JP6169178B2 - ハイドロゲルコーティングされた足場 - Google Patents
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Description
a)二酸化チタン足場を用意する工程と、
b)生物学的活性物質と、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール(PEG)、セルロース、ポリ(アクリル酸)(PAA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(乳酸)(PLA)、PLA-PGA、PLA-PEG、デキストラン、デキストラン-PEG、デンプン、コラーゲンベースのゲル、アガロース、プルロニック酸、ヘパラン硫酸、グリコサミノグリカン、ポリエチレンオキシド(PEO)、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー[P(EO-co-PO)]ならびにプルロニック/ポロキサマーからなる群から選択される約1〜10%w/vのポリマーとを含むポリマー溶液を、前記二酸化チタン足場の少なくとも一部に置き、続いて二酸化チタン足場を遠心分離する工程と、
c)工程b)における二酸化チタン足場に置かれたポリマーのゲル化をもたらす工程と、
d)必要に応じて、二酸化チタン足場を乾燥させる工程と
を含み、工程b)およびc)が、少なくとも1回必要に応じて反復される方法を対象にする。
本文脈における「足場」は、開放多孔性構造に関する。本文脈における足場は、「SC」と省略することができる。「二酸化チタン足場」とは、足場構造の建造材料として主に二酸化チタンを含む足場を意味する、即ち、二酸化チタンは、足場構造形成を担う主要物質である。したがって、二酸化チタン足場は、約51〜100wt%、60〜100wt%、60〜90wt%、70〜100wt%、70〜90wt%、80〜90wt%または80〜95wt%二酸化チタン等、約51wt%、60wt%、70wt%、80wt%、90wt%、95wt%、96wt%、97wt%、98wt%、99wt%または100wt%二酸化チタン等、50wt%を超える二酸化チタンを有する。よって、二酸化チタン足場は、足場の建造材料として二酸化チタンを含むまたはこれからなることができる。
生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを含む本明細書に開示されている二酸化チタン足場を生成するための方法の一例は、
a)二酸化チタン足場を用意する工程と、
b)生物学的活性物質と、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール(PEG)、セルロース、ポリ(アクリル酸)(PAA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(乳酸)(PLA)、PLA-PGA、PLA-PEG、デキストラン、デキストラン-PEG、デンプン、コラーゲンベースのゲル、アガロース、プルロニック酸、ヘパラン硫酸、グリコサミノグリカン、PEO、P(EO-co-PO)およびプルロニック/ポロキサマーからなる群から選択される約1〜10%w/vのポリマーとを含むポリマー溶液を、前記二酸化チタン足場の少なくとも一部に置き、続いて二酸化チタン足場を遠心分離する工程と、
c)工程b)における二酸化チタン足場に置かれたポリマーのゲル化をもたらす工程と、
d)必要に応じて、二酸化チタン足場を乾燥させる工程と
を含み、工程b)およびc)が、少なくとも1回必要に応じて反復される方法である。
ハイドロゲルは、空間充填剤、生物活性分子の送達媒体として、および細胞を組織化し所望の組織の形成を導く刺激を呈する三次元構造として等、組織工学における様々な適用に用いられており、本文書に開示されているハイドロゲルコーティングは、係る目的のいずれかに有利に用いることができる。本文書の二酸化チタン足場はまた、本明細書に開示されている方法によりハイドロゲルでコーティングされる前または後に、細胞播種に有利に用いることができる。
前述の通り、ハイドロゲル溶液および/または二価カチオン溶液は、1種または複数の異なる種類の生物学的活性物質を含むことができる。したがって、生物学的活性物質は、ハイドロゲルコーティングに取り込まれ得る。したがって、ハイドロゲルコーティングは、生物学的活性物質の担体として作用することができ、生物学的活性物質は、ハイドロゲルコーティングを介して、アルギン酸塩コーティングされた二酸化チタン足場によって結果として送達される。ハイドロゲルコーティングは、1種類の生物学的活性物質または2種類以上の生物学的活性物質の混合物を含むことができる。前述の通り、ハイドロゲルコーティングが、本明細書の他の箇所に開示されている方法の工程b)およびc)を反復することにより調製される場合、異なる層は、異なる生物学的活性物質を含むことができる。
本文書の二酸化チタン足場は、細胞結合および内部成長のための三次元空間を作製することにより組織形成を可能にする構造支持体として機能し得る網状足場である。足場の二酸化チタンは、生体適合性であり、異なる形状へと加工して、細胞成長のための機械的支持体および枠組みをもたらすことのできる足場を提供する。よって、二酸化チタン足場は、骨の再生のため等、組織工学において用いるべき適した構造を提供する。
a)二酸化チタンのスラリーを調製する工程と、
b)工程a)のスラリーを、スポンジ構造等、多孔性ポリマー構造等、可燃性多孔性構造に置く工程と、
c)可燃性多孔性構造においてスラリーを凝固させる工程と、
d)凝固した二酸化チタンスラリーから可燃性多孔性構造を除去する工程であって、
i)凝固した金属酸化物スラリーを有する可燃性多孔性構造を約500℃までゆっくりと焼結し、この温度を少なくとも30分間保持し、
ii)約3K/分で約最小1500℃または約1750℃まで急速に焼結し、この温度を少なくとも10時間保持し
iii)少なくとも3K/分で室温まで急速に冷却すること
により行うことのできる工程と、
を包含することができる。
実験セクション
1.1.ペプチドおよびエナメル基質誘導体の調製
エナメル基質誘導体(EMD)は、Straumann GmbH社(Basel、Switzerland)により快く供給された。リン酸緩衝食塩水(PBS)(PAA Laboratories GmbH社、Pasching、Austria)に溶解した0.1%酢酸に、10mg/mlとなるようEMDを溶解した。以前の研究(Rubert Mら、2011)に詳細に記載されている通り、3種の合成ペプチド[Table 1(表1)]を設計した。
単量体の最小60%がグルロン酸塩の低粘性アルギン酸塩である、アルギン酸ナトリウム[Pronova UP LVG(登録商標)]をNovaMatrix(FMC BioPolymer AS社、Norway)から購入した。さらに精製することなくアルギン酸ナトリウムを用いた。PBSにおいて2パーセント(w/v)アルギン酸ナトリウムを調製し、180rpmで室温にて一晩撹拌して、均質なアルギン酸塩ハイドロゲルを得た。最終濃度50μg/mlの合成ペプチドまたはEMDとアルギン酸塩溶液を混合した。続いて、合成ペプチド/EMDを含有するアルギン酸塩の溶液を24ウェル培養プレートに分配し、エアブラシ(aerograph)塗料アトマイザ(Precisso(登録商標)、Madrid、Spain)を用いて300mM CaCl2を噴霧した。室温における1〜2時間のインキュベーション後に、アルギン酸塩ハイドロゲルは完全にゲル化した。
走査型電子顕微鏡(SEM、Hitachi S-3400N、Hitachi High-Technologies Europe GmbH社、Krefeld、Germany)を用いて、対照2%アルギン酸塩ハイドロゲルおよび合成ペプチド2(50μg/ml)を含有する2%アルギン酸塩ハイドロゲルの形態を観察した。アルギン酸塩ハイドロゲル(非凍結乾燥および凍結乾燥)の微細構造を観察した。アルギン酸塩ハイドロゲル凍結乾燥のため、-80℃で試料を凍結し、続いて-35℃で凍結乾燥した。続いて、N2中で試料を凍結して、鋭利なメスを用いて正確な(accurated)切断により断面を得た。10kVおよび40Paを用いて×25および×100の倍率でアルギン酸塩ハイドロゲルの構造を観察した。×25倍率の画像のために環境二次電子検出器(ESED)を用い、×100倍率の画像のために後方散乱電子検出器(BSED)を用いた。SEM、Hitachi S-3400Nのソフトウェアを用いて各孔の直径を測定した。
ペプチド放出プロファイルを試験するために、P2をFITCで標識した。蛍光分光測定により、2%アルギン酸塩ハイドロゲルに含有されたペプチド(50μg/ml)の放出を定量化した。先ず、アルギン酸塩ハイドロゲルを培養培地で洗浄して、過剰なCaCl2を除去した。続いて、750μlの細胞培養培地を、ペプチドがロードされたアルギン酸塩ハイドロゲルに加えた。試料を37℃、5%CO2で21日間インキュベートし、細胞培養培地を週2回交換した。既定の(prefixed)時点(24時間目、4日目、7日目、11日目、14日目、18日目および21日目)において、上清を収集し、蛍光分光測定(λex 490nmおよびλem 525nm)により解析して、培地に放出されたペプチドの量を決定した。洗浄工程において放出されたペプチドの量も測定した。実験を3回行い、各試料を三連で解析した。
マウス骨芽細胞の細胞株MC3T3-E1(DSMZ、Braunschweig、Germany)を以前に記載された通りに維持した(Tiainen Hら、2011)。播種する前に、架橋されたアルギン酸塩ハイドロゲルを含有する24ウェル培養プレートを750μlの培養培地で洗浄して、過剰なCaCl2を除去した。異なる細胞密度を用いて2%アルギン酸塩ゲルにおける細胞接着の効率を評価した後に、最終実験のために、100000細胞/ウェルの密度で細胞を播種した。培地を週2回新しく換えた。播種24時間後に培養培地を収集して、細胞生存率を試験した。14および21日目に細胞を収集して、リアルタイムRT-PCRを用いて接着および骨原性関連マーカーの遺伝子発現を解析した。光学顕微鏡(Leica DMIRB、Leica Microsystems Wetzlar GmbH社、Germany)を用いて培養物をルーチンに観察した。
実験に最良の播種密度を決定するために、播種1および5日後に、アルギン酸塩ハイドロゲルへの細胞の接着を評価した。30×104〜200×104細胞/ウェルの密度を検査した。凍結融解方法により、アルギン酸塩ハイドロゲルに接着した細胞を脱イオン蒸留水に溶解させた。ヘキスト33 258蛍光アッセイを用いたDNA含量の決定のために細胞ライセートを用いた。TNEバッファーにおける20μg/mlのヘキスト33 258蛍光染色(Sigma社、St. Quentin Fallavier、France)と試料を混合し、多機能マイクロプレートリーダー(Cary Eclipse蛍光分光光度計、Agilent Technologies社、Santa Clara、USA)を用いて356/465nmの励起および発光波長で蛍光の強度を測定した。線形検量線を用いて細胞数と相対蛍光単位を相関させた。
24時間後に培養培地において決定されたLDH活性は、膜漏出または細胞溶解の指標とした。サイトゾル酵素の活性を、以前に記載された通りに推定した(Rupert Mら、2011)。
前骨芽細胞のMC3T3-E1細胞における14および21日間の処理後に、遺伝子発現における、アルギン酸塩ハイドロゲルにロードされた合成ペプチドおよびEMDの効果を試験した。
全データは、平均値±SEMとして提示されている。その正規分布に応じてマンホイットニーの検定またはスチューデントt検定により群間の差を評価した。異なる変数間の相関を測定するために、ピアソン相関解析を用いた。Windows(登録商標)用SPSSプログラム(Chicago、IL)バージョン17.0を用いた。結果は、p値≦0.05において統計的に有意であると考慮された。
アルギン酸塩微細構造
図1は、凍結乾燥した2%アルギン酸塩ハイドロゲル[図1A)および図1B)]および合成ペプチドを含有する2%アルギン酸塩ハイドロゲル[図1C)および図1D)]由来の断面の微細構造を示す。SEM画像から分かる通り、合成ペプチドを含有するアルギン酸塩ハイドロゲルは、2%アルギン酸塩ハイドロゲルよりも不規則な構造を示したが、解析した全ゲルにおいて、多孔性および相互接続された構造が観察された。両方の架橋されたハイドロゲルは、それぞれ合成ペプチドありまたはなしの2%アルギン酸塩ハイドロゲルに関して、42.9±3.5μmおよび44.7±4.1μmの孔径を有する多孔性および相互接続された構造を提示した。
2%アルギン酸塩ハイドロゲルからのペプチド放出プロファイルは、図2に描写されている。インキュベーションの最初の24時間におけるペプチドのバースト放出が観察された(54.67%)。さらに、累積放出プロファイルから分かる通り、25.8%のペプチドが11日目までに徐々に放出され、続いて21日目まで経時的に持続放出された。実験の終わりに(21日後に)、アルギン酸塩ハイドロゲルに理論的に含有される総ペプチドの5.6%が、放出されていなかった。ロードされたペプチドの12.7%が、過剰なCaCl2を除去するための培養培地によるアルギン酸塩ハイドロゲルの洗浄工程において放出されたことに留意されたい。
播種された細胞の半分超が、プレーティング1日後にゲルに接着しなかったため、アルギン酸塩ハイドロゲルにおける低い細胞接着率が観察された。にもかかわらず、細胞は、アルギン酸塩ハイドロゲルに結合し、細胞培養にわたって増殖した(図3)。さらに、アルギン酸塩ハイドロゲル表面に結合し広がる骨芽細胞の能力を検証するために、共焦点顕微鏡により細胞を可視化した。共焦点画像は、播種される細胞数が多くなるにつれて、アクチン染色の増加を伴う核の数の増加を示し、1日目から5日目にかけて増加する[図3A)〜図3H)]。さらに、アルギン酸塩ハイドロゲルにおいて培養された骨芽細胞の細胞糸状仮足が、SEMにより認められた。
24時間後(図4)または長期間後(データ図示せず)のいずれにおいても、合成ペプチドを含有するアルギン酸塩ハイドロゲルにおいて培養された細胞における毒性効果は見出されなかった。P2は、EMDと比較して24時間後に細胞生存率を有意に増加させたが、P5は、EMDおよび未処理アルギン酸塩ゲルと比較して、有意により低い毒性効果を示した。
培養21日後の対照と比較して、P5で処理した細胞においてItga8の発現が増加した(図5A)。Itgb1 mRNAレベルは、対照と比較して14日間のP2およびP6による処理後に有意に減少した。21日後に、P6で処理した細胞は、EMDと比較してItgb1 mRNAレベルを有意に低下させた(図5B)。Itgb3およびFn1は、対照と比較して14日間のP2およびP6処理後に有意に減少し(図5Cおよび図5D)、21日後に差は観察されなかった。
Bmp2相対mRNAレベルは、EMDと比較して、14日間のP6処理後に有意に増加したが、21日間のP2処理後に減少した。EMD処理は、対照と比較して14日間の細胞培養後にBmp2 mRNAレベルにおける有意な減少を誘導した一方、21日後にBmp2 mRNAレベルにおける増加が見出されたが、この差は、統計的有意性に達しなかった(図6A)。
ポリプロリンリッチ合成ペプチドは、以前に、in vitroで骨形成および石灰化を誘導し、in vivoにおける骨再吸収を減少させることを示した。本研究の目標は、単独で、または骨格インプラントの生分解性コーティングとして、骨形成および石灰化を促進するこれらの合成ペプチドによる局所的処置のための、ハイドロゲルを有する適した製剤を開発することであった。
Pストレッチを露出する。ペプチド2およびペプチド6は、2個の別個のループを提示するが、ペプチド5は、CおよびN末端間の接触を可能にするループの異なるトポロジーを有する。したがって、異なるペプチド間におけるC末端の到達性およびこの短いコンセンサス配列(PPXPP)の構造的な硬直性におけるこれらの構造的な差が、受容体との相互作用に影響し得るという事実は、接着遺伝子の差次的発現を説明することができる。
結論として、結果は、2%のアルギン酸塩ハイドロゲルが、合成ポリプロリンリッチペプチドの局所的送達に適した製剤であり、MC3T3-E1細胞におけるインテグリンアルファ8、オステオポンチンおよびオステオカルシン発現を誘導することを実証する。これらのペプチド修飾アルギン酸塩ハイドロゲルは、骨組織工学適用のための生物学的活性物質を有する新世代の注射可能担体を表すことができ、二酸化チタン足場等、骨格インプラントのための生分解性コーティングとしての使用に有望である。
材料と方法
2.1.合成ペプチド2(P2)の調製
合成プロリンリッチペプチド2(P2)(2HN-PLVPSQPLVPSQPLVPSQPQPPLPP-COOH)(配列番号1)をEurogentec社(Seraing、Belgium)から購入した。7.2mgの選択された合成ペプチドを含有する1本のバイアルは、フリーズドライされたペレット形態で発送されており、これをリン酸緩衝食塩水(PBS)(PAA Laboratories GmbH社、Pasching、Austria)に溶解した0.1%酢酸に、10mg/mlとなるよう溶解した。
アルギン酸ナトリウム[Pronova UP LVG(登録商標)](最小60%の単量体がグルロン酸塩である低粘性アルギン酸塩)をNovaMatrix(FMC BioPolymer AS社、Norway)から購入した。
(Tiainen Hら、2010)により以前に記載された通りに、ポリマースポンジ複製により、9mmの直径および8mmの高さのサイズを有する多孔性TiO2足場を生成した。続いて、P2ありまたはなしの1層の2%アルギン酸塩ゲルによりTiO2足場をコーティングした。簡潔に説明すると、オービタルシェーカー(IKA Vibrax VXR basic、Staufen、Germany)において1時間室温にて100rpmでかき混ぜつつ、P2ありまたはなしの2%アルギン酸塩溶液にTiO2足場を浸した。次に、252×gで1分間足場を遠心分離した。試料を50mM CaCl2に1時間浸漬して、ゲル化させた。次に、足場をdH2Oですすいで、過剰なCaCl2を除去した。最終的に、試料を一晩室温で乾燥させた。1層の2%アルギン酸塩ゲルでコーティングされた足場(対照アルギン酸塩足場)を対照群として用い、一方、コーティングされていないTiO2足場(アルギン酸塩なし、SC)も対照群として用いた。
ペプチド2を含有する2%アルギン酸塩でコーティングされたTiO2足場(P2-アルギン酸塩コーティングされた足場)を、1ml蒸留水(pH7.4)を含有する48ウェルプレート(Nunc GmBh & Co. Kg社、Langenselbold、Germany)内に置いた。細胞培養条件を模倣するために、200rpmのオービタルシェーカー[IKA(登録商標)Schuttler MTS 2、Germany]において6時間37℃、湿度条件(蒸留水容器を用いる)で試料をかき混ぜた。次に、37℃、加湿雰囲気下で最大21日間試料を維持した。既定の時点において(2日目、5日目、7日目、9日目、12日目、14日目、16日目、19日目および21日目)、蒸留水を収集し、新鮮蒸留水を各ウェルに加えた。206nmの波長におけるUV-Vis分光光度計[PerkinElmer(登録商標)Lambda 25 UV/Vis Systems、USA]により試料吸光度を解析して、放出されたペプチドの量を決定した。並行して、1層の2%アルギン酸塩ゲルでコーティングされたTiO2足場を対照として用いて、アルギン酸塩からの分解産物から得られた吸光度値を減算した。
コーティングされていない、およびペプチドありまたはなしの[P2および対照(-)]2%アルギン酸塩でコーティングされたTiO2足場(SC)を、無菌条件における48ウェルプレート(Nunc GmbH & CO. KG社、Langenselbold、Germany)内に置いた。200,000細胞/足場の密度で細胞を播種し、10%FBS(PAA Laboratories社、Pasching、Austria)ならびに100Uペニシリン/mlおよび100μgストレプトマイシン/ml抗生物質(PAA Laboratories社、Pasching、Austria)を補充したα-MEM(PAA Laboratories社、Pasching、Austria)において維持した。足場内部の均質な細胞分布を保証するため、かき混ぜ播種方法を用いた(Takahashi Yら、2003)。簡潔に説明すると、1mlの細胞懸濁液を足場に添加した後に、オービタルシェーカー(Unitron、Infors HT社、Basel、Switzerland)において6時間180rpmで37℃、湿度条件においてプレートをかき混ぜた。続いて、37℃で5%CO2の加湿雰囲気下において最大21日間細胞を維持した。培養培地(1ml)を1日おきに新しく換えた。
走査型電子顕微鏡(SEM、Hitachi S-3400N、Hitachi High-Technologies Europe GmbH社、Krefeld、Germany)を用いて、アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場の形態を観察した。培養7および21日後に、SEMをさらに用いて、TiO2足場構造中の細胞接着を可視化した。簡潔に説明すると、細胞をPBSで2回洗浄し、PBSにおける4%のグルタルアルデヒドで2時間固定した。続いて、固定用溶液を除去し、細胞を蒸留水で2回洗浄した。30分間の間隔で、50%、70%、90%および100%エタノール溶液の添加により細胞を脱水した。エタノールを除去し、細胞を室温に放置して、残ったエタノールを蒸発させた。後方散乱および二次電子検出器を用いて10kVおよび40Paで足場を観察した。提示された画像は、代表的な区域に由来する。
48時間後の培養培地において決定された乳酸脱水素酵素(LDH)活性を細胞生存の指標とした。メーカーのキット説明書(Roche Diagnostics社、Mannheim、Germany)に従って、サイトゾル酵素の活性を決定した。
3D足場において成長する細胞を、脱イオン蒸留(destilled)水において凍結融解方法により溶解した。細胞ライセートを、ヘキスト33258蛍光アッセイを用いたDNA含量の決定に用いた。TNEバッファーにおける20μg/mlのヘキスト33258蛍光染色剤(Sigma社、St. Quentin Fallavier、France)と試料を混合し、多機能マイクロプレートリーダー(Cary Eclipse蛍光分光光度計、Agilent Technologies社、Santa Clara、United States)を用いて、356/465nmの励起および発光波長において蛍光の強度を測定した。線形検量線を用いて相対蛍光単位を細胞数と相関させた。
Tripure(登録商標)(Roche Diagnostics社、Mannheim、Germany)を用いて、メーカーのプロトコールに従って全RNAを単離した。Nanodrop分光光度計(NanoDrop Technologies社、Wilmington、DE、USA)を用いて、260nmにおける全RNAを定量化した。大容量RNA-to-cDNAキット(Applied Biosystems社、Foster City、CA)を用いて、サプライヤーのプロトコールに従って、同量の全RNA(850ng)を42℃で60分間逆転写してcDNAを作製した。PCR反応を行うまで、各cDNAのアリコートを凍結した(-20℃)。
全データを平均値±SEMとして提示する。コルモゴロフ・スミルノフ検定を行って、正規性検定のためのパラメトリックまたはノンパラメトリック分布を仮定し、その正規分布に応じてマンホイットニーの検定またはスチューデントt検定により群間の差を評価した。Windows(登録商標)用SPSSプログラム(Chicago、IL、US)バージョン17.0を用いた。結果は、p値≦0.05において統計的に有意であると考慮した。
ペプチド放出
P2-アルギン酸塩コーティングされた足場からのペプチド放出プロファイルは、図7に描写されている。インキュベーションの最初の2日間におけるペプチドのバースト放出が観察された(21日後に放出されたP2の累積量の42.8%)。5日後に、放出されたペプチドの量は、(21日目までに放出された累積量の)9.4%に減少し、続いてより遅い、但し持続したペプチド放出が、インキュベーション21日目まで経時的に行われた。さらに、累積放出は、インキュベーション21日後に、2%アルギン酸塩ゲルに捕捉されたP2が依然として存在したことを示唆する。
図8に示す通り、試験した実験群のいずれに対しても毒性効果は観察されなかった。検査した全群において、同様のパーセンテージの細胞生存率が決定され、対照アルギン酸塩足場(-)およびP2-アルギン酸塩コーティングされた足場(P2)のいずれも、細胞培養48時間後に細胞にいかなる毒性効果も示さなかったことを示す。
アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場をSEMにより観察した。図9Aおよび図9Bに示す通り、TiO2足場の一部の孔は、アルギン酸塩によるコーティング過程の後に遮断されたが、細胞播種および標準細胞培養条件(37℃および加湿雰囲気)における7日間のインキュベーション後に、ほぼ全ての孔は遮断解除された(図9Cおよび図9D)。よって、コーティング過程の直後には遮断されたままであった孔において、遮断アルギン酸塩ゲルのある程度の分解が観察された。
培養7日後に、DNA定量化を用いて、TiO2足場において成長する細胞の数を決定した(図11)。SEM画像によると、培養7日後に、細胞の数は、アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場のいずれかにおいて、TiO2足場(SC)と比較して有意により低かった。よって、SCと比較して、それぞれP2なしおよびありのアルギン酸塩コーティングされた足場において、細胞数の61%および49%低下が見出された。データは、統計的有意性に達しなかったが、P2でコーティングされた足場は、アルギン酸塩対照足場(-)よりも32%多い細胞を示した。
図12に示す通り、Itb1の相対mRNAレベルは、培養7日後に、TiO2足場(SC)と比較して、アルギン酸塩コーティングされた足場(P2ありまたはなしのいずれか)において成長する細胞において有意に減少した。にもかかわらず、細胞培養21日後に、群間に差は観察されなかった。21日後に、TiO2足場(SC)と比較して、アルギン酸塩コーティングされた足場(P2ありまたはなしのいずれか)において成長する細胞において、Itgb3 mRNAレベルが増加した。コーティングされていない足場と比較して、より高いmRNAレベルのFn1が、21日後の2%アルギン酸塩コーティングされた足場において成長する細胞と、P2-アルギン酸塩コーティングされた足場において成長する細胞において見出されたが、最後の群に関して、データは、統計的有意性に達しなかった。Itga8 mRNAは、培養21日後に、対照アルギン酸塩足場と比較して、P2-アルギン酸塩コーティングされた足場において成長する細胞において有意に増加した。
図13は、数種類の骨芽細胞分化マーカー遺伝子の相対mRNAレベルを示す。培養21日後に、オステリクスmRNAレベルは、コーティングされていない足場と比較して、アルギン酸塩コーティングされた足場(P2ありまたはなしのいずれか)において成長する細胞において増加した。Bmp-2およびIl-6 mRNAレベルは、細胞培養21日後に、コーティングされていない足場およびアルギン酸塩コーティングされた足場の両方と比較して、P2-アルギン酸塩コーティングされた足場において培養した細胞において有意に増加した。細胞増殖に関連するマーカーであるColl-I mRNAレベルは、細胞培養7日後に、アルギン酸塩コーティングされた足場と比較して、P2-アルギン酸塩コーティングされた足場において培養した細胞において有意に増加した。培養21日後に、Coll-Iは、コーティングされていない足場と比較して、アルギン酸塩コーティングされた足場およびP2-アルギン酸塩コーティングされた足場の両方において有意に増加した。試験した時点のいずれにおいても、実験群間でOpn、Bsp、AlpおよびOc mRNA発現レベルにおける有意な差は観察されなかった。
本実験において、骨形成および石灰化を促進するための荷重負荷骨組織適用における使用のための、生物学的活性物質ありおよびなしのアルギン酸塩コーティングでコーティングされた二酸化チタン足場の適合性を実証した。TiO2足場は、圧縮強度において最大2.6MPaの強度を有することが報告され(Tiainen Hら、2010)、ブタin vivo試験において優れた機械的抵抗を示した。
た。ECMの合成、組織化および成熟化が終了したら、Oc発現が上方調節されて、石灰化をもたらす。結果は、培養21日後にOc mRNAレベルの微増を示し、したがって、細胞が、ちょうど石灰化過程の初期であったと結論づけることができる。さらに、OpnおよびBspの遺伝子発現レベルによる本出願人らの結果に従うと、コーティングされていないTiO2足場に播種されたMC3T3-E1細胞により以前に報告された通り、骨芽細胞におけるBsp/Opn mRNA関連の増加は、ECM石灰化の刺激を示し得る。
結論として、結果は、アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場が、骨芽細胞分化を誘導するプロリン配列が豊富な合成ペプチド等、生物学的活性物質の送達のためのマトリックスとして作用し得ることを実証する。骨形成および石灰化における、合成プロリンリッチペプチド等の生物学的活性物質の骨原性効果とTiO2足場の物理的および骨伝導性質との組み合わせは、荷重負荷適用における骨組織再生のための新たな戦略を表すことができる。
(Tiainen Hら、2010)により以前に記載された通り、ポリマースポンジ複製により、9mmの直径および8mmの高さのサイズを有する多孔性TiO2足場を生成した。次に、P2(配列番号1)ありまたはなしのpH5.5の1層の2%キトサンで足場をコーティングした。キトサンは、エビおよびカニ殻の天然構成成分である、キチンの脱アセチル化誘導体である。これは、最大pH6.2の水に可溶性の、生体適合性のpH依存性カチオン性ポリマーである。簡潔に説明すると、1時間室温でオービタルシェーカー(IKA Vibrax VXR basic、Staufen、Germany)において100rpmでかき混ぜつつ、P2ありまたはなしの溶液にTiO2足場を浸した。次に、252×gで1分間足場を遠心分離した。pH8.0を有する水溶液に試料を浸漬して、ゲル化させた。このpHを上回るキトサン水溶液の塩基性化は、水分補給されたゲル様沈殿物の形成をもたらす。キトサンアミン基の中和と、その結果としての反発的鎖間静電力の排除が為され、その後、これにより広範な水素結合および鎖間の疎水性相互作用が可能になり、続いて相分離が行われる。次に、足場をdH2Oですすいで、過剰な物質を除去した。最終的に、試料を一晩室温で乾燥させた。
(Tiainen Hら、2010)により以前に記載された通り、ポリマースポンジ複製により、9mmの直径および8mmの高さのサイズを有する多孔性TiO2足場を生成した。次に、P2(配列番号1)ありまたはなしの1層の20%ポロキサマー407[Pluronic(登録商標)F127]で足場をコーティングした。1時間10℃でオービタルシェーカー(IKA Vibrax VXR basic、Staufen、Germany)において100rpmでかき混ぜつつ、P2(配列番号1)ありまたはなしの溶液にTiO2足場を浸した。次に、252×gで1分間、10℃にて足場を遠心分離した。次に、試料を37℃に置いて、ゲル化させた。
(Tiainen Hら、2010)により以前に記載された通り、ポリマースポンジ複製により、9mmの直径および8mmの高さのサイズを有する多孔性TiO2足場を生成した。次に、P2(配列番号1)ありまたはなしの1層の3%高分子量ポリ(アクリル酸)(PAA)で足場をコーティングした。PAAは、生体接着ポリマーである。1時間4℃でオービタルシェーカー(IKA Vibrax VXR basic、Staufen、Germany)において100rpmでかき混ぜつつ、P2(配列番号1)ありまたはなしのPAA溶液にTiO2足場を浸した。次に、252×gで1分間、4℃にて足場を遠心分離した。次に、試料を37℃に置いて、ゲル化させた。
(Tiainen Hら、2010)により以前に記載された通り、ポリマースポンジ複製により、9mmの直径および8mmの高さのサイズを有する多孔性TiO2足場を生成した。次に、P2(配列番号1)ありまたはなしの1層の8%メチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)ならびに1wt% NaClで足場をコーティングした。次に、1時間10℃でオービタルシェーカー(IKA Vibrax VXR basic、Staufen、Germany)において100rpmでかき混ぜつつ、P2(配列番号1)ありまたはなしの溶液にTiO2足場を浸した。次に、252×gで1分間、10℃にて足場を遠心分離した。次に、試料を37℃に置いて、ゲル化させた。
(Tiainen Hら、2010)により以前に記載された通り、ポリマースポンジ複製により、9mmの直径および8mmの高さのサイズを有する多孔性TiO2足場を生成した。次に、P2(配列番号1)ありまたはなしの1層の2.5%PAA-g-ポロキサマーグラフトコポリマーで足場をコーティングした。1時間3℃、pH7.4でオービタルシェーカー(IKA Vibrax VXR basic、Staufen、Germany)において100rpmでかき混ぜつつ、P2(配列番号1)ありまたはなしの溶液にTiO2足場を浸した。次に、252×gで1分間、3℃にて足場を遠心分離した。試料を37℃に置いて、ゲル化させた。
(Tiainen Hら、2010)により以前に記載された通り、ポリマースポンジ複製により、9mmの直径および8mmの高さのサイズを有する多孔性TiO2足場を生成した。次に、光開始剤4-ベンゾイルベンジル)トリメチル塩化アンモニウム(BBTMAC)を含有するPEO(5ml、5%w/v)またはP(EO-co-PO)の1層の水溶液で足場をコーティングした[P2(配列番号1)ありまたはなしでTiO2足場に5%のポリマー質量を注いだ]。次に、0.5時間室温でオービタルシェーカー(IKA Vibrax VXR basic、Staufen、Germany)において100rpmでかき混ぜつつ、P2(配列番号1)ありまたはなしの溶液にTiO2足場を浸した。次に、252×gで1分間、室温にて足場を遠心分離した。次に、Dimax光硬化システム、モデル5000 Floodにおいて試料を2分間UV照射して、200〜400nmにおいてゲル化させた。
1.概要
シンバスタチン(SIM)(即ち、生物学的活性物質)含有アルギン酸塩溶液に、高度に多孔性の二酸化チタン(TiO2)足場を浸した。走査型電子顕微鏡および過ヨウ素酸シッフ染色により可視化された足場の微細構造は、TiO2足場支柱の表面を覆う、均一に分布したアルギン酸塩層を明らかにした。進行性かつ持続したSIM放出が最大19日間観察された。SIMなしの足場と比較して、SIMを有する足場による骨芽細胞における細胞毒性効果は観察されなかった。リアルタイムRT-PCRを用いて、骨芽細胞マーカー(コラーゲンI型アルファ1、アルカリホスファターゼ、オステオプロテジェリン、オステオカルシンおよび血管内皮成長因子A)の発現を定量化した。マルチプレックスイムノアッセイ(Luminex)により、オステオプロテジェリン、血管内皮成長因子Aおよびオステオカルシンの分泌を解析した。10μM SIMを有する足場において培養した細胞によるオステオカルシンの相対発現および分泌は、SIMなしの足場と比較して、21日後に有意に増加した。加えて、10nMおよび10μM SIMの両方を有する足場において培養した細胞からの血管内皮成長因子Aの分泌は、SIMなしの足場と比較して、21日目に有意に増強された。結論として、この結果は、SIMコーティングされたTiO2足場が、SIMの持続放出を支持し、骨芽細胞分化を誘導することができることを示す。SIMの骨原性効果とTiO2足場の物理的性質との組み合わせは、即時の荷重負荷が望まれるまたは利用できない欠損における骨再生のための新たな戦略を表すことができる。したがって、本実施例は、例えば骨芽細胞成長にプラスの効果をもたらすために、本文書のアルギン酸塩コーティングされた二酸化チタン足場を用いて、生物学的活性物質を送達することができることを実証する例示的な実施形態である。
2.1.SIMを含有するアルギン酸塩ハイドロゲルでコーティングされたTiO2足場の製作
以前に記載された通りに(Tiainen Hら、2010)、ポリマースポンジ複製により、9mmの直径および8mmの高さのサイズを有する多孔性TiO2足場を生成した。要するに、ポリマー発泡体をTiO2スラリーに含浸し、乾燥させ、その後1500℃で40時間焼結した。第2の層のTiO2スラリーを足場に加え、先述と同じ温度で再焼結した。マイクロ断層撮影法(micro-computed tomography)(1172 micro-CTイメージングシステム、Skyscan、Kontich、Belgium)により決定した足場の総表面積は、20.295cm2であった。生成された足場を、121℃で20分間オートクレーブすることにより滅菌した。SIM(Krebs Biochemicals & Industries社、Andhra Pradesh、India)を100%エタノールに溶解し、その後、所望の濃度でミリQ(milliQ)水における2%(w/v)Pronova UP LVGアルギン酸ナトリウム(FMC BioPolymer社、Sandvika、Norway)に加えて、SIM含有アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場を作製した。使用前に、0.22μm孔径シリンジフィルター(TPP Techno Plastic Products AG社、Trasadingen、Switzerland)により、SIMありまたはなしのアルギン酸塩溶液を滅菌した。
アルギン酸塩コーティングされた足場を金スパッタリングし(Cressington sputter coater 108 auto、Cressington Scientific Instruments社、Watford、England)、15kV加速電圧における後方散乱二次イオンによる走査型電子顕微鏡(SEM)(TM-1000、Hitachi High-Technologies社、Tokyo、Japan)により、その微細構造を可視化した。過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色により、アルギン酸塩コーティングをさらに評価した。簡潔に述べると、足場をミリQ水で洗浄し、1%過ヨウ素酸溶液(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO、USA)において5分間酸化させた。次に、足場をミリQ水ですすぎ、シッフ試薬(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO、USA)に15分間置いた。最終的に、足場を微温の水道水に5分間浸漬し、その後撮像した(NikonデジタルカメラD700、Sendai Nikon Corporation社、Miyagi、Japan)。
アルギン酸塩コーティングされた足場およびSIM(2.4mM、0.6mM)含有アルギン酸塩コーティングされた足場を、加湿雰囲気下にて最大19日間、1mlミリQ水において37℃で維持して、SIMの放出プロファイルを決定した。既定の時点(0.25日目、2日目、4日目、6日目、8日目、10日目、13日目、15日目、17日目、19日目)において、ミリQ水を交換し、UV-Vis分光光度計(PerkinElmer Lambda 25 UV/Vis System、PerkinElmer社、Waltham、MA、USA)を用いて、放出されたSIMの量を定量化した。238nmの波長における試料吸光度を解析し、時点毎に線形検量線を用いて、放出されたSIMの量と相対吸光度単位を相関させた。SIMなしのアルギン酸塩でコーティングされた足場からの吸光度値を対照として用いて、アルギン酸塩分解産物から得られるバックグラウンド値を減算した。実験を三連で行った。
3名のドナー、うち2名は大腿骨(16歳および10歳の男性)、1名は脛骨(41歳の男性)由来の初代ヒト骨芽細胞(Cambrex Bio Science社、Walkersville、MD、USA)を、75cm2培養フラスコ中で37℃、5%CO2の加湿雰囲気下において、10%ウシ胎仔血清、0.1%ゲンタマイシン硫酸塩およびアンホテリシン-B抗生物質および0.1%アスコルビン酸(Lonza Walkersville、MD、USA)を補充した骨芽細胞培養培地において培養した。継代7〜9由来の細胞を400,000細胞/mlの密度で足場に播種した。足場の至るところにおける均質な細胞分布を確実にするために、かき混ぜ播種方法を用いた(Takahshiら、2003)。培養培地に浸漬した足場を48ウェル培養プレートに置いた。1mlの細胞懸濁液を足場に加えた後に、200rpmで6時間、37℃にてオービタルシェーカーにおいてプレートをかき混ぜた。細胞を播種した足場を新たな培養プレートの1ml培養培地に移し、37℃、5%CO2の加湿雰囲気下で最大21日間維持した。培養培地を1日おきに交換した。細胞毒性、アルカリホスファターゼ(ALP)活性およびタンパク質発現アッセイにおける使用のために、収集した培地を保存した。リアルタイムRT-PCRおよび免疫細胞化学における使用のため、培養7、14および21日後に足場を収集した。
培養培地におけるサイトゾル(cytostolic)酵素乳酸脱水素酵素(LDH)の活性に基づき、SIM含有足場の細胞毒性を推定した。メーカーの細胞毒性検出キット説明書(Roche Diagnostics社、Mannheim、Germany)に従って、14日目まで1日おきに収集した培地におけるLDH活性を決定した。50μlの試料をキット反応混合物と共に30分間暗所で室温にてインキュベートした。プレートリーダー(Biochrom Asys Expert 96マイクロプレートリーダー、Biochrom社、Holliston、MA、USA)において492nmの試料の吸光度を測定した。
P-ニトロフェニルリン酸塩(pNPP)基質(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、USA)を黄色の最終産物、p-ニトロフェノールへと加水分解するALPの能力を用いて、培養2、8、14および21日後に、培養培地におけるALP活性を定量化した。各試料から25μlの培地を採取し、96ウェルプレートにおいて30分間暗所で室温にて100μlのpNPP溶液と共にインキュベートし、その後50μlの3M NaOHを各ウェルに加えて、反応を停止した。プレートリーダー(Biochrom Asys Expert 96マイクロプレートリーダー、Biochrom社、Holliston、MA、USA)において405nmの吸光度を測定し、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼ(Promega社、Madison、WI、USA)に基づく検量線を用いてALP活性を定量化した。
メーカーの説明書に従って修飾PES 3K遠心分離フィルター(VWR、Radnor、PA、USA)を用いて、収集した培養培地のアリコートを8倍に上昇濃縮(up-concentrated)した。xMAP技術を用いたLuminex 100/200システム(Luminex社、Austin、TX、USA)において、濃縮細胞培養培地におけるタンパク質レベルの複数分析物(multianalyte)プロファイリングを行った。xPONENT 3.1ソフトウェア(Luminex社、Austin、TX、USA)により、取得した蛍光データを解析した。ヒト骨パネルおよびヒトサイトカイン/ケモカインキット(Millipore社、Billerica、MA、USA)を用いて、培養2、8、14および21日後に、培養培地におけるオステオプロテジェリン(TNFRSF11B)、オステオカルシン(BGLAP)および血管内皮成長因子A(VEGFA)の量を測定した。メーカーのプロトコールに従って、全解析を行った。
メーカーのプロトコールに僅かな修飾を加えて、Qiagen RNA miniキット(Qiagen社、Hilden、Germany)を用いて、細胞播種した足場から全RNAを単離した。簡潔に説明すると、溶解バッファーに1時間4℃で足場を浸漬し、続いて300rpmのオービタルシェーカーにおいて10分間室温でかき混ぜた。その後、足場を廃棄し、ライセートバッファーを2Wで30秒間超音波処理した(Sonics Vibracell VC130PB、CT、USA)。残る手順は、メーカーに提供されるプロトコールに従った。
培養21日後に、メスの使用により足場を半分に切り、4%パラホルムアルデヒド(PFA)/4.6%D-マンニトールにおいて15分間固定し、その後、さらに加工するまで1%PFA/4.6%D-マンニトールにおいて貯蔵した。ミリQ水(pH7.4)に溶解した0.05%シトラコン酸無水物において15分間95℃に加熱することにより、固定した足場を熱誘導性エピトープ回復に付し、0.2%Triton Xを有するリン酸緩衝食塩水(PBS)に溶解した1.25%ウシ血清アルブミン(BSA)において1μg/mlとなるよう希釈したモノクローナルマウス抗ヒトコラーゲンI型抗体(I-8H5、MP Biomedicals、Santa Ana、CA、USA)と共に1時間室温でインキュベートし、続いて2mg/ml濃度となるよう2.5%BSA/0.05%Tween-20/PBSにおいて希釈したCy3コンジュゲートロバ抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch社、West Grove、PA、USA)において30分間室温でインキュベーションした。細胞を播種しホールマウント染色した足場を、DAPIを用いて対比染色し、カバーガラス上に置き、Dako蛍光マウント用培地(Dako社、Glostrup、Denmark)で覆った。FluoView 1000共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)(Olympus社、Center Valley、PA、USA)において共焦点レーザー走査型顕微鏡法を行った。反射モードでCLSMを用いて足場表面を可視化した。ImageJ(NIH、Bethesda、MD、USA)を用いて画像を解析した。
細胞毒性、ALP活性、遺伝子発現およびタンパク質分泌解析により得たデータは、正規性検定[シャピロ・ウイルク(Shapiro-Wilk)]に合格し、パラメトリック一元配置ANOVA(SigmaPlot 12.3、Systat Software、San Jose、CA、USA)に従ったホルム・シダック(Holm-Sidak)検定を用いて群間で比較した。≦0.05の確率を有意と考慮した。
3.1. 2%アルギン酸塩ハイドロゲルでコーティングされたTiO2足場の特徴づけ
アルギン酸塩コーティングされた足場のSEM解析は、浸漬遠心分離技法が、TiO2足場支柱の表面をコーティングするアルギン酸塩の均一な分布をもたらしたことを明らかにした(図14;A〜C)。TiO2足場の頂部(図15A)および中央部(図15B)のPAS染色により可視化される通り、アルギン酸塩の分布には僅かな変動しか観察されなかった。
2.4mMおよび0.6mM SIMを有する足場のSIM放出を調べた。両方の濃度に対し、SIMの緩慢な持続放出を検出した。しかし、2.4mM SIMを有する足場は、0.6mM SIMを有する足場に観察された15日間放出と比較して、より長期の17日間放出期間をもたらした(図16)。累積放出は、19日間のインキュベーションの後であっても、SIMがアルギン酸塩に捕捉されたままであったことを示唆した。この時点の後の濃度が検出限界を下回ったため、連続的な放出を検出することはできなかった。
広範な濃度(2.4mM、0.6mM、24μM、10μM、1μM、0.1μMおよび10nM)に関して、アルギン酸塩コーティングされた足場からのSIMの細胞毒性効果を検査した。細胞を足場に播種した場合、SIMは、より高い濃度(10μMを超える)において骨芽細胞に対し高度に細胞毒性であることが判明した(データ図示せず)。より低濃度のSIM(10μMおよび10nM)に関して14日間の細胞毒性試験を行って、持続した期間SIMに曝露した際の骨芽細胞生存率における効果を調べた。より高いLDH活性は概して、14日間の期間を通じて、10nM SIMを有する足場と比較して、10μM SIMを有する足場由来の培地において検出された。SIM濃度のどちらも、SIMなしのアルギン酸塩コーティングされた足場の効果と比較して、LDH活性の有意な増加を引き起こさなかった。LDH活性プロファイルにある程度の変動が見られ、SIMに対する細胞応答におけるドナー依存性の差を示した(図17;A〜C)。
SIM含有足場における骨芽細胞の培養は、SIMなしの足場と比較して、10nMまたは10μM SIMを有する足場のいずれかに関して、測定した時点のいずれかの培養培地におけるALP活性を有意に変化させなかった(図18;A〜C)。
結論として、試験は、アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場が、骨芽細胞分化を誘導するSIM送達のためのマトリックスとして作用し得ることを示す。10μm SIMを含有するアルギン酸塩でコーティングされた足場は、低い細胞毒性を有し、足場において培養した骨芽細胞からのVEGFAおよびBGLAPの分泌が有意に増加した。SIMの局所的骨原性効果およびTiO2足場の物理的性質の組み合わせは、荷重負荷骨における骨組織再生のための新たな戦略を表すことができる。
1.材料と方法
1.1.二酸化チタン足場の製作
以前に記載された通りに(Tiainenら、2010)、ポリマースポンジ複製により、9mmの直径および4mmの高さのサイズを有する多孔性TiO2足場を生成した。要するに、TiO2スラリーにポリマー発泡体を含浸させ、乾燥させ、その後1500℃で40時間焼結した。生成された足場を121℃で20分間オートクレーブすることにより滅菌した。
皮下(subcutanous)脂肪組織からhAD-MSCを単離した。その間葉系性質を確認するため、その表面抗原発現ならびに環境刺激に応答して骨原性、軟骨形成および脂肪生成系列へと選択的に分化する能力に関して細胞を特徴づけた。次のマーカータンパク質を評価した:
CD14(-)、CD19(-)、CD34(+)、CD45(-)、CD44(+)、CD73(+)、CD90(+)、CD105(+)、HLA-DR(-)およびIgG(-)。runt関連転写因子2(RUNX2)、コラーゲンI型アルファ1(COL1A1)、アルカリホスファターゼ(ALPL)活性/mRNA発現およびアリザリンレッド染色による組織学的評価により、細胞の骨原性分化表現型を評価した。SRY(性決定領域Y)-ボックス9(SOX9)、コラーゲンII型アルファ1(COL2A1)およびアグリカン(ACAN)mRNA発現を評価することにより、軟骨形成分化を解析した。ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマ(PPARG)mRNA発現およびオイルレッド染色による組織学的可視化により、脂肪生成分化を決定した。
それぞれ1名は脛骨、2名は大腿骨由来の3名の男性ドナー由来のhOST(Cambrex Bio Science社、Walkersville、MD、USA)を、75cm2培養フラスコにおいて37℃で5%CO2の加湿雰囲気下、10%ウシ胎仔血清、0.1%ゲンタマイシン硫酸塩およびアンホテリシン-B抗生物質および0.1%アスコルビン酸(Lonza Walkersville、MD、USA)を補充した骨芽細胞培養培地において培養した。細胞播種時に、脛骨由来のhOSTは、継代9に達し、2名の大腿骨ドナー由来のhOSTは、それぞれ継代6および8に達した。
培養培地に予め浸漬した足場を24ウェル培養プレートに置き、1mlの培養培地における2×105細胞/足場の密度で細胞懸濁液を足場の頂部に滴下して加えた。足場の至るところにおける均質な細胞分布を確実にするために、かき混ぜ播種方法を用いた(Takahashiら、2003)。播種後に、200rpmで6時間37℃、湿度条件で、オービタルシェーカーにおいてプレートをかき混ぜた。細胞を播種した足場を新たな培養プレートの1ml培養培地に移し、37℃で5%CO2の加湿雰囲気下にて維持した。翌日、細胞を播種した足場を全て、4.6%D-マンニトール溶液に2回浸漬し、続いて300×gで1分間遠心分離した。次に、細胞を包埋した足場を、それぞれの群に従って異なる仕方で処理した。対照群におけるコーティングされていない足場を新たな培養プレートの1ml培養培地に直ちに移し、37℃で5%CO2の加湿雰囲気下において最大21日間維持した。300μlの2%(w/v)Pronova UP LVGアルギン酸ナトリウム(FMC BioPolymer、Sandvika、Norway)、600μlの2%(w/v)Pronova UP LVGアルギン酸カルシウム(FMC BioPolymer、Sandvika、Norway)、600μlの0.003%(w/v)クエン酸/4.6%D-マンニトールおよび300μlの4.6%D-マンニトールからなる新しく作製した溶液に10分間浸漬し、続いて300×gで1分間遠心分離して過剰なアルギン酸塩溶液を除去することにより、EMDなしのアルギン酸塩群における足場をアルギン酸塩ハイドロゲルでコーティングした。50mM CaCl2溶液においてアルギン酸塩コーティングされた足場を安定化させ、新たな培養プレートの1ml培養培地に移し、37℃で5%CO2の加湿雰囲気下において最大21日間維持した。600μlの0.003%(w/v)クエン酸/4.6%D-マンニトールが、追加的な150μg/mlのEMD(ロット番号:EMD 9121、Institut Straumann、Basel、Switzerland)を含有し、アルギン酸塩溶液全体に対し50μg/mlの最終EMD濃度をもたらしたこと以外は、EMDなしのアルギン酸塩群における足場と同じ仕方で、EMDを有するアルギン酸塩群における足場を処理した。各ドナー、各処理および2つの収集時点の3回複製が、全54種の足場に包含された。培地を1日おきに交換し、細胞毒性、アルカリホスファターゼ(ALP)活性、総タンパク質含量および発現アッセイにおける使用のために保存した。リアルタイムRT-PCRおよび免疫細胞化学における使用のために、培養14および21日後に足場を収集した。
過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色により、アルギン酸塩コーティングを可視化した。簡潔に述べると、足場をミリQ水で洗浄し、1%過ヨウ素酸溶液(Sigma-Aidrich社、St. Louis、MO、USA)において5分間酸化させた。次に、足場をミリQ水ですすぎ、シッフ試薬(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO、USA)中に15分間置いた。最終的に、足場を微温の水道水に5分間浸漬し、その後撮像した。さらに、培養2日後に、PAS/Pan-カドヘリン二重染色によりアルギン酸塩コーティングにおけるhAD-MSCの接着性を評価した。足場をメスにより半分に切り、4%パラホルムアルデヒド(PFA)/4.6%D-マンニトールにおいて15分間固定し、その後さらに加工するまで1%PFA/4.6%D-マンニトールにおいて貯蔵した。固定した足場を先ずPAS方法に従って染色し、続いてPan-カドヘリン染色した。要するに、PAS染色された足場を、0.2%Triton Xを有するリン酸緩衝食塩水(PBS)に溶解した1.25%ウシ血清アルブミン(BSA)に4μg/mlとなるよう希釈したモノクローナルマウス抗ヒトPanカドヘリン抗体(I-8H5、MP Biomedicals社、Santa Ana、CA、USA)と共に1時間室温でインキュベートし、続いて2μg/mlの濃度となるよう2.5%BSA/0.05%Tween-20/PBSに希釈したCy3コンジュゲートロバ抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch社、West Grove、PA、USA)において、30分間室温でインキュベーションした。細胞を播種したホールマウント染色した足場を、DAPIを用いて対比染色し、カバーガラス上に置き、Dako蛍光マウント用培地(Dako社、Glostrup、Denmark)で覆った。FluoView 1000共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)(Olympus社、Center Valley、PA、USA)において共焦点レーザー走査型顕微法を行った。反射モードでCLSMを用いて足場表面を可視化した。ImageJ(NIH、Bethesda、MD、USA)を用いて画像を解析した。
培養培地におけるサイトゾル酵素乳酸脱水素酵素(LDH)の活性に基づき、細胞を播種した足場の細胞毒性を推定した。メーカーの細胞毒性検出キット説明書(Roche Diagnostics社、Mannheim、Germany)に従って、培養14日目まで1日おきに収集した培地におけるLDH活性を決定した。50μlの試料を50μlのキット反応混合物と共に30分間暗所で室温にてインキュベートした。プレートリーダー(Biochrom Asys Expert 96マイクロプレートリーダー、Biochrom社、Holliston、MA、USA)において、492nmにおける試料の吸光度を測定した。
メーカーの説明書に従ってビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキット(Thermo Scientific Pierce Biotechnology社、Rockford、IL、USA)を用いて、培養2、8、14および21日後に、培養培地における細胞を播種した足場の総タンパク質含量を決定した。25μlの試料を200μlのキット作業試薬と共に30分間暗所で37℃にてインキュベートした。プレートリーダー(Biochrom Asys Expert 96マイクロプレートリーダー、Biochrom社、Holliston、MA、USA)において562nmにおける試料の吸光度を測定し、BSA(Thermo Scientific Pierce Biotechnology社、Rockford、IL、USA)に基づく検量線により総タンパク質量を計算した。
P-ニトロフェニルリン酸塩(pNPP)基質(Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO、USA)を黄色の最終産物、p-ニトロフェノールへと加水分解するALPの能力を用いて、hAD-MSCに関しては培養2、4、6、10、16および20日後に、hOSTに関しては培養4、8、12、16および21日後に、培養培地におけるALP活性を定量化した。25μlの試料を100μlのpNPPと共に30分間暗所で室温にてインキュベートし、その後50μlの3M NaOHを加えて、反応を停止した。プレートリーダー(Biochrom Asys Expert 96マイクロプレートリーダー、Biochrom社、Holliston、MA、USA)において405nmにおける吸光度を測定し、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼ(Promega社、Madison、WI、USA)に基づく検量線によりALP活性を定量化した。
メーカーにより提供されたプロトコールに従って、Qiagen RNA miniキット(Qiagen社、Hilden、Germany)により、細胞を播種した足場から全RNAを単離した。ランダムプライマーを用いたRevertAid First Strand cDNA合成キット(Fermentas社、St. Leon- Rot、Germany)によりcDNAを合成した。TaqMan(登録商標)ユニバーサルマスターミックスによりApplied Biosystems 7300リアルタイムシステム(Life Technologies社、Paisley、UK)においてリアルタイムPCRを行った。増幅プログラムは、鋳型cDNA変性のためのプレインキュベーション工程(10分間95℃)と、続く変性工程(15秒間95℃)およびアニーリング工程(60秒間60℃)で構成される40サイクルからなった。各アッセイにおいてcDNA鋳型なしの陰性対照を行った。グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)、RUNX2、SOX9、PPARG、COL1A1、オステオプロテジェリン(TNFRSF11B)、分泌リン酸化タンパク質1(SPP1)、ALPLおよびオステオカルシン(BGLAP)に関して、hAD-MSCのリアルタイムRT-PCRを行った。GAPDH、COL1A1、TNFRSF11B、SPP1、ALPLおよびBGLAPに関して、hOSTのリアルタイムRT-PCRを行った。ΔΔCT方法(Pfafflら、2001)を用いて、リアルタイムRT-PCRデータを解析した。
xMAP技術を用いたLuminex 100/200システム(Luminex社、Austin、TX、USA)において、培養培地におけるタンパク質レベルの複数分析物プロファイリングを行った。取得した蛍光データを、xPONENT 3.1ソフトウェア(Luminex社、Austin、TX、USA)により解析した。培養2、8、14および21日後に、ヒト骨パネルキット(Millipore社、Billerica、MA、USA)により、培養培地におけるオステオプロテジェリン(TNFRSF11B)、分泌リン酸化タンパク質1(SPP1)およびオステオカルシン(BGLAP)の量を測定した。メーカーのプロトコールに従って全解析を行った。
培養14および21日後に、足場をメスにより半分に切り、4%パラホルムアルデヒド(PFA)/4.6%D-マンニトールにおいて15分間固定し、その後さらに加工するまで1%PFA/4.6%D-マンニトールにおいて貯蔵した。ミリQ水(pH7.4)に溶解した0.05%シトラコン酸無水物において95℃で15分間加熱することにより、固定した足場を熱誘導性エピトープ回復に付し、0.2%Triton Xを有するリン酸緩衝食塩水(PBS)に溶解した1.25%ウシ血清アルブミン(BSA)において1μg/mlとなるよう希釈したモノクローナルマウス抗ヒト抗体(I-8H5、MP Biomedicals社、Santa Ana、CA、USA)と共に1時間室温でインキュベートし、続いて2mg/mlの濃度となるよう2.5%BSA/0.05%Tween-20/PBSに希釈したCy3コンジュゲートロバ抗マウスIgG(Jackson ImmunoResearch社、West Grove、PA、USA)において30分間室温でインキュベーションした。細胞を播種したホールマウント染色した足場を、DAPIを用いて対比染色し、Dako蛍光マウント用培地(Dako社、Glostrup、Denmark)によりカバーガラスにおいてマウントした。FluoView 1000 CLSM(Olympus社、Center Valley、PA、USA)において共焦点レーザー走査型顕微鏡法を行った。反射モードでCLSMを用いて足場表面を可視化した。ImageJ(NIH、Bethesda、MD、USA)により画像を解析した。
パラメトリック一元配置ANOVAに従ったホルム・シダック検定を用いて、細胞毒性、ALP活性、遺伝子発現、総タンパク質含量および分泌解析により得られたデータを群間で比較した。等しい分散および/または正規性検定が失敗した場合、順位におけるクラスカル・ワリス一元配置ANOVAを行った(SigmaPlot 12.3、Systat Software、San Jose、CA、USA)。≦0.05の確率を有意として考慮した。
2.1.アルギン酸塩コーティングされた細胞を播種した足場の特徴づけ
アルギン酸塩コーティングされた足場のPAS染色は、TiO2足場支柱の表面全体をコーティングするアルギン酸塩ハイドロゲルの均一な分布を明らかにした(図23A)。さらに、アルギン酸塩コーティングされたTiO2足場へのhAD-MSC接着性は、PAS/Pan-カドヘリン二重染色により実証された(図22D)。さらに、播種されたhAD-MSCの大部分は、アクリジンオレンジ/エチジウムブロマイド染色によると、培養2日目に生存可能であった(図23)。
細胞表面抗原発現パターン、CD14(-)、CD19(-)、CD34(+)、CD45(-)、CD44(+)、CD73(+)、CD90(+)、CD105(+)、HLA-DR(-)およびIgG(-)は、造血または内皮起源細胞の非存在を示唆した。骨および脂肪生成分化は、それぞれアリザリンレッドおよびオイルレッドによる組織学的可視化により実証された。加えて、細胞は、培養において骨、軟骨および脂肪沈着細胞へと選択的に分化した。その抗原表面発現パターン、組織学的評価ならびに骨原性、軟骨形成および脂肪生成系列に沿って分化するその潜在力のため、細胞は、hAD-MSCと称された。
EMDありまたはなしのアルギン酸塩コーティングされた足場に関して14日間の細胞毒性試験を行って、hAD-MSCおよびhOST生存率におけるアルギン酸塩およびEMDの効果を調べた。より高いLDH活性は概して、14日間の期間を通して、EMDなしのアルギン酸塩コーティングされた足場と比較して、EMDを有するアルギン酸塩コーティングされた足場由来の培地において検出された。EMDを有するアルギン酸塩コーティングされた足場由来のhAD-MSCを除き、足場のどちらも、コーティングされていない足場の効果と比較して、LDH活性の有意な増加を引き起こさなかったことは、EMDなしのアルギン酸塩コーティングされた足場およびコーティングされていない足場と比較して、12日目にLDH活性の有意な増加を明らかにした(図24A)。さらに、EMDありおよびなしのアルギン酸塩コーティングされた足場由来のhOST培地において、コーティングされていない足場と比較して、2、4および14日目にLDH活性の有意な減少が観察された(図24B)。hAD-MSCおよびhOSTのLDH活性プロファイルにおいてある程度の変動が観察され、アルギン酸塩およびEMDに対し細胞応答における細胞型依存性の差を示した(図24;A〜B)。
8日目に、コーティングされていない足場と比較してEMDありおよびなしのアルギン酸塩コーティングされた足場由来の培地において総タンパク質量の有意な増加が検出されたこと、12日目に、EMDなしのアルギン酸塩コーティングされた足場およびコーティングされていない足場と比較してEMDありのアルギン酸塩コーティングされた足場由来の培地において総タンパク質量の有意な増加が観察されたことを除き、EMDありまたはなしの足場のいずれかに関し、コーティングされていない足場と比較して、いかなる時点におけるhAD-MSC培養培地の総タンパク質含量においても有意な差は概して観察されなかった(図24C)。2および4日目に、コーティングされていない足場と比較してEMDありおよびなしのアルギン酸塩コーティングされた足場由来の培地において総タンパク質量の有意な減少が検出されたことを除き、EMDありまたはなしの足場のいずれかに関し、コーティングされていない足場と比較して、いかなる時点におけるhOST培養培地の総タンパク質含量においても有意な差は概して観察されなかった(図24D)。
20日目にEMDなしのアルギン酸塩コーティングされた足場およびコーティングされていない足場と比較して、EMDを有するアルギン酸塩コーティングされた足場において培養した細胞由来の培地におけるALP活性が有意に増加したドナー1と、10日目にEMDなしのアルギン酸塩コーティングされた足場およびコーティングされていない足場と比較して、EMDを有する足場において培養した細胞由来の培地におけるALP活性が有意に減少したドナー3を除き、EMDありまたはなしのアルギン酸塩コーティングされた足場におけるhAD-MSCの培養は、EMDありまたはなしの足場のいずれかに関して、コーティングされていない足場と比較して、測定した時点のいずれにおいても培養培地におけるALP活性を有意に変化させなかった。
hAD-MSCにおけるCOL1A1、TNFRSF11B、SPP1、ALPLおよびBGLAP mRNAレベルの発現において、試験した時点のいずれにおいても、実験群間に有意な差は観察されなかった。加えて、RUNX2、SOX9およびPPARG mRNAレベルの発現において、試験した時点のいずれにおいても、実験群間に有意な差は観察されなかった。
RUNX2およびSOX9の沈着におけるEMDの効果を評価するため、染色した足場においてCLSM可視化を行った(図25)。
コーティングされていない足場と比較して、いかなる時点においても、EMDありまたはなしの足場いずれかに由来するhAD-MSCまたはhOST培養培地いずれかのTNFRSF11B、SPP1およびBGLAP含量において、有意な差は観察されなかった。いかなる時点においても、EMDありまたはなしの足場のいずれかに由来する第2のドナーの培養培地中TNFRSF11B含量において、実質的な差は観察されず、第1のドナーに対し、8、14および21日目に、EMDありまたはなしの足場のいずれかに由来する培養培地のTNFRSF11B含量における実質的な差は検出されなかった。しかし、あらゆる時点において、EMDを有する足場と比較して、EMDなしの足場において培養した細胞に由来する培養培地における第3のドナーのTNFRSF11Bの含量は、より増加した。21日目に、EMDなしの足場と比較して、EMDを有する足場において培養した細胞由来の培養培地における第3のドナーのSPP1の含量がより多く発現されたことを除き、いかなる時点においても、EMDありまたはなしの足場のいずれかに由来する培養培地の第1および第3のドナーのSPP1含量において、実質的な差は観察されなかった。さらに、8および21日目において、EMDを有する足場において培養した細胞由来の培養培地における第2のドナーのSPP1含量は、EMDなしの足場と比較してより増強された。いかなる時点においても、EMDありまたはなしの足場のいずれかに由来する第1および第3のドナーの培養培地中BGLAP含量において、実質的な差は観察されなかった。しかし、2および8日目に、EMDを有する足場において培養した細胞由来の第2のドナーの培養培地中BGLAP含量は、EMDなしの足場と比較してより増強された。
要約すると、この結果から、本発明者らは、hAD-MSCおよびhOSTが、EMC誘導体送達のためのコーティング手順を生き延びる能力を有すると結論づけることができる。さらに、hOSTは、EMDを有するアルギン酸塩コーティングされた足場内において、骨原性系列へと分化することができ、この結果は、有効性をin vivoで評価する前に重要である。
(Tiainen Hら、2010)により以前に記載された通り、ポリマースポンジ複製により、9mmの直径および8mmの高さのサイズを有する多孔性TiO2足場を生成した。次に、放射線不透過性コントラスト液[Omnipaque(イオヘキソール)、GE Healtcare社]を有する1層の2%アルギン酸塩ゲルで、TiO2足場をコーティングした。簡潔に説明すると、1時間室温でオービタルシェーカー(IKA Vibrax VXR basic、Staufen、Germany)において100rpmでかき混ぜつつ、P2(配列番号1)ありまたはなしの2%アルギン酸塩溶液にTiO2足場を浸した。次に、252×gで1分間足場を遠心分離した。50mM CaCl2に試料を1時間浸漬して、ゲル化させた。次に、足場をdH2Oですすいで、過剰なCaCl2を除去した。最終的に、試料を室温で一晩乾燥させた。1層の2%アルギン酸塩ゲル(対照アルギン酸塩足場)でコーティングされた足場を対照群として用い、一方、コーティングされていないTiO2足場(アルギン酸塩なし、SC)も対照群として用いた。microCTスキャナー(Skyscan 1172、Kontich、Belgium)において足場をスキャンし、CTvoxにおいて可視化し、CTanにおいて解析した。足場の孔径は、5%しか低下せず、多孔度変化は、3%未満であった。相互接続性は、アルギン酸塩層の塗布により変化せず、足場が依然として開放多孔性構造を有し、ごく僅かな孔が遮断された(暗色)ことを証明した(図26)。支柱の全てがアルギン酸塩の薄層(<10μm)で覆われていることも目に見えた。
Claims (12)
- 表面の少なくとも一部が、少なくとも1種の生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを備え、
a)二酸化チタン足場を用意する工程と、
b)生物学的活性物質と、1000〜1000000g/molの分子量(Mw)を有する約1〜10%w/vのポリマーとを含むポリマー溶液を、前記二酸化チタン足場の少なくとも一部に置き、続いて二酸化チタン足場を遠心分離する工程と、
c)工程b)における二酸化チタン足場に置かれたポリマーのゲル化をもたらす工程と、
d)必要に応じて、二酸化チタン足場を乾燥させる工程と
を含み、工程b)およびc)が、少なくとも1回必要に応じて反復される方法によって得ることができるまたは得られる、二酸化チタン足場。 - 前記ハイドロゲルコーティングが、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール(PEG)、セルロース、ポリ(アクリル酸)(PAA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(乳酸)(PLA)、PLA-PGA、PLA-PEG、デキストラン、デキストラン-PEG、デンプン、コラーゲンベースのゲル、アガロース、ポロキサマー、ヘパラン硫酸、グリコサミノグリカン、ポリエチレンオキシド(PEO)、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー[P(EO-co-PO)]ならびにポロキサマーのコポリマーからなる群から選択される少なくとも1種のポリマーを含む、請求項1に記載の二酸化チタン足場。
- 前記生物学的活性物質が、合成もしくは天然生物活性分子、天然もしくは合成薬物、および/または生細胞からなる群から選択される、請求項1または2に記載の二酸化チタン足場。
- 前記生物学的活性物質が、天然または組換え生体接着剤;天然または組換え細胞結合因子;天然、組換えまたは合成バイオポリマー;天然または組換え血液タンパク質;天然または組換え酵素;天然または組換え細胞外マトリックスタンパク質;天然または合成細胞外マトリックス生体分子;天然または組換えシグナル分子、成長因子およびホルモン;天然、組換えおよび合成ペプチド、合成ペプチドホルモン;天然、組換えまたは合成デオキシリボ核酸;天然、組換えまたは合成リボ核酸(ribonucleotide acid);天然または組換え受容体;酵素阻害剤;薬物;生物学的活性アニオンおよびカチオン;ビタミン;アデノシン一リン酸(AMP)、アデノシン二リン酸(ADP)またはアデノシン三リン酸(ATP);マーカー生体分子;アミノ酸;脂肪酸;ヌクレオチド(RNAおよびDNA塩基)、糖、テトラサイクリン等の抗生物質ならびにスタチンおよびビスホスホネート等の小型の生物学的有機分子からなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場。
- 前記生細胞が、間葉系幹細胞、骨細胞、多能性細胞、骨前駆細胞、血管細胞、前駆血管細胞およびストロマ細胞からなる群から選択される、請求項3に記載の二酸化チタン足場。
- 前記ポリマーが、1000〜200000g/molの分子量(Mw)を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場。
- 前記ハイドロゲルコーティングが、1〜20μm等、少なくとも1μmの湿潤厚さを有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場。
- 前記アルギン酸塩が、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸カルシウムおよびアルギン酸ストロンチウムからなる群から選択される、請求項2から7のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載の生物学的活性物質を含むハイドロゲルコーティングを含む二酸化チタン足場を生成するための方法であって、
a)二酸化チタン足場を用意する工程と、
b)生物学的活性物質と、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール(PEG)、セルロース、ポリ(アクリル酸)(PAA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(乳酸)(PLA)、PLA-PGA、PLA-PEG、デキストラン、デキストラン-PEG、デンプン、コラーゲンベースのゲル、アガロース、ポロキサマー、ヘパラン硫酸、グリコサミノグリカン、ポリエチレンオキシド(PEO)、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー[P(EO-co-PO)]ならびにポロキサマーのコポリマーからなる群から選択される約1〜10%w/vのポリマーとを含むポリマー溶液を、前記二酸化チタン足場の少なくとも一部に置き、続いて二酸化チタン足場を遠心分離する工程と、
c)工程b)における二酸化チタン足場に置かれたポリマーのゲル化をもたらす工程と、
d)必要に応じて、二酸化チタン足場を乾燥させる工程と
を含み、工程b)およびc)が、少なくとも1回必要に応じて反復される方法。 - 請求項1から8のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場を含む医療用インプラント。
- 医療用インプラントとして使用するための、請求項1から8のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場。
- 骨等、組織の再生、修復、置換および/または回復のために使用するための、請求項1から8のいずれか一項に記載の二酸化チタン足場または請求項10に記載の医療用インプラント。
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