan och nanonivan. Denna mikro- och nanostruktur kan modifieras beroende pa tillverkningsforhallandena. Pordiametrarna pa mikronivan är typiskt i omradet av 1-10 pm. Porerna pa nanonivan är typiskt mindre an 1 pm i diameter.

En titandioxidscaffoldstruktur i foreliggande sammanhang har typiskt en kombinerad mikro- och makropordiameter av ungefar 10-3000 pm, sasom 20-2000 pm, 30-1500 pm eller 30-700 pm. Pordiametern kan ocksa vara ovan 40 pm med sammankopplade porer av atminstone 20 pm.

Storleken och formen av titandioxidscaffolden bestams beroende pa dess avsedda 20 anvandning. Storleken och formen av titandioxidscaffolden kan anpassas antingen pa tillverkningsstadiet eller genom senare modifiering av ett fardigt scaffold. Titandioxidscaffoldama kan darfor latt skraddarsys kir deras specifika anvandning i en specifik patient. Typiskt justeras storleken, formen etc. av titanidioxidscaffolden innan den belaggs med en hydrogelbelaggning.

Typiskt kan titandioxidscaffolden produceras genom en metod av att doppa en polymersvampstruktur i en titandioxiduppslamning (se t ex metoderna beskrivna i WO 08078164), tillata uppslamningen att stelna pa svampen och uffora ett eller fler sintringssteg for att ta bort svampen och skapa en stark scaffoldstruktur. Titandioxidscaffolden kan darfor till exempel vara en titandioxidscaffold beskriven i WO 08078164. En sadan metod kan inkludera stegen av att: bereda en uppslamning av titandioxid; tillhandahalla uppslamningen av steg a) till en brannbar poros struktur, sasom en poros polymerstruktur, sasom en svampstruktur; tillata uppslamningen att stelna pa den brannbara porosa strukturen; 24 d) ta bort den brannbara porosa strukturen fran den stelnade titandioxiduppslamningen, van i steg d) kan utforas genom langsam sintring av den brannbara porosa strukturen med den stelnade metalloxiduppslamningen till omkring 500°C och bibehallande av denna temperatur i atminstone 30 minuter; snabb sintring till omkring minimum 1500 °C eller till omkring 1750 °C vid ca 3 K/min och bibehallande av denna temperatur i atminstone 10 timmar; och snabbt kyla till rumstemperatur atminstone 3 K/min. 10 Uppfinningen kommer vidare att beskrivas ii de foljande exemplen vilka inte begransar omfattningen av uppfinningen sasom beskriven i patentkraven.

EXPERIMENTALDEL Exempel 1: Beredning av alginathydrogel med och utan biologiskt aktiv substans Tabell 1. Aminosyrasekvens av syntetiska prolinrika peptider.

Peptid Sekvens (N-terminal till C-terminal) Polar AA Hydrofob AA P2 (SEQ ID NO 1) PLVPSQPLVPSQPLVPSQPQPPLPP 7 (S,Q) 18 (P,L,V) P5 (SEQ ID NO 2) PLVPSSPLVPCCPLVPCCPSPPLPP 3 (S) 22 (P,L,V,C) P6 (SEQ ID NO 3) PHQPMQPQPPVHPMQPLPPQPPLPP 7(H,Q) 18 (P,M,V,L) Aminosyra (AA); peptid 2 (P2); peptid 5 (P5); peptid 6 (P6); S = Ser; P = Pro; L = Leu; V = Val; Q = Gln; M = Met; H = His; C = Cys. 1.Material och metoder 1.1.Beredning av peptid och emaljmatrisderi vat 20 Emaljmatrisderivat (EMD) tillhandaholls vanligen av Straumann GmbH (Basel, Schweiz). EMD lostes till 10 mg/ml i 0,1 % attiksyra i fosfatbuffrad saltlosning (PBS) (FAA Laboratories GmbH, Pasching, Osterrike). Tre syntetiska peptider (Tabell 1) designades som beskrivet i detalj i tidigare studier (Rubert M et al., 2011).

Peptider inkoptes fr5n Eurogentec (Seraing, Belgien). De syntetiska peptiderna lostes upp till 5 eller 10 mg/ml (i fallet med peptid 2 FITC-markt) i 0,1 % attiksyra i PBS. Alikvoter for att undvika upprepade frys-tiningscykler bereddes och lagrades vid -°C till anvandning. 1.2.Beredning av alginathydrogeler Natriumalginat (Pronova UP LVG 0) - en lagviskos alginat dar minimum 60 % av monomererna är guluronat - inkoptes fran NovaMatrix (FMC BioPolymer AS, Norge). Natriumalginaten anvandes utan vidare rening. Tv5 procent (vikt/vol) natriumalginat bereddes i PBS och omrOrdes vid 180 vpm vid rumstemperatur Over natt for att fa en 10 homogen alginathydrogel. Alginatlosningen blandades med syntetiska peptider eller EMD vid en slutlig koncentration av 50 pg/ml. Losningen av alginat inneh5llande syntetiska peptider/EMD distribuerades sedan till 24-hals odlingsplattor och sprayades med 300 mM Ca0I2 genom anvandning av en aerograph paint atomizer (Precisso 0, Madrid, Spanien). Efter 1-2 timmars inkubering vid rumstemperatur var alginathydrogelen fullstandigt gelnad. 1.3. Karakterisering av morfologi av alginathydrogel genom skannande elektronmikroskopi Morfologi av 2 °A) kontrollalginathydrogeler och 2 % alginathydrogeler innehallande syntetisk peptid 2 (50 pg/ml) observerades genom att anvanda skannande 20 elektronmikroskop (SEM, Hitachi S-3400N, Hitachi High-Technologies Europe GmbH, Krefeld, Tyskland). Mikrostruktur av alginathydrogeler (ej lyofiliserade och lyofiliserade) observerades. For alginathydrogellyofilisering frystes prover vid -80 °C foljt av lyofilisering vid -°C. Prover frystes sedan i N2 f6r att till5ta ett exakt snitt till tvarsnitt genom att anvanda en vass skalpell. Strukturer av alginathydrogeler observerades vid x25 och x100 forstoring genom att anvanda 10 kV och 40 Pa. Environmental secondary electron detector (ESED) anvandes for bilder vid x25 f6rstoring och aterspridningselektrondetektor (back scatter electron detector (BSED)) anvandes for bilder x100 forstoring. Diametern av varje por mattes genom att anvanda mjukvaran fran SEM, Hitachi S-3400N. 1.4.Frisattningsprofil f6r peptid For att studera peptidfrisattningsprofilen, marktes P2 med FITC. Frisattningen av peptid inneh5lIen i den 2 %-iga alginathydrogelen (50 pg/ml) kvantifierades genom fluorescensspektroskopi. Forst tvattades alginathydrogelerna med odlingsmedium fOr att ta bort overskottet av Ca0I2. Sedan tillsattes 750 pl av cellodlingsmedia pa peptidladdad 26 alginathydrogel. Proverna inkuberades vid 37 00 och 5 % CO2 i 21 dagar och cellodlingsmedia byttes tva ganger i veckan. Vid forbestamda tidpunkter (24 tim, 4 d, 7 d, 11 d, 14 d, 18 d och 21 d) samlades supernatanter och analyserades genom fluorescensspektroskopi (A ex 490 nm och A em 525 nm) for att bestamma mangden av 5 peptid frisatt till medierna. Mangden av peptid frisatt under tvattsteget mattes ocksa. Experimentet utfOrdes tre ganger och vale prov analyserades i triplikat.

Relativa fluorescensenheter korrelerade med mangden frisatt peptid genom att anvanda en linjar standardkurva for vale tidpunkt. 1.5.Cellodling av MC3T3-E1 10 Musosteoblastcellinjen MC3T3-E1 (DSMZ, Braunschweig, Tyskland) bibeholls som tidigare beskrivet (Tiainen H et al., 2011). lnnan sadd tvattades 24-hals odlingsplattor innehallande tvarbundna alginathydrogeler med 750 pl av odlingsmedium for att ta bort overskott av CaCl2. Efter utvardering av effektiviteten av cellvidhaftning pa 2 % alginatgel genom att anvanda olika celldensiteter, saddes, for de slutliga experimenten, celler vid en 15 densitet av 100 000 celler/brunn. Media fornyades tva ganger per vecka. Odlingsmedia samlades 24 timmar efter sadd for att studera cellviabilitet. Celler skordades vid dagar 14 och 21 for att analysera genuttryck av cellvidhaftnings- och osteogenrelaterade markorer genom att anvanda realtids RT-PCR. Odlingar observerades rutinmassigt genom att anvanda ljusmikroskopi (Leica DMIRB, Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Tyskland). 1.6.Cellvidhaftning till 2 % alginatgel Vidhaftning av celler pa alginathydrogelen efter en och fern dagar efter sadd utvarderades for aft bestamma den basta densiteten for sadd for experimenten. Densiteter fran 30 x 4 till 200 x 4 celler/brunn testades. Celler som var vidhaftade pa alginathydrogelen lyserades med en frys-tiningsmetod i avjoniserat destillerat vatten. 25 Cellysat anvandes for bestamning av DNA-kvantitet genom att anvanda Hoechst 33 258 fluorescensanalys. Prover blandades med 20 pg/ml av Hoechst 33 258 fluorescensfarg (Sigma, St. Quentin Fallavier, Frankrike) i TNE-buffert och intensiteten av fluorescens mattes vid exciterings- och emissionsvaglangder av 356/465 nm genom att anvanda en multifunktions mikroplattlasare (Cary Eclipse fluorescens spektrofotometer, Agilent 30 Technologies, Santa Clara, USA). Relativa fluorescensenheter korrelerades med cellantal genom aft anvanda en linjar standardkurva.

MC3T3-E1-celler vidhaftade pa alginathydrogeler efter en och fern dagars odling visualiserades genom konfokalmikroskopi (Leica TCS SPE Microsystems Wetzlar GmbH, 27 Wetlzar, Tyskland). I korthet fixerades celler s5dda p5 alginathydrogeler med 4 °A formaldehyd i PBS vid 400 i 10 min. For fargning permeabiliserades celler i 0,2% triton och autofluorescens fran material blockerades med 3 % BSA in PBS. Cytoskelettet hos cellerna fargades genom att anvanda 5 pg/ml FITC phalloidin (Sigma, St. Quentin Fallavier, Frankrike) och karnan med DAPI (Sigma, Schnelldorf, Tyskland). Vidare observerades cellvidhaftningen och —fastandet av 100 x 3 celler initialt sadda p5 2 °A alginathydrogeler efter cellfixering med 4 % formaldehyd i PBS vid 4 °C i 10 min foljt av visualisering genom att anvanda SEM och ESED vid 10 kV, x200 och 40 Pa. 1.7.Cellviabilitet 10 LDH-aktiviteten som bestamdes i odlingsmedia efter 24 timmar togs som en indikator av membranlackage eller cellys. Aktiviteten av det cytosoliska enzymet uppskattades som tidigare beskrivet (Rupert M et al., 2011).

Tabell 2. Sekvens av osteoblastmarkorrelaterade gener.

Gen Primersekvens 18S S 5"- GTAACCCGTTGAACCCCATT -3" (SEQ ID NO 7) A 5"- CCATCCAATCGGTAGTAGCG -3" (SEQ ID NO 8) GAPDH S 5"- ACCCAGAAGACTGTG-GATGG -3" (SEQ ID NO 9) A 5"- CACATTGGGGGTAGGAACAC -3" (SEQ ID NO 10) Itga8 S 5"- TCGCCTGGGAGGAGGCGAAA -3" (SEQ ID NO 11) A 5"- TCTTAACCGCTGTGCTCCCCG -3" (SEQ ID NO 12) Itgb1 S 5" AGCAGGCGTGGTTGCTGGAA -3" (SEQ ID NO 13) A 5"- TTTCACCCGTGTCCCACTTGGC -3" (SEQ ID NO 14) Itgb3 S 5"- AGGGGAGATGTGTTCCGGCCA -3" (SEQ ID NO 15) A 5"- ACACACAGCTGCCGCACTCG -3" (SEQ ID NO 16) Fnl S 5"- GCTGCCAGGAGACAGCCGTG -3" (SEQ ID NO 17) A 5"- GTCTTGCCGCCCTTCGGTGG -3" (SEQ ID NO 18) 28 Bmp2 S 5"- GCTCCACAAACGAGAAAAG-C -3" (SEQ ID NO 19) A 5"- AGCAAGGGGAAAAG-GACACT -3" (SEQ ID NO 20) Coll-I S 5"- AGAGC-ATGACCGATGGATTC -3" (SEQ ID NO 21) A 5"- CCTTCTTGAGGTTGCCAGTC -3" (SEQ ID NO 22) Bsp S 5"- GAAAATGGAGACGGCGATAG -3" (SEQ ID NO 23) A 5"- A000GAGAGTGTGGAAAGTG-3" (SEQ ID NO 24) Alp S 5"- AACCCAGACACAAGCATT-CC -3" (SEQ ID NO 25) A 5"- GAGAGCGAAGGGTCAGTCAG -3" (SEQ ID NO 26) Oc S 5"- CCGGGAGCAGTGTGAGCTTA -3" (SEQ ID NO 27) A 5"- TAGATGCGTTTGTAGGCGGTC -3" (SEQ ID NO 28) Opn S 5"- TCTGCGGCAGGCATTCTCGG -3" (SEQ ID NO 29) A 5"- GTCACTTTCACCGGGAGGGAGGA -3" (SEQ ID NO 30) 1.8.Isolering av total-RNA och utttyck av osteoblastmarkorer genom realtids-RT-PCR Effekten av syntetiska peptider och EMD laddade in i alginathydrogelerna pa genuttryck studerades efter 14 och 21 dagars behandling pa preosteoblast MC3T3-E1-celler. 5 Total-RNA isolerades genom att anvanda Tripure0 (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) enligt tillverkarens protokoll. Total-RNA kvantifierades vid 260 nm genom att anvanda en Nanodrop spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA).

Samma mangd av RNA (350 ng) transkriberades omvant till cDNA genom att anvanda hogkapacitets-RNA-till-cDNA-kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), enligt protokollet 10 av leverantoren. Alikvoter av varje cDNA frystes (-20°C) tills PCR-reaktionerna utfordes.

Realtids-PCR utfordes i Lightcycler 4800 (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) genom att anvanda SYBR green detektion. Realtids-PCR utfordes ffir tva referensgener (18SrRNA och glyceraldehyde-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH)) och tio malgener (integrin alfa 8 (Itga8), integrin beta1 (Itgb1), integrin beta 3 (Itgb3), fibronektin 1 (Fn1), bone 29 morphogenic protein 2 (Bmp2), kollagen typ I (Coll-/), bone sialoprotein (Bsp), alkalint fosfatas (Alp), osteokalcin (Oc) och osteopontin (Opn)).

Primersekvenser anges i Tabell 2. Reaktionsforhallanden och relativ kvantifiering har ufforts som tidigare beskrivet (Tiainen H et al., 2011). 1.9.Statistiska analyser Alla data presenteras som medelvarden ± SEM. Skillnader mellan grupper bedomdes genom Mann-Whitney-test eller genom Studentens t-test beroende pa deras normaldistribution. Far att mata korrelationen mellan olika variabler anvandes Pearsonkorrelationsanalys. SPSSO -programmet for Windows (Chicago, IL) version 17.0 10 anvandes. Resultat ansags statistiskt signifikanta vid p-varden Resultat Alginatmikrostruktur Figur 1 visar mikrostrukturen av ett tvarsnitt fran en lyofiliserad 2 % alginathydrogel (Figurer 1 A) och 8)) och 2 % alginathydrogel innehallande syntetisk peptid (Figurer 1C) 15 och D)). Som ses i SEM-bilderna observerades en poros och sammankopplad struktur i alla analyserade geler aven om alginatgel innehallande syntetisk peptid visade en mer irreguljar struktur an 2 % alginathydrogel. Bada tvarbundna hydrogelerna presenterade en poros och sammanbunden struktur med en pordiameter av 42.9 ±3.5 pm och 44.7 ± 4.1 pm, for 2 % alginathydrogel utan respektive med syntetisk peptid.

Peptidtillforsel fran 2 % alginathydrogel Peptidfrisattningsprofil fran 2 % alginathydrogeler visas i Figur 2. En krevadfrisattning av peptid under de forsta 24 timmarna av inkubering observerades (54,67 %). Vidare, som ses i den kumulativa frisattningsprofilen, frisattes 25,8 % av peptid langsamt upp till 11 dagar, foljt av en fordrojd frisattning over tid upp till 21 dagar. Vid slutet av experimentet 25 (efter 21 dagar) hade 5,6 °A av den totala peptiden teoretiskt innehallen i alginathydrogelen inte frisatts. Det skall noteras att 12,7 `)/0 av den laddade peptiden frisattes under tvattsteget av alginathydrogelerna med odlingsmedia for att ta bort overskott av CaCl2.

Cellvidhaftning och —prolifere ring 30 En lag hastighet av cellvidhaftning pa alginathydrogelerna observerade eftersom mer an halften av de sadda cellerna inte vidhaftade till gelen en dag efter plattning. Trots detta faste celler till alginathydrogelen och prolifererade Over cellodlingen (Figur 3). Vidare visualiserades celler genom konfokalmikroskopi for att verifiera formagan av osteoblaster att fasta och sprida sig pa alginathydrogelytor. Konfokalbilder visar en okning i antalet av karnor affoljt av en okning i aktinfargning som stort antal av celler sadda och okande fran dag 1 till dag 5 (Figurer 3A)-H)). Vidare uppskattades cellfilopodia av osteoblaster odlade pa alginathydrogelen genom SEM (Figur 3J)). DNA-innehallet anvandes for att bestamma antalet av celler narvarande pa alginathydrogeler. Som ses i Figur 3!) sags okande procenthalt av cellproliferering nar antalet av initiala celler sadda pa gelen okade. Darfor, medan ingen proliferering fran dag 1 till 5 sags nar saddensiteten var 30 x 3 celleribrunn, sags en 122,9%, 98,1% och 91,8% okning for saddensiteter av 60 x 3, 100 10 x 3 respektive 200 x 3 celleribrunn. Bland de olika saddensiteterna som testades var 100 x 3 celleribrunn den som gemensamt uppvisade rimligt initialt cellfastande och en okning i cellproliferering och valdes darfor for vidare experiment.

Effekt av alginathydrogel laddad med syntetiska peptider pa cellviabilitet Inga toxiska effekter sags i celler odlade pa alginathydrogeler innehallande syntetiska peptid, vare sig efter 24 timmar (Figur 4) eller efter en lang tidsperiod (data visas ej). P2 okade signifikant cellviabilitet efter 24 timmar jamfort med EMD, medan P5 visade signifikant lagre toxiska effekter jamfort med EMD och obehandlad alginatgel.

Effekter av alginathydrogeler laddade med syntetiska peptid pa genutttyck av cellvidhaftningsmarkorer Uttryck av Itga8 var okat i celler behandlade med P5 jamfort med kontroll efter 21 dagars odling (Figur 5A)). m-RNA-nivaer av Itgbl minskade signifikant efter behandling med P2 och P6 i 14 dagar jamfort med kontroll. Efter 21 dagar, reducerade celler behandlade med P6 signifikant m-RNA-nivaer av Itgbl jamfort med EMD (Figur 5B)). Itgb3 och Fnl minskade signifikant efter 14 dagars behandling med P2 och P6 jamfort med kontroll (Figurer 5C) och D)) och inga skillnader observerades efter 21 dagar.

Effekt av alginathydrogel laddad med syntetiska peptid pa genutttyck av osteoblastmarkorer Relativa nivaer av Bmp2-mRNA okade signifikant efter 14 dagars behandling med P6 medan de minskade efter 21 dagars behandling med P2 jamfort med EMD. Aven om EMD-behandling inducerade en signifikant minskning av nivaer av bmp2-mRNA efter 14 dagars odling jamfort med kontroll, sags en okning av nivaer av bmp2-mRNA efter 21 dagar, Oven om skillnader inte nadde statistisk signifikans (Figur 6A)). 31 Co//-/-genuttryck minskade signifikant efter 14 dagars behandling med vilken som heist av de syntetiska peptiderna jamfort med kontroll (Figur 68)). lnga skillnader i niv5er av BspmRNA s5gs bland de olika behandlingarna (Figur 6C)). Niv5er av ALP-mRNA minskade signifikant efter behandling med P6 i 14 dagar och 21 dagar och med P2 efter 21 dagars behandling jamfOrt med kontroll (Figur 6D)). Efter 14 dagars cellodling detekterades okade nivaer av Oc-mRNA i celler odlade p5 2 % alginatgel och inneh5llande syntetiska peptider jamfort med celler behandlade med EMD. Efter 21 dagar hade celler behandlade med P5 eller P6 okade niv5er av Oc-mRNA jamfort med kontroll (Figur 6(E)). Uttryck av Opn minskade signifikant efter 14 dagars odling med P2 och P6 jamfort med kontroll. 10 Efter 21 dagar okade niv5er av Opn-mRNA signifikant med vilken som heist av de syntetiska peptiderna och EMD jamfort med kontroll. EMD-behandling okade markant uttrycksnivaer av mRNA av Opn jamfort med P2 och P6 (Figur 6F)).

Diskussion Polyprolinrika syntetiska peptider har tidigare visats inducera benbildning och mineralisering in vitro och minskad ben resorption in vivo. Syftet med denna studie var att utveckla en lamplig formulering med en hydrogel for lokal behandling med dessa syntetiska peptider for att gynna benbildning och mineralisering, antingen i sig sjalva eller som en bionedbrytbar belaggning for skelettimplantat.

I foreliggande studie, exponerades celler for alginatgel innehallande olika syntetiska 20 peptider och odlades under en lang tidsperiod for att utvardera effekten av dessa peptider p5 det biologiska svaret av osteoblaster. Den optimala formuleringen av hydrogelen m5ste till5ta bildningen av en kompakt struktur for en kontrollerad, lokal och specifik tillfOrsel av bioaktiv molekyl. S5dana egenskaper styrs av den fysikaliska egenskapen (t ex mekanik, nedbrytning, gelbildning), masstransportegenskapen (t ex diffusion) och kraven for biologisk interaktion (t ex cellvidhaftning och -signalering) for vane specifik tillampning.

Tidigare studier utforda genom att anvanda alginat gel (Protanal LF200M, FMC polymers, Oslo, Norge) vid olika polymerkoncentrationer (1 %, 2 %, 3 %, 6 % och 10 %) har visat en minskning i porstorlek nar polymerkoncentrationen okar, vilket resulterar i koncentrationen 30 av 2 % som den mest lovande formuleringen att verka som en peptidvehikel. Med detta i beaktande tvarbands 2 % alginathydrogel joniskt med 300 mM av CaCl2 och valdes som det valda materialet.

SEM-analys av mikrostrukturen av bade alginatgeler med och utan syntetiska peptider efter en process av lyofilisering visade en poros och sammanbunden struktur med en 32 pordiameter av 42-44 pm; likval observerades en kompakt struktur med en porstorlek av ungefar 1 pm i diameter efter SEM-analys av ej lyofiliserade geler (data visas ej). Diffusionshastighet av proteiner paverkas av molekylvikten och storleken av det som diffunderar (definierat genom Stokes radier) jamfort med dessa porer och beror av den kemiska naturen av proteinet (interaktioner molekyl-alginat, polarisering, d v s hydrofila droger kan diffundera mycket snabbt medan hydrofoba droger diffunderar langsamt genom gelporerna). Pa grund av faktumet att syntetiska peptider anvanda i foreliggande studier är sma peptider av 25 aminosyrors langd (molekylvikt i omradet av 2509,172782,34 Da) kan en latt diffusionshastighet genom gelen forvantas. Foljaktligen uppvisade 10 i foreliggande studie en peptid laddad i 2 °A alginathydrogeler en krevadlik frisattning under de fOrsta 24 timmarna av inkubering fOljt av progressiv och fordrojd frisattning under 21-dagarsperioden.

Effektiviteten av alginatgel for cellvidhaftning och —proliferering undersoktes ocksa eftersom alginat har beskrivits som ett inert substrat med otillracklig proteininteraktion for cellvidhaftning och det har foreslagits att mammalieceller inte kan interagera med omodifierade alginathydrogeler. I sjalva verket kopplar de fiesta studier med alginathydrogel ett helt ECM-protein eller en peptidsekvens kapabel att binda cellulara receptorer kovalent till polymeren for att fa en hogt specifik vidhaftande yta. Mycket riktigt har vissa studier rapporterat att modifiering av alginat med en RDG-innehallande peptid gynnade cellvidhaftning och —spridning medan minimal cellvidhaftning observerades pa omodifierade alginathydrogeler. EmeMedd visar foreliggande studie att omodifierad alginathydrogel (Pronova UP LVG ()) tillater cellvidhaftning och —spridning. Skillnaderna mellan de rapporterade studierna verkar vara pa grund av det beskrivna forhallandet mellan kompositionen och renheten av alginatgelerna som anvands och formagan hos celler att proliferera pa deras ytor. I foreliggande studie inneh011 den anvanda alginaten ett minimum av 60 % G-fraktioner, vilket darfor tillat cellfastande och —spridning. Den optimala saddensiteten for in vitro-studierna utvarderades genom DNA-kvantifiering. Resultaten visade att 100 x 3 celler/brunn var densiteten med hogre effektivitet i bade cellvidhaftning och cellproliferering och valdes darfor for vidare studier. Alginathydrogelen visade sig vara icke-toxisk for MC3T3-E1-cellerna, och uppvisande nagot slags skyddande effekt pa cellviabilitet jamfort med celler odlade pa vavnadsodlingsplast. Vidare bekraftades att de syntetiska peptidema som administrerades som en hydrogelformulering är icke-toxiska, i enlighet med resultaten erhallna i tidigare studier efter cellbehandling under lang och kort tid. 33 Stabil osteoblastcellvidhaftning astadkoms i stor grad av integriner, heteromera receptorer sammansatta av a och i3 -subenheter som dimeriserar i specifika kombinationer och interagerar med extracellular matrisproteiner. Det har visats att osteoblaster uttrycker olika integrinreceptorer beroende pa materialet dar de vaxes. Forutom deras roll vid cellvidhaftning reglerar integriner cytoskelettorganisation och medierar signaltransduktion och reglerar darfor uttrycket av gener som kontrollerar proliferering, differentiering och matrixremodellering.

For att undersoka om de syntetiska peptiderna kan paverka integrinuttryck och cellvidhaftning pa alginathydrogeler studerades mRNA-uttrycksnivaer av Itga8, Itgbl, Itgb3 och det cellulara matrisproteinet Fnl. Uttrycket av Itgbl, Itgb3 and Fnl var signifikant minskat efter 14 dagars behandling med syntetiska peptider, i synnerhet for P2 och P6. pi integrinsubenheten hittas i benreceptorer for kollagen, fibronektin och laminin och medierar vidhaftning av osteoblaster till ECM medan av/33-integrin skulle mediera vidhaftningen till Opn och vitronektin. Av intresse är upptackten att uttryck av av/33- integrin stimulerar cellproliferering och inhiberar matrismineralisering i osteoblastceller; och att FN — ett rikligt forekommande ECM-protein som binder till ett stort antal integriner, inkluderande /31- och /33-integrinsubenheter — ocksa uttrycks i h6g grad i de tidiga stadierna av osteogenes medan dess ackumulering i matrisen reduceras under cellmognad. Vidare okade behandling med de syntetiska peptider signifikant Itga8-uttryck efter 21 dagars behandling och markant nar celler behandlades med P5. Itga8 har visats interagera med osteopontin (Opn) ett protein som utsondras av osteoblaster involverade i cellvidhaftning och —proliferering, vars uttryck okar efter mineralisering har initierats. Har visade bilateral korrelationsanalys mRNA-uttrycksnivaerna av Itga8 och Opn en Pearson korrelation av 0,678 (p < 0,01). Dessa resultat kan indikera att celler behandlade med de syntetiska peptiderna är i ett senare stadium av cellmognad jamfort med kontrollgruppen och är i linje med uttrycksresultaten av de analyserade osteoblastmarkorerna. Det har beskrivits att den korta sekvensen av PPXPP i den C-terminala regionen av peptider deltar i transaktiveringsaktiviteten av transkriptionsfaktorer och/eller samaktivatorer. Verkningsmekanismen av de syntetiska peptiderna kan involvera interaktion med en 30 receptor som är kapabel att inverka pa intracellulara signaleringskaskader och att exposition av deras C-terminaler innehallande konserverad prolinrik region (PPLPP) kan vara av vikt i signalaktiviteten av de syntetiska peptiderna. De syntetiska peptiderna visar signatur av kompakta, valpackade strukturer som saknar element av sekundarstruktur, som forvantat pa grund av det rika innehallet av proliner och exponerar deras PPLPP- stracka pa ett satt som är lampligt for interaktioner. Medan peptid 2 och peptid 6 34 presenterar tva distinkta looper, har peptid 5 en skild topologi av loopar som gar en kontakt mellan C- och N-terminalerna mojlig. Faktumet att dessa strukturella skillnader i tillgangligheten av C-terminalen och den strukturella rigiditeten av denna korta konsensussekvens (PPXPP) mellan olika peptider skulle kunna paverka interaktionen 5 med en receptor kan forklara skillnaden i uttryck av vidhaftningsgener.

A ena sidan sags det aft osteokalcin, den mest specifika och senaste av uttryckta osteoblastmarkorer med en roll i mineralisering, var signifikant inducerad efter 14 och 21 dagars behandling med de formulerade syntetiska peptiderna jamfort med obehandlad och EMD-alginatgel, dvsi overensstammelse med resultaten erhallna nar administrerad i 10 odlingsmedia. Foljaktligen, var Opn, ett sialoprotein producerat vid olika stadier av differentiering med hoga nivaer uttrycka efter mineralisering har initierats, signifikant uppreglerat efter 21 dagars behandling med bade EMD och syntetiska peptider jamfort med kontroll. A andra sidan, observerades vid de studerade tidpunkterna inga skillnader i uttrycket av gener relaterade till osteogenes (Coll-I, Bmp-2, Bsp och Alp) eftersom dessa 15 gener är reglerade vid tidigare stadier an osteokalcin under osteoblastdifferentiering, i huvudsak under prolifererings- och matrismognadsfasen. Det är intressant att notera aft alla studierna som har utforts hittills med de syntetiska peptiderna upprepat har visat en okning i osteokalcin-mRNA-nivaer, bade in vitro och in vivo. Relevansen av denna mark& har demonstrerats i en ny in vivo-studie (Monjo M et al., 2012), dar den Pasta prediktiva 20 markoren for osseointegrering av Ti-implantat bland alla var osteokalcin. Det forslas att de syntetiska peptiderna forbattrar egenskaperna hos alginathydrogelen for cellvidhaftning och att cellerna odlade pa hydrogelen formulerade med syntetiska peptider var i ett mer moget stadium av differentieringsprocessen over cellerna odlade pa kontrollhydrogel och hydrogel formulerad med EMD. 25 Man kan anta att verkningsmekanismen av de syntetiska peptiderna kan involvera interaktion med en receptor som är kapabel av aft inverka pa cellulara signaleringskaskader under de initiala stadierna av celldifferentiering for att slutligen stimulera osteoblastdifferentiering och aft tillgangligheten och strukturella rigiditeten av denna korta konsensussekvens (PPXPP) kan vara av vikt i signaleringsaktiviteten av de 30 syntetiska peptiderna. Vidare fran de foreliggande resultaten antas det att peptiderna kunde binda till integrinerna som uttrycks pa cellyta, vilket forst kunde Oka osteoblastfastandet pa alginathydrogelytan och sekundart modulera uttrycket av gener relaterade med mogen osteoblastfenotyp.

Slutsats Slutligen demonstrerar resultaten aft 2% av alginathydrogel är en lamplig formulering for den lokala tillforseln av syntetiska polyprolinrika peptider, inducerande integrin alfa 8-, osteopontin- och osteokalcinuttryck i MC3T3-E1-celler. Dessa peptidmodifierade alginathydrogeler kan representera en ny generation av injicerbara barare med biologiskt aktiv substans for tillampningar i benvavnadsregenerering och är lovande for anvandning som bionedbrytbara belaggningar for skelettimplantat, sasom titandioxidscaffoldar.

Exempel 2: Framstallning av en alginatbelagd titandioxidscaffold MATERIAL OCH METHODER 2.1.Framstallning av syntetisk peptid 2 (P2).

Syntetisk prolin-rik peptid 2 (P2) (2HN- PLVPSQPLVPSQPLVPSQPQPPLPP-000H) (SEQ ID NO 1) inkoptes fran Eurogentech (Seraing, Belgien). Ett ror innehallande 7,2 mg av den valda syntetiska peptiden tillfordes i en frystorkad pelletform och lostes upp till 10 mg/ml i 0,1% attiksyra i fosfatbuffrad saltlosning (PBS) (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Osterrike).

Alikvoter bereddes far att undvika upprepade cykler av frysning-tining och lagrades vid - 20°C till anvandning. 2.2.Framstallning av 2 % alginat innehallande peptid 2.

Natriumalginat (Pronova UP LVGC,) — en lagviskos alginat dar minimum 60% av 20 monomerar är guluronat — inkoptes fran NovaMatrix (FMC BioPolymer AS, Norge).

Natriumalginaten anvandes utan vidare rening. Kvantitet (2 %, vikt/volym) av natriumalginat lostes upp i destillerat vatten genom omrorning i 3 timmar vid rumstemperatur for att fa en homogen alginatlosning. En fixerad koncentration (50 pg/ml) av P2 sattes till losningen och omrordes i 1 timme. 2.3.Tillverkning av Ti02_scaffoldar belagda med 2% alginat innehallande P2.

De porosa Ti02-scaffoldarna producerades genom polymersvampreplikering som tidigare beskrivet av (Tiainen H etal., 2010), med en storlek av 9 mm i diameter och 8 mm hojd. Sedan belades Ti02-scaffoldarna med eft lager av 2 % alginatgel med eller utan P2. I korthet nedsanktes T2-scaffoldarna i 2 % alginatlosning med eller utan P2 under skakning vid 100 vpm pa en orbitalskak (IKA Vibrax VXR basic, Staufen, Tyskland) i 1 timme vid rumstemperatur. Scaffoldar centrifugerades sedan vid 252xg i 1 min. Prover nedsanktes i 50 mM CaCl2 i 1 timme for att tillata gelning. Scaffoldar skoljdes sedan med 36 dH20 for att ta bort overskott av CaCl2. Slutligen fick prover torka over natten vid rumstemperatur. Scaffoldar belagda med ett lager av 2 % alginatgel (kontrollalginatscaffold) anvandes som kontrollgrupp medan obelagda Ti02-scaffoldar (utan alginat SC) ocksa anvandes som kontrollgrupp. 2.4.Frisattningsprofil fOr peptid 2 frail Ti02-scaffoldar belagda med 2% alginatgel.

Ti02-scaffolds belagda med 2 % alginat innehallande peptid 2 (P2-alginatbelagd scaffold) placerades i 48-halsplattor (Nunc GmBh & Co. Kg, Langenselbold, Tyskland) innehallande 1 ml destillerat vatten (pH 7,4). For att efterlikna cellodlingsforhallanden skakades prover pa en orbitalskak vid 200 vpm (IKA® Schuttler MIS 2, Tyskland) i 6 10 timmar vid 37 °C och under fuktiga forhallanden (genom att anvanda en behallare med destillerat vatten). Sedan bibeholls prover vid 37 °C i en fuktsatt atmosfar i upp till 21 dagar. Vid forbestamda tidpunkter (2 d, 5 d, 7 d, 9 d, 12 d, 14 d, 16 d, 19 d och 21 d), samlades destillerat vatten upp och farskt destillerat vatten sattes till vane brunn. Provabsorbanser analyserades genom UV-Vis-spektrofotometer (PerkinElmer() Lambda 15 25 UV/Vis Systems, USA) vid en vaglangd av 206 nm for att bestamma mangden av frisatt peptid. ParallelIt anvandes Ti02-scaffoldar med ett lager av 2 % alginatgel som kontroll for att dra bort absorbansvarden erhallna fran degraderingsprodukter fran alginat.

Relativa absorbansenheter korrelerades med mangden av frisatt peptid genom att anvanda en linjar standardkurva for varje tidpunkt och den kumulativa P2-frisattningen 20 beraknades sedan. Experimentet utfordes i triplikat. 2.5.Cellodling av MC3T3-E1 pa belagda och obelagda Ti02-scaffoldar.

Ti02-scaffoldar (SC) obelagda och belagda med 2% alginat med eller utan peptid (P2 och kontroll (-)) placerades i 48-halsplattor (Nunc GmbH & CO. KG, Langenselbold, Tyskland) under sterila forhallanden. Celler saddes vid en densitet av 200 000 celler/scaffold och bibeholls i a-MEM (PAA Laboratories, Pasching, Osterrike) kompletterat med 10% FBS (PAA Laboratories, Pasching, Osterrike) och 100 E penicillin/ml och 100 pg streptomycin/ml antibiotika (PAA Laboratories, Pasching, Osterrike). For att garantera en homogen celldistribution inuti scaffolden anvandes en skaksaddmetod (Takahashi Y et al., 2003). 1 korthet, efter tillsats av 1 ml av cellsuspension till scaffoldarna, skakades 30 plattor pa en orbitalskak (Unitron, Infors HT, Basel, Schweiz) i 6 timmar vid 180 vpm vid 37°C och under fuktiga forhallanden. Sedan bibeholls celler vid 37 °C i en fuktsatt atmosfar av 5 % CO2 i upp till 21 dagar. Odlingsmedia (1m1) battrades pa varannan dag. 37 Odlingsmedia samlades upp efter 48 timmars behandling fOr att testa cytotoxicitet (LDHaktivitet).

For att uppskatta formagan av cellproliferering in i detta 3D-system studerades antalet celler efter 7 dagar ocksa genom DNA-kvantifiering genom att anvanda Hoechst-5 infargning. ParallelIt visualiserades cellfastning av MC3T3-E1 i scaffolden ocksa genom SEM efter 7 och 21 dagars odling.

Uttryck av markorer relaterade till osteoblastcellmognad och —differentiering efter 7 och 21 dagars cellodling uppskattades genom realtids RT-PCR. 2.6.SEM-visualisering av 2% alginatbelagda 7702-scaffoldar. 10 Morfologi av alginatbelagda Ti02-scaffoldar observerades genom att anvanda ett skannande elektronmikroskop (SEM, Hitachi S-3400N, Hitachi High-Technologies Europe GmbH, Krefeld, Tyskland). SEM anvandes vidare for att visualisera cellvidhaftning i Ti02- scaffoldstrukturen efter 7 och 21 dagars odling. I korthet tvattades cellerna tva ganger med PBS och fixerades med glutaraldehyd 4% i PBS i 2 timmar. Sedan togs 15 fixeringsvatskan bort och cellerna tvattades tva ganger med destillerat vatten. Vid 30 minuters intervall dehydrerades cellerna genom tillsatsen av 50%, 70%, 90% och 100% etanollOsningar. Etanol togs bort och cellerna lamnades vid rumstemperatur for att evaporera den kvarstaende etanolen. Scaffoldar observerades vid 10 kV och 40 Pa genom att anvanda aterspridnings- och sekundara elektrondetektorer. Bilder som 20 presenteras är fran en representativ area. 2.7.Cellviabilitet.

Laktatdehydrogenas (LDH)-aktivitet som bestamdes i odlingsmedia efter 48 timmar togs som en indikator pa celloverlevnad. Aktiviteten av cytosolenzymet bestamdes genom att folja tillverkarens kitinstruktioner (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). 25 Resultat presenterades relativt LDH-aktiviteten i mediumet fran celler odlade i obelagda scaffoldar, vilket sattes till 100%. 2.8.Bestamning av cellantal.

Celler som vaxer pa 3D-scaffoldarna lyserades genom en frysning-tiningsmetod i avjoniserat destillat vatten. Cellysat anvandes for bestamning av DNA-kvantitet genom att 30 anvanda Hoechst 33258 fluorescensanalys. Prover blandades med 20 pg/ml av Hoechst 33258 fluorescensfarg (Sigma, St. Quentin Fallavier, Frankrike) i TNE-buffert och intensiteten av fluorescensen mattes vid excitations- och emissionvaglangder av 356/46 38 nm genom att anvanda en multifunktionsmikroplattlasare (Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer, Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Relativa fluorescensenheter korrelerades med cellantal genom att anvanda en linjar standardkurva. 2.9.RNA-isolering och realtids RT-PCR-analys.

Totalt RNA isolerades genom att anvanda Tripure® (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland), enligt tillverkarens protokoll. Totalt RNA kvantifierades vid 260 nm genom att anvanda en Nanodrop-spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA). Samma mangd av totalt RNA (850 ng) transkriberades omvant till cDNA vid 42 °C i 60 min 10 genom att anvanda High Capacity RNA-to-cDNA kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), enligt protokollet av leverantoren. Alikvoter av vane cDNA frystes (-20 °C) tills PCRreaktionerna utfordes.

Realtids-PCR utfordes i Lightcycler 480® (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) genom att anvanda SYBR green detektion. Realtids-PCR utfordes for tva referensgener (18SrRNA och glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (Gapdh)) och 12 malgener (integrin alpha8 (Itga8), integrin beta1 (Itgb1), integrin beta3 (Itgb3), fibronektin 1 (Fn1), osterix (Osx), bone morphogenetic protein 2 (Bmp2), kollagen-I (Coll-/), interleukin-6 (II-6), bone sialoprotein (Bsp), alkalint fosfatas (Alp), osteokalcin (Oc) och osteopontin (Opn)).

Primersekvenserna anges i detalj i tabell 3 Tabell 3. Primersekvenser av osteoblastmarkorrelaterade gener anvanda i realtids-PCR.

Gen Primersekvens 18S S 5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3' (SEQ ID NO 7) A 5'- CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3' (SEQ ID NO 8) Gapdh S 5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3' (SEQ ID NO 9) A 5'-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3' (SEQ ID NO 10) Itgb1 S 5'- AGCAGGCGTGGTTGCTGGAA -3' (SEQ ID NO 13) A 5'- TTTCACCCGTGTCCCACTTGGC -3' (SEQ ID NO 14) Itgb3 S 5'- AGGGGAGATGTGTTCCGGCCA -3' (SEQ ID NO 15) 39 A 5'- ACACACAGCTGCCGCACTCG -3' (SEQ ID NO 16) Fnl 55'- GCTGCCAGGAGACAGCCGTG -3' (SEQ ID NO 17) A 5'- GTCTTGCCGCCCTTCGGTGG -3' (SEQ ID NO 18) Itga8 S 5'- TCGCCTGGGAGGAGGCGAAA -3' (SEQ ID NO 11) A 5'- TCTTAACCGCTGTGCTCCCCG -3' (SEQ ID NO 12) Osx S5' - ACTGGCTAGGTGGTGGTCAG- 3' (SEQ ID NO 31) A 5' - GGTAGGGAGCTGGGTTAAGG- 3' (SEQ ID NO 32) Bmp2 S 5'- GCTCCACAAACGAGAAAAG-C-3' (SEQ ID NO 33) A 5'- AGCAAGGGGAAAAGGACACT-3' (SEQ ID NO 34) Co//-/ S 5'- AGAGC-ATGACCGATGGATTC -3' (SEQ ID NO 21) A 5'- CCTTCTTGAGGTTGCCAGTC -3' (SEQ ID NO 22) 11-6 S 5'- ACTTCCATCCAGTTGCCTTC- 3' (SEQ ID NO 35) A 5' -TTTCCACGATTTCCCAGAGA- 3' (SEQ ID NO 36) Bsp S 5'-GAAAATGGAGACGGCGATAG-3' (SEQ ID NO 23) A 5'-A000GAGAGTGTGGAAAGTG-3' (SEQ ID NO 24) Alp S 5'-AACCCAGACACAAGCATTCC-3' (SEQ ID NO 25) A 5'- GAGAGCGAAGGGTCAGTCAG-3' (SEQ ID NO 26) Oc S 5'- CCGGGAGCAGTGTGAGCTTA-3' (SEQ ID NO 27) A 5'-TAGATGC-GTTTGTAGGCGGTC -3' (SEQ ID NO 28) Opn S 5'-TCTGCGGCAGGCATTCTCGG-3' (SEQ ID NO 29) A 5'-GTCACTTICACCGGGAGGGAGGA-3' (SEQ ID NO 30) Varje reaktion innehall 7 pl Lightcycler-FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (innehallande Fast Start Taq polymeras, reaktionsbuffert, dNTPs mix, SYBRGreen I dye och MgC12), 0,5 pM av vardera och de antisensspecifika primrarna och 3 pl av cDNAspadningen i en slutlig volym av 10 pl. Amplifieringsprogrammet bestod av ett forinkuberingssteg for denaturering av templat cDNA (10 min 95 °C), foljt av 45 cykler bestaende av ett denatureringssteg (10s 9°C), ett hybridiseringssteg (8-10 s 60 °C, forutom for Osx som var 5 s 68 °C och Alp som var 8s 6°C) och eft forlangningssteg (10 s 72 °C).

Efter vale cykel mattes fluorescens vid 72 °C (Aex 470 nm, Aem 530 nm). En negativ kontroll utan cDNA-templat kordes i vale analys.

Realtidseffektiviteter beraknades fran de givna lutningarna i mjukvaran for LightCycler 480 10 genom att anvanda seriespadningar, visande alla de undersokta transkriptens hoga realtids-PCR-effektivitetshastigheter och hog linearitet nar olika koncentrationer anvands. PCR-produkter utsattes for en smaltkurveanalys pa LightCycler och efterfoljande 2 % agaros/TAE-gelelektrofores for att bekrafta amplifieringsspecificitet, Tm respektive amplikonstorlek.

Relativ kvantifiering efter FOR beraknades genom att dela koncentrationen av malgenen i vale prov med medelvardet av koncentrationen av de tva referensgenerna i samma prov genom att anvanda Advanced relative quantification-metoden tillhandahallen av analysmjukvaruversion 1.5 kir LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). 2.10. Statistik 20 Alla data presenteras som medelvarden ± SEM. Ett Kolmogorov-Smirnov-test utfordes for att anta parametriska eller icke parametriska distributioner for normalitetstesterna, skillnader mellan grupperna uppskattades genom Mann-Whitney-test eller genom Studenten t-test beroende pa deras normalfordelning. SPSSO program for Windows (Chicago, IL, US), version 17.0 anvandes. Resultat avsags statistiskt signifikanta vid p- varden 0.05.

RES U LTAT Peptidfrisattning Peptidfrisattningsprofil fran P2-alginatbelagda scaffoldar visas iFigur 7. En krevadfrisattning av peptiden under de forsta 2 dagarna av inkubering observerades (42,8 °A av den kumulativa mangden av P2 frisatt efter 21 dagar). Efter 5 dagar minskade mangden frisatt peptid till en 9,4 % (av den kumulativa mangden frisatt upp till 21 dagar) foljt av en langsammare men fordrojd frisattning over tid upp till 21 dagars inkubering. 41 Vidare foreslar den kumulativa frisattningen att det efter 21 dagars inkubering fortfarande finns P2 fangad i den 2 %-iga alginatgelen.

LDH-aktivitet.

Som visat i Figur 8, observerades inga toxiska effekter for nagon av experimentgrupperna 5 som studerades. Liknande procenthalt av cellviabilitet bestamdes i alla de testade grupperna, vilket indikerade att antingen kontrollalginatscaffoldar (-) och P2alginatbelagda scaffoldar (P2) inte visade nagra toxiska effekter pa celler efter 48 timmars cellodling.

SEM-visualisering av Ti02-scaffoldar belagda med 2 % alginatgel. 10 Alginatbelagda Ti02-scaffoldar observerades med SEM. Som visat i Figurer 9A och 9B, var vissa av porerna av Ti02-scaffoldarna blockerade efter belaggningsprocessen med alginat aven om nastan alla porer var oblockerade efter cellsadd och 7 dagars inkubering under standardcellodlingsforhallanden (Figurer 90 och 9D). Darfor sags viss nedbrytning av den blockerande alginatgelen i de parer som fOrbley blockerade direkt efter 15 belaggningsprocessen.

Aven om mangden av celler som vaxer pa obelagda Ti02-scaffoldar (SC) var hogre (Figur 10A och 10B) an pa alginatbelagda Ti02-scaffoldar (Figur 10C-10F) var celler formogna att penetrera och vidhafta in i de belagda scaffoldarna med 2 % alginatgel antingen med eller utan P2. 20 En okning fran dag 7 till dag 21 i antalet celler som vaxer pa scaffoldarna sags for alla experimentgrupper.

Cellantal.

DNA-kvantifiering anvandes for att bestamma antalet celler som vaxer pa Ti02scaffoldarna efter 7 dagars odling (Figur 11). I enlighet med SEM-bilder, var antalet celler 25 efter 7 dagars odling signifikant lagre i alla av de alginatbelagda Ti02-scaffoldarna jamfort med Ti02-scaffoldar (SC). Darfor sags, jamfort med SC, en 61 % och en 49 % reducering i cellantal pa alginatbelagda scaffoldar utan respektive med P2. Aven om data inte nadde statistisk signifikans, visade scaffoldar belagda med P2 32 % fler celler an de alginatbelagda kontrollscaffoldama (-).

Genuttryck av markorer relaterade till cellvidhaftning.

Som visat i Figur 12, var relativa mRNA-nivaer av Itbl signifikant minskade i celler som vaxer pa alginatbelagda scaffoldar (antingen med eller utan P2) jamfort med h02- 42 scaffoldar (SC) efter 7 dagars odling. Trots det observerades inga skillnader mellan grupper efter 21 dagars odling. Efter 21 dagar var /tgb3-mRNA-nivaer okade i celler som vaxer pa alginatbelagda scaffoldar (antingen med eller utan P2) jamfort med Ti02scaffoldar (SC). Hogre mRNA-nivaer av Fnl fanns i celler som vaxer pa 2 % alginatbelagda scaffoldar efter 21 dagar och i celler som vaxer pa P2-alginatbelagda scaffoldar jamfort med obelagda scaffoldar, aven om data fOr den sista gruppen inte n5dde statistisk signifikans. itga8-mRNA var signifikant 6kad i celler som vaxer p5 P2alginatbelagda scaffoldar jamfort med kontrollalginatscaffoldar efter 21 dagars odling.

Genutttyck av flera osteoblastdifferentieringsmarkorer. 10 Figur 13 visar relativa mRNA-niv5er for flera osteoblastdifferentieringsmarkorgener. Efter 21 dagars odling var osterix-mRNA-nivaer okade i celler som \taxer pa alginatbelagda scaffoldar (antingen med eller utan P2) jamfort med obelagda scaffoldar. mRNA-niv5er av Bmp-2 och /1-6 var signifikant okade i celler odlade p5 P2-alginatbelagda scaffoldar jamfOrt med bade obelagda scaffoldar och alginatbelagda scaffoldar efter 21 dagars cellodling. mRNA-niv5er av Coil-I, en mark& relaterad till cellproliferering var signifikant 6kade i celler odlade p5 P2-alginatbelagda scaffoldar jamfort med alginatbelagda scaffoldar efter 7 dagars cellodling. Efter 21 dagars odling var Coll-/ signifikant 6kad i bade alginatbelagda scaffoldar och P2-alginatbelagda scaffoldar jamfort med obelagda scaffoldar. Inga signifikanta skillnader observerades i mRNA-uttrycksnivaer av Opn, Bsp, Alp och Oc mellan experimentgrupper vid nagon av de studerade tidpunkterna.

DISKUSSION I foreliggande experiment demonstrerades lampligheten av en titandioxidscaffold belagd med en alginatbelaggning, med och utan en biologiskt aktiv substans fOr anvandning i barande benvavnadsapplikationer fOr att gynna benbildning och mineralisering. Ti02- scaffoldar har rapporterat ha styrkor upp till 2,6 MPa i kompressionsstyrka (Tiainen H et al. 2010) och visade utmarkt mekaniskt motst5nd i en in vivo-studie i gris.

Vid benvavnadsregenerering m5ste strukturen av scaffolden tillhandahalla en optimal mikromiljo fOr osteogenes. Scaffoldporositeten, sammankopplingen av pornatverket, forhallandet ytaarea-till-volym och de fysikokemiska egenskaperna av ytan bestammer cellmigrering och -differentiering, beninvaxt, vaskularisering och massoverforing mellan cellerna och miljon. Anvandningen av hogt porosa Ti02-scaffoldar genom att anvanda en skakmetod for cells5dd har visats tillhandahalla en god fastning och distribution av preosteoblastiska celler fr5n mus. I foreliggande studie uppvisade Ti02-scaffoldar belagda 43 med ett lager av 2 % alginat en mikrostruktur som är lamplig for deras anvandning som scaffold for tredimensionell cellvaxt.

Aven am fâ porer forblev blockerade direkt efter belaggningsprocessen var nastan alla porer oblockerade efter 7 dagars inkubering vid 37 °C pa grund av bionedbrytbarhetsegenskaperna av alginat, vilket darmed tillhandah011 oppnande fonster for celler att penetrera och migrera in i strukturen. lnga skillnader i cellviabilitet observerades mellan belagda och obelagda Ti02-scaffoldar. En krevadlik frisattning av P2 under de forsta timmarnas inkubering sags foljt av progressiv och fordrojd frisattning under 21-dagarsperioden, vilket foljde samma monster som i alginathydrogelerna pa egen 10 hand.

Ti02-scaffoldar tillhandaholl en lamplig yta for osteoblaster att vidhafta till, migrera och proliferera. Aven am mangden av celler pa alginatbelagda Ti02-scaffoldar var lagre an i obelagda Ti02-scaffoldar, stodde scaffoldar belagda med alginat cellprogression och —differentiering. Dessa resultat är i enlighet med foregaende studier som rapporterar att alginaten är ett inert substrat for cellfastande och att syntetiska peptider rika pa prolinsekvenser okar egenskaperna for cellfastande av alginathydrogelen. Darfor visade, aven am ej signifikant, Ti02-scaffoldar belagda med 2 % alginat innehallande syntetisk peptid 2 en trend i att fOrbattra cellfastande (+32 %) efter 7 dagar jamfort med alginatbelagda Ti02-scaffoldar. 20 Det har rapporterats att biomaterialkomposition reglerar cellfastande och organisation av cytoskelett med langtidseffekter pa cellmognad och mineralisering av osteoblaster. I enlighet med effektiviteten i cellfastande observerad genom SEM och DNA-kvantifiering pa de olika grupperna var mRNA-nivaer av Itgbl minskade i celler som vaxer pa alginatbelagda Ti02-scaffoldar jamfOrt med de som \taxer pa obelagda scaffoldar. Vidare var mRNA-nivaer av Itgb3 och Fnl (vilka uttrycks i hog grad vid tidiga steg av osteogenes och reduceras under den cellulara mognadsprocessen) signifikant okade i celler som vaxer in i de alginatbelagda Ti02-scaffoldarna jamfort med de obelagda scaffoldama efter 21 dagars odling. Vidare inducerades uttryck av Itga8, en integrin som spelar en roll under mineralieringssteget genom bindningen till osteopontin, genom P2-alginatbelagda 30 scaffoldar jamfort med alginatbelagda scaffoldar, vilket foreslar att P2 kan inverka pa mineraliseringsprocesser. Integriner är inte bara involverade i fastandet av celler till materialytan men medierar ocksa signaltransduktionsvagar som inducerar benbildning och mineralisering. lntressant nog var uttrycket av gener sasom Itgb3, Fnl, Coll-/ och Osx, som är relaterade till tidiga steg av osteoblastdifferentiering och vilka normalt 44 uppregleras under kort period och darefter nedregleras, okade under den senare studerade tidpunkten (21 dagar) i celler som vaxte in i alginatbelagda Ti02-scaffoldar jamfort med celler som vaxer pa obelagda scaffoldar. Det är mojligt att tidvis sekvens av tidiga markorer relaterade till osteoblast differentiering varierar nar MC3T3-E1-celler vaxer 5 pa obelagda scaffoldar eller pa alginabelagda scaffoldar, sa aft celler som vaxer pa alginatbelagda ytor visade en fOrbattrad celldifferentiering over proliferering jamfort med obelagda Ti02-scaffoldar formodligen pa grund av de initiala svarigheterna av cellvidhaftning pa alginaten. Aven om alginatbelaggning verkar forsamra cellvidhaftning och —proliferering pa scaffoldarna, bekraftades forvarvande av en mogen och organiserad 10 matris (ECM) kompetent f6r mineralisering genom en markerad okning i mRNA-nivaer av Alp och Bsp fran dag 7 till 21 dagar f6r alla grupperna. Nar syntesen, organisationen och mognaden av ECM är klar, uppregleras Oc-uttryck vilket leder till mineralisering. Resultaten visade en liten 6kning i mRNA-nivaer av Oc efter 21 dagars odling, darfor kan man sluta sig till aft celler var precis vid borjan av mineraliseringsprocessen. I enlighet med vara resultat med genuttrycksnivaer av Opn och Bsp kunde vidare den 6kade relationen Bsp/Opn-mRNA i osteoblastceller vara indikativ for stimuleringen av ECMmineralisering som tidigare rapporterat med MC3T3-E1-celler sadda pa obelagda h02scaffoldar.

Dessutom forbattrade tillsatsen av P2 till alginat egenskaperna f6r cellproliferering och — 20 differentiering jamfort med alginatbelagda scaffoldar som det kan forstas genom mangden av celler matta genom DNA-innehall och de hogre uttrycksnivaerna av Bmp2, Coll-I och 11-6. Hittills har de syntetiska peptiderna som är rika pa polyprolinsekvenser upprepat visat en okning i mRNA-nivaer av osteokalcin, bade in vitro- och i in vivo-studier dar titanimplantat belades med peptiden och vidare laddades in i en alginathydrogel for deras anvandning som en barare for lokal tillforsel. Darfor tillater detta sammantaget oss aft foresla aft P2-alginatbelagda scaffoldar skulle gynna hogre celldifferentiering och mineralisering i en in vivo-miljo.

SLUTSATS Slutligen demonstrerar resultaten aft alginatbelagda Ti02-scaffoldar kan agera som en matris for tillforsel av biologiskt aktiva substanser, sasom en syntetisk peptid rik pa prolinsekvenser som inducerar osteoblastcelldifferentiering. Kombinationen av de fysikaliska och osteokonduktiva egenskaperna av Ti02-scaffoldar med osteogena effekter av en biologiskt aktiv substans, sasom en syntetisk prolinrik peptider, pa benbildning och mineralisering kan representera en ny strategi for benvavnadsregenerering i barande tillampningar.

Exempel 3: Tillverkning av Ti02-scaffoldar belagda med kitosangel innehallande P2 De porosa Ti02-scaffoldarna kommer att prod uceras genom polymersvampreplikering 5 som tidigare beskrivet av Tiainen H etal., 2010, med en storlek av 9 mm i diameter och 8 mm hoga. Sedan kommer scaffoldarna att belaggas med ett lager av 2 °A kitosan vid pH 5,5 med eller utan P2 (SEQ ID NO 1). Kitosan är det deacetylerade derivatet av kitin, en naturlig komponent av rak- och krabbskal. Den är en biokompatibel, pH-beroende kajonpolymer, vilken är loslig i vatten upp till pH 6,2. I korthet kommer Ti02-scaffoldar 10 sankas ner i losning med eller utan P2 under skakning vid 100 vpm i en orbitalskak (IKA Vibrax VXR basic, Staufen, Tyskland) i en timme vid rumstemperatur. Scaffoldar kommer sedan att centrifugeras vid 252 x g i 1 min. Prover kommer att sankas ner i en vattenhaltig losning med pH 8,0 for att tillata gelning. Basgoring av vattenbaserade losningar med kitosan ovan detta pH leder till bildningen av ett hydrerat gelliknande precipitat.

Fasseparering foljer av neutraliseringen av amingrupper i kitosan och den efterfoljande elimineringen av repulsiva elektrostatiska krafter mellan kedjor, vilket darefter tillater omfattande vatebindning och hydrofoba interaktioner mellan kedjor. Scaffoldar kommer sedan att tvattas med dH20 for att ta boil overskott. Slutligen lamnades prover att torka Over natten vid rumstemperatur.

Exempel 4: Tillverkning av Ti02.scaffoldar belagda med pluronicgel innehallande P2.

De porosa Ti02-scaffoldarna kommer att prod uceras genom polymersvampreplikering som tidigare beskrivet av Tiainen H etal., 2010, med en storlek av 9 mm i diameter och 8 mm hoga. Sedan kommer scaffoldarna att belaggas med ett lager av 20 `)/0 Poloxamer 407 (Pluronic0 F127) med eller utan P2 (SEQ ID NO 1). Ti02-scaffoldar kommer att sankas ner i en losning med eller utan P2 (SEQ ID NO 1) under skakning vid 100 vpm pa en orbitalskak (IKA Vibrax VXR basic, Staufen, Tyskland) i 1 timme vid °C. Scaffoldar kommer sedan att centrifugeras vid 252 x g i 1 min vid °C. Prover kommer sedan att placeras vid 37 °C for att tillata gelning.

Exempel 5: Tillverkning av Ti02-scaffoldar belagda med poly(akrylsyra) (PAA)-gel innehallande P2.

De porosa Ti02-scaffoldarna kommer att prod uceras genom polymersvampreplikering som tidigare beskrivet av Tiainen H etal., 2010, med en storlek av 9 mm i diameter och 8 46 mm hoga. Sedan kommer scaffoldarna att belaggas med ett lager av 3 % poly(akrylsyra) (PAA)med hog molekylvikt med eller utan P2 (SEQ ID NO1). PAA är en bioadhesiv polymer. Ti02-scaffoldar kommer att sankas ner i PAA-losningen med eller utan P2 (SEQ ID NO1) under skakning vid 100 vpm p5 en orbitalskak (IKA Vibrax VXR basic, Staufen, Tyskland)i 1 timme vid 4 °C. Scaffoldar kommer sedan att centrifugeras vid 252 x g i 1 min vid 4 °C. Prover kommer sedan att placeras vid 37 °C for att tillata gelning.

Exempel 6: Tillverkning av Ti02-scaffoldar belagda med metylcellulosa- och hydroximetylcellulosa (HPMC)-hydrogel innehallande P2.

De porosa T102-scaffoldarna producerades genom polymersvampreplikering som tidigare 10 beskrivet av Tiainen H et al., 2010, med en storlek av 9 mm i diameter och 8 mm hoga. Sedan kommer scaffoldarna att belaggas med ett lager av 8 % metylcellulosa och hydroximetylcellulosa (HPMC) och 1 vikt% NaCI med eller utan P2 (SEQ ID NO1) under skakning vid 100 vpm p5 en orbitalskak (IKA Vibrax VXR basic, Staufen, Tyskland) i 1 timme vid 10 °C. Scaffoldar kommer sedan att centrifugeras vid 252 x g 11 min vid 10 °C. 15 Prover kommer sedan att placeras vid 37 °C for att tillata gelning.

Exempel 7: Tillverkning av Ti02-scaffoldar belagda med poly(akrylsyra) (PAA)-gpoloxamergel innehallande P2.

De porosa Ti02-scaffoldarna kommer att prod uceras genom polymersvampreplikering som tidigare beskrivet av Tiainen H etal., 2010, med en storlek av 9 mm i diameter och 8 20 mm hoga. Sedan kommer scaffoldarna att belaggas med ett lager av 2,5 % PAA-gpoloxamerympsampolymerer med eller utan P2 (SEQ ID NO1). Ti02-scaffoldar kommer att sankas ner i losning med eller utan P2 (SEQ ID NO1) under skakning vid 100 vpm p5 en orbitalskak (IKA Vibrax VXR basic, Staufen, Tyskland) i 1 timme vid 3 °C vid pH 7,4. Scaffoldar kommer sedan att centrifugeras vid 252 x g i 1 min vid 3 °C. Prover kommer 25 sedan att placeras vid 37 °C for att tillata gelning.

Exempel 8: Tillverkning av Ti02-scaffoldar belagda med PEO och P(E0-co-P0)-gel innehAllande P2.

De porosa Ti02-scaffoldarna kommer att produceras genom polymersvampreplikering som tidigare beskrivet av Tiainen H etal., 2010, med en storlek av 9 mm i diameter och 8 30 mm hoga. Sedan kommer scaffoldar att belaggas med ett lager av vattenhaltig losning av PEO (5 ml, 5 °A vikt/vol) eller P(E0-co-P0) inneh5llande fotoinitiator 4- bensoylbensyl)trimetylammoniumklorid (BBTMAC) (5 % av polymermassan halides i ett Ti02-scaffold med eller utan P2 (SEQ ID NO 1). Ti02-scaffoldar kommer sedan att sankas 47 ner i en losning med eller utan P2 (SEQ ID NO 1) under skakning vid 100 vpm p5 en orbitalskak (IKA Vibrax VXR basic, Staufen, Tyskland) i 0,5 timmar vid rumstemperatur. Scaffoldar kommer sedan aft centrifugeras vid 252 x g i 1 min vid rumstemperatur. Prover kommer sedan att UV-belysas i en Dimax ljushardningssystem, modell 5000 Flood, i 2 minuter for att till5ta gelning vid 200-4000 nm.

Det ska forstas att medan uppfinningen har beskrivit i samband med den detaljerade beskrivningen darav är den foregaende beskrivningen avsedd att illustrera och inte begransa omfattningen av uppfinningen, vilken definieras av omfattningen av de bilagda patentkraven. Andra aspekter, fordelar och modifieringar är inom omfattningen av de 10 fOljande patentkraven.

Om inte uttryckligen motstridigt beskrivet kan vardera av de foredragna sardragen beskrivna hari anvandas i kombination med vilket som heist och alla andra hari beskrivna foredragna sardrag. 48 REFERENSER Tiainen H, Lyngstadaas SP, Ellingsen JE, Haugen HJ. Ultra-porous titanium oxide scaffold with high compressive strength. J Mater Sci Mater Med 2010;21:2783-92.

Takahashi Y, Tabata Y. Homogeneous seeding of mesenchymal stem cells into 5 nonwoven fabric for tissue engineering. Tissue Eng 2003;9:931-8.

Tiainen H, Monjo M, Knychala J, Nilsen 0, Lyngstadaas S P, Ellingsen J E and Haugen H J. The effect of fluoride surface modification of ceramic TiO2 on the surface properties and biological response of osteoblastic cells in vitro Biomed. Mater. 2011;6 045006.

Rubert M, Ramis J M, Vondrasek J, Gaya A, Lyngstadaas SP and Monjo M. Synthetic 10 peptides analogue to enamel proteins promote osteogenic differentiation of MC3T3-E1 and mesenchymal stem cells J. Biomater. Tissue Eng. 2011; 1 198-209.

Monjo M, Ramis J M, Ronold H J, Taxt-Lamolle S F, Ellingsen J E and Lyngstadaas S P. Correlation between molecular signals and bone bonding to titanium implants Clin. Oral Implants Res. 2012 doi: 10.1111/j.1600-0501.2012.02496.x.Maniatopoulos C, Sodek J, 15 Me!cher AH. Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell and tissue research 1988;254:317-30. 49

Claims

PATE NTKRAV 1. En titandioxidscaffold, van i atminstone del av en yta av namnda titandioxidscaffold är tillhandahallen med en hydrogelbelaggning innefattande atminstone en biologiskt aktiv substans, och van i namnda titandioxidscaffold är erhallbar genom en metod innefattande stegen av att: 1. tillhandahalla en titandioxidscaffold innefattande overvagande titandioxid, 2. tillhandahalla en polymerlosning innefattande en biologiskt aktiv substans/substanser och omkring 1-10 `)/0 vikt/vol av en polymer till atminstone delavnamndatitandioxidscaffoldochsedancentrifugera titandioxidscaffolden, 3. astadkomma gelning av polymeren tillhandahallen titandioxidscaffolden i steg b); och 4. eventuellt torka titandioxidscaffolden, van i steg b) och c) eventuellt upprepas atminstone en gang. 2. En titandioxidscaffold i enlighet med krav 1, van i namnda hydrogelbelaggning innefattar atminstone en polymer vald fran gruppen bestaende av alginat, kitosan, hyaluronsyra, polyetylenglykol (PEG), cellulosa, poly(akrylsyra) (PAA), poly(glykolsyra) (PGA), poly(mjolksyra) (PLA), PLA-PGA, PLA-PEG, dextran, dextran-PEG, starkelse, kollagenbaserade geler, agaroser, pluronic-syra, heparansulfat, glykosaminoglykaner, polyetylenoxid (PEO), sampolymer av etylenoxid och propylenoxid (P(E0-co-P0)), och pluronic/poloxamer. 3. En titandioxidscaffold i enlighet med krav 1 eller 2, van i namnda biologiskt aktiva substans valjs fran gruppen bestaende av en syntetisk eller naturlig bioaktiv molekyl, en naturlig eller syntetisk drog och/eller en levande cell. 4. En titandioxidscaffold i enlighet med vilket som heist av de foregaende kraven, vani namnda biologiskt aktiva substans valjs fran gruppen bestaende av naturliga eller rekombinanta bioadhesiver; naturliga eller rekombinanta faktorer for cellfastande; naturliga, rekombinanta eller syntetiska biopolymerer; naturliga eller rekombinanta blodproteiner; naturliga eller rekombinanta enzymer; naturliga eller rekombinanta extracellular matrisproteiner; naturliga eller syntetiska extracellular matrisproteiner; naturliga eller rekombinanta signalmolekyler, tillvaxffaktorer och hormoner; naturliga, rekombinanta och syntetiska peptider, syntetiska peptidhormoner; naturliga, rekombinanta eller syntetiska deoxiribonukleinsyror; naturliga, rekombinanta eller syntetiska ribonukleotidsyror; naturliga eller rekombinanta receptorer; enzyminhibitorer; droger; biologiskt aktiva anjoner och katjoner; vitaminer; adenosinmonofosfat (AMP), adenosindifosfat (ADP) eller adenosintrifosfat (ATP); markorbiomolekyler; aminosyror; fettsyror; nukleotider (RNA- och DNA-baser), socker, antibiotikasubstanser, s5som tetracykliner och sm5 biologiska organiska molekyler, sasom statiner och bisfosfonater. 5. En titandioxidscaffold i enlighet med krav 3, van i namnda levande cell valjs fran gruppen bestaende av mesenkymala stamceller, benceller, pluripotenta celler, benprekursorceller, vaskulara celler, prekursorvaskularceller och stromaceller. 6. En titandioxidscaffold i enlighet med vilket som heist av de foreg5ende kraven, vani namnda polymerer har en molekylvikt (Mw) av 1 000-1 000 000 g/mol, sasom 1000200 000 g/mol. 7. En titandioxidscaffold i enlighet med vilket som heist av de foregaende kraven vilken hydrogelbelaggning har en v5ttjocklek av 5tminstone 1 pm, such as 1-20 pm. 8. En titandioxidscaffold i enlighet med vilket som heist av krav 2-7, van i namnda alginat valjs fran gruppen bestaende av natriumalginat, kaliumalginat, kalciumalginat och strontiumalginat. 9. Ett medicinsk implantat innefattande en titandioxidscaffold i enlighet med vilket som heist av krav 1-8. 10. En titandioxidscaffold i enlighet med vilket som heist av krav 1-8 for anvandning som ett medicinskt implantat. 11. En titandioxidscaffold i enlighet med vilket som heist av krav 1-8 eller ett medicinskt implantat enligt krav 9 kw anvandning for regenereringen, reparationen, ersattandet och/eller aterstallandet av vavnad, sasom ben. 12. En metod for att producera en titandioxidscaffold innefattande en hydrogelbelaggning innefattande en biologiskt aktiv substans i enlighet med vilket som heist av krav 1-8, van i namnda metod bestar av stegen av att:

1. tillhandahalla en titandioxidscaffold innefattande overvagande titandioxid,

2. tillhandahalla en polymerlosning innefattande en biologiskt aktiv substans/substanser och omkring 1-10 % vikt/vol av en polymer vald fr5n gruppen bestaende av alginat, kitosan, hyaluronsyra, polyetylenglykol (PEG), cellulosa, poly(akrylsyra) (PAA), poly(glykolsyra) (PGA), poly(mjolksyra) (PLA), PLA-PGA, PLA-PEG, dextran, dextran-PEG, starkelse, kollagenbaseradegeler,agaroser,pluronic-syra,heparansulfat, glykosaminoglykaner, polyetylenoxid (PEO), sampolymer av etylenoxid och 51 propylenoxid (P(E0-co-P0)), och pluronic/poloxamer till atminstone del av namnda titandioxidscaffold och sedan centrifugera titandioxidscaffolden,

3. a' stadkomma gelning av polymeren tillhandahallen titandioxidscaffolden i steg b); och

4. eventuellt torka titandioxidscaffolden, van i steg b) och c) eventuellt upprepas atminstone en gang 52